principles of flow cytometry - imunologie.lf2.cuni.czimunologie.lf2.cuni.cz/soubory_vyuka/prutokova...
TRANSCRIPT
Průtoková cytometrie• Princip průtokové cytometrie• Použití více fluorescenčních barev -
teorie kompenzace• Možnosti analýzy dat• Některé aplikace průtokové cytometrie
Imunologické laboratorní metody20.4.2009
Průtokový cytometr = „Automatický mikroskop“
Odpad
Detekce& Počítání
Vzorek
Buňky prochází před objektivem mikroskopu a je automaticky změřena jejich fluorescence.
Nevýhody oproti mikroskopii: nevíme, kde je v buňce signál lokalizován
Průtoková cytometrie je technologie, kteráumožňuje simultánní měření několika charakteristik na úrovni jedné buňky
Složky průtokového cytometruSložky průtokového cytometruFluidika: vzorek – buněčná suspenze.
Nasátí vzorku do přístroje. Průtok vzorku přístrojem. Vytvořeníproudu buněk pro měření. Sortování. Regulace rychlosti měření.
Optika: Zdroj excitačního záření. Optické zařízení pro sběr emitovaného záření a odraženého světla. Zdroje světla (lasery, detektory, filtry)
Elektronika: Převod optického signálu na elektronický signál. Digitalizace pro počítačovou analýzu.
Analýza dat: Zobrazení dat & analýzaidentifikace populacíkvantifikace intenzity značeníkvantifikace zastoupení buněk v dané populaci
Schéma fluidiky
Unášecítekutina
Odpad
NatlakováníVakuum
TlakVzorku(Variabilní)
Tlakunáš. tek.(Stálý)
vzorekvzorek
Princip průtokové cytometrieJádro průtokového cytometru: Flow cell - kyveta
Quartznozzle
FluorescenFluorescenččnníí signsignáályly
Laserový paprsekLaserový paprsek
Nasátí buněk
Velikost otvoru v nozzle = 50 to 400 µm- na některých přístrojích lze měnit
Hydrodynamická fokusace v kyvetěDobré rozlišení Horší rozlišení
VzorekVzorekUnášecí tekutina Unášecí tekutina
Vysoký tlak vzorku, široký proud vzorku.Nevhodné pro DNA analýzu
Nízký tlak vzorku,úzký proud vzorkuVhodné pro DNA analýzu
nízký vysoký
Rozptyl světla buňkou:Forward Scatter (FSC)Čím větší buňka, tím větší rozptyl světla
FSC závisí na velikosti buňky
LaserLaserovýový paprsekpaprsekFSCFSC
DeteDetekktortor
Rozptyl světla buňkou:Side Scatter (SSC)
FSCFSCDeteDetekktortor
SbSběěrnrnéé ččooččkyky
SSCSSCDeteDetekktortor
Laserový paprsekLaserový paprsek
Intenzita SSC je proporcionálnímnožství cytosolických struktur v buňce (granula, buněčné inkluze, atd.)SSC závisí na granularitě buňky
Rozdělení krevních buněk dle FSC a SSC
FSC
SSC
Lymfocyty
Monocyty
Granulocyty
ErytrocytyErytrocytydebrisdebris,,MrtvMrtvéé bubuňňkyky
Intenzita fluorescence
FITC
FITC
101 104103102
Relativní intenzita fluorescence
Poče
t bun
ěk
FITC
FITCFITC
FITCFITC
FITCFITC
FITC
Fluorescenční kanály• Fluorochromy (buňce vlastní nebo navázané, např. pomocí
protilátek) na buňkách absorbují část světla a excitují se • Emise světla o nižší energii, tj. o delší vlnové délce než byla
excitační. • Emitované fotony prochází přes sběrné čočky a jsou pomocí
soustavy filtrů a zrcadel rozděleny do kanálů dle svojí vlnovédélky
Stokesův posun
LaseryLight amplification by stimulated emission of radiation
• Zdroj monochromatického světla (jediná vlnová délka) • Zdroj koherentního vlnění = vlnění o stejné frekvenci,
stejného směru kmitání a stejné fáze (nebo se stejným fázovým rozdílem).
• Stabilní zdroj záření
Lasery v průtokovém cytometru:
Dvoulaserové průtokové cytometryargon laser - modrý (488 nm)
helium-neon diode laser - červený (633 nm).
Třílaserové průtokové cytometryviolet laser - fialový (407 nm) nebo UV laser (350 nm)
Detekce Fluorescence
FSCFSCDetectorDetector
CollectionCollectionLensLens
Laser BeamLaser Beam
FluorescenceFluorescenceDetector A, B, C, etcDetector A, B, C, etc……
EmitovanEmitovanáá fluorescence je pomocfluorescence je pomocíísestavy filtrsestavy filtrůů a a ččoočček rozdek rozděělena podle lena podle vlnovvlnovéé ddéélky do kanlky do kanáállůů..
Na koncových detektorech je v Na koncových detektorech je v kakažžddéém z nich vyhodnocena intenzita m z nich vyhodnocena intenzita fluorescence.fluorescence.
Intenzita fluorescence
FITC
FITC
101 104103102
Relative fluorescence intensity
Num
bero
f Eve
nts
FITC
FITCFITC
FITCFITC
FITCFITC
FITC
Long Pass Filtry (LP)
• Propouští všechny vlnové délky vyšší nežspecifikovaná vlnová délka
• Example: 500LP bude propouštět všechny vlnové délky větší než 500nm
400nm400nm 500nm500nm 600nm600nm 700nm700nm
Tran
smitt
ance
Tran
smitt
ance
Short Pass Filtry (SP)
• Propouští všechny vlnové délky kratší nežspecifikovaná vlnová délka
• Příklad: 600SP bude propouštět všechny vlnové délky kratší než 500nm.
400nm400nm 500nm500nm 600nm600nm 700nm700nm
Tran
smitt
ance
Tran
smitt
ance
Pásmové filtry• Propouší specifické rozmezí vlnových délek• Příklad: 550/20BP Filter bude propouštět
vlnové délky mezi 540nm a 560nm (550/20 = 550+/-10, ne 550+/-20)
400nm400nm 500nm500nm 600nm600nm 700nm700nm
Tran
smitt
ance
Tran
smitt
ance
Dichroické filtry
• Mohou být long pass (LP) nebo short pass (SP)• Filtr je umístěn v úhlu 45°• Část světla je odražena v úhlu 90º k příchozímu
paprsku, část světla je propuštena.
DichroicDichroicFilterFilter
Detector 1Detector 1
Detector 2Detector 2
Jednoduché schéma optiky přístroje FacsCalibur
Počet kanálů:2 lasery – obvykle 4 kanály3 lasery – až 11 kanálů
FITC
PE
PC5
APC
Spektra běžných fluorochromůLaser Lines (nm)Laser Lines (nm) 350350 457457 488488 514514 610610 632632
300300 400400 500500 600600 700700
PE-Texas Red
Texas Red
PI
Ethidium
PE
FITC
cis-Paranaric Acid
ElektronikaDetektory PMT (photomultiplier tube): elektrony dopadají na fotokatodu
Lze měnit napětí na PMT – lze nastavit citlivost detektoru
Konverze optického signálu do elektronických signálů(změny v napětí - pulsy)
Amplifikace signálu a digitalizace (Analog to Digital Converters = ADC ).
Analýza výšky Height (H), šířky Width (W) a plochy Area (A) pulsu
Softwarová analýza dat – LIST MODE FILE: pro každou buňku hodnoty všech parametrů
Práh (Threshold)
Hodnota treshold definuje minální intenzitu signálu v daném kanálu, která je zaznamenáno. Nižší signály nejsou zobrazeny ani zaznamenány.
Kompenzace
• Fluorochromy typicky emitují světlo v širokém spektru vlnových délek (100nm nebo víc)
• V závislosti na uspořádání filtrů, detektory mohou zachytit fluorescenci od jiných fluorochromů, které jsou detekovány v jiných kanálech kanálů(tzv. přesvit, překryv spekter)
• Přesvit je třeba „kompenzovat“, tak aby detektor zaznamenal signál pouze 1 fluorochromu
Excitační a emisní spektra fluorochromů (modrý laser)
•Stejná excitace různá emise
•Překryv spekter(overlap)
KompenzaceJednobarevné značeníCD8 FITC
Jde pouze o výpočet, úpravu dat, tak aby byla analyzovatelnáZávisí na:• nastavení přístroje (PMT napětí na
detektorech)• vlastnostech dané šarže fluorochromu
FL2-%FL1=12%FL2-%FL1=0%
Kompenzace pomocí softwaru
• Je potřeba připravit jednobarevně značenékontrolní vzorky
• Software vypočítá hodnoty kompenzací• Snadné, přesné a rychlé• Umožňuje to mnohobarevnou analýzu
Možné na cytometrech nové generaceFL1 FL2 FL3
FL1 Comp 3.96 0FL2
Comp 27.35 5.15FL3
Comp 0 11.18
Kompenzační matrix
Mnohobarevná cytometrie• Výhody
• Šetří čas a vzorky• (1) 6barevná zkumavka = (15) 2barevných zkumavek
• Exponenciální nárůst informace• Data z (1) 6barevné zkumvky » (15) 2barevných zkumavek
• Identifikace nových/málo zastoupených populací (<0.05%)• interní kontroly ve vzorku
• Problémy• Musí se pečlivě zvolit kombinace protilátek a fluorochromů
• Ne všechny reagencie jsou dostupné ve všech barvách• Vyšší možnost vzniku chyb
• Je potřeba zvolit správné kontroly
Analýza a interpretace dat• Data v LIST MODE FILE – pomocí speciálního
softwaru grafické zobrazení• Různé typy grafů• Statistiky• Názvy běžných programů (CellQuest, Flowjo, WinMDI,
FCS Express)
Histogramy – zobrazení 1 parametru
Event #
Param 1FSC
Param2SSC
Param3
FITC
Param4
PE
Param5
APC
1 100 500 10 650 4
2 110 505 700 700 6
3 90 480 720 670 10
4 95 490 15 720 15
0………10………100………1000…….10000
LIST MODE FILE
Čet
nost
(cou
nt)
Intenzita signálu
Dot ploty – zobrazení 2 parametrů
FSC
Periferní krev –populace dle velikosti a granularity
SSC
30%
60%Periferní krev –populace lymfocytů dle CD4 a CD8
Gatování
Gate je definován jako oblast(za pomoci logických operátorů- AND, NOT, OR)
Data mohou být zobrazena pouze pro definovaný subsetbuněk
Vytvoření statistik pro buňky,které nás zajímají:• procento pozitivních buněk• Hodnota fluorescence (relativní hodnota)
Populace krevních dendritických buněk
Hlavní aplikace na průtokovém cytometru:
• DNA a RNA analýza• Analýza životnosti (zastoupení apopt. buněk)• Fenotypizace (zastoupení populací, testování
aktivace buněk)• Funkce buněk (Ca2+influx)• Imunologické funkce ( ox. reakce, cytotoxické
funkce)• Sorting a buněčná izolace
Stanovení zastoupení základních buněčných populací
CD
16 P
E, C
D56
PE
NK buňky
CD3 FITC
Ostatní populace:
CD16+CD56+ NK buňkyCD14+ monocyty
Periferní krev – populace lymfocytůdle CD4 a CD8:CD4+ Th lymfocytyCD8+ Tc (cytotoxické) lymfocyty
Analýza životnosti, apoptózyApoptóza– fosfatidylserin na vnější straně membrány– vazba Annexinu V
Mrtvé buňky- Průnik barvy do jádra (propidium iodide PI)
G1
S phase
G2
MG1
2 1
Analýza buněčného
cyklu
DNA obsah na průtokovém cytometru
G0/1
G2/MS
Eve
nts
1DNA obsah
Rozložení do fází buněčného cyklu
Značení konců DNA dUTP
Green Fluorescence
Green Fluorescence
Apoptóza –fragmentace DNA
Na volné konce DNA se enzymaticky naváže [Fluorescein-deoxyuridinetriphosphate (dUTP)]
Detekce v kanálu FITC
Apoptotické buňky (DNA je fragmentována
Živé buňky (DNA není fragmentována
Oxidační reakceNapř. Testování funkce makrofágůOxidací vzniká fluorescenční produkt, který je detekován cytometricky.
• Superoxide Hydroethidine• Hydrogen Peroxide Dichlorofluorescein• Glutathione levels Monobromobimane• Nitric Oxide Dichlorofluorescein
Influx calciaStimulace – nespecifická, specifická (receptory)Fluorescence barvičky pouze, pokud váže vápník (Indo-1, Rho-2)
Flow Cytometry Image Cytometry
Time (Seconds)0 36 72 108 144 180
RA
TIO
[sho
rt/lo
ng]
0 2
00 4
00 6
00 8
0010
00
StimulationStimulation
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0 50 100 150 200
Rat
io: i
nten
sity
of 4
60nm
/ 40
5nm
sig
nals
Time (seconds)
Testování fagocytózy• Pohlcují dendritické buňky (DC) apoptotické nádorové buňky ?• Červeně označené nád. buňky, DC označené protilátkou HLA-DR
FITC (zelená)
0 102 103 104 105
<B-610/20-A>: DiI
0
102
103
104
105
<B-5
30/3
0-A
>: H
LA-D
R F
ITC
74.529.7 44.6
22.43.24
0 102 103 104 105
<B-610/20-A>: DiI
0
102
103
104
105
<B-5
30/3
0-A
>: H
LA-D
R F
ITC
73.345.7 27.5
24.82.01
0 102 103 104 105
<B-610/20-A>: DiI
0
102
103
104
105
<B-5
30/3
0-A
>: H
LA-D
R F
ITC
73.371.2 2.12
242.73
24 hodControl 0°C 4 hod