Viljely­ ja DNA­pohjaiset menetelmät polttoöljyllä

saastuneen maan ritsoremediaatioprosessin

tutkimisessa

Pro gradu

Kaisa LappiHuhtikuu

2007

Helsingin YliopistoSoveltavan kemian ja mikrobiologian laitos

Mikrobiologian osasto

3

AlkusanatPro  gradu  ­työni  oli  osa  Helsingin  Yliopiston  Soveltavan  kemian  ja  mikrobiologian

laitoksella  vuonna  2005  toteutettua  tutkimusta,  jossa  seurattiin  polttoöljyn

hajoamisprosessia  rehuvuohenherneen  (Galega  orientalis)  juuristossa.  Vuoden  2005

keväällä  perustettiin  Viikin  kasvihuoneille  koe,  jossa  prosessia  seurattiin  21­viikon  ajan

sekä mikrobiologisin että kemiallisin menetelmin.

Tutkimuksen  suunnitteluun  ja  toteutukseen  osallistuivat  ohjaajina  Leena  Suominen  ja

Kaisa Wallenius sekä pro gradu ­työntekijöinä itseni lisäksi Elina Kondo ja Anu Mikkonen.

Omassa pro gradu ­työssäni arvioin erilaisten mikrobiologisten menetelmien soveltuvuutta

öljynhajotusprosessin seurantaan. Elina Kondo vastasi projektin kemiallisista analyyseistä

ja  seurasi  pro  gradu  ­työssään  muun  muassa öljyhiilivetyjen  kokonaismäärien  muutoksia

kokeen  kuluessa  sekä  suoritti  käytetyn  koemaan  maa­analyysit  (Kondo  2006).  Anu

Mikkonen  seurasi  pro  gradu  ­työssään  hajoamisprosessin  aikana  tapahtuvia

mikrobiekologisia muutoksia (Mikkonen 2007).

Haluan kiittää kaikkia tähän projektiin osallistuneita tuesta, jota olen saanut gradutyöni eri

vaiheissa. Erityisesti  haluan  välittää kiitokseni ohjaajalleni  Kaisa  Walleniukselle,  joka on

ollut korvaamaton tuki kaikissa gradutyöni vaiheissa. Anu Mikkosta ja Elina Kondoa halua

kiittää  kaikesta  siitä  vertaistuesta,  jota  he  ovat  tarjonneet  koko  gradutyöni  ajan.  Dosentti

Kristina  Lindströmiä  haluan  kiittää  mahdollisuudesta  työskennellä  hänen

tutkimusryhmässään  sekä  hänen  tarjoamistaan  mahdollisuuksista  osallistua  useisiin  alan

kansainvälisiin  tapaamisiin.  Leena  Suomista  haluan  kiittää  ohjauksesta  ja  arvokkaista

kommenteista gradun kirjoitusvaiheessa. Haluan  lisäksi kiittää Ekokemin stipendirahastoa

sekä  Neste  Oy:n  tutkimussäätiötä,  joiden  rahoitus  mahdollisti  tämän  tutkimusprojektin

toteuttamisen.

4

SisällysluetteloAlkusanat...................................................................................................... 3Kuvaluettelo ................................................................................................. 6Taulukkoluettelo .......................................................................................... 8Johdanto..................................................................................................... 10Kirjallisuuskatsaus .................................................................................... 121. Biologinen öljynhajotus ........................................................................ 12

1.1 Öljyn muodostuminen ja rakenne ...................................................................................13

1.2 Aerobinen öljynhajotus....................................................................................................141.2.1 Alifaattisten öljyhiilivetyjen aerobinen hajotus..........................................................................151.2.2 Aromaattisten hiilivetyjen aerobinen hajotus.............................................................................17

1.3 Anaerobinen öljynhajotus................................................................................................201.3.1 Aromaattisten hiilivetyjen anaerobinen hajotus .........................................................................201.3.2 Alifaattisten hiilivetyjen anaerobinen hajotus............................................................................22

2. Öljyllä saastuneiden maiden puhdistus .............................................. 232.1 Bioremediaatio .................................................................................................................23

2.1.1 Luontainen bioremediaatio .......................................................................................................242.1.2 Biostimulaatio..........................................................................................................................252.1.3 Bioaugmentaatio ......................................................................................................................252.1.4 Ex situ ­menetelmät ..................................................................................................................26

2.2 Fytoremediaatio ...............................................................................................................272.2.1 Ritsoremediaatio ......................................................................................................................28

3. Bioremediaation tutkimusmenetelmät öljyllä saastuneilla maa­alueilla......................................................................................................... 30

3.1 Viljelyyn perustuvat menetelmät.....................................................................................333.1.1 MPN........................................................................................................................................33

3.2 DNA­pohjaiset menetelmät..............................................................................................373.2.1 DNA:n eristys maanäytteistä.....................................................................................................403.2.2 DNA:n pitoisuuden mittaus ......................................................................................................413.2.3 Kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR .........................................................................................43

Kokeellinen osuus ..................................................................................... 464. Tutkimuksen tavoitteet.......................................................................... 465. Materiaalit ja menetelmät ...................................................................... 47

5.1 Kasvihuonekoe .................................................................................................................475.1.1 Koeasetelma.............................................................................................................................475.1.2 Kasvihuonekokeen hoito...........................................................................................................515.1.3 Näytteenotto.............................................................................................................................54

5.2 MPN­menetelmä polttoöljynhajottajille..........................................................................545.2.1 MPN­levyjen valmistus ja inkubointi ........................................................................................555.2.2 MPN­lukumäärän määritys .......................................................................................................565.2.3 MPN­kasvatusten toteutus ........................................................................................................57

5.3 DNA:n eristys maanäytteistä ...........................................................................................59

5

5.4 DNA:n pitoisuuden määritys ...........................................................................................605.4.1 NanoDrop® ND1000 UV­Vis ­spektrofotometrimittaus.............................................................605.4.2 PicoGreen®­mittaus..................................................................................................................61

5.5 NahAc­geenin monistaminen Q­RTm­PCR:llä...............................................................625.5.1 PCR­alukkeet ...........................................................................................................................625.5.2 Standardin valmistaminen PCR­tuotteesta.................................................................................625.5.3 Näytelevyjen valmistus ja ajo ABI 7300­laitteella .....................................................................645.5.4 Standardiplasmidin valmistus ...................................................................................................65

5.6 Kasvihuonekokeesta saatu muu aineisto .........................................................................68

6. Tulokset .................................................................................................. 726.1 Menetelmien testauksen ja optimoinnin tulokset ............................................................72

6.1.1 MPN­menetelmän optimointitulokset........................................................................................726.1.2 NanoDrop®­ ja PicoGreen® ­menetelmien arviointi ...................................................................796.1.3 NahAc­geenin monistuminen kasvihuonekokeen näytteistä .......................................................816.1.4 NahAc­fragmentin siirtyminen plasmidiin .................................................................................84

6.2 Ritsoremediaatioprosessin seuranta................................................................................876.2.1 Kasvien kasvu ..........................................................................................................................876.2.2 Polttoöljynhajottajien MPN­lukumäärien vaihtelu kokeen aikana ..............................................906.2.3 DNA­pitoisuuden vaihtelu kasvihuonekokeen aikana ................................................................91

7. Tulosten tarkastelu ja johtopäätökset ................................................. 937.1 Kasvihuonekokeen ritsoremediaatioprosessin tarkastelu eri menetelmillä ...................93

7.1.1 Kasvien kasvu ..........................................................................................................................937.1.2 Polttoöljynhajottajien MPN­lukumäärien vaihtelu.....................................................................947.1.3 Bakteeribiomassan muutokset DNA:n pitoisuuden perusteella...................................................967.1.4 NahAc­geenin monistuminen ....................................................................................................98

7.2 Käytettyjen menetelmien arviointi ..................................................................................987.2.1 MPN­menetelmä ......................................................................................................................987.2.2 DNA­pitoisuuden mittaus NanoDrop®:illa ..............................................................................1007.2.3 PicoGreen®­mittaus................................................................................................................1007.2.4 Kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR .......................................................................................101

8. Loppupäätelmät ................................................................................... 1039. Lähdeluettelo ....................................................................................... 104Liitteet ....................................................................................................... 112

6

Kuvaluettelo1. Pseudomonas putida Gpo1­kannan OCT­plasmidin koodaama alkaanienhajotusreitti.                                                                                                                      s. 16

2. Prokaryoottien ja eukaryoottien aromaattisten hiilivetyjen aerobisenhajotuksen reittejä.                                                                                      s. 18

3. Pseudomonas stutzeri AN10­kannan kromosomaalisesti koodattu ylempinaftaleenin hajotusreitti.                                                                                                    s. 19

4. Aromaattisten öljyhiilivetyjen anaerobisia hajoamisreittejä.                                        s. 21

5. Tetratsoliumsuolojen rakenne ja elektronien siirtyminen dehydrogenaasiltatetratsoliumsuoloille.                                                                                                         s. 35

6. Kvantitatiivisen reaaliaikaisen PCR:n standardisuoran fluoresessinmuutokset PCR:n aikana.                                                                                                  s. 45

7. Näyteruukkujen kosteuden säätäminen vaa´an avulla.         s. 52

8. Kokeen kolmen eri kerranteen sijainnit kasvihuoneessa.         s. 53

9. Koeviikon 12 näytteenottoruukut.         s. 54

10. MPN­levyjen inkuboinnin aikana käytetyt rasiat.         s. 56

11. NanoDrop® ND1000 UV­Vis –spektrofotometri.         s. 60

12. Näyte NanoDrop® ND1000 UV­Vis –spektrofotometrissä.         s. 61

13. Polttoöljyn pitoisuuden (mg/kg) muutokset kasvillisessa (ÖKR), kasvittomassa(Ö) ja steriilissä (ÖS) öljymaassa 21­viikoisen kasvihuonekokeen aikana.         s. 69

14. Kasvibiomassan tuotto puhtaassa (PKR) ja polttoöljyllä saastutetussa(ÖKR) maassa.         s. 70

15. Koemaan typpipitoisuus (% maan kuivapainosta) kasvillisessa (ÖKR),kasvittomassa (Ö) ja steriilissä (ÖS) öljymaassa viikolta 6 viikolle 21.         s. 71

16. INT­soluhengitysindikaattorin avulla saatujen positiivisten kaivojenlukumäärät näytteenottoviikon 0 MPN­näyte­ ja kontrollilevyillä.         s. 73

17. Positiivisten kaivojen lukumäärät näytteenottoviikon 0 MPN­näyte­ jakontrollilevyillä 1, 2 ja 3 vuorokautta WST­1 lisäyksen jälkeen.         s. 73

18. Näytelevy kahden vuorokauden jälkeen WST­1­ ja INT­reagenssienlisäämisestä (vasemmalla) ja sama levy viikon päästä WST­1­ ja INT­reagenssien lisäämisestä (oikealla).         s. 74

7

19. MPN­tulokset näytteenottoviikoilta 0 ja 3.         s. 76

20. MPN­tulokset näytteenottoviikoilta 6 ja 8.         s. 77

21. Positiivisten kaivojen lukumäärät näytteenottoviikon 8 kasvillisen öljykäsittelyn(ÖKR) MPN­näytelevyllä ja negatiivisella kontrollilevyllä.         s. 78

22. MPN­tulokset viikoilta 12, 16 ja 21.         s. 79

23. NanoDrop®­laitteen antamat spektrit Q­RTm­PCR:ssä käytetylle PCR­tuotteelle(vasemmalla) ja näytteenottoviikon 0 kasvillisen öljykäsittelyn (ÖKR)maa­DNA­uutteelle (oikealla).                               s. 81

24. Näytteenottoviikon 0 saastutetun kasvikäsittelyn (ÖKR) DNA­uutelaimennustenmonistuminen Q­RTm­PCR:llä.                               s. 82

25. Näyte­DNA:n 10­3­laimennuksen, negatiivisen kontrollin sekästandardi­PCR­tuotteen reaktiotuotteiden sulamiskäyrät.         s. 83

26. Näytteenottoviikkojen 0, 3, 8 ja 21 maa­DNA­uutteidenmonistuminen Q­RTm­PCR:llä.         s. 84

27. P. putida G7 –kannasta nah_pitkä­alukkeilla monistetut PCR­tuotteet.         s. 85

28. Kloonauksen onnistumisen tarkistus.         s. 85

29. Klooneista nah_pitkä­alukkeille saadut PCR­tuotteet.         s. 86

30. Kahdesta kloonatusta plasmidista sekä P. putida G7­kannasta nah_pitkä­alukkeilla monistetut PCR­tuotteet ajettuna 2 %:lla agaroosigeelillä.         s. 87

31. Rehuvuohenherneet viikolla 5.         s. 89

32. Näytteenottoviikolla 6 ÖKR­ruukusta harvennettu kasvi.         s. 89

33. Rehuvuohenherneet viikolla 10.         s. 89

34. Kasvihuonekokeen jäljellä olevat ruukut viikolla 13.         s. 89

35. Rehuvuohenherneet viikolla 14.         s. 89

36. Viikon 21 näytteenottoruukut.         s. 89

37. Kasvihuonekokeen MPN­tulokset.         s. 90

38. PicoGreen®­mittauksella saadut keskimääräiset DNA­pitoisuudetkasvihuonekokeen eri käsittelyille kokeen kuluessa.        s. 92

8

Taulukkoluettelo1. Raakaöljyn ensimmäisessä jalostusvaiheessa eli jakotislauksessa saatavat jakeet.     s. 14

2. Öljyllä saastuneiden maiden bioremediaation tutkimusmenetelmiä.                           s. 32

3. Kasvihuonekokeen koeasetelma.         s. 48

4. Näyteruukkujen koostumus.          s.49

5. Kasvihuonekokeessa käytetyn maasekoituksen kivennäisaineksenlajitekoostumus.         s. 50

6. Kasvihuonekokeessa käytetyn maasekoituksen perusominaisuuksia.         s. 50

7. Q­RTm­PCR:ssä käytetyt NAH­alukkeet.         s. 62

8. PCR­reaktioliuoksen koostumus monistettaessa nahAc­geenifragmenttiaP. putida G7­kannasta pesäke­PCR:llä.         s. 63

9. NahAc­geenifragmentin monistamisessa P. putida G7­kannasta käytettypesäke­PCR­ohjelma.         s. 63

10. Maa­DNA­uutteiden sopivan laimennustason määrittämiseenkäytetty Q­RTm­PCR­ohjelma.         s. 65

11. Kloonattavan nahAc­fragmentin monistamiseen suunnitellut alukkeet.         s. 66

12. Ligaatioseoksen koostumus.         s. 67

13. Q­RTm­PCR:n standardina käytetyn PCR­tuotteen NanoDrop® ­mittaustulokset.   s. 80

14. Maa­DNA­uutteiden NanoDrop® ja PicoGreen® ­mittaustulokset sekäNanoDrop® ­laitteen antamat puhtausarvot maa­DNA­uutteille.         s. 80

9

Lyhenneluettelobp Emäspari (Basepair)

BTEX Bentseeni, tolueeni, etyylibentseeni, ksyleenit

DGGE Denaturoiva gradienttigeelieletroforeesi

FISH Fluoresenssi in­situ hybridisaatio

GC­MS Kaasukromatografia­massaspektrometria

HAMBI Helsingin  yliopiston  Soveltavan  kemian  ja  mikrobiologian

laitoksen mikrobikantakokoelma

HUM Hiivauute­mannitoli

INT 2­(p­iodofenyyli)­3(p­nitrofenyyli)­5­fenyylitetratsolium­

kloridi

LH­PCR Pituusheterogenia­polymeraasiketjureaktio

MPN Todennäköisin lukumäärä  (Most probable number)

nt Nukleotidi

PAH Polyaromaattinen hiilivety (Polyaromatic hydrocarbon)

PCR Polymeraasiketjureaktio (Polymerase chain reaction)

PLFA Fosfolipidirasvahappo (Phospholipid fatty acid)

Q­RTm­PCR Kvantitatiivinen reaaliaikainen polymeraasiketjureaktio

(Quantitative real­time polymerase chain reaction)

SIP (Stable isotope probing)

T­RFLP Terminaalisen restriktiofragmentin pituuspolymorfia

WST­1  4­[3­(4­iodofenyyli)­2­(4­nitrofenyyli)­2H­5­tetratsolio]­1,3­

 bentseenidisulfonaatti

X­Gal 5­bromo­4­kloro­3­indolyyli­ ­D­galaktopyranosidi

10

JohdantoViimeisen vuosisadan aikana öljyn  teollinen  tuotanto, kuljetus  ja  jakelu ovat aiheuttaneet

öljyhiilivetyjen  leviämisen  ympäristöön  ja  muodostumisen  merkittäväksi

ympäristöongelmaksi.  Ympäristöministeriön  vuonna  1994  julkaiseman  SAMASE­

kartoituksen  loppuraportin  mukaan  Suomessa  on  yli  20  000  aluetta,  joita  epäillään

saastuneiksi. Näistä  33 % eli  noin 6 000 aluetta on erilaisten polttoaineiden saastuttamia.

Yleisimmiksi  maaperän  saastuttajiksi  todettiin  erilaiset  korjaamot,  romuttamot  ja

huoltoasemat  (Puolanne  ym.  1994).  Koska  näiden  toimialojen  valvonta  on  Suomessa

viimeaikoina huomattavasti  tiukentunut, syntyy uusia pilaantuneita maa­alueita Suomessa

nykyään  pääasiassa  erilaisten  onnettomuuksien  seurauksena  (Salo  2003).  Yleisimpänä

onnettomuustyyppinä  Salo  (2003)  pitää  öljylämmitteisen  omakotitalon  öljysäiliötä

täytettäessä  sattuneita  vahinkoja  ja  laiterikkoja.  Koska  maaperän  saastuneisuus  heikentää

maa­alueiden  käyttökelpoisuutta,  pilaa  pohjavesiä  sekä  voi  aiheuttaa  vaaraa  ihmisten  ja

eläinten  terveydelle,  korostavat  Puolanne  ym.  (1994)  SAMASE­projektin

loppuraportissaan saastuneiden maa­alueiden kunnostustoimien tärkeyttä.

Saastuneita  maa­alueita  voidaan  kunnostaa  erilaisilla  fysikaalisilla  tai  kemiallisilla

menetelmillä, kuten lämpökäsittelyllä tai pesulla, tai erilaisilla biologisilla menetelmillä eli

bioremediaatiolla.  Bioremediaatiomenetelmät  perustuvat  pääasiassa  maaperän  mikrobien

kykyyn  hajottaa  erilaisia  haitta­aineita.  Koska  bioremediaatio  perustuu  biologisiin

prosesseihin,  joihin  vaikuttavat  maaperässä  monet  ympäristötekijät  yhtäaikaisesti,  on

bioremediaation  etenemisen  ennustaminen  usein  hankalaa.  Näin  ollen  tarvitaan  tarkkoja,

monipuolisia  ja  luotettavia  menetelmiä,  joiden  avulla  voidaan  seurata  bioremediaation

etenemistä  maaperässä.  Tässä  tutkimuksessa  asiaa  lähestyttiin  tutkimalla

rehuvuohenherneen  (Galega  orientalis)  juuristossa  tapahtuvaa  ritsomediaatiota

yhdistämällä monia erilaisia mikrobiologisia ja kemiallisia tutkimusmenetelmiä.

Kirjallisuuskatsaukseni  koostuu  kolmesta  erillisestä  aihealueesta.  Ensimmäisessä  osiossa

käsittelen  öljyn  biologista  hajoamista  sekä  hapellisissa  että  hapettomissa  oloissa.  Lisäksi

tarkastelen  muutamia  yleisimpien  öljyn  yhdisteiden  hajotusreittejä,  koska  erityisesti

käytettäessä  DNA­pohjaisia  menetelmiä,  on  tärkeää  tuntea  erilaiset  öljynhajotusreitit  ja

niiden  avainentsyymit.  Toisessa  osiossa  käsittelen  erilaisia  bioremediaatiometelmiä,  joita

on  hyödynnetty  öljyllä  saastuneiden  maiden  puhdistuksessa.  Viimeisessä  osuudessa

11

tarkastelen  erilaisia  bioremediaation  tutkimusmenetelmiä  keskittyen  pääasiassa

mikrobiologisiin menetelmiin.

Kokeellisen  osuuteni  alussa  on  esitetty  2005  vuoden  alussa  perustettu  kasvihuonekoe,

jonka  perustamiseen  sekä  ylläpitoon  osallistuivat  itseni  lisäksi  Elina  Kondo,  Anu

Mikkonen,  Kaisa  Wallenius  ja  Leena  Suominen.  Tämän  jälkeen  kokeellinen  osuuteni

keskittyy MPN­menetelmän, DNA­pitoisuusmittausten sekä reaaliaikaisen kvantitatiivisen

PCR:n  optimointiin  ja  soveltamiseen  kasvihuonekokeen  ritsoremediaatioprosessin

tutkimisessa.

Koska pro gradu ­työni oli osa laajempaa kokonaisuutta, on tulosteni  tarkastelun kannalta

välttämätöntä  esittää  myös  Elina  Kondon  saamia  tuloksia  (Kondo  2006).  Elina  Kondon

tulokset on  esitetty  tämän  pro  gradu  ­tutkielman  materiaalit  ja  menetelmät osion  lopussa

kappaleessa 5.6.

12

Kirjallisuuskatsaus

1. Biologinen öljynhajotusBiologista öljynhajoamista tapahtuu sekä hapellisissa että hapettomissa oloissa. Maaperän

mikrobeista  useiden  bakteeri­  ja  sienisukujen  edustajat  kykenevät  hyödyntämään

öljyhiilivetyjä  energian  ja  hiilenlähteenään.  Myös  muutamien  mikrolevien  on  todettu

pystyvän  öljyhiilivetyjen  hajotukseen  (van  Hamme  ym.  2003).  Atlas  ja  Cernilian  (1995)

mukaan hapellisissa oloissa  merkittävin  maaperän öljyhiilivetyjen  hajotukseen osallistuva

bakteerisuku on  ­proteobakteereihin kuuluva Pseudomonas. Tämän lisäksi öljyhiilivetyjen

hajotukseen  kykeneviä  bakteereita  löytyy  muun  muassa  Burkholderia­,  Sphingomonas­,

Achromobacter­,  Nocardia­,  Mycobacterium­,  Vibrio­ ja  Bacillus­suvuista  (Atlas  ja

Cernilia 1995). Myös sienet ovat hapellisissa oloissa merkittäviä öljyhiilivetyjen hajottajia

ja  niiden  on  arveltu  olevan  maaperässä  joissain  tapauksissa  jopa  bakteereita

merkittävämpiä  hajottajia.  Muiden  muassa  sienisuvuista Candida,  Rhodotorula,

Aureobasidium,  Penicillium,  Aspergillus ja  Fusarium löytyy  öljyhiilivetyjen  hajotukseen

kykeneviä lajeja (Riser­Roberts 1998).

Öljyhiilivetyjen  hajotustehokkuus  on  suuresti  riippuvainen  maaperän  luontaisten

mikrobien  geneettisestä  sopeutumisesta  öljyhiilivetyjen  hajotukseen.  Lisäksi

öljyhiilivetyjen  hajotustehokkuuteen  vaikuttavat  monet  ympäristötekijät,  kuten  maan

rakenne,  orgaanisen  aineksen  määrä,  hapen  ja  ravinteiden  saatavuus,  lämpötila,  pH,

suolapitoisuus  ja vedenaktiivisuus. Nämä  tekijät vaikuttavat  sekä maan mikrobistoon että

öljyhiilivetyjen sitoutumiseen maapartikkeleihin. Huonosti veteen liukenevien yhdisteiden,

kuten  öljyhiilivetyjen,  hajotusta  rajoittaa  merkittävästi  myös  niiden  biosaatavuus.  Jotta

mikrobit pystyvät olemaan metabolisesti aktiivisia, ne vaativat korkean vedenaktiivisuuden.

Tällöin öljyhiilivetyjä hajottavat mikrobit ja heikosti vesiliukoiset öljyhiilivedyt eivät usein

kohtaa toisiaan maaperässä. (Maier 2000)

13

1.1 Öljyn muodostuminen ja rakenne

Öljy  on  muodostunut  meressä  eläneiden  eläinten  ja  kasvien  jäänteistä  noin  50­200

miljoonaa  vuotta  sitten.  Kovassa  paineessa  ja  kuumuudessa  pitkien  aikojen  kuluessa

monimutkaiset  fysikaaliset  ja  kemialliset  reaktiot  muuttivat  kuolleen  eläin­  ja

kasvikudoksen  raakaöljyksi  ja  maakaasuksi.  Sopivat  olosuhteet  merien  pohjiin  syntyivät,

kun  uudemmat  sedimenttikerrostumat  painoivat  alempia  kerrostumia  aiheuttaen  valtavan

paineen.

Raakaöljy  koostuu  pääasiassa  erilaisista  hiilivedyistä,  jotka  voidaan  jakaa

molekyylirakenteen  perusteella  toisaalta  suoriin,  haaroittuneisiin  ja  rengasmaisiin

yhdisteisiin,  toisaalta  tyydyttyneisiin,  tyydyttämättömiin  ja  aromaattisiin  yhdisteisiin.

Raakaöljyn  koostumus  vaihtelee  huomattavasti  eri  esiintymisalueiden  välillä,  mutta

keskimäärin  raakaöljyssä  on  50  %  rengasmaisia  tyydyttyneitä  hiilivetyjä  ja  25  %

avoketjuisia  hiilivetyjä.  Aromaattisten  osuus  on  raakaöljyssä  yleensä  korkeintaan  15  %.

Aromaattiset  hiilivedyt  jaetaan  mono­,  di­  ja  polyaromaatteihin  (PAH),  joista

monoaromaattisissa  yhdisteissä  on  yksi  aromaattinen  rengas,  di­aromaateissa  kaksi  ja

polyaromaateissa  kolme  tai  enemmän.  Vedyn  ja  hiilen  lisäksi  raakaöljy  sisältää  pieniä

määriä  rikkiä,  typpeä  ja  happea  sitoutuneena  orgaanisiin  yhdisteisiin.  Raakaöljyssä  on

myös  pieniä  määriä  metalleja,  joista  merkittävimmät  ovat  vanadiini  ja  nikkeli.  (Aatelo

1995a)

Öljytuotteet  valmistetaan  raakaöljystä  tislaamalla  raakaöljy  jakotislauskolonnissa  (Aatelo

1995b).  Jakotilauskolonni  on  jopa  80  metriä  korkea  uuni,  jossa  yhdisteet  erottuvat

kiehumispisteensä mukaisesti. Uunin yläpäässä lämpötila on 30­40 ºC ja pohjalla noin 400

ºC. Jakotislauksessa raakaöljystä erotetaan seitsemän eri  jaetta. Eri  jakeet kerätään uunista

niin, että kevyin raakaöljyn jae, polttokaasu, kerätään putkiuunin yläpäästä ja öljyn raskain

jae,  josta  valmistetaan  raskaat  polttoöljyt  ja  bitumituotteet,  jää  putkiuunin  pohjalle.

Taulukossa 1 on esitetty jakotislauksessa saatavat jakeet ja lämpötilaväli, jolta kyseinen jae

on kerätty. Jakotislauksen jälkeen jakeita usein jatkokäsitellään muun muassa pilkkomalla

suurimpia öljyhiilivetyjä pienemmiksi molekyyleiksi  ja tislaamalla jakeita uudelleen,  jotta

saadaan haluttuja lopputuotteita.

14

Polttoöljy, jota käytetään muun muassa talojen lämmityksessä, kuuluu kaasuöljyihin ja sen

tislausalue  on  laajimmillaan  170  ºC:sta  390  ºC:een.  Kaasuöljyn  raskaampia  jakeita

käytetään polttoöljyn talvilaadussa ja kevyempiä jakeita kesälaadussa. (Hästbacka 1992)

Taulukko 1. Raakaöljyn ensimmäisessä jalostusvaiheessaeli jakotislauksessa saatavat jakeet. Muokattu Aatelon (1995b)julkaisemasta taulukosta.Jae Tislauksen

alkupiste ºCTislauksen

loppupiste ºCPolttokaasut

Bensiinit 10 150­180

Petrolit 150­180 200­220

Kevyt kaasuöljy 200­220 280­320

Kaasuöljy 280­320 360­400

Raskas kaasuöljy 330­420 470­500

Pohjaöljy 390­420

Öljyn  sisältämien  yhdisteiden  rakenteet  vaikuttavan  monin  tavoin  öljyn  biologiseen

hajoavuuteen.  Öljyhiilivedyistä  suoraketjuiset n­alkaanit  ovat  helpoiten  mikrobien

hajotettavissa (van Hamme ym. 2003). Tämän jälkeen järjestyksessä helpoiten hajotettavia

ovat  haaroittuneet  alkaanit  ja  alkeenit,  alle  neljärenkaiset n­alkyyliaromaatit,

monoaromaatit,  sykliset  alkaanit  ja  polyaromaatit.  Vaikeimmin  hajotettavia  ovat

kompleksiset  rengasrakenteiset  asfalteenit.  Lisäksi  monet  öljyhiilivedyt  voivat  olla

myrkyllisiä  mikrobeille,  mikä  hidastaa  näiden  öljyhiilivetyjen  hajoamista  (Maier  2000).

Maierin (2000) mukaan öljyhiilivetyjen myrkyllisyys perustuu yleensä niiden lipofiiliseen

luonteeseen.  Myrkylliset  öljyhiilivedyt  sitoutuvat  mikrobien  solukalvoon,  jolloin

solukalvon rakenne häiriintyy.

1.2 Aerobinen öljynhajotus

Aerobinen  hajotus vaatii  tapahtuakseen  molekulaarista  happea  ja  voi  tapahtua  näin  ollen

ainoastaan  hapellisissa  oloissa.  Aerobinen  hajotus  on  yleensä  aina  hapettomissa  oloissa

tapahtuvaa  anaerobista  hajotusta  tehokkaampaa.  Aerobinen  hajotus  käynnistyy,  kun

oksygenaasientsyymi  liittää  öljyhiilivetyyn  yhden  tai  kaksi  happiatomia  (Riser­Robets

1998).  Sekä  alifaattisia  että  aromaattisia  yhdisteitä  voidaan  hajottaa  aerobisissa  oloissa.

15

Usein  öljyhiilivetyjen  hajotukseen  kykenevät  mikrobit  ovat  kuitenkin  erikoistuneet  joko

alifaattisten  tai aromaattisten  hiilivetyjen  hajotukseen  ja pystyvät hajottamaan  vain  tietyn

kokoisia aromaattisia tai alifaattisia yhdisteistä. (Whyte ym. 1997)

1.2.1 Alifaattisten öljyhiilivetyjen aerobinen hajotus

Monet  mikrobit  pystyvät  aerobisissa  oloissa  käyttämään  erikokoisia  alkaaneja  hiilen­  ja

energianlähteenään. Alkaanien on  todettu hajoavan aerobisissa oloissa useampaa erilaista

reittiä.  Jopa  samalta  mikrobikannalta  on  löydetty  useita  entsyymejä,  jotka  voivat  toimia

toisistaan riippumatta metaboliareitin samassa vaiheessa (van Hamme ym. 2003).

Perusteellisimmin  tyydyttyneiden  öljyhiilivetyjen  hajoamista  on  tutkittu Pseudomonas

putida  Gpo1­kannalla,  jolla  alkaanien  hajotukseen  vaadittavia  entsyymejä  koodaa  OTC­

plasmidi  (van  Hamme  ym.  2003).  Alkaanien  hajotukseen  osallistuvat  geenit  ovat  OTC­

plasmidissa kahdessa operonissa. Isompi operoneista (alkBFGHJKL) koodaa suurinta osaa

metaboliareitillä  tarvittavista entsyymeistä  (kuva 1). Toinen operoni koodaa geenejä alkT

ja alkS.  Pienemmän  operonin alkT­geeni  koodaa  alkaanien  hajotusreitillä  tarvittavaa

rubredoksiinireduktaasientsyymiä (kuva 1) kun taas AlkS osallistuu hajotusreitin säätelyyn.

Operoneja  luetaan plasmidissa toisiaan kohti  ja niiden 3´­päiden etäisyys toisistaan on 9,7

kiloemästä.  Tällä  9,7  kiloemäksen  välialueella  on  todettu  olevan  vielä  yksi  alkaanien

hajotukseen  osallistuva  geeni, alkN.  AlkN  on  siirtäjäproteiini  (methyl­accepting

transducer),  joka  pystyy  ottamaan  vastaan  metyyliryhmän.  AlkN­proteiinin  tehtävää

alkaanien  hajotuksessa  ei  ole  pystytty  vielä  täysin  selvittämään,  mutta  van  Bailen  ym.

(2001) mukaan sen uskotaan liittyvän alkaanikemotaksikseen.

16

Kuva  1. Pseudomonas  putida  Gpo1­kannan  OCT­plasmidin  koodaama  alkaanienhajotusreitti. Metaboliareitin entsyymit ovat mono­oksygenaasi (AlkB), rubredoksiinit (AlkG jaAlkF),  rubredoksiinireduktaasi  (AlkT),  alkoholidehydrogenaasi  (AlkJ),  aldehydidehydrogenaasi(AlkH)  sekä  asetyyli  koentsyymi­A­syntetaasi  (AlkK).  AlkS  on  metaboliareitin  positiivinensäätelijä.  Proteiinien  AlkL  ja  AlkN  merkitystä  ei  ole  pystytty vielä  täysin  selvittämään. Kuva  onmuokattu van Beilen ym. (2001) julkaisemasta kuvasta.

Kuvassa 1 on esitetty OTC­plasmidin koodaaman alkaanihajotusreitin entsyymien sijainti

solussa. Proteiini AlkB on alkaanimono­oksygenaasi,  joka aloittaa n­alkaanien hajotuksen

liittämällä  yhden  happiatomin  alkaanin  hiilivetyketjun  päähän,  jolloin  muodostuu

primaarinen  alkoholi  (van  Beilen  ym.  1994).  Molekylaarisen  hapen  toinen  happiatomi

muodostaa  kahden  protonin  kanssa  vesimolekyylin.  Tarvittavat  elektronit  reaktioon

saadaan  nikotiiniamidinukleotidiltä  (NADH).  Elektronit  siirtyvät  NADH:ltä  mono­

oksygeenasille (AlkB) rubredoksiinireduktaasin (AlkT) ja rubredoksiinien (AlkF ja AlkG)

kautta (van Beilen ym. 1994).

Alkoholidehydrogenaasi  (AlkJ)  muuttaa primaarisen alkoholin  aldehydiksi,  jonka  jälkeen

proteiini  AlkH  muodostaa aldehydistä karboksyylihapon  (van Beilen  ym. 1994). Lopuksi

AlkK  liittää  hiilivetyketjun  karboksyylipäähän  asetyylikoentsyymiA:n,  minkä  jälkeen

hiilivetyketju  siirtyy  ­oksidaatioon  hajotettavaksi.  ­oksidaatio  ei  vaadi  enää  happea

tapahtuakseen ja voi näin ollen tapahtua myös hapettomissa oloissa.

17

Edellä  esitetystä  P.  putida  Gpo  1  ­kannan  metaboliareitistä  poikkeavilla  alkaanien

hajotusreitteillä  mono­oksygenaasi  voi  olla  esimerkiksi  korvautunut  dioksygenaasilla.

Tällöin  metaboliareittiä  kutsutaan  Finnertyn  reitiksi  (Tani  ym.  2001).  Alkaanien

hajotuksen aloittava  mono­oksygenaasi  voi  myös  liittää happiatomin  hiilivetyketjun  pään

sijasta  keskelle  hiilivetyketjua  (Atlas  ja  Bartha  1998).  Tällöin  muodostuu  sekundaarinen

alkoholi,  joka  muutetaan  ketoni­  ja  asetyyliesterivälituotteiden  kautta  primaariseksi

alkoholiksi ja edelleen asetaattihapoksi.

1.2.2 Aromaattisten hiilivetyjen aerobinen hajotus

Aromaattisten hiilivetyjen hajoaminen maaperässä on yleensä alifaattisten öljyhiilivetyjen

hajoamista huomattavasti hitaampaa. Aromaattisten yhdisteiden hajoamista hidastaa muun

muassa  niiden  heikko  vesiliukoisuus  ja  voimakas  sitoutuminen  maapartikkeleihin  (Maier

2000). Monet mikro­organismit (bakteerit,  sienet ja  levät) pystyvät kuitenkin hajottamaan

aromaattisia  yhdisteitä  (van  Hamme  ym.  2003).  Mitä  vähemmän  aromaattisessa

yhdisteessä  on  renkaita,  sitä  helpommin  se  on  yleensä  mikrobien  hajotettavissa.  Raskain

aromaattinen  yhdiste,  jota  mikro­organismit  tämän  hetkisen  tiedon  mukaan  pystyvät

hyödyntämään ainoana  hiilen­  ja energianlähteenä on nelirenkainen. Tosin viisirenkainen

bentso[a]pyreenin  on  todettu  hajoavan  myös  hitaasti  luonnossa,  mutta  sen  täydellinen

hajotus  vaatii  useiden  mikrobilajien  osallistumista  hajotusprosessiin  (van  Hamme  ym.

2003).

Bakteereilla  aromaattisten  yhdisteiden  hajotuksen  aloittaa  dioksygenaasi,  joka  liittää

bentseenirenkaaseen  kaksi  happiatomia,  jolloin  muodostuu  ensin  epästabiili cis,cis­

dihydroksidioli,  joka  spontaanisti  muuttuu  katekoliksi  (kuva  2).  Tämän  jälkeen

hajotusreaktio etenee organismista riippuen meta­ tai orto­reitti (Smith 1990). Meta­reitillä

katekoli­2,3­dioksygenaasi  avaa  katekolin  aromaattisen  renkaan  renkaaseen  liittyneiden

hydroksyyliryhmien vierestä,  jolloin muodostuu 2­hydroksimukonisemialdehydi (kuva 2).

Orto­reitillä  katekoli­1,2­dioksygenaasi  avaa  katekolin  aromaattisen  renkaan

hydroksyyliryhmien välistä,  jolloin muodostuu cic,cis­mukonihappo (kuva 2). Meta­reitin

lopputuotteina syntyy pyruvaatti ja asetaldehydi ja orto­reitin lopputuotteina sukkinaatti ja

asetyyli­koentsyymiA  (Smith  1990).  Nämä  yhdisteet  bakteeri  pystyy  hyödyntämään

esimerkiksi sitruunahappokierrossaan.

18

Sienien  on  todettu  olevan  maaperässä  merkittäviä  erityisesti  polyaromaattisten

öljyhiilivetyjen  hajottajina.  Kuvassa  2  on  esitetty  myös  sienten  aromaattisten

öljyhiilivetyjen  hajotusreitti,  joka eroaa prokaryoottien hajotusreitistä. Sienillä  hajotuksen

aloittaa sytokromi P450­mono­oksygenaasi. Tämä seuraa entsymaattinen veden lisääminen,

jossa  syntyy trans­dihydrodioleita  ja  fenoleita.  Nämä  yhdisteet  hajoavat  usein  nopeasti

aerobisissa oloissa joko bakteerien tai sienten toimesta. (Cernilia 1997)

Kuva 2. Prokaryoottien ja eukaryoottien aromaattisten hiilivetyjen aerobisenhajotuksen reittejä. Kuva muokattu Scraggin (2005a) julkaisemasta kuvasta.

Naftaleeni  on  niin  kutsuttu  diaromaatti,  joka  koostuu  kahdesta  fuusiotuneesta

bentseenirenkaasta.  Se  on  yksi  myrkyllisimmistä öljyn  vesiliukoisen  fraktion  yhdisteistä

(Riser­Roberts  1998)  ja  tästä  syystä  sen  biologista  hajoamista  on  tutkittu  paljon.  Muun

muassa  katabolisen  plasmidin  NAH7  koodaama  naftaleenin  hajotusreitti  on  jo  pystytty

selvittämään  yksityiskohtaisesti.  Hajotusreittiä  koodaavat  geenit  ovat  ryhmittyneet

19

plasmidiin  kahdeksi  operoniksi.  Toinen  operoneista  koodaa  niin  sanottua  ylempää  reittiä

(eng.  upper  pathway),  ja  toinen  niin  sanottua  alempaa  reittiä  (eng.  lower  pathway).

Ylempää  reittiä  koodaava  operoni  koostuu  geeneistä nahAaAbAcAdBFCED.  Ylemmällä

reitillä naftaleeni  muutetaan  salisylaatiksi  (kuva  3).  Ylemmän  reitin  ja  naftaleenin

hajotuksen  aloittava  entsyymi  on  naftaleenidioksygenaasi.  Se  koostuu  neljästä  eri

alayksiköstä:  naftaleenidioksygenaasisreduktaasista  (NahAa),

naftaleenidioksygenaasiferredoksiinista (NahAb), naftaleenidioksygenaasin Fe­S­proteiinin

isosta  alayksiköstä  (NahAc)  ja  naftaleenidioksygenaasin  Fe­S­proteiinin  pienestä

alayksiköstä  (NahAd)  (Bosch  ym.  1999).  Ylemmän  reitin  jälkeen  salisylaatin  hajotus

jatkuu alemmalla reitillä, jota koodaava operoni koostuu geeneistä nahGTHINLOMKJ (van

Hamme  ym.  2003).  Alemmalla  reitillä  salisylaatti  muutetaan meta­reittiä

sitruunahappokierron välituotteiksi, pyruvaatiksi ja asetaldehydiksi.

Kuva  3. Pseudomonas  tutzeri  AN10­kannan  kromosomaalisesti  koodattu ylempinaftaleenin  hajotusreitti. Kuvan  aineenvaihduntatuotteet  ovat  1)  naftaleeni,  2) cis­naftaleenidihydrodioli, 3) 1,2­dihydroksinafteleeni, 4) 2­hydroksikromene­2­karboksylaatti, 5) cis­o­hydroksibensaalipyruvaatti, 6)  salisyylialdehydi  ja 7)  salisylaatti. Metaboliareitin ensyymit ovatnaftaleenidioksygenaasi  (NahA),  naftaleeni­cis­dihydrodiolidehydrogenaasi  (NahB),  1,2­dihydroksinaftaleenidioksygenaasi  (NahC),  2­hydroksikromene­2­karboksylaattidehydrogenaasi(NahD),  1,2­dihydroksibentsyylipyruvaattialdolaasi  (NahE)  ja  salisyylialdehydidihydrogenaasi(NahF). Kuva muokattu Bosch ym. (1999) julkaisemasta kuvasta.

Naftaleenin  hajotusreitin  geenit  sijaitsevat  yleisesti  katabolisessa  plasmidissa,  mutta  on

löydetty  myös useita kantoja,  joissa  naftaleenin  hajotusreittiä koodaavat geenit  sijaitsevat

bakteerin  genomissa.  Bosch  ym.  (1999)  totesivat Pseudomonas  stutzeri AN10­kannan

kromosomissa  sijaitsevan  ylemmän  naftaleenin  hajotusreitin  olevan  hyvin  samanlainen

kuin  plasmidin  NAH7  koodaama  hajotusreitti  (kuva  3).  Heidän  mielestään  on  hyvin

todennäköistä,  että  koko  ylempi  hajotusreitti  on  siirtynyt  NAH7­kaltaisesta  plasmidista

osaksi P. stutzeri AN10­kannan genomia. Lisäksi Bosch ym. ovat havainneet viitteitä siitä,

että P.  stutzeri AN10­kannalla  olisi  mahdollisesti  rinnakkain  kaksi  erillistä  ylempää

hajotusreittiä. Öljyhiilivetyjen hajotukseen tarvittavien geenien onkin todettu usein olevan

osana  niin  kutsuttuja  liikkuvia  elementtejä  (Tsuda  ym.  1999).  Tästä  johtuen  hyvin

samanlaisia metabolisia reittejä voidaan löytää kaukaista sukua olevilta bakteereilta.

20

1.3 Anaerobinen öljynhajotus

Anaerobista öljyhiilivetyjen hajoamista on tutkittu vasta muutamien vuosikymmenien ajan.

Viimeisen  kymmenen  vuoden  aikana  on  löydetty  useita  anaerobisia  öljyhiilivetyjen

hajotusreittejä monilta eri  bakteerilajien edustajilta  (Heider  ym. 1999). Monia kantoja on

onnistuttu  myös  eristämään  puhdasviljelmiksi.  Kaikissa  tähän  asti  eristetyissä  kannoissa

anaerobinen  öljyhiilivetyjen  hajotus  perustuu  anaerobiseen  soluhengitykseen  eli  vaatii

ulkoisen elektronin vastaanottajan (Heider ym. 1999). Kaikki öljyhiilivetyjen anaerobinen

hajoaminen  maaperässä  ei  kuitenkaan  perustu  anaerobiseen  soluhengitykseen.

Meckenstock  (1999)  on  onnistunut  eristämään  öljyhiilivetyjen  hajotukseen  kykenevän

fermentatiivisen  bakteerikonsortion.  Lisäksi  Heider  ym.  (1999)  esittävät,  että

anoksygeeniset fotosynteettiset bakteerit kykenisivät hajottamaan öljyhiilivetyjä.

Yleisimmin  elektronien  vastaanottajina  anaerobisessa  öljyhiilivetyjen  pelkistyksessä

toimivat  nitraatti,  ferri­rauta,  sulfaatti  ja  vetyioni  (Heider  ym.  1999).  Vetyionin

pelkistykseen  perustuvalla  anaerobisella  soluhengityksellä  voidaan  tuottaa  energiaa

ainoastaan  ympäristöissä,  joissa  reaktion  tuottamaa  vetyä  poistetaan  jatkuvasti.  Sopivan

ympäristön  luovat  metanogeenit,  jotka  kuluttavat  vetyä  tuottaessaan  metaanikaasua

(Heider  ym.  1999).  Eristettyjen  bakteerikantojen  on  osoitettu  pystyvän  hajottamaan

anaerobisissa oloissa  aromaattisista  yhdisteistä bentseeniä,  alkyylibentseenejä, naftaleenia

ja  fenantreenia (van Hamme ym. 2003). Lisäksi alifaattisista alkaaneista  ja alkeeneista 6­

20­hiilisten yhdisteiden on osoitettu hajoavan anaerobisesti (van Hamme ym 2003).

1.3.1 Aromaattisten hiilivetyjen anaerobinen hajotus

Aromaattisten öljyhiilivetyjen on todettu hajoavat anaerobisissa oloissa hyvin monenlaisia

reittejä.  Kuvassa  4  on  esitetty  BTEX  (bentseeni,  tolueeni,  etyylibentseeni  ja  ksyleenit)  ­

yhdisteiden  tällä  hetkellä  tunnettuja  anaerobisia  metaboliareittejä.  Koska  anaerobista

öljyhiilivetyjen  hajotusta  tapahtuu  monenlaisissa  ympäristöissä  erilaisten  elektronien

vastaanottajien  läsnäollessa,  ei  ole  yllättävää,  että  myös  metaboliareitit  poikkeavat

toisistaan (Zhang ja Bennett 2005).

BentsoyylikoentsyymiA  on  yleinen  välituote  BTEX­yhdisteiden  hajotuksessa  (kuva  4).

Seuraava reaktio on pelkistysreaktio, jossa aromaattisesta renkaasta muodostuu alisyklinen

dienoyylikoentsyymiA  (Harwood  ym.  1999).  Reaktiossa  toimiva  entsyymi  on

21

bentsoyylikoentsyymiA  reduktaasi,  joka  on  aromaattisten  yhdisteiden  anaerobisen

hajotuksen  avainentsyymi  (Harwood  ym.  1999).  BentsoyylikoentsyymiA­reduktaasi  ei

vielä  saa  aikaan  aromaattisen  renkaan  aukeamista,  vaan  aromaattisen  renkaan  pelkistystä

seuraa  sarja  tavanomaisia  hydraatio­  ja  dehydrogenaatioreaktioita,  jotka  lopulta  johtavat

alisyklisen  renkaan  hydrolyyttiseen  avaamiseen  (Harwood  ym.  1999).  Yhdestä  moolista

BTEX­yhdistettä  syntyy  täydellisen  anaerobisen  hajoamisen  seurauksena  kolme  moolia

asetyylikoentsyymiA:ta  ja  yksi  mooli  hiilidioksidia  (Zhang  ja  Bennett  2005).

AsetyylikoentsyymiA:n myös anaerobiset bakteerit pystyvät hyödyntämään  ­oksidaatiolla.

Kuva  4.  Aromaattisten  öljyhiilivetyjen  anaerobisia  hajoamisreittejä. Reaktioissatoimivat  entsyymit:  E1)  bentsyylisukkinaattisyntaasi,  E2  ja  E4)  etyylibentsyylisukkinaattisyntaasi,E3)  etyylibentseenidehydrogenaasi  ja  E5)  bentsoyyli­CoA­reduktaasi.  Entsyymien  E1,  E2  ja  E4reaktioihin  merkitty  A­kirjain  on  fumaraatti  (HOOCCH=CHCOOH).  Kuva  muokattu  Zhangin  jaBenettin (2005) julkaisemasta kuvasta.

22

1.3.2 Alifaattisten hiilivetyjen anaerobinen hajotus

Alkaanien  ja  alkeenien  anaerobista  hajotusta  on  tutkittu  aromaattisten  yhdisteiden

hajoamista huomattavasti vähemmän. Tämä johtuu todennäköisesti siitä, että aromaattisten

yhdisteiden  myrkyllisyyden  vuoksi  niistä  ollaan  yhteiskunnallisesti  huomattavasti

kiinnostuneempia (Zhang ja Bennett 2005).

Ensimmäinen  alkaanien  anaerobiseen  hajotukseen  kykenevä  bakteeri,  sulfaatin  pelkistäjä

Hxd3,  eristettiin  vuonna  1991.  Hdx3  pystyy  kasvamaan  anaerobisesti  16­hiilisellä

heksadekaanilla  ja  muilla  pitkäketjuisilla  alkaaneilla  sekä  pystyy  heksadekaanin

täydelliseen  mineralisaatioon  anaerobisissa  oloissa  (Heider  ym.  1999).  Hxd3­kannan

jälkeen  useita  anaerobiseen  alkaanien  hajotukseen  kykeneviä  sulfaatin  pelkistäjiä  sekä

muutamia  nitraatin  pelkistäjiä  on  onnistuttu  eristämään  puhdasviljelmiksi  (Wilkes  ym.

2002). Lisäksi on todettu rautaa pelkistävien sekä metanogeenisten konsortioiden pystyvän

anaerobiseen  alkaanien  hajotukseen  (So  ja  Young  2001).  Alkaanien  hajotuksen

biokemiallista  taustaa  ei  vielä  kovin  hyvin  tunneta.  On  kuitenkin  selvää,  että  myös

anaerobisen alkaanien hajotuksen käynnistäviä reaktioita on useita (Heider ym. 1999).

Wilkes  ym.  (2001)  esittävät  nitraatin  pelkistäjän,  HxN1,  käynnistävän  anaerobisen  n­

heksaanin  hajotuksen  liittämällä  entsymaattisesti  fumaraatin  heksaanin  toiseen  hiileen

muodostaen  1­metyylipentyylisukkinaatin.  Reaktio  on  hyvin  samanlainen  kuin

aromaattisten  yhdisteiden  hajotuksen  yhteydessä  tapahtuva  fumaraatin  liittäminen

aromaattiseen  renkaaseen  (kuva  4).    So  ym.  (2003)  esittävät  puolestaan  sulfaatin

pelkistäjien  aloittavan  anaerobisen  alkaanien  hajotuksen  liittämällä  hiilidioksidin n­

alkaanin kolmanteen hiileen. Tämän jälkeen hiilivetyketju katkaistaan toisen ja kolmannen

hiilen  välistä  niin,  että  kaksi  ensimmäistä  hiiltä  irtoavat  ja  jäljelle  jää  rasvahappo.

Rasvahappo voidaan edelleen hajottaa  ­oksidaatiolla. Tämänhetkinen  tietämys alkaanien

anaerobisesta hajoamisesta on kuitenkin vähäistä.

23

2. Öljyllä saastuneiden maiden puhdistusPerinteisesti  saastuneita  maita  on  käsitelty  erilaisilla  kemiallisilla  ja  fysikaalisilla

puhdistusmenetelmillä. Menetelminä on käytetty muun muassa maa­aineksen pesua,  jossa

saastunut  maaperä  joko  huuhdellaan  paikan  päällä  tai  käsitellään  pesulaitteistossa.

Puhdistus perustuu saastuttavien aineiden siirtämiseen nestefaasiin  ja poistoon pesuveden

mukana. Haitta­aineita voidaan myös poistaa polttamalla tai muilla termisillä käsittelyillä.

Lisäksi  voidaan  käyttää  haitta­aineiden  stabilointia,  jossa  haitta­aineet  sidotaan

fysikaalisilla  tai  kemiallisilla  käsittelyillä  maaperän  rakenteeseen  siten,  että  niiden

kulkeutuminen ympäristöön estyy. (Puolanne ym. 1994)

Kaikki  edellä  mainitut  perinteiset  puhdistusmenetelmät  vaikuttavat  suuresti  maan

rakenteeseen  ja  sen  luonnollisiin  biologisiin  prosesseihin.  Tällä  hetkellä  ollaankin  hyvin

kiinnostuneita  löytämään  ympäristöystävällisempiä  maaperän  puhdistusmenetelmiä

erilaisista  biologisista  menetelmistä.  Biologiset  menetelmät  ovat  perinteisiä  menetelmiä

halvempia  ja  niillä  voidaan  käsitellä  tehokkaammin  matalampia  saastepitoisuuksia.

(Scragg 2005a)

2.1 Bioremediaatio

Bioremediaatiolla  tarkoitetaan  ympäristöön  joutuneiden  haitta­aineiden  poistamista

biologisilla  menetelmillä.  Yleensä  bioremediaatiolla  tarkoitetaan  mikrobien  tai  kasvien

tuottamien  entsyymien  aikaansaamaa  haitta­aineiden  hajoamista,  mutta  bioremediaationa

pidetään myös haitta­aineiden kertymistä kasveihin ja mikrobeihin. Bioremediaation avulla

voidaan  puhdistaa  ympäristöstä  ennen  kaikkea  luonnollisissa  prosesseissa  syntyneitä

haitta­aineita  kuten  öljyä,  mutta  myös  raskasmetalleja  ja  erilaisia  synteettisiä  orgaanisia

yhdisteitä,  kuten  liuottimia,  hyönteis­  ja  kasvimyrkkyjä  sekä  räjähdysaineita.  (Scragg

2005a)

Haitta­aineita  hajottavat  organismit  voivat  joko  hyödyntää  yhdisteitä  hiilen­  ja

energianlähteinä  tai  hajotus  voi  tapahtua  niin  kutsutun  kometabolian  kautta.

Kometaboliassa organismin tuottamat epäspesifiset entsyymit muokkaavat yhdistettä ilman

että  yhdistettä  käytetään  hiilen­  tai  energianlähteenä.  Haitta­aineiden  hajotus  tapahtuu

yleensä  vaiheittain  useiden  entsyymien  peräkkäisen  toiminnan  seurauksena.  Maaperässä

24

tämä  tapahtuu  usein  monien  mikrobien  yhteisvaikutuksen  seurauksena.  Haitta­aineiden

täydellisessä hajoamisessa eli mineralisaatiossa haitta­aineet hajoavat täydellisesti tuottaen

hiilioksidia,  vettä  ja  muita  epäorgaanisia  yhdisteitä.  Jos  maaperän  mikrobipopulaatiosta

puuttuu  jokin  yhdisteen  hajotukseen  vaadittava  entsyymi,  yhdisteen  hajotusprosessi

pysähtyy. Tällä tavoin maaperään voi kertyä hajoamattomia yhdisteitä. (Maier 2000)

Saastuneiden maiden biologista puhdistusta voidaan tehdä sekä paikan päällä  ilman maan

siirtämistä eli in situ tai siirretylle maa­ainekselle eli ex situ. In situ ­menetelmien etuna on,

ettei  se  edellytä  kallista  maamassojen  siirtelyä.  Lisäksi in  situ ­menetelmät  yleensä

häiritsevät hyvin vähän maan luonnollista toimintaa. (Sylvia ym. 2005)

2.1.1 Luontainen bioremediaatio

Yksinkertaisin in situ ­puhdistusmenetelmä on luontainen bioremediaatio, jossa saastuneen

ympäristön  luontaisten  mikrobien  annetaan  hajottaa  ympäristöön  joutuneita  haitta­aineita

ilman  että  prosessiin  mitenkään  vaikutetaan.  Kun  luontaista  bioremediaatiota  käytetään

saastuneen  alueen  puhdistusmenetelmänä,  on  hajoamisen  etenemistä  seurattava  sekä

alueen mahdollisia riskejä kartoitettava. (Sylvia ym. 2005)

Maan  mikrobiyhteisöjen  aineenvaihdunnan  monipuolisuus  ja  kyky  hajottaa  erilaisia

yhdisteitä  on  valtava.  Monet  mikrobiyhteisöt  pystyvät  myös  hajottamaan  monia  niin

kutsuttuja  ksenobiootteja  eli  yhdisteitä  joita  ei  luonnossa  esiinny.  Penet  ym.  (2006)  sekä

Solano­Serena  ym.  (2000) ovat  todenneet  saastuneiden  maiden  mikrobiyhteisöjen  olevan

huomattavasti  tehokkaampia  hajottamaan  kyseisiä  haitta­aineita  kuin  saastumattomien

maiden  mikrobiyhteisöt.  Tästä  he  ovat  päätelleet  maan  mikrobiyhteisöjen  sopeutuvan

erilaisten  haitta­aineiden  hajotukseen.  Sopeutuminen  voi  olla  sekä  hajottajien  määrällistä

lisääntymistä  että  mikrobien  geneettistä  muuntumista  (Solano­Serena  ym.  2000).

Vertaillessaan  öljyhiilivedyillä  saastuneen  ja  saastumattoman  maan  kykyä  hajottaa

bensiinin  yleisimpiä  yhdisteitä  laboratoriossa  Solano­Serena  ym.  (2000)  totesivat

saastuneiden  maiden  mikrobiyhteisön  pystyvän  hajottamaan  sellaisia  öljyhiilivety­

yhdisteitä,  joita  saastumattomien  maiden  mikrobiyhteisöt  eivät  pystyneet  lainkaan

hajottamaan.

25

2.1.2 Biostimulaatio

Vaikka  maaperän  luontaiset  mikrobit  pystyvät  hajottamaan  valtavaa  määrää  erilaisia

yhdisteitä,  luontainen  bioremediaatio  etenee  usein  hyvin  hitaasti  ja  sen  tehostaminen  on

usein  tarpeellista. Vaikuttamalla  hajotusprosessia hidastaviin  tekijöihin, kuten  ravinteiden

tai  hapen  puutteeseen,  voidaan  haitta­aineiden  hajotusta  maaperässä  tehostaa.  Näitä

maaperän  luonnollisen  mikrobiston  aktiivisuuden  lisäämiseen  pyrkiviä  menetelmiä

kutsutaan biostimulaatioksi. (Scragg 2005a)

Biostimulaation  avulla  on  onnistuttu  useissa  tapauksissa  tehostamaan  luontaista

bioremediaatiota. Biostimulaatiota hyödynnettiin laajamittaisesti vuonna 1989, kun Exxon

Valdez­öljytankkeri haaksirikkoutui Alaskan rannikolle (Scragg 2005b). Tällöin 1700 km

rannikkoaluetta  saastui  raakaöljyllä.  Biostimulaatio  toteutettiin  tällöin  lisäämällä

saastuneille maa­alueille fosfori­typpilannoitetta (Scragg 2005b). Öljyhiilivetyjen tiedetään

muuttavan  maaperän  hiili­typpi­  ja  hiili­fosforisuhteita  mikrobeille  epäedullisempaan

suuntaan,  jolloin  parantamalla  näitä  suhteita  voidaan  usein  lisätä  maaperän  mikrobien

aktiivisuutta  (Sylvia  ym.  2005).  Exxon  Valdezin tapauksessa  lannoituksen  vaikutuksia

seurattiin  vertailemalla  lannoitettuja  alueita  kontrollialueisiin,  joita  ei  oltu  lannoittettu

(Lindstrom  ym. 1991). Lannoituksen  todettiin  tehostavan öljyhiilivetyjen hajotusta  silmin

nähtävästi.  Lisäksi  lannoitetuilla  alueilla  mitattiin  korkeampia  öljy­yhdisteiden

mineralisaationopeuksia  ja  todettiin  öljynhajottajien  lukumäärien  olevan  selvästi

korkeampia.  (Lindstrom  ym.  1991)  Lannoituksen  avulla  saastuneiden  maa­alueiden

öljyhiilivetypitoisuudet  onnistuttiin  Exxon  Valdezin  tapauksessa  laskemaan

öljyonnettomuutta edeltäneelle tasolle 3­4 vuodessa (Scragg 2005b).

2.1.3 Bioaugmentaatio

Sen lisäksi, että saastuneen maa­alueen  luontaisten mikrobien hajotustehokkuutta voidaan

parantaa biostimulaation avulla, voidaan hajotusta tehostaa myös lisäämällä haitta­aineiden

hajotukseen  kykeneviä  mikrobeja  ympäristöön.  Tätä  lähestymistapaa  kutsutaan

bioaugmentaatioksi.  Monissa  tapauksissa  lisättyjen  bakteereiden  on  kuitenkin  todettu

häviävän  nopeasti  maaperästä  (Thompson  ym.  2005).  Tämän  nopean  häviämisen  on

päätelty  olevan  seurausta  laboratoriossa  kasvatettujen  mikrobien  heikentyneestä

kilpailukyvystä,  jolloin  ne  maahan  lisättäessä  häviävät  kilpailussa  maaperän  luontaiselle

mikrobistolle.

26

Marquez­Rocha  ym.  (2001)  ovat  keskittyneet  tutkimaan  puhdasviljelmien  sijasta

mikrobikonsortioiden hyödyntämistä bioaugmentaatiossa. Lisäksi sekä Barbeau ym. (1997)

että  Gentry  ym.  (2004)  ovat  tutkineet  aktivoidun  maa­aineksen

hyödyntämismahdollisuuksia  bioaugmentaatiossa.  Maa­aineksen  aktivointi  tapahtuu

bioreaktorissa, jossa maa­ainekseen sekoitetaan tutkittavaa haitta­ainetta. Tämän on todettu

lisäävän  kyseistä  haitta­ainetta  hajottavien  mikrobien  määrää  maa­aineksessa.  Aktivoitu

maa­aines hyödynnetään mikrobiymppinä saastuneella maa­alueella.

Koska haitta­aineiden hajoamiseen  luonnossa vaikuttavat aina monet ympäristötekijät, on

hajotusta  rajoittavat  tekijät  määritettävä  jokaisessa  tapauksessa  erikseen.  Jos  alueella  on

hyvin  vähän  mikrobiaktiivisuutta tai hajotettavat yhdisteet ovat hyvin  hankalasti hajoavia

voi  yhdisteiden  hajotukseen  kykenevien  mikrobiymppien  lisääminen  eli  bioaugmentaatio

tehostaa  hajotusta  (Maier  2000).  Suurimman  osan  haitta­aineista  on  kuitenkin  todettu

hajoavan luontaisten mikrobien toimesta kaikissa ympäristöissä (Maier 2000). Hajotus voi

tosin olla  hidasta. Tällöin on  tärkeää selvittää  mitkä  tekijät  rajoittavat hajotusta  ja  yrittää

vaikuttaa näihin tekijöihin biostimulaation avulla.

2.1.4 Ex situ ­menetelmät

Kun saastuneen maa­aineksen puhdistusta ei voida syystä tai  toisesta tehdä paikan päällä,

voidaan  biologisia  puhdistusmenetelmiä  hyödyntää  myös  siirretylle  maa­ainekselle.

Menetelmiä, joissa maa­ainesta siirretään käsittelyä varten kutsutaan ex situ ­menetelmiksi.

Ex situ ­menetelmissä maa­aines puhdistetaan esimerkiksi bioreaktorissa, kompostoimalla

tai ns. peltokäsittelyllä. Koska maan siirtäminen tuo kustannuksia, ovat ex situ ­menetelmät

aina in  situ ­menetelmiä  kalliimpia.  Tosin  esimerkiksi  bioreaktorissa  maa­aines  voidaan

puhdistaa paljon nopeammin kuin in situ ­menetelmillä. (Sylvia ym. 2005)

Ex situ ­menetelmissä  haitta­aineiden hajotusta  tehostetaan samoilla  menetelmillä kuin in

situ ­menetelmissä.  Pellolle,  bioreaktoriin  ja  kompostiin  luodaan  lannoittamalla

optimaaliset  ravinneolosuhteet.  Bioreaktorissa  taataan  optimaaliset  happiolosuhteet

ilmastamalla;  pellolla  ja kompostissa  sekoittamalla  maa­ainesta.  Lisäksi  voidaan  säädellä

pH:ta,  hapetus­pelkistys­potentiaalia  ja  veden  aktiivisuutta.  Bioreaktorissa  voidaan

säädellä  myös  lämpötilaa.  Olosuhteiden  säätäminen  optimaalisiksi  on  helpointa

bioreaktorissa  ja  hajotustehokkuus  saadaan  bioreaktorissa  korkeammaksi  kuin  muilla

27

menetelmillä (Sylvia ym. 2005). Bioreaktorin käyttö on kuitenkin kallista eikä sillä voida

käsitellä suuria maamassoja yhtäaikaisesti.

Kontrolloiduissa  oloissa,  kuten  bioreaktorissa,  bioaugmentaatiota  on  hyödynnetty

huomattavasti  paremmin  tuloksin  kuin in  situ ­menetelmissä  (Sylvia  ym.  2005).

Bioaugmentaation tulevaisuuden sovellutukset voisivat näin ollen hyvin olla erilaisissa e x

situ ­menetelmissä.  Lisäksi  laboratorio­oloissa  on  tutkittu  geneettisesti  muunneltujen

organismien  hyödyntämistä  öljyhiilivetyjen  hajotuksen  tehostamisessa  (Dua  ym.  2002).

Näitä  geneettisesti  muunneltuja  superhajottajia  voitaisiin  mahdollisesti  tulevaisuudessa

käyttää  bioreaktorin  kaltaisessa  suljetussa  ympäristössä  tapahtuvassa  puhdistuksessa

(Scragg 2005a).

2.2 Fytoremediaatio

Fytoremediaatio  on  bioremediaation  osa­alue,  joka  hyödyntää  kasveja  haitta­aineiden

poistamisessa.  Kasveja  voidaan  hyödyntää  monin  eri  tavoin  ympäristönpuhdistuksessa.

Newman  ja  Renolds  (2004)  ovat  jaotelleet  katsauksessaan  fytoremediaatiomenetelmät

neljään  eri  ryhmään,  joita  ovat  fytodegradaatio,  fytoakkumulaatio,  fytostabilointi  ja

ritsoremediaatio.  Fytodegradaatiossa  kasvit  ottavat  sisäänsä  ympäristömyrkkyjä  ja

hajottavat  niitä  solujensa  sisällä.  Fytoakkumulaatiossa  kasvit  ainoastaan  keräävät

ympäristömyrkkyjä  biomassaansa,  mutta  eivät  hajota  niitä.  Fytostabiloinnissa  kasvien

juuriston  avulla  estetään  haitta­aineita  valumasta  esimerkiksi  vesistöihin  tai  pohjaveteen.

Fytoremediaation  osa­aluetta,  joka  hyödyntää  kasvin  juuriston  mikrobiaktiivisuutta

nostavaa vaikutusta haitta­aineiden hajotuksessa, kutsutaan ritsoremediaatioksi. Erityisesti

ritsoremediaatiota  pidetään  lupaavana  menetelmänä  öljyhiilivetyjen  poistamisessa

maaperästä (Kuiper ym. 2004).

Fytoremediaatio  soveltuu  pintamaiden  matalien  saastepitoisuuksien  käsittelyyn  alueilla,

joilla  ei  ole  kiireellistä  kunnostuksen  tarvetta.  Alkorta  ja  Garbisu  (2001)  pitävät

fytoremediaation  hyvinä puolina sitä,  että  se häiritsee hyvin  vähän  maaperän  luonnollista

toimintaa  ja  on  lisäksi  edullinen  ja  esteettisesti  miellyttävä  menetelmä.  Artikkelissaan  he

kuitenkin korostavat, että ennen fytoremediaation soveltamista saastuneille maa­alueille on

selvitettävä,  etteivät  haitta­aineet  haihdu  kasvien  kautta  ilmakehään  tai  ettei  kasveissa

muodostu  haitta­aineista  vielä  myrkyllisempiä  yhdisteitä  kasvin  metabolian  seurauksena.

28

Jos  kasveihin  kertyy  jotain  myrkyllisiä  yhdisteitä,  on  varmistettava,  etteivät  nämä

myrkylliset yhdisteet siirry ravintoketjussa eteenpäin.

2.2.1 Ritsoremediaatio

Ritsoremediaatiossa  hyödynnetään  kasvin  juuriston  edistävää  vaikutusta  haitta­aineiden

hajotuksessa.  Juuristo  vaikuttaa  monin  tavoin  maan  ominaisuuksiin.  Juuristolla  on

vaikutusta  muun  muassa  maan  hiilidioksidi­,  happi­  ja  vesipitoisuuteen,  happamuuteen,

osmoottiseen  paineeseen  sekä  hapetus­pelkistys­potentiaaliin  (Parrish  ym.  2005).  Lisäksi

mikrobiaktiivisuus  on  huomattavasti  korkeampaa  kasvien  juuristossa  kuin  sitä

ympäröivässä  maassa.  Tämän  havainnon  teki  Hiltner  jo  vuonna  1904.  Samalla  Hiltner

esitti  termin  ritsosfääri,  jonka  hän  määritteli  alueeksi,  jolle  kasvin  juuriston  vaikutus

maaperässä ylettyy. (Kuiper ym. 2004)

Sen  lisäksi,  että  ritsosfäärissä  on  ympäröivää  maata  korkeampi  mikrobitiheys,  on

ritsosfäärin  mikrobiyhteisön  todettu  poikkeavan  huomattavasti  ympäröivän  maan

mikrobiyhteisöistä. Mikrobiyhteisöjen koostumuksen on todettu myös olevan erilainen eri

kasvilajien  juuristossa.  Mikrobiyhteisöjen  rakenteeseen  juuristossa  vaikuttaa  kasvilajin

lisäksi  kasvin  juurieritteiden  koostumus,  juurten  rakenne,  kasvin  ikä  sekä  maan

ominaisuudet.  Gram­negatiivisten  bakteerien,  kuten Pseudomonas­suvun  edustajien  on

todettu olevan vallitsevia ritsosfäärissä. (Kuiper ym. 2004)

Haitta­aineiden  tehostunut  hajotus  ritsosfäärissä  perustuu  pääasiassa  mikrobien

kohonneeseen  lukumäärään  sekä  korkeampaan  metaboliseen  aktiivisuuteen  (Kuiper  ym.

2004).  Tosin  on  esitetty  ainakin  joidenkin  kasvien  juurieritteiden  edistävän  erityisesti

polyaromaattisten  hiilivetyjen  (PAH)  hajotusta  (Parrish  ym.  2005,  Spriggs  ym.  2005).

Parrish  ym.  (2005)  tutkivat  PAH­yhdisteiden  hajoamista  rohtomesikän  (Melilotus

officinalis)  ja  ruokonatan  (Festuca  arundinacea)  juuristossa.  He  totesivat

kasvihuonekokeissaan  erityisesti  rohtomesikän  juuriston  tehostavan  merkittävästi

polyaromaattisten  hiilivetyjen  hajoamista.  Parrish  ym.  uskovat  PAH:ien  tehostuneen

hajotuksen  johtuvan  kasvin  juurisolujen  erittämistä  rengasrakenteisista  yhdisteistä,  jotka

aktivoivat  epäspesifisiä,  rengasrakenteisia  yhdisteitä  hajottavia  entsyymejä.  He  esittävät

näiden entsyymien osallistuvan myös PAH:ien hajotukseen.

29

Useiden  haitta­aineiden  on  todettu  hajoavan  tehokkaammin  usean  kasvilajin  yhteisössä

kuin  monokulttuurissa  (Maila  ym.  2005,  Palmroth  ym.  2002).  Maila  ym.  vertailivat

Brachiaria  serrata  ­kasvin  ja  sormihirssin  (Eleusine  coracana)  vaikutusta  PAH­

yhdisteiden  hajoamiseen  kyseisten  kasvien  monokulttuureissa  sekä  niiden  yhteisössä.

Maila  ym.  totesivat  Brachiarian  ja  sormihirssin  yhteisön  tehostavan  PAH:ien  hajotusta

huomattavasti  enemmän  kuin  kyseisten  kasvien  monokulttuurien.  Monokulttuuriin

verrattuna  usean  kasvilajin  yhteisö  ylläpitää  maassa  monimuotoisempaa  mikrobistoa,  ja

tarjoaa  siten  paremmat  edellytykset  hajottaa  hankalasti  hajoavia  yhdisteitä,  kuten  PAH­

yhdisteitä.

Eri  kasvilajien  kyky  edistää  haitta­aineiden  hajotusta  juuristonsa  avulla  poikkeaa

huomattavasti  toisistaan.  Palmroth  ym.  (2002)  vertailivat  neljän  erilaisen  kasvipeitteen,

männyn  taimiston,  poppelin  taimiston,  ruohokasviyhteisön  ja  palkokasviyhteisön,  kykyä

edistää dieselöljyn hajotusta. He totesivat tutkimuksessaan palkokasvien edistävän selvästi

tehokkaimmin  dieselöljyn  hajotusta.  Ruohokasviyhteisön  ei  puolestaan  todettu

merkittävästi edistävän diesel­öljyn hajotusta.

Lisäksi Palmroth ym. (2002) totesivat kaksivuotisen kokeensa aikana dieselöljyn häviävän

selvästi  nopeammin  maasta  kokeen  toisena  vuonna,  jolloin  dieselöljyä  lisättiin  samaan

maahan  toiseen  kertaan  kokeen  toistamiseksi.  Palmroth  ym.  päättelivät  ritsosfäärin

mikrobiston  sopeutuneen öljynhajotukseen  ja  öljynhajottajien  rikastuneen  maassa kokeen

ensimmäisen vuoden aikana.

Joissain  tapauksissa  kasvien  ei  ole  todettu  edistävän  lainkaan  haitta­aineiden  hajotusta,

vaan  vaikutus  on  voinut  olla  jopa  päinvastainen.  Lalende  ym.  (2003)  seurasivat

kenttäkokeessaan kymmenen kuukauden ajan pyreenin hajoamista italianraiheinän (Lolium

multiflorum)  juuristossa  ja  vertasivat  sitä  kasvittomaan  verrokkimaahan.  He  totesivat

yllätyksekseen  pyreenin  hajoavan  jopa  nopeammin  kasvittomassa  verrokkimaassa  kuin

tutkimuksen  kohteena  olevassa  kasvillisessa  maassa.  Syyksi  tähän  Lalende  ym.  esittävät

kasvien juurten erittämiä orgaanisia yhdisteitä, joita osa pyreenin hajottajista mahdollisesti

käyttää  pyreenin  sijasta  energian­  ja  hiilenlähteinään.  Vaikeasti  hajoavien  yhdisteiden

hajoaminen maaperässä voi näin ollen myös hidastua kasvien läsnäollessa niiden tuottaessa

maaperään helpommin hyödynnettäviä energian­ ja hiilenlähteitä.

30

Toisaalta  hyödynnettäessä  eri kasvilajeja  ja  mahdollisesti hieman erilaisia  olosuhteita, on

todettu  pyreenin  hajotuksen  tehostamisen  olevan  mahdollista  ritsoremediaation  avulla.

Esimerkiksi Chen ym. (2003) ovat omassa tutkimuksessaan todenneet pyreenin hajotuksen

olevan  huomattavasti  tehokkaampaa  sekä  ruohonatan  (Festuca  arundinacea)  että

luutahirssin (Panicum virtacum L.) ritsosfäärissä kuin verrokkina toimivassa kasvittomassa

maassa.

Toimiessaan  ritsoremediaatio  on  edullinen  ja  erittäin  ympäristöystävällinen  menetelmä.

Sen  lisäksi  että  ritsoremediaation  avulla  voidaan  edistää  haitta­aineiden  hajotusta,  kasvit

parantavat  maan  ominaisuuksia  ravitsemalla  ja  ilmastamalla  maata.  Lisäksi  kasveja

voidaan  hyödyntää  saastuneen  maa­alueen  maisemoinnissa.  Ritsoremediaatio  tosin  vaatii

usein usean kasvukauden ennen kuin saadaan näkyviä tuloksia. (Scragg 2005a, Sylvia ym.

2005)

3. Bioremediaation tutkimusmenetelmät

öljyllä saastuneilla maa­alueillaBioremediaatio  perustuu  suurimmalta  osaltaan  mikrobien  kykyyn  hajottaa  haitta­aineita.

Näin  ollen  on  tärkeää  tuntea  bioremediaation  taustalla  olevat  mikrobiologiset  prosessit.

Ensimmäiset  öljynhajotuksen  mikrobiologiaa  koskevat  tutkimukset  hyödynsivät  erilaisia

viljelymenetelmiä,  joiden avulla  rikastettiin öljynhajottajia  tai määritettiin öljynhajottajien

lukumääriä erilaisissa näytteissä (Mills ym. 1978, Walker  ja Colwell 1976). Tällä hetkellä

mikrobiologinen  tutkimus  hyödyntää  enenevässä  määrin  erilaisia  molekyylibiologisia

menetelmiä.  Molekyylibiologiset  menetelmät  perustuvat  solun  molekyylien,  kuten

nukleiinihappojen, proteiinien ja rasvahappojen, tutkimiseen.

Seuraamalla  bioremediaation  mikrobiologisia  tapahtumia,  kuten  hajottajamikrobien

lukumääriä ja aktiivisuutta hajotusprosessin aikana, voidaan saada käsitys bioremediaation

etenemisestä  ja  tehokkuudesta  kunakin  ajankohtana.  Tarkasteltaessa  saastuneen  maa­

alueen  mikrobiyhteisöjä  ja  niissä  tapahtuvia  muutoksia  voidaan  selvittää bioremediaation

mikrobiekologisia vaikutuksia maaperässä.

31

Tutkittaessa  bioremediaatiota  on  mikrobiologisen  tutkimuksen  rinnalla  tarpeellista

kuitenkin  hyödyntää  myös  muita  menetelmiä. Esimerkiksi öljy­yhdisteiden pitoisuuksissa

tapahtuvia  muutoksia  bioremediaatioprosessin  aikana  on  helpointa  seurata  kemiallisilla

menetelmillä (Ivnacev­Tumbas ym. 2004). Muutoksia maaperän myrkyllisyydessä voidaan

seurata  erilaisilla  toksisuustesteillä.  Fernandez  ym.  (2005)  painottavat  artikkelissaan

toksisuustestien  merkitystä  tutkittaessa  saastuneita  maa­alueita  ja  huomauttavat  pelkkien

kemiallisten  menetelmien  antavan  joissain  tapauksissa  virheellisen  kuvan  maaperän

saastuneisuudesta.

Fernandezin  ym.  (2005)  mukaan  toksisuustestien  etu  kemiallisiin  menetelmiin  verrattuna

on,  että  niiden  avulla  voidaan  myös  selvittää  hajoamisprosesseissa  syntyvien  väli­  ja

sivutuotteiden  myrkyllisyyttä  sekä  erilaisten  yhdisteiden  yhteisvaikutusta.  Lisäksi

toksisuustestien  avulla  saadaan  myös  käsitys  maaperän  myrkyllisten  yhdisteiden

biosaatavuudesta,  jota kemiallisilla menetelmillä ei voida selvittää. Fernandez ym.  (2005)

mainitsevat  myös,  että  tutkittaessa  ikääntyneitä  maita,  joissa  myrkylliset  yhdisteet  ovat

sitoutuneet  hyvin  tiukasti  maahan, kemialliset  analyysit  voivat  yliarvioida haitta­aineiden

todellista  riskiä.  Tiukasti  maahan  sitoutunut  myrkyllinen  yhdiste  ei  ole  biosaatavaa  eikä

siten aiheuta välitöntä riskiä maaperän eliöstölle (Fernandez ym. 2005).

Jotta  voidaan  saada  luotettava  ja  kattava  kuva  bioremediaation  etenemisestä  saastuneella

maa­alueella, on järkevää hyödyntää useita seurantamenetelmiä yhtäaikaisesti. Taulukkoon

2 on koottu bioremediaation tutkimuksessa yleisimmin käytettyjä tutkimusmenetelmiä.

Taulukko 2. Öljyllä saastuneiden maiden bioremediaation tutkimusmenetelmiä. Kirjaimet A, B, C ja D edustavat erityyppisiä menetelmiä siten, että Atarkoittaa viljelypohjaisia menetelmiä, B molekyylibiologisia menetelmiä, C kemiallisia menetelmiä ja D ekotoksikologisia menetelmiä.

Tutkimusaihe Menetelmä ViiteMaljaus Walker ja Colwell 1975Viljeltävien öljyhiilivetyjen hajotukseen kykenevien mikrobien

lukumäärän määritys MPN­menetelmä Wrenn ja Venosa 1996

Öljyhiilivetyjen hajotukseen kykenevien mikrobien eristys Maljaus Mills ym. 1978

A

Saastuneen maan mikrobiyhteisön hiilenkäyttöprofiilin muutostenseuraaminen Biolog Hadwin ym. 2006

Valitun geenien kopioluvun määrittäminen maanäytteistä Reaaliaikainen kvantitatiivinen PCR Powell ym. 2006

Valitun mikrobiryhmän edustajien lukumäärän määrittäminen suoraanmaanäytteistä Fluoresenssi in­situ hybridisaatio (FISH) Duteau ym. 1998 ja

Jjemba ym. 2006

Valitun yhdisteen hajotukseen osallistuvien aktiivisten mikrobientutkiminen Stable isotope probing (SIP) Singleton ym. 2005

Rasvahappoanalyysi (PLFA) Hadwin 2006

Denaturoiva gradienttigeelieletroforeesi (DGGE) Koizumi ym. 2002

B

Mikrobiekologisten muutosten seuraaminenTerminaalisen restriktiofragmentin pituuspolymorfia(T­RFLP) Katsivela ym. 2005

Öljyhiilivetyjen pitoisuuksien määrittäminen kaasukromatografia­massaspektrometria (GC­MS)  Ivancev­Tumbas ym. 2004CMaaperän mikrobien öljyhiilivetyjen hajotuspotentiaalin määrittäminen Leimattujen 14C­yhdisteiden mineralisaatio Tuomi ym. 2004

Vibrio fischeri ­valobakteeritesti Juvonen ym. 2000

Kasvien itäminen / biomassan tuotto Fernandez ym. 2005D

Maaperän toksisuuden selvittäminen

Kastematojen elinkykyisyys Fernandez ym. 2005

33

3.1 Viljelyyn perustuvat menetelmät

Öljynhajotukseen kykeneviä mikrobeja on  tutkittu 1900­luvun  alusta  lähtien  (Bushnell  ja

Haas  1941,  Edmonds  ja  Cooney  1966).  1900­luvun  alkupuolella  öljynhajottajamikrobeja

tutkittiin  viljelemällä  niitä  joko nestemäisille  tai  kiinteille  kasvatusalustoille.  Käyttämällä

sopivaa  kasvatusalustaa  ja  olosuhteita  on  onnistuttu  rikastamaan  muun  muassa

maanäytteistä halutunlaisia mikrobeja. Öljynhajottajia tutkittaessa on perinteisesti käytetty

kasvatusalustaa,  jossa  ainoana  hiilenlähteenä  on  jokin  öljyn  yhdiste  (Bushnell  ja  Haas

1941).

Viljelymenetelmien  avulla  pystytään  eristämään  haitta­aineiden  hajotukseen  kykeneviä

mikrobeja  tarkempia  tutkimuksia varten  (Bushnell  ja Haas  1941)  tai  voidaan  esimerkiksi

määrittää  elinkykyisten  mikrobien  lukumäärää  maanäytteistä  (Mills  ym.  1978,  Walker  ja

Colwell 1976) joko maljaamalla tai niin kutsutulla MPN­menetelmällä.

Viljelymenetelmien  suurimpana  rajoituksena  on,  että  niiden  avulla  voidaan  tutkia  vain

hyvin  pientä  osaa  maaperän  kaikista  mikrobeista.  Kirkin  ym.  (2005)  mukaan

tämänhetkisillä  viljelymenetelmillä  pystytään  maaperän  mikrobilajeista  tutkimaan

ainoastaan noin yhtä prosenttia.

3.1.1 MPN

MPN  on  lyhenne  sanoista  most  probable  number  eli  todennäköisin  lukumäärä.

Menetelmän  kehitti  Joseph  Lister  jo  1800­luvun  puolivälissä  heterotrofisen

kokonaisbakteerilukumäärän  määrittämiseen.  MPN­menetelmässä  nestemäistä  näytettä

laimennetaan  kunnes  viimeisimmissä  laimennuksissa  ole  enää  lainkaan  tutkimuksen

kohteena  olevia  mikrobeja.  Tämän  jälkeen  laimennussarja  viljellään  ravintoliemiputkiin.

Mitä  useampia  rinnakkaisia  putkia  käytetään,  sitä  luotettavampi  tulos  saadaan.

Kasvatuksen  jälkeen  lasketaan  samentuneiden  eli  kasvua  sisältävien  putkien  lukumäärät

kullakin  laimennustasolla  ja  arvioidaan  niiden  perusteella  alkuperäisen  näytteen

todennäköisin mikrobilukumäärä eli MPN.

Nykyään  menetelmää  käytetään  myös  monien  spesifisten  mikrobiryhmien,  kuten

öljynhajottajien,  tutkimiseen.  Kun  tutkitaan  öljynhajottajia  MPN­menetelmällä,  käytetään

34

kasvualustana jotain hiiletöntä alustaa, johon lisätään öljyä ainoaksi hiilenlähteeksi. Tällöin

vain öljyä ravinnokseen käyttävät mikrobit kasvavat alustalla.

MPN:ssä oletetaan,  että mikrobit ovat tasaisesti  jakautuneena nestemäisessä näytteessä  ja

että  jokaisen  laimennuksen  rinnakkaiset  näytteet  sisältävät  saman  keskimääräisen

mikrobilukumäärän  (Riser­Roberts  1998).  Tämä  oletus  ei  kuitenkaan  koskaan  täysin

toteudu,  sillä  mikrobit  eivät  koskaan  ole  näytteessä  täysin  tasaisesti  jakautuneina.  Tästä

johtuen  MPN­menetelmä  on  epätarkka  ja  sen  avulla  saadaan  vain  likimääräinen  käsitys

viljeltävien mikrobien lukumäärästä tutkittavissa näytteissä (Riser­Roberts 1998).

MPN­menetelmää  voidaan  käyttää  sekä  prokaryooteille  että  eukaryooteille  ja  kasvatus

voidaan  tehdä  sekä  hapellisissa  että  hapettomissa  oloissa.  Edellytys  on,  että  kasvatuksen

jälkeen mikrobien kasvu voidaan havaita jollain menetelmällä. Mikrobien kasvua on MPN­

menetelmissä  mitattu  muun  muassa  hapon  tuoton  tai  kasvualustan  samentumisen

perusteella  (Riser­Roberts  1998).  Lisäksi  voidaan  hyödyntää  erilaisia

soluhengistysindikaattoreita, jotka osoittavat värireaktiolla metabolisesti aktiivisten solujen

läsnäolon (Riser­Roberts 1998).

Soluhengitysindikaatoreina  MPN­menetelmissä  on  käytetty  esimerkiksi

tetratsoliumsuoloihin  kuuluvia  2­(p­iodofenyyli)­3(p­nitrofenyyli)­5­fenyylitetratsolium­

kloridia  (INT)  (Haines  ym.  1996,  Mosher  ym.  2003)  sekä  4­[3­(4­iodofenyyli)­2­(4­

nitrofenyyli)­2H­5­tetratsolio]­1,3­benseenidisulfonaattia  (WST­1)  (Johnsen  ym.  2002).

Tetratsoliumsuolojen  toiminta  perustuu  siihen,  että  ne  pystyvät  ottamaan  vastaan

elektroneja  solujen  hengitysketjuun  kuuluvalta  dehydrogenaasientsyymiltä  ja  pelkistyvät

tällöin värilliseksi formatsaaniksi (kuva 5). Tetrasoliumsuoloihin kuuluvien INT­ ja WST­

1­yhdisteiden värireaktiot voidaan määrittää silmämääräisesti. Lisäksi käytettäessä WST­1­

reagenssia  voidaan  hyödyntää  myös  sen  muodostaman  formatsaanin  absorptiomaksimia

450 nanometrissä ja lukea tulokset absorptiolukijalla (Johnsen ym. 2002).

35

Kuva 5. Tetratsoliumsuolojen rakenne ja elektronien siirtyminen dehydrogenaasiltatetratsoliumsuoloille. Kuva muokattu Dojindo Molecular Technologies:in sivuilta otetustakuvasta (www.dojindo.com).

Ensimmäiset  MPN­menetelmät  öljynhajottajien  lukumäärien  määrittämiseen  kehitettiin

1970­luvulla (Mills ym. 1978, Walker ja Colwell 1976). Määritykset tehtiin koeputkissa ja

kasvun  määrittäminen  tapahtui  silmämääräisesti  kasvualustan  samentumisen  perusteella.

Vuonna  1990  Brownin  ja  Braddockin  julkaisema  Sheen  Screen  MPN­menetelmä  tehtiin

24­kuoppalevyllä  ja  tällöin  kasvun  havainnointi  ei  enää  perustunut  kasvualustan

samentumisen seuraamiseen. Brownin  ja Braddockin  (1990) menetelmässä kuoppalevyllä

olevien  näytelaimennusten  päälle  ruiskutettiin  ohut  raakaöljykalvo.  Kasvatuksen  jälkeen

positiivisiksi kaivoiksi laskettiin kaivot, joissa pinnalla oleva öljykalvo oli emulgoitunut eli

hajonnut pieniksi pisaroiksi.

Vuonna  1996  sekä  Haines  ym.  että  Wrenn  ja  Venosa  julkaisivat  molemmat  96­

kuoppalevyllä  tehtävän  MPN­menetelmän,  jossa  ensimmäistä  kertaa  hyödynnettiin

öljynhajottajien  lukumäärän  määrittämiseen  tetrasoliumsuoloihin  kuuluvaa

soluhengitysindikaatoria  INT:ä.  Haines  ym.  (1996)  käyttivät  kehittämäänsä  menetelmää

öljynhajottajien kokonaislukumäärän määrittämiseksi. Wrenn ja Venosa (1996) puolestaan

määrittivät  öljynhajottajien  kokonaislukumäärän  lisäksi  ensimmäistä  kertaa  MPN­

menetelmällä myös alkaanien ja aromaattisten öljyhiilivetyjen hajottajien lukumääriä.

Wrenn  ja  Venosa  (1996)  totesivat  tutkimuksissaan,  ettei  soluhengitysindikaattori  INT

sovellu  PAH:in  hajottajien  lukumäärän  määrittämiseen.  He  kuitenkin  huomasivat,  että

PAH­yhdisteiden  hajotessa  muodostuu  keltaruskeita  hajoamistuotteita,  jotka  ovat

silminhavaittavissa  näytekaivojen  pohjalla.  Nämä  kaivot  he  määrittivät  aromaattisten

36

yhdisteiden  hajottajille  kehittämässään  MPN­menetelmässä  positiiviksi  kaivoiksi.

Käytettäessään  INT  ­soluhengitysindikaattoria  öljynhajottajien  kokonaislukumäärän

määrittämiseen Wrenn ja Venosa (1996) havaitsivat muutamia vääriä positiivisia reaktioita.

Myös  Mosher  ym.  (2003)  mainitsevat  artikkelissaan,  että  INT  ­soluhengitysindikaattorin

on todettu jossain tutkimuksissa reagoivan epätoivotusti joidenkin liuottimien kanssa.

Vuonna 2002 Johnsen ym. julkaisivat uuden 96­kuoppalevyllä tehtävän MPN­menetelmän

PAH:in  hajottajien  lukumäärän  määrittämiseen.  Menetelmässä  positiiviset  kaivot

määritetään  silmämääräisen  arvioinnin  sijasta  absorptiolukijalla.  Menetelmä  hyödyntää

tetrasoliumsuoloihin  kuuluvaa  WST­1  ­soluhengitysindikaattoria,  joka  voidaan

pelkistyneen  yhdisteen  vesiliukoisuuden ansiosta  määrittää  myös  absorptiolukijalla.  Näin

ollen  saadaan  yksiselitteiset  tulokset,  jotka  eivät  riipu  tuloksia  lukevasta  henkilöstä.

Johnsen  ym.  (2002)  nimittäin  totesivat,  että  kun  useampi  henkilö  määritti  samoja  INT­

soluhenhditysindikaattorin  avulla  saatuja  tuloksia,  eri  henkilöiden  saamat  tulokset  usein

poikkesivat toisistaan huomattavasti.

Bioremediaatiotutkimuksissa  on  useimmin  hyödynnetty  Wrennin  ja  Venosan  (1996)

kehittämää  INT­soluhengitysindikaattoriin  käyttöön  perustuvaa  MPN­menetelmää  (Kirk

ym.  2005,  Miya  ja  Firestone  2001).  Menetelmän  avulla  on  määritetty

bioremediaatiotutkimuksissa  sekä  öljynhajottajien  kokonaislukumääriä  että  PAH:in

hajottajien  lukumääriä.  Bachoon  ym.  (2001a)  puolestaan  ovat  käyttäneet  omassa

bioremediaatiotutkimuksessaan Brownin  ja  Braddockin  (1990)  kehittämää Sheen  Screen­

menetelmää  öljynhajottajien  kokonaislukumäärän  määrittämiseen.  Myös  joitain  uusia

MPN­menetelmiä  on  kokeiltu  viimeaikaisissa  bioremediaatiotutkimuksissa  (Brakstad  ja

Lødeng 2005).

MPN­menetelmä  on  käyttökelpoinen  silloin  kun  halutaan  seurata  mikrobipopulaatioissa

tapahtuvia  suuria  muutoksia  (Riser­Roberts  1998).  Jotta  saadaan  tarkempi  ja  kattavampi

kuva  maaperän  mikrobistosta, on  viljelyyn  perustuvien  menetelmien  lisäksi  hyvä käyttää

joitain molekyylibiologisia, kuten DNA­pohjaisia, menetelmiä.

37

3.2 DNA­pohjaiset menetelmät

DNA­menetelmien  avulla  tarkasteluun  voidaan  sisällyttää  myös  ne  mikrobilajit,  joita  ei

tämän  hetkisillä  menetelmillä  pystytä  viljelemään.  Käytettäessä  DNA­pohjaisia

menetelmiä  tutkittavia  mikrobeja  ei  tarvitse  viljellä  vaan  DNA  voidaan  uuttaa  suoraan

näytteistä.  DNA:n  eristyksen  jälkeen  tutkittava  kohde  rajataan  valitsemalla  oikeanlaiset

alukkeet tai koettimet haluttujen geenisekvenssien tutkimiseen.

Tärkeintä  hyödynnettäessä  DNA­pohjaisia  menetelmiä  ympäristönäytteille  onkin  valita

käytettävät  alukkeet  huolellisesti.  Alukkeiden  tai  koettimien  suunnittelu  ja  valinta  ei

kuitenkaan aina ole aivan yksinkertaista (Baker ym. 2003). Alukkeiden tulee olla spesifiset

tutkittavalle geenille, mutta toisaalta riittävän degeneroituneet,  jotta niiden avulla voidaan

tutkia  mahdollisimman  laajasti  kyseisen  geenin  esiintymistä  maaperän  mikrobistossa

(Baker  ym.  2003).  Jotta  tarkastelu  pystytään  rajaamaan  tarkasti  haluttuun  kohteeseen,

esimerkiksi  tiettyyn  mikrobilajiin  tai  ­ryhmään,  on  tutkittavasta  geenistä oltava  riittävästi

sekvenssitietoa.

Jos tutkimuskohdetta taas ei haluta rajata tiettyyn ryhmään, vaan sen sijaan halutaan tutkia

maaperän  mikrobiekologiaa  mahdollisimman  laajasti,  on  käytettävä  niin  sanottuja

universaaleja  alukkeita  ja  koettimia,  jotka  teoriassa  ovat  komplementaarisia  kaikkien

maaperän  mikrobien  tietyn  geenin  geenisekvenssiin.  Kuten  Baker  ym.  (2003)  kuitenkin

artikkelissaan  toteavat,  kaikkien  maaperän  mikrobien  geenisekvenssejä  ei  yhdellä

alukeparilla  tai  koettimella  pystytä  kattamaan.  Näin  ollen  kehitettäessä  näitä  ns.

universaaleja  alukkeita,  voidaan  ainoastaan  pyrkiä  kattamaan  mahdollisimman  suuri  osa

maaperän  mikrobiston  geenisekvensseistä.  Kaikkien  maaperän  mikrobien  yhtäaikainen

tutkiminen on mahdotonta (Baker ym. 2003).

Mikrobilukumäärän määrittäminen

DNA­pohjaisista  menetelmistä  muiden  muassa  kvantitatiivista  reaaliaikaista  PCR:ää  (Q­

RTm­PCR), sekä mikroskopointiin perustuvaa FISH (eng. fluorescent in situ hybridization)

­menetelmää  voidaan  käyttää  mikrobilukumäärien  määrittämiseen  maanäytteistä.

Käytettäessä Q­RTm­PCR:ää on maanäytteistä ensin eristettävä DNA. FISH­menetelmässä

eristystä tai rikastusta ei tarvita.

38

Kvantitatiivinen  reaaliaikainen  PCR:ää  (Q­RTm­PCR)  perustuu  valitun  geenin

monistamiseen  näytteistä.  Sitä  on  käytetty  useiden  eri  mikrobiryhmien  edustajien

lukumäärän määrittämiseen maanäytteistä (Henry ym. 2004, Kurola ym. 2005, Labrenz ym.

2004). Muutamissa tutkimuksissa on Q­RTm­PCR:llä määritetty ympäristönäytteistä myös

bakteerien kokonaislukumääriä (Bach ym. 2002, Takahashi ym. 2006). On kuitenkin tärkeä

muistaa, että menetelmällä ei varsinaisesti määritetä mikrobien lukumäärää vaan sen sijaan

valitun geenin kopiolukua (Zhang ja Fang 2006). Tämä on tärkeää huomata, koska tiettyjen

geenien  kopioluku  voi  vaihdella  suuresti  eri  bakteerilajien  välillä.  Esimerkiksi

määritettäessä mikrobien kokonaislukumäärää monistamalla 16S rRNA­geeniä, ongelmana

on, että bakteerien 16S­rRNA­geenikopioluvut vaihtelevat eri bakteerilajien välillä yhdestä

geenikopiosta  jopa  13  kopioon  (Bach  ym.  2002).  Tällöin  näytteen  todellisen

mikrobilukumäärän arvioiminen geenikopioluvun perusteella on todella hankalaa.

Mikroskopointiin  perustuvassa  FISH­menetelmässä  käytetään  kiinnostuksen  kohteena

olevalle mikrobiryhmälle spesifisiä fluoresoivia nukleotidikoettimia, joiden avulla voidaan

tutkittavaan ryhmään kuuluvat mikrobit erottaa fluoresenssimikroskopialla näytteen muista

mikrobeista.  Koska  mikroskopointi  voidaan  tehdä  myös  suoraan  maanäytteistä,

menetelmässä  ei  synny  bakteerien  tai  DNA:n  eristyksestä  johtuvaa  virhettä.  Toisaalta

menetelmä  on  hyvin  työläs  ja  bakteerien  tunnistaminen  maapartikkelien  seasta  voi  olla

hankalaa.

Mikrobiekologian tutkiminen

Kun  halutaan  saada  kokonaiskuva  maaperän  mikrobiekologiasta,  hyödynnetään

tutkimuksissa  usein 16S  rRNA­geeniä  (Baker  ym.  2003).  16S  rRNA­geeni  koodaa

ribosomien  pienempää  alayksikköä  ja  se  löytyy  kaikilta  bakteereilta.  Se  sisältää  sekä

vaihtelevia  että  konservoituneita  alueita.  Kun  halutaan  tutkia  yhtäaikaisesti

mahdollisimman  suurta  osaa  maaperän  mikrobeista,  suunnitellaan  alukkeet

konservoituneelle  alueelle.  Kun  halutaan  tutkia  tiettyä  mikrobiryhmää,  hyödynnetään

puolestaan  vaihtelevia  alueita.  Toinen  vaihtoehto  haluttaessa  rajata  tutkimus  pienempään

mikrobijoukkoon,  on  valita  tutkittavaksi  geeni,  joka  löytyy  vain  kiinnostuksen  kohteena

olevan  ryhmän  mikrobeilta.  Kun  halutaan  tutkia  esimerkiksi  öljynhajotukseen  kykeneviä

mikrobiyhteisöjä, voidaan valita tutkittavaksi jokin öljynhajotukseen osallistuva geeni.

39

Öljyllä saastuneiden maiden mikrobiekologisissa tutkimuksissa on käytetty monia erilaisia

DNA­sormenjälkimenetelmiä,  kuten  denaturoivaa  gradienttigeelielektroforeesia  (DGGE)

(Koizumi  ym.  2002),  terminaalisen  restriktiofragmentin  pituuspolymorfiaa  (T­RFLP)

(Katsivela  ym.  2005)  ja  pituusheterogenia­PCR:ää  (LH­PCR)  (Mills  ym.  2003).  Kaikki

edellä  mainitut  menetelmät  perustuvat  tutkittavan  geenissekvenssin  monistamiseen.

Monistamisen  jälkeen  erilaiset  geenisekvenssit  erotellaan  toisistaan  ja  erilaisten

geenisekvenssien lukumäärä ja esiintyvyys näytteissä määritetään. Edellä mainittuja DNA­

sormenjälkimenetelmiä voidaan hyödyntää tutkittaessa laajasti maaperän mikrobiekologiaa

tai silloin kun halutaan keskittyä tutkimaan vain tiettyä mikrobiryhmää.

Aktiivisten mikrobien tutkiminen

Yksi  tapa  tutkia maanäytteiden aktiivisia mikrobeja on keskittyä RNA:n  tutkimiseen  (Ka

ym.  2001,  Prosser  2002,  Sharma  ym.  2005).  Prosser  (2002)  jakaa  artikkelissaan  RNA:n

tutkimusmenetelmät  kahteen  eri  tapaan.  Ensinnäkin  voidaan  keskittyä  tutkimaan  lähetti­

RNA:ta.  Tällöin  voidaan  selvittää  mitkä  geenit  ovat  aktiivisia  vallitsevissa  olosuhteissa.

Lähetti­RNA:n tutkiminen voi kuitenkin olla hankalaa muun muassa lähetti­RNA:n lyhyen

puoliintumisajan  takia.  Toinen  vaihtoehto  onkin  tutkia  solujen  ribosomaalista  RNA:ta.

Ribosomaalisen  RNA:n  määrä  on  soluissa  moninkertainen  verrattuna  lähetti­RNA:han  ja

tämän takia ribosomaalisen RNA:n eristäminen ja tutkiminen on huomattavasti helpompaa.

Ribosomaalisen  RNA:n  tutkiminen  perustuu  oletukseen,  että  aktiivisissa  mikrobeissa  on

lepotilassa olevia mikrobeja huomattavasti enemmän ribosomeja (Prosser 2002).

SIP  (eng.  stable  isotope  probing)  on  kehitetty  metabolisesti  aktiivisten  mikrobien

tutkimiseen  (Lueders  ym.  2004,  Singelton  ym.  2005).  Menetelmä  perustuu  leimattujen

substraattien käyttöön. Tutkittava yhdiste, esimerkiksi jokin öljyn yhdiste, leimataan hiilen

painavammalla isotoopilla 13C ja tutkittavaa maanäytettä inkuboidaan tämän painavamman

yhdisteen  läsnä  ollessa  (Singelton  ym.  2005).  Tällöin  tutkittavaa  yhdistettä  hajottavien

mikrobien DNA leimautuu muuta DNA:ta painavammaksi, hiilen painavamman isotoopin

liittyessä  metabolian  seurauksena  osaksi  mikrobien  DNA:ta.  Tämä  painavampi  DNA

voidaan DNA:n eristyksen jälkeen erottaa muusta DNA:sta ultrasentrifugoinnilla (Lueders

ym. 2004, Singelton ym. 2005). Tällä tavoin voidaan keskittyä tutkimaan ainoastaan tiettyä

yhdistettä hajottavia mikrobeja.

40

3.2.1 DNA:n eristys maanäytteistä

Sovellettaessa DNA­pohjaisia menetelmiä  ympäristönäytteille  joudutaan usein eristämään

ensin näytteen kokonais­DNA. Frostegård ym. (1999) jakavat artikkelissaan maanäytteiden

DNA:n  eristysmenetelmät  kahteen  eri  tapaan.  Ensinnäkin  DNA  voidaan  eristää  suoraan

maanäytteistä tai vaihtoehtoisesti voidaan maanäytteestä ensin eristää solut, minkä jälkeen

eristetyistä  soluista  tehdään  DNA:n  eristys.  Frostegård  ym.  (1999)  mainitsevat  solujen

eristykseen perustuvien  menetelmien etuna  huomattavasti  puhtaamman  DNA:n  sekä  sen,

että  solunulkoista  DNA:ta  uuttuu  menetelmällä  hyvin  vähän.  Toisaalta  Frostegård  ym.

(1999) mainitsevat, että yleensä DNA:n eristystä varten saadaan eristettyä ainoastaan noin

25­35 % kaikista maanäytteen soluista. Tämä voi  johtaa Frostegårdin ym. (1999) mukaan

vääristyneeseen kuvaan maaperän mikrobiyhteisön rakenteesta. Eri mikrobilajien edustajat

sitoutuvat  eri  tavalla  maapartikkeleihin,  jolloin  tietyn  bakteerilajin  edustajat  uuttuvat

maanäytteistä toisia helpommin.

Maa­DNA:n  eristykseen  tuo  usein  virhettä  myös  se,  että  solujen  hajotusmenetelmät

vaikuttavat  eri  tavalla  eri  tyyppisiin  soluihin.  On  todettu  muun  muassa  että  gram­

positiivisten bakteerien DNA:n vapauttaminen soluista on huomattavasti hankalampaa kuin

gram­negatiivisten  bakteerien  (Frostegård  ym.  1999).  Tämä  johtuu  siitä,  että  gram­

positiivisten bakteerien soluseinä on kestävämpi erilaisille hajotusmenetelmille kuin gram­

negatiivisten bakteerien.

Edustavan DNA­näytteen saamista hankaloittaa  lisäksi  se,  että eri bakteerilajit  jakautuvat

maahan  epätasaisesti.  Grampositiivisten  aktinobakteerien  on  todettu  olevan  valtalajeja

maa­aggregaattien sisällä  ja gramnegatiivisten  ­  ja  ­proteobakteerien  maa­aggregaattien

pinnoilla  (Mummey  ja  Stahl  2004).  Tämän  lisäksi  bakteerit  esiintyvät  maassa  usein

rykelminä. Toisin sanoen maaperän tietyissä kohdissa, ns. hot spoteissa, mikrobiaktiivisuus

voi  olla  moninkertainen  ympärillä  olevaan  maahan  verrattuna.  Bakteerien  epätasainen

jakautuminen maassa on hyvin merkittävää erityisesti koska DNA­uuttoon otetaan yleensä

hyvin  pieni  näyte  (Kirk  ym.  2004).  Sovellettaessa  DNA­pohjaisia  menetelmiä

maanäytteille DNA­uutto on merkittävä virhelähde (Kirk 2004).

41

3.2.2 DNA:n pitoisuuden mittaus

DNA­pitoisuuden määrittäminen on monissa DNA­pohjaisissa menetelmissä välttämätöntä

(Singer  ym.  1997).  Sen  lisäksi  erilaisten  DNA­pitoisuusmittausten  avulla  saadaan  tietoa

muun muassa DNA­uuton onnistumisesta, näytteiden puhtaudesta sekä DNA­molekyylien

hajonneisuudesta. Karkeasti DNA:n pitoisuuden mittausmenetelmät voidaan jakaa kahteen

ryhmään,  spektrofotometrisiin  sekä  fluoresoivia  väriaineita  hyödyntäviin

mittausmenetelmiin.

Spekrofotometrinen mittaus

Helpoin  ja  nopein  menetelmä  DNA­pitoisuuden  määritykseen  on  spektrofotometrinen

mittaus,  joka perustuu DNA:n absorptiomaksimiin 260 nm:ssä. Kokeellisesti on osoitettu,

että kun puhtaan DNA­liuoksen absorptio 260 nm:ssä on 1, vastaa se DNA­konsentraatiota

50  g/ml (Suominen ja Ollikka, 1999).

Spektrofotometrisen  mittauksen  avulla  voidaan  myös  määrittää  DNA­näytteen  puhtautta.

Tämä  tehdään  mittaamalla  DNA­näytteen  absorptiota  260  nm:n  lisäksi  myös

aallonpituuksilla  280  nm  ja  230  nm  (NanoDrop®  Tecnologies  2004).  Näillä

aallonpituuksilla  saatujen  tulosten  avulla  lasketaan  DNA­näytteelle  sen  puhtaudesta

kertovat  suhdeluvut  A260nm/A280nm  sekä  A260nm/A230nm.  Puhtaalle  DNA:lle  suhdeluku

A260nm/A280nm on noin 1,8 ja puhtaalle RNA:lle noin 2,0. Kun A260nm/A280nm ­suhdeluku on

DNA­näytteelle  alle  1,8  ja  RNA­näytteelle  alle  2,0  sisältää  näyte  todennäköisesti  myös

proteiineja,  fenoleja  tai  muita epäpuhtauksia. On  huomattava,  että DNA­näytteessä,  jossa

proteiinikontaminaatio  laskee  A260nm/A280nm ­suhdeluvun  arvoa,  RNA­kontaminaatio

puolestaan  nostaa  tätä.  Näin  ollen  DNA­näytteiden,  joissa  on  sekä  proteiini­  että  RNA­

epäpuhtauksia,  puhtaudesta  on  vaikea  sanoa  mitään    A260nm/A280nm ­suhdeluvun  avulla.

Tällöin  voidaan  turvautua  suhdelukuun  A260nm/A230nm,  jonka  arvo  on  puhtaalle  DNA:lle

noin  1,8­2,2.  Jos  suhdeluvun  arvo  on  näytteelle  merkittävästi  pienempi,  on  DNA­näyte

todennäköisesti epäpuhdas. (Suominen ja Ollikka, 1999)

Perinteisen  spektrofotometrisen  mittauksen  heikkous  on  se  että,  mittaus  vaatii  paljon

DNA:ta,  jota  ei  mittauksen  jälkeen  voida  hyödyntää  muihin  tarkoituksiin.  Nykyään  on

kuitenkin kehitetty myös spektrofotometrejä, joilla DNA­pitoisuden mittaus voidaan tehdä

jopa  1  l:sta  DNA­uutetta.  Tälläinen  laite  on  NanoDrop®  ND1000  UV­Vis  –

42

spektrofotometri  (NanoDrop®  2004).  Laite  pystyy  mittaamaan  kaksijuosteisen  DNA­

pitoisuuksia  yhden  mikrolitran  tilavuudesta  konsentraatioalueella  2  ng/ l  ­  3700  ng/ l

(NanoDrop® 2004).

Tämä  ei  kuitenkaan  poista  spektrofotometrisen  mittauksen  suurinta  ongelmaa.

Spektrofometristä  mittausta  voidaan  nimittäin  soveltaa  luotettavasti  vain  puhtaille  DNA­

uutteille.  Esimerkiksi  maasta  eristetyssä  DNA:ssa  on  niin  paljon  mittausta  häiritseviä

epäpuhtauksia, että saatujen tulosten tarkkuuteen ei voida  luottaa (Kabir ym. 2003). Maa­

DNA­uutteille käytetäänkin usein fluoresoiviin väriaineisiin perustuvia mittausmenetelmiä

(Sandaa ym. 1998).

Fluoresoiviin väriaineisiin perustuva mittaus

Monet  DNA­pitoisuuden  mittausmenetelmät  perustuvat  erilaisten  fluoresoivien  DNA­

värien  käyttöön.  Yleisin  näistä  menetelmistä  on  geelielektroforeesi,  jossa  DNA­näytteet

ajetaan  sähkövirran  avulla  agaroosigeelissä.  Tämän  jälkeen  DNA  saadaan  näkyviin

etidiumbromidin  avulla.  Etidiumbromidi  sitoutuu  DNA:han  ja  fluoresoi  DNA:han

sitoutuneena  kirkkaasti  UV­valossa.  DNA:n  pitoisuus  voidaan  arvioida  geeliltä

silmämääräisesti  vertaamalla  näytejuovien  fluoresenssin  määrää  tunnettuihin  DNA­

standardeihin, jotka ajetaan geelillä näytteiden kanssa. Menetelmän etuna on, että proteiinit

ja  pienet  määrät  RNA:ta  eivät  häiritse  määritystä.  Lisäksi  geelielektroforeesin  avulla

voidaan  määrittää  myös  DNA­molekyylien  kokoa,  jota  ei  spektrofotometrisellä

mittauksella  voida  tehdä.  Geelielektroforeesimenetelmä  on  kuitenkin  hyvin  epätarkka,

koska  se  perustuu  vain  silmämääräiseen  määritykseen,  eikä  se  sovellu  matalille  DNA­

pitoisuuksille (Suominen ja Ollikka 1999).

Tarkimpiin  mittaustuloksiin  päästään  mitattaessa  DNA:han  sitoutuvien  väriaineiden

fluoresenssia  fluoresenssin  intensiteettiä  mittaavilla  laitteilla  eli  fluorometreillä.  Tällöin

fluoresenssin  voimakkuus  voidaan  muuttaa  DNA­pitoisuudeksi  standardisuoran  avulla.

Yksi  DNA­pitoisuuden  fluorometrisissä  mittauksissa  yleisesti  käytetty  väriaine  on

PicoGreen®  (Molecular  Probes® 2003,  Sandaa  ym.  1998).  Käytettäessä  PicoGreen® :iä

voidaan fluorometrisesti määrittää DNA­pitoisuuksia 25 pikogrammasta 1 mikrogrammaan

millilitrassa  (Sandaa  ym.  1998).  Fluorometristä  riippuen  myös  fluorometrinen  mittaus

voidaan suorittaa jopa yhden mikrolitran tilavuudesta (NanoDrop® 2004).

43

3.2.3 Kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR

Kvantitatiivinen  reaaliaikainen  PCR  (Q­RTm­PCR)  on  kehitetty  geenilukumäärien

määrittämiseen  DNA­näytteistä.  Kvantitatiivinen  reaaliaikainen  PCR  eroaa  tavallisesta

PCR:stä  merkittävimmin  siinä,  että  Q­RTm­PCR:ssä  syntyvän  PCR­tuotteen  määrää

seurataan  reaaliaikaisesti  jokaisen  syklin  jälkeen  (Zhang  ja  Fang  2006).  Q­RTm­PCR:n

edellytyksenä  onkin,  että  PCR­tuotteen  kertymistä  pystytään  seuraamaan  PCR­reaktion

aikana. PCR­reaktion aikana tapahtuvassa detektiossa hyödynnetään Q­RTm­PCR:ssä joko

kaksijuosteiseen  DNA:han  sitoutuvia  fluoresoivia  väriaineita,  kuten  SYBR®Green:iä,  tai

fluoresoivia koettimia, kuten TaqMan­koettimia (Mackay ym. 2002).

Fluoresoiva  väriaine  SYBR®Green  sitoutuu  PCR:n  synteesivaiheen  jälkeen  syntyneisiin

PCR­tuotteisiin  (Zhang  ja  Fang  2006).  SYBR®Green  fluoresenssi  voimistuu  200­

kertaiseksi  sen  sitoutuessa  kaksijuosteiseen  DNA:han.  PCR­laite  mittaa  automaattisesti

SYBR®Green:in  lähettämän  fluoresenssin  intensiteetin  joka  syklin  jälkeen.

Denaturaatiovaiheessa  SYBR®Green  taas  irtoaa  DNA:sta  ja  PCR­reaktio  voi  jatkua

normaalisti.

Zhang ja Fang (2006) mainitsevat SYBR®Green­menetelmän hyviksi puoliksi menetemän

yksinkertaisuuden  ja  sen  että  se  ei  vaadi  koettimien  suunnittelua.  SYBR®Green:iin

perustuvan  detektion  heikkous  on  Zhangin  ja  Fangin  (2006)  mukaan  sen  epäspesifisyys.

SYBR®Green­väriaine nimittäin kiinnittyy  täysin  epäpesifisesti kaikkeen kaksijuosteiseen

DNA:han. Näin ollen SYBR®Green detektoi myös PCR­reaktiossa mahdollisesti syntyvät

epäspesifiset tuotteet.

PCR­reaktiossa  mahdollisesti  syntyvien  epäspesifisten  tuotteiden  tunnistamiseksi  on

kehitetty  niin  sanottu  sulamiskäyräanalyysi  (Mackay  ym.  2002).  PCR­ajon  jälkeen

suoritettavan  sulamiskäyräanalyysin  avulla  määritetään  saatujen  PCR­tuotteiden

sulamispiste  ja  verrataan  sitä  oikean  tuotteen  tunnettuun  sulamispisteeseen.

Sulamiskäyräanalyysin  perusteella  voidaan  siis  päätellä  onko  saatu  monistettua  oikeaa

tuotetta.

TaqMan­koettimeen  perustuvassa  detektiossa  puolestaan  käytetään  monistettavalle  PCR­

tuotteelle  spesifisiä  koettimia,  jolloin  detektio  on  huomattavasti  spesifisempää  kuin

44

SYBR®Green­menetelmässä  (Mackay  ym.  2002).  TaqMan­koettimen  toiseen  päähän  on

liitetty  fluoresoiva  leima  ja  toiseen  päähän  ns.  vaimennin  (eng.  quencher).  Vaimennin

himmentää  fluoresoivan  leiman  lähettämää  fluoresenssia  ollessaan  kiinni  leimatussa

koettimessa  (Mackay  ym.  2002).  PCR­reaktiossa  koetin  kiinnittyy  syntyneisiin  DNA­

juosteisiin  denaturaation  jälkeisessä  kiinnittymisvaiheessa.  Synteesin  aikana  Taq­

polymeraasi  katkaisee  DNA­juosteisiin  sitoutuneen  koettimen  niin  että  fluoresoiva  leima

irtoaa  koettimen  toisessa  päässä  olevasta  vaimentimesta.  Tällöin  fluoresoiva  leima  alkaa

fluoresoida  voimakkaasti.  Jokaisen  syklin  synteesivaiheen  jälkeen  fluoresoivien  leimojen

lähettämä fluoresenssi mitataan.

Jotta  PCR­näytteiden  lähettämät  fluoresenssit  voidaan  Q­RTm­PCR:ssä  muuttaa

geenijuosteiden  lukumääriksi,  on  jokaisessa  ajossa  näytteiden  lisäksi  ajettava  myös

standardisarja.  Standardisarja  valmistetaan  referenssimikrobin  DNA:sta,  jonka  DNA­

pitoisuus  on  määritetty  spektrofotometrisesti.  Standardi­DNA:na  voidaan  käyttää

esimerkiksi  PCR­tuotetta  (Kabir  ym.  2003),  plasmidia  (Henry  ym.  2004)  tai  genomista

DNA:ta  (Filion  ym.  2003).  Standardien  geenikopioluku  määritetään  ennen  PCR­ajoa

mittaamalla  standardi­DNA:n  pitoisuus  ja  laskemalla  sen  avulla  standardin  sisältämien

tutkittavien geenien kopiolukumäärä.

Koska  standardisuoran  geenikopioluvut  tunnetaan,  voidaan  näytteiden

geenikopiolukumäärä  määrittää standardisuoran avulla. Näytteiden  ja  standardien  vertailu

perustuu  ns.  kynnyssyklin  (threshold  cycle)  määrittämiseen  jokaiselle  näytteelle  sekä

standardeille (Zhang  ja Fang 2006). Näytteen kynnyssykli on se PCR­reaktion sykli,  jolla

näytteen  fluoresenssi  ylittää  valitun  kynnysarvon  (threshold)  (Zhang  ja  Fang  2006).

Fluoresenssin kynnysarvo,  jonka perusteella kynnyssykli  määräytyy,  valitaan niin,  että se

asettuu PCR­tuotteen monistumisen logaritmisen vaiheen alkuun (kuva 6). Jokainen näyte

siis  ylittää  fluoresenssin  kynnysarvon  eri  syklillä,  riippuen  kopioitavan  geenin

alkuperäisestä  kopioluvusta  näytteessä.  Mitä  suurempi  näytteen  kopioluku  on  sitä,

aiemmin näyte saavuttaa fluoresenssin kynnysarvon.

45

Kuva 6. Kvantitatiivisen reaaliaikaisen PCR:n standardisuoran  fluoresessinmuutokset PCR:n aikana. Kynnyssykli (Ct) määräytyy valitun fluoresenssin intensiteetinkynnysarvon perusteella. Kuva muokattu Zhangin ja Fangin (2006) julkaisemasta kuvasta.

Ympäristönäytteet  asettavat  useita  haasteita  Q­RTm­PCR:lle.  Zhang  ja  Fang  (2006)

esittävät  artikkelissaan  yhtenä  suurena  ongelmana  maasta  eristettyjen  DNA­uutteiden

sisältämät  epäpuhtaudet,  kuten  humushapot,  jotka  usein  alentavat  merkittävästi  PCR­

reaktion  tehokkuutta.  Tämä  aiheuttaa  ongelmia  ympäristönäytteiden  geenikopioluvun

määrittämisessä  standardisuoran  avulla.  Standardisuoran  käyttö  geenikopioluvun

määrittämisessä nimittäin edellyttää, että näytteiden  ja standardien PCR­tehokkuudet ovat

yhtä  suuret.  Tämä  ei  kuitenkaan  toteudu  käytettäessä  epäpuhtaille  maa­DNA­uutteille

standardeina puhdasviljelmästä eristettyä puhdasta DNA:ta (Zhang ja Fang 2006).

Lisäksi alukkeiden  ja koettimien suunnittelu ympäristönäytteille on usein hyvin hankalaa,

koska  vain  hyvin  pieni  osa  maaperän  mikrobien  sekvensseistä  tunnetaan.  Myös

kvantitatiivisessa  reaaliaikaisessa  PCR:ssä,  kuten  muissakin  DNA­pohjaisissa

menetelmissä, on riskinä sekä epäspesifisten tuotteiden monistuminen valituilla alukkeilla

sekä se, ettei valittujen alukkeiden avulla saada monistettua kaikkia tutkimuksen kohteena

olevan mikrobiryhmän geenisekvenssejä (Kurola ym. 2005).

46

Kokeellinen osuus

4. Tutkimuksen tavoitteetGradutyöni  oli  osa  laajempaa  tutkimusta,  jonka  tavoitteena  oli  tarkastella

rehuvuohenherneen  käyttöä  ja  soveltuvuutta  polttoöljyllä  saastuneen  maan  biologiseen

puhdistukseen.  Tutkimus  suoritettiin  kasvihuoneessa  21­viikkoisena  astiakokeena.  Oma

osuuteni  oli  kasvihuonekokeen  mikrobiologisten  muutosten  seuranta  MPN­menetelmän,

DNA­pitoisuusmittausten ja kvantitatiivisen reaaliaikaisen PCR:n avulla.

Gradutyöni keskeiset tavoitteet olivat:

1) optimoida MPN­menetelmä polttoöljynhajottajien lukumäärän määrittämiseen,

2) selvittää MPN­menetelmällä kasvin vaikutusta öljynhajottajien lukumääriin polttoöljyllä

saastutetussa maassa,

3)  vertailla  kahden  DNA­pitoisuuden  määritysmenetelmän  soveltuvuutta  maasta

eristetyille DNA­uutteille,

4) tarkastella DNA­pitoisuuden muutoksia eri käsittelyissä kokeen aikana,

5)  määrittää  naftaleenin  hajottajien  lukumäärissä  tapahtuvia  muutoksia  kokeen  aikana

kvantitoimalla nahAc­geenin lukumääriä kvantitatiivisella reaaliaikaisella PCR:llä ja

6)  arvioida  saatujen  tulosten  perusteella  rehuvuohenherneen  vaikutusta

öljynhajotusprosessiin.

47

5. Materiaalit ja menetelmät

5.1 Kasvihuonekoe

5.1.1 Koeasetelma

Kasvihuonekoe perustettiin vuoden 2005 helmikuussa Viikin tiedepuiston kasvihuoneelle.

Kokeen käsittelyt olivat:

1) polttoöljyllä saastutettu maa, johon kylvettiin vuohenhernettä,

2) polttoöljyllä saastutettu maa ilman vuohenhernettä,

3) saastuttamaton maa, johon kylvettiin vuohenhernettä sekä

4) steriloitu polttoöljyllä saastutettu maa ilman vuohenhernettä.

Koe  koostui  yhteensä  120  näyteruukusta.  Näyteruukkuina  käytettiin  2  litran  muovisia

kukkaruukkuja  savisilla  aluslautasilla  (Pirilän  Kukkatalo  Oy,  Tuusula).  Jokaisesta

käsittelystä oli kolme rinnakkaista  ruukkua kutakin näytteenottoajankohtaa varten,  jolloin

kaksitoista  ruukkua  poistui  kokeesta  jokaisessa  näytteenotossa.  Koeasetelma  on  esitetty

kokonaisuudessaan taulukossa 3.

48

Taulukko 3. Kasvihuonekokeen koeasetelma

1Nesteen kevyt polttoöljy, pitoisuus valmiissa koemaassa 3000 ppm (paino / kuivapaino)2Rhizobium galegae lisättiin vuohenherneen siemenien pinnalle kylvön yhteydessä symbionttisen typensidonnan aikaansaamiseksi3 Steriloituja öljymaa ruukkuja hyödynnettiin vain kemiallisissa analyyseissä, joihin otettiin näytteitä viikoilla 0, 1, 3, 6, 12 ja 214Näytteenottoviikot on laskettu viikkoina kokeen aloittamisesta.5Jokaisesta käsittelystä tehtiin kolme ylimääräistä ruukkua6Jokaisesta käsittelystä tehtiin kolme rinnakkaista ruukkua jokaista näytteenottoa varten

  Näytteenottoviikot4

0  1  2  3  4  6  8  12  16  21  E5

Käsittely Lyhenne  Tutkimuskohde Näytteenottoon varattujen ruukkujen lukumäärä6  Yhteensä

Öljymaa1, kasvija R. galegae2 ÖKR

Kasvin juuriston vaikutus öljylläsaastuneen maan mikrobistoon ja öljynhajoamiseen

3  3  3  3  3  3  3  3  3  3  3 33

Öljymaa ÖÖljyllä saastuneen maan mikrobistonkehitys ja öljyn hajoaminen ilmanjuuriston vaikutusta

3  3  3  3  3  3  3  3  3  3  3 33

Puhdas maa,kasvi ja R.galegae

PKR Vuohenherneen kasvu ja ritsosfäärinmikrobisto saastuttamattomassa maassa 3  3  3  3  3  3  3   3  3  3  3 33

Steriloituöljymaa3 ÖS Fysikaalis­kemiallisen hajoamisen

osuus öljynhajoamisesta3  3 3 3 3    3  3 21

120

49

Koemaa  oli  seos  Juvan  Partalan  hietamaata  (73  %),  Viikin  peltomaata  (4  %)  ja

Hiekkatuote­hiekkaa  (Optiroc)  (23 %).  Hiekan  raekoko  oli  0,5­1,2  mm.  Lisäksi  kaikkiin

ruukkuihin  lisättiin Puutarhan Ystävä LUOMU perusvoima­  lannoitetta (NPK 0­5­3 + Ca

17,  Mg  6,  Kemira  Agro  Oy)  viisi  millilitraa.  Ennen  koemaan  sekoittamista  ja

näyteruukkujen  kokoamista  hieta­  ja  multamaa  seulottiin  4  mm  seulan  läpi.  Hietamaan

seulonta  tehtiin  noin  kolme  viikkoa  ja  Viikin  maan  yhtä  viikkoa  ennen  näyteruukkujen

kokoamista.  Hietamaa  kasteltiin  30  %:iin  sen  vedenpidätyskyvystä  yhtä  viikkoa  ennen

kokeen perustamista.

Kaikkien käsittelyjen näyteruukkujen koostumukset on esitetty taulukossa 4. Näyteruukut

koottiin jokainen erikseen, jotta voitiin varmistaa rinnakkaisten ruukkujen mahdollisimman

yhdenmukainen  koostumus.  Sekoitus  tehtiin  käsin  metallisen  kulhon  pohjalla  käyttäen

muovisia  kauhoja  ja  metallilusikoita.  Sekoitusvälineet  puhdistettiin  jokaisen  ruukun

käsittelyn  välissä.  Ennen  koemaiden  lisäämistä  ruukkuihin,  ruukkujen  pohjalle  laitettiin

peiteharsoa  (Tarhatuote)  ja  n.  4  dl  kevytsoraa  (Leca  Kevytsora  KS410,  Optiroc  tai

Kevytsora,  Kekkilä  Oyj,  Parkano).  Taulukoissa  5  ja  6  on  esitetty  valmiin  koemaan

lajitekoostumus  ja  perusominaisuuksia.  Valmis koemaa oli  vähätyppistä  hietamaata,  joka

sisälsi niukasti orgaanista ainesta (Kondo 2006).

Taulukko 4. Näyteruukkujen koostumus. ÖKR on öljyllä saastutettu maa kasvilla, Ö öljylläsaastutettu  maa  ilman  kasvia,  ÖS  öljyllä  saastutettu  steriloitu  maa  ja  PKR  saastuttamaton  maakasvilla.

Lisäys/ruukku  Prosenttiosuus(%)

Käsittely

Juvan hietamaa 920 g1 (1 litra) 73

Viikin peltomaa56 g1 (½ dl) 4

Hiekkatuote­hiekka

n. 280 g (2 dl) 23

Perusvoima –lannoite 5 ml

Kaikissa käsittelyissä(PKR, ÖKR, Ö, ÖS)

Polttoöljy1 3,62 ml2            Öljykäsittelyissä (ÖKR, Ö, ÖS)1Painot ilmoitettu maan tuorepainona1Kevyt polttoöljy, kesälaatu (Neste), tarkat kemialliset tiedot liitteessä 12Vastaa öljynpitoisuutta 3000 ppm (paino/kuivapaino)

50

Taulukko 5. Kasvihuonekokeessa käytetynmaasekoituksen kivennäisaineksen lajitekoostumus.(Kondo 2006)

Lajite Osuus (%)

Sora 0

Karkea hiekka 20

Hieno hiekka 11

Karkea hieta 17

Hieno hieta 35

Karkea hiesu 9

Hieno hiesu 3

Saves 6

Taulukko 6. Kasvihuonekokeessa käytetynmaasekoituksen perusominaisuuksia. (Kondo 2006)

Hehkutuskevennys 4,8

C (%) 1,8

N (%) 0,1

pHCaCl2 5,4

Kakapo [(cmol(+)kg­1] 7,3

KVKef [cmol(+)kg­1] 6,4

Feox (mg kg­1) 6100

Alox (mg kg­1) 400

Saastuttamattoman  maan  (PKR)  ruukkuja  tehtäessä  kaikki  taulukossa  4  esitetyt  ainesosat

sekoitettiin  yhtäaikaisesti  samassa astiassa. Öljymaaruukkuja  (ÖKR, Ö  ja ÖS) koottaessa

sekoitettiin  ensin  polttoöljy  ja  hiekka  keskenään,  minkä  jälkeen  tämä  seos  sekoitettiin

hietamaan,  multamaan  ja  lannoitteen  seokseen.  Näin  yritettiin  välttää  polttoöljyn

epätasainen  jakautuminen  valmiissa  koemaassa.  Steriilikontrollit  (ÖS)  valmistettiin

51

lisäämällä veteen  liuotettu hopeanitraatti (AgNO3) valmiisiin öljymaaruukkuihin pinnalle,

niin että koemaan  lopullinen hopeanitraattipitoisuus steriilikontrolleissa oli 0,3 % (paino /

tuorepaino).

Näytemaiden  annettiin  tasapainottua  neljä  vuorokautta  ennen  kylvöä  ja  ensimmäistä

näytteenottoa.  Kylvöä  varten  kaikkiin  ruukkuihin  lisättiin  noin  yhden  cm:n  kerros

saastuttamatonta  koemaata  (ilman  lannoitetta)  ns.  itämiskerrokseksi.  Kaikki  ruukut

punnittiin ja punnitustulos merkittiin jokaisen ruukun kylkeen. PKR­ ja ÖKR käsittelyiden

ruukkuihin  kylvettiin  pinnalle  20  kpl  vuohenherneen  siemeniä  (Naturcom  Oy,  Ruukki).

Siemenet  siirrostettiin  symbioottisen  typensidonnan  aikaansaamiseksi  ruiskuttamalla

HUM­liemessä  (liite  3)  kasvanutta Rhizobium  galegae  HAMBI  540  ­bakteeriviljelmää

siementen pinnalle kylvön yhteydessä.

Viikon  kuluttua  ensimmäisestä  kylvöstä  kylvettiin  jokaiseen  kasvilliseen  purkkiin  5

siementä  lisää  kasvun  varmistamiseksi.  Tällä  kertaa  siemenet  laitettiin  n.  0,5  cm:n

syvyiseen kuoppaan, joka peitettiin ohuella maakerroksella.

5.1.2 Kasvihuonekokeen hoito

Kasvihuoneen lämpötila­asetukset olivat vuorokausittain 12 tuntia 20 ºC ja 12 tuntia 15 ºC.

Ruukkuja  kasteltiin  automaattisesti  kastelutikkujen  avulla.  Aluksi  automaattinen  kastelu

säädettiin  3,5  desilitraan  päivässä  ja  myöhemmin  kasvien  kasvaessa  automaattikastelun

määrää  lisättiin.  Kastelua  täydennettiin  lisäksi  tarvittaessa  käsinkastelulla  (kuva  7).

Käsinkastelussa  hyödynnettiin  ruukkujen  kylvöhetken  punnitustuloksia.  Kylvöhetken

punnitustuloksiin  lisättiin  50  grammaa  ja  tätä  painoa  pidettiin  ruukun  tavoitepainona.

Näyteruukkujen alittaessa tavoitepainon niitä kasteltiin käsin vaa´an avulla tavoitepainoon

(kuva 7). Käsinkastelu suoritettiin tarvittaessa useita kertoja viikossa. Kasvien kasvusta ja

siitä johtuvan suuremman haihdutuksen seurauksena koeviikolla 14 jokaisen ruukun (myös

kasvittomien käsittelyiden) tavoitepainoon lisättiin vielä 50 grammaa.

Ilman  kosteusprosentti  säädettiin  itämisen  ajaksi  70  %:iin,  minkä  jälkeen  se  oli  50  %

kokeen  loppuun  saakka.  Varjostusverhot  säädettiin  estämään  auringonvalon  pääsy

kasvihuoneeseen,  kun  kasvihuoneen  lämpötila  ylitti  25  ºC  tai  kun  auringonsäteily  ylitti

arvon  400  W/m2.  Kun  ulkoa  tulevan  valon  määrä  jäi  kasvihuoneessa  valaistuna  aikana

52

(lämpötilasäätö  20  ºC)  alle  arvon  400  W/m2,  valon  puute  korvattiin  automaattisella

keinovalaistuksella.

Koeviikolla  6  kasvilliset  ruukut harvennettiin  niin,  että  jokaiseen  näyteruukkuun  jäi  viisi

vuohenherneen  tainta.  Harvennus  tehtiin  poistamalla  kasvit  ruukuista  juurineen.

Koeviikolla  12  saastuttamattoman  kasvikäsittelyn  (PKR)  ruukuista  harvennettiin  vielä

kaksi  tainta  jokaisesta  ruukusta.  Tällä  kertaa  harvennus  tehtiin  leikkaamalla  jokaisesta

ruukusta  kaksi  kasvia  tyvestä  poikki,  koska  kasvien  irrottaminen  juurineen  oli  tässä

vaiheessa jo mahdotonta.

Koeviikolla 14 kaikkiin ruukkuihin lisättiin pinnalle typetöntä PK­lannoitetta (Kukkaloisto

Syyslannoite  PK  0­22­27,  Nutriforte  Oy,  Suomi).  Veteen  liuotettua  lannoitetta  lisättiin

jokaiseen ruukkuun noin 0,5 ml. Koeviikolla 15 tehtiin niitto,  jossa kasvillisista ruukuista

poistettiin  kaikki  kasvit  niin,  että  kasvit  leikattiin  poikki  noin  viiden  senttimetrin

etäisyydeltä maan pinnasta.

Kuva 7. Näyteruukkujen kosteudensäätäminen vaa´an avulla. Kaikki näyteruukutpunnittiin säännöllisesti ja kasteltiin tarvittaessatavoitepainoon. Kuvan ottanut Anu Mikkonen.

53

Olosuhteiden  vaihtelua  kasvihuoneen  eri  osissa  tasoitettiin  satunnaistamalla  ruukkujen

paikkoja  pöydällä  viikoittain.  Kasvihuoneen  pöytä oli  jaettu  poikittaissuunnassa kolmeen

yhtä  suureen  osaan  eli  kerranteeseen  (kuva  8). Jokaisessa  kerranteessa  oli  yksi  kolmesta

rinnakkaisesta  ruukusta.  Jokaisessa  kerranteessa  ruukkujen  paikat  oli  numeroitu.

Satunnaistus tehtiin siten, että ruukut pysyivät koko ajan samassa kerranteessa. Ruukkujen

vähentyessä  näytteenottojen  yhteydessä  ruukkujen  etäisyyttä  toisiinsa  kasvatettiin.

Satunnaistus tehtiin Matlab ­ohjelmasta saatujen satunnaislukujen avulla.

Kuva 8. Kokeen kolmen eri kerranteen sijainnit kasvihuoneessa.

54

5.1.3 Näytteenotto

Näytteitä  otettiin  21­viikkoisen  kasvihuonekokeen  aikana  kymmenen  kertaa.

Näytteenottoviikot  olivat:  kylvöhetki  (viikko  0)  ja  viikot  1,  2,  3,  4,  6,  8,  12,  16  ja  21.

Kuvassa 9 on esitetty näytteenottoon viikolla 12 otetut ruukut.

Kuva 9. Koeviikon 12 näytteenottoruukut.Kuvassa ovat peräkkäin kaikki kyseisen käsittelynkerranteet. Käsittelyt vasemmalta oikealle ovat:saastuttamaton maa vuohenherneellä (PKR), öljymaakasvilla (ÖKR), öljymaa (Ö) ja steriloitu öljymaa (ÖS).Kuvan ottanut Anu Mikkonen.

Näytteenoton  yhteydessä  kyseisen  viikon  kasvillisista  näyteruukuista  leikattiin  talteen

kasvien maanpinnan yläpuolinen osa, josta määritettiin kasvien kuivapaino (Kondo 2006).

Tämän  jälkeen koko näyteruukkujen sisältämä  maa seulottiin 4  mm seulan  läpi. Seulottu

maa  sekoitettiin  huolellisesti  ja  jaettiin  näytteiksi.  DNA­uuttoa  varten  otettiin  jokaisesta

ruukusta neljä yhden gramman näytettä, jotka pakastettiin näytteenottopäivänä ­80 ºC:een.

MPN­analyyseihin otettiin viiden gramman näytteet, jotka analysoitiin tuoreina.

5.2 MPN­menetelmä polttoöljynhajottajille

Tutkimuksessa käytetyn MPN­menetelmän lähtökohtana oli MECBIO (Microbial Ecology

and  Bioremediation  in  Cold  Climate)  ­verkoston  laboratoriokurssilla  joulukuussa  2004

käytetty  MPN­menetelmä  (liite  2).  Menetelmä  oli  kehitetty  öljynhajottajien

kokonaislukumäärien  määrittämiseen  maanäytteistä  Hainesin  ym.  (1996)  julkaiseman

menetelmän pohjalta. MPN­menetelmä tehtiin 96­kuoppalevyillä ja se perustui hiilettömän

Bushnell­Haas­mineraalialustan  (DifcoTM,  USA)  käyttöön.  Tässä  tutkimuksessa  MPN­

näytelevyillä  ainoana  hiilenlähteenä  käytettiin  tutkimuksen  kohteena  olevaa  polttoöljyä.

55

Näytelevyille valmistettiin protokollan mukaisesti (liite 2) negatiiviset kontrollilevyt, joille

lisättiin  samat  maanäytelaimennokset  kuin  näytelevyille,  muttei  lainkaan  hiilenlähdettä.

Negatiivisten  kontrollilevyjen  avulla  voitiin  osoittaa,  että  positiiviset  reaktiot  MPN­

näytelevyillä olivat seurausta polttoöljyn hyödyntämisestä hiilenlähteenä.

5.2.1 MPN­levyjen valmistus ja inkubointi

Hyvin  sekoitettua  maanäytettä  punnittiin  5,0  grammaa  kierrekorkilliseen  100  ml:n

lasipulloon. Pulloon lisättiin 45 ml fosfaattipuskuria (pH 7,0) (liite 2) ja pulloa ravisteltiin

tasoravistelijassa  vaakatasossa  nopeudella  400  kierrosta  minuutissa  10  minuutin  ajan.

Ravistelun  avulla  haluttiin  irrottaa  mikrobit  maapartikkeleista  ja  siirtää  ne

puskuriliuokseen.  Ravistelun  jälkeen,  alkuperäisestä  protokollasta  poiketen,

maasuspensiopulloa  seisotettiin  ennen  laimennusarjan  valmistusta.  Seisotuksen

tarkoituksena  oli  saada  MPN­levyjen  mittausta  mahdollisesti  häiritsevät  maapartikkelit

vajoamaan pullon pohjalle.

Seisotuksen  jälkeen  maasuspensiopulloista otettiin varovasti 1  ml supernatanttia,  välttäen

pullon  pohjalla  olevaa  maalietettä.  Supernatantista  valmistettiin  10­kertainen

laimennussarja  Bushnell­Haas­mineraalialustaan.  Laimennussarja  pipetoitiin  kahdelle

matalalle  tasapohjaiselle  96­kuoppalevylle  (NuncTM,  Tanska)  niin,  että  valmiilla  levyillä

oli  kahdeksan  peräkkäistä  10­kertaista  laimennosta  ja  jokaisesta  laimennoksesta  oli

kaksitoista  rinnakkaista  kaivoa.  Näytetilavuus  jokaisessa  kaivossa  oli  200  l.  Levyjä

käsiteltäessä  vältettiin  koskemasta  levyjen  pohjiin,  jottei  sinne  tarttuisi  epäpuhtauksia,

jotka  voisivat  häiritä  myöhemmin  levyjen  tulosten  lukua.  Näytelevyille  lisättiin  lopuksi

jokaiseen kaivoon 2  l:aa tutkimuksen kohteena olevaa polttoöljyä hiilenlähteeksi.

Levyjä inkuboitiin huoneenlämmössä (21­24 ºC) ja pimeässä kolme viikkoa. Näytelevyt ja

kontrollilevyt  laitettiin  erillisiin  rasioihin  inkuboinnin  ajaksi  (kuva  10),  jotta  haihtuvat

öljyn komponentit eivät pääsisi siirtymään näytelevyiltä negatiivisille kontrollilevyille.

56

Kuva 10. MPN­levyjen inkuboinnin aikana käytetyt rasiat.Vasemmalla on negatiivisten kontrollilevyjen säilytysrasia ja oikeallanäytelevyjen säilytysrasia.

5.2.2 MPN­lukumäärän määritys

Tutkimuksen  aikana  testattiin  mikrobien  kasvun  määritystä  MPN­levyiltä  MECBIO­

kurssin  työohjeen  (liite  2)  mukaisesti  kahdella  tetratsoliumsuoloihin  kuuluvilla

värireagensseilla INT:llä (2­(p­iodofenyyli)­3(p­nitrofenyyli)­5­fenyylitetratsolium­kloridi)

(Sigma,  UK)  ja  WST­1:llä  (4­[3­(4­iodofenyyli)­2­(4­nitrofenyyli)­2H­5­tetratsolio]­1,3­

benseenidisulfonaatti)  (Roche,  Saksa).  Koska  tetratsoliumsuolat  häiritsevät  mikrobien

kasvua, lisättiin ne MPN­levyille vasta inkuboinnin jälkeen.

Käytettäessä  INT­soluhengitysindikaattoria  lisättiin MPN­levyille  INT­reagenssista  tehtyä

laimennusta  niin,  että  jokaisessa  kaivossa  INT­reagenssin  loppukonsentraatio  oli  0,6

mg/ml.  Tulokset  kaivoista,  joihin  oli  lisätty  INT­reagenssia,  luettiin  silmämääräisesti

vuorokauden  jälkeen  reagenssin  lisäämisestä.  Kaikki  kaivot,  joissa  oli  havaittavissa

punaista väriä, laskettiin positiivisiksi.

Käytettäessä  WST­1­soluhengitysindikaattoria  lisättiin  MPN­levyn  kaivoihin  10  l

käyttövalmista  WST­1­liuosta.  WST­1­reagenssin  antamat  tulokset  luettiin  ELISA­

lukijalla  (Labsystems iEMS  Reader  MF)  aallonpituuksilla  450  nm  ja  620  nm.

Aallonpituutta  450  nm,  jolla  pelkistynyt  WST­1  absorboi  voimakkaasti,  käytettiin

varsinaisena  mittausaallonpituutena.  Aallonpituudella  620  nm  pelkistynyt  WST­1

puolestaan  absorboi  hyvin  vähän  ja  tätä  aallonpituutta  käytettiin  mittauksissa  niin

sanottuna  referenssiaallonpituutena.  Referenssiaallonpituuden  avulla  oli  tarkoitus  poistaa

450  nm:llä  saaduista  mittaustuloksista  tausta­absorptio.  Tausta­absorptiota  mittauksiin

aiheuttivat  kaivojen  pohjalla  olevat  solut  ja  maapartikkelit  sekä  levyjen  pohjissa

mahdollisesti olevat sormenjäljet tai muut epäpuhtaudet.

57

WST­1­mittaustulokset  siirtyivät  automaattisesti  ELISA­lukijalta  Ascent  Software­

tietokoneohjelmaan  (versio  2.6).  Tämän  jälkeen  tulokset  siirrettiin  Excel­

taulukkolaskentaohjelmaan,  jossa  aallonpituudella  620  nm  saatu  absorptio  vähennettiin

aallonpituudella  450  nm  saadusta  absorptiosta.  Positiivisiksi  kaivoiksi  määritettiin  ne

kaivot,  joiden absorptioarvo ylitti  tausta­absorption vähennyksen  jälkeen arvon 0,05 (liite

2).

INT  ja  WST­1  värireagensseihin  perustuvan  määrityksen  lisäksi  tutkimuksessa  testattiin

absorbanssimittausta  ilman  tetrasoliumsuolojen  lisäystä  MPN­levyille.  Tällöin

absorbanssimittaus perustui  mikrobien kasvun aiheutumaan kasvualustan  samentumiseen.

Tässä  yhteydessä  tutkittiin  eri  aallonpituuksilla  tehtyjen  mittausten  eroja  ja  määritettiin

valitulle  aallonpituudelle  raja­arvo,  jonka  alapuolelle  jäävät arvot  luettiin  negatiivisiksi  ja

sen ylittävät arvot positiivisiksi.

Kun  asetettujen  raja­arvojen  avulla  oli  määritetty  MPN­levyiltä  positiivisten  kaivojen

lukumäärät  kaikissa  laimennuksissa,  syötettiin  neljän  peräkkäisen  laimennuksen

positiivisten kaivojen lukumäärät Mike Curialen internetissä julkaisemaan MPN –laskuriin

(VB  3  versio)  (internetsivu http://www.i2workout.com/mcuriale/mpn/index.html

käyttöpäivä  1.8.2005).  MPN­laskuriin  syötetyt  laimennukset  valittiin  niin,  että

korkeimmassa  näistä  neljästä  peräkkäisestä  laimennuksesta  ei  ollut  yhtään  positiivista

kaivoa.  Tuloksena  MPN­laskuri  ilmoitti  näytteen  todennäköisimmän  mikrobilukumäärän

sekä 95 prosentin luottamusvälin kyseiselle tulokselle.

5.2.3 MPN­kasvatusten toteutus

MECBIO­verkoston  laboratoriokurssilla  käytettyä  MPN­menetelmää  jouduttiin

tutkimuksen aikana optimoimaan monin tavoin, ennen kuin se soveltui tämän tutkimuksen

näytteiden  analysointiin.  Esikokeista  saatujen  tulosten  perusteella  alkuperäiseen

protokollaan  (liite  2)  lisättiin  maanäytesuspension  seisotusvaihe  ennen  laimennussarjan

valmistamista.  Tällä  haluttiin  estää  maapartikkelien  kulkeutuminen  MPN­levyille,  jossa

maapartikkelien  mukana  siirtyvät  hiilenlähteet  voisivat  aiheuttaa  vääriä  positiivisia

reaktioita MPN­levyjen matalimmissa  laimennuksissa. Näytteenottoviikoilla 0, 1, 3, 6 ja 8

maanäytesuspensiota  seisotettiin  5  minuuttia  ennen  laimennussarjan  valmistamista.

58

Näytteenottoviikolla 8 vertailtiin 5, 10 ja 20 minuutin seisotusaikojen vaikutusta saataviin

tuloksiin. Viikoilla 12, 16 ja 21 maanäytesuspension seisotusaikana käytettiin 20 minuuttia.

Näytteenottoviikon  0  eli  kylvöhetken  näytteistä  valmistetuilla  MPN­levyillä  testattiin

soluhengitysidikaattorien  WST­1  ja  INT  soveltuvuutta  polttoöljynhajottajien  kasvun

havaisemiseen.  Kolmen  viikon  inkuboinnin  jälkeen  MPN­näyte­  ja  kontrollilevyille

lisättiin  kuuteen  ensimmäiseen  sarakkeeseen  WST­1­soluhengitysindikaattoria  ja  kuuteen

viimeiseen  sarakkeeseen  INT­soluhengitysindikaattoria.  Kaivot,  joihin  oli  lisätty  INT­

soluhengitysindikaattoria,  luettiin  silmämääräisesti  yhden  vuorokauden  jälkeen  INT­

reagenssin lisäämisestä. Kaivot, joihin oli lisätty WST­1­reagenssia luettiin yhden, kahden

ja  kolmen  vuorokauden  jälkeen  WST­1  lisäyksestä.  Näytelevyjen  inkubointiaika  WST­1

kanssa haluttiin  optimoida  siten,  että  se oli  riittävän  pitkä,  jotta  kaikki  positiiviset  kaivot

ilmestyisivät  vaikutusajan  kuluessa  näytelevyille.  Toisaalta  vaikutusajan  kuluessa  ei

haluttu negatiivisille kontrollilevyille ilmestyvän positiivisia kaivoja.

Kokeen  alusta  lähtien  testattiin  myös  absorbanssilukijalla  tapahtuvan  sameusmittauksen

soveltuvuutta MPN­lukumäärien määritykseen. Sameusmittauksissa rinnakkaisina kaivoina

käytettiin  kaikkia  MPN­levyn  kahtatoista  kaivoa.  Koska  MPN­levyjen  tulosten  luku

haluttiin  automatisoida  tehtäväksi  ELISA­lukijalla,  oli  tätä  varten  valittava  sopiva

aallonpituus  kasvusta  johtuvan  absorbanssin  mittaamiseen.  Viikoilla  0  ja  3  MPN­levyt

luettiin  sameuden  perusteella  aallonpituudella  620  nm,  joka  oli  WST­1­reagenssin

referenssiaallonpituus. Viikolla 3  vertailtiin aallonpituuksilla 620  nm, 540  nm  ja 450  nm

saatavia tuloksia. Näytteenottoviikkojen 6, 8, 12, 16 ja 21 näytteistä valmistetut MPN­levyt

luettiin aallonpituudella 450 nm.

MPN­analyysit  tehtiin  jokaisena  näytteenottokertana  kahtena  rinnakkaisena  määrityksenä

niin, että rinnakkaiset näytteet otettiin kasvihuonekokeen eri kerranteista (kuva 8).

59

5.3 DNA:n eristys maanäytteistä

DNA­eristykset  kasvihuonekokeen  näytteistä  tehtiin  yhdessä  tutkimukseen  osallistuneen

pro  gradu  ­työntekijän  Anu  Mikkosen  kanssa.  DNA:n  eristys  tehtiin  pakastetuista

maanäytteistä  FastPrep Spin  Kit  for  Soil­kitillä  (Qbiogene,  USA).  Jokaista  näyteruukkua

kohti  tehtiin  kaksi  rinnakkaista  eristystä.  Näytemäärä  oli  0,5  ±  0,05  g.  DNA:n  eristys

tehtiin  valmistajan  ohjeen  mukaisesti,  muutamaa  alla  mainittua  pientä  muutosta  lukuun

ottamatta.  Valmistajan  mukaan  FastPrep  Spin  Kit  for  Soil­kitti  soveltuu  genomisen

bakteeri­, sieni­, kasvi­ tai eläin­DNA:n eristämiseen maanäytteistä.

Maanäytteet  punnittiin  kitin  Lysing  Matrix  E  –putkiin,  jonka  jälkeen  putkiin  lisättiin

puskuria. DNA vapauttaminen soluista  tapahtui  ravistelemalla Lysing Matrix E –putkissa

olevia  maanäytteitä  FastPrepTM  FP120  ­laitteella  (BIO  101  Savant, USA)  nopeudella  5,5

30  sekunnin  ajan.  Solujen  hajotus  perustui  Lysing  Matrix  E  –putkissa  oleviin  pieniin

keraamisiin helmiin, jotka ravistelun aikana jauhoivat maanäytteiden sisältämät solut rikki.

Ravistelun  jälkeen  rikkonaisten  solujen  kappaleet  ja  maapartikkelit  poistettiin  liuoksesta

sentrifugoimalla 5 minuuttia. Supernatantit siirrettiin puhtaisiin eppendorf­putkiin.

DNA­uutteisiin  lisättiin  seuraavaksi  proteiinien  saostusliuosta,  minkä  jälkeen  saostuneet

proteiinit  sentrifugoitiin  putkien  pohjalle.  Supernatantti  siirrettiin  putkiin,  joissa  DNA

sitoutui  putkissa  olevan  Binding  Matrix:in  silikageelipartikkeleihin.

Silikageelipartikkeleihin  sitoutunutta  DNA:ta  huuhdeltiin  kitin  suola­etanoliliuoksella.

Lopuksi DNA eluoitiin DNAaasi ja pyrogeeni vapaalla vedellä 120 µl tilavuuteen. Eluoitu

DNA­uute jaettiin neljäksi noin 25 µl:n osanäytteeksi ja uutteet pakastettiin ­80 ºC:een.

60

5.4 DNA:n pitoisuuden määritys

5.4.1 NanoDrop® ND1000 UV­Vis ­spektrofotometrimittaus

Mittaus  suoritettiin  pipetoimalla  yksi  mikrolitra  tutkittavaa  DNA­uutetta  kuvassa  11

esitetyn  NanoDrop®­laitteen  alemman  metallilevyn  kohouman  päälle.  Kohoumasta  lähtee

laitteen sisäosiin kuituoptinen kaapeli, joka pystyy ottamaan vastaan siihen lähetettyä valoa

(NanoDrop® 2004). Kun näyte oli pipetoitu kohouman päälle, laskettiin ylempi metallilevy

näytteen päälle. Tämän  levyn sisällä on valoa  lähettävä kuituoptinen kaapeli (NanoDrop®

2004).

Kuva 11. NanoDrop® ND1000 UV­Vis –spektrofotometri. Kuva NanoDropTechnologies (internetsivu www.nanodrop.com).

Näyte pysyy kahden metallilevyissä olevan kohouman välissä nestejännitteen avulla (kuva

12).  Laite  lähettää  valoa  yläpuolella olevan  kuituoptisen kaapelin kautta  nestepylvääseen

(NanoDrop® 2004). Kun valo on läpäissyt nestepylvään, alapuolinen kuituoptinen kaapeli

kerää  valon  ja  laite  analysoi  näytteeseen  imeytyneen  valon  määrän  valitulla

aallonpituusalueella.  Tuloksena  laite  antaa  näytteen  spektrin,  DNA­pitoisuuden  (260  nm

absorption  perusteella)  sekä  arvot  DNA:n  puhtaudesta  kertoville  suhdeluvuille

A260nm/A280nm ja A260nm/A230nm.

61

Kuva 12. Näyte NanoDrop® ND1000 UV­Vis –spektrofotometrissä. Kuva NanoDropTechnologies (internetsivu www.nanodrop.com).

5.4.2 PicoGreen®­mittaus

Mittaus  tehtiin  PicoGreen®dsDNA  Quantitation  Reagent  ­kitin  (Molecular  Probes,  USA)

ohjeen  mukaisesti  käyttäen  kitin  reagensseja.  Kitti  sisälsi  200­kertaista  PicoGreen®­

värireagenssia, 20­kertaista TE­puskuria ja 1­kertaiseen TE­puskuriin liuotettua  ­DNA:ta,

jonka  pitoisuus  oli  100  µg/ml.  Kitin  200­kertaisesta  PicoGreen®­värireagenssista  ja  20­

kertaisesta  TE­puskurista  valmistettiin  ennen  mittauksen  aloittamista  1­kertaiset

käyttöliuokset.  Koska  PicoGreen®  hajoaa  herkästi  valossa,  PicoGreen®­reagenssin

pipetointi tehtiin ilman kohdevalaistusta ja kaikki PicoGreen®­väriliuosta sisältävät putket

suojattiin huolellisesti foliolla.

DNA­pitoisuuden  määritys  tehtiin  matalilla  tasapohjaisilla  96­kuoppalevyillä  (NuncTM,

Tanska) 200 µl:n reaktiotilavuudessa. DNA­pitoisuusstandardit, 200 ng, 100 ng, 40 ng, 20

ng ja 4 ng, valmistettiin kitin  ­DNA:sta ja pipetoitiin kahtena rinnakkaisena näytelevyille.

Maa­DNA­uutteiden  näytemääränä  käytettiin  yhtä  mikrolitraa.  Vaikka  näin  pieni

näytemäärä  on  hyvin  altis  pipetoinneista  johtuville  epätarkkuuksille,  ei  suurempaa

näytemäärää  haluttu  käyttää  DNA­uutteiden  vähyyden  vuoksi.  Jokaiseen  näytekaivoon

pipetoitiin  ensin  100  µl  1­kertaista  TE­puskuria.  Tämän  jälkeen  lisättiin  1  µl  maa­DNA­

uutetta  ja  lopuksi  kaikkiin  kaivoihin  lisättiin  100  µl  1­kertaista  PicoGreen®­väriliuosta.

Jokaiselle  näytelevylle  jätettiin  kaksi  sokeaa  näytettä,  johon  ei  lisätty  lainkaan  DNA­

uutetta. PicoGreen®­väriliuoksen altistumista valolle vältettiin pitämällä näytelevy  folioon

käärittynä mittauslaitteelle kuljetuksen ajan.

Mittaus  tehtiin  Fluoroscan  Ascent­laitteella  (Labsystems)  hyödyntäen  Ascent  Software­

tietokonenohjelmaa  (versio  2.4.2).  Mittausohjelma  koostui  kahdesta  ravistelusta,

62

inkuboinnista  ja  mittauksesta.  Laite  ravisteli  aluksi  levyä  vaakatasossa  10  sekuntia

nopeudella 1200 kierrosta minuutissa. Tämän jälkeen laite inkuboi levyä 2 minuuttia + 45

ºC:ssa.  Inkubointia  seurasi  vielä  toinen  10  sekunnin  ravistelu  nopeudella  1200  kierrosta

minuutissa.  Tämän  jälkeen  levy  luettiin  käyttäen  eksitaatioaallonpituutta  485  nm  ja

emissioaallonpituutta 538 nm.

Mittaustulokset  siirrettiin  Excel­taulukkolaskentaohjelmaan. Excel­ohjelmassa  kaikista

mittaustuloksista  vähennettiin  sokean  näytteen  antama  taustafluoresenssi.

Fluoresenssiarvot muutettiin standardisarjan avulla DNA­pitoisuuksiksi.

5.5 NahAc­geenin monistaminen Q­RTm­PCR:llä

5.5.1 PCR­alukkeet

Taulukossa  7  on  esitetty  Q­RTm­PCR:ssä  käytetyt  alukkeet.  Alukkeet  on  suunnitellut  ja

julkaissut Baldwin ym. (2003).

Taulukko 7. Q­RTm­PCR:ssä käytetyt NAH­alukkeet.

Alukkeennimi Sekvenssi  5´­3´ Pituus

(nt)5 ´pään sijainti

nahAc­geenissä

NAH_F CAAAA(A/G)CACCTGATT(C/T)ATGG 20 46

NAH_R  A(C/T)(A/G)CG(A/G)G(C/G)GACTTCTTTCAA 20 422

5.5.2 Standardin valmistaminen PCR­tuotteestaStandardina  kvantitatiivisessa  reaaliaikaisessa  PCR:ssä  (Q­RTm­PCR)  käytettiin

Pseudomonas  putida  G7­kannasta  (HAMBI  9)  Baldwinin  ym.  (2003)  NAH­alukkeilla

(taulukko 7) monistettua PCR­tuotetta. P. putida G7­kannalla on 83 kiloemäksen kokoinen

katabolinen  plasmidi,  jossa  tutkittava nahAc­geeni  sijaitsee.  Ensin  varmistettiin

tutkimuksessa käytettävien NAH­alukkeiden sitoutuminen oikeisiin kohtiin P. putida G7­

kannan nahAc­geenissä.  Tätä  varten P.  putida G7­kannan nahAc­geenisekvenssi  (AC­

numero  M83949)  haettiin  NCBI:n  GenBank­nukleotiditietokannasta  (internetsivu

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank.index.html  käyttöpäivä  14.4.2005).  Haettu

sekvenssi  siirrettiin  internetissä  olevaan  Primer3­ohjelmaan  (internetsivu

63

http://frodo.wi.mit.edu/cgi­bin/primer3/primer3_www.cgi käyttöpäivä  26.5.2005),  jossa

selvitettiin NAH­alukkeiden sitoutumiskohdat nahAc­geenissä sekä laskettiin odotettavissa

olevan PCR­tuotteen koko.

NahAc­geenifragmentin  monistaminen P.  putida  G7­kannasta  käyttäen  NAH­alukkeita

tehtiin pesäke­PCR:llä TY­maljoille (liite 3) viljellyistä P. putida G7 ­pesäkkeistä, joita oli

kasvatettu  +  28  ºC:ssa  yksi  vuorokausi.  PCR­reaktioliuoksen  koostumus  sekä  käytetty

PCR­ohjelma  on  esitetty  taulukoissa  8  ja  9.  Monistus  tehtiin  PCT­200  Peltier  Thermal

Cycler­laitteella (MJ Research, USA) 100 µl:n reaktiotilavuudessa.

Taulukko 8. PCR­reaktioliuoksen koostumus monistettaessa nahAc­geenifragmenttiaP. putida G7­kannasta pesäke­PCR:llä.

Reagenssi Loppukonsentraatio

Templaatti Soluja P. putida G7­pesäkkeestä

NAH­F (Oligomer, Suomi) 0,5 µM

NAH­R (Oligomer, Suomi) 0,5 µM

dNTP – seos (Finnzymes, Suomi) 0,2 mM jokaista

Reaktiopuskuri (Immunodiagnostic Oy, Espanja) 1x

Polymeraasi (Immunodiagnostic Oy, Espanja) 1 U / reaktio

Steriili MQ­vesi

Taulukko 9. NahAc­geenifragmentin monistamisessa P. putida G7­kannasta käytettypesäke­PCR­ohjelma.

Ohjelman vaihe Kesto (min:s) Lämpötila (ºC)  Kierrokset

1. Alkudenaturaatio 15:00 95 1

2. Denaturaatio3. Alukkeiden kiinnittyminen

4. Synteesi

0:301:00

1:00

9447

72

30

5. Jäähdytys 15 1

64

PCR:n  onnistuminen  ja  PCR­tuotteen  koko  tarkistettiin  geelielektroforeettisesti  1,5  %

agaroosigeelillä  (GellyPhor®,  EuroClone,  U.K.).  Latauspuskurina  geelillä  käytettiin

Blue/Orange  Loading  Dye:ta  (Promega,  USA)  ja  PCR­tuotteen  molekyylikoon

määrittämiseen  pGEM®  DNA  markkeria  (Promega,  USA).  Tarkistuksen  jälkeen  PCR­

tuotteet puhdistettiin MinElute PCR Purification kitillä (Qiagen, USA) valmistajan ohjeen

mukaisesti. Puhdistettu PCR­tuote eluoitiin EB­puskuriin 50  l:n tilavuuteen ja tarkistettiin

1,5 % agaroosigeelillä kuten edellä.

Jotta  standardi­PCR­tuotteen DNA­pitoisuus saatiin  määritettyä  mahdollisimman tarkasti,

PCR­tuotteen DNA­pitoisuus  määritettiin  seitsemänä  rinnakkaisena  mittauksena kolmesta

eri  laimennuksesta  NanoDrop®­laitteella.  DNA­pitoisuuden  ja  PCR­fragmentin  pituuden

perusteella  laskettiin  liuoksen  sisältämien  DNA­fragmenttien  lukumäärä  eli  geenin

kopioluku alla olevan kaavan avulla.

DNA­pitoisuus (g/  l)— — — — — — — — —    •  Avogadron  vakio

PCR­palan pituus (bp) • 660

5.5.3 Näytelevyjen valmistus ja ajo ABI 7300­laitteella

Q­RTm­PCR:ssä  käytetty  SYBR®Green  PCR  Master  mix  (Applied  Biosystems,  USA)

sisälsi  alukkeita  ja  tutkittavaa  näytettä  lukuun  ottamatta  kaikki  muut  PCR­reaktioon

tarvittavat  komponentit.  Q­RTm­PCR­reaktiot  tehtiin  30  l  reaktiotilavuudessa,  niin  että

jokaisessa  reaktiossa  oli  15  l  kaksinkertaista  SYBR®Green  Master  mix:iä,  2,5  l

molempia alukkeita (300 nM), ja 10  l tutkittavaa DNA­näytettä tai sen laimennosta.

PCR­reaktiot  tehtiin  96­kuoppalevyillä  (96­Well  Optical  Reaction  Plate,  Applied

Biosystems,  USA).  Näytelevyille  pipetoitiin  ensin  alukkeista  ja  SYBR®Green  Master

mix:istä tehty seos. Tämän  jälkeen  levy siirrettiin toiseen tilaan,  jossa standardit  ja DNA­

näytteet  lisättiin  levyille.  Lopuksi  näytelevy  suljettiin  ohuella  läpinäkyvällä  tarrakannella

(Optical  Adhesive  Cover  Starter  Kit,  Applied  Biosystems,  USA).  Näytelevyä  pidettiin

koko  sen  käsittelyn  ajan  96­kuoppalevytelineessä  (Applied  Biosystems),  jotta  se  pysyisi

puhtaana ulkopinnoiltaan. Näytelevyjen ajo tehtiin 7300 Real Time PCR System­laitteella

(Applied  Biosystems),  josta  tulokset  siirtyivät  automaattisesti  tietokoneelle  Sequence

Detection Software ­ohjelmaan (versio 1.2.3).

65

Ensin  Q­RTm­PCR:n  avulla  selvitettiin,  millä  laimennustasolla  tutkittavat  maa­DNA­

uutteet  monistuivat  tehokkaimmin.  Maa­DNA­uutelaimennukset,  joita  tutkimuksessa

vertailtiin, olivat 10­1,  10­2,  10­3  ja 10­4. Kaikista  laimennoksista  tehtiin PCR­näytelevylle

kolme rinnakkaista reaktiota. Käytetty PCR­ohjelma on esitetty taulukossa 10.

Taulukko 10. Maa­DNA­uutteiden sopivan laimennustason määrittämiseenkäytetty Q­RTm­PCR­ohjelma.

Ohjelman vaihe Kesto (min:s) Lämpötila (ºC) Kierrokset

1. Alkudenaturaatio 15:00 95 1

2. Denaturaatio

3. Alukkeiden kiinnittyminen4. Synteesi

0:15

0:300:30

95

4772

45

5. Sulamiskäyräanalyysi0:150:30

0:15

9560

95

1

Vertailtaessa  nahAc­geenikopiolukuja  eri  näytteenottoviikkojen  välillä  tehtiin  Q­RTm­

PCR­ajo  muuten  taulukon  10  mukaisella  PCR­ohjelmalla,  mutta  sekä  alukkeiden

kiinnittymis­ että synteesiaikaa pidennettiin 30 sekunnista 45 sekuntiin.

5.5.4 Standardiplasmidin valmistus

PCR­tuotteesta  valmistetun  standardin  lisäksi  valmistettiin  plasmidistandardi Q­RTm­

PCR:ää  varten.  Plasmidistandardi  valmistettiin  kloonaamalla P.  putida  G7­kannasta

monistettu nahAc­geenifragmentti  osaksi  pCR®2.1­TOPO®­plasmidivektoria  (Invitrogen,

USA).

Kloonausta varten suunniteltiin uudet alukkeet, koska kloonauksen yhteydessä voi tapahtua

muutamien  nukleotidien  deleetioita  kloonattavan  palan  päistä.  Uusien  alukkeiden

sitoutumiskohdat olivat nahAc­geenissä noin 20 nukleotidiä Baldwinin ym. (2003) NAH­

alukkeiden  ulkopuolella.  Alukkeet  suunniteltiin  alukkeiden  suunnittelusta  annettujen

ohjeiden mukaisesti (Suominen ja Ollikka 1999). Lopuksi alukkeiden sekvenssit syötettiin

Primer3­ohjelmaan (internetsivu http://frodo.wi.mit.edu/cgi­bin/primer3/primer3_www.cgi

käyttöpäivä  20.6.2005),  joka  laski  suunniteluille  alukkeille  mm.  sulamislämpötilan,  sekä

66

arvioi  alukkeiden  toimivuutta  PCR­reaktioissa,  ilmoittaen  alukkeen  sisäisten

sekundäärirakenteiden  ja  alukedimeerien  muodostumistodennäköisyyden.  Taulukossa  11

on esitetty suunniteltujen alukkeiden sekvenssit sekä ominaisuuksia.

Taulukko  11. Kloonattavan nahAc­fragmentin monistamiseen  suunnitellut  alukkeet.Monistettavan  PCR­tuotteen  koko  oli  423  emäsparia.  Alukkeiden  sijainnit nahAc­geenissä,alukkeiden  pituudet  sekä  niiden  GC­prosentti  on  määritetty  ilman  erillistä  ohjelmaa.  Alukkeidensulamislämpötilat laskettu Primer3­ohjelmalla.

Alukkeennimi

5 ´pään sijaintinahAc­geenissä

Sekvenssi5´­3´

Pituus(nt)

Sulamislämpö(º C)

GC­prosentti(%)

nah_pitkä_F 25GTGAGTGAATCTGGGCTGAC

20 58 55

nah_pitkä_R 448CATAGATGAAGCCATGGAAGC

21 60 48

Suunnitelluilla  nah_pitkä­alukkeilla  monistettiin pesäke­PCR:llä kloonattavaa  fragmenttia

P.  putida  G7­kannasta,  joka  oli  kasvanut  yhden  vuorokauden  TY­maljalla  +  28  ºC:ssa.

PCR­reaktio  tehtiin  50  µl  tilavuudessa.  PCR­reaktioliuoksen  koostumus  oli  muuten

taulukon 8 mukainen, mutta alukkeina käytettiin taulukon 11 nah_pitkä­alukkeita. Käytetty

PCR­ohjelma  oli  taulukon  9  mukainen.  PCR:n  onnistuminen  ja  PCR­tuotteen  koko

tarkistettiin geelielektroforeettisesti kuten edellä.

Nah_pitkä­alukkeilla  monistetun  PCR­tuotteen  kloonaamiseen  pCR®2.1­TOPO®­

kloonausvektoriin  käytettiin  TOPO  TA  Cloning®­kittiä  (Invitrogen,  USA)  ja

transformaatio  tehtiin  kitin  kemiallisen  transformaation  protokollan  mukaisesti.  Ensin

PCR­tuotteesta  ja  kitin  pCR®2.1­TOPO®­kloonausvektorista  valmistettiin  ligaatioseos

(taulukko 12) kuuden  mikrolitran  tilavuuteen. PCR­tuotteen  ja plasmidivektorin annettiin

ligoitua keskenään viisi minuuttia huoneenlämmössä, minkä jälkeen ligaatioseos siirrettiin

jäille.  Kaksi  mikrolitraa  ligaatioseosta  lisättiin  putkeen,  joka  sisälsi  kompetentteja  One

Shot® E. coli ­soluja. Tätä seosta seisotettiin jäillä 20 minuuttia. Transformaatio, eli DNA­

molekyylien siirtäminen kompetenttien solujen sisälle, tapahtui lyhyen lämpökäsittelyn (30

sekuntia  +  42  ºC)  avulla.  Transformaation  jälkeen  solujen  päälle  lisättiin  SOC­liuosta  ja

putkia inkuboitiin 1 tunti ravistelussa +37 ºC:ssa.

67

Taulukko 12. Ligaatioseoksen koostumus

Reagenssi tilavuus/reaktio (µl)

PCR­tuote 2

Suolaliuos 1

Vektoriplasmidi 1

steriili MQ­vesi 2

Inkuboinnin  jälkeen  seos  levitettiin  LB­maljoille,  jotka  sisälsivät  50  µg/ml  ampisilliiniä

(Sigma, Saksa) ja 80 µg/ml X­gal:a (Fermentas). Ampisilliinin avulla maljoille valikoitiin

ne  solut,  jotka  olivat  ottaneet  sisäänsä  pCR®2.1­TOPO®­plasmidivektorin.  Selektio

perustui  siihen,  että  ainoastaan  pCR®2.1­TOPO®­plasmidivektorissa  oli

ampisilliiniresintenttiyttä koodaava geeni.

Maljoilla  olevan  laktoosianalogin  X­gal:n  avulla  voitiin  maljoilta  tunnistaa  pesäkkeet,

joiden  pCR®2.1­TOPO®­plasmidivektoriin  oli  liittynyt  insertti.  Tunnistus perustui  siihen,

että  vektorissa  insertti  liittyy  keskelle  laktoosia  hajottavaa  entsyymiä,  ­galaktosidaasia,

koodaavaa  geeniä,  jolloin  geeni  muuttuu  toimimattomaksi.  Koska  X­gal:n  hajoamistuote

on väriltään kirkkaan sininen,  tunnistetaan solut,  joissa on  toimiva  ­galaktosidaasigeeni,

sinisestä  väristä.  Pesäkkeet,  joiden  plasmidiin  insertti  on  liittynyt  haluttuun  kohtaan  eli

keskelle  ­galaktosidaasigeeniä, ovat puolestaan väriltään valkoisia.

Maljoja,  joille  transformantit  oli  viljelty,  kasvatettiin  +37  ºC:ssa  yksi  vuorokausi.

Kasvatuksen  jälkeen  maljoilta  poimittiin  valkoisia  ja  vaaleansinisiä  pesäkkeitä,  joista

tehtiin  puhdasviljelmät  LB­maljoille,  joissa  oli  ampisilliiniä  ja  X­gal:a  edellä  mainituissa

pitoisuuksissa.  Kloonauksen  onnistuminen  tarkistettiin  puhdasviljelmistä  pesäke­PCR:llä

sekä kloonauskitin  M13­alukkeilla  (Invitrogen,  USA)  että  nah_pitkä­alukkeilla  (taulukko

11).  M13­alukkeet  kiinnittyvät  vektoriin  kloonauskohdan  molemmille  puolille,  jolloin

kloonattu  pala  jää  monistettavan  alueen  sisään.  M13­alukkeilla  PCR  tehtiin  kitin  ohjeen

mukaisesti ja nah_pitkä­alukkeilla taulukon 8 ja 9 mukaisesti. PCR­reaktiot tehtiin 20 µl:n

tilavuudessa  ja  PCR:n  onnistuminen  ja  PCR­tuotteiden  koko  tarkistettiin

geelieletroforeettisesti.

68

Kloonit,  joista  monistui  oikean  kokoista  fragmenttia  sekä  kloonauskitin  M13­alukkeilla

että  nah_pitkä­alukkeilla,  viljeltiin  3  ml:aan  LB­lientä,  jossa  oli  5  g/ml  ampisilliiniä.

Putkia  inkuboitiin  +37  ºC:ssa  ja  ravistelussa  (125  kierrosta  minuutissa)  yön  yli.

Kasvatuksista  kerättiin  sentrifugoimalla  solut  1,5  ml  eppendorf­putkien  pohjalle.  Tämän

jälkeen tehtiin plasmidin eristys JETquick­plasmidin eristyskitillä  (Genomed, Saksa) kitin

ohjeen mukaisesti. Plasmidin eristyksen onnistuminen tarkistettiin geelielektroforeettisesti.

Standardiplasmidia testattiin Q­RTm­PCR:llä käyttäen NAH­alukkeita (taulukko 7).

5.6 Kasvihuonekokeesta saatu muu aineisto

Tässä osiossa on esitetty Kondon  (2006) kasvihuonekokeen aikana saamia  tuloksia,  jotka

toimivat  tausta­aineistona  tässä  työssä  saaduille  tuloksille.  Kaikki  alla  olevat  tulokset  on

julkaistu Kondon pro gradu ­tutkielmassa. Taulukot ja kuvat on otettu muokkaamattomina

Kondon pro gradu ­tutkielmasta, ainoastaan muutamia kuvatekstejä hieman muutettu.

Tässä  osiossa  esitetyt  tulokset  ovat:  1)  öljyhiilivetyjen  kokonaispitoisuuden  vaihtelu

kasvillisessa  (ÖKR),  kasvittomassa  (Ö)  ja  steriilissä  (ÖS)  öljykäsittelyssä

kasvihuonekokeen  aikana  (kuva  13),  2)  öljyllä  saastutetun  (ÖKR)  ja  saastuttamattoman

(PKR)  kasvikäsittelyn  kasvibiomassan  tuotto  (kuva  14)  ja  3)  maan  typpipitoisuuden

vaihtelu käsittelyissä ÖKR, Ö ja PKR (kuva 15).

Kuvassa  13  on  esitetty  polttoöljyn  hajoaminen  kasvihuonekokeen  polttoöljyllä

saastutetuissa  käsittelyissä  eli  käsittelyissä  ÖKR,  Ö  ja  ÖS.  Öljypitoisuus  on  määritetty

jokaisella  näytteenottoviikolla  kolmen  rinnakkaisen  ruukun  keskiarvona.  Virherajoina

kuvassa 13 on esitetty rinnakkaisten ruukkujen öljypitoisuuksien keskihajonta.

Steriloimattomissa  öljykäsittelyissä  (ÖKR  ja  Ö)  öljyhajoaminen  oli  koko  kokeen  ajan

hyvin  yhdenmukaista  (kuva  13).  Öljypitoisuus  laski  käsittelyissä  ÖKR  ja  Ö  jyrkästi

viikolle  3,  minkä  jälkeen  öljypitoisuuden  lasku  selvästi  hidastui.  Viikolta  16  viikolle  21

öljypitoisuuden  lasku  steriloimattomissa  öljykäsittelyissä  (ÖKR  ja  Ö)  oli  hyvin  vähäistä.

Steriilissä öljykäsittelyssä (ÖS) polttoöljyn pitoisuus laski koko kokeen aikana vain hyvin

vähän (kuva 13).

69

0

500

1000

1500

2000

2500

0 5 10 15 20 25

aika viikkoina kokeen alusta

pito

isuu

s m

aass

a (m

g/kg

 maa

ta)

ÖKRÖÖS

Kuva 13. Polttoöljyn pitoisuuden (mg/kg) muutokset kasvillisessa (ÖKR),kasvittomassa (Ö) ja steriilissä (ÖS) öljymaassa 21­viikoisen kasvihuonekokeenaikana. Polttoöljypitoisuus on ilmoitettu kuvassa maan kuivapainoa kohden. (Kondo 2006)

Kuvassa  14  on  esitetty  kokeen  kasvillisten  käsittelyiden,  eli  käsittelyiden  PKR  ja  ÖKR,

kasvibiomassan  vaihtelu  eri  näytteenottoviikoilla.  Kasvibiomassa  on  määritetty  jokaisella

näytteenottoviikolla kolmen rinnakkaisen ruukun keskiarvona. Virherajoina kuvassa 14 on

esitetty  rinnakkaisten  ruukkujen  kasvibiomassan keskihajonnat.  Näytteenottoviikkojen  12

ja  16  välissä,  viikolla  15,  kaikki  kasvit  molemmista  käsittelyistä  niitettiin.  Tästä  johtuen

kuvan  14  kuvaajissa  on  näytteenottoviikkojen  12  ja  16  välillä  katko.  Viikkojen  6  ja  12

välillä  molempien  käsittelyiden  näyteruukuissa  oli  viisi  kasvia.  Viikon  12  jälkeen öljyllä

saastutetun  kasvikäsittelyn  (ÖKR)  ruukuissa  oli  jokaisessa  viisi  kasvia,  mutta

saastuttamattoman kasvikäsittelyn (PKR) ruukuissa ainoastaan kolme kasvia.

Kasvibiomassa alkoi saastuttamattomassa käsittelyssä (PKR) nousta voimakkaasti viikon 6

jälkeen ja öljyllä saastutetussa käsittelyssä (ÖKR) viikon 8 jälkeen (kuva 14). Käsittelyssä

PKR  kasvibiomassa  oli  viikkojen  6  ja  12  välillä  koko  ajan  selkeästi  korkeampi  kuin

käsittelyssä ÖKR. Niiton jälkeen saastutetun käsittelyn kasvibiomassa eli ensin viikolla 16

matalampi kuin saastuttamattoman käsittelyn,  mutta  saavutti kuitenkin  saastuttamattoman

käsittelyn  kasvibiomassan  kokeen  lopussa  (kuva  14).  Tosin  käsittelyssä  ÖKR  oli  tällöin

viisi kasvia ja käsittelyssä PKR vain kolme kasvia.

70

0

1

2

3

4

5

6

7

0 5 10 15 20 25

aika viik koina kokeen alus ta

kasv

ibio

mas

sa (g

 kp)

PKR

ÖKR

Kuva  14.  Kasvibiomassan  tuotto  puhtaassa  (PKR)  ja  polttoöljyllä  saastutetussa(ÖKR) maassa. Viikolla 12 puhtaan maan ruukuista harvennettiin jokaisesta kaksi kasvia, jolloinviikon 12 jälkeen saastuneen maan ruukuissa oli jokaisessa viisi kasvia ja puhtaan maan ruukuissakolme kasvia. Viikolla 15 molemmista käsittelyistä niitettiin kaikki kasvit. (Kondo 2006)

Kuvassa  15  on  esitetty  kasvillisen  ja  kasvittoman  polttoöljyllä  saastutetun  maan,  eli

käsittelyjen  ÖKR  ja  Ö,  sekä  saastuttamattoman  kasvillisen  maan  (PKR)  typpipitoisuudet

viikkojen 6  ja 21 välillä. Öljykäsittelyissä  (ÖKR  ja Ö)  maan  typpipitoisuus oli  viikolla 6

lähes  samalla  tasolla.  Tämän  jälkeen  kasvittomassa  öljykäsittelyssä  (Ö)  maan

typpipitoisuus  laski  tasaisesti  kokeen  kuluessa  (kuva  15).  Kasvillisessa  öljykäsittelyssä

(ÖKR)  typpipitoisuus  puolestaan  ensin  nousi  selvästi  viikon  6  ja  12  välissä  ja  taas  laski

viikkojen  12  ja  21  välissä  (kuva  15).  Saatuttamattomassa  kasvikäsittelyssä  (PKR)

typpipitoisuus  oli  koko  kokeen  ajan  matalampi  kuin  öljykäsittelyissä  (ÖKR  ja  Ö).  PKR­

käsittelyssä typpipitoisuus ensin nousi hieman viikkojen 6 ja 12 välillä, mutta laski selvästi

viikolta 12 viikolle 16 (kuva 15).

71

0,05

0,055

0,06

0,065

0,07

0,075

0,08

0,085

0,09

0 5 10 15 20 25

aika viikkoina kokeen alusta

N %

PKR

ÖKR

Ö

Kuva 15. Koemaan typpipitoisuus (% maan kuivapainosta) kasvillisessa (ÖKR),kasvittomassa (Ö) ja steriilissä (ÖS) öljymaassa viikolta 6 viikolle 21. Virhejanatviikoilla 6, 16 ja 21 kuvaavat kolmen ja viikolla 12 kahden rinnakkaisen määrityksen välistäkeskihajontaa. (Kondo 2006)

Kasvihuonekokeen  aikana  suoritettiin  kaikkien  tutkimukseen  osallistuneiden  yhteistyöllä

viikolla  24  kasvillisten  käsittelyjen  (ÖKR  ja  PKR)  ylimääräisten  ruukkujen  (taulukko  3)

rehuvuohenherneille  asetyleeninpelkistysmittaus.  Tehty  asetyleeninpelkistysmittaus  on

esitetty  Kondon  pro  gradu  ­tutkielmassa.  Koska  asetyleeninpelkistysmittausta  ei  tässä

tutkimuksessa suoritettu kvantitatiivisesti, ei eri käsittelyjen typensidontatehokkuutta voitu

vertailla.  Asetyleenin  pelkistysmittauksen  avulla  voitiin  kuitenkin  todeta,  että  sekä

öljykäsittelyn  (ÖKR)  että  saastuttamattoman  käsittelyn  (PKR)  rehuvuohenherneiden

juurissa havaitut juurinystyrät kykenivät sitomaan aktiivisesti typpeä.

Kondo määritti kokeen kuluessa kaikkien maanäytteiden kuivapainot, joita on hyödynnetty

tämän työn tulosten analysoinnissa.

72

6. Tulokset

6.1 Menetelmien testauksen ja optimoinnin tulokset

Testauksen ja optimoinnin tavoitteena oli

1) kehittää MPN­menetelmä polttoöljynhajottajien lukumäärien määritykseen,

2)  selvittää  spektrofotometrisen  mittauksen  ja  PicoGreen®­väriaineeseen  perustuvan

mittauksen soveltuvuutta maa­DNA­uutteiden DNA­pitoisuusmittauksiin,

3)  kehittää  kvantitatiivinen  reaaliaikainen  PCR  naftaleenin  hajotukseen  osallistuvan

nahAc­geenin monistamiseen maa­DNA­uutteista ja

4) valmistaa kvantitatiivissa reaaliaikaisessa PCR:ssä käytettävä standardiplasmidi.

6.1.1 MPN­menetelmän optimointitulokset

MPN­menetelmä  optimoinnin  yhteydessä  testattiin:  1)  WST­1  ja  INT  ­soluhengitys­

indikaattorien  soveltuvuutta  MPN­lukumäärien  määritykseen  2)  absorbanssilukijalla

tehtävän  sameusmittauksen  soveltuvuutta  MPN­lukumäärien  määritykseen  ja  3)

maanäytesuspension seisottamisen vaikutusta saataviin tuloksiin.

WST­ ja INT­reagenssien soveltuvuus polttoöljynhajottajien MPN­

määrityksiinINT­reagenssin  perusteella  saatujen  positiivisten  kaivojen  lukumäärät  kasvihuonekokeen

kerranteen 1 ruukuista otetuista maanäytteistä tehdyillä MPN­näyte­ ja kontrollilevyillä on

esitetty  kuvassa  16.    INT­soluhengitysindikaattorilla  saatujen  tulosten  perusteella  öljyllä

saastutetun kasvillisen  (ÖKR)  ja kasvittoman  (Ö) käsittelyn  näytelevyillä oli  molemmilla

selvästi enemmän positiivisia kaivoja kuin saastuttamattoman kasvillisen käsittelyn (PKR)

näytelevyllä.  Tämän  perusteella  INT­soluhengitysindikaattorin  avulla  voitiin  selvästi

erotella ainakin PKR­käsittely polttoöljyllä saastutetuista käsittelyistä ÖKR ja Ö. Tulosten

lukeminen  käytettäessä  INT­reagenssia  ei  kuitenkaan  ollut  yksiselittteistä,  koska  erot

positiivisten  ja  negatiivisten  kaivojen  välillä  eivät  olleet  silmämääräisesti  arvioituna

selkeitä. Lisäksi käytettäessä INT­reagenssia myös negatiivisilla kontrollilevyillä oli useita

positiivisia kaivoja (kuva 16).

73

Positiivisten kaivojen lukumäärät näytteenottoviikon 0 näytteistä tehdyilläMPN­levyillä yksi vuorokausi INT­lisäyksen jälkeen

0

5

10

15

20

25

Näytelevy Negatiivinenkontrolli

Näytelevy Negatiivinenkontrolli

Näytelevy Negatiivinenkontrolli

ÖKR Ö PKR

Posi

tiivi

sten

 kai

voje

n lu

kum

äärä

Kuva 16. INT­soluhengitysindikaattorin avulla saatujen positiivisten kaivojenlukumäärät näytteenottoviikon 0 MPN­näyte­ ja kontrollilevyillä. ÖKR on öljylläsaastutettu maa kasvilla, Ö öljyllä saastutettu maa ilman kasvia ja PKR saastuttamaton maa kasvilla.

WST­1­reagenssin  perusteella  saatujen  positiivisten  kaivojen  lukumäärät  kerranteen  1

käsittelyjen  ÖKR,  Ö  ja  PKR  näyte­  ja  kontrollilevyillä  yhden,  kahden  ja  kolmen

vuorokauden  jälkeen  WST­lisäyksestä  on  esitetty  kuvassa  17.  Jokaisen  kuluneen

vuorokauden  aikana  ilmestyi  sekä  näytelevyille  että  negatiivisille  kontrollilevyille  uusia

positiivisia reaktiota (kuva 17).

Positiivisten kaivojen lukumäärät näytteenottoviikon 0 näytteistätehdyillä MPN­levyillä 1, 2 ja 3 vuorokautta WST­1 lisäyksen jälkeen

0

5

10

15

20

25

30

35

40

Näytelevy Negatiivinenkontrolli

Näytelevy Negatiivinenkontrolli

Näytelevy Negatiivinenkontrolli

ÖKR Ö PKR

Pos

itiiv

iste

n ka

ivoj

en lu

kum

äärä

1 vrk2 vrk3 vrk

Kuva 17. Positiivisten kaivojen lukumäärät näytteenottoviikon 0 MPN­näyte­ jakontrollilevyillä 1, 2 ja 3 vuorokautta WST­1 lisäyksen jälkeen. ÖKR on öljylläsaastutettu maa kasvilla, Ö öljyllä saastutettu maa ilman kasvia ja PKR saastuttamaton maa kasvilla.

74

Käytettäessä WST­1­soluhengitysindikaattoria ilmestyi negatiivisille kontrollilevyille vielä

enemmän  positiivisia  kaivoja  kuin  käytettäessä  INT­reagenssia  (kuvat  16  ja  17).  Kun

MPN­levyjen  inkubointia  soluhengitysindikaattorien  lisäämisen  jälkeen  oli  jatkettu  yli

viikko, olivat MPN­näytelevyjen kaikki kaivot muuttuneet positiivisiksi,  riippumatta siitä

oliko kaivoon lisätty INT­ vai WST­1­soluhengitysindikaattoria (kuva 18).

               WST­1                   INT                                    WST­1                 INT

Kuva 18. Näytelevy kahden vuorokauden jälkeen WST­1­ ja INT­reagenssienlisäämisestä (vasemmalla) ja sama levy viikon päästä WST­1­ ja INT­reagenssienlisäämisestä (oikealla). MPN­levyn kuuteen ensimmäiseen sarakkeeseen on lisätty WST­1­soluhengitysindikaattoria ja kuuteen viimeiseen sarakkeeseen INT­soluhengitysindikaattoria.WST­1:n pelkistynyt muoto on väriltään keltainen ja INT:n pelkistynyt muoto tummanpunainen.

Koska  sekä  näytelevyille  että  negatiivisille  kontrollilevyille  ilmestyi  WST­1:n  ja  INT:n

kanssa  inkuboitaessa  joka  vuorokausi  uusia  positiivisia  reaktioita,  ei  sopivaa  tulosten

lukuhetkeä  pystytty  kummallekaan  soluhengitysindikaattorille  määrittämään.  Menetelmä,

jossa negatiivinen kontrolli tuottaa positiivisia tuloksia ei ole luotettava. Tästä syystä tässä

tutkimuksessa luovuttiin soluhengitysindikaattorien WST­1 ja INT käytöstä.

Kasvualustan sameuden absorbanssimittaksen soveltuminen

polttoöljynhajottajien MPN­määrityksiinKasvihuonekokeen  aikana  saadut  MPN­tulokset  on  esitetty  kuvissa  19,  20  ja  22.

Öljynhajottajien  lukumäärät  on  esitetty  logaritmisella  asteikolla  ja  tulokset  on  ilmoitettu

yhden  maanäytegramman  kuivapainoa  kohden.  Kuviin  merkityt  virhejanat  ilmaisevat  95

prosentin luottamusvälin saaduille MPN­tuloksille.

Kuvassa 19 on esitetty näytteenviikkojen 0 ja 3 MPN­tulokset. Näytteenottoviikoilla 0 ja 3

MPN­levyt  luettiin  WST­1:n  referenssiaallonpituudella  ei  aallonpituudella  620  nm.

75

Saaduista  tuloksista  havaittiin,  että  negatiivisilla  kontrollilevyillä  absorbanssiarvo  jäi,

matalinta  laimennusta  ja  satunnaisia  kaivoja  lukuunottamatta,  kaikissa  kaivoissa  selvästi

alle  absorbanssiarvon  0,1  (liite  4).  Näytelevyillä  raja­arvon  0,1  ylittäviä  kaivoja  oli

öljykäsittelyistä  (ÖKR  ja  Ö)  tehdyillä  MPN­näytelevyillä  viidessä  ensimmäisissä

laimennuksessa  ja  saastuttamattomassa  kasvikäsittelyssä  (PKR)  kolmessa  ensimmäisessä

laimennuksessa  (liite  4).  Saaduista  tuloksista  pääteltiin,  että  absorbanssiarvon  0,1

ylittyminen  kaivossa,  MPN­näytelevyjen  matalinta  laimennusta  lukuunottamatta,  johtui

polttoöljyä hyödyntävien mikrobien kasvun aikaansaamasta kasvualustan samentumisesta.

Mikrobikasvu kuoppalevyillä varmistettiin vielä mikroskopoimalla.

Kaivot, joiden absorbanssi saavutti valitun raja­arvon 0,1 laskettiin positiiviseksi ja kaivot,

joiden absorbanssi oli  alle  0,1  laskettiin  negatiivisiksi. Valitulla  raja­arvolla  negatiivisilla

kontrollilevyillä  oli  muutamia  positiivisia  kaivoja  matalimmissa  laimennoksissa  (liite  4).

Tämä kuitenkin sallittiin, koska niissä  laimennoksissa,  joiden perusteella öljykäsittelyiden

MPN­lukumäärät määritettiin, ei positiivisia kaivoja negatiivisilla kontrollilevyillä ollut.

Näytteenottoviikolla  0,  eli  kylvöhetkellä,  tehtiin  MPN­levyt  kaikista  käsittelyistä  ja

näytteenottoviikolla 3 öljyllä saastutetuista käsittelyistä (ÖKR ja Ö). Näytteenottoviikolla 0

eli  kolme  päivää  polttoöljysaastutuksen  jälkeen  käsittelyjen  ÖKR  ja  Ö

polttoöljynhajotukseen kykeneviä mikrobien MPN­lukumäärät olivat  jo noin satakertaiset

saastuttamattoman  maan käsittelyyn  (PKR)  verrattuna  (kuva 19). Näytteenottoviikkoon 3

mennessä  polttoöljynhajotukseen  kykenevien  mikrobien  MPN­lukumäärät  olivat

molemmissa  öljyllä  saastutetuissa  käsittelyissä  (ÖKR  ja  Ö)  selvästi  nousseet

näytteenottoviikolta 0 (kuva 19).

76

Polttoöljynhajottajien  MPN­lukumäärät näytteenottoviikoilla 0 ja 3

10000

100000

1000000

10000000

100000000

Viikko 0 Viikko 3

Näytteenottoviikko

MPN

 / g 

(d. w

.)

PKR kerranne 1PKR kerranne 2ÖKR kerranne 1ÖKR kerranne 2Ö kerranne 1Ö kerranne 2

Kuva 19. MPN­tulokset näytteenottoviikoilta 0 ja 3.

Näytteenottoviikolla  3  MPN­levyjä  luettiin  aallonpituuden  620  nm  lisäksi  myös

aallonpituuksilla  500  nm  ja  450  nm  selkeämmin  negatiivisia  ja  positiivisia  kaivoja

erottelevan mittausaallonpituuden löytämiseksi. Tällöin todettiin, että aallonpituudella 450

nm positiivisten ja negatiivisten kaivojen absorbassiarvojen ero oli suurempi kuin käytössä

olevalla  aallonpituudella  620  nm  (liite  5).  Suurempi  absorbanssiero  positiivisten  ja

negatiivisten  kaivojen  välillä  parantaa  saatujen  tulosten  luotettavuutta.  Lisäksi  todettiin,

että  muutamat  kaivot  MPN­näytelevyillä,  jotka  aallonpituudella  620  nm  mitattuna  jäivät

hieman alle  valitun  raja­arvon  0,1,  ylittivät  raja­arvon aallonpituudella 450  nm  mitattuna

(liite  5).  Tämä  puolestaan  lisää  menetelmän  herkkyyttä.  Koska  MPN­levyjen  lukeminen

aallonpituudella  450  nm  lisäsi  tulosten  luotettavuutta  sekä  menetelmän  herkkyyttä

siirryttiin viikon 3 jälkeen mittaamaan levyt aallonpituudella 450 nm.

Kuvassa 20 on esitetty näytteenottoviikkojen 6 ja 8 MPN­tulokset. Näytteenottoviikolla 6

MPN­levyt  tehtiin öljyllä  saastutetuista  käsittelyistä  (ÖKR  ja Ö)  ja  näytteenottoviikolla  8

kaikista  käsittelyistä.  Näytteenottoviikolla  6  käsittelyiden  ÖKR  ja  Ö  MPN­lukumäärät

olivat  hieman  korkeampia  kuin  näytteenottoviikolla  8.  Käsittelyjen  ÖKR  ja  Ö  välillä  ei

havaita  eroja  kummallakaan  näytteenottoviikolla.  Näytteenottoviikolla  8

saastuttamattoman  kasvikäsittelyn  (PKR)  polttoöljynhajotukseen  kykenevien  mikrobien

MPN­lukumäärät  olivat  yhä  noin  100­kertaa  matalammat  kuin  käsittelyissä  ÖKR  ja  Ö

(kuva 20).

77

Polttoöljynhajottajien MPN­lukumäärät näytteenottoviikoilla  6 ja 8

10000

100000

1000000

10000000

100000000

1000000000

Viikko 6 Viikko 8

Näytteenottoviikko

MPN

 / g 

(d. w

.) PKR keranne 1PKR kerranne 2ÖKR kerranne 1ÖKR kerranne 2Ö kerranne 1Ö kerranne 2

Kuva  20.  MPN­tulokset  näytteenottoviikoilta  6  ja  8. Näytteenottoviikon  6  kasvittomanöljykäsittelyn (Ö) kerranteen 2 tuloksia ei ole kuvassa.

Kuvassa  21  on  esitetty  näytteenottoviikolla  8  tehdyn  maanäytesuspension  seisotusajan

testauksen  tulokset.  Kuvassa  21  on  esitetty  positiivisten kaivojen  lukumäärät  5,  10  ja  20

minuutin  seisotusajan  jälkeen  tehdyillä  MPN­levyillä.  Saatujen  tulosten  perusteella

maasuspension  seisotusajalla  oli  suuri  vaikutus  positiivisten  kaivojen  lukumääriin

negatiivisilla kontrollilevyillä. Kun seisotusaikaa pidennettiin 20 minuuttiin, päästiin eroon

kaikista positiivisista kaivoista negatiivisilla kontrollilevyillä. Saatujen tulosten perusteella

maanäytesuspension  seisotusajan  pidentäminen  ei  merkittävästi  vaikuttanut  MPN­

näytelevyiltä  saataviin  tuloksiin.  Koska  seisotusajan  pidentäminen  selkeästi  vähensi

asetetun  absorbanssin  raja­arvon  0,1  ylittäviä  kaivoja  negatiivisilla  kontrollilevyillä,

siirryttiin tämän tuloksen perusteella jatkossa käyttämään 20 minuutin seisotusaikaa.

78

Seisotusajan vaikutus positiivisten kaivojenlukumääriin MPN­levyillä

010

2030

40

Näytelevy Negatiivinenkontrollilevy

Posi

tiivi

sten

 kai

voje

nlu

kum

äärä 5 min

10 min20 min

Kuva 21. Positiivisten kaivojen lukumäärät näytteenottoviikon8 kasvillisen öljykäsittelyn (ÖKR) MPN­näytelevyllä ja negatiivisellakontrollilevyllä.

Kuvassa  22  on  esitetty  kasvihuonekokeen  viimeiset  MPN­tulokset,  eli  tulokset

näytteenottoviikoilta  12,  16  ja  21.  Näitä  MPN­levyjä  tehtäessä  maasuspension

seisotusaikana käytettiin 20 minuuttia.

Näytteenottoviikolla 12 tehtiin MPN­levyt öljyllä saatutetuista käsittelyistä (ÖKR ja Ö) ja

näytteenottoviikoilla  16  ja  21  kaikista  käsittelyistä.  Saadut  tulokset  osoittivat,  että

näytteenottoviikon  12  jälkeen  polttoöljynhajottajien  MPN­lukumäärät  laskivat  selvästi

molemmissa öljykäsittelyissä (ÖKR ja Ö) sekä viikolle 16 että viikolle 21 mentäessä. Eroja

käsittelyiden  ÖKR  ja  Ö  välillä  ei  näissä  viimeisissäkään  MPN­tuloksissa  nähty.  Erot

saastuttamattoman  kasvikäsittelyn  (PKR)  ja  öljykäsittelyiden  (ÖKR  ja  Ö)  välillä  olivat

puolestaan selvästi tasaantuneet kasvihuonekokeen loppua kohden. Viikolla 21 käsittelyjen

ÖKR  ja  Ö  polttoöljynhajottajien  MPN­lukumäärä  oli  enää  noin  kymmenkertainen

verrattuna käsittelyyn PKR (kuva 22).

79

Polttoöljyhajottajien MPN­lukumäärät näytteenottoviikoilla 12, 16 ja 21

10000

100000

1000000

10000000

100000000

Viikko 12 Viikko 16 Viikko 21

Näytteenottoviikko

MP

N / 

g (d

. w.)

PKR keranne 1PKR kerranne 2ÖKR kerranne 1ÖKR kerranne 2Ö kerranne 1Ö kerranne 2

Kuva 22. MPN­tulokset viikoilta 12, 16 ja 21.

6.1.2 NanoDrop®­ ja PicoGreen® ­menetelmien arviointi

NanoDrop®­UV­Vis­spektrofotometrin  toimivuutta  puhtaille  DNA­uutteille  arvoitiin

mittaamalla  Q­RTm­PCR:ssä  standardina  käytetyn  PCR­tuotteen  pitoisuus  eri

laimennuksissa  (taulukko  13).  Lisäksi  vertailtiin  joidenkin  maa­DNA­uutteen  avulla

NanoDrop®­  ja  PicoGreen®  ­menetelmien  antamia  tuloksia  ja  arvioitiin  molempien

menetelmien  soveltuvuutta  maa­DNA­uutteiden  DNA­pitoisuuden  mittaukseen  (taulukko

14).

Taulukossa  13  on  esitetty  Q­RTm­PCR:n  standardina  käytetyn  PCR­tuotteen

mittaustulokset.  DNA­pitoisuuden  lisäksi  taulukossa  on  esitetty  NanoDop®­laitteen

antamat DNA:n puhtaudesta kertovat suhdeluvut A260nm/A230nm  ja A260nm/A280nm. Taulukon

13  tuloksista  nähdään,  että  DNA­pitoisuudet  eri  laimennuksissa  vastaavat  hyvin  näytteen

laimennustasoa. Lisäksi NanoDop®:n rinnakkaiset mittaukset olivat hyvin lähellä toisiaan.

Suhdelukujen  A260nm/A230nm  ja  A260nm/A280nm  arvot  sekä  DNA­uutteen  spektri  (kuva  23)

osoittivat PCR­tuotteen olevan hyvin puhdasta DNA:ta.

80

Taulukko 13. Q­RTm­PCR:n standardina käytetyn PCR­tuotteen NanoDrop® ­mittaustulokset.

Näyte DNA­pitoisuus  A260nm/A230nm A260nm/A280nm

Laimentamaton PCR­tuote 72 ng/ l 1,8 1,9

1/5­laimennettu PCR­tuote 13 ng/ l  2,1 1,9

1/10­laimennettu PCR­tuote 7 ng/ l 2,0 1,9

Kaikki taulukossa esitetyt tulokset ovat seitsemän rinnakkaisen mittauksen keskiarvoja. Hajontarinnakkaisten mittausten välillä oli ±1 ng/ l.

Taulukossa 14 on esitetty maa­DNA­uutteiden NanoDrop® ja PicoGreen® ­mittaustulokset.

Saaduista  tuloksista  nähtiin  selvästi,  että  maa­DNA­uutteet  olivat  erittäin  epäpuhtaita,

koska  erityisesti  A260nm/A230nm­suhdeluvun  arvo  oli  kaukana  puhtaan  DNA:n  arvosta

(taulukko  13).  Taulukon  14  perusteella  NanoDrop®:lla  saadut  mittaustulokset  olivat

kaikille  mitatuille  maa­DNA­uutteille monikertaiset verrattuna PicoGreen®  ­menetelmällä

saatuihin tuloksiin.

Taulukko 14. Maa­DNA­uutteiden NanoDrop® ja PicoGreen® ­mittaustulokset sekäNanoDrop® ­laitteen antamat puhtausarvot A260nm/A230nm ja A260nm/A280nm maa­DNA­uutteille.

DNA­pitoisuusNäyte

NanoDrop®  PicoGreen®A260nm/A230nm A260nm/A280nm

PKR_viikko 0 53 ng/ l 11 ng/ l 0,20 1,5

ÖKR_viikko 0 63 ng/ l 13 ng/ l 0,35 1,5

Ö_viikko 0 88 ng/ l 15 ng/ l 0,34 1,5

PKR_viikko 1 130 ng/ l 11 ng/ l 0,34 1,3

ÖKR_viikko 1 86 ng/ l 19 ng/ l 0,30 1,4

Ö_viikko 1 160 ng/ l 23 ng/ l 0,42 1,4

PKR_viikko 21 140 ng/ l 41 ng/ l 0,44 1,5

ÖKR_viikko 21 140 ng/ l 40 ng/ l 0,40 1,5

Ö_viikko 21 98  ng/ l 38 ng/ l 0,38 1,6Mittaustulokset  on  esitetty  taulukossa  yhtä  mikrolitraa  DNA­uutetta  kohden.  ÖKR  on  öljylläsaastutettu maa kasvilla, Ö öljyllä saastutettu maa ilman kasvia ja PKR saastuttamaton maa kasvilla.Mittaukset on tehty ilman rinnakkaisia määrityksiä.

81

Kuvassa  23  on  esitetty  NanoDrop­laitteen  antamat  spektrit  Q­RTm­PCR:ssä  standardina

käytetylle PCR­tuotteelle (vasemmalla) ja maa­DNA­uutteelle (oikealle). Q­RTm­PCR:ssä

käytetyn  standardi­PCR­tuotteen  spektrissä  nähdään  selvä  absorptiomaksimi  260  nm:ssä

eli  DNA:n  absorptiomaksimissa.  Maa­DNA­uutteen  absorptiomaksimi  on  220  nm:ssä  tai

sen alapuolella.  Myös proteiinien  absorptiomaksimissa  230  nm:ssä on  maa­DNA­uutteen

absorptio paljon suurempaa kuin DNA:n absorptiomaksimissa 260 nm:ssä.

Kuva 23. NanoDrop®­laitteen antamat spektrit Q­RTm­PCR:ssä käytetylle PCR­tuotteelle(vasemmalla) ja näytteenottoviikon 0 kasvillisen öljykäsittelyn (ÖKR) maa­DNA­uutteelle(oikealla).

6.1.3 NahAc­geenin monistuminen kasvihuonekokeen näytteistä

Reaaliaikaisella  kvantitatiivisella  PCR:llä  haluttiin  tässä  tutkimuksessa  selvittää nahAc­

geenikopiolukujen  vaihtelua  eri  käsittelyiden  ja  eri  näytteenottoviikkojen  välillä.

Ensimmäiseksi  haluttiin  määrittää  maa­DNA­uutteista  sopiva  laimennustaso  Q­RTm­

PCR:ää varten. Tutkimuksessa haluttiin lisäksi valmistaa plasmidi,  joka sisältäisi Q­RTm­

PCR:ssä  monistettavan nahAc­geenifrakmentin.  Tätä  plasmidia  voitaisiin  silloin  käyttää

PCR­tuotteen sijasta standardina Q­RTm­PCR:ssä.

Kun  standardiksi  valmistetun  plasmidin  monistumista  Q­RTm­PCR:llä  testattiin,  ei

yhdestäkään standardiplasmidin  laimennuksesta  saatu PCR­tuotetta. Tästä  syystä kaikissa

esitetyissä Q­RTm­PCR­ajoissa on käytetty standardina Pseudomonas putida G7­kannasta

Baldwinin  ym.  (2003)  NAH­alukkeilla  monistettua  PCR­tuotetta.  Standardiplasmidin

valmistus ja sen toimimattomuuden selvittäminen on esitetty osiossa 6.1.4.

82

Kuvassa 24 on esitetty näytteenottoviikon 0 öljyllä saastutetun kasvillisen käsittelyn (ÖKR)

DNA­uutelaimennusten 10­1,  10­2,  10­3  ja  10­4  amplifikaatiokäyrät.  Koska  kaikki  näytteet

saavuttivat  fluoresenssin  kynnysarvon  vasta  pienimmän  standardin  jälkeen,  ei

geenikopiolukua  näytteille  tässä  ajossa  voitu  määrittää.  Standardina  ajossa  käytettiin

standardi­PCR­tuotteen  kuutta  peräkkäistä  kymmenkertaista  laimennusta,  joista  tehtiin

jokaisesta  kolme  rinnakkaista  reaktiota.  Standardi­PCR­tuotteen  tarkkaa  kopiolukua  ei

ollut vielä tässä vaiheessa määritetty.

Kuvasta  24  nähtiin,  että  monistuminen  oli  heikointa  näytelaimennuksista  10­1  ja  10­2.

Nämä  näytteet  eivät  saavuttaneet  fluoresenssin  kynnysarvoa  lainkaan  45  PCR­syklin

aikana.  Näytelaimennus  10­3  saavutti  fluoresenssin  kynnysarvon  noin  syklillä  34  ja

näytelaimennus 10­4 noin syklillä 37. Paras amplifikaatio saatiin siis näytelaimennoksesta

10­3. Kuvassa 32 on esitetty selkeyden vuoksi  jokaisesta laimennuksesta vain yhden PCR­

reaktion  amplifikaatio  kolmesta  rinnakkaisesta.  Rinnakkaisten  näytteiden  kynnyssykli

vaihteli  laimennosten  10­3  ja  10­4  kohdalla  useitakin  syklejä.  Kuvaan  24  valittiin

molemmista  laimennuksista  sen  reaktion  amplifikaatiokäyrä,  jonka  kynnyssykli  oli

kolmesta rinnakkaisesta tuloksesta keskimmäinen.

Kuva 24. Näytteenottoviikon 0 saastutetun kasvikäsittelyn (ÖKR) DNA­uutelaimennusten monistuminen Q­RTm­PCR:llä. Kuvassa on esitetty selkeydenvuoksi jokaisesta laimennuksesta vain yhden PCR­reaktion amplifikaatio kolmestarinnakkaisesta.

83

Kuvassa 25 on esitetty yhden negatiivisen kontrollin, yhden standardi­PCR­tuotteen, sekä

yhden maa­DNA­näytteen sulamiskäyräanalyysi. Kuvaan 25 valitut näytteet olivat kuvassa

24 esitetystä ajosta. Kuvassa 25 nähdään  yhteensä kolme sulamispiikkiä. Alukedimeerien

sulamispiikki  oli  noin  72  ºC:n  kohdalla.  Tämä  näkyi  ainoana  piikkinä  negatiivisessa

kontrollissa. Suurin sulamispiikki  sulamiskäyräanalyysissä nähtiin  noin 87  ºC:n kohdalla.

Se  oli  suurin  piikki  sekä  standardin  että  maa­DNA­uutteen  sulamiskäyräanalyysissä.

Lisäksi maa­DNA­uutteen sulamiskäyräanalyysissä näkyi pieni piikki noin 82 ºC kohdalla.

Kuva 25. Näyte­DNA:n 10­3­laimennuksen, negatiivisen kontrollin sekä standardi­PCR­tuotteen reaktiotuotteiden sulamiskäyrät.

Kuvassa 26 on esitetty viikkojen 0, 3, 8 ja 21 öljyllä saastutetusta kasvillisesta käsittelystä

(ÖKR)  eristettyjen  DNA­uutteiden  monistuminen  Q­RTm­PCR:llä.  Kaikkien  näiden

näytteiden  maa­DNA­uutteista  tehtiin  10­3­laimennukset,  joista  tehtiin  Q­RTm­PCR:ään

kolme  rinnakkaista  reaktiota.    Kuvaan  26  on  merkitty  kaikkien  standardien  kopioluvut.

Kaikki  standardien  kolme  rinnakkaista  reaktiota  saavuttivat  fluoresenssin  kynnysarvon

samalla syklillä, lukuunottamatta pienintä standardia, jonka geenikopioluku oli kymmenen

kopiota.

84

Kaikki tutkitut näytteet saavuttivat fluoresenssin kynnysarvon vasta pienimmän standardin

jälkeen  (kuva  26).    Näin  ollen  tässäkään  ajossa  ei  pystytty  määrittämään  näytteiden

kopiolukuja.  Kaikista  tutkituista  näytteistä  monistui  joko  hyvin  heikosti  tai  ei  ollenkaan

nahAc­geeniä.  Kaikkien  näytteiden  geenien  kopioluvut  jäivät  alle  detektiorajan  eli  alle

kymmenen geenikopion.

Kuva 26. Näytteenottoviikkojen 0, 3, 8 ja 21 maa­DNA­uutteiden monistuminen Q­RTm­PCR:llä. Kuvassa ei selvyyden vuoksi ole esitetty kaikkia näytteiden rinnakkaistenreaktioiden tuloksia.

6.1.4 NahAc­fragmentin siirtyminen plasmidiin

Tutkimuksessa  haluttiin  valmistaa  Q­RTm­PCR:ssä  käytettävä  standardiplasmidi,  joka

sisältäisi  Q­RTm­PCR:ssä  monistettavan nahAc­geenifragmentin.  Koska  plasmidiin

haluttiin  siirtää  hieman  pidempi  fragmentti  kuin  mitä  Q­RTm­PCR:llä  monistettiin,

suunniteltiin  työssä  nah_pitkä­alukkeet  (taulukko  11),  jotka  kiinnittyivät  P.  putida  G7  –

kannan nahAc­geeniin  noin 20 nukleotidiä Q­RTm­PCR:ssä käytettyjen NAH­alukkeiden

(taulukko  7)  ulkopuolelle.  Näiden  alukkeiden  avulla  monistettiin  423  emäsparin  pituista

palaa P. putida G7 –kannan nahAc­geenistä pesäke­PCR:llä. Monistettu nahAc­fragmentti

haluttiin tämän jälkeen liittää pCR®2.1­TOPO®­kloonausvektoriin.

85

Työssä  suunnittellut  alukkeet  monistivat P.  putida  G7  –kannan nahAc­geenistä  geeliltä

arvioituna  oikeankokoista  eli  423  emäsparin  pituista  palaa  (kuva  27).  Kuvan  perusteella

kloonattavaksi valittiin PCR­tuote 1.

     2045 bp     1605 bp     1198 bp       676 bp517­350 bp

Kuva 27. P. putida G7 –kannasta nah_pitkä­alukkeilla monistetut PCR­tuotteet.

Kloonauksen  onnistuminen  todettiin  ensin  tekemällä  kloonauskitin  M13  –alukkeilla

valituista klooneista pesäke­PCR (kuva 28). Monistettavan PCR­tuotteen odotettu koko oli

625 emäsparia. Klooneista 6, 7, 9, 12 ja 14, PCR ei saatu lainkaan PCR­tuotetta (kuva 28).

Klooneihin  15  ja  16  oli  siirtynyt  insertti  oli  pieni.  Myös  kloonin  1  PCR­tuote  on  silmin

havaittavasti pienempi kuin muista klooneista saadut PCR­tuotteet.

             1    2   3  4   5   6   7   8   9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22

2645 bp

1605 bp1198 bp  676 bp  517 bp

Kuva  28.  Kloonauksen  onnistumisen  tarkistus.  Valituista  klooneista  M13  –alukkeillasaadut  PCR­tuotteet.

1. pGEM®­DNA­markkeri2. PCR­tuote 13. PCR­tuote 24. PCR­tuote 35. pGEM®­DNA­markkeri6. Negatiivinen kontrolli7. Negatiivinen kontrolli

1. pGEM®­molekyylipainomarkkeri          12. pGEM®­molekyylipainomarkkeri2. PCR­tuote kloonista 1                            13. PCR­tuote kloonista 113. PCR­tuote kloonista 2                            14. PCR­tuote kloonista 124. PCR­tuote kloonista 3                            15. PCR­tuote kloonista 135. PCR­tuote kloonista 4                            16. PCR­tuote kloonista 146. PCR­tuote kloonista 5                            17. PCR­tuote kloonista 157. PCR­tuote kloonista 6                            18. PCR­tuote kloonista 168. PCR­tuote kloonista 7                            19. Negatiivinen kontrolli9. PCR­tuote kloonista 8                            20. Negatiivinen kontrolli10. PCR­tuote kloonista 9                          21. Negatiivinen kontrolli11. PCR­tuote kloonista 10                        22. pGEM®­molekyylipainomarkkeri

 1   2    3   4    5   6   7

86

Koska  kuvan  28  molekyylipainomarkkerissa  alle  517  emäsparin  vyöhykkeet  eivät

erottuneet hyvin geeliltä, varmistettiin oikean kokoisen insertin siirtyminen klooneihin 2, 3,

4,  5,  8,  10,  11  ja  13  tekemällä  vielä  PCR  nah_pitkä­alukkeilla  (kuva  29).  Kaikista

klooneista  saatiin  PCR­tuotetta,  jonka  koko  oli  geeliltä  arvioituna  oikea  eli  noin  423

emäsparia. Plasmidin eristys tehtiin kuvien 29 klooneista 3, 4, 8 ja 10.

             1   2    3   4    5   6    7   8    9   10  11  12

2645 bp

1198 bp676 bp

  517 bp

Kuva 29. Klooneista nah_pitkä­alukkeille         saadut PCR­tuotteet.

Standardi­plasmidin toimimattomuuden selvittäminen

Kun  kloonatuista  plasmideista  ei  saatu  lainkaan  tuotetta Q­RTm­PCR:n  NAH­alukkeilla,

haluttiin syy tähän selvittää. Tämä tehtiin selvittämällä, onko tutkimuksessa suunnitelluilla

nah_pitkä­alukkeilla saatu monistettua P. putida G7­kannasta oikeaa tuotetta ja onko tämä

tuote saatu siirrettyä kloonattuihin plasmideihin.

Kun  sekä P.  putida  G7­kannasta  että  klooniplasmideista  nah_pitkä­alukkeilla  monistetut

PCR­tuotteet  ajettiin  rinnakkain  hitaasti  agaroosigeelille,  todettiin,  että  nah_pitkä­

alukkeilla monistui P.  putida G7­kannasta oikean, 423 emäsparin pituisen, PCR­tuotteen

lisäksi myös toista hieman oikeaa tuotetta lyhyempää epäspesifistä PCR­tuotetta (kuva 30).

Kun  näiden  fragmenttien  ajautumista  agaroosigeelillä  verrattiin  klooniplasmideista

nah_pitkä­alukkeilla  monistuneen  fragmentin  ajautumiseen,  todettiin,  että

klooniplasmideihin  oli  kloonauksessa  siirtynyt  oikean  PCR­tuotteen  sijasta  tätä  oikeaa

PCR­tuotetta hieman lyhyempi epäspesifinen tuote (kuva 30).

1. pGEM®­DNA­markkeri2. PCR­tuote kloonista 23. PCR­tuote kloonista 34. PCR­tuote kloonista 45. PCR­tuote kloonista 56. PCR­tuote kloonista 87. PCR­tuote kloonista 108. PCR­tuote kloonista 119. PCR­tuote kloonista 1310. Negatiivinen kontrolli11. Negatiivinen kontrolli12. pGEM®­DNA­markkeri

87

            1    2   3   4   5    6   7   8   9   10 11

2645 bp1605 bp1198 bp

  676 bp  517 bp    460 bp    396 bp

Kuva 30. Kahdesta kloonatusta plasmidista sekä P. putida G7­kannastanah_pitkä­alukkeilla monistetut PCR­tuotteet ajettuna 2 %:lla agaroosigeelillä.

6.2 Ritsoremediaatioprosessin seuranta

6.2.1 Kasvien kasvu

Rehuvuohenherneiden  kasvua  ÖKR­  ja PKR­käsittelyiden  näyteruukuissa  seurattiin  koko

kokeen  ajan  silmämääräisesti.  Lisäksi  Kondo  (2006)  määritti  kasvillisista  käsittelyistä

(ÖKR ja PKR) kaikkien näytteenottojen yhteydessä kasvibiomassan (kuva 14).

Ensimmäisessä  kylvössä  istutettujen  kahdenkymmenen  vuohenherneen  siemenen

itämisprosentti  oli  sekä  öljyllä  saastutetussa  (ÖKR)  että  saastuttamattomassa  (PKR)

kasvillisessa  käsittelyssä  noin  30  %.  Monet  näistä  ensimmäisessä  kylvössä  istutuista

siemenistä  kuitenkin  kuolivat  hieman  itämisensä  jälkeen.  Viikolla  1  tehdyssä

paikkauskylvössä  5  cm:n  syvyyteen  istutetut  siemenet  itivät  huomattavasti  paremmin

eivätkä  myöskään  kuolleet  itämisen  jälkeen.  Vaikka  siementen  itämistehokkuudessa  ei

ollut  ÖKR­  ja  PKR­käsittelyiden  välillä  selkeitä  eroja,  rehuvuohenherneen  taimet

kasvoivat itämisen jälkeen huomattavasti hitaammin ÖKR­käsittelyn ruukuissa kuin PKR­

käsittelyn  ruukuissa  (kuvat  31  ja  32).  Vaikka  kasvien  kasvu  ÖKR­käsittelyssä  kiihtyi

kokeen  edetessä,  olivat  kasvit  ÖKR­ruukuissa  vielä  koeviikolla  10  huomattavasti

pienempiä kuin PKR­käsittelyn kasvit (kuvat 14 ja 33).

Viikolla  14  PKR­käsittelyn  kasvit  alkoivat  näyttää  huonovointisilta  (kuvat  34  ja  35).

Viikolla  14  tehdystä  lannoituksesta  huolimatta  viikolla  15  PKR­käsittelyn  kasvit  olivat

alkaneet  jo lakastua ja myös ÖKR­käsittelyn kasvit alkoivat kellastua. Viikolla 15 tehdyn

niiton  jälkeen  sekä  ÖKR­  että  PKR­käsittelyihin  kasvoi  muutamassa  päivässä  uudet

1. pGEM®­DNA­markkeri2. PCR­tuote kloonatusta plasmidista3. PCR­tuote kloonatusta plasmidista4. PCR­tuote P. putida G7 pesäkkeestä5. PCR­tuote P. putida G7 pesäkkeestä6. PCR­tuote P. putida G7 pesäkkeestä7. PCR­tuote P. putida G7 pesäkkeestä8. PCR­tuote P. putida G7 pesäkkeestä9. PCR­tuote P. putida G7 pesäkkeestä10. Negatiivinen kontrolli11. pGEM®­DNA­markkeri

88

terveen  näköiset  versot.  Niiton  jälkeen  kasvit  ÖKR­käsittelyissä  kasvoivat  jo  lähes  yhtä

nopeasti kuin PKR­käsittelyssä (kuvat 14 ja 36).

Viikolla  6  harvennuksen  yhteydessä  poistettujen  kasvien  juurissa  oli  havaittavissa  paljon

vaaleanpunaisia  juurinystyröitä  (kuva  32).  Juurinystyröiden  määrässä  ei  havaittu

merkittävää  eroa  saastuttamattoman  maan  ja  öljymaan  kasvien  välillä.  Jatkossa  kaikkien

näytteenottojen  yhteydessä  havaittiin  kaikissa  kasveissa  runsaasti  vaaleanpunaisia

juurinystyröitä.  Asetyleeninpelkistysmittausten  (Kondo  2006)  perusteella  voitiin  todeta,

että havaitut juurinystyrät sitoivat aktiivisesti typpeä.

89

Rehuvuohenherneiden kasvu kasvihuonekokeen aikana

Kuva 31. Rehuvuohenherneet viikolla 5.            Kuva 32. Näytteenottoviikolla 6Vasemmalla kasvit saastuttamattomassa maassa ÖKR­ruukusta harvennettu kasvi.(PKR) ja oikealla polttoöljyllä saastutetussa          Kasvi on kuvassa noin 5 cm pituinen.maassa (ÖKR). Kuvan ottanut Anu Mikkonen.

Kuva 33. Rehuvuohenherneet         Kuva 34. Kasvihuonekokeen jäljellä olevatviikolla 10. Vasemmalla PKR­ ruukut viikolla 13. Kuvan ottanut Anu Mikkonen.käsittely ja oikealla ÖKR­käsittely.Kuvan ottanut Anu Mikkonen.

Kuva 35. Rehuvuohenherneet viikolla    Kuva 36. Viikon 21 näytteenottoruukut.14. PKR­käsittelyssä (vasemmalla)            Käsittelyt vasemmalta oikealle ovat PKR, Ö,kasvin lehdet ovat jo selvästi kellastuneet. ÖS ja ÖKR.

90

6.2.2 Polttoöljynhajottajien MPN­lukumäärien vaihtelu kokeen aikana

MPN­menetelmän  avulla  haluttiin  tutkia,  lisääkö  rehuvuohenherne  kasvihuonekokeessa

polttoöljynhajotukseen  kykenevien  mikrobien  lukumääriä.  Kasvittoman  ja  kasvillisen

polttoöljyllä  saastutetun  maan,  eli  käsittelyiden  ÖKR  ja  Ö,  MPN­lukumääriä  vertailtiin

näytteenottoviikoilla 0,  3,  6,  8,  12, 16  ja 21. Lisäksi käsittelystä PKR määritettiin MPN­

lukumäärät viikoilla 0, 6, 8, 16 ja 21. Vertailemalla käsittelyistä ÖKR ja Ö saatuja tuloksia

käsittelyn  PKR  tuloksiin,  voitiin  selvittää,  lisääkö  polttoöljysaastutus  polttoöljyn

hajotukseen kykenevien mikrobien lukumääriä maassa.

Kuvaan 37  on  koottu  kaikki  kasvihuonekokeen  MPN­tulokset. Esitetyt  MPN­lukumäärät

on määritetty kasvualustan sameuden absorbanssimittauksen perusteella. Käytettyyn MPN­

menetelmään  tehtiin  kaksi  muutosta  tutkimuksen  aikana.  Näytteenottoviikon  3  jälkeen

muutettiin  mittausaallonpituus  620  nm:stä  450  nm:iin.  Näytteenottoviikon  8  jälkeen

siirryttiin  käyttämään  viiden  minuutin  sijasta  20  minuutin  seisotusaikaa

maanäytesuspensiolle ennen laimennussarjan valmistamista näytteestä. Ajankohdat, jolloin

muutokset tehtiin, on merkitty kuvaan 37 väleinä näytteenottoviikkojen 3 ja 6 sekä 8 ja 12

välissä.

Polttoöljynhajottajien MPN­lukumäärät eri näytteenottoviikoilla

10000

100000

1000000

10000000

100000000

1000000000

Viikko0

Viikko3

Viikko6

Viikko8

Viikko12

Viikko16

Viikko21

Näytteenottoviikko

MP

N / g

 (d. w

.)

PKR keranne 1PKR kerranne 2ÖKR kerranne 1ÖKR kerranne 2Ö kerranne 1Ö kerranne 2

Kuva 37. Kasvihuonekokeen MPN­tulokset. Viikkojen 3 ja 6 sekä 8 ja 12 välissämenetelmää on hieman muutettu optimoinnin seurauksena.

91

Koska  menetelmää  on  tutkimuksen  aikana  kaksi  kertaa  hiukan  muutettu,  ei  kaikkien  eri

näytteenottoviikkojen  tuloksia  voida  täysin  luotettavasti  vertailla  keskenään.  Tuloksista

voitiin  kuitenkin  sanoa,  että  polttoöljynhajottajien  todennäköisimmät  lukumäärät

öjykäsittelyissä (ÖKR ja Ö) nousivat selvästi näytteenottoviikolta 0 näytteenottoviikolle 3

ja taas puolestaan laskivat selvästi näytteenottoviikkojen 12 ja 21 välillä (kuva 37).

Polttoöljynhajotukseen  kykenevien  mikrobien  MPN­lukumäärät  saastuttamattomassa

kasvikäsittelyssä  (PKR)  olivat  kaikilla  tutkituilla  näytteenottoviikoilla  huomattavasti

matalammat  kuin  öljykäsittelyissä  (kuva  37).  Kasvihuonekokeen  lopussa  käsittelyn  PKR

MPN­lukumäärät  kuitenkin  lähentyivät  selvästi  öljykäsittelyiden  ÖKR  ja  Ö  MPN­

lukumääriä.

6.2.3 DNA­pitoisuuden vaihtelu kasvihuonekokeen aikana

Maa­DNA­uutteiden  DNA­pitoisuusmittauksiin  soveltuvalla  PicoGreen®­menetelmällä

haluttiin  tutkia  DNA­pitoisuuden  vaihtelua  kasvihuonekokeen  eri  käsittelyissä  kokeen

aikana.  DNA:n  pitoisuusmittaus  tehtiin  kaikista  DNA­uuteista  ilman  rinnakkaisia

mittauksia.

DNA:n  eristykset  oli  tehty  tutkimuksen  aikana  kaikista  näyteruukuista  kahtena

rinnakkaisena uuttona. Jokaisen ruukun kahdesta rinnakkaisesta DNA­uutteesta on laskettu

ensin  DNA­pitoisuuksien  keskiarvo,  jonka  jälkeen  on  määritetty  kolmen  rinakkaisen

ruukun keskiarvo. Tämä keskiarvo on kuvassa 38 esitetty käsittelyiden DNA­pitoisuutena.

Kuvassa  38  esitetyt  virherajat  ovat  rinakkaisten  ruukkujen  DNA­pitoisuuksien

keskihajontoja.

Kaikkien  käsittelyiden  DNA­pitoisuus  nousi  kasvihuonekokeen  aikana  (kuva  38).

Öljykäsittelyjen  ÖKR  ja  Ö  DNA­pitoisuus  nousi  nopeasti  heti  kokeen  alusta  noin

näytteenottoviikolle 3 asti. Tämän jälkeen kasvillisen öljykäsittelyn (ÖKR) DNA­pitoisuus

laski  jyrkästi  viikolle  6,  mutta  nousi  taas  viikkojen  6  ja  12  välillä.  Kasvittomassa

öljykäsittelyssä (Ö) viikon 3 jälkeen DNA­pitoisuus nousi hitaasti viikkojen 6 ja 12 välillä.

Viikon  12  jälkeen  sekä  käsittelyn  ÖKR  että  Ö  DNA­pitoisuus  pysyi  melko  tasaisena

kokeen loppuun eli viikolle 21.

92

Saastuttamaton  kasvikäsittely  (PKR)  erosi  DNA­pitoisuusmittausten  perusteelle  selkeästi

öljykäsittelyistä  ÖKR  ja  Ö  (kuva  38).  Käsittelyn  PKR  DNA­pitoisuus  pysyi  hyvin

tasaisena kokeen alusta noin  viikolle 8 asti. Viikon 8  jälkeen DNA­pitoisuus käsittelyssä

PKR  nousi  ensin  hitaasti,  mutta  kiihtyi  kokeen  loppua  kohden.  Viikolla  21

saastuttamttoman  kasvikäsittelyn  (PKR)  DNA­pitoisuus  tavoitti  jo  öljykäsittelyjen  (ÖKR

ja Ö) DNA­pitoisuudet.

Maanäytteiden DNA­pitoisuudet kasvihuonekokeen aikana

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

0 5 10 15 20 25

Näytteenottoviikko

DNA

­pito

isuu

s (n

g / g

)

ÖKRÖPKR

Kuva 38. PicoGreen®­mittauksella saadut keskimääräiset DNA­pitoisuudetkasvihuonekokeen eri käsittelyille kokeen kuluessa. DNA­pitoisuudet on esitetty kuvassamaanäytteiden kuivapainoja kohden. Virherajoina kuvassa on esitetty mittaustulostenkeskihajonnat.

93

7. Tulosten tarkastelu ja johtopäätökset

7.1 Kasvihuonekokeen ritsoremediaatioprosessin tarkastelu eri

menetelmillä

7.1.1 Kasvien kasvu

Vaikka polttoöljypitoisuuden 3000 ppm havaittiin tässä tutkimuksessa  selvästi hidastavan

rehuvuohenherneiden kasvua (kuvat 31 ja 33), ei se estänyt rehuvuohenherneen itämistä ja

kasvamista.  Kasvien  itämistehokkuus  ja  biomassan  tuotto  mainitaan  monissa  lähteissä

hyvinä  indikaattoreina  öljyllä  saastuneiden  maiden  toksisuudesta  (Juvonen  ym.  2000  ja

Fernandez  ym.  2005).  Tässä  tutkimuksessa  saatujen  tulosten  perusteella

rehuvuohenherneen  itämistehokkuutta  ei  kuitenkaan  voida  pitää  hyvänä

toksisuusindikaattorina,  koska  öljyllä  saastutetun  kasvikäsittelyn  (ÖKR)  ja

saastuttamattoman  kasvikäsittelyn  (PKR)  välillä  ei  havaittu  merkittäviä  eroja  kasvien

itämistehokkuudessa. Myös Smith ym. (2006) havaitsivat  tutkimuksessaan, etteivät PAH­

yhdisteet  estäneet  merkittävästi  tutkittujen  ruoho­  ja  hernekasvien  itämistä,  mutta

hidastivat  selvästi  tutkittujen  kasvien kasvua  itämisen  jälkeen.  Myös  tässä  tutkimuksessa

saatujen  tulosten  perusteella  vuohenherneen  biomassan  tuotto  oli  hyvä  indikaattori

polttoöljyllä  saastuneen  maan  toksisuudesta  (kuva  14).  Kun  maan  polttöljypitoisuus

kokeen  kuluessa  laski,  kiihtyi  saastutetussa  kasvikäsittelyssä  (kuva  13)  kasvien

kasvuvauhti selvästi (kuvat 14 ja 36).

Pitkäjärvi ym. (2003) eivät havainneet kenttäkokeissaan 3000 ppm dieselöljysaastutuksen

merkittävästi  hidastavan  vuohenherneiden  kasvua  verrattuna  saastuttamattomaan

kontrolliin. Myös Suominen ym. (2000) totesivat kasvihuonekokeessaan, ettei ikääntyneen

öljyllä  saastuneen  maan  noin  2­3  prosentin  kokonaisöljyhiilivetypitoisuus  vaikuttanut

merkittävästi  rehuvuohenherneiden  kasvuun.  Kuitenkin  Suominen  ym.  (2000)  totesivat

samassa  tutkimuksessa  aromaattisten  öljyhiilivetyjen  malliyhdisteenä  käytetyn  meta­

toluaatin  hidastavan  rehuvuohenherneen  kasvua  selvästi  jo  pitoisuudessa  1000  ppm.

Eroavia  tuloksia  voi  selittää  esimerkiksi  erot  öljyn  levittäytymisessä  koemaihin.

Kenttäkokeessa  öljysaastutusta  voi  olla  hankalampi  saada  levittäytymään  koko

maamassaan  tasaisesti.  Tällöin  rehuvuohenherneen  juuristolle  jää  maassa  puhtaampia

kohtia, joihin juuret voivat levittäytyä.

94

Kun  polttoöljynpitoisuus  biologisen  hajotuksen  seurauksena  laski  (kuva  13),  myös

rehuvuohenherneen  kasvuvauhti  kiihtyi  (kuvat  14  ja  21).  Näytteenottoviikolla  15  tehdyn

niiton  jälkeen  ei  rehuvuohenherneiden  kasvussa  kasvillisten  käsittelyiden  välillä  havaittu

enää  selkeää  eroa  (kuva  14  ja  21).  Polttoöljypitoisuus  oli  öljyllä  saastutetussa

kasvikäsittelyssä tällöin noin 500 ppm (kuva 13).

7.1.2 Polttoöljynhajottajien MPN­lukumäärien vaihtelu

Koska  polttoöljynhajottajien  lukumäärissä  tapahtuvien  muutosten  seuraamiseen  käytettyä

MPN­menetelmää  jouduttiin  kasvihuonekokeen  aikana  optimoimaan,  ei  MPN­

menetelmällä  saatu  yhtenäistä  aikasarjaa  (kuva  37).  Saaduista  tuloksista  voi  silti  tehdä

päätelmiä  öljynhajottajien  lukumäärien  vaihtelusta  kasvihuonekokeen  kuluessa.  MPN­

tulosten  perusteella  öljynhajottajien  lukumäärät  sekä  kasvillisessa  (ÖKR)  että

kasvittomassa  (Ö)  öljykäsittelyssä  nousivat  vain  aivan  kokeen  alussa,  korkeintaan

näytteenottoviikolle  6  tai  7,  jonka  jälkeen  öljynhajottajien  MPN­lukumäärät  alkoivat

molemmissa käsittelyissä selvästi laskea (kuva 37). Tämä tulos sopii hyvin yhteen Kondon

(2006) polttoöljyn hajoamisesta saamien tulosten kanssa (kuva 13). Kondo (2006) havaitsi,

että  polttoöljyn  hajoaminen  oli  kiivainta  aivan  kasvihuonekokeen  alussa  ja  hidastui  jo

viikolla  3  merkittävästi.  Polttoöljynhajottajien  MPN­lukumäärän  nousu  öljykäsittelyissä

(ÖKR  ja  Ö)  oli  näin  ollen  voimakkainta  silloin  kun  polttoöljyn  pitoisuus  maassa  laski

nopeimmin (kuvat 13 ja 37).

Täysin  vastaavanlaista  tutkimusta,  jossa  öljynhajottajien  MPN­lukumäärien  määritystä

olisi  hyödynnetty,  ei  kirjallisuudesta  löydy.  Bachoon  ym.  (2001b)  vertasivat

tutkimuksessaan  Sheen  Screen  MPN­menetelmällä  raakaöljyn  hajottajien  lukumääriä

raakaöljyllä  saastutetussa  maassa  ja  saastuttamattomassa  kontrollimaassa  kuukauden  ja

kolmen  kuukauden  jälkeen  raakaöljysaastutuksesta.  He  totesivat  tutkimuksessaan

öljynhajottajien  MPN­lukumäärien  nousevan  saastutetussa  käsittelyssä  yhden  kuukauden

kuluessa  100­kertaiseksi  verrattuna  saastuttamattomaan  käsittelyyn,  mutta  laskevan

kolmen  kuukauden  kuluessa  ainoastaan  kymmenkertaisiksi  saastuttamattomaan  maahan

verrattuna.  Myös  tässä  tutkimuksessa  todettiin,  että  21­viikkoisen  kasvihuonekokeen

aikana polttoöljynhajottajien  MPN­lukumäärät nousivat öljyllä  saastutetuissa käsittelyissä

(ÖKR ja Ö) vain ensimmäisen kuukauden aikana,  jonka  jälkeen ne alkoivat  laskea. Myös

Bachoon  ym.  (2001b)  päättelivät  tutkimuksessaan,  että  kolmen  kuukauden  kuluessa

95

raakaöljyn  helpommin  hajotettavat  yhdisteet  on  hajotettu,  jonka  seurauksena

öljynhajottajien lukumäärät maassa laskevat.

Eroja  polttoöljyllä  saastutettujen  käsittelyiden  (ÖKR  ja  Ö)  välillä  ei  tässä  tutkimuksessa

MPN­menetelmällä  havaittu  yhdelläkään näytteenottoviikolla.  Tätä  tulosta  tukee Kondon

(2006) gradutyössään saamat tulokset siitä, että polttoöljyn hajoaminen kasvillisessa (ÖKR)

ja kasvittomassa (Ö) öljykäsittelyissä eteni koko kokeen ajan hyvin samalla tavalla (kuva

13).  Näin  ollen  oli  odotettavaa,  että  myös  öljynhajottajien  lukumäärien  vaihtelut  kokeen

aikana  vastasivat  toisiaan  näissä  käsittelyissä.  Saastuttamaton  kasvikäsittely  (PKR)

puolestaan  erosi  MPN­menetelmän  perusteella  koko  kokeen  ajan  selkeästi  öljyllä

saastutetuista  käsittelyistä  (kuva  37).  Tämän  perusteella  tässä  tutkimuksessa  käytetty

kohtuullisen  lievä  polttoöljysaastutus  sai  aikaan  suuria  muutoksia  koemaan

mikrobipopulaatioissa,  mikä  näkyi  polttoöljynhajotukseen  kykenevien  mikrobien

lukumäärien voimakkaana nousuna. Käytetyllä MPN­menetelmällä polttoöljysaastutuksen

vaikutus  nähtiin  selvästi  vielä  21  viikon  jälkeen  polttoöljysaastutuksesta  verrattaessa

saastutetuista  käsittelyistä  (ÖKR  ja  Ö)  saatuja  tuloksia  saastuttamattoman  kasvikäsittelyn

(PKR) tuloksiin (kuva 37).

Saastuttamattomassa  kasvikäsittelyssä  polttoöljynhajotukseen  kykenevien  mikrobien

MPN­lukumäärien  havaittiin  kuitenkin  nousevan  kasvihuonekokeen  aikana.  Tämä  johtui

todennäköisimmin  niin  kutsutusta  ritsosfääriefektistä  eli  siitä,  että  juuriston  lähellä

bakteerien  kokonaislukumäärä  voi  nousta  jopa  tuhatkertaiseksi  verrattuna  ympäröivään

maahan (Kuiper ym. 2004). Näin ollen rehuvuohenherneiden kasvaessa juuriston vaikutus

nostaa PKR­käsittelyssä kokeen  lopussa kokonaisbakteerilukumääriä ruukuissa. Koska on

tiedossa,  että  monet  saastuttamattomassa  maassa  elävistä  mikrobeista  kykenevät

öljynhajotukseen  (Laurie  ja  Lloyd­Jones  2000),  noussee  saastuttamattomassa

kasvikäsittelyssä  kokonaisbakteerilukumäärien  noustessa  myös  öljynhajotukseen

kykenevien mikrobien lukumäärä.

96

7.1.3 Bakteeribiomassan muutokset DNA:n pitoisuuden perusteella

Bachoon  ym.  (2001b)  vertasivat  tutkimuksessaan  MPN­menetelmällä  määritettyjen

heterotrofisten  bakteerien  lukumäärien  vaihtelua  bioremediaation  aikana  maanäytteiden

DNA­pitoisuuden vaihteluun. He totesivat, että maanäytteiden DNA­pitoisuudet vastasivat

erittäin  hyvin  MPN­menetelmällä  määritettyjä  heterotrofisten  bakteerien  lukumäärissä

tapahtuvia  muutoksia.  Bachoon  ym.  (2001b)  toteavat  artikkelissaan  DNA­

pitoisuusmittauksen  olevan  jopa  tarkempi  ja  herkempi  menetelmä

kokonaisbakteerilukumäärän määrittämiseen kuin heterotrofisten mikrobien määrittäminen

joko  maljaamalla  tai  MPN­menetelmällä.  Lisäksi  he  korostavat,  että  DNA­

pitoisuusmittauksiin  perustuva  bakteeribiomassan  määritys  ei  kärsi  viljelystä  johtuvista

vääristymistä, kuten maljaaminen ja erilaiset MPN­menetelmät. Koska tässä tutkimuksessa

ei  kasvihuonekokeen  näytteistä  määritetty  heterotrofisten  bakteerien  lukumääriä,  voidaan

DNA­pitoisuuden  vaihtelua  kasvihuonekokeen  aikana  (kuva  38)  verrata  ainoastaan

polttoöljynhajottajien  MPN­lukumäärissä  tapahtuviin  muutoksiin  (kuva  37).  Saaduista

tuloksista havaitaan, että DNA­pitoisuuden vaihtelu kokeen aikana (kuva 38) vastasi hyvin

öljynhajottajien MPN­lukumäärissä tapahtuvia muutoksia (kuva 37).

DNA­pitoisuus  kasvillisessa  (ÖKR)  ja  kasvittomassa  (Ö)  öljykäsittelyissä  nousi

voimakkaasti  kasvihuonekokeen  kolmen  ensimmäisen  viikon  aikana.  Tällöin  myös

polttoöljynhajottajien  MPN­lukumäärät  nousivat  voimakkaasti  (kuva  37)  ja  polttoöljyn

hajoaminen  oli  kiivainta  (kuva  13).  DNA­pitoisuus  nousi  öljykäsittelyissä  (ÖKR  ja  Ö)

ensimmäisen  kolmen  viikon  aikana  lähes  kaksinkertaiseksi.  Kolmen  viikon  jälkeen,  kun

helpoimmin  hajoavat  öljynyhdisteet  oli  hajotettu,  sekä  maanäytteiden  DNA­pitoisuuden

kasvu (kuva 38) että öljynhajoaminen (kuva 13) hidastuivat huomattavasti. Kokeen lopussa,

jolloin  polttoöljynhajottajien  MPN­lukumäärät  laskivat  selvästi  öljykäsittelyissä  (ÖKR  ja

Ö),  kääntyi  myös  maanäytteistä  uuttuvan  DNA:n  määrä  ainakin  kasvittomassa

öljykäsittelyssä (Ö) loivaan laskuun (kuva 38).

Ensimmäisten 8 viikon ajan saastuttamattomasta kasvikäsittelystä (PKR) uuttuvan DNA:n

määrä pysyi öljykäsittelyihin (ÖKR ja Ö) verrattuna hyvin alhaisena ja tasaisena (kuva 38).

Kuitenkin  viikon 8  jälkeen saastuttamattomasta kasvikäsittelystä   uuttuvan DNA:n  määrä

alkoi  nousta  selvästi.  Hieman  tätä  ennen,  noin  viikolla  6,  käsittelyssä  PKR

rehuvuohenherneet  olivat  alkaneet  kasvaa  voimakkaasti  (kuva  14). Koska

97

saastuttamattomasta  kasvikäsittelystä  uuttuvan  DNA­määrän  voimakas  nousu  ajoittuu

samaan hetkeen kuin rehuvuohenherneiden voimakas kasvu (kuva 14), voidaan olettaa, että

viikon 8 jälkeen saastuttamattomassa kasvikäsittelyssä (PKR) tapahtuva DNA­pitoisuuden

nousu  johtuu  rehuvuohenherneen  juuriston  vaikutuksesta  eli  ns.  ritsosfääriefektistä.  Osa

DNA­pitoisuuden  noususta  saastuttamattomassa  kasvikäsittelyssä  voidaan  mahdollisesti

selittää  myös  sillä,  että  tutkittaviin  näytteisiin  on  jäänyt  vielä  seulonnan  jälkeen  pieniä

juuren  kappaleita,  joista  DNA­uuton  yhteydessä  uuttuu  myös  DNA:ta.  Koska  öljyllä

saatutetun    kasvikäsittelyn  (ÖKR)  DNA­pitoisuus  ei  kuitenkaan  selvästi  nouse  kokeen

lopussa  verrattuna  kasvittomaan  öljykäsittelyyn,  tämä  ei  vahvista  kasvisoluista  eristyvän

merkittäviä määriä DNA:ta.

Kasvillisessa öljykäsittelyssä (ÖKR) viikkojen 4  ja 6 välillä uuttuvan DNA:n määrä  laski

selvästi  (kuva  38).  Tätä  laskua  voi  mahdollisesti  selittää  helposti  hajotettavien

öljynyhdisteiden loppuminen viikolla 4 ja lyhyt sopeutumisaika hankalammin hajotettavien

yhdisteiden  hajotukseen.  Toisaalta  vastaavanlaista  uuttuvan  DNA­määrän  laskua  ei

kasvittomassa  öljykäsittelyssä  (Ö)  viikolla  6  nähty.  Viikkojen  6  ja  12  välillä  DNA­

pitoisuus nousi kasvillisessa öljykäsittelyssä (ÖKR) kasvittoman öljykäsittelyn (Ö) tasolle.

Osittain  tätä  nousua  viikkojen  6  ja  12  välillä  voi  selittää  rehuvuohenherneiden  juuriston

vaikutus eli  ns.  ritsosfääriefekti kasvillisessa öljykäsittelyssä. Toisaalta ainakin  viikolla  8

rehuvuohenherneet  olivat  käsittelyssä  ÖKR  vielä  hyvin  pieniä  (kuva  14).

Todennäköisimmin  viikolla  6  tapahtuva  lasku  kasvillisen  öljykäsittelyn  DNA­

pitoisuuksissa  johtuukin  joko  näytteiden  suuresta  hajonnasta  tai  jonkinlaisesta

mittausvirheestä.

Kokeen  loppupuolella,  jolloin  saastuttamattomassa kasvikäsittelyssä (PKR) näkyy  juurien

vaikutus  selvänä  DNA­pitoisuuden  nousuna  maanäytteissä,  kasvillisessa  öljykäsittelyssä

(ÖKR)  ritsosfääriefekti  näkyy  yllättävän  vähän.  Tosin  pientä  DNA­pitoisuuden  laskua

viikkojen  12  ja  21  välillä,  joka  nähdään  kasvittomassa  öljykäsittelyssä,  ei  havaita

kasvillisessa öljykäsittelyssä.

98

7.1.4 NahAc­geenin monistuminen

Monistettaessa  naftaleenin  hajotukseen  osallistuvaa nahAc­geeniä  kvantitatiivisella

reaaliaikaisella PCR:llä maa­DNA­uutteista ei yhdenkään tutkitun näytteen geenikopioluku

saavuttanut  edes  kymmenen  geenikopion  detektiorajaa.  Näin  ollen  valittu  menetelmä  ei

riittänyt  osoittamaan  naftaleenin  hajottajien  lukumäärien  vaihtelua  eri  käsittelyissä

kasvihuonekokeen aikana.

7.2 Käytettyjen menetelmien arviointi

7.2.1 MPN­menetelmä

Koska  tutkimuksen  kuluessa  havaittiin,  ettei  valittu  MPN­menetelmä  soveltunut

sellaisenaan tämän tutkimuksen näytteiden analysointiin, yksi tärkeä tavoite tutkimuksessa

oli toimivan MPN­menetelmän kehittäminen öljynhajottajien lukumäärien määrittämiseen.

Suurimpia  ongelmia  alkuperäisessä  MPN­menetelmässä  (liite  2)  aiheuttivat

tetrasoliumsuolat,  joita  alkuperäisessä  MPN­menetelmässä  käytettiin  kasvun

havaitsemiseen  MPN­levyillä.  Syytä  havaittuun  ongelmaan  eli  tetrasoliumsuolojen  liian

suureen  reaktiivisuuteen  MPN­levyillä  (kuva  18)  ei  tässä  tutkimuksessa  pystytty

selvittämään. Yhdeksi syyksi epäiltiin tetrasoliumsuolojen reagoimista MPN­näytelevyillä

joidenkin  öljynyhdisteiden  kanssa.  Mosher  ym.  (2003)  mainitsevat  artikkelissaan,  että

tetrasoliumsuolojen on todettu reagoivan ainakin joidenkin liuottimien kanssa epätoivotulla

tavalla.  Toisaalta  käytettäessä  tetrasoliumsuoloja  havaittiin  myös  negatiivisilla

kontrollilevyillä  useita  positiivisia  reaktioita,  tosin  yleensä  vain  matalimmissa

laimennuksissa. Nämä negatiivisten kontrollilevyjen matalimmissa  laimennuksissa olevan

positiiviset  reaktiot  voivat  toisaalta  selittyä  sillä,  että  matalimmat  laimennukset  ovat

voineet  sisältää  vielä pieniä  määriä  maapartikkeleita. Näiden  maapartikkelien  mukana on

puolestaan voinut  siirtyä MPN­levyille  mikrobeille  soveltuvia hiilenlähteitä. Nämä pienet

määrät hiilenlähteitä ovat voineet saada aikaan MPN­levyjen negatiivisten kontrollilevyjen

matalimmissa  laimennuksissa  heikkoa  kasvua.  Koska  tetrasoliumsuoloja  käytetään  juuri

silloin  kun  halutaan  havaita  heikkoakin  kasvua,  on  tämä  vähäinen  kasvu  voinut  saada

aikaan positiivisen reaktion.

99

Mikrobien  kasvun  aiheuttaman  sameuden  absorbanssimittaukseen  perustuva  MPN­

menetelmä  kehitettiin  ja  saatiin  optimoitua  toimivaksi  tämän  tutkimuksen  kuluessa.

Merkittävin  muutos  alkuperäiseen  ohjeeseen,  tulosten  lukutavan  muuttamisen  lisäksi,  oli

maanäytesuspension  ravistelun  jälkeisen  seisotusajan  lisääminen  menetelmään  sekä

seisotusajan  pidentäminen  viidestä  minuutista  kahteenkymmeneen  minuuttiin.

Pidentämällä  seisotusaikaa  päästiin  kokonaan  eroon  positiivisista  kaivoista

kontrollilevyillä.    Tämä  johtui  luultavasti  siitä,  että  pidennettäessä  seisotusaikaa

pienimmätkin  maapartikkelit  ehtivät  vajoamaan  maasuspensiopullon  pohjalle,  jolloin

laimennussarjaa  tehtäessä  mukana  ei  siirtynyt  matalimpiinkaan  laimennuksiin  enää

maapartikkeleita eikä hiilenlähteitä, jotka voisivat aiheuttaa mikrobikasvua.

Koska MPN­menetelmä on hyvin epätarkka menetelmä, jolla pienien erojen havaitseminen

on  mahdotonta  (Riser­Roberts  1998),  ei  ole  yllättävää,  ettei  MPN­menetelmän  avulla

onnistuttu  havaitsemaan  eroja  öljynhajottajien  MPN­lukumäärissä  kasvillisen  (ÖKR)  ja

kasvittoman (Ö) öljykäsittelyn välillä.

Erilaisilla  MPN­menetelmillä  määritettyjen  öljynhajottajien  kokonaislukumäärät  yhdessä

grammassa  öljyllä  saastunutta  maata  vaihtelevat  kirjallisuuden  perusteella  103  (Bachoon

ym. 2001b) ja 1010 (Kirk ym. 2005) välillä, riippuen muun muassa öljysaasteen laadusta ja

määrästä  sekä  maatyypistä.  Tässä  tutkimuksessa  saadut  kokonaisöljynhajottajien  MPN­

lukumäärät  (106­108) ovat  kirjallisuuden  perusteella  hyvin  korkeita.  Tässä  tutkimuksessa

olosuhteet  öljynhajottajien  rikastumiseen  olivatkin  optimaaliset,  koska  öljysaastutus  oli

tuore, maa oli hyvin lannoitettua ja lämpötila kasvihuoneella oli korkea (noin + 20 Cº).

Viljelyyn perustuvan MPN­menetelmän ongelmaksi tutkimuksen aikana osoittautui, että se

joudutaan  tekemään  aina  tuoreista  näytteistä.  Näin  ollen  ensimmäisten

näytteenottoviikkojen  näytteitä,  jotka  oli  analysoitu  hieman  eri  menetelmällä  kuin

viimeisten  näytteenottoviikkojen  näytteet,  ei  voitu  kokeen  lopussa  enää  uusia.  Lisäksi

MPN­menetelmä oli hyvin työläs ja tuloksia jouduttiin odottamaan kolme viikkoa kestävän

inkuboinnin ajan. Toisaalta MPN­menetelmällä saatiin koko kokeen ajalta  tuloksia,  jotka

sopivat hyvin yhteen muilla menetelmillä saatujen tulosten kanssa.

Tässä tutkimuksessa kehitettyä MPN­menetelmää voidaan jatkossa hyödyntää sellaisenaan

polttoöljyn  biologisen  hajoamisen  seurantaan.  Tässä  tutkimuksessa  käytettyä  MPN­

100

menetelmää  voitaisiin  kehittää  edelleen  muun  muassa  yksittäisten  öljynyhdisteiden

hajottajien lukumäärien seuraamiseen.

7.2.2 DNA­pitoisuuden mittaus NanoDrop®:illa

Spektrofotometrisen  NanoDrop®­mittauksen  todettiin  tässä  tutkimuksessa  antavan

moninkertaisesti  suuremman  arvion  maa­DNA­uutteiden  DNA­pitoisuudesta  kuin  maa­

DNA­uutteille  kehitetty  PicoGreen®­menetelmä  (taulukko  14).  Syynä  tähän  ovat  maa­

DNA­uutteiden  sisältämät  epäpuhtaudet,  jotka  absorboivat  DNA:n  absorptiomaksimissa

(Kabir  ym.  2003).  Kabir  ym.  (2003)  toteavat  artikkelissaan  yksiselitteisesti

spektrofometristen  mittausten  yliarvioivan  maa­DNA­uutteiden  DNA­pitoisuuksia  ja

olevan  näin  ollen  käyttökelvottomia  maasta  eristetyille  DNA­uutteille.  Tästä  huolimatta

spektrofotometristä  mittausta  käytetään  usein  maa­DNA­uutteiden  DNA­pitoisuuksien

määrittämiseen.

Etuna  NanoDrop®­laitteessa  perinteiseen  spektrofotometriseen  mittaukseen  on  pienen

näytetilavuuden  lisäksi  se,  että  laite  näyttää  jokaiselle  mittaamalleen  näytteelle

absorptiospektrin. Tällöin voidaan, vertaamalla näytteen spektriä puhtaan DNA:n spektriin,

päätellä  yhdellä  silmäyksellä  soveltuuko  spektrofotometrinen  mittaus  tutkittavalle

näytteelle (kuva 23).

Puhtaille  DNA­näytteille  NanoDrop®  oli  saatujen  tulosten  (taulukko  13)  perusteella

luotettava  ja tarkka menetelmä. Saman näytteen rinnakkaisten mittausten välillä oli hyvin

vähän vaihtelua (taulukko 13). Myös eri  laimennustasojen perusteella saadut arviot DNA­

pitoisuudesta olivat hyvin samansuuntaisia (taulukko 13).

7.2.3 PicoGreen®­mittaus

PicoGreen®­mittauksen  avulla  saatiin  tässä  tutkimuksessa  helposti  käsitys  biomassan

vaihtelusta  maanäytteissä. Toisaalta on  muistettava, että DNA­pitoisuusmittauksen avulla

määritettiin  samalla  maanäytteistä  myös  sieni­,  eläin­  ja  kasvi­DNA:n  määrää.  DNA­

pitoisuusmittauksen  avulla  voidaan  näin  ollen  saada  ainoastaan  suurpiirteinen  käsitys

maanäytteen  kokonaisbiomassan  vaihteluista,  eikä  sitä  voida  käyttää  lainkaan  spesifisten

ryhmien seurantaan.

101

PicoGreen®­mittauksen  virherajoja  olisi  mahdollisesti  pystytty  pienentämään  käyttämällä

yhden  mikrolitran  sijasta  isompaa  näytetilavuutta.  Toisaalta  suurta  vaihtelua

mittaustuloksiin  aiheutti  myös  se,  että  rinnakkaiset  DNA­uutteet  oli  eristetty  kolmen  eri

kerranteen  näyteruukusta,  joihin  on  mahdollisesti  vaikuttanut  muun  muassa  sijainti

kasvihuoneen pöydällä (kuva 11). Myös samasta näyteruukusta eristettyjen DNA­uutteiden

DNA­pitoisuuksissa  oli  vaihtelua,  tosin  se  oli  vähäisempää  kuin  näyteruukkujen  välinen

vaihtelu. Mittauksesta johtuva vaihtelu näytteiden välillä oli  todennäköisesti hyvin pientä,

koska  rinnakkaisista  standardikaivoista  tehdyissä  mittauksissa  vaihtelua  havaittiin  hyvin

vähän.

PicoGreen®  DNA­pitoisuusmittaukset  oli  DNA:n  eristyksen  jälkeen  helppo  suorittaa  ja

mittaus  voitaisiin  tarvittaessa  myös  uusia  pakastetuista  DNA­uutteista.  PicoGreen®:llä

tehtyjen  DNA­pitoisuusmittausten  avulla  saatiin  muiden  tutkimuksessa  saatujen  tulosten

kanssa hyvin yhteensopivia tuloksia. Tosin DNA­pitoisuusmittauksen perusteella arvioituja

bakteerimäärien vaihteluja kokeen kuluessa ei voida pitää kovin tarkkoina.

7.2.4 Kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR

Syitä siihen, että naftaleenin hajotukseen osallistuvaa nahAc­geeniä ei kasvihuonekokeen

näytteistä  onnistuttu  monistamaan,  voi  olla  monia.  Ensinnäkin  maanäytteistä  eristetyissä

DNA­uutteissa  oli  paljon  PCR:ää  inhiboivia  tekijöitä  ja  maa­DNA­uutteita  jouduttiin

laimentamaan aina laimennukseen 10­3 asti ennen Q­RTm­PCR:ää. Laimentamalla näytettä

näin  paljon  laimennettiin  mahdollisesti  myös  näytteen  sisältämät nahAc­geenit  pois

tutkittavista  näytteistä.  Lisäksi  laimennus  10­3  sisälsi  luultavasti  vielä  runsaasti  PCR

inhibitiota,  jolloin  näytteiden  monistuminen ei ole  lainkaan niin  tehokasta kuin puhtaasta

DNA:sta.

Bach  ym.  (2002)  vertailivat  myös  omassa  tutkimuksessaan  FastDNA  Spin  Kit  for  Soil­

kitillä  (Bio  101,  USA)  eristetyistä  maa­DNA­uutteista  tehtyjen  eri  laimennusten

monistumista  Q­RTm­PCR:llä.  He  vertailivat  tutkimuksessaan  16S­RNA­geenin

monistumista  laimennuksista  1:10,  1:20,  1:100,  1:500,  1:1000  ja  1:5000.  Tehokkaimmin

Bach  ym.  (2002)  totesivat  16S­RNA­geenin  monistuvan  laimennuksesta  1:100.  Tässä

tutkimuksessa  eristettyjen  DNA­uutteiden  monistuminen  oli  puolestaan  tehokkainta

laimennuksesta 1:1000. Tätä voi osittain selittää se, että tässä tutkimuksessa tutkittiin aivan

102

eri  tyyppistä  geeniä  kuin  16S­rRNA­geeni.  Toisaalta  eri  tyyppisistä  maanäytteistä  uuttuu

eri tavalla esimerkiksi humushappoja ja muita PCR:ää inhiboivia tekijöitä.

Toinen syy Q­RTm­PCR:ssä saatuun  tulokseen  voi olla se, että polttoöljy  sisältää suuren

määrän erilaisia öljynyhdisteitä, joista suurin osa on huomattavasti naftaleenia helpommin

hajoavia.  Näin  ollen  voi  olla  mahdollista,  että  21­viikkoisen  kasvihuonekokeen  aikana

hajosi  polttoöljystä  vasta  naftaleenia  helpommin  hajoavia  yhdisteitä  eikä  naftaleenin

hajotus 21­viikkoisen kokeen aikana ehtinyt vielä alkamaan.

Lisäksi  polttoöljy  kuluu  kevyisiin  polttoöljyihin  ja  sisältää  melko  vähän  painavia

öljynyhdisteitä.  Vaikka  tutkimuksessa  käytetyssä  polttoöljyssä oli  4,8  painoprosenttia  di­

aromaatteja  (liite  1),  on  se  kuitenkin  melko  pieni  osuus  kaikista  polttoöljyn  yhdisteistä.

Näin  ollen  on  myös  mahdollista,  ettei  naftaleeni  ole  lainkaan  merkittävä  substraatti

öljynhajottajille polttoöljyllä saastutetussa maassa.

Maaperän  mikrobeilta  on  löydetty  monia  vaihtoehtoisia  reittejä  myös  naftaleenin

hajotukseen  (Bosch  ym. 1999). Näin ollen on myös mahdollista,  että  tässä  tutkimuksessa

naftaleeninhajotus  on  tapahtunut  ainakin  osittain  jotain  toista  metaboliareittiä,  joka  ei

välttämättä sisällä  lainkaan nahAc­geeniä tai siinä oleva nahAc­geenin sekvenssi poikkeaa

merkittävästi tällä hetkellä tunnetuista nahAc­geenisekvensseistä.

Jatkossa  Q­RTm­PCR:llä  voitaisiin  kokeilla  jokin  toisen  öljynhajotukseen  osallistuvan

geenin  monistamista  kasvihuonekokeen  näytteistä.  Tämä  geeni  voisi  olla  esimerkiksi

suoraketjuisten  öljyhiilivetyjen  eli  alkaanien  hajotukseen  osallistuva alkB­geeni.  Lisäksi

maa­DNA­uutteiden  epäpuhtaudesta  johtuvat  ongelmat  Q­RTm­PCR:ssä  todennäköisesti

vähenisivät puhdistamalla DNA­uutteita edelleen. Näin maa­DNA­uutteiden PCR­inhibitio

vähenisi, eikä maa­DNA­uutteita tarvitsisi laimentaa niin paljon ennen Q­RTm­PCR:ää.

103

8. LoppupäätelmätViljelymenetelmien,  kuten  MPN,  etuna  bioremediaation  seurannassa  on  niiden

helppokäyttöisyys  ja  edullisuus.  Toisaalta  viljelymenetelmien  avulla  voidaan  tutkia  vain

hyvin  pientä  joukkoa  maan  koko  mikrobistosta  ja  tämä  heikentää  merkittävästi  niiden

käyttökelpoisuutta.  DNA­pohjaisten  menetelmien  soveltaminen  maanäytteille  vaatii

puolestaan  syvällistä  perehtymistä  ja  laajaa  menetelmien  optimointia.  DNA­pohjaisilla

menetelmillä,  kuten  kvantitatiivisella  reaaliaikaisella  PCR:llä,  voidaan  kuitenkin

todennäköisesti  saada  tietoa  huomattavasti  pienemmistä  muutoksista  maanperän

mikrobistossa sekä tutkia myös hyvin spesifisten ryhmien sisällä tapahtuvia muutoksia.

104

9. LähdeluetteloAatelo, M. (toim.) 1995a. Öljyn historia. Teoksessa: Aatelo, M. Lähteiltä tuotteiksi – öljyntie. Tammer­Paino Oy. Tampere. Sivut 11­18.

Aatelo, M. (toim.) 1995b. Öljynjalostus. Teoksessa: Aatelo, M. Lähteiltä tuotteiksi – öljyntie. Tammer­Paino Oy. Tampere. Sivut 39­80.

Alkorta,  I.  ja  Garbisu,  C. 2001.  Phytoremediation  of  organic  contaminants  in  soil.Bioresource Tecnology, vol. 79, sivut 273­276.

Atlas, R.M. ja Bartha R. 1998. Microbial ecology – Fundamentals and application. Neljäspainos. Benjamin/Cummings Publishing Company Inc. USA. Sivut 523­531.

Atlas,  R.M.  ja  Cerniglia,  C.E.  1995.  Bioremediation  of  petroleum  pollutants;  diversityand environmental aspects of hydrocarbon biodegradation. BioScience, vol. 45, sivut 332­338.

Bach,  H.­J.,  Tomanova,  J.,  Schloter,  M.  ja  Munch,  J.C.  2002.  Enumeration  of  totalbacteria  and  bacteria  with  genes  for  proteolytic  activity  in  pure  cultures  and  inenvironmental  samples  by  quatitative  PCR  mediated  amplification.  Journal  of  Microbialmethods, vol. 49, sivut 235­245.

Bachoon,  D.S.,  Araujo,  R.,  Molina,  M.  ja  Hodson,  R.E. 2001a. Microbial communitydynamics and evaluation of bioremediation strategies  in oil­impacted salt marsh sedimentmicrocosms. Journal of Industrial Microbiology and Biotecnology, vol. 27, sivut 72­79.

Bachoon, D.S., Hodson, R.E.  ja Araujo, R. 2001b. Microbial community assessment inoil­impacted salt marsh sediment microcosms by traditional and nucleic acid­based indices.Journal of Microbiological Methods, vol. 46, sivut 37­49.

Baker,  G.C.,  Smith,  J.J.  ja  Cowan,  D.A.  2003.  Review  and  re­analysis  of  domain­spesific 16S primers. Journal of Microbiological Methods, vol. 55, sivut 541­555.

Baldwin, B.R., Nakatsu, C.H. ja Nies, L. 2003. Detection and enumeration of aromaticoxygenase  genes  by  multiplex  and  real­time  PCR.  Applied  and  EnvironmentalMicrobiology, vol. 69, sivut 3350­3358.

Barbeau,  C.,  Deschenes,  L.,  Karamanev,  D.,  Comeau,  Y.  ja  Samson,  R.  1997.Bioremediation  of  pentachlorophenol­contaminated  soil  by  bioaugmentation  usingactivated soil. Applied Microbiology and Biotecnology, vol. 48, sivut 745­752.

Bosch,  R.,  García­Valdés,  E.  ja  Moore,  E.R.B. 1999.  Genetic  characterization  andevolutionary  implications  of  a  chromosomally  encoded  naphtalene­degradation  upperpathway from Pseudomonas tutzeri AN10. Gene, vol. 236, sivut 149­157.

Brakstad,  O.G.  ja  Lodeng,  A.G.G.  2005. Microbial  diversity  during  biodegradation  ofcrude oil in seawater from the North sea. Microbial Ecology, vol 49, sivut 94­103.

105

Brown, E.J. ja Braddock, J.F. 1990. Sheen screen, a miniaturized most­probable­numbermethod  for  enumeration  of  oil­degrading  microorganisms.  Applied  and  EnvironmentalMicrobiology, vol. 56, sivut 3895­3896.

Bushnell,  L.D.  ja  Haas  H.F.  1941.  The  utilization  of  certain  hydrocarbons  bymicroorganisms. Journal of Bacteriology, vol. 41, sivut 653­673.

Cernilia,  C.E.  1997.  Fungal  metabolism  of  polycyclic  aromatic  hydrocarbons:  past,present  and  future  applications  in  bioremediation.  Journal  of  Industrial  Microbiology  &Biotecnology, vol. 19, sivut 324­333.

Chen, Y.­C., Banks, M.K, ja Schwab, A.P. 2003. Pyrene degradation in the rhizosphereof  Tall  Fescue  (Festuca  arundinacea)  ja  Switchgrass  (Panicum  virgatum  L.).Environmental Science & Tecnology, vol. 37, sivut 5778­5782.

Dua,  M.,  Singh,  A.,  Sethunathan,  N.  ja  Johri,  A.K. 2002.  Biotecnology  andbioremediation:  successes  and  limitations.  Applied  Microbiology  and  Biotecnology,  vol.59, sivut 143­152.

Duteau,  N.M.,  Rogers,  J.D.,  Bartholomay,  C.T.  ja  Reardon,  K.F.  1998.  Species­specific  oligonucleotides  for  enumeration  of Pseudomonas  putida  F1, Burkholderia  sp.strain JS150, and Bacillus subtilis ATCC 7003 in biodegradation experiments. Applied andEnvironmental Microbiology, vol. 64, sivut 4994­4999.

Edmonds, P. ja Cooney, J.J. 1966. Identification of microorganisms isolated from jet fuelsystems. Applied Microbiology, vol. 15, sivut 411­416.

Fernandez, M.D., Cagigal, E., Vega, M.M., Urzelai, A., Babin, M., Pro, J. ja Tarazona,J.V.  2005.  Ecological  risk  assessment  of  contaminated  soil  through  direct  toxicityassessment. Ecotoxicology and Environmental Safety, vol. 62, sivut 174­184.

Filion,  M.,  St­Arnaud,  M.  ja  Jabaji­Hare,  S.H.  2003.  Direct  quatification  of    fungalDNA from soil substrate using real­time PCR. Journal of Microbiological Methods, vol. 53,sivut 67­76.

Frostegård, Å., Courtois, S., Ramisse, V., Clerc, S., Bernillon, D., Le Gall, F., Jeannin,P., Nesme, X. ja Simonet, P. 1999. Quantification of bias related to the extraction of DNAdirectly from soils. Applied and Environmental Microbiology, vol. 65, sivut 5409­5420.

GenBank­nukleotiditietokanta internersivu http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank.index.html

Gentry,  T.E.,  Josephson,  K.L.  ja  Pepper  I.L.  2004.  Functional  establishment  ofintroduced chlorobenzoate degraders following bioaugmentation with newly activated soil.Biodegradation, vol. 15, sivut 67­75.

Hadwin, A.K.M., Del Rio, L.F., Pinto, L.J., Painter, M., Routledge, R. ja Moore, M.M.2006.  Microbial  communities  in  wetlands  of  the  Athabasca  oil  sands:  genetic  andmetabolic characterization. FEMS Microbiology Ecology, vol. 55, sivut 68­78.

106

Haines,  J.R.,  Wrenn,  B.A.,  Holder,  E.L.,  Strohmeier,  K.L.,  Herrington,  R.T.  jaVenosa, A.D. 1996. Measurement of hydrocarbon­degrading microbial populations by 96­well  plate  most­probable­number  procedure.  Journal  of  Industrial  Microbiology,  vol.  16,sivut 36­41.

Harwood,  C.S.,  Burchhartdt,  G.,  Herrman,  H.  ja  Fuchs,  G. 1999.  Anaerobicmetabolism of aromatic compounds via  the benzoyl­Co­A pathway. FEMS MicrobiologyReviews, vol. 22, sivut 439­458.

Heider,  J.,  Spormann,  A.M.,  Beller,  H.R.,  Widdel,  F.  1999.  Anaerobic  bacterialmetabolism of hydrocarbons. FEMS Microbiology Reviews, vol. 22, sivut 459­473.

Henry,  S.,  Baudoin,  E.,  Lopez­Gutierrez,  J.C.,  Martin­Laurent,  F.,  Brauman,  A.  jaPhilippot,  L. 2004.  Quatification  of  denitrifying  bacteria  in  soils  by nirK  gene  targetedreal­time PCR. Journal of Microbiological Methods, vol. 59, sivut 327­235.

Hästbacka, K. (päätoim.) 1992. NESTE – Öljyistä muoveihin. Neste Oy. Espoo. Sivu 60.

Ivancev­Tumbas, I., Trickovic, J., Karlovic, E., Tamas, Z., Roncevic, S., Dalmacija, B.,Petrovic,  O.  ja  Klasnja,  M. 2004  GC/MS­SCAN  to  follow  the  fate  of  crude  oilcomponents in bioreactors set to remediate contaminated soil. International Bioremediation& Biodegradation, vol 54, sivut 311­318.

Jjemba,  P.K.,  Kinkle,  B.K.  ja  Shann,  J.R.  2006. In­situ  enumeration  and  probing  ofpyrene­degrading soil bacteria. FEMS Microbiology Ecology, vol. 55, 287­298.

Johnsen,  A.R.,  Bendixen,  K.  ja  Karlson,  U.  2002.  Detection  of  microbial  growth  onpolycyclic  aromatic  hydrocarbons  in  microtiter  plates  by  using  the  respiration  indicatorWST­1. Applied and Environmental Microbiology,vol. 68, sivut 2683­2689.

Juvonen,  R., Martikainen,  E., Schultz,  E.,  Joutti, A.,  Ahtiainen, J.  ja Lehtokari,  M.2000. A battery of toxicity test as indicators of decontamination in composting oily waste.Ecotoxicology and Environmental Safety, vol. 47, sivut 156­166.

Ka, J.O., Yu, Z. ja Mohn, W.W. 2001. Monitoring the size and metabolic activity of thebacterial  community  during  biostimulation  of  fuel­contaminated  soil  using  competitivePCR and RT­PCR. Microbial Ecology, vol. 42, sivut 267­273.

Kabir, S., Rajendran, N., Amemiya, T., Itoh, K. 2003.Real­time quatitative PCR assayon  bacterial  DNA:  in  a  model  soil  system  and  environmental  samples.  The  Journal  ofgeneral and applied microbiology, vol. 49, sivut 101­109.

Katsivela, E.,  Moore, E.R., Maroukli D., Strompl,  C., Pieper,  D.  ja Kalogerakis, N.2005.  Bacterial  community  dynamics  during  in­situ  bioremediation  of  petroleum  wastesludge in landfarming sites. Biodegradation, vol. 16, sivut 169­180.

Kirk,  J.L.,  Beaudette,  L.A.,  Hart,  M.,  Moutoglis,  P.,  Klironomos,  J.N.,  Lee,  H.  jaTrevors,  J.T.  2004.  Methods  for  studying  soil  microbial  diversity.  Journal  ofMicrobiological Methods, vol. 58, sivut 169­188.

107

Kirk,  J.L.,  Klironomos,  J.N.,  Lee,  H.  ja  Trevors,  J.T.  2005. The effects  of  perennialryegrass and alfalfa on  microbial abudance and diversity  in petroleum contaminated soil.Environmental Pollution, vol. 133, sivut 455­465.

Koizumi, Y., Kelly,  J.J., Nakagawa, T., Urakawa, H., El­Fantroussi, S., Al­Muzaini,S.,  Fukui,  M.,  Urushigawa,  Y.  ja  Stahl,  D.A.  2002.  Applied  and  EnvironmentalMicrobiology, vol. 68, sivut 3215­3225.

Kondo, E. 2006. Ritsoremediaatio öljyllä saastuneen maan biopuhdistusmenetelmänä. Progradu  ­tutkielma.  Pro  Terra.  No.  27/2006.  Helsingin  yliopisto  Soveltavan  kemian  jamikrobiologian laitos.

Kuiper,  I.,  Lagendijk,  E.L.,  Bloemberg,  G.V.  ja  Lugtenberg,  B.J.J.  2004.Rhizoremediation:  A  beneficial  plant­microbe  interaction.  Molecular  Plant­MicrobeInteractions, vol. 17, sivut 6­15.

Kurola, J., Salkinoja­Salonen, M., Aarnio, T., Hultman, J. ja Romantschuk, M. 2005.Activity, diversity and population size of ammonia­oxidising bacteria  in oil­contaminatedlandfarming soil. FEMS Microbiology Letters, vol. 250, sivut 33­38.

Labrenz,  M.,  Brettar,  I.,  Cristen,  R.,  Flavier,  S.,  Bötel,  J.  ja  Hölfe,  M.G.  2004.Development and application of  real­time PCR approach  for quantification of unculturedbacteria in the Central Baltic sea. Applied and Environmental Microbiology, vol. 70, sivut4971­4979.

Lalande, T.L., Skipper, H.D., Wolf, D.C., Reynolds, C.M., Freedman, D.L., Pinkerton,B.W.,  Hartel,  P.G.  ja  Grimes  L.W.  2003.  Phytoremediation  of  pyrene  in  a  cecil  soilunder field conditions. International Journal of Phytoremediation, vol. 5, sivut 1­12.

Laurie, A.D. ja Lloyd­Jones, G. 2000. Quatification of phnAc and nahAc in contaminatedNew Zealand soils by competitive PCR. Applied and Environmental Microbiology, vol. 66,sivut 1814­1817.

Lindstrom, J.E., Prince, R.C., Clark, J.C., Grossman, M.J., Yeager, T.R., Braddock,J.F.  ja  Brown,  E.J.  1991.  Microbial  populations  and  hydrocarbon  biodegradationpotentials  in  fertilized  shoreline  sediments  affected  by  the  T/V Exxon  Valdez  oil  spill.Applied and Environmental Microbiology, vol. 57, sivut 2514­2522.

Lueders, T., Manefield, M. ja Friedrich, M.W. 2004. Enhanced sensitivity of DNA­ andrRNA­based stable isotope probing by fractionation and quantitative analysis of  isopycnicsentrifugation gradients. Environmental Microbiology, vol. 6, sivut 73­78.

Mackay,  I.M.,  Arden,  K.E.  ja  Nitsche,  A.  2002.  Real­time  PCR  in  virology.  NucleicAcids Reseach, vol. 30, sivut 1292­1305.

Maier,  R.M.  2000.  Microorganisms  and  organic  pollutants.  Teoksessa:  Maier,  R.M.,Pepper, I.L., Gerba, C.P. Environmental microbiology. Academic Press. USA. Sivut 363­402.

108

Maila,  P.M.,  Randima,  P.  ja  Cloete,  T.E.  2005.  Multispecies  and  monoculturerhizoremediation of polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) from the soil. InternationalJournal of Phytoremediation, vol. 7, sivut 87­98.

Marquez­Rocha,  F.J.,  Hernandez­Rodriguez,  V.  ja  Lamela,  MA.T.  2001.Biodegradation  of  diesel  oil  in  soil  by  a  microbial  consortium.  Water,  Air  and  SoilPollution, vol. 128, sivut 313­320.

Meckenstock, R.U. 1999. Fermentative toluene degradation in anaerobic defined syntroficcocultures. FEMS Microbiology Letters, vol. 177, sivut 67­73.

Mikkonen,  A.  2007.  Pro  gradu  ­tutkielma.  Helsingin  yliopisto  Soveltavan  kemian  jamikrobiologian laitos. Julkaisematon.

Mills, A.L., Breuil, C. ja Colwell R.R. 1978. Enumeration of petroleum­degrading marineand estuarine microorganisms by the most probable number method. Canadian Journal ofMicrobiology, vol 24, sivut 552­557.

Mills,  D.K.,  Fitzgerald,  K.,  Litchfield,  C.D.  ja  Gillevet,  P.M.  2003.  A  comparison ofDNA  profiling  techniques  for  monitoring  nutrient  impact  on  microbial  communitycomposition  during  bioremediation  of  petroleum­contaminated  soils.  Journal  ofMicrobiological methods, vol, 54, sivut 57­74.

Miya,  R.K.  ja  Firestone  M.K.  2001. Enhanced  phenanthrene  biodegradation  in  soil  byslender oat root exudates and root debris. Journal of Environmental Quality, vol. 30, sivut1911­1918.

Molecular  Probes®,  PicoGreen®dsDNA  Quantitation  Reagent  and  Kits,  ProductInformation, Tarkistettu: 28.1.2003.

Mosher, J.J., Levison, B.S. ja Johnston, C.G. 2003. A simplified dehydrogenase enzymeassay  in  contaminated  sediment  using  2­(p­iodophenyl)­3(p­nitrophenyl)­5­phenyltetrazolium cloride. Journal of Microbiological Methods, vol. 53, sivut 411­415.

MPN­laskuri internetsivu http://www.i2workout.com/mcuriale/mpn/index.html

Mummey,  D.L.  ja  Stahl  P.D.  2004.  Analysis  of  soil  whole­  and  inner­microaggregatebacterial communities. Microbial Ecology, vol. 48, sivut 41­50.

NanoDrop®  Technologies.  2004. NanoDrop®  ND­1000  Spectrophotometer  V3.1  User´smanual. NanoDrop Technologies Inc. Tarkistettu 2004.

Newman,  L.A.  ja  Reynolds,  C.M.  2004.  Phytodegradation  of  organic  compounds.Current Opinion in Biotechnology, vol. 15, sivut 225­230.

Palmroth, M.R.T., Pichtel, J. ja Puhakka J.A. 2002. Phytoremediation of subarctic soilcontaminated with diesel fuel. Bioresource Technology, vol. 84, sivut 221­228.

109

Parrish,  Z.D.,    Banks,  M.K.  ja  Schwab,  A.P. 2005. Effect of  root death and decay ondissipation of polycyclic aromatic hydrocarbons in the rhizosphere of yellow sweet cloverand tall fescue. Journal of Environmental Quality, vol. 34, sivut 207­216.

Penet,  S.,  Vendeuvre,  C.,  Bertoncini,  F.,  Marchal,  R.  ja  Monot,  F.  2006.Characterisation  of  biodegradation  capacities  of  environmental  microflorae  for  diesel  oilby  comprehensive  two­dimensional  gas  chromatography.  Biodegradation,  vol.  17,  sivut577­585.

Pitkäjärvi, J., Räsänen, L., Langenskjölt, J., Wallenius, K., Niemi, M. ja Lindström,K. 2003. Persistance,  population dynamics and competitiveness  for nodulation of  markergene­tagged Rhizobium  galegae  strains  in  field  lysimeters  in  the  boreal  climatic  zone.FEMS Microbiology Ecology, vol. 46, sivut 91­104.

Powell, S.M., Ferguson, S.H., Bowman, J.P. ja Snape, I. 2006. Using real­time PCR toassess changes in the hydrocarbon­degrading microbial community in antarctic soil duringbioremediation. Microbial Ecology, vol. 52, sivut 523­532.

Primer3­ohjelma   internetsivu http://frodo.wi.mit.edu/cgi­bin/primer3/primer3_www.cgi

Prosser, J.I. 2002. Molecular and  functional diversity  in soil micro­organisms. Plant andSoil, vol. 244, sivut 9­17.

Puolanne,  J.,  Pyy,  O.  ja  Jeltsch,  U.  (toim.)  1994.  Saastuneet  maa­alueet  ja  niidenkäsittely  Suomessa  –  saastuneiden  maa­alueiden  selvitys­  ja  kunnostusprojekti;loppuraportti. Ympäristöministeriö Muistio 5.  Painatuskeskus Oy. Helsinki.

Riser­Roberts,  E.  1998.  Remediation  of    petroleum  contaminated  soils  –  Biological,Physical, and Chemical Processes. CRC Press LLC. USA. Sivut 115­160 ja 389­391.

Salo, T. 2003. Pilaantunut maa­alue. Teoksessa: Savelainen K.  (toim.) Pilaantuneet maa­alueet  –  Uudenmaan  ympäristökeskuksen  neuvottelupäivä  Helsingissä  5.3.2003.Uudenmaan ympäristökeskuksen Monisteita nro. 128, sivut 13­18.

Sandaa, R.­A., Enger, Ø., ja Torsvik, V. Rapid method for fluorometric quantification ofDNA in soil. Soil Biology & Biochemistry, vol. 30, sivut 265­268.

Scragg,  A. 2005a.  Bioremediation.  Teoksessa:  Scragg,  A.  Environmental  Biotecnology.Toinen painos. Oxford University Press Inc. New York. Sivut. 173­229.

Scragg,  A. 2005b.  Specific  topics.  Teoksessa:  Scragg  A.  Environmental  Biotecnology.Toinen painos. Oxford University Press Inc. New York. Sivut. 401­418.

Sharma,  S.,  Aneja,  M.K.,  Mayer,  J.,  Munch,  J.C.  ja  Schloter,  M.  2005.Characterization  of  bacterial  community  structure  in  rhizosphere  soil  of  grain  legumes.Microbial Ecology, vol. 49, sivut 407­415.

Singelton, D.R., Powell, S.N., Sangaiah, R., Gold, A., Ball, L.M. ja Aitken, M.D. 2005.Stable­isotope  probing  of  bacteria  capable  of  degrading  salicylate,  naphtalene,  or

110

phenanthrene  in  a  bioreactor  treating  contaminated  soil.  Applied  and  EnvironmentalMicrobiology, vol. 71, sivut 1202­1209.

Singer,  V.L,  Jones,  L.J.,  Yue,  S.T.  ja  Haugland,  R.P.  1997.  Characterization  ofPicoGreen  reagent  and  development  of  a  fluorescence­based  solution  assay  for  double­stranded DNA quantitation. Analytic Biochemistry, vol. 249, sivut 228­238.

Smith,  M.R.  1990.  The  biodegradation  of  aromatic  hybrocarbons  by  bacteria.Biodegradation, vol. 1, sivut 191­206.

Smith,  M.J.,  Flowers,  T.H.,  Duncan,  H.J.  ja  Alder,  J.  2006.  Effects  of  polycyclicaromatic hydrocarbons on germination and subsequent growth of grasses and  legumes  infreshly contaminated soil and soil with aged PAHs residues. Environmental Pollution, vol.141, sivut 519­525.

So, C.M., Phelps, C.D. ja Young, L.Y. 2003. Anaerobic transformation of alkanes to fattyacids  by  a  sulfate­reducing  bacterium,  strain  Hxd3.  Applied  and  EnvironmentalMicrobiology, vol. 69, sivut 3892­3900.

So, C.M., Young, L.Y. 2001. Anaerobic biodegradation of alkanes by enriched consortiaunder four different reduncing conditions. Environmental Toxicology and Chemistry, vol.20, sivut 473­478.

Solano­Serena, F., Marchal, R., Lebeault, J­M., Vandecasteele, J­P. 2000. Distributionof the environment of degradative capacities for gasoline attenuation. Biodegradation, vol.11, sivut 29­35.

Spriggs,  T., Banks,  M.K.  ja  Schwab  P. 2005. Phytoremediation of polycyclic aromatichydrocarbons  in manufactured gas plant­impacted soil.  Journal of Environmental Quality,vol. 34, sivut 1755­1762.

Suominen,  I.,  Ollikka,  P.  1999.  Yhdistelmä­DNA­tekniikan  perusteet.  Kolmas  painos.Opetushallitus. Hakapaino Oy. Sivut 67­68 ja 107­112...

Suominen,  L.,  Jussila,  M.M.,  Mäkeläinen,  K.,  Romantschuk,  M.  ja  Lindström,  K.2000. Evaluation of  the Galega­Rhizobium galegae  system  for the bioremediation of oil­contaminated soil. Environmental Pollution, vol. 107, sivut 239­244.

Sylvia, D.M.  (toim.),  Fuhrmann, J.J.,  Hartel,  P.G.  ja Zuberer,  D.A. 2005. Principlesand applications of  soil  microbiology. Toinen painos. Pearson Prentice Hall. USA. Sivut536­561.

Takahashi,  H.,  Konuma,  H.  ja  Hara­Kudo,  Y. 2006. Development of quatitative  real­time PCR method to enumerate total bacterial counts in ready­to­eat fruits and vegetables.Journal of Food Protection, vol. 69, sivut 2504­2508.

Tani, A., Ishige, T., Sakai, Y. ja Kato, N. 2001. Gene structure of the alkane hydroxylaseomplex in Acinetobacter sp. strain M­1. Journal of Bacteriology, vol. 183, sivut 1819­1823.

111

Thompson, I.P., van der Gast, C.J., Ciric, L. ja Singer, A.C. 2005. Bioaugmentation forbioremediation:  the  challenge  of  strain  selection.  Environmental  Microbiology,  vol.  7,sivut 909­915.

Tsuda,  M.,  Tan,  H.M.,  Nishi,  A.  ja  Furukawa  K. 1999.  Mobile  catabolic  genes  inbacteria. Journal of  Biocience and Bioengineering, vol. 87, sivut 401­410.

Tuomi,  P.M.,  Salminen,  J.,  Jørgensen,  K.S.  2004.  The  abundance  of nahAc  genescorrelates  with  the 14C­naphthalene  mineralization  potential  in  petroleum  hydrocarbon­contaminated oxic soil layers. FEMS Microbiology Ecology, vol.51, sivut 99­107.

Van  Beilen,  J.B.,  Panke,  S.,  Lucchini,  S.,  Franchini,  A.G.,  Röthlisberger,  M.  jaBernard  Witholt,  B.  2001.  Analysis  of Pseudomonas  putida  alkane­degradation  geneclusters  and  flanking  insertion  sequences:  evolution  and  regulation  of alk  genes.Microbiology, vol. 147, sivut 1621­1630.

Van Beilen, J.B., Wubbolts, M.G. ja Witholt, B. 1994. Genetics of alkane oxidation byPseudomonas oleovorans. Biodegradation, vol. 5, sivut 161­174.

Van  Hamme,  J.D.,  Singh,  A.  ja  Ward,  O.P.  2003.  Recent  advances  in  petroleummicrobiology. Microbiology and Molecular Biology Reviews, vol. 67, sivut 503­549.

Walker,  J.D.  ja  Colwell,  R.R.  1976.  Enumeration  of  petroleum­degradingmicroorganisms. Applied and Environmental Microbiology, vol. 31, sivut 198­207.

Wilkes,  H.,  Rabus,  R.,  Fischer,  T.,  Armstroff,  A.,  Behrends,  A.  ja  Widdel,  F. 2002.Anaerobic degradation of n­hexane in a denitrifying bacterium: Further degradation of theinitial  intermediate  (1­metylpentyl)succinate  via  C­skeleton  rearrangement.  Archives  ofMicrobiology, vol. 177, sivut 235­243.

Whyte,  L.G.,  Bourbonniere,  L.,  Greer,  C.W.  1997.  Biodegradation  of  petroleumhydrocarbons  by  psychrotrophic  Pseudomonas  strains  possessing  both  alkane  (alk)  andnaphtalene  (nah)  catabolic  pathways.  Applied  and  Environmental  Microbiology,  vol.  63,sivut 3719­3723.

Wrenn,  B.A.  ja  Venosa,  A.D.  1996.  Selective  enumeration  of  aromatic  and  aliphatichydrocarbon degrading bacteria by most­probable­number procedure. Canadian Journal ofMicrobiology, vol. 42, sivut 252­258.

Zhang,  C.  ja  Bennett,  G.N. 2005. Biodegradation of xenobiotics by anaerobic  bacteria.Applied Microbiology and Biotecnology, vol. 67, sivut 600­618.

Zhang, T. ja Fang, H.H.P. 2006. Applications of real­time polymerase chain reaction forquatification  of  microorganisms  in  environmental  samples.  Applied  Microbiology  andBiotecnology, vol. 70, sivut 281­289.

112

Liitteet