proizvodnja mleČne kisline* -...

UNIVERZA V LJUBLJANI BIOTEHNI�KA FAKULTETA

�IVILSKA TEHNOLOGIJA

PROIZVODNJA MLEČNE KISLINE*

Petra SKOČIR, Marija-Mojca SPREICER, Robert STIBILJ, Dejan SUBAN

(�tudentje tretjega letnika �tudija �ivilske tehnologije)

prof. dr. Peter Raspor in asist. dr. Maja Pa� (mentorja)

Ljubljana, 2001 *Seminarska naloga pri predmetu Biotehnologija

Proizvodnja mlečne kisline, Seminarska, Biotehni�ka fakulteta, �tudij �ivilske tehnologije, 2001. 2

Povzetek: Mlečna kislina je ena najpomembnej�ih organskih kislin, ki se uporablja v �ivilstvu. V seminarju so opisane osnovne lastnosti kisline, zgodovina pridobivanja, njena uporabnost, vloga v različnih izdelkih in predvsem načini pridobivanja z biotehnolo�kimi metodami. Opisane so tudi mikrobiolo�ke osnove bioprocesa, posamezni rodovi mikroorganizmov in njihove značilnosti, razdelitev ter uvrstitev v sistem. Biokemijski del opisuje osnovne poti razgradnje substrata in metabolizem posameznih komponent. Prikazan je osnovni proces pridobivanja mlečne kisline- fermentacija, parametri ki vplivajo na rast, predvsem viri raznih organskih snovi in načini izločevanja kisline. Opisani so tudi ekolo�ki vidiki bioprocesa ter uporabnost bioproizvoda v �ivilih kot konzervans, regulator pH ter prispevek k okusu. Summary: Lactic acid is one of the most important organic acid used in a food processing. In this seminar is described basic properties of lactic acid, history of its producing, its usilisation and role in different products and the most of all: ways of producing lactic acid with biotechnological methods. It is describing microbiological fundamentals of process, individual genus of micro-organisms and their properties, division and replacement in system. The biochemical part is describing basic paths of substrate decay and metabolism of some components. Shown is basic process of fermentation, parameters which are important for growth, especially sources of different organic compounds and possible ways to claim the final product. It is also describing the ecological view of bioproces and application of bioproducts in food as preservatives, regulators of pH and flavoring.


KAZALO 1. UVOD 5 1.1. Splo�no o kislinah 5 1.1.1. Mlečna kislina 5 1.1.2. Proizvodnja mlečne kisline 5 2. ZGODOVINA BIOPROCESA 6 3. MIKROBIOLO�KE OSNOVE PROCESA 7 3.1. Rod Lactobacillus 8 3.2. Rod Streptococcus 9 3.3. Rod Lactococcus 9 3.4. Rod Pediococcus 9 3.5. Rod Leuconostoc 9 3.6. Rod Enterococcus 10 3.7. Rod Bifedobacterium 10 3.8. Izolacija in kultivacija 10 3.9. Razmno�evanje in ohranitev starter kulture 10 4. BIOKEMIJSKE OSNOVE PROCESA 11 4.1. Lastnosti mlečne kisline 11 4.2. Uporaba mlečne kisline in njenih soli 12 4.3. Industrijsko pridobivanje mlečne kisline 13 4.4. Mikroorganizem 14 5. BIOIN�INIRSKE OSNOVE BIOPROCESA 16 5.1. Uvod 16 5.2. Pripravljalni postopki 17 5.2.1. Revitalizacija 17 5.2.2. Priprava inokuluma 17 5.3. Hranilne snovi 17 5.3.1. Viri ogljika 18 5.3.2. Viri du�ika 18 5.3.3. Viri fosforja 18 5.3.4. Viri drugih elementov 18 5.3.5. Vri drugih organskih spojin 19 5.4. Fermentacija � proces proizvodnje mlečne kisline 19 5.4.1. Klasična metoda kalcijevega laktata 19 5.4.1.1. Izolacija in či�čenje produkta 20 5.4.2. Metoda amonijevega laktata 21 5.4.3. Uporaba kontinuirane fermentacije 22 5.4.4. Imobilizirane celične kulture 22 6. EKOLO�KI VIDIKI BIOPROCESA 23


7. UPORABA MLEČNE KISLINE V PROIZVODNJI HRANE 23 7.1. Mlečna kislina v fermentiranih mlečnih izdelkih 24 7.2. Mlečna kislina v drugih �ivilskih proizvodih 24 7.3. Uporaba nekaterih mikroorganizmov v proizvodnji hrane 24


1. UVOD 1.1. Splo�no o kislinah Kisline imenujemo vse tiste snovi, ki oddajajo protone. Take snovi imenujemo tudi donorji protonov. Raztopljene v vodi disocirajo na ione, na vodikov proton H+ in anion OH-. V razredčenih vodnih raztopinah izra�amo koncentracijo vodikovih ionov pogosto z vrednostjo pH. pH vodne raztopine je definiran kot negativni logaritem koncentracije vodikovih, to je oksonijevih ionov. Lestvica pH: 1-7 in 7-14. Kisle raztopine so vse tiste raztopine, katerih pH je manj�i od 7. V teh raztopinah je koncentracija oksonijevih ionov večja od 1,0. 10-7 mol dm-3. Če pa je koncentracija oksonijevih ionov manj�a od 1.0. 10-7 mol dm-3 je raztopina bazična (Klofutar s sod., 1997). 1.1.1. Mlečna kislina Mlečna kislina je monohidroksi monokarboksilna kislina s formulo CH3CH(OH)COOH. Me�a se z vodo v vseh razmerjih. Njene soli se imenujejo laktati. Ker vsebuje v molekuli 'alkoholno' hidroksilno skupino, se v navzočnosti oksidantov oksidira. Oksidacija poteka preko piruvične kisline, ki odcepi CO2 in preide v acetaldehid, ta pa se nadalje oksidira v ocetno kislino (Klofutar s sod., 1997). OH H OH / [O] -CO2 / / CH3-CH-COOH CH3-C-COOH CH3- C = O CH3-C= O mlečna kislina piruvična kislina acetaldehid ocetna kislina 1.1.2. Proizvodnja mlečne kisline Naravno nastaja v procesu mlečno kislinske fermentacije, kar je odkrito �e zelo dolgo. Kot končni produkt fermentacije se pojavlja v racemični me�anici dveh izomer D in L zaradi nesimetričnega ogljikovega atoma. L izomera je mnogo pomembnej�a za človeka, saj jo lahko laktat dehidrigenaza razgradi, medtem ko akumulacija D izomere povzroči ledvično acidozo. L izomero proizvajajo nekatere plesni in bakterije. Kemijska proizvodnja mlečne kisline je omejena na proizvodnjo racemičnih me�anic. Biotehnolo�ko lahko dobimo tudi čiste L-laktate. Stereokemična čistost je posebej pomembna pri polimerizaciji (Hrovatin, 1982). Strukturni formuli L in D izomere: COOH COOH HO-C-H H-C-OH CH3 CH3 L- izomera D- izomera


Hemofermentativne mlečno kislinske bakterije proizvajajo mlečno kislino, dočim heterofermentativne mlečno kislinske bakterije ustvarjajo poleg mlečne kisline tudi vzporedne produkte: etanol, CO2, propionska, maslena kislina,� Prve, posebno tiste z visokimi izkoristkom so najprimernej�e za proizvodnjo mlečne kisline na industrijski način. Metabolična pot nastanka mlečne kisline je glikoliza, ki je na kratko prikazana z enačbo: C6H12O6 2 CH3-CO-COOH 2 CH3-CHOH-COOH + 22kcal Obseg sinteze je odvisen od vrste bakterijskih kultur, njihove starosti in pH. Substrat za proizvodnjo predstavljajo melasa, sirotka, hidroliziran �krob, pa tudi glukoza in dekstroza. Fermentacijo vodijo s pomočjo bakterij vrste Lactobacillus delbruckii. Med procesom vzdr�ujejo konstanten pH z dodajanjem Ca-karbonata (Hrovatin, 1982). V koncentraciji manj�i od 1% deluje mlečna kislina smrtno na večino saprofitnih mikroorganizmov, medtem ko v koncentraciji okrog 2% tudi na same bakterije mlečnokislinskega vrenja. Spontano mlečno kislinsko vrenje, ki se pojavlja pri konzerviranju, se v začetku procesa vzporedno z bakterijami mlečne kisline namno�ijo tudi ostale mikrobne vrste. Medtem, ko koncentracija mlečne kisline raste, se zmanj�uje �tevilo prisotnih mikrobnih vrst (Hrovatin, 1982). V industriji ta proces seveda ne teče spontano. Proizvodi se konzervirajo tako, da se vzpostavijo pogoji, ki ustrezajo bakterijam mlečno kislinskega vrenja (dodatek NaCl, vzdr�evanje anaerobnih pogojev), a ne ustrezajo razvoju drugih mikrobnih vrst. V industriji se najpogosteje uporabljajo bakterije iz dru�ine Lactobacillaceae. Vse so gram pozitivne, ne tvorijo spor (razen vrste Lactobacillus inulinus) in niso gibljive (razen posameznih izjem). Kot izvor energije lahko koristijo le ogljikove hidrate (Jarry in Lemonerie, 1988). Poleg sladkornih surovin za proizvodnjo mlečne kisline se uporabljajo tudi �krobne surovine. Če uporabljamo le-te je potrebno njihovo predhodno sladkanje, ki se običajno opravi s pomočjo amilolitičnih encimov. Na tr�i�ču se dobi mlečno kislino v koncentracijah od 20% do 80%. Vi�je koncentracije je te�ko doseči, saj pride do kondenzacije v ciklični laktid. Pribli�no ena tretina proizvodnje je sintetična, dve tretini pa biotehnolo�ka (Jarry in Lemonerie, 1988). 2. ZGODOVINA BIOPROCESA Proizvodnja mlečne kisline s pomočjo mikroorganizmov je zagotovo najstarej�a proizvodnja katerekoli kisline sploh. �e od pradavnine človek u�iva izdelke, ki so bili konzervirani s pomočjo mlečno kislinske fermentacije. V zadnjem stoletju mlečno kislino tudi proizvajajo in to za potrebe industrije, predvsem �ivilske (Sahm, 1996). �e veliko časa je minilo, ko so ljudje ugotovili, da pri organskih snoveh, če so shranjene na sobni temperaturi, pride do spontanega vretja. Na osnovi te ugotovitve so začeli razvijati izdelke. Fermentacija je bila nekoč precej delikaten in nepredvidljiv proces. Obstaja nekaj arheolo�kih dokazov, da so �e �tiri tisočletja pred na�im �tetjem s pomočjo fermentacije iz testa izdelovali kruh. Pri jezeru Biel v �vici je bila najdena karbonizirana �truca, v kateri so jasno vidne pore, ki so nastale pri vzhajanju. Iz arhaičnih tekstov so ugotovili, da so leta 3200 pred na�im �tetjem v Mezapotamiji izdelovali sir, maslo in jogurt iz kravjega, ovčjega


in kozjega mleka. �e leta 150 pred na�im �tetjem, ko so �e obstajali sirarski cehi v Jeruzalemu najdbe ka�ejo na to, da je bila fermentacija zelo uporabna (Sahm, 1996).

Slika 1: Glinena plo�čica iz Ur-a, (Sahm, 1996) Na sliki je prikazana glinena plo�čica iz Uruka 3200 let pred na�im �tetjem na kateri je prvi zapis v zgodovini kjer so omenjeni fermentirani produkti. S pu�čicami so označena mesta kjer pi�e kaj so izdelovali (sir, jogur, testo) in iz česa (mleko).(Sahm, 1996) Leta 1780 je nem�ki znanstvenik Care Wilhelm Scheele iz kislega mleka izoliral mlečno kislino. Tudi Louis Pasteur je raziskoval fermentacijo in 1875 leta postavil teorijo, da so vzrok vrenja in nastanka mlečne kisline mikroorganizmi. 20 let kasneje je bila njegova teorija potrjena, ko je Joseph Lister izoliral prvo čisto kulturo bakterij, ki jo je poimenoval Bacterium lactis. To vrsto je 1909 leta Lohnis prekvalificiral v Streptococcus lactis. Danes jo poznamo kot Lactococcus lactis. Dokončen dokaz, da so te bakterije povzročitelji fermentacije je bil podan leta 1890, ko sta jih znanstvenika W. Sorch in H. Weigmann izolirala iz kislega zelja. Tudi v 20. stoletju so bile mlečno kislinske bakterije močno proučevane (Sahm 1996). Zgodovina industrijske proizvodnje čiste mlečne kisline je bistveno kraj�a. Prvi tovrstni poiskusi so bili narejeni v ZDA leta 1881. Firma Avery je sku�ala nadomestiti uvo�ene tartrate za proizvodnjo pecilnih pra�kov z domačimi kalcijevimi laktati. Leta 1895 so v Ingelherimu v Nemčiji ustanovili tovarno za proizvodnjo mlečne kisline (Sahm, 1996). 3. MIKROBIOLO�KE OSNOVE BIOPROCESA Mlečno kislinske bakterije so izredno pomembna skupina bakterij. So gram pozitivne, nepatogene in nesporogene. V sve�em mleku je zelo veliko laktobacilov (102-103/ml), ki jih s pasterizacijo uničimo in s tem preprečimo kvarjenje. Za proizvodnjo mlečnih izdelkov pa jih nujno potrebujemo. Pri proizvodnji jogurta Lactobacillus delbruckii bulgaricus skupaj s Streptococcus thermophilus fermentirata mleko v jogurt. (Schopmeyer, 1943) Mlečno kislinske bakterije so anaerobni organizmi, običajno negibljive bakterije, ki pridobivajo energijo s fermentacijo. Za rast potrebujejo veliko rastnih faktorjev. Nekatere bakterije ne izkori�čajo laktoze (Lactobacillus belbrickii), ampak pretvarjajo glukozo preko piruvata v mlečno kislino. Mlečno kislinske bakterije pre�ivijo in celo rastejo pri nizkih pH


vrednostih (do pH 3). Mlečno kislinske bakterije tvorijo mikrofloro mleka, zato so prisotne v mleku in mlečnih izdelkih. Prva �tudija in klasifikacija mlečno kislinskih bakterij je bila objavljena 1919 leta (po Orla-Jeusnu). Sistematiko mlečno kislinskih bakterij je podal na osnovi fermentacije sladkorjev, tvorbe plina, morfologije celic, odnosa bakterij do kisika in na osnovi optimalne temperature rasti. Njegova sistematika se je obdr�ala vse dokler moderna biotehnologija in molekularna biologija nista podali predloga, da se naredi naravno evolucijsko drevo. Vse mlečno kislinske bakterije razen bifidobakterij (uvr�čene so med Actinomyces) so v evolucijskem drevesu uvr�čene v Clostridium. Brandt in Tenber sta 1988 oblikovala shematično drevo.

Slika 2: Shematično drevo (Sahm, 1996) Najstarej�i del tega drevesa predstavlja rod Clostridium, ki je anaeroben. Večina predstavnikov iz drugih rodov (Leuconostoc, Lactobacillus, Lactococcus in Streptococcus) ni striktno anaerobnih. Bolj ali manj uspe�no rastejo pri ni�jih koncentracijah kisika. Pomembno dejstvo, ki se nana�a na evolucijsko drevo pa je to, da so vrste, ki se uporabljajo v biotehnologiji proizvodnje hrane in �ivalske krme, jasno ločene od patogenih vrst. So pa Enterococcus, ki se ne smatra kot specifični starter kulture, bli�nji sorodniki rodu Listeria, ki pa je patogen. Med bakterije, ki so glavni proizvajalci mlečne kisline se pri�tevajo Streptococcus lactis in sorodne vrste ter Lactobacillus vrste. Streptokoki so okrogle ali jajčaste oblike, so v parih ali veri�icah, premera manj kot 2.10-6m. Laktobacili so palčke, dolge, tanke ali kraj�e kroglaste, ki so lahko posamično ali v veri�icah. Dolge so 6 � 7.10-6m (Gaber, Golob, Frim in Horvat, 2000) 3.1. Rod Lactobacillus Laktobacili potrebujejo za svojo rast sladkorje, razgradne produkte beljakovin, vitamine in navadno nizko koncentracijo kisika. Glavni produkt fermentacije je mlečna kislina. Najdemo jih v mleku, mlečnih izdelkih, mesu in mesnih izdelkih, sestavljajo pa tudi mikrofloro člove�kega telesa. V splo�nem velja, da so predstavniki tega rodu nepatogeni. Laktobacili so zelo pomembni pri proizvodnji jogurta (dominantna sestavina arome jogurta je acetaldehid, ki nastane iz treonina s pomočjo specifične aldolaze L. bulgarricus) kefirja in klasičnih trdih sirov (Ementalec, Parmezan, Grana, Gruyeve). Pomembno vlogo igrajo tudi pri proizvodnji vina, piva, viskija, saj lahko vodijo za�eljeno pa tudi neza�eljeno fermentacijo. (Gaber, Golob, Frim in Horvat, 2000)


3.2. Rod Streptococcus Te bakterije so v močni povezavi s člove�kim organizmom, veliko je patogenih. Izjema je Streptococcus thermophilus, ki se uporablja v proizvodnji jogurtov in sirov. Vsi streptokoki so hemofermentativni in v glavnem proizvajajo L+ mlečno kislino. So manj odporni na kisline kot laktobacili. Mnogi fermentacije ne pre�ivijo in to zaradi mlečne kisline, ki jo med postopkom sami ustvarijo. Rastejo samo na zelo kompleksnih goji�čih (krvni agar). Ta rod vsebuje funkcionalno dve različni skupini: oralni streptokoki in hemolitični streptokoki. (Gaber, Golob, Frim in Horvat, 2000) 3.3. Rod Lactococcus Laktokoki so homofermentativni organizmi. Glavni produkt fermentacije je L+ mlečna kislina. Rod vključuje vrste: Lactococcus lactis, Lactococcus garviae, Lactococcus plantarium, Lactococcus raffinolactis, Lactococcus lactis. Laktokokov ovičajno ne najdemo v fekalijah in v zemlji. Rod Lactococcus se uporablja v mlečni industriji kot čista ali me�ana kultura za proizvodnjo nekaterih sirov (Camembert, Tilsit, Edamec, Gauda) kislega mleka, kefirja in kisle smetane. (Gaber, Golob, Frim in Horvat, 2000) 3.4. Rod Pediococcus Za ta rod je značilna tipična morfologija celic, saj tvorijo tetrade v eni ravnini. Taksonomsko so sorodne rodu Lactobacillus. Imajo homofermentativen metabolizem. Potencialno so nevarni kvarljivci piva, saj so mikroaerofilni, precej tolerantni do alkohola in antibiotičnega delovanja, ki ga imajo smole, ki se nahajajo v hmelju. Pivovarji se kvarjenju piva zaradi delovanja Pediococcus damnocus izogibajo s CIP tehniko či�čenja vse opreme. Na splo�no najdemo predstavnike tega rodu v fermentiranih izdelkih rastlinskega porekla (kislo zelje, kumare, olive, krma). Odkrili pa so jih tudi v sve�em in prekajenem mesu, sve�ih in ribah kakor tudi v siru. V nekaterih dr�avah se Pediococcus damnocus uporablja kot starter kultura pri proizvodnji nekaterih vrst klobas in slanine. Ker se zni�a pH vrednost, se zmanj�a mo�nost oku�be s potencialno patogenimi organizmi (Staphylococcus aureus). Z uporabo teh starter kultur se skraj�a proizvodni čas izdelka, izbolj�a pa se tudi kvaliteta in mikrobiolo�ka obstojnost. (Gaber, Golob, Frim in Horvat, 2000) 3.5. Rod Leuconostoc Leuconostoc so heterofermentativne, kokoidne bakterije. So zelo raz�irjene v naravi, predvsem v rastlinah. Za rast potrebujejo ogljikove hidrate, aminokisline in peptide, nukleinske in ma�čobne kisline ter vitamine (biotin, nikotin, tiamin, pantotenska kislina). Optimalna temperatura rasti je med 20 in 300C. So aerotolerantni. Lenconostoc nima dobro razvitega proteolitičnega sistema, ki je nujno potreben za razgradnjo kazeina in s tem za oskrbo z du�ikom, zato sam ne raste dobro v mleku. Rast se izbolj�a, če so prisotni tudi mezofilni laktokoki. Lenconostoc oenos ima pomembno biotehnolo�ko funkcijo pri jabolčno mlečni fermentaciji, ki je potrebna v rdečih vinih. Je edina vrsta, ki je bila kadarkoli izolirana iz vina pri ni�ji pH vrednosti od 3,5. Navajen je na visoke koncentracije etanola in na prisotnost �veplovega dioksida. (Gaber, Golob, Frim in Horvat, 2000)


3.6. Rod Enterococcus Enterokoki so naseljeni v črevesju človeka in �ivali. Prisotnost enterokokov je pokazatelj neustrezne higiene pri proizvodnji določenih �ivil. Optimalna temperatura rasti je 400C, pa tudi več. Rastejo tudi, če je prisoten NaCl (tudi nad 6,5%). Enterokoki čez zimo izginejo iz rastlin in se ponovno pojavijo spomladi in poleti (insekti). Ni �e dolgo tega, ko so Enterococcus foecium dodajali krmi mladih �ivali za preprečitev infekcije črevesja s patogenimi organizmi (Salmonella, E. coli). (Gaber, Golob, Frim in Horvat, 2000) 3.7. Rod Bifidobacterium Bifedobakterije ne spadajo med Clostridium, gram pozitivne baktrije, kot vse ostale mlečno kislinske bakterije. Kljub temu so uvr�čene med mlečno kislinske, saj je glavni produkt njihove fermentacije mlečna kislina. Habitat teh striktno anaerobnih bakterij so člove�ki in �ivalski iztrebki, črevesje insektov, vampi pre�vekovalcev, odpadna voda,� V mleku uspevajo le, če jim dodamo 'bifidofaktorje' (laktoza, N-acetilglukozamin, hidrolizati peptidov). (Gaber, Golob, Frim in Horvat, 2000) 3.8. Izolacija in kultivacija Izolacija mlečno kislinskih bakterij iz določenega habitata ni problematična. Pogoj pa je, da predstavljajo glavni del prisotne mikroflore. Mlečno kislinske bakterije potrebujejo goji�če, ki je bogato s hranili. Običajno je pH goji�ča ni�ji zato, da lahko izkoristimo acidofilne lastnosti, ki jih ima večina mlečno kislinskih bakterij. Glede na prvo izolacijo je lahko ugodna inkubacija agar plo�č pod anaerobnimi pogoji (npr. v atmosferi, ki vsebuje 10% ogljikovega dioksida in 90% du�ika). Temperatura inkubacije je odvisna od biotopa v katerem se mlečno kislinske bakterije nahajajo. Če hočemo iz me�anice mezofilnih in termofilnih mlečno kislinskih bakterij izolirati samo termofilne bakterije je priporočena temperatura inkubacije 40-450C. Mlečno kislinske bakterije tvorijo majhne kolonije, tako, da je npr. po 4 dneh inkubacije premer kolonije 1-2mm. Prvi korak pri izolaciji analiziranega vzorca je največkrat inkubacija v mesnem bujonu. Veliko klasičnih rastlinskih medijev omogoča rast več vrstam bakterij in ne samo eni. Mikroskopska preiskava vzorca je edini način, da ugotovimo katere vrste bakterij so zrasle na goji�ču. Za izolacijo in razmno�evanje laktobacilov se uporablja MRS-agar. (Gaber, Golob, Frim in Horvat, 2000) 3.9. Razmno�evanje in ohranitev starter kultur Starter kulture uporabljajo v industrijski proizvodnji hrane ter krme za �ivali. Fermentacija zelene �ivalske krme, ki je shranjena v silusu poteka spontano in to zaradi razvoja avtohtone mikroflore. Mlečni proizvodi pa so skoraj vedno proizvedeni s pomočjo komercialnih starter kultur. Te so lahko tekoče, posu�ene ali pa zamrznjene. Pomembno je, da imajo visok odstotek pre�ivelosti in optimalno aktivnost za določen tehnolo�ki postopek (naprimer fermentacija laktoze do laktata, proizvodnja komponent arome). Dolgotrajna uporaba kulture ni uspe�na, saj se lahko razvijajo organizmi, ki lahko povzročijo neza�eljeno fermentacijo. V večini primerov zagotavlja pasterizirano ali sterilizirano mleko osnovno hranilo za medij, ki se uporablja za mno�ično proizvodnjo starter kultur. Mleku,


kot mediju za razmno�evanje tekočih starter kultur se lahko doda kvasni ekstrakt, laktoza, glukoza in kalcijev karbonat. Za dose�eno in ohranjeno optimalno aktivnost in pre�ivelost mlečno kislinskih bakterij je potrebno izvesti nevtralizacijo nastale mlečne kisline in sicer z amonijevim ali natrijevim hidroksidom. Veliko vrst mlečnih streptokokov med fermentacijo proizvaja tudi vodikov peroksid. Zaradi tega je koristno, če rastnemu mediju dodamo katalazo in sicer toliko, da je v ml kulture prisotnih več kot 1010 �ivih celic. Za pripravo koncentriranih starter kultur se posnetemu mleku doda papain ali bakterijske encime in to zato, da se prepreči sedimentacija kazeina v separatorju, kjer se zbira biomasa. Moderna tehnologija priprave starter kultur omogoča delo na področju mikrobiologije kakor tudi veliko zanesljivosti do proizvajalcev starter kultur. Klasične tekoče starter kulture, ki vsebujejo 109/ml aktivnih celic, je potrebno pred inokulacijo namno�it. Te tekoče starter kulture lahko hranimo pri temperaturi okolja tudi več mesecev. Koncentrirane starter kulture so primerne za direktno inokulacijo v bioreaktor. Direktna inokulacija ima določene prednosti glede za�čite pred bakteriofagi, ki so pogosto prisotni v odprtih fermentacijskih sistemih . (Gaber, Golob, Frim in Horvat, 2000) 4. BIOKEMIJSKE OSNOVE BIOPROCESA 4.1.Lastnosti mlečne kisline Zaradi lahke samoesterifikacije pri segrevanju se mlečni kislini ne da določiti točnega vreli�ča; ocenili so ga na 190°C pri normalnem tlaku, pri 12mm Hg zna�a 119°C in pri 1mm Hg 82°-85°C. Pri koncentriranju vodne raztopine mlečne kisline se molekule dehidrirajo ali samoesterificirajo predno odstranimo vso vodo; tako da je vodna raztopina mlečne kisline, ki je več kot 18%-tna sestavljena iz: monomerne mlečne kisline, produktov linearne kondenzacije in samoesterifikacije, laktida in vode. Ko začnemo s koncentriranjem mlečne kisline, dobimo iz dveh molekul laktil mlečne kisline in molekulo vode. Z nadaljnim koncentriranjem ta zopet izgubi molekulo vode in nastane laktid.

2 CH3CHOH-COOH CH3CHOHCOOCH-(CH3)-COOH + H2O

CH-(CH3 )OCO-(CH3 )OCO

Pri nadaljnjem odcepljanju vode iz COOH in OH skupine dobimo verigaste molekule polimlečne kisline. OH[CH(CH3)COO]n H Razmerje med komponentami zavisi od koncentracije, temperature in dol�ine shranjevanja mlečne kisline. Mlečna kislina je sirupasta tekočina, ki je popolnoma topna v vodotopnih organskih topilih kot sta alkohol in aceton. Dejstvo, da se mlečna kislina porazdeli v nevodotopnih topilih kot so butanol, izoamilalkohol, n-amilalkohol, benzilalkohol, etil in izopropileter, med topilo in vodo se uporablja pri postopku či�čenja mlečne kisline z ekstrakcijo. Pri razredčevanju mlečne kisline z vodo pride pri sobni temperaturi do ravnote�ja �ele po pribli�no 100 dneh, pri 98°C po 12 urah in pri vrenju nakisane raztopine nekaj prej.


Z razredčevanjem se viskoznost raztopine ne zmanj�uje kot bi pričakovali, ampak se veča do ravnote�ja.

Diagam �t.1: odvisnost viskoznosti od časa, ki je potekel po razredčenju na 77,33% iz 85,32% ( Macarol, 1980) Mlečna kislina ka�e značilne reakcije organskih kislin (tvorba soli, ter estrov z alkoholi) in zaradi vsebovane-OH skupine značilne reakcije za alkohole (esterifikacija s kislinami, ahidridi). 4.2. Uporaba mlečne kisline in njenih soli V svetu se izdeluje �tiri kvalitete mlečne kisline in sicer: 1. tehnična mlečna kislina 22%, 44% in 80%, katero se uporablja v usnjarski in tekstilni

industriji; zahteve po kvaliteti postavlja navadno kupec glede na uporabo. 2. prehrambena mlečna kislina 50%-80%, ki se uporablja predvsem kot uravnalec kislosti

in konzervans v �ivilski industriji; kvaliteta prehrambene mlečne kisline je predpisana s standardi.

3. mlečna kislina za plastične mase se uporablja pri izdelovanju amino in fenolformaldehidnih smol za nevtralizacijo bazičnega katalizatorja; ta mlečna kislina sovpada s kvaliteto p.a.

4. mlečna kislina za farmacevtske namene in kozmetiko pribli�no 85%, katere kvaliteta je predpisana s farmakopejo.

Med najbolj pogosto uporabljene soli mlečne kisline sodijo: - srebrov laktat kot antiseptik v zobozdravstvu - kalcijev laktat v terapijah s kalcijem in kot dodatek pecilnemu pra�ku - natrijev in kalijev laktat, ki zaradi svojih fizikalnih lastnosti nadome�čata glicerol - etilaktat kot vezivo pri proizvodnji tablet


4.3. Industrijsko pridobivanje mlečne kisline Industrijska proizvodnja mlečne kisline sloni na fermentativnih postopkih pretvorbe ogljikovih hidratov pod vplivom različnih mikroorganizmov. Kot producenti mlečne kisline so znani Lactobacillus delbrueckii, L. casei, L. leichmani, L. bulgaricus, L. penthosus in Streptomyces lactis. Vsi na�teti mikroorganizmi so homofermentativni; izbiro mikroorganizma pa pogojuje vir ogljikovih hidratov (surovina za fermentacijo) in temperatura biosintetskega ciklusa. Kot vir biosintetske pretvorbe ogljikovih hidratov slu�i lahko vrsta surovin. Kislina v splo�nem lahko nastaja iz glukoze, saharoze ali laktoze, najcenej�a pa je uporaba sirotke in melase kot osnove fermentacijskih substratov. Sama fermentacija poteka pri relativno visokih temperaturah (45-50°C), vendar je potrebno za vsako fermentacijo optimalno temperaturo ugotoviti. Prav tako pa zahteva tudi vsak tip fermentacije čisto določen procent sladkorja v substratu, medtem, ko je večina bakterij-producentov mlečne kisline-anaerobnih in odpade potreba po kisiku med fermentacijskim ciklusom. Pomemben dejavnik je pH substrata, ker je bolje, da je substrat rahlo kisel, čeprav je treba med fermentacijskem ciklusom nevtralizirati nastajajočo mlečno kislino, ker bi v obratnem primeru prevelika kislost onemogočila bakterijam �ivljenje. Sama fermentacija poteka na fermentacijskem substratu določenega koncentracije sladkorja (vir sladkorja je melasa), ki smo ga pasterizirali s segrevanjem na 90°C 15min. Melasni raztopini je potrebno dodajati hranila, kot so superfosfat, natrijev ali amonijeve soli ter občasno druge dodatke. Tako pripravljen substrat inokuliramo z 12-18 ur starimi bakterijami v takem razmerju, da je razmerje inokuluma v substratu 3 do 5% volumna substrata. Pod anaerobnimi pogoji pri 47-50°C poteka fermentacija pribli�no 72 ur, ker je v tem času pretvorba sladkorja (kot inverta) v mlečno kislino 95%. Med nastajanjem ve�emo mlečno kislino v obliki kalcijevega laktata, saj nevtraliziramo nastajajočo mlečno kislino v fermentacijskem ciklusu, s kredo. (Macarol, 1980) Nevtralizacija kisline poteka po shemi: Shema 1: Nevtralizacija kisline (Prescott in Dunn, 1949)

O CH3CHOHC OH HO CH3CHOHCOO + Ca Ca + 2 H20 OH HO CH3CHOHCOO CH3CHOHC O


Po končani fermentaciji spro�čamo mlečno kislino- dobljeno kot kalcijev laktat- s koncentrirano �veplovo kislino, nastali kalcijev sulfat pa ločimo od surove mlečne kisline s filtriranjem. Shematsko bi lahko prikazali celoten tehnolo�ki postopek takole:

Shema 2: Celoten tehnolo�ki postopek (Macarol, 1980) 4.4.Mikroorganizem Omenili smo �e, da je fermentacija mlečne kisline anaerobna in submerzna, iz melase- kot surovine- pa se sladkor pretvarja v mlečno kislino zaradi delovanja encimskega kompleksa bakterije Lactobacillus delbrueckii. Ta bakterija ima podoben encimski sestav kot kvasovke, zatorej je mlečnokislinsko vrenje podobno kvasnemu, do kopičenja mlečne kisline pa prihaja ( za razliko od kvasne fermentacije) zaradi tega, ker Lactobacillus nima karboksilaze, ki jo kvasovke imajo in se metabolična pot ustavi pri mlečni kislini.


Biosintezo te kisline bi - čisto preprosto, lahko podali takole: C6H1206→ 2CH3−CHOH−COOH Metabolno pot nastanka pa: C6H12O6→ CH2OH−CHOH−CHO glicerinaldehid CH3CO−CHO → CH3−CHOH−COOH metilgliksal mlečna kislina Bakterija Lactobacillus delbrueckii spada v tisto skupino predstavnikov rodu Lactobacillus, za katero je značilna homofermentativna razgradnja sladkorja - to pomeni, da je glavni produkt metabolizma glukoze (preko 85%) mlečna kislina. Celice bakterije so paličaste, dolge 2-9 cm, nastopajo pa posamezno ali v veri�icah. Kolonije so normalno hrapave in nepigmentirane, ne rastejo pri 15°C, marveč je rast zaznavna �ele pri 45°C, običajno pa pri 50°-52°C, čeprav je optimum rasti med 40° in 44°C. Sve�e izolirana kultura običajno dobro fermentira maltozo, medtem, ko je razgradnja dekstroze znatno slab�a. Zato ga moramo počasi prilagajati na �eljeno fermentiranje in prav ta faza prilagajanja običajno ni tako enostavna, kot navaja literatura. Uspe pa ga vzgojiti v dobro industrijsko kulturo, ki razgrajuje dekstrozo tako, da maltozni raztopini dnevno dodajamo dekstrozo. Normalno pa je, da so določeni sevi Lactobacillus delbrueckii primernej�i za tako prilagajanje, kajti lahko se zgodi, da z drugimi sevi sploh ne uspemo doseči za�eljenega efekta. Celične stene Lactobacillusa vsebujejo glicerol tehoično kislino, peptidoglikan pa je L-lizin-D-aspartat. Serolo�ke grupe niso zaznavne. Vsebujejo kalcijev pantotenat, niacin in riboflavin, medtem, ko niso odkrili tiamina, piridoksala, folne kisline in vitamina B12. Za produkcijo mlečne kisline v industrijskem obsegu je potrebno izbrati tak sev L. delbrueckii, ki dobro raste na melasi in ga je mogoče gojiti s serijskimi precepljanji na različna melasna goji�ča z dodatkom fosfata in krede. (Macarol, 1980) Mlečna kislina daje tudi jodoformsko reakcijo: To je v bistvu reakcija med spojinami, ki vsebujejo acetilno skupino, CH3CO-, in jodom v alkalnem mediju. Pri tem pa je treba poudariti, da reakcija z ocetno kislino ne poteka, rabi pa se jo �e posebno za kvalitativni dokaz etanola. (Klofutar s sod., 1997) CH3CHO + 3 I2 + 3 NaOH CI3CHO + 3 NaI + 3 H2O acetaldehid trijodoacetaldehid

CI3CHO + NaOH CHI3 + HCOONa trijodoacetaldehid jodoform natrijev formiat


Glukoneogeneza je sinteza glukoze iz neogljikovodikovega izvora, ampak iz laktata, aminikislin in glicerola. Laktat nastal pri kontrakciji mi�ic se pretvarja v jetrih v glukozo. Glavna surovina za glukoneogenezo je laktat, ki nastane kot posledica pretirane mi�ične aktivnosti. V anaerobnih pogojih tkiva skeletnih mi�ic je pri kontrakciji hitrost nastanka piruvata večja od hitrosti oksidacije piruvata v ciklusu citronske kisline. Velja tudi, da je hitrost nastanka NADH pri glikolizi v aktivnih mi�icah večja, kot je hitrost oksidacije NADH v dihalni verigi. Vse zavisi od razpolo�ljive NAD+ za oksidacijo gliceraldehid-3-fostata. Reakcija: Encim je laktat-dehidrogenaza. CH3-CO-COO¯ + NADH + H+ ↔ CH3CHOHCOO¯ + NAD+ Reakcija je reverzibila. Laktat predstavlja slepo ulico metabolizma. Da bi se dalje metaboliziral, se mora ponovno pretvoriti v piruvat. Najpomembnej�a stvar pri tej reakciji je regeneracija NAD+. Nastali laktat v skeletnih mi�icah gre po krvi v jetra. Laktat in piruvat zlahka difundirata skozi celične membrane mi�ice v kri in pridejo v jetra. Laktata pride več kot piruvata, ker je v skeletnih mi�icah pri kontrakciji razmerje NADH/NAD+ dokaj visoko. Ko laktat pride v jetra se oksidira v piruvat, saj je tu razmerje v citosolu NADH/NAD+ nizko. Tu se začne glukoneogeneza. Iz piruvata preko reakcij nastaja glukoza, ki gre v skeletne mi�ice. Ta cikel imenujemo Corijev ciklus. (Strayer, 1995) 5. BIOIN�INIRSKE OSNOVE BIOPROCESA 5.1.Uvod Prvi poiskusi proizvodnje mlečne kisline so bili narejeni 1881 v ZDA. Mlečna kislina je produkt fermentativnega delovanja mlečnokislinskih bakterij. Mikrobiolo�ki proizvodnji je vedno konkurirala kemijska sinteza mlečne kisline. Najbolj uporabljene metode so : ! oksidacija propana z du�ikovo kislino in du�ikovim peroksidom v prisotnosti kisika pri čemer dobimo α - nitratov propionsko kislino, ki se kasneje hidrolizira v mlečno in du�ikovo kislino.

! hidroliza nitrila mlečne kisline, ki je obstojna v reakciji acetaldehida z HCN. Mlečno kislino je potrebno �e izolirati in očistiti iz brozge. Končna cena pa je odvisna ravno od čistosti mlečne kisline. 5.2.Pripravljalni postopki Priprava biokulture je tisti del celotnega bioprocesa, v kateri �eljeno kulturo revitaliziramo in s tem pripravimo inokulum za uporabo v industriji.


5.2.1.Revitalizacija S postopkom revitalizacije biokulture �elimo zagotoviti čim bolj�o pre�ivelost biokulture, ki je bila globoko zamrznjena ali dehidrirana. V večini primerov revitalizacijo omogoči rehidracija. Pri liofiliziranih ali kako drugače su�enih kulturah, ta poteka ob dodatku tekočega goji�ča, ki je običajno enako uporabljenemu mediju za namno�itev biokulture pred trajnim shranjevanjem. Rehidracija v destilirani vodi daje slab�o pre�ivelost celic zaradi neuravnote�enega osmotskega tlaka, ki ob prehitri rehidraciji povzroči pokanje celic. Za močno termorezistentne bakterijske spore, ki so bile predhodno zamrznjene, se uporablja �ok odtajevanje, kjer se biokulturo izpostavi temperaturi 100°C za 90s. Termolabilnej�im biokulturam pa postopoma dvigamo temperaturo. 5.2.2.Priprava inokuluma Proces se nadaljuje z inokulacijo industrijskega bioreaktorja. Namen teh procesov je proizvodnja dovolj velike količine biomase, ki je hkrati tudi v optimalnem fiziolio�kem stanju, da razvije maksimalno produktivnost med samim bioprocesom. V industri se za shranjevanje in začetno laboratorijsko izolacijo biokulture običajno uporablja čvrsta goji�ča, nadaljne namno�evanje pa poteka submerzno v tekočem goji�ču. Inokulum običajno predstavlja 0.5-10 % volumna medija, ki ga inokuliramo. Dobro je, če imamo čim večjo količino inokuluma z največjo koncentracijo celic, ker s tem skraj�amo čas rasti in prilagoditve na novo okolje. Ustrezno koncentracijo inokuluma dose�emo s sedimentacijo ali centrifugiranjem. 5.3.Hranilne snovi Mikroorganizmi potrebujejo za svoj obstanek, rast in razmno�evanje energijo, potrebujejo pa �e gradnike lastnih snovi. Nekateri lahko izkori�čajo svetlobno energijo za zadovoljevanje energijskih potreb (večina fotosintetskih avtotrofov je za industrijsko uporabo nezanjimivih ), drugi energijo pridobivajo iz snovi, v katerih je ta vezana in se spro�ča z degradacijo. Pravilno zagotavljanje hranilnih in drugih potrebnih substanc nam poda poznavanje metaboličnih in sinteznih poti, odločilna pa sta tehnolo�ki preiskus in ekonomika postopka. Kvalitativno najpomembnej�i element je ogljik . Pomembno je tudi v kak�ni obliki ga dodamo kulturi, izkoristljivost (potreba po či�čenju) ter cena, saj je le ta na trzi�ču relativno nizka. Viri hranil so predvsem mono in disaharidi. 5.3.1.Viri ogljika • glukoza: končni produkt kislinske ali encimske hidrolize polisaharidov s pomočjo

encimov α−amilaza in glukozidaza. • maltoza: produkt encimske razgradnje �kroba z α−amilazami in β−amilazami. • saharoza: odpadni produkt pri proizvodnji sadnih sirupov in predvsem kuhinjskega

sladkorja • laktoza: stranski produkt v mlečni industriji, nahaja se v sirotki. Polisaharidi so za mlečnokislinske bakterije nedostopni razen za Lactobacillous amylophilus in Lactobacillous amylovorus. Zato je potrebno polisaharide hidrolizirati. Kislinska hidroliza se uporablja redkeje, ker pride do tvorbe neza�eljenih produktov. Za


encimsko hidrolizo pa uporabljamo α−amilaze bakterij in glukoamilaze pridobljene iz plesni. Najpogosteje uporabljen vir ogljika v proizvodnji mlečne kisline je saharoza, pridobljena iz melase. Pri laktozi pa se srečujemo z problemom nizke koncentracije v surovini, zato je potrebno laktozo koncentrirati, kar poveča stro�ek surovine. 5.3.2. Viri du�ika Du�ik se v goji�če dodaja v obliki amonijaka, nitratov, nitritov, amonijevega sulfata, sečnine, ... Du�ik je potreben za tvorbo lastnih amino kislin in drugih du�ikovih spojin. Du�ik (amonijak, amonijev hidroksid) je pomenben pri uravnavanju pH, ki pada zaradi aktivnosti mikroorganizmov. Optimalna koncentracija amonijaka je 1mg/l. Večje koncentracije povzročajo inhibicije aktivnosti mikrobnih celic. Kot vir du�ika se pogosto uporabljajo aminokisline, peptidi ali proteini pridobljeni iz sojine moke, ali z predelavo drugih odpadnih virov �ivilske industrije. Pomembna je tudi dozacija. Prevelike doze posameznih aminokislin lahko preprečijo sintezo nekaterih encimov ali povečajo resorbcijo potrebnih ionov. Uporaba aminokislin pospe�i delovanje in razmno�evanje mikroorganizmov, zlasti ko bi morale celice same proizvajati potrebne aminokisline. Kot vir du�ika lahko uporabljamo tudi odpadno biomaso iz predhodnega bioprocesa. 5.3.3. Viri fosforja Fosfor dodajamo kot snov za vzdr�evanje konstantnega pH (oblika fosforjeve (V) kisline). Mikroorganizmi ga potrebujejo za rast in proizvodnjo sekundarnih metabolitov, kjer njegova koncentracija ne sme presegati 10mmol/l. V vi�jih koncentracijah deluje inhibirajoče na celico. Ker prosto mlečno kislino velikokrat ve�emo na kalcijev karbonat, s tem uravnavamo pH na vrednost 5.5-6.0. Največkrat dodajamo fosfor v obliki soli ali fosfatov. Upo�tevat moramo tudi količino fosforja ki ga s sabo prinese surovina. 5.3.4. Viri drugih elementov Kompleksni hranilni substrati so pogosto zadosten vir vseh elementov, ki jih potrebujejo mikroorganizmi. Nekaj teh elementov je za delovanje mokroorganizmov nujno potrebnih in jih imenujemo mikroelementi (Mg, K, Ca, Zn, Mn, Co, Mo). �elezo je potrebno pogosto dodati, saj je njegova koncentracija prenizka. Koncentracija elementov ne sme presegati vrednosti 1ppm, ker vi�je koncentracije negativno vplivajo na delovanje mlečnokislinskih bakterij. Mikroelementi se dodajajo v obliki tehničnih kemikalij. Pri tem pa moramo biti previdni, ker le te lahko vsebujejo preveč drugih neza�eljenih snovi. Tu je pomemben tudi material iz katerega je narejen bioreaktor, saj je mlečna kislina pri vi�jih koncentracijah korozivna. Pozornost je potrebno nameniti tudi interakcijam med ioni, da ne pride do obarjanja in s tem do nedostopnosti posameznih mikroelementov kot je to pri sulfidu. Zato se kot vir �vepla dodaja sulfat ali elementarno �veplo.


5.3.5. Viri drugih organskih spojin Tu gre predvsem za vitamine, ki jih potrebujemo v majhnih količinah, tudi manj kot10-12mmol/l. Vitamini so pomembni, ker so sestavni del koencimov in sodelujejo v mnogih biokemijskih reakcijah. Nekatere odpadne vode �ganjarn, predelave sadja in krompirja vsebujejo precej takih snovi, ki jih mikroorganizmi potrebujejo v manj�ih mno�inah. Ti slu�ijo kot dodatek glavnim virom ogljika in du�ika. (Buchta, 1983) 5.4. Fermentacija-proces proizvodnje mlečne kisline

Shema 3:Industrijska produkcija mlečne kisline (Buchta, 1983) Poznamo �tevilne metode proizvodnje mlečne kisline. Najpomenbnej�a je klasična metoda kalcijevega laktata, metoda amonijevega laktata, kontinuirana fermentacija ter �tevilne druge. 5.4.1.Klasična metoda kalcijevega laktata Je najstarej�a metoda proizvodnje mlečne kisline in tudi najbolj raz�irjena. Potek je prikazan na shemi 3.Pred pričetkom bioprocesa moramo najprej pripraviti ustrezno goji�če. Dodamo sladkorje(glukozo, ki jo je potrebno predhodno encimsko in kislinsko hidrolizirati), ki predstavljajo izvor ogljika. Uporablja se lahko tudi sirotka ali melasa. Koncentracija sladkorja v goji�ču je med 120 do 180 g/l in je odvisna od vrste


mikroorganizmov. Zagotoviti moramo tudi izvor du�ičnih snovi (amonijak, amonijev fosfat, amonijev sulfat) v obliki kvasnih ekstraktov, peptona,...V primeru, ko smo dodali kot vir du�ika in ogljika organske snovi, smo deloma �e zagotovili vse potrebne snovi, v nasprotnem primeru pa le te dodamo v obliki soli ali čistih substanc. Goji�ča in aparature ki jih bomo v procesu uporabili je potrebno sterilizirati. Fermentacijske posode so najrazličnej�ih volumnov. Od le nekaj m3 do več 100m3. Pomembni so tudi materiali iz katerih je bioreaktor narejen. Mlečna kislina je korozivna, zato lahko pride do kontaminacije brozge in do po�kodb na bioreaktorju. Materiali iz katerih so bili v preteklosti zgrajeni fermentatorji so bili predvsem les in beton. Danes je to nerjaveče jeklo. Sestavna dela bioreaktorja sta �e me�alo (ohranjanje snovne in temperaturne homogenosti), grelec (v začetku fermentacije) ter hladilec (med fermentacijo se prične spro�čati toplota). Sterilni kalcijev karbonat se doda pred ali med bioprocesom v obliki pra�ka za vzdr�evanje pH. Ta ve�e nase prosto mlečno kislino in vzdr�uje pH med 5.5 in 6.0 Inokulacija poteče tako, da dodamo 10% inokuluma pripravljenega v manj�em bioreaktorju. Znak, da fermentacija poteka se poka�e po 6h, ko prične izhajat CO2, kot posledica dodatka kalcijevega karbonata. Z ishajanjem CO2 je preprečen vstop kisika v sistem. Med fermentacijo lahko pustimo, da se temperatura dvigne tudi do 50°C, če uporabljamo dovolj termostabilne mikroorganizme kot je L. delbrueckii. Visoka temperatura isključuje mo�nost tvorbe drugih organskih kislin, ki bi nastajale pri aerobnih reakcijah. Fermentacija je zaključena po 2-6 dneh, odvisna je od koncentracije porabljenega ogljika. Zgornja meja koncentracije sladkorja je odvisna od topnosti kalcijevega laktata, ki se pri večjih koncentracijah začne usedati na dno fermentacijske posode. Poiskusi ka�ejo da so vi�je koncentracije sladkorja (260 g/l) pri fermentaciji z dozacijo kalcijevega oksida, s katerim se pH dvigne na 6.3, kar povzroči kontinuirano izločanje kalcijevega laktata in pomakne ravnote�je na stran produktov. Izkoristek postopka je 99.6% v treh dneh. Izkoristeki pri običajnih postopkih pa so 85-95%. Zaradi nihanja pH pride do tvorbe manj�e količine 2% ocetne in propionske kisline, kot posledica občasnega prehoda iz homofermentativne v heterofermentativno fazo fermentacije. 5.4.1.1.Izolacija in či�čenje produkta Kvaliteta produkta je močno odvisna od surovine, ki smo jo uporabili kot izvor ogljika. Či�čenje po klasični metodi (Rauch) pričnemo s segrevanjem brozge, da se raztopi ves proizveden kalcijev laktat, nato dodamo �vepleno kislino (87%). Rezultat je prosta mlečna kislina kislina in kalcijev sulfat, ki se izloči kot oborina in ga naknadno filtriramo. Zdru�en filtrat evaporiramo v vakuumu, ostalo količino kalcijevega sulfata pa odstranimo skupaj z barvnimi konponentami, z adsorbcijo na aktivno oglje. Te�ke kovine odstranimo z heksacianoferatom, pri čemer nastanejo stabilni kompleksi. Kislino koncentriramo z ionsko izmenjevalno kromatografijo. S tem postopkom dose�emo koncentracije do 80%. Če uporabljamo slab�o kakovost surovine ogljikovega izvora, je potrebno �e dodatno či�čenje in uporaba snovi za učinkovitej�o filtracijo. Uporablja se tudi kristalizacija kalcijevega laktata, preden mu dodamo �vepleno kislino. Večje izkoristke so dosegli z uporabo magnezijevega ali cinkovega laktata namesto kalcijevega, predvsem zaradi popolnej�e kristalizacije (Bode) Druge tehnike izolacije kislin, kot je solventna ekstrakcija z topili izopropil eter, α,ω-diamino-oligoetri, izobutanol in drugi, so razvili zaradi onesna�evanja okolja z odpadnim kalcijevim in drugimi sulfati.


Razvile so se tudi druge metode: ionsko izmenjevalna tehnika (Yoshida1992, Evangelista 1994). Uporaba tekočih membran (Chaudhuri in Pzzle 1992, Lazarova in Peeva 1994). Pogosto se uporablja separacija, pri kateri izvajamo esterifikacijo mlečne kisline z metanolom (Schopmyer 1943). Dobljen hlapen ester oddestiliramo in naknadno izvedemo deesterifikacijo z vodo. Kot produkt dobimo metanol in mlečno kislino visoke čistosti. Prednost metode je da ni nikakr�nega odpadka, slabost pa draga oprema. 5.4.2.Metoda amonijevega laktata Za vzdr�evanje konstantne pH v mejah 5.5-6.0 se uporablja različne karbonate in hidrokside, vendar pride do nastajanja neuporabnega stranskega produkta, zato se je razvila metoda, pri kateri nastaja produkt ki ga lahko uporabimo. Pri tej metodi se uporablja amonijak in ima �tevilne različice (Poznanski 1976, Jarry in Lemonerie 1988). Pri tej metodi se producira uporaben amonijev sulfat, ki nastane v reakciji amonijevega laktata z �vepleno kislino. Za či�čenje je bila uporabljena tudi esterifikacija z različnimi alkoholi in z raznolikimi konbinacijami le teh (Cockrem in Johnson 1993). Z vi�anjem temperature se dose�e večja efektivnost procesa. Metoda ki sta jo razvila Septika in Septikova (1992) je shematično prikazana na shemi 3. Med fermentacijo se konstantno dodaja amonijev hidroksid. Po končani fermentaciji se brozga koncentrira do 50-60% vsebovane mlečne kisline, doda se H2SO4. Sprostita se mlečna kislina in amonijev sulfat kot prosta oborina, ki se odstrani z filtracijo. Amonijev sulfat se uporabi kot gnojilo. Filtrat se uvaja v esterifikacijsko kolono, kjer protitočno potujejo hlapi alkohola. Nastali ester in ostanek prostega materiala se ločijo na rektifikacijski koloni. Izoliran metilni ester reagira z vodo, v tem koraku poteče deesterifikacija in tako dobimo prosto mlečno kislino, katere izkoristek je 90-95%, odvisno od sladkorja, katerega uporabljamo. (Septika in Septikova, 1992). Dobljen produkt ima pri koncentraciji 80±0.8% naslednje lastnosti: specifična te�a: 1.196g/l pepel: nič sulfat: nič kalcij: nič kloridi: sledovi �elezo: sledovi


Shema 4: Industrijska proizvodnja mlečne kisline z uporabo metode amonijevega laktata, (Septika in Septikova, 1992). 5.4.3.Uporaba kontinuirane fermentacije Prednosti kontinuirane fermentacije je večja produktivnost, ki pa je odvisna od uporabljene metode. Metoda po Richterju (1987) je dosegla produktivnost tudi do 50 g/Lh. Razvite so bile tudi specifične metode za fermentacijo sirotke (Boyaval 1987, Koluzik 1992, Boergardts 1994), saj ima le ta nizko vsebnost laktoze. Z večanjem fermentacijskih produktov nastajajo tudi stranski produkti. Prednost te metode je, da poleg večje produktivnosti ne proizvaja stranskih produktov, ki nastanejo v fazi fermentacije, pri nevtralizaciji kisline za vzdr�evanje optimalnega pH. Za či�čenje in izolacijo se tu uporablja predvsem elektrodializa, ionskoizmenjevalna kromatografija, sistem z tekočimi membranami in �tevilne druge. 5.4.4.Imobilizirane celične kulture Precej�en del �tudij je bil p osvečen tej tematiki (Linko, 1984; Mehala in Cheryan, 1987b; Boyaval in Goulet, 1988; Bassi, 1991), vendar �e ni pri�lo do uporabe tovrstne tehnike v industriji pridobivanja mlečne kisline. (Septika in Septikova, 1992).


6.EKOLO�KI VIDIK BIOPROCESA Problemi emisije odpadkov in akumulacija sekundarnih surovin v okolje so spremljajoči problemi obstoječih tehnolo�kih postopkov v �ivilski industriji. Nastajajo v velikih količinah v postopkih predelave, procesiranja, skladi�čenja, distribucije in marketinga. V preteklosti je veljalo okolje kot neskončen vir vseh dobrin, ki ga lahko izkori�čamo brez stro�kov za njegovo skrb. Dvig zavesti in spoznanje, da je okolje omejen vir člove�kih dobrin v zadnjem obdobju vpliva na nov pristop do okolja, v katerem �ivimo. Nekatere obstoječe in nove tehnologije, ki nastajajo na področju �ivilstva �e vključujejo različne tehnolo�ke in biotehnolo�ke postopke za�čite okolja pred onesna�enjem. Sodobna �ivilska industrija je �e sposobna ponuditi potro�niku sve�o in procesirano hrano visoke kakovosti. Kljub sodobnim tehnolo�kim postopkom, ki se v ta namen uporabljajo se je nemogoče izogniti nastajanju sekundarnih surovin in odpadkov ter zračnim emisijam, ki potencialno vplivajo na onesna�evanje okolja. Zato je potrebno vzdr�evanje in smotrno izkori�čanje naravnih virov bogastva s pomočjo reciklacije in izkori�čanjem sekundarnih surovin in odpadkov s postopki, ki zmanj�ujejo obremenitev in onesna�enje okolja. Na tem področju nam bioprocesi omogočajo re�evanje in vzpostavljanje poru�enega ravnote�ja kro�enja snovi v naravi in kontrolo onesna�enja. Izdelki, ki nastajajo skozi bioprocesne aktivnosti iz sekundarnih surovin in odpadkov, se ponovno vključujejo v prehransko verigo ljudi in �ivali in so pogosto vi�jega cenovnega razreda, kot izhodi�čne surovine. Uporabljajo se tudi zaradi mo�nosti hitrej�e transformacije organskih snovi v obliko, ki je okolju prijaznej�a. Kvasovke, plesni, bakterije in alge so mikroorganizmi, ki sodelujejo v različnih bioprocesih transformacije sekundarnih surovin in odpadkov. Zato so osnovne značilnosti sekundarnih surovin in odpadkov �ivilske industrije zelo pomembne za izbiro bioprocesa nadaljne obdelave in predelave. Skupna značilnost vseh sekundarnih surovin in odpadkov �ivilske industrije je, da imajo večjo moč onesna�enja okolja, kot je to v primeru komunalnih odpadkov. Več kot 30 % surovin, ki se vključujejo v tehnolo�ki proces predelave v �ivilski industriji postane odpadek , ki potrebuje dodatno obdelavo ali predelavo (Leonard in Schaub, 1996). Na različnih področjih �ivilske industrije nastajajo vzporedno s potekom tehnolo�kega postopka tudi sekundarne surovine in odpadki. Danes je mo�na proizvodnja mlečne kisline brez kakr�nega koli ekolo�kega onesna�enja, saj po degradaciji mlečne kisline iz laktatov ostaneta le H2O in CO2, ki se vrneta v ciklus kro�enja snovi v naravi. Proces mlečno kislinskega vrenja je zelo pomemben tako za ljudi kot za �ivali, saj je osnova naravnega in spontanega konzerviranja nekaterih vrst hrane. (Johanides, 1976) 7. UPORABA MLEČNE KISLINE V PROIZVODNJI HRANE Skoraj 85 % proizvedene mlečne kisline se uporablja za �ivilsko industrijo kot konzervans in sredstvo za kisanje. Mlečna kislina, ki se uporablja v �ivilstvu mora biti najmanj 80%, brezbarvna in brez vonja. Mlečna kislina in njene soli so priznani kot varni (GRAS- Generally Recognized As Safe) aditivi, priznani od FDA (Food and Drug Administration) v ZDA.


Mlečna kislina se uporablja v mnogih �ivilih: razne brez alkoholne pijače, vina, pivo, sla�čice, mesni izdelki konzervirana zelenjava, mlečni izdelki, pekarstvo,... 7.1. Mlečna kislina v fermentiranih mlečnih izdelkih Ljudje so �e od nekdaj dodajali predhodno fermentirana �ivila surovini, ki so jo fermentirali in tako izzvali uspe�nej�o fermentacijo. Fermentacijski produkti mlečno kislinskih bakterij dajejo �ivilom prijeten okus, jim povi�ajo hranilno vrednost, inhibirajo rast patogenih organizmov in izbolj�ajo ali spremenijo teksturo. Med fermentirane mlečne izdelke uvr�čamo: jogurt, kefir, sirotko, kislo smetano, margarino, maslo,... Fermentacijsko nastala mlečna kislina ima v mleku in mlečnih izdelkih dva pomena: s svojo kislostjo preprečuje razvoj acidofobnih mikroorganizmov in povzroča koagulacijo mlečnega kazeina, ki se nahaja kot koloidna raztopina kalcijev-kazeinat-fosfat kompleks v obliki micelja. 7.2. Mlečna kislina v drugih �ivilskih proizvodih Mlečna kislina ima svojo vlogo tudi pri mesnih izdelkih: izbolj�a obstojnost klobas, �unk, salam, perutnine za 30-50%. Uravnava pH v izdelkih iz ribjega in rakovega mesa brez kak�nega večjega vpliva na okus. Zaradi prijetno kiselkastega okusa se uporablja kot aditiv pri proizvodnji pijač, esenc, sadnih sokov in sirupov, kot sredstvo za kisanje v d�emih, �elejih in sla�čicah. Prijeten okus daje tudi dresingom, majonezam in omakam, poleg tega pa deluje �e kot preservativ in uravnava pH. Za uravnavanje pH se uporablja tudi v vinarstvu in konzerviranih zelenjavah kot so kumarice, olive, čebula, korenje,.. Mlečna kislina je naravno prisotna v pivu in se tudi uporablja za uravnavanje pH na posameznih stopnjah varenja piva. Pri odpravljanju napak zaradi posledic uporabe trde vode v proizvodnji �ganih pijač, se uporablja za mehčanje vode namesto apna, ker se la�je odstrani in ne pu�ča belkaste barve. 7.3 Uporaba nekaterih mikroorganizmov v proizvodnji hrane S. thermophilus je zmo�en rasti pri povi�ani temperaturi in ga zato tudi uporabljajo za specifične starter kulture v mnogih mlečnih izdelkih kot npr. jogurt, parmezan,... L. lactis je izredno pomemben v proizvodnji fermentiranih mlečnih izdelkih. Uporablja se pri proizvodnji fermentiranega mleka, kislih krem, fermentiranega masla, nezrelih sirov (npr. skuta) in veliko različnih vrst zrelih sirov. E. durans se uporablja za izdelovanje sirov kot so mozzarella. Lc. Mesenteroides prevladujejo v mnogih fermentiranih zelenjavnih proizvodih kot so kumarice, kislo zelje, olive. Mnoge vrste Leuconostocov proizvajajo velike količine ekstracelularnih polisaharidov, ki se lahko uporabljajo kot stabilizatorji in zgo�čevalci jedi. Lc. Oenos je pomembna bakterija pri izdelavi vina, ker razgradi jabolčno kislino v mlečno in s tem zmanj�ajo kislost vina. Laktobacili pripomorejo k okusu raznih zrelih sirov, pomembni pa so tudi pri produkciji fermentirane zelenjave.


Pediokoki se uporabljajo kot starter kulture pri fermentaciji klobas. P. Damnosus so nujno potrebni pri varjenju piva, kjer se v nasprotnem primeru lahko pojavljajo napake kot so pregosto pivo in napake v okusu. (Johanides, 1976)


REFERENCE: ! Buchta, K.1983. Biotechnology, Volume 6, Products of primary metabolism, M.Roehr,

VCH Weinheim 1996, stran 299 ! Erčulj-Rogelj,K., Senčar,L., Skok,P., Skubic,M., Mikrobna sinteza lipidov,seminar,

Ljubljana, 2000 ! Gaber, M., Golob, �., Firm,A., Horvat,j., Anaerobna produkcija mlečne kisline,

seminar,Ljubljana 2000 ! Hrovatin, D. Biocidno delovanje mlečne kisline in njenih soli, 1-12 s. ! Johanides, V., Korčulanin, A., Marič, V., Divjak, S., Vla�ič, D. 1976 Industrijska

mikrobiologija, Zagreb, Tehnolo�ka fakulteta 185 s. ! Klofutar, C., �malc, A., Rudan-Tasič, D. Laboratorijske vaje iz kemije, Ljubljana 1997, ! Perdih, A. Pripravljalini procesi biotehnologij, 1996. V: Biotehnologija osnovna znanja,

Raspor P.,ur., Bia,d.o.o. Ljubljana,1996 347-361 s. ! Macrae, R./ Robinson, R.K. / Sadler, M.J. Enciclopledia of food science, food

technology and nutrition, vol.4 2651-2654 s. ! Macarol, N. Optimizacija proizvodnje mlečne kisline, Tovarna organskih kislin, Ilirska

bistrica, okrober 1980, 5-16 s. ! Prescott, S. C., Dunn C. G. Industrial microbiology, London, New York, Sydney, 1949,

404-428 s. ! Renmand, H. S., Reed, G. 1996. Biotechnology second, completely revisied edition,

volume 6, Product of primary metabolism, 298s, 303 s. ! Stryer, L., Biochemistry, Zagreb, 1995, 497s, 577s. ! Sahm. H., Biotechnology, Volume 1- Biological fundamentals, WCH Weinheim, Bonn, 1996, 330 s.

! Galactic, the lactic acid universe, CH.DE St. Job 12,BE 1180 Brussels, Belgium http://www.lactic.com/lactic acid.html,

http://www.lactic.com/lactic acid.html

proizvodnja mleČne kisline* -...

Documents