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PROTEINAS FIBROSAS
Las proteínas fibrosas se dividen en general en tres grupos,
dependiendo de la estructura secundaria de las moléculas
individuales: las a-hélices super-enrolladas, la triple hélice
del colágeno, y las hojas b en las fibras amiloides y las
sedas.
Las fibras en a-hélice de la lana son flexibles, pueden ser
estiradas hasta el doble de su longitud, y son elásticas,
retornando a su longitud inicial cuando se libera la tensión.
Las fibras del colágeno son fuertes, resistentes al
alargamiento y relativamente rígidas. Las fibras con hojas b
son fuertes y muy flexibles. Las fibras de la seda de araña
son mas resistentes que un hilo de acero de las mismas
dimensiones, pero son muy flexibles.
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a-hélices super-enrolladas
Dos o mas a-helices pueden enrollarse sobre si mismas para formar
“superhelicoides” muy estables de hasta 1000 Å de longitud. Estas
estructuras se encuentran en proteínas fibrosas como la miosina y
la tropomiosina del músculo, la fibrina de los coágulos sanguíneos
y la queratina del pelo. La interacción entre las a-hélices se hace
habitualmente por interacciones hidrofóbicas, a menudo mediadas
por Leu o Ileu.
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El colágeno es muy rico en prolina, hidroxiprolina y glicina. Uno de cada
tres residuos es Gly.
El colágeno es una molécula en forma de bastón, de hasta 3000 Å de largo
y sólo 15 Å de diámetro. Es la proteína mas abundante en los mamíferos,
siendo el componente fibroso principal de la piel, los huesos, los cartílagos
los tendones y los dientes. Está formado por una triple hélice, diferente de
la a-hélice (no se mantiene cada hebra por puentes de hidrógeno internos,
sino por la repulsión estérica de Pro y HyPro). Cada hebra de procolágeno
tiene dos “cabezas” globulares, una en cada extremo, necesaria para el
ensamblado de la fibra, que luego se elimina. Por eso al desnaturalizarlo,
no se renaturaliza, y forma gelatina.
EL COLAGENO
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LA TRIPLE
HELICE DEL
COLAGENO
En el interior de la
triple hélice no
queda espacio para
un aminoácido de
mayor tamaño que
la Gly.
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PROTEINAS DE
MEMBRANA
A diferencia de las proteínas globulares solubles, que
concentran sus residuos hidrofóbicos en su interior,
resguardándolos del agua, las proteínas integrales de
membrana tienen la mayoría de sus residuos
hidrofóbicos en su superficie, interaccionando con
los lípidos de la membrana.
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PROTEINAS DE MEMBRANA.
Proteínas integrales y Proteínas periféricas
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PROTEINAS INTRINSECAMENTE DESORDENADAS
(PROTEINAS INTRINSECAMENTE NO ESTRUCTURADAS)
• Desde comienzos del Siglo XXI se han descripto numerosasproteínas que presentan una estructura flexible o unplegamiento azaroso en la mayor parte de su extensión.
• De acuerdo al concepto clásico, estas proteínas no seríanfuncionales; sin embargo, se ha demostrado que proteínascon este tipo de plegamiento están involucradas en diferentesvías de señalización, algunas son factores transcripcionales,receptores de membrana, o bien son proteínas abundantes enalgunos tejidos de diferentes organismos.
• Los proyectos genoma de eucariotes permiten predecir quealrededor de un 30 % de las proteínas codificadas seríanproteínas parcial o totalmente desordenadas.
• Es posible que la flexibilidad estructural no se dé o se démucho menos en el ambiente intracelular, comparado con loque se observa en solución acuosa.
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• A: Ribulosa 1,5-bisfosfato carboxilasa-oxigenasa de espinaca,proteína globular
• B: Factor de inicio de la traducción (eIF1A) humano, la mayor parte decuya estructura es desordenada.
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En general estas proteínas presentan una composición de
aminoácidos particular. Son proteínas de baja complejidad que
tienen una baja abundancia o carecen de aminoácidos
hidrofóbicos y/o voluminosos (Val, Ile, Met, Phe, Trp, Tyr), que
promueven el plegamiento espontáneo de las proteínas
globulares, y poseen una alta proporción de aminoácidos
cargados o polares (Gln, Ser, Pro, Glu, Lys, Arg) y en algunos
casos tienen una alta abundancia de aminoácidos pequeños (Gly,
Ala).
Se sabe que estas proteínas tienen la capacidad de fluctuar
entre diferentes estados conformacionales en una escala de nano
a micro-segundos. Esta alta flexibilidad por unidad de tiempo les
da la habilidad de interaccionar con distintas moléculas, o de
modos diferentes con la misma molécula. Por ejemplo, las
proteínas p21 y p27 actuando sobre quinasas dependientes de
ciclinas (CDKs), pueden actuar como activadoras o inhibidoras
de las mismas.
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• A: La proteína puede unir un ligando con una conformación dada yrealizar una función específica.
• B: La misma proteína puede interaccionar con el mismo ligando (ocon otro distinto) a través de una conformación diferente, y asírealizar una función completamente distinta.
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PLEGAMIENTO DE LAS
PROTEINAS.
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LA RIBONUCLEASA: EL EXPERIMENTO DE ANFINSEN.
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REDUCCION DE LOS PUENTES DISULFURO
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La urea desnaturaliza a la ribonucleasa (es decir, deja solo su estructura
primaria) y el b-mercaptoetanol reduce los puentes disulfuro.
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Si se elimina la urea y luego se deja
que los puentes disulfuro vuelvan a
formarse por oxidacion con el aire, se
recupera la estructura nativa. Si se
oxida en presencia de urea, se obtiene
una “ribonucleasa revuelta”, inactiva,
pero esta recupera su actividad en
presencia de trazas de b-mercapto-
etanol.
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LA PARADOJA DE LEVINTHAL.
Para u n a p ro te ín a p equ eñ a, d e 1 0 0 re sid u o s d e
am in o ácid o s:
Si cad a re sid u o p u ed e asu m ir 3 p o sicio n es, e l
n ú m ero to tal d e e stru ctu ras p o sib le s será igu al a 3 1 0 0 ,
lo qu e e s igu al a 5 x 1 0 4 7
Si to m a 1 0 -1 3 seg p ara co n vertir u n a e stru ctu ra
en o tra e l tiem p o to tal requ erid o p ara e l p legam ien to
co rrecto será
5 x 1 0 4 7 x 1 0 -1 3 seg = 5 x 1 0 3 4 seg = 1 .6 x 1 0 2 7
añ o s.
(Parad o ja d e Levin th al)
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El plegamiento puede
pasar a traves de un
intermediario que ya
tiene practicamente
completa la estructura
secundaria (el globulo
fundido). Puede tener un
camino unico o tener
caminos alternativos.
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AGENTES DESNATURALIZANTES.
1) Extre m o s d e p H. Mu ch as p ro te ín as se d e sn atu ralizan a
valo re s d e p H < 5 o > 1 0 . Esto p u ed e d e be rse a la
io n izació n d e gru p o s e n e l in te rio r d e la p ro te ín a (His a
p H ácid o , Ty r a p H alcalin o ) ; a rep u lsió n e le ctro stática
e n tre gru p o s d e la su p e rficie d e la p ro te ín a; a la
d e stru cció n d e p u e n te s salin o s im p o rtan te s e n la
e stabilizació n d e la e stru ctu ra n ativa.
2) Age n te s d e sn atu ralizan te s . Lo s m ás u sad o s so n la u rea
y e l clo rh id rato d e gu an id in a:
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DESNATURALIZACION DE UNA PROTEINA.
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DICROISMO CIRCULAR DE PROTEINAS: SU USO
EN EL ESTUDIO DEL PLEGAMIENTO.
La quiralidad y la absorción de luz son las dos condiciones necesarias y
suficientes para aplicar la técnica de dicroísmo circular (CD)
Los aminoácidos, salvo la glicina, son quirales. Los aminoácidos
aromáticos, los puentes disulfuro y la unión peptídica absorben luz en el
ultravioleta.
El CD mide la diferencia de luz circularmente polarizada izquierda (LCP) y
derecha (RCP). El CD se expresa en unidades de elipticidad (deg.cm2.dmol-1)
y se utiliza un espectropolarímetro..
El CD permite medir el contenido y el tipo de estructura secundaria, en el UV
lejano (180-230 nm) donde absorbe luz la unión peptídica), y la presencia de
estructura terciaria, en el ultravioleta cercano (230-340 nm) donde absorben
luz los residuos aromáticos y los puentes disulfuro;Trp y Tyr son los que
mas contribuyen.
El CD en el UV cercano se da por el entorno asimétrico de los residuos
aromáticos cuando la proteína está plegada. La señal se pierde si se la
despliega.
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PLEGAMIENTO DE LAS PROTEÍNAS IN VITRO E IN VIVO .
In v it ro : Ple gam ien to e sp o n tán e o , a m u y bajas co n ce n tracio n e s d e
p ro te ín a p ara evitar agregad o s . Bu ffe r re d o x (GSH/ GSSG) para in d u cir
la fo rm ació n co rre cta d e p u e n te s d isu lfu ro .
In v iv o : Ple gam ien to a altas co n cen tracio n e s p ro te icas, asistid o p o r
o tras p ro te ín as.
1 ) Pu en te s d isu lfu ro : p ro te ín a d isu lfu ro iso m e rasa. Co n tie n e
se cu en cias –Cy s-Gly -His-Cy s- y ace le ra u n as 6 0 0 0 ve ce s e l in te rcam bio
d e p u e n te s d isu lfu ro .
2) Un io n e s p e p tíd icas X-Pro : Pe p tid il p ro lil iso m e rasa. En vez d e
se r to d as u n io n e s en t ran s , co m o p ara lo s d e m ás am in o ácid o s, u n 6 %
d e las co n Pro e s cis . La PPI ace le ra 3 0 0 ve ce s la iso m e rizació n cis-tran s.
3 )Preven ció n d e la fo rm ació n d e agre gad o s m o le cu lare s:
ch ape ro n as m o le cu lare s . Se un en reve rsib le m en te a zo n as d esp le gad as
d e l p o lip é p tid o n acien te , e v itan su agre gació n y facilitan su
p le gam ie n to co rre cto , co n co n su m o d e ATP.
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PURIFICACION DE LAS
PROTEINAS.
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METODOS GENERALES DE PURIFICACION DE PROTEINAS.
1)Ru p tu ra d e l m ate rial y o bte n ció n d e u n e xtracto libre d e cé lu las .
2)Pre cip itació n (sale s , p H, alta te m p e ratu ra, so lve n te s o rgán ico s) .
3)Diális is o u ltrafiltració n . Co n ce n tració n .
4)Fraccio n am ie n to cro m ato gráfico .
Prin cip io d e se p aració n Tip o d e cro m ato grafía
Fo rm a y tam añ o Filtració n p o r ge l
Carga n e ta Cro m ato grafía d e in te rcam bio ió n ico .
Pu n to iso e lé ctrico Cro m ato e n fo cad o
Hid ro fo bicid ad Cro m ato grafía d e in te racció n
h id ro fó bica
Cro m ato grafía e n fase re ve rsa
Fu n ció n bio ló gica Cro m ato grafía d e afin id ad
An tige n icid ad In m u n o ad so rció n
Co n te n id o e n carbo h id rato Cro m ato grafía co n le ctin as
in m o bilizad as
Gru p o s su lfh id rilo s libre s Cro m ato grafía co vale n te
Cap acid ad d e ligar m e tale s Cro m ato grafía d e qu e lato s
m e tálico s
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Eliminación de moléculas chicas por diálisis.
Se requiere, en general, después de una precipitación con sulfato de amonio.
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FILTRACION POR GEL
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CROMATOGRAFIA DE INTERCAMBIO IONICO.
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CROMATOGRAFÍA DE
AFINIDAD.
Se explota el hecho de que toda
proteína es capaz de
interaccionar con uno o mas
ligandos. Fijándolos a una
matriz, se puede purificar
selectivamente a la proteína en
estudio.
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Purificacion step TotalProtein
Total
activity
Spec ific
Activity
Purification
factor
Yield
Cell-free extract
ConA-Sepharo se
Mono Q
Mono P
mg
227.5
5.6
0.67
0.36
unitsa
56.00
43.75
25.95
14.70
unitsa/mg
0.246
7.81
38.73
40.83
Fold
1
31.75
157 .44
165 .97
%
100
78.1
46.34
26.25
Tabla de purificacion y determinacion de
homogeneidad proteica.