pruebas treponémicas y no treponémicas
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UADY FACULTAD
DE QUÍMICA Campus de Ciencias
De la Salud
UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE YUCATÁN
FACULTAD DE QUÍMICA
CURSO DE VERANO 2013
BACTERIOLOGÍA
Pruebas treponémicas y no treponémicas
Elaborado por
DAVID POOT PECH
Docente
M. en C. Claribel Huchin Chan
FECHA DE ENTREGA
MÉRIDA, YUCATÁN A VIERNES 21 DE JUNIO DE 2013
2
1. Pruebas serológicas
La sífilis se diagnostica en la mayor parte de los pacientes mediante las pruebas
serológicas. Se utilizan dos tipos generales de pruebas, las pruebas
biológicamente inespecíficas (no treponémicas) y las pruebas treponémicas
específicas.1
Las pruebas no treponémicas se emplean para la detección selectiva porque se
realizan con rapidez y son poco costosas. La positividad de una de estas pruebas
se confirma con una prueba treponémica.1
Estos grupos son complementarios, no mutuamente excluyentes. Las pruebas no
treponémicas son muy útiles como estudios de cribado. Las pruebas treponémicas
deben reservarse como estudios confirmatorios cuando una prueba no
treponémica es positiva o cuando la sospecha clínica de sífilis es alta, a pesar de
que una prueba no treponémica sea no reactiva.2
2. Pruebas serológicas inespecíficas con antígeno de cardiolipina
Las pruebas no treponémicas determinan los anticuerpos de IgG e IgM
(anticuerpos reagínicos) desarrollados frente a los lípidos que se liberan de las
células dañadas durante la fase precoz de la enfermedad. El antígeno que se usa
para las pruebas no treponémicas es la cardiolipina, la cual se obtiene del
corazón de las vacas. Las pruebas que se usan con frecuencia son la prueba
Venereal Disease Research Laboratory (VDRL) y la prueba de rapid plasmid
reagin (RPR).1
Ambas pruebas consiste en una reacción entre un antígeno de lecitina, colesterol
y cardiolipina purificada que se mezcla con el suero y/o diluciones del mismo. La
presencia de anticuerpos antirreaginas produce una aglutinación de partículas,
esta deben observarse al microscopio.3 Ambas pruebas se pueden efectuar de
forma rápida, aunque se debe inactivar el complemento en el suero 30 minutos
antes de que se pueda realizar la prueba del VDRL, esta prueba solo puede
utilizarse para analizar el líquido cefalorraquídeo de los pacientes con sospecha
de neurosífilis. Otras pruebas no treponémicas utilizan la reagina sérica no
3
calentada (USR) y la prueba de suero no calentada con rojo de toluidina
(TRUST).1
2.1. VDRL (Venereal Disease Research Laboratory)
2.1.1. Fudamento
Es una reacción de floculación, donde el antígeno utilizado está compuesto por
colesterol, lecitina y cardiolipina. Esta prueba no treponémica mide anticuerpos
antilipídicos; IgG e IgM, los cuales son formados por el huésped en respuesta al
material lipídico liberado de las células huésped dañadas en la infección por TP y
material lipídico de la superficie celular treponémica. Tiene gran sensibilidad y baja
especificidad, utiliza controles para su sofisticación (véase Cuadro 1).4
2.1.2. Metodología para VDRL5
a) Reacción cualitativa (detección).
1. Obtener suero o plasma para utilizarse fresco o descomplementado.
2. Dejar que el látex VDRL alcance la temperatura ambiente.
3. Agitar frasco antes de su empleo y durante el reparto utilizar el
cuentagotas para repartir el látex retirarlo del frasco y tapar.
4. En la repartición dejar caer la gota en forma vertical.
5. Agitar seis minutos en el agitador.
6. Leer inmediatamente al microscopio.5
Cuadro 1. Controles para la prueba cualitativa VDRL.
Reacción cualitativa (detección )
Pozuelo No. 1 Pozuelo No. 2 Pozuelo No. 3
Depositar en una placa de Kline
Testigo antígeno Control positivo titulado
3 a 24 sueros o plasmas pacientes
Suero o plasma - - 30 µL Control positivo suero - 30 µL - Suero fisiológico 30 µL - Látex VDRL (con contador de gotas calibrado)
1 gota 1 gota 1 gota
b) Reacción cuantitativa preparar varias disoluciones con el suero de control
positivo titulado o los sueros de pacientes, con solución salina isotónica (de
1:2 hasta 1:128). Realizar la reacción con cada una de estas disoluciones
(como en la reacción cualitativa).5
4
2.1.3. Interpretación de resultados
La formación de cúmulos de las partículas de látex (en masas véase Figura 1) se
considera una reacción positiva, reportándose como Reactiva. Es una prueba
negativa o no reactiva, si se observan las partículas de látex repartidas
uniformemente.5
Figura 1. Prueba VDRL: las reacciones en esta prueba se evalúan microscópicamente. (A) Suero
no reactivo. Las partículas de antígeno VDRL se encuentran dispersas de forma uniforme, sin
agruparse. (B) Suero reactivo: las partículas de antígeno VDRL están fuertemente aglutinadas por
este suero sifilítico. Las partículas aisladas se agrupan en cúmulos y grandes grumos. 100 x.2
2.2. RPR (Prueba rápida de reagina plasmática)
2.2.1. Fundamento
Es una suspension estabilizada que contiene cardiolipina, lecitina y colesterol. a la
cual se le ha adicionado particulas de carbon.6
La prueba RPR es rápido, barato, y fácil de usar. Es excepcionalmente útil en la
detección. Al igual que su contraparte no treponémico mayor, la VDRL, que puede
ser cuantificada. Estas pruebas son muy sensibles, es decir, hay pocos falsos
negativos, excepto como se discute a continuación.7
2.2.2. Equipos, materiales y reactivos
Aguja calibre 20 descartable, sin bisel, tratada con silíconas, frasco de plástico
para distribuir antígeno. De 3,89 g, tarjetas RPR recubiertas de plástico con diez
círculos, de aproximadamente 18 mm de diámetro cada uno, dispositivos plásticos
desechables (Dispenstir®). para distribución-agitación, que libera 50 µL.2
5
Placa rotatoria mecánica, de velocidad tija o regulable a 100 ± 2 rpm, que
describa un círculo de 1,8 cm de diámetro en el plano horizontal.
Cubierta humectante para la placa rotatoria.
Lámpara incandescente de alta intensidad.
Dispositivo de seguridad para pipetear, con puntas descartables de 50 µL.
Recipientes para residuos y desinfectantes.
Guantes de látex desechables. anteojos de seguridad y ropa protectora.
Suspensión de antígeno RPR (una variante del antígeno para VDRL):
combinación estabilizada de cardiolipina al 0,003%, lecitina al 0,020-0,022%,
colesterol al 0,09%. cloruro de colina al 10%, EDTA 0.0125M, carbón al
0,1875%, Na2HP04 0,1 M,2
KH,P04 0,01 M, timerosal al 0,1% y agua destilada.
Muestras de suero control: sueros liofilizados sobre una tarjeta reactivo (R), de
reacción mínima (MR) y no reactivo (N).
Solución fisiológica al 0.9% como diluyente.
2.2.3. Métodos para la detención de RPR
2.2.3.1. Método cualitativo
1. Perforar el inserto del frasco y colocar la aguja calibrada.5
2. Mezclar perfectamente el frasco del antígeno por agitación ligera antes de
cada determinación.
3. Con el tubo gotero colocar en un círculo de la tarjeta una gota del suero o
plasma del paciente, extendiendo la gota en el área de reacción, con la
parte posterior del tubo gotero o de polietileno.
4. Con el frasco gotero en posición vertical y con la aguja hacia abajo agregar
una gota de antígeno a la gota colocada en el paso 3.
No mezclar las dos gotas5
5. Mantener la tarjeta en rotación por 8 minutos a 100 rpm.
6. Al término de la rotación interpretar los resultados en un periodo de 1
minuto.5
2.2.3.2. Interpretación de resultados
Reactivo: aparición de partículas de carbón aglutinado.
6
No reactivo: presencia de una suspensión homogénea de color gris, en ocasiones
aparece el botón central, o algunas partículas de carbón migran al borde del
círculo, permaneciendo la suspensión homogénea en ambos casos el resultado se
reporta como negativo o no reactivo.5
2.2.3.3. Método cuantitativo
Pruebas cuantitativas RPR se reportan como "no reactivo" o "reactivo" en
diluciones de 1:01, 1:02, 1:04, 1:08, 1:16, 1:32, 1:64, etc Si bien gran confianza
puede ser colocado en las pruebas RPR o VDRL, recuerde que los pacientes con
sífilis primaria activa infecciosa con frecuencia tienen VDRL no reactivo y las
pruebas de RPR (véase Figura 2).7
Figura 2. Reacciones de RPR pruebas cualitativas y cuantitativas.
2.3. Reacción en suero no calentado. USR (Unheated Serum Reagin)
2.3.1. Principios de la prueba
La USR es una prueba microscópica, no-treponémica y de floculación en placa.
El antígeno de USR detectara anticuerpos (reaginas) antilipoidales en muestras
de suero de personas con otras condiciones agudas y crónicas.
7
La prueba de microfloculación USR usa una suspensión de antígeno de VDRL
modificado que contiene cloruro de colina, la cual incrementa la reactividad del
anticuerpo en suero no calentado. Semejante a la VDRL, la prueba se lee
microscópicamente y es rápido y fácil de hacer. Sin embargo, a diferencia de la
VDRL, la suspensión antigénica de la USR no debe ser preparada o descartada
diariamente.4
2.3.2. Materiales
2.3.2.1. Reactivos
1. Suspensión antigénica USR. Una combinación estabilizada de cardiolipina,
colesterol y lecitina en una solución resuspendida de EDTA, cloruro de
colina, fosfato y timerosal. La suspensión antigénica se guarda a 2 – 8 °C.
Suspensiones no abiertas son estables al menos por 1 año desde la fecha
de manufactura o hasta la fecha de expiración.2
2. Alcohol, Etanol 95%
3. Acetona 2
2.3.2.2. Preparados
1. Muestras de suero control. Reactivo (R), débil reactivo (D) y no reactivo
(NR).
2. Solución salina 0,9%. Agregar 0,9 g de cloruro de sodio seco (ACS) a 100
ml de agua destilada.
2.3.4. Procedimientos
2.3.4.1. Prueba Cualitativa
1. Las pruebas de floculación en placa para sífilis, son afectadas por la
temperatura. Para obtener resultados confiables y reproducibles, la
suspensión antigénica de USR, los controles y la muestra a analizar deben
estar a temperatura ambiente (23 – 29 °C) cuando se realiza la prueba.2
2. Colocar con una pipeta automática 50 µl de suero no calentado en un anillo
de parafina o cerámica de la placa. No usar placas de vidrio con
concavidades, pocillos o anillos de vidrio.
8
3. Resuspender suavemente la suspensión de antígeno de USR.
4. Sostener la aguja dispensadora de la suspensión antigénica y la jeringa en
posición vertical, dispensar varias gotas para eliminar el aire de la aguja;
luego agregar exactamente 1 gota (22 µl) de suspensión antigénica a cada
círculo conteniendo suero.
5. Colocar la placa sobre el rotador mecánico. Rotar la placa por 4 minutos a
180 ± 2 rpm. Cuando se realiza la prueba en un clima seco, cubrir las
placas con un cobertor humidificante durante la rotación para prevenir la
evaporación excesiva.
6. Inmediatamente después de la rotación, sacar la placa del rotador y leer los
resultados.
7. Realizar la prueba cuantitativa en todas las muestra de suero que
produzcan un resultado reactivo, débil reactivo o no reactivo rugoso en la
prueba cualitativa.2
2.3.4.1.1. Lectura e informe de los resultados cualitativos
Leer las reacciones usando un microscopio equipado con ocular de 10X y
objetivo de 10X.
Informar los resultados de la siguiente manera (véase cuadro 2):2
Cuadro 2. Interpretación de resultados pruebas USR
Lectura Informe
Grumos grandes o medianos Reactivo (R) Grumos pequeños Débil reactivo (D) Sin grumos o muy ligera rugosidad No reactivo (NR)
2.3.4.2. Prueba Cuantitativa
Diluir hasta un título de punto final todas las muestras que produzcan resultados
reactivo, débil reactivo o no reactivo rugoso en la prueba cualitativa. Analizar la
muestra de suero no diluida y diluida 1:2, 1:4 y 1:8. Se pueden realizar en una sola
placa las pruebas cuantitativas hasta diluciones 1:8 de tres muestras de suero
(véase Figura 3 y Cuadro 3 para la interpretación del resultado).4, 6
9
Figura 3. Prueba cuantitativa parea USR
Cuadro 3. Informe de los resultados cuantitativos en suero 4,6
Suero no diluido
(1:1)
Resultado en diluciones del suero Inforeme
1:2 1:4 1:8 1:16 1:32
R D N N N N Reactivo, no diluido (1 dil)
R R D N N N Reactivo, 2 dils
R R R D N N Reactivo, 4 dils
D D R R D N Reactivo, 8 dils
N (rugoso) D R R R N Reactivo, 16 dils
D N N N N N Débil Reactivo, 1 dil
A continuación se reporta en el Cuadro 4, la sensibilidad de las pruebas no
treponémicas en los diferentes estadios de la enfermedad de sífilis.
Cuadro 4. Sensibilidad y Especificidad de las Pruebas No-Treponémicas
Prueba
Sensibilidad (%) por estadio de sífilis no tratada (rango) Especificidad
No-sífilis %
(rango) Primaria Secundaria Latente Tardía
VDRL 78 (74-87)
100
96 (88-100) 71 (34-94) 98 (96-99)
RPR 86 (77-99) 98 (95-100) 73 98 (93-99)
USR 80 (72-88) 95 (88-100) - 99
TRUST 85 (77-86) 98 (95-100) - 99 98-99)
3. Pruebas serológicas específicas con antígeno treponémico
3.1. Prueba de absorción de anticuerpos treponémicos fluorescentes
(FTA-ABS)
10
La prueba treponémica más empleada era la prueba de absorción de anticuerpos
treponémicos fluorescentes (FTA-ABS) la cual es una prueba de anticuerpos
fluorescentes indirectos. Las células de T. pallidum inmovilizadas en el
portaobjetos se utilizan como antígeno. El portaobjetos se recubre de suero del
paciente, que se ha mezclado con un extracto de treponemas no patógeno. A
continuación se añaden antibióticos antihumanos marcados con fluoresceína con
el propósito de detectar la presencia de anticuerpos específicos en dicho suero.1
3.1.1. Materiales y equipo
Estufa de incubación de 35 a 37 °C, baño de agua regulable a 56 °C, dispositivo
de seguridad para pipetas. micropipeteadores graduables de 10 a 200 µL, Ansa
bacteriológica estándar de platino de 2 mm calibre 26, papel absorbente, soporte
para portaobjetos con cámara húmeda y toallas de papel, placas de coloración, de
vidrio o plástico, con soporte para portaobjetos desmontable, portaobjetos de 2,5 x
7,5 cm, con un extremo mate, de 1 mm de espesor, con dos círculos grabados, de
1 cm de diámetro interno, cubreobjetos, tubos de ensayo (12 x 75 mm) y gradillas,
recipientes para descartar el material y desinfectantes, guantes de látex
descartables, anteojos de seguridad y ropa protectora, microscopio de
fluorescencia equipado para microscopia con fluoresceína, agitadora B.2
3.1.2. Reactivos Comerciales
Antígeno de T. pallidum: una suspensión de T. pallidum (cepa Nichols)
obtenida en tejido testicular de conejo y lavada con solución salina
tamponada. para eliminar las globulinas de conejo.2
Suero anti-IgG humana marcado con FITC.2
Absorbente: preparado de cultivos de treponemas de Reiter no patógenos,
habitualmente sin el agregado de conservantes. A menudo se venden
fraccionados en cantidades de 5 mL y liofilizados, aunque también se
venden en estado líquido.
11
Suero control reactivo: una mezcla de muestras de suero humano
obtenidas de dadores sifilíticos que son reactivos 4+. Se utilizan para
preparar sueros control 4+ y controles mínimamente reactivos 1+. El control
1+ muestra el grado mínimo de fluorescencia informado como reactivo y se
utiliza como estándar de lectura.
Suero control inespecífico: una mezcla de sueros obtenida de individuos no
sifilíticos. Sin agregado de conservantes. Este control muestra una
reactividad inespecífica > 2+ en una dilución 1:5 en buffer de fosfatos (PBS)
y casi no se tiñe cuando se diluye 1:5 en absorbente.
Aceite: aceite de inmersión de baja fluorescencia, no secante, tipo A,
Cargille 1248.
Acetona: reactivo grado ACS.2
3.1.3. Reactivos preparados
PBS, pH 7,2.2
Tween 80 (polisorbato 80) al 2% en PBS. Calentar los reactivos en baño
María a 56 °C. Agregar a 49 mL de PBS esteril 1 mL de Tween 80, medido
desde el extremo de una pipeta, lavando la pipeta con la mezcla. Controlar
el pH y llevarlo a 7,2 con NaOH 1 N. Desechar si se forma un precipitado o
el pH cambia.
Medio de montaje: agregar una parte de PBS a 9 partes de glicerina
(reactivo proanálisis).
Agua destilada.
3.2. Preparación de los reactivos de la prueba
3.2.1. Antígeno de T. pallidum
Rehidratar el antígeno de acuerdo con las instrucciones del fabricante.2
Los frascos ampolla abiertos, conservados a 2 a 8 °C, son estables durante
una semana.2
Para preparar los portaobjetos, mezclar completamente la suspensión del
antígeno en una agitadora durante 10 segundos. Determinar por
microscopia de fondo oscuro que los treponemas estén adecuadamente
dispersos antes de realizar los frotis para la prueba FTA-ABS.
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Limpiar los portaobjetos con una gasa limpia para eliminar las panículas de
polvo. Limpiar los portaobjetos por vibración sónica o frotándolos con
alcohol si los treponemas no se ven con claridad después de la coloración.
Preparar frotis muy delgados de T. pallidum dentro de cada circulo
mediante un ansa de alambre de 2 mm. Colocar el antígeno contenido en
un ansa dentro de dos círculos de 1 cm. Dejar secar al aire al menos
durante 15 minutos.
Fijar los portaobjetos en acetona durante 10 minutos y secar al aire. No fijar
más de 60 portaobjetos con 200 mL de acetona.
Conservar los frotis fijados con acetona a - 20 °C. No descongelar y
congelar nuevamente los frotis.
Conservar los frascos ampolla de antígeno no abiertos a 2 a 8 °C. El
antígeno no abierto es estable hasta la fecha de vencimiento.2
3.2.2. Titulación de la anti-IgG humana
Rehidratar el conjugado de acuerdo con las instrucciones. Si esta turbio,
centrifugarlo a 500 g durante 10 minutos. Fraccionar en alícuotas pequeñas
y conservar a -2 0 °C. No congelar nuevamente el conjugado
descongelado; conservarlo a 2 a 8°C.2
Preparar diluciones 4+ y 1+ del suero reactivo de control, para determinar la
dilución de trabajo del conjugado.
Correr el patrón control con una referencia o un conjugado conocido.2
3.3. TINCION INESPECIFICA SUERO REACTIVO 4+ y 1+
3.3.1. Adsorbente
Rehidratar el material liofilizado con agua destilada esteril o de acuerdo con
las instrucciones del fabricante. El absorbente rehidratado puede
conservarse a 2 a 8 ºC o a -2 0 ºC. Puede utilizarse todo el tiempo que se
desee mientras la reactividad obtenida sea aceptable y el producto no este
contaminado.2
3.3.2. Suero problema
13
Seguir las medidas de seguridad recomendadas para la manipulacion de
sueros humanos.2
Calentar el suero problema y el suero control a 56 °C durante 30 minutos,
antes de realizar la prueba.
El día de la prueba recalentar el suero problema durante 10 minutos a 56
°C.2
3.3.3. Suero control
Rehidratar el suero de acuerdo con las instrucciones del fabricante.2
Fraccionar en alícuotas de 0,25 mL y conservar a -2 0 °C durante todo el
tiempo en que la reactividad sea aceptable.
Preparar los siguientes controles para cada determinación:
o Suero control reactivo (R) 4+: un suero sifilítico que muestre
fluorescencia 4+ en una prueba sin absorción y fluorescencia solo
levemente reducida en la prueba absorbida. Para producir suero no
absorbido, agregar 50 µL de suero control reactivo a un tubo que
contenga 200 µL de PBS y mezclar bien. Para producir suero
absorbido, transferir 50 µL del suero control reactivo a un tubo con
200 µL de absorbente y mezclar bien.
o Suero control mínimamente reactivo (MR). Es una dilución en PBS
del suero control reactivo, que del mínimo grado de fluorescencia
(1+) considerada reactiva.
o Suero control inespecífico (NS): un suero no sifilítico que muestre
fluorescencia >2+ en la prueba no absorbida. Para producir el suero
no absorbido, transferir 50 µL del suero control inespecífico a un tubo
que contenga 200 µL de PBS y mezclar bien. Para producir el suero
absorbido, transferir 50 µL del suero control inespecífico a un tubo
con 200 |iL de absorbente y mezclar bien.
o Los controles para tinción inespecífica de los conjugados consisten
en un frotis de antígeno cubierto con 30 µL de PBS en lugar de suero
y un frotis de antígeno cubierto con 30 µL de absorbente en lugar de
suero.2
14
3.4. Prueba FTA-ABS
Identificar los portaobjetos preparados antes con antígeno numerándolos en
el extremo mate.2
Numerar cada tubo y portaobjetos para que se correspondan con el suero
problema y el suero control por utilizar.
Preparar diluciones del suero control reactivo (4+), mínimamente reactivo
(1+) y control inespecífico en absorbente o PBS de acuerdo con las
instrucciones.
Pipetear 200 µL de absorbente en un tubo de ensayo para cada suero
problema.
Agregar 50 µL de suero problema calentado al tubo correspondiente y
mezclar ocho veces.
Cubrir los frotis de antígeno que corresponda con 30 µL de las diluciones
suero control reactivo (4+), mínimamente reactivo (1+) y control
inespecífico.
Cubrir los frotis de antígeno que corresponda con 30 µL de PBS y 30 µL. de
absorbente para los controles a y b de tinción inespecífica. Los controles
deben mostrar el siguiente patrón:
Cubrir los frotis de antígeno que correspondan con 30 µL de las diluciones
del suero problema.
Evitar la evaporación colocando los portaobjetos en cámara húmeda e
incubar a 35 a 37 °C durante 30 minutos.
Al finalizar la incubación realizar los siguientes lavados:2
o Colocar los portaobjetos en los soportes para tinción y lavar 5
segundos con PBS corriente.
o Colocar durante 5 minutos los portaobjetos en cubetas de coloración
que contengan PBS.
o Agitar los portaobjetos sumergiéndolos y retirándolos del PBS al
menos 30 veces.
o Repetir los dos pasos anteriores con PBS nuevo.
15
o Lavar los portaobjetos durante 5 segundos con agua destilada
corriente y secar en forma suave con papel absorbente.
Diluir la anti-IgG humana marcada con FITC hasta su título de trabajo en
PBS con 2% de Tween 80 y colocar aproximadamente 30 µL de conjugado
diluido sobre cada frotis.
Repetir la incubación y los lavados de los portaobjetos.
Montar los portaobjetos de inmediato, colocando una pequeña gota de
medio de montaje y un cubreobjetos sobre cada frotis.
Colocar los portaobjetos en una habitación oscura y leer antes de
transcurridas 4 horas.
Controlar los frotis por microscopia de fondo oscuro, utilizando primero la
lámpara de tungsteno, para verificar la presencia de treponemas en el frotis,
luego leer la fluorescencia FITC (prueba).
Utilizando el portaobjetos de control mínimamente reactivo (1+) como
estándar de lectura, registrar la intensidad de fluorescencia de los
treponemas:
Informar los resultados de la siguiente forma (véase Cuadro 5 y Figura 4):2
Cuadro 5. Sistema de informe para la prueba FTA-ABS
Lectura inicial de la prueba Lectura de repetición Informe
4+ Reactivo 3+ Reactivo 2+ Reactivo 1+ Reactivo 1+ ˃1+ Mínimamente reactivo* 1+ 1+ No reactivo ˂1+ ˂1+ No reactivo N No reactivo Fluorescencia en rosario Fluorcencia atípica observada**
*En ausencia de signos de infección treponémica, este resultado de la prueba debe considerarse dudoso. Debe obtenerse una segunda muestra 1 a 2 semanas después de la muestra inicial y enviarla al laboratorio para realizar pruebas serológicas. **La fluorescencia en rosario ha sido observada en pacientes con lupus eritematoso sistémico activo o con otras enfermedades autoinmunitarias.
16
Figura 4. Treponema pallidum. Este control de la prueba FTA-ABS muestra tinción 4+ de las
espiroquetas. Se observan la forma helicoidal y las espirales firmemente enrolladas en algunas de
las celulas bacterianas. Esta microfotografía es una preparación con inmunofluorescencia indirecta
de T. pallidum que utiliza antiglobulina humana conjugada con fluoresceína (aumento original.
600x).2
4. Otras pruebas treponémicas
Otra de estas pruebas es la Treponema pallidum haemaglutination assay (TPHA)
la cual consiste en un test de aglutinación indirecto para la determinación de
anticuerpos T. pallidum en el suero/plasma humano. Una prueba de estas es la
TPI (Treponema pallidum immobilizatiton) sin embargo, esta prueba ya es
obsoleta debido a su baja sensibilidad en la sífilis primaria. 2
La Reacción de inmovilización del T. pallidum (TPI o prueba de Nelson): esta es
una prueba costosa, de ejecución muy delicada, que ya ha sido prácticamente
sustituida por la FTA-ABS, a pesar de ser la más específica. Se ha considerado
prueba de referencia en casos dudosos y consiste en la demostración de la
inmovilización de T. pallidum vivos móviles por los anticuerpos específicos en el
suero del paciente, después de la segunda semana de la infección. Se mezclan
diluciones del suero del paciente con complemento y T. pallidum vivos y
activamente móviles, extraídos de chancros testiculares de conejo. La reacción se
lee en el microscopio de campo oscuro y se considera positiva cuando se produce
la inmovilización de más del 50 % de los treponemas presentes. En suero normal,
el movimiento activo continúa. Esta prueba es difícil de realizar, requiere
treponemas vivos y en la actualidad rara vez se practica.8
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Reacción de hemaglutinación pasiva (HAP) (TPHA) y microhemaglutinación
Treponema pallidum (MHA-TP): estas pruebas son de reciente introducción; la
MHATP se ha utilizado para la determinación de anticuerpos específicos
antitreponémicos. Se basa en la sensibilización de hematíes formalinizados de
pavo o de carnero, con un lisado de T. pallidum. La adición de un suero positivo
provoca la aglutinación de los hematíes. Es una prueba muy sensible, pero menos
específica que la FTA-ABS, es muy simple y de bajo costo, por lo que su uso se
está generalizando. Esta prueba se hace positiva un poco más tarde, en la
evaluación de la infección; es confirmatoria para el diagnóstico de la sífilis, con la
excepción de la fase primaria de la enfermedad. Se han empleado ensayos que
usan la reacción en cadena de polimerasa (PCR) para la demostración del ADN
de T. pallidum en muestras clínicas, pero el papel del PCR en laboratorio clínico
necesita aún ser determinado.8
4.1. Prueba rápida para determinación de sífilis en sangre total
Las pruebas rápidas para la determinación de sífilis son un ensayo
inmunocromatográfico en fase sólida para detección cualitativa de anticuerpos tipo
IgG, IgM e IgA contra Treponema pallidum.4
Los tipos de muestra con que se ha estandarizado este método son sangre, suero
y plasma, otros fluidos no son recomendados para realizar esta prueba.
Las muestras que son obtenidas prematuramente durante el periodo de infección,
pueden tener niveles no detectables de anticuerpos. Si se obtiene un resultado
negativo y la clínica del paciente es sospechosa, se debe repetir la prueba
después de un tiempo según criterio médico.4
4.1.1. Procedimiento
Rotular el dispositivo de prueba rápida con el nombre o número del
paciente.4
Limpiar la zona de punción con algodón impregnado en alcohol, secar con
un algodón seco y limpio.
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Presionar el dedo seleccionado para hacer llenado capilar.
Puncionar con la lanceta la parte lateral de la yema del dedo.
Con la pipeta plástica o tubo capilar tomar la cantidad de sangre necesaria
para la prueba.
Adicionar la cantidad requerida de sangre según la técnica utilizada dentro
del pozo de muestra.
Agregar las gotas necesarias de diluyente (de acuerdo a la técnica
utilizada) dentro del pozo de muestra .En este paso se debe esperar a que
se absorba cada gota de diluyente antes de agregar la siguiente.
Interpretar la prueba dentro del tiempo señalado en la técnica.4
4.1.2. INTERPRETACIÓN
• En la ventana de resultados aparecerá una banda de color en la línea de
control señalada con la letra C, lo que indica que la prueba está
funcionando adecuadamente.
• En la ventana de resultados, en la línea señalada con la letra T aparece el
resultado del paciente:
Negativo: Solamente aparece la banda de color en el control C.4
Positivo: Aparecen dos bandas de color, la banda control C y la banda test T.4
Inválido: Cuando no aparece ninguna banda de color en la línea de control C, se
debe repetir la prueba con un dispositivo de prueba nuevo.
A continuación en el Cuadro 6, se resumen las diferencias de las pruebas de
serología treponémicas y no treponémicas.
Cuadro 6. Diferencias entre las pruebas treponémicas y no treponémicas.6
Pruebas no treponémicas Pruebas treponémicas
Características VDRL (Venereal Disease Research Laboratories).
RPR (rapid plasma reagin).
USR (Unheated serum reagin).
TRUST (Toluidine red unheated serum test).
TP-PA (Treponema pallidum particle agglutination)
MHA-TP (microhaemagglutination assay for antibodies to Treponema pallidum).
FTA-ABS (fluorescent treponemal antibody absorption)
EIA (Nontreponemal enzyme immunoassays).
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MHA-TP (microhaemagglutination assay for antibodies to Treponema pallidum).
Pruebas rapidas Ventajas Ampliamente difundidas y
disponibles.
Permiten seguimiento al poderse valorar la respuesta al tratamiento y diagnosticar infecciones recurrentes de sífilis.
No sirven para seguimiento.
Algunas requieren instrumental y personal calificado.
Las pruebas treponémicas suelen permanecer positivas para toda la vida, por lo que no permiten distinguir entre sífilis activa y pasada.
La cuantificación de las pruebas Treponémicas no es fiable.
Desventajas Baja especificidad.
Subjetividad.
Permanece positiva de por
vida. Costos Bajos Altos
Complejidad Baja Variables
5. Listado de referencias
1- Murray, P.; Rosenthal, K.; Pfaller, M. Micribiología médica. 6ª Edición. Editorial
Elsevier, Barcelona, 2009, pp 409
2- Winn, W.; Allen, S.; Janda, W.; Koneman, E.; Procop, G.; Schrekenberger, P.;
Woods, G. Koneman diagnóstico microbiológico: texto y atlas en color. 6ª
edición, Ed. Médica Panamericana, Buenos Aires, 2008, pp 1082; 1461-5.
3- Basualdo J. Torres R. Microbiología Biomédica. Editorial Atlante S.R.L.
Buenos Aires, 2006, pp. 491.
4- Malbrán, C.G. Manual de técnicas y procedimiento para el diagnóstico de
sífilis. Centro Nacional de Referencia en Enfermedades de Transmisión
Sexual. INEI-ANLIS, Argentina, 2010; pp 1-37.
5- Garibay, A. Manual de prácticas de Inmunología. Editorial UniSon, Hermosillo,
Sonora, 2006; pp 75-82
6- xx. Trejos, S.; Zambrano, J. Manual para el diagnóstico de sífilis. Instituto
nacional de salud. 2011. pp. 5, 23.
7- Texas department of state health service. Interpretation of Serological Tests for
Syphilis. HIV-STD testing locations in Texas FACTS, 2005, 1-4.
20
8- Llop, A.; Valdés-Depena, M.; Zuazo, J. Microbiología y parasitología médicas.
Tomo 1, CIP editorial Ciencias Médicas, La Habana, 2001, pp 394, 395.