Tartu Ülikool Bioloogia-Geograafia teaduskond Botaanika ja ökoloogia instituut

Bakalaureusetöö

Prymnesium parvum (Prymnesiophyceae) adaptatsioon auto-toksiinidega

Olga Veressova

Juhendaja: vanemteadur Kalle Olli

Tartu 2006

Sisukord

1. Sissejuhatus...................................................................................................................3 2. Kahjulikud vetikaõitsengud ..........................................................................................4

2.1. Vetikaõitsengute mõjud ökosüsteemile ja inimesele .............................................4 2.1.1. HAB liikide mõju teistele vetikaliikidele........................................................5

2.2. Vetikaõitsenguid mõjutavad looduslikud ja antropogeensed faktorid ...................6 3. Haptofüüdid ..................................................................................................................8

3.1. HAB liigid haptofüütide hulgas .............................................................................9 3.1.1. Emiliania ning tema õitsengud........................................................................9 3.1.2. Phaeocystis ning tema õitsengud ...................................................................9 3.1.3. Chrysochromulina ning tema õitsengud .......................................................10 3.1.4. Prymnesium ning tema õitsengud .................................................................10

4. Prymnesium parvum ...................................................................................................11 4.1. Prymnesium toksiinid ja toksilisus.......................................................................12 4.2. Toksilisuse eelised ...............................................................................................13 4.3. Auto-toksilisus .....................................................................................................14

5. Töö eesmärk................................................................................................................15 6. Materjalid ja metoodika ..............................................................................................17 7. Tulemused................................................................................................................... 19 8.Arutelu .........................................................................................................................22 Kokkuvõte.......................................................................................................................24 Summary .........................................................................................................................25 Tänuavaldused ................................................................................................................26 Kasutatud kirjandus.........................................................................................................27

2

1. Sissejuhatus Viimastel aastakümnetel on üheks akuutsemaks keskkonnaprobleemiks kujunenud

kahjulikud vetikaõitsengud1, mis põhjustavad kalade, veeimetajate, veelindude ning

teiste veeorganismide suremist, muudavad ökosüsteemide struktuuri ja

funktsioneerimist, ohustavad inimese tervist ning toovad majanduslikku kahju kalandus-

ning turismiettevõtetele. Mitukümmend aastat tagasi olid HAB-idest mõjutatud vaid

mõned rannikualad, nüüd aga ohustavad kahjulikud õitsengud enamikke rannikuriike

(Glibert et al. 2003), ning nende uurimiseks on käivitatud mitmed rahvusvahelised

programmid.

Üheks oluliseks HAB liigiks on haptofüütide (Prymnesiophyceae, sün.

Haptophyceae) klassi kuuluv toksiline vetikas Prymnesium parvum, mis põhjustab

massilisi õitsenguid eri maailmamere osades. P. parvum toksiinid avaldavad kahjulikku

mõju mitte ainult kaladele ja teistele veeloomadele, vaid ka erinevatele fütoplanktoni

liikidele. Võimalik, et teistele fütoplanktoni liikidele hukatuslike eksotoksiinide

eritamine keskkonda (allelopaatia) on osa P. parvum elustrateegiast, mis võimaldab

liigil edukalt konkureerida teiste fütoplankteritega nappide toitainete tingimustes. Kuid

toksiine tootvatel liikidel on alati oht kahjustada oma enda elulisi funktsioone, mida

nimetatakse auto-toksilisuseks. Kuna P. parvum kontsentratsioon võib õitsengu ajal olla

küllaltki suur, on alust oletada, et rakud suudavad ennast mingil viisil kaitsta iseenda

toksiinide eest, et on olemas teatud immuunsusmehhanism(id) omaenda eksotoksiinide

vastu. Töö praktilises osas tehtud eksperimendi eesmärgiks oligi uurida Prymnesium

parvum rakkude adaptatsiooni rakkude endi poolt kasvukeskkonda eritatud toksiinidega.

1 ingl. k. HAB – Harmful Algal Blooms

3

2. Kahjulikud vetikaõitsengud

Vetikaõitsengud kujutavad endast fütoplanktoni biomassi akumulatsiooni veekogus,

mis toimub juhul, kui vetikate kasvukiirus ületab kadusid (sh. rakkude lüüsumine,

herbivoorsed kaod). Mõnedel juhtudel võivad õitsengud avaldada kahjulikku mõju nii

ökosüsteemile, kui ka inimestele, põhjustades kalade ja teiste veeorganismide suremist,

olulist rahalist kahju kalandusele ja turismimajandusele, ning teisi otseseid ja kaudseid

negatiivseid tagajärgi. Kuigi erinevate vetikaliikide põhjustatud õitsengute ilmingud ja

tagajärjed on väga erinevad, nimetatakse kõiki selliseid nähtusi üldnimetusega

“kahjulikud vetikaõitsengud”.

Kahjulikke õitsenguid põhjustavaid organisme võib laias laastus liigitada kolmeks

rühmaks: 1) toksilised vetikad, mis isegi madalal rakkude kontsentratsioonil

põhjustavad kalade ja limuste mürgistust; 2) kõrge biomassiga õitsenguid põhjustavad

mitte-toksilised vetikaliigid, mis tekitavad veekogus hapnikupuudust, moodustavad

geelitaolisi masse või toodavad ebameeldiva lõhnaga vahtu, ning 3) kõrge biomassiga

toksilised õitsengud (enamasti tsüanobakterid), mis avaldavad vee ökosüsteemile

samasugust mõju nagu kahe eelmise rühma esindajad (EUROHAB 1999).

2.1. Vetikaõitsengute mõjud ökosüsteemile ja inimesele

Vetikaõitsengute kahjulikke mõjusid võib jaotada neljaks kategooriaks: 1) otsene

kahju inimese tervisele; 2) majanduslik kahju, mis kaasneb kalavarude ning teiste

mereandide varude kahanemisega; 3) majanduslik kahju turismi ettevõtetele ning 4)

negatiivne mõju veeökosüsteemile tervikuna (GEOHAB 2001). Õitsengute mõju

ökosüsteemile ja inimesele oleneb suurel määral õitsenguid põhjustavatest

vetikaliikidest. Inimesele globaalselt kõige rohkem probleeme põhjustavaks peetakse

dinoflagellaate, kuid ka sini- ja mõnede ränivetikate õitsengutel võivad olla negatiivsed

tagajärjed inimese tervisele ja majanduslikule tegevusele.

Terviseprobleeme inimesel põhjustavad eelkõige toksiliste vetikaliikide õitsengud.

Mürgistuse põhjuseks on tavaliselt kalade, karploomade, krabide jt. mereandide

söömine, milles on akumuleerunud vetikatoksiine. Samuti võivad toksiinid teatud

4

ilmastikutingimustel kanduda aerosoolide kujul mandri kohale ning põhjustada

inimestel hingamisteede probleeme (Baden 1983).

Toksiinide akumulatsioon kalades ning teistes majanduslikult olulistes

mereorganismides kahjustab kaudselt kalamajandust ning kalakasvatust, kuna sellised

mereannid muutuvad (vähemalt teatud perioodiks) söögikõlbmatuks. Kuid

vetikaõitsengutel on ka otsene mõju kala- ning söödavate mereselgrootute varudele,

kuna paljud HAB liigid on kaladele toksilised. Ihtüotoksilisi liike on dinoflagellaatide

(Dinophyceae), rafidiofüütide (Raphidiophyceae), haptofüütide (Prymnesiophyceae)

ning sinivetikate (Cyanobacteria) hulgas. Kuid ka mitte-toksilised kõrge biomassiga

õitsengud võivad põhjustada kalade suremist, tekitades veekogus hapnikupuudust või

kahjustades mehhaaniliselt kalade lõpuseid (GEOHAB 2001).

Kuna vetikaõitsengutega kaasneb tihtipeale vee värvuse muutus, ebameeldiv lõhn,

vahu teke, nahka ärritavate ainete esinemine vees ning teised ebameeldivad nähtused,

siis langeb õitsengutest mõjutatud rannaalade atraktiivsus turistidele, ning turismist

saadav tulu kahaneb oluliselt.

Sageli ei kahjusta vetikaõitsengud mitte ainult üksikuid liike, vaid mõjutavad

veeökosüsteemi tervikuna, muutes looduslikke biotoope ning toiduahela struktuuri

(Glibert et al. 2003). Näiteks, vetikate lagunemise tõttu tekkiv hapnikupuudus ohustab

praktiliselt kõiki aeroobseid veeorganisme. Kõrge biomassiga õitsengud varjavad

valgust ning vähendavad taimede fotosünteetilist aktiivsust, ohustades sellega põhjale

kinnitunud veetaimestikku, mis on väärtuslikuks elupaigaks paljudele veeloomadele.

Mõnede vetikate toksiinid akumuleeruvad toiduahelas, põhjustades veeimetajate ja -

lindude haigestumist ja surma (Work et al. 1993; Scholin et al. 2000).

2.1.1. HAB liikide mõju teistele vetikaliikidele Paljude HAB liikide kasvukiirus ei ole teiste vetikaliikide kasvukiirusest oluliselt

kõrgem. Seega ei ole nende edukus planktonikoosluses tingitud mitte niivõrd nende

kasvukiirusest, vaid pigem teistest elustrateegia omadustest.

Elustrateegia oluliseks elemendiks teatud HAB liikide puhul on nende

fütoplanktiliste konkurentide kasvu pärssimine (EUROHAB 1999). Mõned vetikad, nt.

5

Dinophysis acuminata (Gentien et al. 1995), Heterosigma akashiwo (Smayda 1998),

paljud sinivetikaliigid, võivad moodustada veepinnal väga suure tihedusega kihte, mis

ei lase läbi valgust ning vähendavad sellega konkurentide fotosünteetilist aktiivsust

(GEOHAB 2001). Teiste HAB liikide puhul (näiteks dinoflagellaat Gymnodinium

mikimotoi ning haptofüüdid Chrysochromulina polylepis ja Prymnesium parvum) on

oluliseks faktoriks keemiline interaktsioon konkureerivate liikidega (allelopaatia). On

näidatud, et nende vetikate toksiinid võivad ohustada teisi veekogus elutsevaid

vetikaliike, ning isegi baktereid, inhibeerides nende kasvu (EUROHAB 1999).

Allelopaatia mehhanismidest on teada suhteliselt vähe, ning on vaja edasisi uuringuid

mõistmaks selle nähtuse rolli vetikaõitsengute dünaamikas.

2.2. Vetikaõitsenguid mõjutavad looduslikud ja antropogeensed

faktorid

Kahjulikud vetikaõitsengud ei ole looduses sugugi mitte uus nähtus, neid on

teadaolevalt aset leidnud sadu ning miljoneid aastaid tagasi. Arvatavalt on viimastel

aastakümnetel õitsengute esinemissagedus oluliselt suurenenud, samuti on laienenud

nende geograafiline levik (GEOHAB 2001). Kuna vetikaõitsengute esinemist

mõjutavad mitmesugused füüsikalised, keemilised ja bioloogilised faktorid, siis nende

intensiivistumise põhjused võivad olla erinevad, kuid arvatavalt on inimtegevusel selles

protsessis väga oluline osa.

Üheks tähtsaks vetikaõitsenguid mõjutavaks faktoriks on kliima, kuna sellest sõltub

olulisel määral veetemperatuur, valgustingimused, kaudselt ka toitainete

kontsentratsioon ning teised vetikate kasvu määravad parameetrid (Glibert et al. 2003).

Järelikult kõik looduslikud ja inimtegevusega seotud protsessid, mis põhjustavad

maailma kliima fluktuatsioone või muutusi, mõjutavad kaudselt ka vetikaõitsengute

esinemissagedust, kestvust ja intensiivsust. Kliimat mõjutava loodusliku protsessi

näiteks on El Niño, mis on seotud Vaikse Ookeani pinnakihi temperatuuri perioodilise

muutusega. El Niño aastatel muutub vee pinnakiht soojemaks, mistõttu võib suureneda

teatud liikide õitsengute esinemise tõenäosus. Vaatamata sellele ei ole leitud

6

usaldusväärset positiivset korrelatsiooni El Niño ning HAB-i vahel (GEOHAB 2001).

Antropogeenne mõju kliimale on põhjustatud peamiselt kasvuhoonegaaside ning

aerosoolide suurenenud emissioonidest. Sellest tingitud kliima soojenemine võib

tekitada maailmameres mitmesuguseid muutusi, mis võivad viia kahjulike

vetikaõitsengute sagenemisele ning HAB liikide veelgi laiemale levikule.

Oluliseks antropogeenseks faktoriks, mis võib soodustada HAB-ide esinemist, on

toitainete suurenenud juurdevoolust tingitud rannalähedaste alade eutrofeerumine.

Toitained võivad pärineda nii tööstusest kui põllumajandusest; viimasel ajal on

kasvanud ka akvakultuuri roll selles protsessis (Naylor et al. 1998). Biogeenid satuvad

veekogusse nii pinna- kui ka põhjavee kaudu, samuti on oluliseks toitainete (peamiselt

lämmastiku) allikaks depositsioon atmosfäärist (Glibert et al. 2003). Mõnedel juhtudel

võib suurenenud toitainete kontsentratsioon põhjustada kõikide vetikaliikide biomassi

suurenemist. Tihtipeale aga soodustab see teistest enam mingi konkreetse liigi (või

liikide) kasvu, ning pahatihti on selleks just HAB liigid. Erinevatel vetikatel on erinev

vajadus toitainete järele. Näiteks ränivetikad, mis on keskkonnale enamasti ohutud,

vajavad oma rakuseina ehitamiseks räni. Kuna maismaalt veekogudesse sissevoolav

heitvesi on räni poolest vaene, kuid rikas lämmastiku ning fosfori poolest, siis suureneb

rannikumeres N:Si ning P:Si suhe. Sellistes tingimustes jäävad ränivetikad konkurentsis

alla teistele vetikaliikidele, mis ei vaja oma kasvuks räni, näiteks dinoflagellaatidele.

Konkurentsi puudumise ning suurenenud toitainete kättesaadavuse tõttu võivad

dinoflagellaadid hakata hoogsalt kasvama, ning põhjustada õitsenguid (GEOHAB

2001).

HAB liikide levik laieneb pidevalt, ning kahjulikud vetikaõitsengud ohustavad järjest

uusi maailma regioone (Smayda 1990; Hallegraeff 1993). Kirjeldatakse üha uusi

toksilisi vetikaliike, mida varem arvati olevat ohutud (mõnede vetikate toksilisus sõltub

nende elupaigast, seega oma looduslikus biotoobis mitte-toksilised vetikaliigid võivad

osutuda toksiliseks mujale introdutseerituna) (Glibert et al. 2003). HAB liikide levikut

mõjutavad tormid, hoovused ning teised looduslikud mehhanismid. Ent ka inimene on

aidanud kaasa kahjulike vetikaõitsengute laiemale levikule: on tõestatud, et võõrliigid

(s.h. ka HAB liigid) võivad levida naftatankerite ballastvee väljavalamise ning

akvakultuuri elusloomade transportimise kaudu (GEOHAB 2001).

7

Kahjulikud vetikaõitsengud on valmistanud palju probleeme kalapüügiettevõtetele.

Kuid võimalik, et kalapüük ise (ning eriti ülepüük) on soodustanud HAB-ide

sagenemist ning intensiivistumist. Väärtuslike püügikalade puhul on tegemist enamasti

veeökosüsteemi tippkiskjatega, nende eemaldamine põhjustab tõsiseid ümberkorraldusi

toiduahelas läbi troofilise kaskaadi. Selle tulemusena võib väheneda herbivooride

arvukus, mis viib omakorda fütoplanktoni vohamisele (Botsford et al. 1997; Glibert et

al. 2003).

HAB-ide võimalike põhjuste loetelu võib jätkata, kuid üldiselt peab tõdema, et meie

teadmised selles valdkonnas on veel üsna ebapiisavad.

3. Haptofüüdid Haptofüüdid on planktilised, üherakulised, kahe viburiga vetikad. Enamasti on nad

mereorganismid, kuid paljud on eurühaliinsed ja üksikud esinevad isegi magevees

(Hoek et al. 1995). Enamus haptofüüte on fototroofid, kuid teatud liigid on võimelised

toituma ka osmotroofselt või fagotroofselt (Tillmann 1998) ning miksotroofsus on üsna

tavaline nähtus.

Haptofüütide unikaalseks tunnuseks on haptoneema olemasolu, mis sarnaneb oma

välimuselt viburiga, kuid erineb sellest nii ehituse, kui ka talitluse poolest. Haptoneema

on polüfunktsionaalne organell, mis osaleb nii substraadile kinnitumises kui ka saagi

haaramises (Kawachi et al. 1991), samuti aitab ta rakul keskkonnas orienteeruda.

Teiseks iseloomulikuks tunnuseks on haptofüütide rakku katvad orgaanilised

soomused. Teatud haptofüütide liikidel – kokolitoforiitidel – ladestub orgaanilisele

soomusele lubi. Selliseid soomuseid nimetatakse kokkoliitideks ning just nendest on

geoloogilise ajaloo vältel moodustunud suured kriidilademed merepõhjas.

Haptophyceae klassi kuulub 11 mineraliseerumata soomustega vetikate perekonda

(umbes 80 liiki) ning umbes 40 kokolitoforiitide perekonda (umbes 200 liiki) (Graham

ja Wilcox 2000).

8

3.1. HAB liigid haptofüütide hulgas

Peamised õitsenguid põhjustavad haptofüütide perekonnad on Emiliania,

Phaeocystis, Chrysochromulina ning Prymnesium.

3.1.1. Emiliania ning tema õitsengud

Emiliania huxleyi on levinud praktiliselt kõikjal maailmameres2, kuid kõige arvukam

on ta toitainete poolest rikastes paras- ning lähispolaarsetes regioonides. Emiliania on

võimeline taluma väga suuri temperatuuri, soolsuse ning toitainete kontsentratsiooni

kõikumisi; samuti võib ta kasvada väga madala valguse intensiivsuse juures. Soodsatel

keskkonnatingimustel põhjustab Emiliania laiaulatuslikke õitsenguid pindalaga kuni

100000 km2. Õitsengute ajal võib vetika rakkude kontsentratsioon ulatuda kuni 105

rakku ml-1, moodustades kuni 80-90% kõikidest fütoplanktoni rakkudest. Kuigi

Emiliania rakud on värvuselt kollased või kuldpruunid, muutub vesi õitsengu ajal

salatiroheliseks tänu valguse peegeldumisele kokkoliitidelt.

Õnneks ei ole Emiliania toksiline vetikas, kuid see-eest toodab ta dimetüülsulfiidi

(DMS). Dimetüülsulfiid on lenduv väävlit sisaldav orgaaniline ühend, mis oksüdeerub

atmosfääris väävelhappeks ning soodustab happevihmade teket. Samuti osaleb DMS

pilvede moodustamisel, suurendades seeläbi maakera albeedot ning põhjustades kliima

jahenemist (Charlson et al. 1987).

3.1.2. Phaeocystis ning tema õitsengud Phaeocystis pouchetii põhjustab kõrge biomassiga õitsenguid paljudes toitainete

rikastes maailmamere osades, peamiselt aga külmades meredes. Vetikal on kaks

eluvormi: üherakuline flagellaat ning sfääriline geelitaoline koloonia. Õitsengu ajal

esinevad enamasti kuni 8 mm diameetriga Phaeocystis kolooniad, mis on arvatavalt

kaitseks ärasöömise ning infektsioonide vastu (Hamm 1999). Nagu ka Emiliania, ei ole Phaeocystis toksiline, kuid toodab dimetüülsulfiidi ning antimikroobse toimega

2 http://www.noc.soton.ac.uk/soes/staff/tt/

9

akrüülhapet. Samuti kaasneb õitsengutega suurte vahu koguste moodustumine, mis

lainetusega randa rulluvad (Graham ja Wilcox 2000). Phaeocystis õitsengud võivad

tekitada veekogus hapnikupuudust, põhjustades bentiliste selgrootute hävingu (Rogers

ja Lockwood 1990). Phaeocystis on nuhtluseks ka kalameestele, kuna õitsengud

peletavad kalad eemale, vähendades sellega kalasaake (Boalch 1987). Eriti massilise

vohamise puhul võivad need vetikad kalavõrke ummistada (Hurley 1982) .

3.1.3. Chrysochromulina ning tema õitsengud

Chrysochromulina perekonnas on kirjeldatud 50 liiki, millest enamus on

mereorganismid, kuid on olemas ka magevees elutsevaid vorme. Perekonna esindajad

on laialt levinud üle kogu maailma, neid leidub isegi polaarvöötmes.

Peamiseks HAB liigiks Chrysochromulina perekonnas on C. polylepis. See liik

kirjeldati 1962. aastal, kuid enne 1988. aastat ei ole ulatuslikke kahjulikke õitsenguid

täheldatud (Bjergskov et al. 1990). Sellepärast tuli C. polylepis esimene toksiline

õitseng 1988. aasta mais-juunis Skagerraki väinas (õitsengu pindala oli üle 60000 km2,

rakutihedus kuni 2×105 rakku ml-1) suure üllatusena (Moestrup 1994).

Chrysochromulina polylepis on toksiline vetikas, ta toodab toksilisi galaktolipiide

(Yasumoto et al. 1990), mis ohustavad nii kalu, kui ka mereselgrootuid (Bjergskov et al.

1990). Veel üheks toksiliseks Chrysochromulina perekonna esindajaks on C.

leadbeateri, mille toksiinid võivad avaldada kahjulikku mõju mõnedele selgrootutele,

näiteks merisiilikutele (Johannesen et al. 1991).

Ka mageveelised Chrysochromulina liigid (nt. C. breviturrita) on võimelised

tekitama massilisi õitsenguid. Tavaliselt kaasneb C. breviturrita õitsengutega

ebameeldiv lõhn ning arvatavalt põhjustavad õitsengud kulleste suremist (Moestrup

1994).

3.1.4. Prymnesium ning tema õitsengud

Prymnesium perekond on väga lähedane Chrysochromulina perekonnale; peamise

morfoloogilise erinevusena on Prymnesium haptoneema väga lühike ning ei ole

võimeline kokku rulluma. Iseäralikult on Prymnesium suuteline kasvama väga laias

soolsuse vahemikus (1-45‰) (Brand 1984; Edvardsen ja Paasche 1998).

10

Prymnesium perekonnas on kirjeldatud 10 liiki (Jordan ja Green 1994), millest

toksilisi on teadaolevalt kaks - Prymnesium parvum ning P. calathiferum3. Kõige

rohkem probleeme on tekitanud Prymnesium parvum õitsengud, põhjustades kalade

suremist eri maailma osades (Moestrup 1994). Enamasti toimuvad Prymnesium

õitsengud riimvees, kuid 1983. aastal Uus-Meremaal registreeriti esmakordselt P.

calathiferum õitseng merevees (Chang 1985). Kirjeldatud on ka kolmas toksiline liik,

Prymnesium saltans, mis olevat põhjustanud massilist kalade hävingut 1990. aastal

Saksamaal (Kell ja Noack 1991), kuid võimalik, et kahju tekitajaks oli hoopis P.

parvum. On võimalik, et P. saltans ja P. parvum puhul on tegemist ühe ja sama liigiga

(Moestrup 1994).

4. Prymnesium parvum

Prymnesium parvum kuulub klassi Prymnesiophyceae (sün. Haptophyceae), seltsi

Prymnesiales. Rakud on ovaalsed, 8-11 µm pikkused, kahe viburiga ning väga lühikese

(3-5 µm) haptoneemaga. Tavaliselt on rakkudel 2 kollakaspruuni kloroplasti. Rakku

katavad mineraliseerumata soomused, mida kattev muster on oluliseks tunnuseks

Prymnesium perekonna liikide eristamisel.

P. parvum on eurühaliinne liik, kuid enimlevinud on ta riimvee ökosüsteemides;

õitsengud toimuvad tavaliselt veekogudes soolsusega 1-12‰. Tavaliselt hakkab P.

parvum massiliselt arenema siis, kui veetemperatuur ületab 10°C (Moestrup 1994), kuid

mõnedel juhtudel on õitsengud toimunud ka palju madalamatel temperatuuridel

(Edvardsen ja Paasche 1998).

Esimene teadaolev kalade suremist põhjustanud Prymnesium parvum õitseng toimus

1920. aastal Workum meres Hollandis. Sellest ajast alates on teada arvukaid õitsenguid

riimvetes üle kogu maailma (Moestrup 1994), s.h. Läänemeres (Lindholm ja Virtanen

1992), mis tekitavad suurt majanduslikku kahju kalandusele. Palju probleeme on P.

parvum valmistanud ka akvakultuurile, kuna sooja ning toitaineterikka veega

3 Mõned autorid kirjeldasid ka P. patelliferum toksilisi õitsenguid (Green, Hibberd et al. 1982; Moestrup 1994), kuid praeguseks on P. parvum ning P. patelliferum loetud üheks ja samaks liigiks (Larsen 1999).

11

kalakasvandused on P. parvum jaoks ideaalseks kasvukeskkonnaks (Premazzi ja

Volterra 1993).

Prymnesium ei ole toksiline mitte ainult kaladele, vaid ka teistele lõpustega

hingavatele veeorganismidele (molluskid, lülijalgsed, kahepaiksete lõpustega hingavad

vastsed jt.) (Paster 1973).

P. parvum esinemisega ei kaasne mitte alati negatiivseid tagajärgi (Moestrup 1994)

ja kalade suremine toimub reeglina vaid väga kõrge rakutiheduse puhul (>0.5-1×105

rakku ml-1). Kuna nii suure biomassi saavutamiseks on vaja suuri lämmastiku ja fosfori

koguseid, siis on enamus kahjulikke õitsenguid toimunud tugevasti eutrofeerunud aladel

(Edvardsen ja Paasche 1998).

4.1. Prymnesium toksiinid ja toksilisus Prymnesium parvum toodab ning eritab keskkonda kõrgelt toksilisi sekundaarseid

metaboliite, mille täpne keemiline koostis ei ole teada (Shilo 1981; Igarashi et al. 1999).

Ilmselt sisaldavad Prymnesium rakud mitut toksilist ühendit, mis erinevad teineteisest

oma koostise, bioloogilise aktiivsuse, stabiilsuse ning optimaalsete tootmistingimuste

poolest. Teadaolevalt on need eksotoksiinid, mis eritatakse elutegevuse käigus

keskkonda, kuid teatud kogus toksilisi ühendeid jääb raku sisse kuni selle surmani, ning

vabaneb alles raku lüüsumisel (Collins 1978).

Üks nendest ühenditest, prümnesiin, on suure molekulmassiga glükolipiid, mille

lipiidne osa moodustab umbes 30% molekulist, ning 70% moodustavad süsivesikud.

Elemendiliselt koosneb prümnesiin süsinikust, vesinikust ja hapnikust, ning ei sisalda

olulisi toitaineid – lämmastikku ja fosforit (Paster 1968; Collins 1978). Teine

kirjeldatud ühend, nimetusega toksiin B, on kompleksne lipoproteiin-süsivesik, mis

koosneb valgust (22%), fosfaadist (0,5%) ja suhkrutest (10-12%) (Ulitzur ja Shilo

1970).

Prymnesium toksiinidel on kolm põhilist toimet - ihtüotoksiline, tsütotoksiline ning

hemolüütiline. Kõik need põhinevad ühel ja samal mehhanismil – rakumembraani

läbilaskvuse muutmisel ja selle terviklikkuse kahjustamisel (Collins 1978). Toksiinid

põhjustavad arvatavasti negatiivselt laetud pooride teket rakumembraanis. Poorid

12

võivad liituda, moodustades suuremaid negatiivselt laetud poore, ning, teatud kriitilist

taset saavutades, toimub membraani katkemine ja raku lüüs (Moran ja Ilani 1974).

Kõige intensiivsem toksiinide tootmine toimub logaritmilises kasvufaasis ning jätkub

statsionaarses faasis (Premazzi ja Volterra 1993). Nagu ka dinoflagellaatide ja

tsüanobakterite puhul, ei ole selget korrelatsiooni rakkude kontsentratsiooni ning

õitsengute toksilisuse vahel (Shilo 1967).

Toksiinide koostis on sarnane rakumembraani koostisega, mis viitab võimalusele, et

toksiinid on kas membraani koostisosaks või koguni selle tasakaalustamata metabolismi

produktiks. Seda väidet toetab asjaolu, et toksilisus suureneb toitainete (lämmastiku ja

fosfori) vaeguse tingimustes (Dafni et al. 1972; Johansson ja Granéli 1999). Peale

lämmastiku ja fosfori kontsentratsiooni sõltub Prymnesium toksilisus ka teistest

keskkonnafaktoritest. Prymnesium toksiinid on temperatuuritundlikud, inaktiveerudes

kõrgetel temperatuuridel (Yariv ja Hestrin 1961). Valguse käes on Prymnesium vähem

toksiline kui pimeduses (Rahat ja Jahn 1965; Padan et al. 1967). See võib olla tingitud

kas toksiinide inaktiveerumisest valguse toimel, või toksiinide tootmise aeglustumisest

fotosünteetilise aktiivsuse suurenedes (Reich ja Parnas 1962). Toksilisus suureneb Ca2+

ja Mg2+ ioonide juuresolekul, kuna toksiini ja katiooni vastastoimel tekib kõrgema

toksilisusega ühend (Shilo 1971).

4.2. Toksilisuse eelised

Toksiinide tootmise evolutsiooniliste eeliste üle on palju vaieldud, samas

usaldusväärsed andmed selle kohta puuduvad.

P. parvum toksiinid võivad olla kaitseks herbivooria vastu (Nejstgaard ja Solberg

1996; Granéli ja Johansson 2003). Miksotroofselt toituva Prymnesium toksiinid

põhjustavad arvatavasti saagi rakkude immobiliseerimist ja lüüsumist, soodustades

sellega fagotroofset toitumist (Skovgaard ja Hansen 2003).

Samuti on võimalik, et toksiinid aitavad Prymnesium teiste fütoplankteritega

edukamalt konkureerida. Kuna toksilisus suureneb mitmekordselt oluliste

makroelementide limitatsiooni korral (N ja P), siis oletatakse, et P. parvum toodab

allelopaatilisi ühendeid kõrvaldamaks konkurente, saades eelise toitainete piirangu

13

tingimustes (Johansson ja Granéli 1999). Selline strateegia võib olla küll väga

efektiivne, kuid paratamatult tekitab auto-toksilisuse probleemi.

4.3. Auto-toksilisus

Auto-toksilisus on liigisisese allelopaatia vorm. See on olukord, kus organismi

sünteesitud keemilised ühendid satuvad keskkonda ning pärsivad tema enda kasvu

(Kumari ja Kohli 1987). Auto-toksilisus on looduses (nii maismaa- kui ka

veeökosüsteemides) laialt levinud, kuid vähe uuritud nähtus (Wolfe 2000).

Paljud taimed sünteesivad toksiine, et kaitsta ennast patogeenide ning herbivooride

eest. Kuidas organismid auto-toksilisuse probleemist üle saavad, on enamasti teadmata.

Mõned taimed kasutavad ilmselt ära füsioloogilisi erinevusi enda ning herbivoori vahel,

tootes näiteks närvimürke (Fowden ja Lea 1979). Teine võimalus auto-toksilisust

vähendada on toota indutseeritavaid toksiine (Paul ja Alstyne 1992). Tihtipeale

talletavad taimed oma sekundaarseid metaboliite spetsiaalsetes vakuoolides, kust need

vabanevad vaid raku vigastamise korral (Wink 1997).

Prymnesium parvum toodab tugeva toimega allelopaatilisi ühendeid ning samas on

võimeline põhjustama väga kõrge rakutihedusega õitsenguid ( > 106 rakku ml-1)

(Edvardsen ja Paasche 1998). Järelikult peavad liigil olema mingid kaitsemehhanismid

auto-toksilisuse vastu. Kuid ilmselt ei oma P. parvum konstitutiivset immuunsust4, kuna

on oletatud, et teatud tingimustes on rakud tundlikud iseenda eksotoksiinide suhtes.

Veel avaldamata uuringute kohaselt sõltub tundlikkus testitava kultuuri eelnevast

kokkupuutest toksiinidega. P. parvum arvatavasti adapteerub kasvukeskkonnas

aegamööda suureneva toksiinide kontsentratsiooniga, mis annab alust oletusele, et

kaitsemehhanismid võivad olla indutseeritavad toksiinide endi poolt (Olli ja Trunov

2005).

4 Immuunsus, mis areneb ontogeneesis ilma induktsioonita toksiinide poolt

14

5. Töö eesmärk Eelpoolnimetatud töös uurisid Olli ja Trunov erinevate toksiinide kontsentratsioonide

mõju suhteliselt madala rakutihedusega (ja eeldatavalt piiratud kokkupuutega

toksiinidega) P. parvum kultuurile. P. parvum külvati kahte kultuuri. Neist ühes nn.

katse-kultuuris, hoiti rakutihedus madal (ca. 70×103 rakku ml-1) lahjendades kultuuri

värske söötmega kord päevas. Teine, nn. alg-kultuur, kasvas segamatult kõrge

rakutiheduseni (Joonis 1).

Joonis 1. Prymnesium parvum alg-kultuuride kasv. Ringikujulised sümbolid näitavad alg-kultuuride rakutihedust ajahetkel, kus võeti proovid auto-toksilisuse testimiseks. Alg-kultuuri kasv peatus toitainete ammendumisel ca. 150×103 rakku ml-1 juures. Väiksemal graafikul on näidatud alg-kultuuri lineaarse kasvu jätkumine pärast toitainete lisamist. Allikas: Olli ja Trunov (2005).

Teatud ajavahemike järel eemaldati kindel kogus alg-kultuuri, filtreeriti, ning

rakuvaba filtraati inokuleeriti P. parvum katse-kultuuri. P. parvum alg-kultuuri

rakuvaba filtraat avaldas selget negatiivset mõju katse-kultuuri kasvule (Joonis 2). Mõju

oli seda negatiivsem mida kõrgem oli alg-kultuuri rakutihedus (Joonis 2). Alg-kultuuri

tihedus suurenes ajas lineaarselt (Joonis 1), mis on ebaharilik, kuna tavaliselt suureneb

vetikakultuuri tihedus ajas eksponentsiaalselt. Sellest tuleneb, et alg-kultuuri enda

kasvukiirus kahanes pidevalt, kuid jäi positiivseks. Sellist tulemust võib interpreteerida

kui rakkude järk-järgulist adaptatsiooni toksiinidega, kus kasvukiirus kahaneb vastavalt

toitainete ammendumisele ja eksotoksiinide akumulatsioonile kasvukeskkonnas.

15

Joonis 2. Prymnesium parvum katse-kultuuride kasv kontroll-söötmetes (ringikujulised sümbolid) ning toksiinidega söötmes (tärnikujulised sümbolid). Iga sümbol tähistab kolme replikaadi keskmist kasvukiirust, veaintervall näitab kasvukiiruste standardhälvet. Allikas: Olli ja Trunov (2005).

Käesoleva töö eesmärgiks oli uurida P. parvum rakkude adaptatsiooni iseenda

toksiinide järk-järguliselt suureneva kontsentratsiooniga. Selleks planeerisin

eksperimendi, kus katse-kultuur inokuleeriti söötmesse, mis pärineks katse-kultuurist (i)

madalama, (ii) sarnase ja (iii) kõrgema rakutihedusega alg-kultuuri rakuvabast

supernatandist. Eeldasin, et alg-kultuuri rakuvabade supernatantide toksiinide

kontsentratsioon on katse-kultuuri söötmekeskkonnaga võrreldes vastavalt (i) madalam,

(ii) sama ja (iii) kõrgem. Kontrollkatseks oleks katse-kultuuri kasvukiirus värskes,

toksiinvabas söötmes. Oodatav katse-kultuuri reaktsioon erinevates alg-kultuuri

supernatantides oleks vastavalt (i) kasvukiirus oleks võrdne kontrollkatsega (ii)

kasvukiirus oleks pisut madalam kui kontrollkatses (iii) kasvukiirus väheneks järsult

võrreldes kontrollkatsega. Sellised tulemused kinnitaks rakkude järk-järgulist

adaptatsiooni sujuvalt suureneva toksiinide kontsentratsiooniga kasvukeskkonnas.

16

6. Materjalid ja metoodika Prymnesium rakkude kasvatamiseks kasutati f/20 söödet, mis oli saadud f/2 söötme5

kümnekordsel lahjendamisel. F/2 sööde valmistati läbi 0,2 µm filtri filtreeritud ning

autoklaavitud Läänemere veest (soolsus 6 ‰). Madalama toitainete sisaldusega söödet

kasutati kiirema toitainete piirangu esilekutsumiseks ja seega rakkude toksilisuse

suurendamiseks.

Prymnesium parvum toksiline tüvi6 inokuleeriti neljasse f/20 söötmega Erlanmayer

kolbi ning kasvatati 18˚C juures, 12:12 tunnise valguse:pimeduse tsükliga, valguse

intensiivsusel ca. 100 µmּm-2ּs-1. Kultuuride algkontsentratsioonid olid ligikaudu

1.5×103, 4.4×103, 9.0×103 ja 17.4×103 rakku ml-1 ning lõppkontsentratsioonid (8 päeva

möödudes) olid vastavalt 38×103, 104×103, 174×103 ja 215×103 rakku ml-1(Joonis 3).

Joonis 3. Prymnesium parvum nelja erineva rakutihedusega kultuuri kasv. Sümbolid näitavad kolme kordusmõõtmise keskmist, veaintervallid on kolme kordusmõõtmise standardhälve.

Kõik rakkude loendused teostati osakeste loendajaga CASY TT7, mis määrab

rakkude kontsentratsiooni ning ruumala elektrilise takistuse mõõtmise kaudu (elusatel

5 http://ccmp.bigelow.org/ 6 Kalmar University Algal Collection, KAC39 7 CASY TT Particle Counter and Analyser (Schärfe System, Saksamaa)

17

rakkudel on elektritakistus suurem, kui ümbritseval elektrolüüdi lahusel). Mõõteriist

loendab osakeste arvu 400 võrdse laiusega mõõtevahemikus piiridega 0 µm kuni 15 µm

(ülemine piir valitakse vastavalt vajadusele). Visuaalse vaatluse põhjal valiti P. parvum

rakkude arvukuse hindamiseks vahemik 5-10 µm.

Lõppkontsentratsiooni saavutamisel eemaldati kõigist neljast kultuurist teatud kogus

söödet ning tsentrifuugiti kiirusel 1200 pööret minutis 5 min. Iga kultuuri

tsentrifuugimisel saadud supernatant jagati võrdselt kaheksa katseklaasi vahel (10 ml

supernatanti igasse katseklaasi) ning rist-inokuleeriti P. parvum rakkudega kõigist

neljast kultuurist (kaks replikaati iga kultuuri kohta). Kontrolliks oli iga kultuur

inokuleeritud puhtasse f/20 söötmesse (samuti kaks replikaati kultuuri kohta).

Rakutihedust mõõdeti kohe pärast inokuleerimist ning ühe ja kahe päeva möödudes.

Katse-kultuuride reaktsiooni hindamiseks arvutati rakkude kasvukiirused esimesel ja

teisel eksperimendi päeval. Kasvukiirus µ = ln(Nt/N0)/t, kus N0 on rakkude

algkontsentratsioon ning Nt on rakkude kontsentratsioon ajavahemiku t järel (antud

juhul üks ööpäev). Kasvukiiruse veahinnangu saamiseks kasutati kordusmõõtmiste

keskmise rakutiheduse simulatsiooni bootstrap-meetodil. Järgnevalt tehti kasvukiiruste

ümberarvutused tuhande simuleeritud rakutiheduste põhjal ning sellest hulgast arvutati

kasvukiiruse 95% usalduspiirid.

Hindamaks alg-kultuuri rakutiheduse mõju katse-kultuuri kasvukiirusele rakendati

ühefaktorilist dispersioonanalüüsi meetodit (ANOVA). Tegelikult ei ole antud testi

rakendamine vaid kahe replikaadi puhul päris korrektne, usaldatavama sõltuvuse

hinnangu saamiseks tuleks katses kasutada vähemalt kolm replikaati.

Kuna töö eesmärgiks oli just auto-toksilisuse uurimine, siis me ei kasutanud teisi

toksilisuse tuvastamise meetodeid. P. parvum toksiinide täpne keemiline koostis ei ole

teada, ning me ei tea, kas auto-toksilisus ja allelopaatiline mõju teistele organismidele

on tingitud samadest või erinevatest ühenditest. Näiteks, hemolüütiline aktiivsus, mida

määratakse tavaliselt biotestides, kaob kõrge pH juures ning ühevalentsete ioonide

juuresolekul, samas kui ihtüotoksilisus jääb. See viib oletusele, et ihtüotoksilisust

põhjustab molekuli lipiidne osa, ning hemolüütiline aktiivsus paikneb valgulises osas,

kuna vaid valgud denatureeruvad aluselises keskkonnas ioonsete kofaktorite toimel

(Collins 1978; Premazzi ja Volterra 1993). Seega on võimalik, et erinevad toksilised

18

aktiivsused paiknevad toksiini molekuli eri osades (Premazzi ja Volterra 1993), ning

alternatiivsete toksilisuse testide rakendamine ei pruugi olla otstarbekas auto-toksilisuse

uurimisel.

7. Tulemused Esimesel päeval pärast inokuleerimist suurenes Prymnesium parvum rakutihedus

enamikes katse-kultuurides (Joonis 4).

Joonis 4. Katse-kultuuride rakutiheduse muutus erineva rakutihedusega alg-kultuuride supernatantides kahel päeval pärast inokuleerimist. Ridades on seeriad esimese kuni neljanda alg-kultuuri supernatantidega. Tulpades on esimese kuni neljanda katse-kultuuri rakutiheduse vastavate alg-kultuuride supernatantides. Veaintervallid on kolme või kahe kordusmõõtmise standardhälve.

Selge rakutiheduse kahanemine oli täheldatud vaid esimese katse-kultuuri puhul, mis

oli inokuleeritud iseenda supernatanti. Teisel päeval suurenesid kõikide katse-kultuuride

rakutihedused, kusjuures kasvukiirused olid esimese päevaga võrreldes tunduvalt

kõrgemad.

19

Joonis 5. Vasakus tulbas on katse-kultuuride kasvukiirused esimesel ning paremas tulbas teisel eksperimendi päeval. Kõrvutiolevad sümbolid kujundavad kahe replikaadi kasvukiiruseid. Horisontaalsed jooned näitavad vastava katsekultuuri kasvu kontroll-söötmes.

Joonisel 5 vasakus tulbas on esitatud katse-kultuuride kasvukiirused esimesel päeval

pärast inokuleerimist. Horisontaalsete joontega on näidatud kontroll-katse (vastava

katse-kultuuri kasvukiirus värskes f/20 söötmes). Esimese katse-kultuuri (minu eelduse

kohaselt kõige tundlikum toksiinide suhtes) kasvukiirus oli kõikide alg-kultuuride

supernatantides madalam, kui kontrollis (kontrolli µ ligikaudu 0.31 d-1). Samas ei ole

täheldatud statistiliselt olulist rakkude kasvukiiruse vähenemist eeldatavalt kõrgema

toksiinisisaldusega alg-kultuurides (anova, p=0.064). Teise katse-kultuuri kasvukiirused

kõikides supernatantides olid samuti kontrolli kasvukiirusest (µ=0.34 d-1) madalamad,

ning erinevused katse-kultuuri kasvukiiruste vahel erinevates kasvukeskkondades ei

olnud statistiliselt olulised (anova, p=0.21). Kolmanda katse-kultuuri kasvukiirused olid

kolme esimese alg-kultuuri supernatantides kõrgem, kui kontrollis (µ=0.19); neljanda

20

alg-kultuuri supernatandis oli see veidi madalam, kui kontrollis. Ka kolmanda katse-

kultuuri puhul ei olnud erinevused kasvukiiruste vahel statistiliselt olulised (anova,

p=0.15). Neljanda katse-kultuuri kasvukiirus kontroll-söötmes oli väga madal (µ=0.08

d-1), olles tunduvalt madalam, kui kasvukiirus kõikide alg-kultuuride supernatantides.

Neljanda katse-kultuuri puhul on täheldatud kasvukiiruse vähenemine alg-kultuuri

kontsentratsiooni suurenemisel, ning erinevused kasvukiiruste vahel erinevate alg-

kultuuride supernatantides on statistiliselt olulised (anova, p<0.05).

Joonise 5 parem tulp näitab katse-kultuuride kasvukiiruseid teisel eksperimendi

päeval (horisontaaljoontega on kujutatud katse-kultuuride kasvukiirused kontrollis).

Katse-kultuuride kasvukiirused kontroll-söötmes olid oluliselt suuremad, kui esimesel

päeval; ka kasvukiirused alg-kultuuride supernatantides olid võrreldes esimese päevaga

enamasti tunduvalt kõrgemad. Esimese katse-kultuuri kasvukiirus oli iseenda

supernatandis veidi madalam, kui kontrollis (kontrolli µ=0.77). Ülejäänud alg-

kultuuride supernatantides täheldasin kasvukiiruse järsku langust võrreldes kontrolliga,

kusjuures kasvukiirus oli seda madalam, mida kõrgem oli alg-kultuuri rakutihedus

(erinevused statistiliselt olulised, p<0.05). Teise katse-kultuuri kasvukiirus oli esimese

alg-kultuuri supernatandis võrdne kontrolli kasvukiirusega (µ=0.62). Sama ning

kõrgema rakutihedusega alg-kultuuride supernatantides oli kasvukiirus kontrolli

kasvukiirusest madalam, kuid statistiliselt olulist kasvukiiruse sõltuvust alg-kultuuri

rakutihedusest ei leitud (p=0.06). Kolmanda katse-kultuuri kasvukiirused olid kõikide

alg-kultuuride supernatantides madalamad, kui kontroll-söötmes (µ=0.58). Esimese

kolme alg-kultuuri puhul on täheldatud katse-kultuuri kasvukiiruse langus alg-kultuuri

rakutiheduse suurenedes, kuid neljanda kultuuri supernatandis oli kasvukiirus

kolmandaga võrreldes veidi kõrgem. Kasvukiiruste erinevused erinevate söötmete vahel

on statistiliselt olulised (p<0.05). Ka neljanda katse-kultuuri kasvukiirused alg-

kultuuride supernatantides olid kõik kontrolliga (µ=0.58) võrreldes madalamad. On

täheldatud kasvukiiruse languse tendents alg-kultuuri rakutiheduse suurenemisega, kuid

erinevused on statistiliselt ebaolulised (p=0.096).

21

8.Arutelu

Suur osa eksperimendi käigus saadud tulemustest ei langenud kokku oodatavate

tulemustega. Esiteks, enamikel juhtudel ei ole leitud statistiliselt olulist sõltuvust alg-

kultuuri rakutiheduse ning sellesse inokuleeritud katse-kultuuri kasvukiiruse vahel, mis

minu eelduse kohaselt pidi olema eriti ilmne madala rakutihedusega katse-kultuuride

puhul. Teiseks, katse-kultuuri kasvukiirus toksiinvabas kontroll-söötmes (eeldatavasti

soodsaim kasvukeskkond P. parvum rakkude jaoks) oli mõnedel juhtudel tunduvalt

madalam võrreldes kasvukiirustega alg-kultuuride supernatantides.

Kuigi tulemused on vastuolus minu oletustega, ei ole veel põhjust püstitatud

hüpoteesi kõrvale heita. Kaldun arvama, et eksperimendi ebaõnnestumise põhjuseks on

pigem metodoloogilised probleemid.

Üheks oluliseks probleemiks taoliste eksperimentide puhul on alg-kultuuri rakkude

eraldamine. Olli ja Trunov poolt läbi viidud eksperimendis, ning ka minu poolt varem

tehtud käesolevaga analoogilises katses P. parvum rakud eraldati filtreerimise abil.

Filtreerimine on efektiivne rakkude eraldamise viis, kuid probleemiks on see, et osa

filtrile jäävaid rakke võib puruneda. Selle tulemusena vabanevad vetika rakusisesed

toksiinid, tõstes kunstlikult filtraadi toksiinide sisaldust. Seda oletust kinnitavad minu

eelmise eksperimendi tulemused (andmed esitamata), kus katse-kultuuride

kasvukiirused olid negatiivsed praktiliselt kõikides (isegi madala rakutihedusega) alg-

kultuuride filtraatides. Antud probleemi vältimiseks kasutasin käesolevas katses

rakkude eraldamiseks tsentrifuugimist. Tsentrifuugimine on võrreldes filtreerimisega

vähem efektiivne viis rakuvaba kasvukeskkonna saamiseks, kuna teatud osa rakke jääb

supernatanti. Supernatandis olevad alg-kultuuri rakud võivad katse tulemust oluliselt

mõjutada, kuid seda mõju on praktikas võimatu arvestada. Kuna tegemist on ühe ja

sama liigiga, siis ei ole võimalik alg- ning katse-kultuuri rakke eristada, ning ei ole

teada, kui suur on alg-kultuuri rakkude kasvukiirus. Mida kõrgem on vastava alg-

kultuuri rakutihedus, seda rohkem rakke jääb arvatavasti supernatanti (minu katses oli

rakkude kontsentratsioon neljanda kultuuri supernatandis umbes 3-4 korda suurem, kui

ülejäänud kultuuride supernatantides). Võimalik, et see asjaolu ongi põhjustanud

olukorra, kus isegi madala rakutihedusega katse-kultuuride kasv kõrge rakutihedusega

22

alg-kultuuride supernatantides oli positiivne. Täheldatud kasv võis olla tingitud mitte

inokuleeritud katse-kultuuri kasvust, vaid alg-kultuuri rakkude kasvust. Üheks

võimalikuks viisiks nendest rakkudest lahti saada võiks olla tsentrifuugimise järgne

supernatandi filtreerimine.

Teiseks oluliseks probleemiks antud meetodi puhul on ümberkülviga kaasnev šokk

vetika rakkudele. Madalad kasvukiirused kõikides kasvukeskkondades (ka kontroll-

söötmes) esimesel päeval ning järsk kasvukiiruse suurenemine teisel päeval toetavad

oletust, et esimene katsepäev kulub rakkudel ümberkülvist saadud šoki ületamiseks.

Esimesel päeval mõõdetud kasvukiirused peegeldavad mitte ainult vetikate reageeringut

toksiinidele, vaid nende üldist reaktsiooni uuele kasvukeskkonnale. Seega tuleb esimese

päeva tulemuste hindamisel olla küllalt kriitiline. Toksiinide mõju hindamine teisel

päeval mõõdetud kasvukiiruste põhjal ei ole samuti päris korrektne, kuna toksiinid

lagunevad kiiresti. Teisel päeval mõõdetud kasvukiirused kajastavad pigem rakkude

taastumist nii ümberkülvamisel saadud šokist, kui ka toksiinide mõjust.

Fütoplanktilise allelopaatia uurimise põhiliseks probleemiks on standardse

metodoloogia puudumine selles valdkonnas. Kõikidel praegusel ajal kasutusel olevatel

meetoditel on oma tehnilised raskused, mis muudavad keeruliseks allelopaatia

mehhanismide eksperimentaalse uurimise. Tulevikus muutuvad ilmselt olulisteks

molekulaarsed uurimismeetodid, mis annavad võimaluse allelopaatiliste ühendite

ekspressiooni ja regulatsiooni protsessidest paremini aru saada (Legrand et al. 2003).

Loodetavasti saab võimalikuks ka auto-toksilisuse ning autotoksilisuse vastaste

immuunsusmehhanismide uurimine molekulaarsete meetodite abil.

23

Kokkuvõte

Allelopaatia nähtus on veeökosüsteemides ilmselt sama laialt levinud, kui maismaal,

mängides olulist rolli planktonikoosluse struktuuri ja funktsioneerimise kujundamises

(Wolfe 2000). Samas on allelopaatilised interaktsioonid fütoplanktoni koosluses

tunduvalt vähem uuritud, kui näiteks maismaataimede puhul. Veelgi vähem on teada

allelopaatiliste ühendite mõjust neid eritava organismi enda rakkudele (auto-

toksilisusest), ning iseenda toksiinide vastastest immuunsusmehhanismidest. Pole teada,

kas kaitsemehhanismid ekspresseeritakse pidevalt, või nende ekspressioon

indutseeritakse siis, kui suureneb auto-toksilisuse oht.

Käesoleva töö objektiks oli toksiline haptofüüt Prymnesium parvum, mille toksiinid

avaldavad kahjulikku mõju nii veeloomadele, kui ka teistele fütoplankteritele.

Mürgitades endaga ehituselt sarnaseid organisme, seab vetikas ohtu ka iseenda rakud.

Samas võib P. parvum looduses põhjustada väga kõrge rakutihedusega toksilisi

õitsenguid (Edvardsen ja Paasche 1998), järelikult on vetikas võimeline allelopaatilisi

ühendeid eritama ilma enda elulisi funktsioone oluliselt kahjustamata. Kuid arvatavalt ei

ole rakud toksiinide mõju eest pidevalt kaitstud. Varasemad eksperimendid näitasid, et

teatud tingimustel on vetika rakud tundlikud iseenda eksotoksiinide suhtes, nimelt need

rakud, mis on eelnevalt kokku puutunud vaid madala toksiinide kontsentratsiooniga,

lüüsuvad kõrge toksiinide sisaldusega keskkonnas (Olli ja Trunov 2005). Minu töö

eesmärgiks oli nimetatud eksperimenti edasi arendada ning uurida, kuidas mõjutab järk-

järguline toksiinide kontsentratsiooni suurenemine rakkude resistentsust nende suhtes.

Eeldasin, et aegamööda kasvav eksotoksiinide kontsentratsioon kasvukeskkonnas (mis

suureneb eelduse kohaselt koos rakutiheduse suurenemisega) indutseerib vetikarakkudel

toksiinide vastaste immuunsusmehhanismide ekspressiooni.

Eksperimendi käigus saadud tulemused on küllaltki vastuolulised, ning nende alusel

on raske järeldada püstitatud hüpoteesi õigsuse või vääruse kohta. Põhjuseks on

arvatavasti mitmed metodoloogilised probleemid, mis teevad allelopaatiat (s.h. ka auto-

toksilisust) külaltki keeruliseks uurimisvaldkonnaks. Tulevikus hakkavad loodetavasti

populaarsust koguma molekulaarsed allelopaatia uurimise meetodid (Legrand et al.

24

2003), mis aitavad muuhulgas ka auto-toksilisuse vastasteid kaitsemehhanisme paremini

mõista.

Summary Prymnesium parvum (Prymnesiophyceae) adaptation to auto-toxins

Allelopathy is a widely spread phenomenon both in terrestrial and marine

ecosystems. It plays an important role in phytoplankton communities, affecting their

structure and functioning (Wolfe 2000). However, allelopathic interactions among the

phytoplankton species are poorly understood. Even less is known about self-toxic

effects of algal toxins, and about defence mechanisms against self-toxicity. We do not

know if these defence mechanisms are expressed continuously, or they are induced

when the risk of self-toxicity increases.

The object of the present study was a toxic haptophyte alga Prymnesium parvum.

The toxins of this alga affect not only fish and other marine animals, but also co-

existing members of the phytoplankton community. By poisoning other organisms, the

cell structures of P. parvum itself are also at risk. As this alga produces high density

blooms (Edvardsen ja Paasche 1998), it is natural to assume some kind of protection

mechanisms against self-toxicity. Supposedly, these defence mechanisms are not

present continuously. The previous studies have shown that under certain conditions P.

parvum is sensitive to its own extracellular toxins. Cells that have previously grown in a

medium with low toxin concentration lyse in the medium with high toxin concentration

(Olli ja Trunov 2005). The aim of my work was to study the effect of gradually

increasing toxin concentrations on the resistance of the algal cells to its own toxins. My

assumption was that gradually increasing concentration of toxins in the medium induces

the expression of defence mechanisms in P. parvum cells.

The results of the present study do not allow to conclude, if my hypothesis was true

or false. The failure of the experiment was apparently caused by technical shortcomings

that make allelopathy a difficult subject to study experimentally. Molecular methods of

studying allelopathy will apparently become important in the future (Legrand et al.

25

2003). These new methods may help to better understand cell protection mechanisms

against self-toxicity.

Tänuavaldused

Tänan südamest oma juhendajat, kelle optimismi, kannatlikkuse ning igakülgse abita

poleks käesolev töö kunagi valminud. Suur aitäh ka emale ja sõpradele, kes mind töö

kirjutamise ajal igati toetasid. Tööd toetas ETF grant 6470.

26

Kasutatud kirjandus

Bjergskov, T., et al. (1990). Toksiske og potentielt toksiske alger i danske farvande. Boalch, G. T. (1987). "Recent blooms in the western English Channel." Rapports et Proces-verbaux des Reunions du Conseil international pour l´Exploration de la Mer 187: 94-97. Botsford, L. W., et al. (1997). "The management of fisheries and marine ecosystems." Science 277: 509-515. Brand, L. E. (1984). "The salinity tolerance of forty-six marine phytoplankton isolates." Estuar. Coast. Shelf Sci. 18: 543-556. Chang, F. H. (1985). Preliminary toxicity test of Prymnesium calathiferum n. sp. isolated from New Zealand. Toxic dinoflagellates. D. M. Anderson, A. W. White ja D. G. Baden. New York, Elsevier: 109-112. Charlson, R. J., et al. (1987). " Oceanic phytoplankton, atmospheric sulfur, cloud albedo and climate." Nature 326 655-661. Collins, M. (1978). "Algal toxins." Microbiol. Rev. 42: 725-746. Dafni, Z., et al. (1972). "Influence of light and phosphate on toxin production and growth of Prymnesium parvum." Journal of General Microbiology 70: 199-207. Edvardsen, B. ja E. Paasche (1998). Bloom dynamics and physiology of Prymnesium and Chrysochromulina. Physiological ecology of harmful algal blooms. D. M. Anderson, A. D. Cembella ja G. M. Hallegraeff. Berlin, Springer-Verlag: 193-208. EUROHAB (1999). Harmful algal blooms in European marine and brackish waters: 94. Fowden, L. ja P. J. Lea (1979). Mechanism of plant avoidance of autotoxicity by secondary metabolites, especially by nonprotein amino acids. Herbivores: their interactions with secondary plant metabolites. G. A. Rosenthal ja D. H. Janzen. New York, Academic Press: 135-160. Gentien, P., et al. (1995). "In situ depth profiling of particles sizes " Deep-Sea Research 42: 1297-1312. GEOHAB (2001). Global ecology and oceanography of harmful algal blooms. Baltimore and Paris: 86. Glibert, P. M., et al. (2003). The EU-US scientific initiative on harmful algal blooms, European Commission and U.S. National science foundation: 57.

Graham, L. E. ja L. W. Wilcox (2000). Algae, Prentice Hall. Granéli, E. ja N. Johansson (2003). "Effects of the toxic haptophyte Prymnesium parvum on the survival and feeding of a ciliate: the influence of different nutrient conditions." Mar. Ecol. Prog. Ser. 254: 49-56. Hallegraeff, G. M. (1993). " A review of harmful algal blooms and their apparent global increase." Phycologia 32: 79-99. Hamm, C. E. (1999). Studies on architecture, ecology and biogeochemistry of Phaeocystis colonies. Pelagic Ecosystems, Biological Oceanography, Universität Bremen. Hoek, C. v. d., et al. (1995). Algae. An introduction to phycology, Cambridge University Press. Hurley, D. E. (1982). "The "Nelson Slime". Observations on past occurrences." NZOI Oceanographic Summary 20: 1-13. Igarashi, T., et al. (1999). "Structures and partial stereochemical assignments for prymnesin-1 and prymnesin-2: potent hemolytic and ichthyotoxic glycosides isolated from the red tide alga Prymnesium parvum." J. Am. Chem. Soc. 121: 8499-8511. Johannesen, T., et al. (1991). "Effects of Chrysochromulina leadbeateri on reared salmon and natural fauna." Fisken og Havet 3: 103-119. Johansson, N. ja E. Granéli (1999). "Influence of different nutrient conditions on cell density, chemical composition and toxicity of Prymnesium parvum (Haptophyta) in semi-continuous cultures. ." J. Exp. Mar. Biol. Ecol. 239: 243-258. Jordan, R. W. ja J. C. Green (1994). " A check-list of the extant Haptophyta of the world." Journal of the Marine Biological Association of the United Kingdom 74: 149-174. Kawachi, M., et al. (1991). "The haptonema as a food-capturing device: observations on Chrysochromulina hirta (Prymnesiophyceae)." Phycologia 30: 563-573. Kell, V. ja B. Noack (1991). " Fischsterben durch Prymnesium saltans Massart im Kleinen Jasmunder Bodden (Rügen) im April 1990." J. Appl. Ichthyol. 7: 187-192. Kumari, A. ja R. K. Kohli (1987). "Autotoxicity of ragweed parthenium (Parthenium, Hysterophorus) " Weed Science 35: 629-632. Legrand, C., et al. (2003). "Allelopathy in phytoplankton—biochemical, ecological and evolutionary aspects " Phycologia 42: 406–419.

28

Lindholm, T. ja T. Virtanen (1992). "Bloom of Prymnesium parvum Carter in a small coastal inlet in Dragsfjärd, southwestern Finland." Env. Toxicol. Wat. Qual. 7: 165-170. Moestrup, Ø. (1994). "Economic aspects: ’blooms’, nuisance species, and toxins." The Haptophyte Algae: 265-285. Moran, A. ja A. Ilani (1974). "The effect of prymnesin on the electric conductivity of thin lipid membranes." J. Membr. Biol. 16: 237-256. Naylor, R. L., et al. (1998). "Nature's subsidies to shrimp and salmon farming." Science 282: 883-884. Nejstgaard, J. C. ja P. T. Solberg (1996). "Repression of copepod feeding and fecundity by the toxic haptophyte Prymnesium patelliferum." Sarsia 81: 339-344. Olli, K. ja K. Trunov (2005). Self-toxicity of Prymnesium parvum, Tartu University. Padan, E., et al. (1967). "Growth and colony formation of the phytoflagellate Prymnesium parvum Carter on solid media." Journal of Protozoology 14: 477-480. Paster, Z. (1968). "Prymnesin: the toxin of Prymnesium parvum Carter." Rev. Int. Oceanogr. Med. 10: 249-258. Paster, Z. K. (1973). Pharmacology and mode of action of prymnesin I. Cell biology: a series of monographs, marine pharmacognosy. Action of marine biotoxins at the cellular level. D. F. Martin ja G. M. Padilla. New York, Academic Press: 241-263. Paul, V. J. ja K. L. Alstyne (1992). "Activation of chemical defenses in the tropical green algae Halimeda spp " Journal of experimental marine biology and ecology 160: 191-203. Premazzi, G. ja L. Volterra (1993). Microphyte toxins. A manual for toxin detection, environmental monitoring and therapies to counteract intoxications. Luxembourg, Commission of the European Communities. Rahat, M. ja T. L. Jahn (1965). "Growth of Prymnesium parvum in the dark; note on the ichthyotoxin formation " Journal of protozoology 12: 246-250. Reich, K. ja I. Parnas (1962). "Effect of illumination on ichthyotoxin in an axenic culture of Prymnesium parvum Carter". Journal of protozoology 9: 38-40. Rogers, S. I. ja S. J. Lockwood (1990). " Observations on coastal fish fauna during a spring bloom of Phaeocystis pouchetii in the eastern Irish Sea." Journal of the marine biological association of the United Kingdom 70: 249-253. Scholin, C. A., et al. (2000). " Mortality of sea lions along the Central California coast linked to a toxic diatom bloom." Nature 403: 80-84.

29

30

Shilo, M. (1967). "Formation and mode of action of algal toxins." Bacteriological reviews 31: 180-193. Shilo, M. (1971). Toxins of Chrysophyceae. Microbiological toxins. S. S. Kadis, A. Giegler ja S. J. Ajl. New York, Academic Press: 67-103. Shilo, M. (1981). The toxic principles of Prymnesium parvum. The Water Environment. Algal Toxins and Health. W. W. Carmichael. New York Plenum Press: 37– 47. Skovgaard, A. ja P. J. Hansen (2003). "Food uptake in the harmful alga Prymnesium parvum mediated by excreted toxins " Limnology and Oceanography 48: 1161-1166. Smayda, T. J. (1990). Novel and nuisance phytoplankton blooms in the sea: evidence for a global epidemic. Toxic Marine Phytoplankton. E. Granéli, B. Sundström, L. Edler ja D. M. Anderson. New York, Elsevier Science Publishing: 29-40. Smayda, T. J. (1998). Ecophysiology and bloom dynamics of Heterosigma akashiwo (Raphidophyceae). Physiological ecology of harmful algal blooms. M. Anderson, A. D. Cembella ja G. M. Hallegraeff. Berlin, Springer-Verlag. 41: 113-131. Tillmann, U. (1998). "Phagotrophy by a plastidic haptophyte, Prymnesium patelliferum." Aquatic Microbial Ecology 14: 155-160. Ulitzur, S. ja M. Shilo (1970). "Procedure for purification and separation of Prymnesium parvum toxins." Biochim. Biophys. Acta 298: 673-679. Wink, M. (1997). "Compartmentation of secondary metabolites and xenobiotics in plant vacuoles." Advances in Botanical Research 25: 141-169. Wolfe, G. V. (2000). "The chemical defense ecology of marine unicellular plankton: constraints, mechanisms, and impacts " Biol. Bull 198: 225-244. Work, T. M., et al. (1993). Domoic acid intoxication of brown pelicans and cormorants in Santa Cruz, California. Toxic phytoplankton blooms in the sea. T. J. Smayda ja Y. Shimizu. Amsterdam, Elsevier science publishers: 643-650. Yariv, J. ja S. Hestrin (1961). "Toxicity of the extracellular phase of Prymnesium parvum cultures " Journal of General Microbiology 24: 165-175. Yasumoto, T., et al. (1990). Screening for hemolytic and ichthyotoxic components of Chrysochromulina polylepis and Gyrodinium aureolum from Norwegian coastal waters. Toxic marine phytoplankton. E. Granéli, B. Sundström, L. Edler ja D. M. Anderson. New York, Elsevier: 436–440.