Rakkude senesents ja immortaliseerumineOnkobioloogia

Taavi Päll lektor, TTÜ

2/41

Recap

p53 kontrollib rakkude jagunemist ja apoptoosiVastusena DNA kahjustustele või onkogeensele stressile p53 stabiliseeritakse ja indutseerubp53 märklaudgeenide ekspressioon, mille seas on rakutsükli inhibiitorid (p21cip1) japroapoptootilised valgud (BAX BH3 only).

Pilt: p21 and DNA damage signalling.

4/41

p53 on muteerunud kuni pooltes kasvajates

Andmed: IARC TP53 Database R17, November 2013. Petitjean A, Mathe E, Kato S, Ishioka C, Tavtigian SV, Hainaut P, Olivier M. Impact of mutant p53 functionalproperties on TP53 mutation patterns and tumor phenotype: lessons from recent developments in the IARC TP53 database.Hum Mutat. 2007 Jun;28(6):622-9.

5/41

Senesents ja immortalisatsioon

Rakkude jagunemispotensiaal koekultuuris onpiiratud

Pilt: Hayflick limit. Phase I is the primary culture; phase II represents subcultivated cells during the period of exponential replication. Phase III represents theperiod when cell replication ceases but metabolism continues. Cells may remain in this state for at least one year before death occurs.

7/41

Rakkude jagunemispotentsiaal langeb vanusega

8/41

Rakkude senesentsi võib põhjustada erinevat tüüpistress

9/41

Oksütatiivse stressi tingimustes (20% )kasvatatud rakud läbivad vähem pooldumisi.

Normaalsed epiteelirakud sõltuvadstroomarakkude toetusest. Kui inimeseeesnaha keratinotsüüte kasvatada puhtakultuurina ilma feederrakkudeta indutseerubneis kiirelt rakutsükli blokk läbi p16ink4aekspressiooni.

Koekultuuri stress indutseerib senesentsiO2

Pildid: Chen et al., 1995 , Fu et al., 2003 .

10/41

Onkogeenne Ras vajab transformeerimisekslisajõude

Onkogeenselt aktiveeritud Ras valgud on võimelised transformeerima immortaliseeritudhiire rakke (Der et al., 1982; Parada et al., 1982).

Kuid hiire embrüonaalsete fibroblastide transfekteerimine inimese ras onkogeeniga eimuuda neid tumorigeenseteks enne kui need rakud on koekultuuri adapteeritud jaimmortaliseerunud.

Selline immortaliseerumine saavutatakse ka siis kui viia rakku koos ras-iga sisse ka mõniteine lisa onkogeen, näiteks v-myc või c-myc, või SV40 suur-T antigeen.

Normaalsetel inimese rakkudel on koekultuuris piiratud eluiga (näiteks HUVEC rakkekasutatakse kuni 8 passeerimiseni) ja neil ei teki spontaanset immortaliseerumist (erinevalthiire-roti rakkudest).

·

·

·

·

11/41

p53 blokeerib Ras transformatsiooniNormaalsete inimese või hiire ja rotifibroblastide transformeerimisel H-RasV12-ga blokeerub nende rakkudejagunemine palju varem kui nadsaavutavad konfluentsuse.

See jagunemise blokk on pöördumatu(senesents) ja sellega kaasneb p53 jap21Cip1 ning p16INK4a valkudeakumulatsioon.

Rakkude minemist senesentsi on võimalikvältida kui p53 neutraliseerida, näiteksadenoviiruse E1A valgu transfekteerimisel.

·

·

·

Pilt: Serrano, 1997

12/41

Onkogeen indutseeritud senesentsOI senesents on tuumorsuppressor mehhanism mis toimib healoomulised kasvajates(onkogeensete radade aktivatsioon normaalsetes rakkudes põhjustas kiire jagunemisebloki).

Pahaloomulistes kasvajates on OI mehhanismid juba tasalülitatud (mutatsioonid p53-s ja RB-s, telomeraas).

Mutatsioonid K-ras, B-raf, PTEN ja NF1 geenis käivitavad rakkudel senesentsi ka in vivo.

In vivo andmed toetavad hüpoteesi, et senesents toimib tuumor-suppressor mehhanismina.

Onkogeenide põhjustatud senesents on aktiivne protsess ning pole põhjustatud replikatiivsepotentsiaali kadumisest (telomeerid on neis rakkudes ok!).

·

·

·

·

·

13/41

Premalignant lung adenomas induced by oncogenic K-ras are positive formarkers of senescence, whereas malignant adenocarcinomas are negative.

Pilt: Collado et al., 2004 .

14/41

HP1-beta ja PML valkudeakumuleerumine kromatiinileinitseerib DNA kahjustusteparandamise mehhanismid

OIS on põhjustatud DNA kahjustustestOnkogeenide poolt indutseeritud stress onpõhjustatud ka DNA kahjustuste poolt mison tekkinud kas

Senesentsi pöördumatuse tingivadulatuslikud kromatiinimodifikatsioonid(metülatsioon) mis väljenduvadheterokromatiinsete fookuste (senescence-associated heterochromatic foci) näol.

·

hapnikuradikaalidest (ROS) (Lee et al.,1999)või

ülemäärasest replikatsioonist(Bartkova et al., 2006).

-

-

·

Pilt: the-scientist.com

15/41

In vivo ja in vitro senesentsi markeridMARKER TEST

SA- -Gal histokeemia

p16INK4a WB, IHC

p15INK4b WB, IHC

p53 WB, IHC

ARF WB, IHC

p21 WB, IHC

SAHFs IF

DEC1 WB, IHC

DCR2 WB, IHC

WB, western blot. IHC, immunohistochemistry. IF, immunofluorescence. SAHFs, senescence-associated heterochromatic foci. DEC1,differentiated embryo-chondrocyte expressed. DCR2, decoy death receptor 2.

β

16/41

BRAF mutatsioonid lükkavad sünnimärgimelanotsüüdid senesentsi

Sünnimärgid (naevi) sisaldavad sagelionkogeenseid BRAF V600E mutatsioone.

Sellised sünnimärgid jäävad siiskikümneteks aastateks vaikeolekusse jaainult harva arenevad melanoomiks.

Pidev BRAFV600E ekspressioon inimesemelanotsüütides indutseerib rakutsüklibloki, mida iseloomustab p16INK4a jahappelise -galaktosidaasi ekspressioon(SA- -Gal).

·

·

·

ββ

Pilt: BRAFE600-associated senescence-like cell cycle arrest of human naevi.

17/41

Geenid mis indutseerivad senesentsiGEEN MUUTUS VÄHIS KONTEKST RAKUTÜÜP VÄHK/KUDE VIITED

Onkogeenid

Ras GOF mutatsioon mutantse alleeliekspressioon

HDF ja MEF* kopsu adenoomid; aterosklerootilisedkahjustused; rinnanäärme hüperplaasia

Serrano et al., 1997, Collado et al., 2005,Minamino et al., 2003, Sarkisian et al., 2007

Raf GOF mutatsioon mutantse alleeliekspressioon

HDF, MEF*,melanotsüüdid

kopsu adenoomid Dankort et al., 2007, Michaloglou et al., 2005

Akt GOF mutatsioon müristüleeritudalleeliüleekspressioon

endoteelirakudja MEF

Chen et al., 2005, Miyauchi et al., 2004

E2F1/3 amplifikatsioon üleekspressioon HDF ajuripatsi hüperplaasia Dimri et al., 2000, Lazzerini Denchi et al., 2005

Cyclin E amplifikatsioon üleekspressioon U20S Bartkova et al., 2006

mos translokatsioon/üleekspressioon

üleekspressioon HDF Bartkova et al., 2006

cdc6 üleekspressioon üleekspressioon HDF Bartkova et al., 2006

Tumorsuppressors

PTEN LOF mutatsioon inaktivatsioon MEF andIMR90

HG-PIN Chen et al., 2005, Courtois-Cox et al., 2006

NF1 LOF mutatsioon inaktivatsioon HDF dermaalne healoomuline fibroom Courtois-Cox et al., 2006

Lühendid: GOF, gain of function; HDF, human diploid fibroblast (IMR90 ja BJ); LOF, loss of function; MEF, murine embryonic fibroblast; HG-PIN, high-gradeprostatic intrapithelial neoplasia. MEF*: senesetsi indutseerimiseks on vajalik üleekspressioon. Tabel: Courtois-Cox, 2008

18/41

TelomeeridTelomeerid on DNA-valk kompleksid, mis stabiliseerivad lineaarsed kromosoomide otsad.

Imetajate telomeerid koosnevad 5-15 kb pikkustest TTAGGG kordusjärjestustest, mislõppevad 3' üheahelalise overhang-iga.

Telomeeride pikkuse säilitamise eest vastutab telomeeraas või alternative telomere length(ALT) korrastus-mehhanism, mis põhineb rekombinatsioonil (>10% vähirakkudel).

·

·

·

19/41

Kromosoomid millel puuduvad õiged otsad onebastabiilsed

1930.ndatel täheldasid Hermann Müller jaBarbara McClintock erinevust katkenudkromosoomide käitumise ja telomeeridevahel.

Hermann Müller leidis, et kromosoomidmillel puuduvad 'õiged' otsad onebastabiilsed.

McClintock leidis, et katkenud otsadfuseeruvad kuid mitte kromosoomid.

·

·

·

Pilt: Smithsonian Institution

20/41

Telomeeride tähtsus - fusion-bridge-breakageTelomeerid võimaldavad rakkudel eristada kromosoomi otsad katkenud DNAst.

DNA kahjustuse korral võib parandamine toimuda kahel viisil:

Telomeerid hoiavad ära NHEJ põhjustatud kromosoomide fusiooni.

NHEJ põhjustatud Fusion-bridge-breakage tsüklid viivad genoomse ebastabiilsuse tekkeni.

Telomeerid annavad rakule autonoomse mehhanismi jagunemistsüklite lugemiseks.

·

·

homoloogne rekombinatsioon (HR).

mittehomoloogne otste ühendamine (non-homologous end-joining, NHEJ).

-

-

·

·

·

21/41

Breakage-fusion-bridge cycle claymation - mitosis in cancer

22/41

Telomeeride pikkus määrab rakkude replikatiivsepotentsiaali

Pildid: Allsopp et al., 1992.

23/41

Telomeeride lühenemine lõppeb kriisiga ja võib põhjustadaimmortalisatsiooni

SV40 large-T transformeeritud inimese neeru fibroblastid (HEK) jagunevad kuni telomeeridelühenemiseni ~1.5 kb pikkusteks.

Lühenenud telomeerid põhjustavad rakkudes nö. kriisi, millest vähesed ellujäävad kloonidväljuvad immortaliseerununa.

Immortaliseerunud rakud ekspresseerivad telomeraasi.

·

·

·

Pildid: Counter et al., 1992.

24/41

Telomeeride lühenemine ehk "end replicationproblem"Telomeerid lühenevad iga raku jagunemisega S-faasis

DNA otste replikatsiooni probleem "end replication problem":

DNA polümeraasid vajavad replikatsiooni alustamiseks praimerit.

DNA replikatsiooniga jääb kromosoomi otstest 50-200 bp DNA lõik 3' otsast replitseerumata(3' overhang).

Rakud mille telomeerid on 10-12 kb pikad jagunevad 50-60 korda.

Rakud lähevad senesentsi kui telomeerid "kuluvad" 4-6 kb pikkusteks.

·

DNA replikatsioon on bidirektsionaalne.

DNA polümeraasid toimivad ühesuunaliselt.

-

-

·

·

·

·

25/41

Telomeeride erosioon toimib tuumor-suppressormehhanismina

Inimese rakkude immortaliseerumisel toimub alati ka telomeeride korrashoiu mehhanismikäivitamine kas telomeraasi üle-ekspressiooni või ALT mehhanismi käivitamise teel.

60-80% inimese vähkidest on telomeraas positiivsed, viidates et telomeeride erosioonivältimine on vähis sama tavaline kui Rb ja p53 inaktivatsioon.

Tüvirakkudes on telomeraasi aktiivsus madalam kui vähirakkudes ja paljudes normaalsetesjagunevates rakkudes puudub telomeraasi ekspressioon täielikult.

Siit võib järeldada, et telomeeride regeneratsioon on vähis hädavajalik vähirakkudejagunemispotentsiaali säilitamiseks.

·

·

·

·

26/41

Effects of DN-hTERT on cell proliferation.Clonal isolates analyzed are from cell linesLoVo a, HA-1 b, SW613 c, 36M d and GM847cells e; in order of initial telomere length fromshortest (LoVo) to longest (GM847). For eachcell line, two clones are shown expressing thecontrol retrovirus ( , ), WT-hTERT ( , ) orDN-hTERT ( , ).

Inhibition of telomerase limits the growth of humancancer cells

□ ■ ∘ ∙△ ▲

Ref.: Hahn et al., 1999.

27/41

Telomeraas ja ALT

Telomeraasi holoensüüm koosneb kahest konserveerunud komponendist:

Telomeraas (TERT), mis sisaldab telomeraasi pöördtranskriptaasi domääni ja

RNA TR (TERC), mis moodustab TERT-iga kompleksi ja toimib praimerina telomeersetekorduste sünteesil.

Lisaks on kompleksis ka dyskerin, mis stabiliseerib telomeraasi holoensüümi.

Mutatsioonid TERT, TR või DKC1 geenides põhjustavad inimesel telomeerseid sündroome.

·

·

·

·

Pilt: Armanios & Blackburn, 2012.

28/41

Telomeeride regeneerimise ALT mehhanismHomoloogne rekombinantsioon kus uustelomeerne DNA sünteesitakserekombinatsiooni ajal kõrval olevakromosoomi pealt.

Õdekromatiidide telomeeride ebavõrdnevahetus (unequal telomere sister chromatidexchanges (T-SCEs)). Tingitunatelemoeersetest kordusjärjestustest saabüks õdekromatiid rekombinatsioonisteiselt kromatiidilt rohkem materjali kui'vastu annab'. Tekkinud tütarrakkudestühes on telomeerid pikenenud, teiseslühenenud.

·

·

Pilt: Cesare & Reddel, 2010.

29/41

Telomeraas positiivsed kasvajad (%, keskmineja 95% usalduspiirid.)

STATE MEAN LOWER UPPER

benign 22.7 6.9 44.9

malignant 69.8 61.0 78.5

normal 17.8 7.3 30.8

Telomeraasi üle-ekpressioon vähis

Andmed: Shay, J. W. & Bacchetti, S. A survey of telomerase activity in human cancer. Eur. J. Cancer 33, 787–791 (1997).

30/41

Telomeeride otsas on sõlmTelomeersele DNA-le seostubvalgukompleks nimega shelterin.

Inimese shelterin kompleks koosnebkuuest valgust: telomere repeat bindingfactor 1 (TRF1), TRF2, repressor/activatorprotein 1 (RAP1), TRF1-interacting nuclearprotein 2 (TIN2), TIN2-interacting protein 1(TPP1) ja protection of telomeres 1 (POT1).

Telomeerne DNA moodustab suure lingu tloop-i, mille 3' overhang ots paardubtelomeeri kordusjärjestustepaarisahelalise osaga.

TRF2 indutseerib t loop struktuurimoodustamise in vitro ja ka tema in vivofunktsioon vastab t loop-ide .

·

·

·

·

Pilt: Karlseder, 1999

31/41

T-loop

32/41

TRF valgudTRF1 reguleerib telomeeride pikkust.

TRF2 vastutab selle eest, et telomeerid oleksid vinks-vonks korras.

TRF2 inhibitsioon põhjustab 3' overhang-i kadumise telomeeri otsast ja viib kromosoomiotste fuseerumiseni.

·

TRF1 on seotud negatiivse tagasisidega, seostub otse telomeeridele ja supresseeribtelomeeride elongatsiooni.

pikaajaline TRF1 üle-ekpressioon telomeraas-positiivetes HT1080 vähirakkudespõhjustas telomeeride lühenemise.

-

-

·

·

33/41

TRF2 kaitseb inimese telomeere otsipidi kokkufuseerumastMuteerunud DNA sidumise domääniga TRF2 (TRF2ΔBΔM) ekspressioon rakkudes viib otsipidifuseerunud kromosoomide tekkeni.

Anafaasi rakud, milles on TRF2ΔBΔM-indutseeritud anafaasi sillad ja lohisev kromosoom(vasakpoolne rakk). DNA on värvitud DAPI-ga.

Pilt: van Steensel, 1998

34/41

Telomeeride avanemine ja lühenemine indutseeribapoptoosi

TRF2 seostumine TTAGGG kordustele maskeerib kromosoomi otsad DNA kahjustustekontrolli mehhanismi eest.

TRF2 inhibitsioon põhjustab kiire ATM/p53–sõltuva DNA kahjustuse kontrollpunktiaktivatsiooni, rakutsükli arresti ja suunab rakud apoptoosi.

Katmata kromosoomi otsad mis tekivad TRF2 funktsiooni inhibeerimisel seostuvad DNAkahjustuste kontrolli valkudega 53BP1, -H2AX, Rad17, ATM ja Mre11.

·

·

·γ

35/41

Increased Incidence of Skin Lesions, Alopecia,and Hair Graying in Aging mTR−/− Mice

Hiirte telomeeridHiirtel on kolm korda pikemad telomeeridkui inimestel, samas on nende eluigalühike.

TR knockout-hiired ei ole resistentsedtumorigeneesile.

mTR null hiirel lühenevad telomeerid 4–5kb generatsiooni kohta.

Võrreldes esimese generatsiooniloomadega oli kolmanda (G3) ja kuuenda(G6) generatsiooni hiirtel probleemehaavade paranemisega, hematopoeesiga,neil oli suurem kasvajate intsidents jalühem eluiga.

·

·

·

·

Pilt: Rudolph, 1999

36/41

Kaplan–Meier analysis of tumour incidence inp53 mutant mice divided on the basis ofgeneration of telomerase deficiency.

Telomere attrition in ageing telomerase-deficient p53 mutant mice promotes thedevelopment of epithelial cancers by aprocess of fusion-bridge breakage that leadsto the formation of complex non-reciprocaltranslocations—a classical cytogeneticfeature of human carcinomas.

Telomere dysfunction promotes non-reciprocal translocations and epithelialcancers in mice

Pilt: Artandi et al., 2000.

37/41

Higher frequency of anaphase bridges in UC progressors. a, Representativeimages of anaphase bridges in the colon. b, Occurrence of anaphasebridges in non-UC controls, UC non-progressors and UC progressors,expressed as a percentage of the total cell number. Bars indicate groupmeans plusminus s.e.m.

Põletiku ja vähi seos: lühenenud telomeeridPõletikuline soolehaigus (ulcerative colitis) on seotud kõrge kolorektaalvähi riskiga ja sedatingituna genoomsest edastabiilsusest.

Telomeeride pikkus korreleerub kromosomaalse ebastabiilsusega selles vähieelsesseisundis.

Soolehaigete patsientide käärsoole epiteelis kellel on vähikolded juba välja arenenudesinevad anafaasi sillad (BFB tunnus) ja muud kromosoomi aberratsioonid.

·

·

Ref: O'Sullivan et al., 2002.

38/41

Telomeerid vähi arengus

Pilt: Skirball Institute of Biomolecular Medicine.

39/41

Lingid teistele loengutele

Sissejuhatav loeng

Vähitüübid

Onkoviirused

Onkogeenid

Retseptorid

Signaalirajad

Tuumor-suppressorgeenid

Rakutsüklikontroll

·

·

·

·

·

·

·

·

p53 ja apoptoos

Immortalisatsioon

Tumorigenees

Genoomiterviklikkus

Mikrokeskkond

Metastaasid

Immuunsus

Vähiravimid

·

·

·

·

·

·

·

·

41/41