saggi biochimici per la valutazione dellattività di ligandi in linee cellulari interfase fase g 1 :...
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Saggi biochimici per la valutazione dell’attività di ligandiin linee cellulari
Interfase
Fase G1: sintesi dei componenti cellulari
Fase S: duplicazione del materiale genetico
Fase G2: sintesi dei materiali necessari alla successiva mitosi.
Il ciclo cellulare è composto fondamentalmente da due parti: l’interfase e la mitosi.
Il processo mitotico è costituito da 4 fasi:Profase, Metafase,
Anafase, Telofase
Le cellule normali non hanno la capacità di proliferare
indiscriminatamente a causa di alcuni geni ubiquitari ad azione
repressiva: p53 e Rb.
Il gene p53 viene così chiamato in quanto codifica per una
proteina di 53 kDa associata alla cromatina e alla matrice
nucleare di cellule normali e tumorali.
La sua entrata nel nucleo è mediata da proteine chaperon in
particolare la Hsp70 (heat shock protein).
A questo punto si aprono due possibilità: se la riparazione è
produttiva il ciclo cellulare può riprendere e la cellula
sopravvive; nel caso in cui il danno sia irreparabile, p53
promuove l’apoptosi della cellula.
Il gene p53 viene considerato un tumor suppressor gene in
quanto la sua attività è in grado di arrestare la progressione del
ciclo cellulare nella fase G1, favorendo la riparazione del DNA
danneggiato.
Riparazione
La proteina p53 è una DNA-binding protein in grado di
riconoscere un motivo simmetrico di 10 bp e di attivare la
trascrizione dei geni.
L’innesco dell’apoptosi può avvenire mediante attivazione
ligando Fas-L con il suo recettore Fas. Il recettore Fas è una
proteina presente sulla membrana plasmatica appartenente alla
famiglia dei recettori del TNF-NGF. Quando lega il suo ligando
induce apoptosi:
Fas
Se la riparazione non ha successo s’innesca il meccanismo di apoptosi
Nell’uomo i processi apoptotici sono coinvolti in:
- sviluppo embrionale
- sviluppo del sistema nervoso centrale
- atrofia tissutale endocrino-dipendente
- turn-over cellulare
In numerosi processi patologici, quali infezioni virali (AIDS),
tumori, e malattie autoimmuni, una deregolazione
dell’apoptosi può essere la base o una delle cause della
patogenesi della malattia.
Induzione dell’apoptosi
- radiazioni ionizzanti
- legame del recettore Fas con il suo ligando Fas-L
(vedi percorso 1 e percorso 2)
- rimozione dal mezzo di coltura dei fattori di crescita
- riduzione della disponibilità di ATP
- aumento di Ca++ citoplasmatico
percorso 1
su queste proteine si aggancia la caspasi 8 che attiva a
cascata le altre caspasi fino alla caspasi 3 la quale produce
idrolisi dei substrati citosolici e nucleari.
dopo il legame si ha oligomerizzazione del recettore Fas
che provoca il reclutamento di proteine citosoliche
FADD/MORT ad attività adattatrice;
Dall’idrolisi della sfingomielina si generano i ceramidi i quali
inducono apoptosi nelle cellule emopoietiche mediante il
ganglioside GD3.
L’apoptosi da GD3 sembra agire a valle delle caspasi in
quanto non può essere bloccata da inibitori specifici delle
caspasi.
percorso 2
L’interazione recettoriale porta all’attivazione di una
fosfolipasi C specifica per la fosfatidilcolina e di una
sfingomielinasi acida.
percorso 3 (mitocondriale)
La caspasi 8 ha come substrato il bid (BH3 interacting domain
death agonist). Il prodotto di idrolisi del bid indicato come t-bid
entra nei mitocondri e genera oligomerizzazione dei fattori pro-
apoptotici Bax e Bak che portano alla fuoriuscita dal
mitocondrio del citocromo c che è il cofattore dell’APAF-1
(Apoptotic Protease Activating Factor 1) che attiva la caspasi
9 che poi porta all’attivazione della caspasi 3 e al taglio dei
substrati cellulari.
Fattori pro-apoptotici: bax, bad, bak
Fattori antiapoptotici: bcl-2, bcl-xL
L’apoptosi può essere indotta da ligandi che
interagendo su recettori specifici portano all’innesco
in seguito ad aumento di Ca++ citoplasmatico.
La caratterizzazione di questi recettori, la loro
funzione regolatrice all’interno della cellula
costituisce un metodo di valutazione dell’attività di
ligandi verso questi recettori.
Lattato PiruvatoLDH
NAD NADH
ResazzurinaResorufinaDiaforasi
560 nm
590 nm
Dosaggio LDH
Studio Citotossicità
Monitoraggio dell’apoptosi
Dosaggio delle CaspasiCysteinyl Aspartate Specific Proteinases
Colorimetrico Fluorimetrico
Le caspasi sono delle cisteino-proteasi in grado di tagliare i
substrati dopo un residuo di aspartato.
Attualmente sono note 10 tipi di caspasi e la più studiata è la
caspasi 3.
La caspasi 3 è normalmente presente in forma inattiva, come
pro-caspasi la quale proteoliticamente viene attivata.
La caspasi 3 è in grado di tagliare il poli-ADP-ribosio-
polimerasi (PARP) un enzima coinvolto nella riparazione del
DNA.
Dalla mappatura del sito di taglio del PARP è stato identificato
un tetrapeptide DEVD come sito dell’attività caspasica.
La coniugazione del DEVD con un residuo colorimentrico o
fluorimentrico costituisce il substrato per il dosaggio della
caspasi presente.
Induzione di apoptosi
Attivazione della caspasi1
caspasi3
DEVD-AFC
pNA = p-nitroanilide ; AFC = 7-ammino-4-trifluorometilcumarina
DEVD-pNA
DEVD
-pNA -AFC
DEVD
rivelazione fluorimetricarivelazione colorimetrica
Dosaggio della Annexina V
L’annexina V è una proteina con forte attività anticoagulante
che ha elevata affinità calcio-dipendente per amminofosfolipidi.
La fosfatidilserina è localizzata dalla parte interna della
membrana cellulare, mentre mediante trasporto attivo durante
l’apoptosi viene a trovarsi sul lato esterno della membrana
cellulare.
L’annexina V in presenza di Ca++ ha elevata affinità per la
fosfatidilserina.
Legando all’annexina V un residuo fluorescente come il
fluorescein isotiocianato (FITC) è possibile misurare la quantità
di fosfatidilserina presente sul lato esterno della membrana
cellulare.
citoplasma
FICTAnnexina V
Ca++Ca++
fosfatidilserina
esterno
interno
Dosaggio MTT bromuro di 3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difenil tetrazolio
MTT(giallo)
mitocondrio
Formazano
Colore (azzurro)
MTT