sítio de seqüência dirigida (sequence-tagged sites) sequence-tagged microssatélites (stms) ou...
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Sítio de Seqüência Dirigida(Sequence-tagged sites)
• Sequence-Tagged Microssatélites (STMS) ou SSR ou Microssatélites
• Microssatélites ancorados– Inter-Simple Sequence Repeat (ISSR)
• Sequence-characterized amplified regions (SCARs)
• Cleaved amplified polymorphic sequence (CAPS)
Fonte: IPGRI
Microssatélites (SSR)
• Sequence-Tagged Microsatélites (STMS)– também conhecido como microssatélite
ou Simple Sequence Repeat (SSR)
• Normalmente locus simples e multi-alélico
• Co-dominante• Altamente reprodutível
Microssatélites (SSR)
• altamente informativo - vários alelos por locos
• detecção por PCR• facilmente transferível entre labs.• distribuição homogênea no genoma
Microssatélites (SSR)ACTTCATTAA TGTCTTAGGT GGCAGAATAC TTTGATGCAA CAATTTCAAG GGGTGCTGAC ATTAAGTTGG CTGCCAATTG
GATAATGGGT GATATTGCTG CCTATATGAA AAATGAAAAG CTTTCTATTA ATGAGATCAA ACTTATGCCA GAAGAGCTAG
TAGAGCTGAT AGCTTCCATT AAAGGTGGGA CTATCAGTGG AAAGATTGGA AAGGAGGTAA GCATTTGCTT CTTTNACTGA
TGCCACTTTC ATGTTCAAAC ATTTGTTAGT AATCCTGTCT ATTTATTTTC ATGGAAGAAT TTTACTAGCT ATTATTCTCC
ACTGTGTAGA TGTGATTTTA TAGTTTGTTT GGATATATAA TTATTGTTCG TGTTTTTTTT TTTAATCCAA ACTTTATAAT
CTTTCCAAGT GCTTTTCTCC TCCCTGTCTT TTTCCTCTAC CACACACACA CACACACACA CACACTCATA CAGAAAAAGG
AAAAAGGAAA GAAAGAGAAC AGGAGATATA AAAACCTTTT TTCTTTATCA ATTAGATAAT TAGTTATAAA AGTTTTTCTC
CTGCTTCTTA TCCCTCCGCT AAATGCCTGA TTAACTTTCT GCTGGTAAAG ATTTAAAATA ACTTGTTAAT TTTGGACATG
NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN CACACACACACACACACAC NNNNNNNNN NNNNN
NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN GTGTGTGTGTGTGTGTGTG NNNNNNNNNNNNNN
Primer REV
Primer FOR
Repetição CA
MicrossatélitesBananeira 3x e 4x
Ma 1.27Ma 1.17
MicrossatélitesBananeira 3x e 4x
Cir 24.25
MicrossatélitesBananeira 2x
Cir 24.25
SCARs• SCARs - sequence-characterised
amplified regions– proposto por Paran & Michelmore (1993)– marcador locus-único derivado de
fragmentos sequenciados de RAPD, ISSR, AFLP
– maior estabilidade - primers específicos– analisado para presença/ausência– possibilidade de simplificação de análise e
automação
SCARsR
*
S
clonar
ACTTCATTAA TGTCTTAGGT GGCAGAATAC TTTGATGCAA CAATTTCAAG GGGTGCTGAC ATTAAGTTGG CTGCCAATTG
GATAATGGGT GATATTGCTG CCTATATGAA AAATGAAAAG CTTTCTATTA ATGAGATCAA ACTTATGCCA GAAGAGCTAG
TAGAGCTGAT AGCTTCCATT AAAGGTGGGA CTATCAGTGG AAAGATTGGA AAGGAGGTAA GCATTTGCTT CTTTNACTGA
TGCCACTTTC ATGTTCAAAC ATTTGTTAGT AATCCTGTCT ATTTATTTTC ATGGAAGAAT TTTACTAGCT ATTATTCTCC
ACTGTGTAGA TGTGATTTTA TAGTTTGTTT GGATATATAA TTATTGTTCG TGTTTTTTTT TTTAATCCAA ACTTTATAAT
CTTTCCAAGT GCTTTTCTCC TCCCTGTCTT TTTCCTCTAC CACACACACA CACACACACA CACACTCATA CAGAAAAAGG
AAAAAGGAAA GAAAGAGAAC AGGAGATATA AAAACCTTTT TTCTTTATCA ATTAGATAAT TAGTTATAAA AGTTTTTCTC
CTGCTTCTTA TCCCTCCGCT AAATGCCTGA TTAACTTTCT GCTGGTAAAG ATTTAAAATA ACTTGTTAAT TTTGGACATG
Primer específico Seqüenciar
SCAR - FeijoeiroROC20460
SCAR - FeijoeiroSCF3
Amplified Fragment Length Polymorphism -
AFLP
• Combinação de RFLP e PCR• Resulta em padrões muito
informativos• Marcador dominante
DNA genômico digestão com duas enzimas
adaptadores
EcoRIMseI
pré-amplificação
amplificação seletiva
ligação
MseI
EcoRI
GAATTCCNCTTAAGCN
NTTAANAATT
ATTCCNGCN
NTNAAT
DNA
digestãoEcoRI MseI
ATTCCNGCN
NTN ATTAAligação
TA
ATTCCNTAAGCN
NTTANAAT
pré-amplificaçãoprimer +1
A
C
amplificaçãoprimer +3
ATTCCATAAGCT
GTTACAAT
AAC
AAC
Exemplo - Gel de AFLP
AFLP de cana com 33P
AFLP de cana com 33P
AFLP de feijãogel desnaturante corado com
prata
AFLP de feijãogel não desnaturante e prata
Primers E- ACA x M- CAA
PBN N
Primers E- AGC x M- CTC
PBN N
AFLP
COMPARAÇÃO ENTRE MARCADORES MOLECULARES
Escolha de MarcadoresCaracterística RFLP RAPD SSR AFLP ISSR CAPS Polimorfismo Pontual Pontual # Pontual Pontual Pontual
InDel InDel Rep. InDel InDel InDel Nível dePolimorfismo médio médio alto médio médio baixo
Abundância alta m.alta média m.alta média alta
Dominância CoDom Dom CoDom Dom Dom CoDom
[DNA] 10 g 25 ng 50 ng 500 ng 25 ng 25 ng
Seqüência não não sim não não sim
Marcação sim/não não não sim/não não não Repetibilidade alta baixa alta média baixa alta
Escolha de MarcadoresCaracterística RFLP RAPD SSR AFLP ISSR CAPS
Informação/Corrida 0-3 0-4 0-2 0-30 0-20 0-2
Patenteado não sim não sim não não
Investimento alto baixo alto médio baixo alto
Custo médio baixo alto médio baixo médio
Karp 96 US$ 2,00 1,00 1,00 1,50 nd. nd. Risterucci 97 FF/100 ind. 3,14 1,71 3,21 1,10 nd. nd.