slovenskÁ po ĽnohospodÁrska univerzita v...

SLOVENSKÁ POĽNOHOSPODÁRSKA UNIVERZITA

V NITRE

FAKULTA BIOTECHNOLÓGIE A POTRAVINÁRSTVA

2123775

DÔKAZ BAKTÉRIÍ LISTERIA MONOCYTOGENES V POTRAVINÁCH

2011 Bc. Andrej Stolár

SLOVENSKÁ POĽNOHOSPODARSKA UNIVERZITA

V NITRE

FAKULTA BIOTECHNOLÓGIE A POTRAVINÁRSTVA

DÔKAZ BAKTÉRIÍ LISTERIA MONOCYTOGENES V POTRAVINÁCH

Diplomová práca

Študijný program: Technológia potravín

Študijný odbor: 4170800 Spracovanie poľnohospodárskych

produktov

Školiace pracovisko: Katedra hygieny a bezpečnosti potravín

Školiteľ: MVDr. Ľubomír Lopašovský, PhD.

Konzultant: MVDr. Pavel Popelka

Nitra 2011 Bc. Andrej Stolár

Čestné vyhlásenie

Podpísaný Andrej Stolár vyhlasujem, že som diplomovú prácu na tému „Dôkaz

baktérií Listeria monocytogenes v potravinách“ vypracoval samostatne s použitím

uvedenej literatúry.

Som si vedomý zákonných dôsledkov v prípade, ak uvedené údaje nie sú

pravdivé.

V Nitre 10. apríla 2011

Bc. Andrej Stolár

Poďakovanie

Touto cestou vyslovujem poďakovanie MVDr. Ľubomírovi Lopašovskému,

PhD. a MVDr. Pavlovi Popelkovi za pomoc, odborné vedenie, cenné rady

a pripomienky pri vypracovávaní mojej diplomovej práce.

Zároveň ďakujem mojej rodine a priateľke za pomoc a morálnu podporu počas

celého môjho štúdia.

Abstrakt

Bezpečnosť potravín je v súčasnej dobe asi najviac skloňovaným slovným

spojením pri výrobe potravín. Jedným z najvýznamnejších patogénnych

mikroorganizmov, ktorý ovplyvňuje bezpečnosť potravín je Listeria monocytogenes.

Cieľom diplomovej práce bolo vyšetrenie rôznych vzoriek potravín a pokrmov na

prítomnosť baktérií Listeria monocytogenes. Vyšetrenie spočívalo v diagnostike rodu

Listeria a následnej identifikácii druhu v rôznych druhoch potravín. Po úprave

vzoriek sme na diagnostiku použili referenčnú horizontálnu metódu (STN EN ISO

11290 – 1:1996), ktorou sme zistili prítomnosť, resp. neprítomnosť, rodu Listeria. Pri

výskyte pozitívnej vzorky sme následne vykonali identifikáciu testom API Listeria,

ktorým sme určili druhovú špecifikáciu. Vyšetrených bolo 100 vzoriek rôznych

potravín, pričom v 6 vzorkách sme identifikovali Listeriu monocytogenes. Všetky

vzorky, v ktorých sme baktériu identifikovali, boli zaradené do skupiny

lahôdkárskych výrobkov. Listeria monocytogenes je pôvodcom alimentárneho

ochorenia nazývaného listerióza. Toto ochorenie postihuje nielen zvieratá, ale aj ľudí,

a preto je veľmi dôležité sledovať výskyt tohto patogénu v potravinách.

Kľúčové slová: Listeria monocytogenes, listerióza, horizontálna metóda, API

Listeria

Abstract

Nowadays, the main issue of food production is food safety. One of the most

important pathogenic microorganism which affects the food safety is Listeria

monocytogenes. The aim of this thesis was to examine various food samples for

bacteria of the Listeria monocytogenes. The examination consisted of a diagnosis of

the genus Listeria and subsequent identification of species in the different types of

food. After adjusting of samples we used the reference horizontal method (STN EN

ISO 11290 – 1:1996) for diagnostic of the presence respectively absence of the

microorganism Listeria. When the result was positiv we conducted the additional test

- API Listeria for further identification of the generic specification. We tested 100

samples of grande range of food, where 6 out of them were positive for the presence

of the Listeria monocytogenes. All samples in which the bacterium was identified,

were from group delicatessen. Listeria monocytogenes is originator a foodborne

disease called listeriosis. Not only animals are affected by this disease, but also

humans so it is very important to monitor the presence of the pathogen in food.

Key words: Listeria monocytogenes, listeriosis, the horizontal method, API Listeria

Obsah

Obsah ............................................................................................................................... 6

Zoznam ilustrácií ............................................................................................................ 7

Zoznam tabuliek ............................................................................................................. 8

Zoznam skratiek a značiek ............................................................................................. 9

Úvod ............................................................................................................................... 11

1 Prehľad o súčasnom stave riešenej problematiky doma a v zahraničí .............. 12

1.1 História objavenia baktérií rodu Listeria ............................................................. 12

1.2 Taxonómia baktérií rodu Listeria ........................................................................ 13

1.3 Charakteristika druhu Listeria monocytogenes ................................................... 14

1.3.1 Morfológia druhu L. monocytogenes ........................................................... 14

1.3.2 Biochemické vlastnosti ................................................................................ 15

1.3.3 Intracelulárny parazitizmus L. monocytogenes ............................................ 18

1.3.4 Výskyt baktérie L. monocytogenes v prostredí a potravinách ..................... 19

1.4 Listerióza – charakteristika ochorenia ................................................................. 21

1.4.1 Zdroj nákazy ................................................................................................ 21

1.4.2 Vznik, vývoj a prejavy ochorenia ................................................................ 22

1.4.3 Prevencia ...................................................................................................... 24

1.4.4 Diagnostika a liečba ..................................................................................... 25

1.4.5 Prognóza ochorenia ...................................................................................... 25

1.4.6 Výskyt a trend listeriózy na území SR ......................................................... 26

2 Cieľ práce ................................................................................................................. 27

3 Metodika práce a metódy skúmania ..................................................................... 28

3.1 Horizontálna metóda STN EN ISO 11290 - 1:1996 ............................................ 28

3.2 API Listeria ......................................................................................................... 33

4 Výsledky práce a diskusia ...................................................................................... 39

Záver .............................................................................................................................. 55

Zoznam použitej literatúry .......................................................................................... 56

Prílohy ............................................................................................................................ 61

7

Zoznam ilustrácií

Obr. 1 Očkovanie a vyhodnotenie misiek so skúškou CAMP (STN EN ISO 11290 – 1:1996) ....................................................... 17

Obr. 2 Intracelulárny parazitizmus a životný cyklus L. monocytogenes (Tóth a Beličková, 1997) .................................................... 19

Obr. 3 Schematické znázornenie patofyziológie infekcie spôsobenej listériami (Vázquez-Boland et al., 2001) ....................................... 23

Obr. 4 Výskyt listeriózy na území SR za posledných 20 rokov (EPIS, 2011) ....................................................... 26

Obr. 5 Trend listeriózy na území SR za posledných 20 rokov (EPIS, 2011) ....................................................... 26

Obr. 6 Schematické znázornenie dôkazu Listeria monocytogenes (STN EN ISO 11290 - 1:1996) ....................................................... 31

Obr. 7 Vzor výsledkovej tabuľky (bioMérieux, 2007) ................................................ 37

Obr. 8 Identifikácia pozitívnej vzorky č. 11 pomocou testov API Listeria ....................................................... 52






Obr. 14 Listeria monocytogenes, mikroskopický pohľad (URL 5, 2009) ....................................................... 61

Obr. 15 Listeria monocytogenes, pohľad elektrónovým mikroskopom (URL 1, 2011) ....................................................... 61

Obr. 16 Automatický dávkovací prístroj DILUMAT 3 mk 2 ..................................... 62

Obr. 17 Stojan so vzorkou ....................................................... 62

Obr. 18 Kolónie L. monocytogenes na krvnom agare .................................................. 63

Obr. 19 Kolónie L. monocytogenes na agare ALOA .................................................... 63

Obr. 20 Testovací prúžok API Listeria ....................................................... 64

Obr. 21 Testovací prúžok API Listeria (URL 3) ....................................................... 64

8

Zoznam tabuliek

Tab. 1 Klasifikácia listérií podľa kultivačných vlastností a biochemických znakov (Greenwood et al., 1999) .......................................... 16

Tab. 2 Odčítacia tabuľka pre test API Listeria (bioMérieux, 2007) ......................... 35

Tab. 3 Tabuľka číselných profilov pre test API Listeria (bioMérieux, 2007) ....................................................... 36

Tab. 4 Identifika čná tabuľka pre test API Listeria (bioMérieux, 2007) ....................................................... 38

Tab. 5 Kritéria bezpečnosti potravín (Nariadenie Komisie (ES) č. 1441/2007 z 5. decembra 2007, ktorým sa mení a dopĺňa nariadenie (ES) č. 2073/2005 z 15. novembra 2005 o mikrobiologických kritériách pre potraviny) ................................................... 41

Tab. 6 Laboratórne vyšetrenie potravín ....................................................... 44

9

Zoznam skratiek a značiek

L. Listeria

S. Staphylococcus

R. Rhodococcus

CAMP - test Christie, Atkins, Munch, Petersen

N nieje známe

R rôzne reakcie

InlA internalín A

InlB internalín B

p60 dominantný extracelulárny proteín

listérií

Mpl metaloproteáza

LLO listeriolyzín O

PI-PLC fosfatidylinozitol fosfolipáza C

ActA actin assembly protein

PlcB lecitináza

aw aktivita vody

KTJ kolónie tvoriace jednotku

PPOVÚ potraviny pre osobitné výživové

účely

PT polotovar

PP príloha pokrmu

ČZ čerstvá zelenina

SS sladké syry

HACCP hazard analysis and critical control

points - analýza nebezpečenstiev

a kritické kontrolné body

10

ISO International Organization for

Standardization – Medzinárodná

Organizácia pre Štandardizáciu

ALOA agar Listeria podľa Ottavianiho

a Agostiho

DIM enzymatický substrát

ESC Eskulín

αMAN 4-nitrofenyl-αD-mannopyranosid

DARL D-ArabitoL

XYL D-Xylóza

RHA L-Rhamnóza

MDG Methyl-αD-glukopyranosid

RIB D-Ribóza

G1P Glukóza-1-fosfát

TAG D-Tagatóza

n počet jednotiek tvoriacich vzorku

c počet jednotiek vzorky s hodnotami

nad m alebo medzi m a M

11

Úvod

Vo svete, ktorý sa riadi hlavne peniazmi, má zrejme každý spotrebiteľ záujem

kúpiť kvalitnú, bezpečnú potravinu. Takáto potravina musí spĺňať najprísnejšie

kritéria, ktoré sú dané legislatívou. Akékoľvek porušenie týchto kritérií má za následok

zníženie kvality potraviny, v horšom prípade vznik nežiaducej kontaminácie, čo vedie

k zníženej bezpečnosti potraviny.

Mikroorganizmy sú odbornou verejnosťou považované za najnebezpečnejšie

kontaminanty. Je to aj preto, lebo je vysoko nepravdepodobné, že by sme sa ich mohli

niekedy úplne zbaviť. Za nebezpečné sa považujú najmä patogénne a podmienečne

patogénne mikroorganizmy.

Listeria monocytogenes sa považuje za mimoriadne významný patogénny

mikroorganizmus, pretože môže rásť aj pri chladničkových teplotách. Je povôdcom

vzácneho a nebezpečného alimentárneho ochorenia, ktoré postihuje nielen ľudí, ale

i zvieratá, nazývaného listerióza.

Kontaminácia potravín baktériou Listeria monocytogenes môže nastať v rôznych

stupňoch procesu výroby, skladovania, doprave, manipulácie a podobne. Podstatnú

úlohu tu zohrávajú zamestnanci potravinárskeho podniku, pretože častokrát sú oni

príčinou kontaminácie potraviny.

Keďže Listeria monocytogenes je ubikvitárna baktéria, sú preto jej primárnymi

zdrojmi hlavne voda, pôda, vtáky a iné zvieratá, ako aj fekálie. Najčastejšie

kontaminovanými potravinami sú mäsové, rybie a mliečne výrobky, lahôdkárske

4a cukrárske výrobky, zelenina.

Výskyt baktérie Listeria monocytogenes je v potravinách nežiaduci, a preto je

veľmi dôležité, aby sa jej prítomnosť v potravinách kontrolovala.

12

1 Prehľad o súčasnom stave riešenej problematiky doma

a v zahraničí

1.1 História objavenia baktérií rodu Listeria

V roku 1911 švédsky vedec, neskôr profesor v obore hygiena potravín, Hülpers,

izoloval baktériu z nekrotických ložísk pečene králika. Zistil, že baktérie sú patogénne

pre myši. Vykonával rôzne farbiace testy, pozoroval rast pri rôznych teplotách

a vykonal testy motility. Aj napriek tomu Hülpers nebol schopný rospoznať túto

baktériu, a preto ju nazval Bacillus hepatica. Nanešťastie Hülpersov kmeň nebol

zachovaný pre neskoršie potvrdenie (Sjöman, 2010).

Prvá zaznamenaná kultúra L. monocytogenes pochádza z roku 1921, izolovali ju

vo Francúzsku Dumont a Cotoni od pacienta s meningitídou (Seeliger, 1988).

Oficiálne objavenie mikroorganizmov rodu Listeria sa však datuje k roku 1924,

kedy Murray et al. (1926) izolovali L. monocytogenes ako etiologického pôvodcu

septického ochorenia králikov a morčiat v laboratóriu v Cambridge

v Anglicku. Bednář et al. (1996) uvádza, že septické ochorenie týchto zvierat bolo

pravidelne sprevádzané výraznou monocytózou v periférnej krvi, a preto Murray, Webb

a Swann nazvali izolovanú grampozitívnu tyčinku Bacterium monocytogenes.

V roku 1927 Pirie izoloval analogického pôvodcu z letálneho ochorenia

hlodavcov v južnej Afrike, korého na počesť lorda Listera nazval Listerella

hepatolytica. V roku 1940 bolo zistené, že oba kmene baktérií sú identické a bolo

dohodnuté používať pre tento nový druh dodnes platný názov Listeria monocytogenes

(Bednář et al., 1996).

Podľa Bednářa et al. (1996) boli už na začiatku minulého storočia popísané

ľudské ochorenia, ktorých patologicko-anatomické prejavy zodpovedajú obrazu

listériovej infekcie. Nyfelt (1929) uvádza, že prvé prípady ľudskej listeriózy boli

hlásené v roku 1929 v Dánsku. Gray a Killinger (1966) dopĺňajú, že v tom istom roku

boli potvrdené aj prvé izolácie z nakazených zvierat, kedy Gill uskutočnil izoláciu

z oviec.

13

1.2 Taxonómia baktérií rodu Listeria

Odjadjare et al. (2010) uvádzajú, že rod Listeria zahrňuje v súčasnej dobe sedem

uznaných druhov:

- L. monocytogenes,

- L. ivanovii,

- L. innocua,

- L. welshimeri,

- L. seeligeri,

- L. grayi,

- L. murrayi,

pričom den Bakker et al. (2010) hovoria o ďalších dvoch uznaných druhoch a to:

- L. marthii,

- L. rocourtiae,

o ktorých sa však začalo písať len v posledných rokoch.

Rod Listeria môžeme rozdeliť podľa viacerých vlastností. Sokol et al. (2007)

uvádzajú rozdelenie rodu Listeria podľa genomickej príbuznosti druhov:

1. skupina: L. monocytogenes, L. ivanovii, L. innocua, L. welshimeri,

L. seeligeri,

2. skupina: L. grayi, L. murrayi.

Veľmi dôležitou vlastnosťou rodu Listeria je patogenita jednotlivých druhov.

Mukherjee et al. (2010) ich rozdelili nasledovne:

1. patogénne druhy: L. monocytogenes, L. ivanovii,

2. nepatogénne druhy: L. innocua, L.welshimeri, L. seeligeri, L. grayi,

L. murrayi.

Sokol et al. (2007) vo svojej publikácii uvádzajú, že patogénny je aj saprofytický

druh L. seeligeri, ktorý však len ojedinele vyvoláva listeriózu u ľudí.

Iné rozdelenie rodu Listeria je na základe hemolýzy. Schmid et al. (2005) na

základe hemolýzy rozdelili rod Listeria na hemolytické druhy a nehemolytické druhy.

Medzi hemolytické druhy zaradili: Listeria monocytogenes,

L. seeligeri, L. ivanovii a medzi nehemolytické druhy: Listeria welshimeri, L. innocua,

L. grayii. S týmto rozdelením sa stotožňujú aj Volokhov et al. (2006). MacGowan et

14

al. (1989) dodávajú, že medzi nehemolytické druhy patrí taktiež

L. murrayi.

1.3 Charakteristika druhu Listeria monocytogenes

1.3.1 Morfológia druhu L. monocytogenes

Listeria monocytogenes, ktorá patrí do čeľade Listeriaceae (Demnerová et al.,

2008), je úzko príbuzná s rodmi Bacillus, Clostridium,- Enterococcus, Streptococcus

a Staphyloccocus (Blažková et al., 2005).

Je to psychrotrofná patogénna baktéria (Azizoglu a Kathariou, 2010), ktorá je

ubikvitárne sa vyskytujúca a je schopná vyvolať ochorenie u ľudí i zvierat (Vázquez-

Boland et al., 2001). Baktérie nevytvárajú púzdra ani spóry. Sú aeróbne alebo

fakultatívne anaeróbne (Blažková, 2005).

Bunky majú tvar dlhých tyčiniek, ale v živočíšnych tkanivách sa môže vyskytovať

aj v takmer kokovitej forme (Šilhánková, 2008). Demnerová et al. (2008) udávajú

veľkosť buniek v rozmedzí 0,4 - 0,5 x 0,5 - 2,0 µm, pričom môžu vytvárať vlákna dlhé

6 - 20 µm. Tieto grampozitívne nesporulujúce tyčinky sú pohyblivé pomocou

peritrichálnych bičíkov, ktoré vytvárajú iba pri teplotách

20 - 25 °C.

Podľa Goliana a Zeleňákovej (2010) je rezistencia tohto patogénu relatívne

vysoká. Tento mikroorganizmus je vďaka svojej fyziologickej kapacite schopný

prispôsobiť sa rôznym podmienkam prostredia.

Maximálna teplota pre rast L. monocytogenes je 45 °C, optimum medzi 30

a 37 °C a najnižšia teplota je 2 °C. Schopnosť rastu a prežívať nízke teploty je daná

schopnosťou adaptovať mastné kyseliny v bunkovej membráne tak, aby zostala

zachovaná membránová fluidita. Skúšky pasterizácie mlieka ukázali, že listérie prežijú

teplotu 62 °C po dobu 35 minút. Z toho vyplýva nutnosť použiť radšej vyššie teploty po

kratšiu dobu, než menšie teploty po dlhšiu dobu expozície. Bezpečná teplota k ich

likvidácii je 72 °C po dobu 10 minút vo vnútri potraviny. Pretože listérie patria

k baktériám s väčšiou odolnosťou voči vyšším teplotám ako iné vegetatívne patogény,

je tepelné spracovanie výrobkov zásadným opatrením z hľadiska bezpečnosti pred

nákazou. Chladiarenské teploty sú pre listérie priaznivé, prežívajú taktiež mrazenie

(Erban, 2007). Gırner a Valík (2004) udávajú, že niektoré kmene javia rast aj pri

15

teplotách 1 až 0,4 °C a ich generačný čas sa udáva 62 až 131 hodín. Preto sa môže, aj

keď pomaly, množiť aj pri tzv. chladničkových teplotách.

L. monocytogenes odoláva soli, nizínu a aj určitým hodnotám pH (Badaoui et al.,

2007). Rastie v širokom intervale hodnôt pH 5,0 – 9,0. V kyslejšom prostredí (pH < 3,5)

sú devitalizované (Gırner a Valík, 2004). Demnerová et al. (2008) uvádzajú, že

optimálne pH je v rozmedzí 7,0-7,5, pričom baktérie sa dokážu množiť pri pH až 9,6.

Erban (2007) poukazuje na to, že listérie sú považované za relatívne tolerantné

voči NaCl, rast bol zaznamenaný v 10 % NaCl pri 25 °C a pH 6,6 až 7,9. Baktérie sú

však schopné prežiť i v 25 % NaCl, 20 dní v suchom prostredí a 6 dní v destilovanej

vode (Blažková et al., 2005).

Podľa Gırnera a Valíka (2004) všetky kmene L. monocytogenes rastú pri

hodnotách aw ≥ 0,93 (≤ 10 % NaCl) a niektoré kmene aj pri aw = 0,83 (asi 20 % NaCl).

V súčasnosti sa u L. monocytogenes rozlišuje 13 sérotypov a to: 1/2a, 1/2b, 1/2c,

3a, 3b, 3c, 4a, 4ab, 4b, 4c, 4d, 4e, 7 (Sjöman, 2010). Na vzniku humánnych listerióz sa

podieľajú predovšetkým sérotypy 1/2a, 1/2b a 4b, pričom v potravinách sa najčastejšie

vyskytuje sérotyp 1/2a (Gelbíčová a Karpíšková, 2008).

1.3.2 Biochemické vlastnosti

Blažková et al. (2005) uvádzajú, že baktérie rodu Listeria produkujú enzým

katalázu, netvoria oxidázu ani ureázu, hydrolyzujú eskulín a hippurát sodný, ale

močovinu, kazeín či želatínu nehydrolyzujú. Listérie sú aktívne sacharolytické

mikroorganizmy a pre ich rast je dôležitá esenciálna D-glukóza.

Tieto baktérie sa dajú rozlíšiť niekoľkými biochemickými testami (tab. 1).

CAMP-test s Rhodococcus equi a Staphylococcus aureus a fermentácia D-xylózy sú

hlavné rozlišovacie znaky. Fermentácia L-ramnózy a α-metyl-D-manosidu sú

pomocnými testami. Ďalšie užitočné testy pre diferenciáciu listérií sú fermentácia

ribózy, citlivosť k fosfomycínu a virulencia pre niektoré zvieratá. Listérie sa líšia

patogenitou pre človeka i pre experimentálne zvieratá (Greenwood et al., 1999).

Ďalšiou významnou vlastnosťou niektorých listérií, ktorá prispieva k potvrdeniu

druhu, je ich hemolytická aktivita. L. monocytogenes tvorí, podobne ako L. seeligeri,

diskrétnu zónu hemolýzy. Výraznú zónu tvorí iba L. ivanovii, ostatné druhy listérií

hemolytickú aktivitu nemajú (Blažková et al., 2005).

16

Podľa Petríkovej (2003), kolónie L. monocytogenes sa vyznačujú modrozeleným

leskom pri pozorovaní v šikmom svetle dopadajúcom na dno misiek (Henriho

iluminácia).

Tab. 1 Klasifikácia listérií podľa kultivačných vlastností a biochemických znakov

(Greenwood et al., 1999)

Druh Hemolýza Redukcia

nitrátov

CAMP-test Okyslenie

S. aureus R. equi D-

manitol D-xylóza

L-

ramnóza

α-metyl-D-

manosid

Listeria

monocytogenes + - + - - + - +

Listeria

ivanovii ++ - - + - - + -

Listeria

innocua - - - - - R - +

Listeria

welshimeri - - - - - R + +

Listeria

seeligeri + - + - - - + R

Listeria

grayi - - N N + - - N

Listeria

murrayi - + N N + R - N

Vysvetlivky k tab. 1:

S. – Staphylococcus

R. – Rhodococcus

N – nie je známe

R – rôzne reakcie

17

CAMP – test je test pôvodne zavedený v roku 1944. Pozitívny test je zosilnenie

hemolýzy v prítomnosti toxického kmeňa Staphylococcus aureus alebo Rhodococcus

equi (Christie et al., 1944).

Obr. 1 Očkovanie a vyhodnotenie misiek so skúškou CAMP (STN EN ISO 11290 –

1:1996)

Pozitívna reakcia s kmeňom R. equi sa pozoruje ako široká hemolýza (5mm až

10mm), ktorá má charakter „hlavy šípu“. Reakcia sa považuje za negatívnu, ak sa malá

zóna širokej hemolýzy rozširuje iba asi 1 mm na priesečníku skúšaného kmeňa

s difúznou zónou kultúry R. equi (STN EN ISO 11290 – 1:1996).

Pozitívna reakcia s kmeňom S. aureus sa prejavuje ako malá zóna zväčšenej

hemolýzy rozširujúca sa iba asi 2 mm od skúšaného kmeňa a vnútri slabej hemolytickej

zóny spôsobenej rastom kmeňa S. aureus. V mieste rastu kmeňov S. aureus

a L. monocytogenes sa veľké zóny hemolýzy nevyskytujú (STN EN ISO 11290 –

1:1996).

18

1.3.3 Intracelulárny parazitizmus L. monocytogenes

Hof et al. (1994) uvádzajú, že patogénne kmene L. monocytogenes sú

intracelulárne parazity schopné napádať, prenikať, rozmnožovať sa a prežívať

intracelulárne v bunkách imunitného systému hostiteľa.

Podľa Blažkovej et al. (2005), infekcia hostiteľskej bunky sa začína

internalizáciou baktérie. Pre vstup listérií do nefagocytujúcích hostiteľských buniek je

dôležitá prítomnosť špeciálnych proteínov, které sú schopné fagocytózu indukovať. Ide

predovšetkým o povrchové proteíny, tzv. internalíny - internalín A (InlA, 800

aminokyselín) a internalín B (InlB, 630 aminokyselín). Ďalším významným proteínom

podieľajúcim sa na internalizácii baktérie je p60 (484 aminokyselín), ktorý je

dominantným extracelulárnym proteínom listérií a je často využívaný k diagnostike

Listeria monocytogenes.

Potom, čo je baktéria pohltená, musí rýchle uniknúť z fagocytárnej vakuoly

(fagozómu), ktorá ju obklopuje, aby sa mohla ďalej množiť. Na uvoľnení z vakuoly sa

podiela virulentný proteín zvaný listeriolyzín O (LLO), ktorý je schopný tvoriť

v membráne fagozómu póry. Celého deju sa v niektorých typoch hostiteľských buniek

zúčastňuje ešte aj fosfolipáza C, špecifická pre fosfatidylinozitol (PI-PLC, 317

aminokyselin). Po úniku z fagozómu sa baktéria v hostiteľskej bunke množí. Aby mohli

baktérie po pomnožení z bunky uniknúť, musia sa premiestniť k jej cytoplazmatickej

membráne. Ich pohyb je sprostredkovaný proteínom ActA (actin assembly protein, 639

aminokyselin). Tento proteín polymerizuje bunkový aktín a vytvára za baktériou akýsi

chvost. Tým, ako sa táto štruktúra predlžuje, je baktéria premiestňovaná až

k membráne. Výsledne sa vytvorí výčnelok, ktorý interaguje so susednou bunkou a je

ňou následne pohltená. V novej hostiteľskej bunke je teda baktéria obalená fagozómom

s dvomi membránami, k jeho rozrušeniu baktéria používa svoje dva ďaľšie virulentné

proteíny - lecitinázu (PlcB, 264 aminokyselín) a metaloproteázu (Mpl, 510

aminokyselín). Po uvoľnení do cytosolu sa baktéria začína množiť a vyššie popísané

deje sa opakujú (Blažková et al., 2005).

19

Obr. 2 Intracelulárny parazitizmus a životný cyklus L. monocytogenes (Tóth

a Beličková, 1997)

(1-3) – adhézia a invázia do hostiteľskej bunky,

(4) – prechod do fagocytárnej vakuoly,

(5) – odchod z vakuoly,

(6) – kolonizácia a množenie v cytoplazme hostiteľskej bunky,

(7) – tvorba aktínovej časti a migrácia cez cytoplazmu do oblasti bunečnej

membrány,

(8) – vyvolávanie fagocytózy v susednej hostiteľskej bunke výčnelkom

obsahujúcim listériu.

1.3.4 Výskyt baktérie L. monocytogenes v prostredí a potravinách

L. monocytogenes patrí medzi ubikvitárne baktérie, ktoré sa nachádzajú bežne

v prostredí. Vyskytujú sa na povrchu pôdy, na pastvinách, v silážiach (predovšetkým

kukuričných) a iných krmivách pre zvieratá, v odpadoch, ale aj v riečnych vodách,

v blate a v kaloch. Dochádza tak ku cirkulácii vo vonkajšom prostredí odkiaľ sa

krmivom dostávajú do zvieracích organizmov a následne fekáliami opäť do vonkajšieho

prostredia (Konečný, 2007). Podľa Tótha a Beličkovej (1997) sa listérie taktiež

vyskytujú u voľne žijúcich zvierat, vtákov, hmyzu a hospodárskych zvierat.

Hostiteľské bunky Baktéria

20

V potravinách bol tento patogénny mikroorganizmus zistený najčastejšie v mäse,

v nedostatočne tepelne opracovaných mäsových výrobkoch (salámy, paštéty),

v nepasterizovanom mlieku a hlavne v mliečnych výrobkoch (pri zrení mäkkých syrov

dochádza k rastu listérií) (Erban, 2007). Podľa Sokola et al. (2007) potenciálne riziko

predstavujú výrobky studenej kuchyne, ryby a výrobky z nich, mrazené výrobky,

čerstvá neumytá alebo nedostatočne umytá zelenina, spracovaná zelenina a cukrárenské

výrobky s vaječnou náplňou.

Surové mäso, predovšetkým mleté mäso a hydina sú častými zdrojmi listérií,

pričom fermentované mäsové produkty ako surové klobásy a surové lákované produkty

sú ich zriedkavejšími nositeľmi. Listérie sú vylučované stolicou. Pri porážke zvierat

môže dochádzať ku kontaktu fekálií s porazeným telom zvierat ako aj s vlastným

mäsom. Z hľadiska konzumentov, toto nebezpečenstvo nie je výrazné, lebo sa jedná

o malé množstvá listérií (< 102 KTJ.g-1) a mäso sa konzumuje spravidla po tepelnej

úprave. Aj pri zrení mäsa bývajú listérie devitalizované a pri fermentácii údenín sa

obyčajne pre nízke hodnoty pH nerozmnožujú. Prítomnosť listérií v tepelne upravených

mäsových produktoch môže byť spôsobená ich sekundárnou kontamináciou alebo

nedostatočným záhrevom. V týchto produktoch nie je v dôsledku tepelnej úpravy

prítomná konkurenčná mikroflóra, preto sa v nich môžu listérie nehatene rozmnožovať

(Görner a Valík, 2004). Cabanová a Kantíková (2006) poukazujú na to že,

L. monocytogenes sa považuje za najviac problematický mikroorganizmus, najmä pri

kontrole v mäsovom priemysle, u výrobkov na priamu spotrebu (tzv. ready-to-eat).

Surové kravské mlieko, hlavne dlhšie skladované u poľnohospodárov, sa môže

stať závažným zdrojom listérií. Tepelné spracovanie však riziko nákazy výrazne znižuje

(Erban, 2007). Zvláštnym rizikom môže byť konzumácia mlieka oviec a kôz kŕmených

silážou (Sokol et al., 2007). Najviac študovanou komoditou zo skupiny mliečnych

výrobkov sú syry, a to hlavne zrejúce. So stúpajúcim pH syrov v priebehu zrenia sú

súčasne vytvárané vhodné podmienky pre jej rast a rozmnožovanie. Rizikovú skupinu

predstavujú predovšetkým mäkké zrejúce syry. U mäkkých syrov býva kontaminácia

lokalizovaná takmer výlučne na povrchu kôrky (Gelbíčová et al., 2008).

Görner a Valík (2004) poukazujú na to, že L. monocytogenes sa v menších

množstvách vyskytuje aj na surovej zelenine. Väčšia epidémia bola zaznamenaná

v roku 1981 v Kanade, kde príčinou bol kapustový šalát. Kontaminácia zeleniny môže

21

nastať pri polievaní a hnojení odpadovými vodami alebo pri predaji zeleninových

zmesí balených vo fólii.

1.4 Listerióza – charakteristika ochorenia

Listerióza – zooantroponóza (Šnirc et al., 2007), je ochorenie z potravín

bakteriálneho pôvodu. Podľa Holka et al. (2001) je listerióza sporadické alebo

hromadne prenosné ochorenie ľudí spôsobené baktériou Listeria monocytogenes,

pričom Sokol et al. (2007) uvádzajú, že toto ochorenie môže spôsobovať aj

saprofytický druh Listeria seeligeri a Listeria ivanovii, avšak len ojedinele, čo uvádzajú

vo svojej publikácii aj Blažková et al. (2005). Je to ochorenie, ktoré postihuje zvieratá

aj ľudí (Čarnogurský, 2007).

Šnirc et al. (2007) považujú za vnímavé najmä ovce, hovädzí dobytok, ošípané,

kone, psy, mačky.

U ľudí sú najviac ohrozené gravidné ženy, novorodenci, dojčatá, ľudia

s oslabeným imunitným systémom (narkomani, alkoholici, onkogénne chorí,

imunosupresívne liečení pacienti, HIV pozitívni) (Nadzonová, 2008).

Profesionálne sú vystavení väčšiemu riziku pracovníci v poľnohospodárstve

(Erban, 2007).

1.4.1 Zdroj nákazy

Všetky druhy listérií, vrátane L. monocytogenes, sú v prírode bežne rozšírené.

Môžu sa vyskytovať vo vode, v pôde, na rastlinách, ale taktiež v tráviacom systéme

voľne žijúcich zvierat. V súvislosti s používaním nekvalitných krmív, obsahujúcich

veľké množstvo listérií, možno pozorovať výskyt L. monocytogenes aj u hospodárskych

zvierat (Blažková et al., 2005).

Šilhánková (2008) uvádza, že okrem bežne v prírode sa vyskytujúcich listérií sa

tieto baktérie vyskytujú aj vo fekáliach, v stolici zdravých ľudí a niekedy aj

v potravinách.

V potravinách bol tento patogén zistený najčastejšie v mäse, v nedostatočne

tepelne opracovaných výrobkoch (salámy, paštéty), v nepasterizovanom mlieku

a hlavne v mliečnych výrobkoch (pri zrení mäkkých syrov dochádza k rastu listérií),

22

v čerstvej zelenine. Ďalší výskyt tejto baktérie bol zaznamenaný v rybách, a to

i v morských čerstvých i údených rybích produktoch. Významným zdrojom sú pokrmy

studenej kuchyne (sekundárna kontaminácia) (Erban, 2007).

1.4.2 Vznik, vývoj a prejavy ochorenia

Rozvoj ochorenia po infekcii prebieha vo dvoch fázach. V prvej fáze preniknú

listérie do buniek hostiteľa, tu sa pomnožia a v druhej fáze sú krvou roznesené

k cieľovým orgánom, v ktorých spôsobujú klinické zmeny. Kvôli veľkej afinite

k nervovým tkanivám a pohlavným orgánom, sú to hlavne orgány centrálneho

nervového systému a placenta (Sedlák et al., 2006).

Pri vstupe infekcie tráviacim systémom sa listérie dostávajú do buniek tenkého

čreva. Imunitné mechanizmy organizmu sa snažia zabrániť rozšíreniu infekcie. Pokiaľ

je imunita oslabená, dôjde k rozpadu napadnutých buniek a prieniku infekcie do krvi

a odtiaľ k cieľovým orgánom. Vznik a priebeh ochorenia teda závisia od imunitného

stavu organizmu (Sedlák et al., 2006).

Pre zdravého jedinca L. monocytogenes nie je nebezpečná, takže nákazu u zdravej

populácie zaznamenávame len veľmi zriedkavo. Tieto baktérie sú nebezpečné pre osoby

s oslabenou imunitou, tehotné ženy, novorodencov a staršie osoby. Ak dôjde ku infekcii

tehotných žien na začiatku gravidity, dochádza k potratom, v neskorších štádiách

tehotenstva sa infikuje placenta, prípadne sa kontaminuje plodová voda. To môže viesť

k poškodeniu plodu alebo narodenia novorodenca so závažnou infekciou, obvykle

encefalitídou alebo pneumóniou. U seniorov a ľudí s oslabenou imunitou spôsobuje

septické stavy, ktoré končia zápalmi mozgu a mozgových blán (Demnerová et al.,

2008). Šilhánková (2008) poukazuje na to, že L. monocytogenes spôsobuje taktiež

ochorenie pečene.

U zdravých ľudí, pokiaľ ochorejú, je najčastejším prejavom meningitída,

meningoencefalitída, abscesy v centrálnom nervovom systéme. Medzi klinické príznaky

patria vysoké horúčky, záchvaty, zlá koordinácia pohybu, bolesti hlavy. U oslabených

ľudí dochádza najčastejšie k sepse, ktorá sa prejavuje horúčkou, nevoľnosťou,

zvracaním, akútnym respiračným zlyhaním, až multiorgánovým zlyhaním (Sedlák

et al., 2006).

23

Ochorenia sú však väčšinou neinvazívne, preto sa prejavujú podobne ako chrípka,

prípadne gastrointestinálnymi príznakmi: únava, zvýšená teplota, svalová bolesť, bolesti

hlavy, bolesti brucha a kŕče, zvracanie. Ochorenie listerióza je veľmi vzácne, ale taktiež

aj nebezpečné, pretože okolo 30 % všetkých prípadov u invazívnej formy končí smrťou

(Erban, 2007).

Obr. 3 Schematické znázornenie patofyziológie infekcie spôsobenej listériami

(Vázquez - Boland et al., 2001)

Patogenita Listeria monocytogenes v kontaminovaných potravinách je závislá od

minimálnej infekčnej dávky, ktorá sa mení z osoby na osobu (Tóth, 1997).

Ku vzniku ochorenia je nutná u zdravých jedincov infekčná dávka cca 108 buniek,

u citlivých osôb len 102-103 buniek (Demnerová et al., 2008).

Inkubačná doba sa pohybuje v rozmedzí od 3-70 dní s priemerom 31 dní po

infekcii. U novorodencov sa v závislosti od spôsobu infekcie ochorenia prejavuje od

2-28 dní (Sedlák et al., 2006).

meningoencefalitída

imunitná odpoveď

subklinická pyogranulomatózna hepatitída

translokácia

kontaminovaná

potravina

pôda

fekálne vylučovanie

febrilná gastroenteritída

potrat novorodenecká sepsa

zápal placenty

bakteriémia septikémia

24

Zdraví ľudia väčšinou neochorejú, ale môže u nich dôjsť k bezpríznakovému

nosičstvu. Až 5 % ľudí je niekedy v priebehu života nosičom infekcie. Vylučovanie

stolicou je väčšinou krátkodobé, vzácne môže trvať aj rok (Sedlák et al., 2006).

U zvierat encefalitická forma postihuje 3. až 7. mozgový nerv. Vyskytuje sa

strnulá chôdza, krúživé pohyby okolo vlastnej osi, aj ochrnutie žuvacieho, hltacieho,

ušného a očného nervu, ochrnutie končatín, plávacie pohyby, kóma, úhyn. Pri

encefalitickej forme vzniká edém mozgu, hnisavá meningoencefalitída. Pri septikémii

vznikajú krvácaniny, nekrotické ložiská v pečeni a slezine, abortované plody sú

edematózne a mumifikované. Pri hydine je častá degenerácia myokardu a perikarditída

(Šnirc et al., 2007).

1.4.3 Prevencia

Prevencia voči výskytu L. monocytogenes spočíva v prísnom dodržiavaní

hygienických predpisov, v dostatočnom opracovaní surovín, pasterizácii a rešpektovaní

plánu HACCP. Kto vyrába potraviny a obaly na ich balenie, manipuluje s nimi alebo

ich umiestňuje na trh, musí vytvárať také podmienky, aby sa predchádzalo zhoršeniu

mikrobiálnej kvality potravín a obalov na ich balenie. Potraviny, ktoré sa majú

konzumovať po ohriatí (napr. párky a iné mäsové výrobky) treba zohriať najmenej na

70 °C a udržiavať ich pri tejto teplote až do konzumácie. Studené pokrmy treba naopak

udržiavať v chlade pri teplotách pod 5 °C a pri izbovej teplote ich nenechávať dlhšie

ako 2 hodiny. Tehotné ženy, starší ľudia a chorí so zníženou imunitou by nemali párky

a mäsové konzervy, ktoré neprejdú varom, konzumovať vôbec (URL 2, 2007).

Sedlák et al. (2006) popísali aj iné preventívne opatrenia ako napríklad:

- nekonzumovať neumyté ovocie a zeleninu,

- zeleninu a ovocie uchovávať oddelene od surového mäsa,

- polotovary uchovávať oddelene od uvarených potravín,

- vyvarovať sa konzumácii surového mlieka a potravín vyrobených z neho,

- vyvarovať sa jedlám z nepreverených zdrojov (hlavne tehotné ženy a osoby so

zníženou imunitou).

Podľa Erbana (2007) je pri potravinách určených na priamu spotrebu vhodné,

aby sa rizikové skupiny obyvateľstva vyhýbali konzumácii:

- niektorých druhov syrov (napr. syry zrejúce pod mazom, syry s plesňou),

25

- vareným mäsovým výrobkom (napr. jaternice konzumované za studena, tlačenka),

- lahôdkovým šalátom.

Zvažuje sa možnosť zavedenia rutinného testovania tehotných žien na listeriózu

(Erban, 2007).

Riziko infekcie pre zdravého človeka pri zachovaní všetkých preventívnych

opatrení je malé (Sedlák et al., 2006).

1.4.4 Diagnostika a liečba

Diagnóza listériových infekcií sa potvrdzuje kultivačným preukázaním pôvodcu

nákazy z krvi, placenty, žalúdočného výplachu, mozgovomiechového moku.

Serologické testy sú nespoľahlivé (Sedlák et al., 2006).

Liečbu je nutné zahájiť ihneď po zistení prvých príznakov. Listerióza sa

najčastejšie lieči antibiotikami penicilínového typu, k cefalosporínom sú listérie

prirodzene rezistentné (Demnerová, 2008).

Úspešné liečenie spočíva vo včasnom podaní antibiotík (Erban, 2007).

1.4.5 Prognóza ochorenia

Mortalita neskorého ochorenia novorodencov je okolo 10 %. Naproti tomu

mortalita skorého ochorenia je 30 - 60 %. U 20 - 40 % novorodencov, ktorí prežívajú,

má následky, ako pľúcne ochorenia, hydrocefalus a iné postihnutia nervového systému.

Včasné podávanie antibiotík infikovaným matkám zvyšuje percento prežitia

novorodencov. Mortalita listeriózy dospelých činí 20 - 50 % u infekcií centrálneho

nervového systému, 5 - 20 % u primárnej bakteriémie a 50 % u infekčnej endokarditídy.

Okolo 25 - 75 % pacientov, ktorí prežijú infekciu centrálneho nervového systému, trpia

následkami, ako je hemiplégia a iné postihnutia nervového systému (Greenwood et al.,

1999).

26

1.4.6 Výskyt a trend listeriózy na území SR

Obr. 4 Výskyt listeriózy na území SR za posledných 20 rokov (EPIS, 2010)

Obr. 5 Trend listeriózy na území SR za posledných 20 rokov (EPIS, 2010)

27

2 Cieľ práce

Cieľom diplomovej práce bolo vyšetrenie lahôdkárskych výrobkov, hotových

pokrmov, príloh pokrmov, potravín pre osobitné výživové účely, konzerv, polotovarov,

čerstvej zeleniny a sladkých syrov na prítomnosť baktérií rodu Listeria použitím

horizontálnej metódy a následnej identifikácie druhu Listeria monocytogenes pomocou

testov API Listeria.

28

3 Metodika práce a metódy skúmania

Vzorky na laboratórne vyšetrenie odoberali pracovníci regionálneho úradu

verejného zdravotníctva podľa platných predpisov. Prevažnú časť tvorili vzorky

lahôdkárskych výrobkov a hotových pokrmov, pričom vyskytli sa aj vzorky potravín

pre osobitné výživové účely, čerstvej zeleniny, konzerv, príloh pokrmov, polotovarov

a sladkých syrov. Vzorky boli vyšetrené referenčnou horizontálnou metódou (STN EN

ISO 11290 - 1:1996) v počte n = 100.

3.1 Horizontálna metóda STN EN ISO 11290 - 1:1996

Mikrobiológia potravín a krmív. Horizontálna metóda na dôkaz a stanovenie

počtu baktérií Listeria monocytogenes

Časť 1: Metóda dôkazu STN EN ISO 11290 - 1:1996

Zmena A1: Modifikácia izolačného média a skúška hemolýzy a zhrnutie údajov

Obsah: zhodnosti (ISO 11290 - 1:1996/AM1:2004)

1. Technické normy a predpisy.

2. Príprava na meranie a pomôcky.

3. Postup skúšky.

4. Vyjadrenie výsledkov.

5. Protokol o skúške.

1. TECHNICKÉ NORMY A PREDPISY

STN EN ISO 11290 – 1:1996

STN EN ISO 11290 – 1:1996/AM1:2004

STN EN ISO 6887 Mikrobiológia. Všeobecné pokyny na prípravu riedení pri

mikrobiologickom skúšaní (560102)

STN ISO 7218 Mikrobiológia potravín a krmív. Všeobecné pravidlá

mikrobiologického skúšania.

29

2. PRÍPRAVA A POMÔCKY

a) Kultivačné média:

� selektívne média na primárne pomnoženie: Fraserovo tekuté médium so

zníženou koncentráciou (polovičné Fraserovo tekuté médium),

� selektívne médium na sekundárne pomnoženie (Fraserovo tekuté médium

s plnou koncentráciou),

� agar na identifikáciu Listeria podľa Ottavianiho a Agostiho (ALOA),

� selektívne tuhé médium – agar Oxford,

� selektívne tuhé médium – agar PALCAM,

� agar TSYEA.

b) Prístroje a pomôcky:

� prístroj na sterilizáciu horúcim vzduchom (sušiareň) alebo parou (autokláv),

� sušiareň alebo termostat s teplotou udržiavanou od 25 do 50 °C ± 1 °C,

� termostaty pre kultiváciu s nasledovnými teplotami:

25 °C ± 1 °C

30 °C ± 1 °C

35 °C ± 1 °C alebo 37 °C ± 1 °C

� vodný kúpeľ s teplotou 47 °C ± 2 °C,

� bakteriologické kľučky a sklenené zahnuté tyčinky,

� pH-meter s presnosťou ± 0,1 pri teplote 25 °C,

� skúmavky a banky, odmerné valce (50 – 1000 ml), delené pipety (1 ml, 10 ml),

Petriho misky (90, 100 mm priemer),

� mikroskop (ideálne s fázovým kontrastom), podložné a krycie sklíčka.

3. POSTUP SKÚŠKY

a) Skúšobná vzorka a médium na primárne pomnoženie sa inkubujú 24 hod. ± 2

hod. pri 30 °C (polovičné Fraserovo tekuté médium).

b) 0,1 ml kultúry po primárnom pomnožení sa naočkuje do 10 ml média na

sekundárne pomnoženie (s plnou koncentráciou) a inkubuje sa 48 hod. ± 2 hod.

pri teplote 35 °C alebo 37 °C (v SR sa používa teplota 37 °C).

c) Z kultúry z primárneho pomnoženia sa naočkuje pomocou bakteriologickej

kľučky (alebo sklenenej tyčinky) na agar ALOA tak, aby sme dobre izolovali

kolónie. Inkubujeme 24 h ± 3 h pri 37 °C (ak je potrebné, ďalších 24 h).

30

d) Rovnako z primárneho pomnoženia sa naočkuje agar Oxford alebo PALCAM.

Inkubujeme 24 h až 48 h pri teplote 30 °C, 35 °C alebo 37 °C.

e) Rovnako sa postupuje aj po sekundárnom pomnožení.

f) Na potvrdenie baktérií Listeria sp. sa vyberie z každej misky selektívnych médií

päť podozrivých kolónií.

g) Vybrané kolónie sa očkujú na agar TSYEA a tento sa inkubuje pri teplote 35 °C

alebo 37 °C 18 h až 24 h.

h) Skúšky na potvrdenie baktérií Listeria sp. sa vykonávajú s kolóniami z čistej

kultúry z agaru TSYEA.

i) Vykonávajú sa tieto skúšky:

� dôkaz katalázy,

� Gramovo farbenie,

� skúška pohyblivosti (ak sú pohyblivé).

j) Na potvrdenie baktérií L. monocytogenes sa vykonávajú tieto skúšky:

� skúška hemolýzy,

� utilizácia sacharidov,

� skúška CAMP.

k) Vykonáva sa záverečné vyhodnotenie s konečným potvrdením.

4. VYJADRENIE VÝSLEDKOV

V súlade s vyhodnotením výsledkov sa vyjadrí prítomnosť alebo neprítomnosť

baktérií Listeria monocytogenes v skúšanej vzorke s udaním množstva skúšanej vzorky

(v gramoch alebo miligramoch).

5. PROTOKOL O SKÚŠKE

V protokole o skúške sa uvedú použitá metóda, inkubačné teploty a získané

výsledky. V protokole sa taktiež uvedú všetky podrobnosti postupu, ktoré nie sú

v príslušnej norme, alebo sú uvedené ako voliteľné a mohli by ovplyvniť výsledky.

Potrebné je uviesť všetky informácie na identifikáciu vzorky.

31

Obr. 6 Schematické znázornenie dôkazu Listeria monocytogenes (STN EN ISO

11290 - 1:1996)

Skúšaná vzorka

( x g alebo x ml )

Médium na primárne

pomnoženie (polovičné

Fraserovo tekuté médium)

Inkubácia 24 h ± 3 h pri 30 °C

0,1 ml kultúry do 10 ml média na sekundárne

pomnoženie (Fraserovo tekuté médium)

Izolácia

ALOA agar

agar PALCAM

agar Oxford

Inkubácia 48 hod ± 3 h pri 35 °C alebo 37 °C

Izolácia

32

Pokračovanie obr. 6 Schematické znázornenie dôkazu Listeria monocytogenes

(STN EN ISO 11290 - 1:1996)

agar na identifikáciu Listeria podľa Ottavianiho

a Agostiho (ALOA) agar

Oxford

agar PALCAM

Inkubácia ALOA agar 24 hod. ± 3 h pri 37 °C (ak je potrebné, ďalších

24 h) Inkubácia 24 – 48 h pri teplote 30 °C,

35 °C, 37 °C

Inkubácia 24 – 48 h pri teplote 30 °C,

35 °C, 37 °C

Potvrdenie baktérií rodu Listeria � subkultivácia na agarové médium TSYEA

a inkubácia pri teplote 35 °C alebo 37 °C 24 h až 48 h

� dôkaz katalázy � Gramovo farbenie � skúška pohyblivosti (ak je potrebná)

Potvrdenie Listeria monocytogenes � skúška dôkazu hemolýzy � utilizácia sacharidov � skúška CAMP

Izolácia

33

3.2 API Listeria

API Listeria je štandardizovaný systém k identifikácii listérií, ktorý využíva

miniaturizovaných testov rovnako ako databáza. Pomocou tohto systému je možné

identifikovať nasledovné druhy: L. monocytogenes, L. ivanovii, L. innocua,

L. welshimeri, L. seeligeri, a L. grayi.

1. Princíp

2. Príprava inokula

3. Inokulácia testovacieho prúžku

4. Odčítanie a interpretácia

1. Princíp

API Listeria pozostáva z 10 mikroskúmaviek obsahujúcich dehydratované

substráty, ktoré umožňujú vykonanie enzymatických testov alebo fermentáciu cukrov.

Počas inkubácie produkuje metabolizmus farebné zmeny, ktoré sú buď spontánne alebo

sa zviditeľnia pridaním činidiel. Reakcie sa odčítajú podľa odčítacej tabuľky, pričom

identifikácia sa získa porovnaním s prehľadom profilov alebo pomocou identifikačného

softwaru.

2. Príprava inokula

- Otvorte ampulku API Suspension Medium (2ml) podľa pokynov v odstavci

„Varovanie a opatrenie“ (ampulka bez kvapátka).

- Pipetou alebo PSIpetou naberte niekoľko dobre izolovaných kolónií. Doporučuje sa

používať mladé kultúry (18-24 hodín staré).

- Pripravte suspenziu so zákalom ekvivalentným 1 McFarlanda. Táto suspenzia sa musí

použiť ihneď po príprave.

- Pozorujte typ hemolýzy a zaznamenajte ju do výsledkovej tabuľky. Slúži ako

dodatočný test.

34

3. Inokulácia testovacieho prúžku

Bakteriálnu suspenziu aplikujte do každej skúmavky, pričom zamedzte tvorbe

bublín (prúžok mierne nakloňte dopredu a špičku pipety alebo PSIpety dajte proti

bočnej stene jamky):

- naplňte skúmavku a jamku testu DIM (okolo 100 µl), pričom zamedzte vzniku

konvexného menisku,

- naplňte iba skúmavkovú časť testov ESC až TAG (okolo 50 µl),

- uzavrite inkubačný box,

- inkubujte 10-18 hodín pri teplote 36 ± 2 °C za aeróbnych podmienok.

4. Odčítanie a interpretácia

Odčítanie testovacieho prúžku

- K testu DIM pridajte kvapku činidla ZYM B.

- Odčítajte všetky reakcie počas 3 minút s použitím odčítacej tabuľky.

- Do výsledkovej tabuľky taktiež zaznamenajte typ hemolýzy. Výsledok tohto testu sa

pri interpretácii prúžku neberie do úvahy.

Interpretácia

Identifikácia sa získa pomocou číselného profilu (Tab. 3).

- Určenie číselného profilu:

Vo výsledkovej tabuľke sa testy rozdelia do skupín po 3, pričom každej sa pridelí

hodnota 1, 2 alebo 4. Sčítaním hodnôt zodpovedajúcich pozitívnym reakciám

v každej skupine sa získa štvormiestny číselný profil, ktorý tvorí číselný profil.

35

Tab. 2 Odčítacia tabuľka pre test API Listeria (bioMérieux, 2007)

TESTY Aktívne zložky Množstvo

(mg/jam..) Reakcia

Výsledky

Negatívne Pozitívne

DIM Enzymatický

substrát 0,106

Diferenciácia

L. innocua / L. monocytogenes

ZYM B / < 3 min

svetlo oranžové ružovobéžové šedobéžové

oranžové

ESC Eskulín

Citran železitý

0,16

0,024 hydrolýza (ESCulin) svetlo žlté čierne

αMAN 4-nitrofenyl-αD-

mannopyranosid 0,045 α-MANnosidase bezfarebné žlté

DARL D-ArabitoL 0,4 okyselenie

(D-ARabitoL)

červené /

oranžovočervené

žlté /

žltooranžové

XYL D-Xylóza 0,4 okyselenie (XYLose)

RHA L-Rhamnóza 0,4 okyselenie

(RHAmnose)

MDG Methyl-αD-

glukopyranosid 0,4

okyselenie (Methyl-αD-

Glucopyranoside)

RIB D-Ribóza 0,4 okyselenie (RIBose)

G1P Glukóza-1-fosfát 0,4 okyselenie (Glucose-

1-Phosphate)

TAG D-Tagatóza 0,4 okyselenie (TAGatose)

- uvedené množstvá sa môžu upraviť v závislosti od titra použitých surovín,

- určité jamky obsahujú produkty živočíšneho pôvodu, obzvlášť peptóny.

36

Tab. 3 Tabuľka číselných profilov pre test API Listeria (bioMérieux, 2007)

Číselný

profil Druh

Číselný

profil Druh

2150 L. ivanovii 3750 L. ivanovii

2170 L. ivanovii 3770 L. ivanovii

2250 L. ivanovii 6010 L. monocytogenes

2310 L. seeligeri/ivanovii 6110 L. monocytogenes/innocua

2311 L. welshimeri 6120 L. grayi

2330 L. ivanovii 6130 L. grayi


2350 L. ivanovii 6310 L. seeligeri/welshimeri

2370 L. ivanovii 6311 L. welshimeri

2410 L. monocytogenes 6410 L. monocytogenes

2510 L. monocytogenes 6450 L. monocytogenes

2550 L. monocytogenes/ivanovii 6510 L. monocytogenes

2711 L. welshimeri 6520 L. grayi



3110 L. seeligeri/innocua/ivanovii 6711 L. welshimeri

3120 L. grayi 7110 L. innocua

3130 L. grayi/ivanovii 7111 L. welshimeri



3210 L. seeligeri/ivanovii 7301 L. welshimeri

3250 L. ivanovii 7310 L. seeligeri/welshimeri/innocua


3300 L. seeligeri/ivanovii 7320 L. grayi

3310 L. seeligeri/ivanovii 7330 L. grayi

Pokračovanie tab. 3 Tabu2007)

Číselný

profil Druh

3311 L. welshimeri

3330 L. ivanovii

3340 L. ivanovii

3350 L. ivanovii

3360 L. ivanovii

3370 L. ivanovii

3510 L. innocua

3520 L. grayi

3711 L. welshimeri

3730 L. ivanovii

Obr. 7 Vzor výsledkovej tabu

37

Tabuľka číselných profilov pre test API Listeria

Druh Číselný

profil Druh

L. welshimeri 7500 L. innocua

7510 L. innocua

7511 L. welshimeri

7520 L. grayi

7530 L. grayi

7701 L. welshimeri

7710 L. welshimeri/innocua

7711 L. welshimeri

L. welshimeri 7720 L. grayi

Obr. 7 Vzor výsledkovej tabuľky (bioMérieux, 2007)

Listeria (bioMérieux,

Druh

L. welshimeri/innocua

38

Tab. 4 Identifika čná tabuľka pre test API Listeria (bioMérieux, 2007)

- % pozitívnych reakcií po 18 – 24 hodinách pri 36 ± 2 °C β

HE

M

- - ++

+(-

)

+ -

TA

G

0 0 0 0 0 97

G1P

0 0 91

5 0 0

RIB

100

0 33

0 0 0

MD

G

33

98

99

100

99

99

RH

A

16

66

4 98

0 76

XY

L 1 2 97

0 99

98

DA

RL

100

100

99

97

99

100

αM

AN

99

98

0 98

5 96

ES

C

100

100

100

100

100

100

DIM

99

99

88

0 97

90

AP

I

LIS

TE

RIA

Lis

teri

a

gra

yi

Lis

teri

a

inn

ocu

a

Lis

teri

a

iva

no

vii

Lis

teri

a

mo

no

cyto

gen

es

Lis

teri

a

seelig

eri

Lis

teri

a

wels

him

eri

Lege

nda β

HE

M:

< 1

0 %

-

70-9

0 %

+

(-)

> 9

0 %

+

10

0 %

+

+

39

4 Výsledky práce a diskusia

V diplomovej práci sme vyšetrili 100 vzoriek (n=100) rôznych druhov potravín

na prítomnosť baktérie Listeria monocytogenes. Zamerali sme sa na vyšetrenie

lahôdkárskych výrobkov, hotových pokrmov, príloh pokrmov, potravín pre osobitné

výživové účely, konzerv, polotovarov, čerstvej zeleniny a sladkých syrov, pričom

prioritné a zároveň najviac zastúpené boli lahôdkárske výrobky a hotové pokrmy.

Jednotlivé percentuálne zastúpenie vzoriek potravín bolo nasledovné:

- lahôdky 46 %

- pokrmy 34 %

- PPOVÚ 8 %

- čerstvá zelenina 4 %

- konzervy 3 %

- prílohy pokrmov 3 %

- polotovary 1 %

- sladké syry 1 %

Princíp postupu vyšetrenia spočíval v tom, že po odobratí vzorky o hmotnosti

25 g a následnej úprave sme použili horizontálnu metódu dôkazu listérií podľa STN

EN ISO 11290 - 1:1996, ktorá je zároveň aj referenčnou metódou, a následne sme

vykonali identifikáciu druhu testom API – Listeria. Z uvedeného počtu vzoriek

n = 100 bolo pozitívnych 6 vzoriek čo predstavuje 6 % zastúpenie z celkového počtu

skúšaných vzoriek. Pozitívne boli nasledovné vzorky:

- vzorka č. 11 Parížsky šalát voľný

- vzorka č. 68 Pikantný šalát

- vzorka č. 78 Valibuk šalát

- vzorka č. 82 Valibuk šalát

- vzorka č. 92 Vlašský šalát

- vzorka č. 93 Šampiňónový šalát

V roku 1999 bolo spolu vyšetrených 12065 vzoriek potravín a surovín s nálezom

Listeria monocytogenes v 220 vzorkách (1,82 %). Percentuálny podiel v roku 1998 bol

0,46 %. Najviac vyšetrených vzoriek bolo v skupine mäsových výrobkov

40

a v tvarohoch a syroch.. Podľa pozitívnych vzoriek bola najvyššia záchytnosť

v surovom kravskom mlieku (vyšetrených 860 vzoriek s pozitivitou 7,56 %)

a v tvarohoch a syroch (vyšetrených 1545 s pozitivitou 5,43 %). V ostatných

skupinách ako sú plesňové syry, výrobky z vajec, majonézy, údené mäso a droby,

kyslomliečne výrobky a jogurty, maslo, hotové jedlá a polotovary nebola

L. monocytogenes zistená (Jacková et al., 2001).

O najvyšších medzných hodnotách v potravinách baktérie Listeria

monocytogenes hovorí Potravinový kódex Slovenskej republiky – 2. časť, 4. hlava -

Mikrobiologické požiadavky na potraviny a na obaly na ich balenie, ktorý sa

odvoláva na Nariadenie Komisie (ES) č. 1441/2007 z 5. decembra 2007, ktorým sa

mení a dopĺňa nariadenie (ES) č. 2073/2005 z 15. novembra 2005

o mikrobiologických kritériách pre potraviny . To prinieslo zmeny v sledovaní

prítomnosti Listeria monocytogenes v potravinách. Zaviedlo povinnosť vyšetrovať

všetky potraviny na priamu spotrebu, okrem niektorých napr. sterilizované konzervy,

chlieb, cukor, liehoviny. Potraviny na priamu spotrebu sú podľa kapitoly I. Kritériá

bezpečnosti potravín pre kritérium rozdelené do 3 skupín.

� Prvá skupina sa týka potravín na priamu spotrebu pre dojčatá a potravín

na priamu spotrebu na osobitné medicínske účely - Listeria

monocytogenes nesmie byť prítomná počas ich uchovateľnosti.

� Druhá skupina sú potraviny na priamu spotrebu, ktoré sú schopné

podporovať rast (okrem prvej skupiny). Táto skupina má dve

podskupiny, ktorá sa líši podľa odberového miestu a zamerania

vyšetrenia. Tu je možné alebo vyžadovať neprítomnosť Listeria

monocytogenes predtým, ako sa potravina dostala spod bezprostrednej

kontroly výrobcu, ktorý ju vyrobil (miesto odberu iba u výrobcu) alebo

tolerovať počet mikroorganizmov do 100 v 1 g počas ich uchovateľnosti

(miesto odberu u výrobcu a v obchodnej sieti). Tolerancia vychádza zo

všeobecne prijatého vedeckého názoru, že množstvo Listeria

monocytogenes do 100 v 1 g nevyvoláva ochorenie.

� Tretia skupina sú potraviny na priamu spotrebu, ktoré nie sú schopné

podporovať rast (okrem prvej skupiny). V tejto skupine sú tolerované

počty Listeria monocytogenes do 100 v 1 g počas ich uchovateľnosti

(URL 4, 2010).

41

Tab. 5 Kritéria bezpečnosti potravín (Nariadenie Komisie (ES) č. 1441/2007

z 5. decembra 2007, ktorým sa mení a dopĺňa nariadenie (ES) č. 2073/2005

z 15. novembra 2005 o mikrobiologických kritériách pre potraviny)

Kategória potravín Mikroorganizmy Plán odberu vzoriek Limity Stupeň, v ktorom sa

uplatňuje kritérium n c m M

Potraviny na priamu

spotrebu určené pre dojčatá a

potraviny na priamu spotrebu

na osobitné medicínske účely

(1)

L. monocytogenes 10 0 neprítomnosť

v 25 g

Produkty uvedené na trh počas

ich uchovateľnosti

Potraviny na priamu

spotrebu schopné

podporovať rast

L. monocytogenes okrem

tých, ktoré sú určené pre

dojčatá a na osobitné

medicínske účely

L. monocytogenes

5 0 100 KTJ/g (2)

Predtým ako sa potravina

dostala spod

bezprostrednej kontroly

prevádzkovateľa

potravinárskeho podniku,

ktorý ju vyrobil

5 0 neprítomnosť

v 25 g (3)

Produkty uvedené na trh

počas ich uchovateľnosti

Potraviny na priamu

spotrebu neschopné

podporovať rast

L. monocytogenes okrem

tých, ktoré sú určené pre

dojčatá a na osobitné

medicínske účely (1) (4)

L. monocytogenes 5 0 100 KTJ/g Produkty uvedené na trh

počas ich uchovateľnosti


n - počet jednotiek tvoriacich vzorku

c - počet jednotiek vzorky s hodnotami nad m alebo medzi m a M

m = M

(1) - Za bežných podmienok nie je potrebné pravidelné testovanie na kritérium

pri týchto potravinách na priamu spotrebu:

- potraviny, ktoré boli tepelne ošetrené alebo inak spracované spôsobom

účinným na odstránenie L. monocytogenes, ak po tomto ošetrení nie je možná

rekontaminácia (napr. výrobky tepelne ošetrené v ich konečnom obale),

- čerstvá, nepokrájaná a nespracovaná zelenina a ovocie okrem vyklíčených

semien,

- chlieb, sušienky a podobné výrobky,

42

- vo fľašiach plnené alebo balené vody, nealkoholické nápoje, pivo, mušt, víno,

liehoviny a podobné výrobky,

- cukor, med a cukrovinky vrátane kakaa a čokoládových výrobkov,

- živé lastúrniky.

(2) - Toto kritérium sa uplatňuje, ak je výrobca schopný príslušnému orgánu

uspokojivo preukázať, že počas uchovateľnosti výrobok nepresiahne limit

100 KTJ/g. Prevádzkovateľ si môže počas procesu určiť medzilimity, ktoré by

mali byť dostatočne nízke, aby sa zaručilo, že na konci uchovateľnosti nebude

presiahnutý limit 100 KTJ/g.

(3) - Toto kritérium sa uplatňuje na produkty predtým, ako sa dostanú spod

bezprostrednej kontroly prevádzkovateľa potravinárskeho podniku, ktorý ich

vyrobil, ak nie je schopný príslušnému orgánu uspokojivo preukázať, že produkt

počas uchovateľnosti nepresiahne limit 100 KTJ/g.

(4) - Produkty s pH < 4,4 alebo aw < 0,92, produkty s pH < 5,0 a aw < 0,94,

produkty s uchovateľnosťou kratšou ako 5 dní sa automaticky považujú za

súčasť tejto kategórie. Na základe vedeckého odôvodnenia sa do tejto kategórie

môžu zaradiť aj iné kategórie produktov.

Interpretácia výsledkov podľa Nariadenia Komisie (ES) č. 1441/2007

z 5. decembra 2007, ktorým sa mení a dopĺňa nariadenie (ES) č. 2073/2005

z 15. novembra 2005 o mikrobiologických kritériách pre potraviny:

L. monocytogenes v potravinách na priamu spotrebu určených pre dojčatá alebo

na osobitné medicínske účely:

- vyhovuje, ak všetky zistené hodnoty preukazujú neprítomnosť baktérie,

- nevyhovuje, ak sa zistí prítomnosť baktérie v ktorejkoľvek z jednotiek vzorky.

L. monocytogenes v potravinách na priamu spotrebu, schopných podporovať rast

L. monocytogenes predtým, ako sa potravina dostala spod bezprostrednej kontroly

prevádzkovateľa potravinárskeho podniku, ktorý ju vyrobil, ak prevádzkovateľ nie je

schopný preukázať, že produkt nepresiahne limit 100 KTJ/g počas jeho

uchovateľnosti:

- vyhovuje, ak všetky zistené hodnoty preukazujú neprítomnosť baktérie,

- nevyhovuje, ak sa zistí prítomnosť baktérie v ktorejkoľvek z jednotiek vzorky.

43

L. monocytogenes v iných potravinách na priamu spotrebu a E. coli v živých

lastúrnikoch:

- vyhovuje, ak sú všetky zistené hodnoty < limit,

- nevyhovuje, ak je ktorákoľvek hodnota > limit.

Všetky vzorky, v ktorých sme identifikovali baktériu Listeria monocytogenes,

boli zaradené do skupiny lahôdkárskych výrobkov. Lahôdkárske výrobky, podľa

kategórie potravín (Tab. 5), patria medzi potraviny na priamu spotrebu schopné

podporovať rast L. monocytogenes okrem tých, ktoré sú určené pre dojčatá a na

osobitné medicínske účely, pričom stupeň, v ktorom sa uplatňuje kritérium, je

„Produkty uvedené na trh počas ich uchovateľnosti“. Kritériom bezpečnosti potravín

je limit, ktorý v tomto prípade je definovaný ako neprítomnosť v 25 g. Na základe

uvedených informácii sme vzorky v ktorých bola prítomná L. monocytogenes uznali

ako nevyhovujúce.

44

Tab. 6 Laboratórne vyšetrenie potravín

Číslo

vzorky Názov vzorky

Druh

vzorky

Výsledky

Listeria monocytogenes

Horizontálna

metóda API test

1. Treska

v majonéze lahôdky neprítomná --

2. Rybací

šalát lahôdky neprítomná --

3. Syrová

pomazánka lahôdky neprítomná --

4. Parížsky


5. Pikantný


6. Mexický šalát


7. Parížsky


8. Zemiakový


9. Diabolský


10. Vlašský


11. Parížsky

šalát - voľný lahôdky prítomná L. monocytogenes

12. Treska


13. Nórsky


14. Rybací


45

Pokračovanie tab. 6 Laboratórne vyšetrenie potravín

Číslo


Druh

vzorky

Výsledky


Horizontálna

metóda API test

15. Hydinový šalát

s cestovinou lahôdky neprítomná --

16. Parížsky


17. Kurací rezeň

v žemle pokrm neprítomná --

18. Cheesburger

pokrm neprítomná --

19. Bryndzové

halušky pokrm neprítomná --

20. Hovädzia

pečienka pokrm neprítomná --

21. Hovädzie mäso

so zeleninou pokrm neprítomná --

22. Hovädzie mäso

s karotkou pokrm neprítomná --

23. Karotka

s jablkami PPOVÚ neprítomná --

24. Zelenina

s kuracím mäsom pokrm neprítomná --

25. Hermelínová

nátierka lahôdky neprítomná --

26. Syrová pikantná

nátierka lahôdky neprítomná --

27. Pečená

jaternica pokrm neprítomná --

28. Pečené kuracie

krídla pokrm neprítomná --

46


Číslo


Druh

vzorky

Výsledky


Horizontálna

metóda API test

29. Sunarka s ryžou

a banánmi PPOVÚ neprítomná --

30. Ryžová mliečna

kaša s ovocím PPOVÚ neprítomná --

31. Sleďové

rezy konzerva neprítomná --

32. Treska


33. Zemiakový


34. Diabolský


35. Řáholecký


36. Rybí


37. Zelenina

s kuracím mäsom pokrm neprítomná --

38. Jahňacie mäso

so zemiakmi pokrm neprítomná --

39. Pečené

králičie mäso pokrm neprítomná --

40. Parížsky

šalát – voľný lahôdky neprítomná --

41. Diabolský

šalát – voľný lahôdky neprítomná --

42. Řáholecký


47


Číslo


Druh

vzorky

Výsledky


Horizontálna

metóda API test

43. Mexický


44. Vajíčkový


45. Pochúťkový


46. Pikantný


47. Šalát sleďový

Mexico lahôdky neprítomná --

48. Korunky

sleďové konzerva neprítomná --

49. Sunar

PPOVÚ neprítomná --

50. Zapečené

kuracie prsia pokrm neprítomná --

51. Vyprážaný

syr pokrm neprítomná --

52. Maďarský

perkelt pokrm neprítomná --

53. Segedínsky

guláš pokrm neprítomná --

54. Bravčové na

šampiónoch pokrm neprítomná --

55. Tirolské rožky

s makom pokrm neprítomná --

56. Bratislavský

tokáň pokrm neprítomná --

48


Číslo


Druh

vzorky

Výsledky


Horizontálna

metóda API test

57. Dunajský

rezeň pokrm neprítomná --

58. Moravské

koláče pokrm neprítomná --

59. Hrachová

polievka pokrm neprítomná --

60. Cestovinový

šalát s tuniakom lahôdky neprítomná --

61. Kapustový

šalát s uhorkou lahôdky neprítomná --

62. Hamánek

morka konzerva neprítomná --

63. Mrkva

so zemiakmi PPOVÚ neprítomná --

64. Sviečková

na smotane pokrm neprítomná --

65. Parená

knedľa pokrm neprítomná --

66. Kapustový

šalát s mrkvou lahôdky neprítomná --

67. Šampiňónové

rizoto so syrom pokrm neprítomná --

68. Pikantný

šalát lahôdky prítomná L. monocytogenes

69. Bulharský


70. Lahôdkový


49


Číslo


Druh

vzorky

Výsledky


Horizontálna

metóda API test

71. Ryžová mliečna

kaša PPOVÚ neprítomná --

72. Mliečna kaša

ovocná PPOVÚ neprítomná --

73. Mliečna kaša

medová PPOVÚ neprítomná --

74. Grécky


75. Holandský


76. Taliansky


77. Šalát

orient lahôdky neprítomná --

78. Valibuk


79. Jarné závitky

s peč. zemiakmi pokrm neprítomná --

80. Kuracie kúsky

s hranolkami pokrm neprítomná --

81. Kuracie stehno

s ryžou pokrm neprítomná --

82. Valibuk


83. Šopský

šalát pokrm neprítomná --

84. Gazdovský

biely syr SS neprítomná --

50


Číslo


Druh

vzorky

Výsledky


Horizontálna

metóda API test

85. Pečené

rebierka pokrm neprítomná --

86. Čerstvá

pažítka ČZ neprítomná --

87. Zemiakové

pyré pokrm neprítomná --

88. Rajčinový

šalát PP neprítomná --

89. Uhorkový


90. Varené

vajce pokrm neprítomná --

91. Zeleninová

polievka pokrm neprítomná --

92. Vlašský


93. Šampiňónový


94. Kapustový


95. Surová mrkva

krájaná ČZ neprítomná --

96. Naložené

hydinové mäso PT neprítomná --

97. Dusená

ryža pokrm neprítomná --

98. Zemiakový šalát

s vajciami lahôdky neprítomná --

51


Číslo


Druh

vzorky

Výsledky


Horizontálna

metóda API test

99. Zelená paprika


100. Kapusta



PPOVÚ – potraviny pre osobitné výživové účely

PT – polotovar

PP – príloha pokrmu

ČZ – čerstvá zelenina

SS – sladké syry

Obr. 8 Identifikácia pozitívn

Obr. 9 Identifikácia pozitívn

52

Identifikácia pozitívn ej vzorky č. 11 pomocou testov API Listeria

Identifikácia pozitívn ej vzorky č. 68 pomocou testov API Listeria

Listeria

Listeria

53

Obr. 10 Identifikácia pozitívnej vzorky č. 78 pomocou testov API Listeria


54



55

Záver

Bezpečnosť a kontrola potravín sú v dnešnej modernej dobe jedným

z rozhodujúcich faktorov, ktoré hýbu svetom potravín.

Diplomová práca bola vypracovaná za účelom kontroly rôznych druhov potravín

na prítomnosť nebezpečných patogénnych baktérií Listeria monocytogenes.

Celý proces kontroly potravín pozostával z dvoch krokov a to:

- diagnostika rodu Listeria,

- identifikácia druhu.

Na diagnostiku rodu Listeria sme použili referenčnú metódu tzv. horizontálnu

metódu dôkazu prítomnosti baktérií rodu Listeria podľa STN EN ISO 11290 – 1:1996.

V prípade zistenia pozitívneho výsledku, a teda dokázania prítomnosti baktérií rodu

Listeria, sme vykonali následne identifikáciu druhu. Na identifikáciu sme použili testy

API Listeria.

Vyšetrili sme 100 druhov rôznych potravín (n = 100). Najväčšie zastúpenie

medzi vzorkami potravín mali lahôdkárske výrobky (46 %), hotové pokrmy (34 %)

a potraviny pre osobitné výživové účely (8 %). Menšie zastúpenie mali vzorky ako

čestvá zelenina (4 %), konzervy a prílohy pokrmov (po 3 %), a najmenšie polotovary

a sladké syry (po 1 %). Vyšetrenie ukázalo, že pozitívnych bolo 6 vzoriek, čo

predstavovalo 6 % z celkového počtu vzoriek. Vo všetkých pozitívnych vzorkách sme

identifikovali baktériu Listeria monocytogenes. Výskyt tejto baktérie bol

identifikovaný výlučne len v lahôdkárskych výrobkoch. Podľa Nariadenia Komisie

(ES) č. 1441/2007 z 5. decembra 2007, ktorým sa mení a dopĺňa nariadenie (ES)

č. 2073/2005 z 15. novembra 2005 o mikrobiologických kritériách pre potraviny sme

vzorky potravín, v ktorých bola identifikovaná prítomnosť L. monocytogenes,

považovali za nevyhovujúce, nakoľko prekročili limit neprítomnosti v 25 g.

Baktéria Listeria monocytogenes sa v súčasnej dobe radí k jedným

z najnebezpečnejších patogénych mikroorganizmov a preto je veľmi dôležité ju

sledovať a kontrolovať či už v prvovýrobe alebo pri samotnom predaji. Listeria

monocytogenes je pôvodcom závažného ochorenia nazývaného listerióza.

Navrhovali by sme prísnejšie a pravidelnejšie monitorovanie prítomnosti

baktérie L. monocytogenes v potravinách.

56

Zoznam použitej literatúry

1. AZIZOGLU, R. O. - KATHARIOU, S. 2010. Temperature-Dependent

Requirement for Catalase in Aerobic Growth of Listeria monocytogenes F2365.

In: Applied And Environmental Microbiology, vol. 76, 2010, no. 21, p. 6998-

7003.

2. BADAOUI, M. N. - CHIKINDAS, M. - , MONTVILLE, T. J. 2007. Changes in

Listeria monocytogenes Membrane Fluidity in Response to Temperature Stress.

In: Applied And Environmental Microbiology, vol. 73, 2007, no. 20, p. 6429-

6435.

3. BEDNÁŘ, M. - FRAŇKOVÁ, V. - SCHINDLER, J. – SOUČEK, A. –

VÁVRA, J. 1996. Lékařská mikrobiologie, bakteriologie, virologie,

parazitologie. Praha 2 : Marvil, 1996, 558 s.

4. bioMérieux, 2007. API Listeria – systém pro identifikaci listerií. Manuál

výrobcu.

5. BLAŽKOVÁ, M. - KARAMONOVÁ, L. - FUKAL, L. - RAUCH, P. 2005.

Listeria monocytogenes – nebezpečný patogen a jeho detekce v potravinách.

In Chemické listy, roč. 99, 2005, s. 467-473.

6. CABANOVÁ, L. - KANTÍKOVÁ, M. 2006. Listeria monocytogenes – jej

výskyt v potravinárstve. In Slovenský veterinársky časopis, roč. 31, 2006, č. 2,

s. 80-81. ISSN 1335-0099.

7. ČARNOGURSKÝ, J. 2007. Modelovanie vybraných parametrov prežívania

Listeria monocytogenes v potravovom reťazci. Autoreferát dizertačnej práce,

Nitra: SPU, 2007.

8. DEMNEROVÁ, K. - KARPÍŠKOVÁ, R. - PAZLAROVÁ, J. 2008.

Mikrobiologická bezpečnost potravin: Listeria monocytogenes a Enterobacter

sakazakii. In Výživa a potraviny, roč. 63, 2008, č.1, s. 9-10.

9. DEN BAKKER, H. C. - CUMMINGS, C. A. - FERREIRA, V. - VATTA, P. -

ORSI, R. H. - DEGORICIJA, L. - BARKER, M. - PETRAUSKENE, O. -

FURTADO, M. R. - WIEDMANN, M. 2010. Comparative genomics of the

bacterial genus Listeria: Genome evolution is characterized by limited gene

acquisition and limited gene loss. BMC Genomics, vol. 11, 2010, p. 688.

57

10. DUMONT, J. - COTONI L. 1921. Bacille semblable à celui du rouget du porc

rencontré dans le L.C.R. d’un méningitique. Ann. Inst. Pasteur, vol. 35, 1921,

p. 625–633.

11. EPIS, 2010. Epidemiologický informačný systém. Dostupné na internete:

www.epis.epis.sk [cit. 2010-12-30].

12. ERBAN, V. 2007. Listerie a jimi způsobená onemocnění. In Výživa a potraviny,

roč. 62, 2007, č. 2, s. 43-44.

13. GELBÍČOVÁ, T. - KARPÍŠKOVÁ, R. 2008. Nálezy Listeria monocytogenes

v potravinách z tržní síte České republiky. III. Vedecká konferencia doktorantov

s medzinárodnou účasťou, 28. November 2008, SPU Nitra, s. 156-153, ISBN-

978-80-552-0138-2.

14. GOLIAN, J. - ZELEŇÁKOVÁ, L. 2010. Ochorenia z potravín. Nitra: SPU,

2010, 105 s. ISBN 978-80-552-0328-7.

15. GÖRNER, F. - VALÍK, Ľ. 2004. Aplikovaná mikrobiológia požívatín.

Bratislava: Malé centrum, 2004, 528 s. ISBN 80-967064-9-7.

16. GRAY, M. L. – KILLINGER, A. H.1966. Listeria monocytogenes and listeric

infections. Bacteriol. Rev. Vol. 30, 1966, p. 309-382.

17. GREENWOOD, D. - SLACK, R. - PEUTHERER, J., et al. 1999. Lekářská

mikrobiologie Přehled infekčních onemocnění: patogeneze, imunita,

laboratorní diagnostika a epidemiologie. Praha : Grada Publishing,

1999. 686 s. ISBN 80-7169-365-0.

18. HALÁNOVÁ, M. - ČISLÁKOVÁ, L. - KALINOVÁ, Z. 2008. Epidemiologická

situácia vo výskyte vybraných zoonóz v SR v roku 2007. In Slovenský

veterinársky časopis, roč. 33, 2008, č. 5, s. 279. ISSN 1335-0099.

19. HOF, H. - NICHTERLEIN, T. - KRETSCHMER, M. 1994. When are Listeria

in foods a health risk? In Trends Food Sci. Technol., 1994, no. 5, p. 185-190.

20. HOLKO, I. - URBANOVÁ, J. - KANTÍKOVÁ, M. - KMEŤ, V. 2001. Detekcia

Listeria monocytogenes v potravinách metódou polymerázovej reťazovej reakcie

– Nested PCR. In Slovenský veterinársky časopis, roč. 26, 2001, č. 1, s. 35-37.

ISSN 1335-0099.

21. HÜLPERS, G. 1911. Lefvernekros hos kanin orsakad af en ej förut beskrifven

bakterie. (Liver necrosis in rabbit caused by an hitherto unknown bacterium).

Svensk Vet. Tidskrift, vol. 2, 1911, p. 265-273.

58

22. CHRISTIE, R. - ATKINS, N. E. - MUNCH-PETERSEN, E. 1944. Australian

Journal of Experimental Biology and Medical Science, vol. 22, 1944, p. 197 –

200.

23. JACKOVÁ, S. - BÜCHLEROVÁ, Z. - HLINKA, D. - BORSUKOVÁ, O. 2001.

Listeria monocytogenes v potravinách a surovinách živočíšneho pôvodu na

Slovensku – aktuality 1999. In Slovenský veterinársky časopis, roč. 26, 2001,

č. 2, s 98. ISSN 1335-0099.

24. JURIŠ, P. 1998. Základy virológie, bakteriológie, epidemiológie

a mikrobiologickej laboratórnej práce. CVT FHPV PU, Prešov, 1998, ISBN 80-

88885-48.

25. KONEČNÝ, S. 2007. Nemoc z potravin, o které se mluví – listerióza. In Maso,

roč. 18, 2007, č. 1, s. 37-38.

26. KUCHTA, T. 2009. Aspekty využitia polymerázovej reťazovej reakcie na

kontrolu hygieny potravín. In Zborník prednášok a posterov z medzinárodnej

vedeckej konferencie Hygiena alimentorum XXX 2009, Košice: UVL, s. 221-

222.

27. MacGOWAN, A. P. - MARSHALL, R. J. - REEVES, D. S. 1989. Evaluation of

API 20 STREP system for identifying Listeria species. J. Clin. Pathol., vol. 42,

1989, p. 548-550.

28. MAJTÁNOVÁ, Ľ. - MAJTÁN, V. 2000. Potravou prenášané bakteriálne

infekcie. In Výživa a zdravie, roč. 45, 2000, č. 2, s. 32-33.

29. MUKHERJEE, K. - ALTINCICEK, B. - HAIN, T. - DOMANN, E. -

VILCINSKAS, A. - CHAKRABORTY, T. 2010. Galleria mellonella as a model

system for studying Listeria pathogenesis. Applied And Environmental

Microbiology, vol. 76, 2010, no. 1, p. 310-317.

30. MURRAY, E. G. D. – WEBB, R. A. – SWANN, M. B. R. S. 1926. A disease of

rabbits characterized by large mononuclear leucocytosis, caused by a hitherto

undescribed bacillus, Bacterium monocytogenes (n. sp.). J. Pathol. Bacteriol.

Vol. 29, 1926, p. 407-439.

31. NADZONOVÁ, B. 2008. Laboratórna diagnostika listeriózy – odber, transport

a diagnostika klinického materiálu. In Zoonózy – spoločná ochrana zdravia ľudí

a zdravia zvierat, 2008, s. 25.

59

32. Nariadenie Komisie (ES) č. 1441/2007 z 5. decembra 2007, ktorým sa mení

a dopĺňa nariadenie (ES) č. 2073/2005 z 15. novembra 2005

o mikrobiologických kritériách pre potraviny.

33. NYFELT, A. 1929. Etiologie de la mononucléose infectieuse. C. R. Soc. Biol.

Vol. 101, 1929, p. 590–591.

34. ODJADJARE, E. E. O. - OBI, L. C. - OKOH, A. I. 2010. Municipal wastewater

effluents as a source of Listerial pathogens in the aquatic milieu of the Eastern

Cape province of South Africa: A concern of public health importance.

International journal of environmental research and public health, 2010, no. 7,

p. 2376-2394. ISSN 1660-4601.

35. PETRÍKOVÁ, J. 2003. Alimentárne nákazy. In Trendy v potravinárstve, roč. 10,

2003, č. 5, s. 7-11. ISSN 1336-085X.

36. SEDLÁK, K. - TOMŠÍČKOVÁ, M., 2006. Nebezpečné infekce zvířat a člověka.

Praha: Scienta, 2006, 167 s. ISBN 80-86960-07-2.

37. SEELIGER, H. P. R. 1988. Listeriosis-history and actual developments.

Infection, vol. 16, 1988, p. 80-84.

38. SCHMID, M. W., NG, E. Y., LAMPIDIS, R., EMMERTH, M., WALCHER,

M., KREFT, J., GOEBEL, W., WAGNER, M., SCHLEIFER, K. H. 2005,

Evolutionary history of the genus Listeria and its virulence genes. Syst. Appl.

Microbiol. Vol. 28, 2005, p. 1-18.

39. SJÖMAN, M. 2010. The use of serotyping and PFGE-typing of Listeria

monocytogenes in food processing contamination studies and human foodborne

infections. Academic dissertation, Helsinki: University of Helsinki, 2010.

40. SOKOL, J. - ČARNOGURSKÝ, J. - ŠNIRC, J. - PAŽUT, V. - GOLIAN, J. -

RAJSKÝ, D. - IGLOVSKÁ, N. 2007. Listeriózy – ich epidemiologické aspekty.

In Zborník prác z medzinárodnej vedeckej konferencie bezpečnosť a kontrola

potravín, Nitra: SPU, s. 98-102. ISBN 978-80-8069-860-7.

41. STN EN ISO 11290 – 1:1996.

42. STN EN ISO 11290 – 1:1996/AM1:2004.

43. STN EN ISO 6887 Mikrobiológia. Všeobecné pokyny na prípravu riedení pri

mikrobiologickom skúšaní.

44. STN ISO 7218 Mikrobiológia potravín a krmív. Všeobecné pravidlá

mikrobiologického skúšania.

60

45. ŠILHÁNKOVÁ, Ľ., 2008. Mikrobiologie pro potravináře a biotechnology.

Praha: Academia, 2008, 363 s. ISBN 978-80-200-1703-1.

46. ŠNIRC, J. - SOKOL, J. - SEGINKO, J. - HERA, A., 2007. Klinická veterinárna

farmakológia. Martin: Neografia, 2007, 1183 s. ISBN 978-80-88892-75-5.

47. TÓTH, L. - BELIČKOVÁ, E. 1997. Každý výskyt Listeria monocytogenes

v potravinách je rizikom zdravia? In Slovenský veterinársky časopis, roč. 22,

1997, č. 5, s. 240-243. ISSN 1335-0099.

48. VÁZQUEZ-BOLAND, J.A. - KUHN, M. - BERCHE, P. - CHAKRABORTY,

T. - DOMÍNGUEZ-BERNAL, G. - GOEBEL, W. - GONZÁLEZ-ZORN, B. -

WEHLAND, J. - KREFT, J. 2001. Listeria pathogenesis and molecular

virulence determinants. Clinical Microbiology Reviews, vol. 14, 2001, no 3,

p. 584–640.

49. VOLOKHOV, D. – GEORGE, J. – ANDERSON, CH. – DUVALL, R. E. –

HITCHINS, A. D. 2006. Discovery of Natural Atypical Nonhemolytic Listeria

seeligeri Isolates. Applied And Environmental Microbiology, vol. 72, 2006, no.

4, p. 2439–2448.

50. URL1>http://www.healthmad.com/conditions-and-diseases/listeriosis/, [cit.

2011-01-06]

51. URL2>http://www.svssr.sk [cit. 2007-01-15]

52. URL3>http://www.sciencephoto.com/images/download_lo_res.html?id=778740

743

53. URL4>http://www.svps.sk/potraviny/info_Listeria_monocytogenes.asp [cit.

2010-11-05]

54. URL5>http://www.topnews.in/now-more-effective-nisin-antibiotics-fight-

foodborne-superbugs-pathogens-2145733 [cit. 2009-03-31]

61

Prílohy

Obr. 14 Listeria monocytogenes, mikroskopický pohľad (URL 5, 2009)

Obr. 15 Listeria monocytogenes, pohľad elektrónovým mikroskopom (URL 1,

2011)

62

Obr. 16 Automatický dávkovací prístroj DILUMAT 3 mk 2

- pre štandardné riedenie pevných alebo kvapalných vzoriek,

- presné, opakovateľné a rýchle, že spĺňa požiadavky normy ISO 6887-1,

- automatická kalibrácia.

Obr. 17 Stojan so vzorkou

63

Obr. 18 Kolónie L. monocytogenes na krvnom agare

Obr. 19 Kolónie L. monocytogenes na agare ALOA

64

Obr. 20 Testovací prúžok API Listeria

Obr. 21 Testovací prúžok API Listeria (URL 3)

slovenskÁ po ĽnohospodÁrska univerzita v...

Documents