Struttura terziaria del

DNA

Struttura terziaria del DNA

• Molte molecole naturali di DNA sono circolari, senza code 3’ o 5’ libere.

• La maggior parte del DNA circolare naturale é superavvolto.

• Il tipo di struttura tridimensionale che coinvolge un’organizzazione di ordine superiore degli elementi, come il superavvolgimento, è detta struttura terziaria.

The shape and the dynamic of a DNA chain is strongly affected not only by the sequence but also

by topological constrictions

In virus capsid-highly packed

Bustamante Lab. BerkeleySteve Harvey Lab.

10 mm longlinear DNAis packed in a 40-50 nmsize box

In bacteria

(see DNA supercoiling)

A TT AG CC G

G C

TA

T

AG

C

C G

G C

T A

A T

Packaging DNA

Histone proteins

Histoneoctamer

B DNA Helix 2 nm

A TT AG CC G

G C

TA

T

AG

C

C G

G C

T A

A T

Packaging DNA

Histone proteins

B DNA Helix

Histoneoctamer

2 nm

A TT AG CC G

G C

TA

T

AG

C

C G

G C

T A

A T

Packaging DNA

Histone proteins

Histoneoctomer

Nucleosome

11 nm

B DNA Helix 2 nm

Modello JmolNucleosome.pdb

Packaging DNA

A TT AG CC G

C G

G C

T A

A T

Packaging DNA

A TT AG CC G

C G

G C

T A

A T

Packaging DNA

A TT AC G

C G

G C

T A

A T

Protein scaffold

11 nm“Beads on a string”

30 nmTight helical

fiber

Looped Domains200 nm

Packaging DNA

G

C

A

T

Protein scaffold

Metaphase Chromosome

700 nm

11 nm

30 nm 200 nm

2 nm

Looped Domains

Nucleosomes

B DNA Helix

Tight helical fiber

Cenni sulla topologia del DNA

Il DNA può essere superavvolto: l’asse dell’elica del DNA può essere, in natura, avvolto a sua volta in un’elica stabile. Per essere stabile, il DNA deve formare un dominio topologico chiuso, ad esempio il DNA deve essere covalentemente chiuso:circolare.

DNA circolare rilassato superavv. solenoidale superavv. plectonemico

Il DNA superavvolto può essere di tipo solenoidale o plectonemico (intrecciato)

How do we describe the topology of ccDNA?

Linking NumberIf the ends of the double helix arebrought together,the # of times W passes around Cis a Topologicalconstant, which cannot be changedwithout cutting thestrands.This number is calledLINKING NUMBER

Pulling the two strandsapart without nicking them,

the number of crossings does not change

Il numero di Linking

Definizione: È il numero di volte che una catena di DNA è connessa ad un’altra in modo tale che se voglio disconnetterle devo rompere un legame covalente.

Da una proiezione (come quelle sopra) si ottiene Lk sommando algebricamente il numero degli incroci (con il loro segno) e dividendo per 2. La somma algebrica serve a contare in modo appropriato gli incroci “veri” e distinguerli dalle sovrapposizioni della proiezione.

+ + - -

1 -1 2 -2

+ + - -

With six positive crossings and two negative crossings, these curves have linking number two.

Computing the linking number

Il numero di Linking

Lk0 = 20

Il numero di Linking di due curve nello spazio è:• indipendente dalla proiezione scelta (è una proprietà topologica delle curve e non della proiezione spaziale scelta);• Invariante per deformazioni continue delle curve, a meno che una delle curve non sia tagliata: è definito solo per DNA covalentemente chiusi. Lk è invariante se le due curve sono costrette su un piano o superavvolte nello spazio;•Lk è sempre intero, siccome due curve possono essere connesse l’una all’altra solo un numero intero di volte;• Il segno di Lk cambia se l’orientazione di una delle curve è invertita;• l’operazione di riflessione rispetto ad un piano di simmetria genera due curve con Lk invertito di segno.

1 -1 2 -2

Lk0 = Tw0

Il numero di Linking del DNA rilassato

Lk° è N/h, dove N è il numero delle basi e h le basi/spira,

Si comprende che il processo di introdurre superavvolgimenti in una molecola di DNA (svolgimento o sovravvolgimento dell’elica destrogira prima della chiusura di una molecola lineare in una circolare) riduce o aumenta il numero di giri d’elica intrappolati dalla chiusura e risulta in un cambiamento del numero Lk delle specie circolari.

Se Lk° corrisponde (all’incirca) al topoisomero con minori costrizioni possibili rispetto allo stato lineare, il topoisomero circolare rilassato, allora la variazione da Lk° è una misura del superavvolgimento.

∆Lk= Lk–Lk° è la differenza di linking o deficit di linking, che può essere positivo o negativo. Nel DNA naturale, ∆Lk<0, essendo questo sottoavvolto rispetto al DNA lineare.

Più precisamente, Lk° è N/h, dove N è il numero delle basi e h le basi/spira, e può essere un numero non intero. E’ il caso di chiusura “rilassata” ideale, che spesso non si può ottenere (spesso i topoisomeri più rilassati hanno ∆Lk= ±0.5 o simile.) Lk° non è un vero numero di linking (che deve essere intero), ma uno stato di riferimento (il numero di linking più prossimo è spesso chiamato Lkm).

L’introduzione del superavvolgimento equivale all’aggiunta di uno stress torsionale, tanto maggiore quanto corta è la molecola: ∆ Lk è spesso normalizzata per Lk°:

= (Lk–Lk°)/Lk° detto differenza di linking specifica (densità di superavv.)Nel DNA naturale, = –0.06, in media.

Generalmente, il Tw può essere definito tramite vettori ruotanti che puntino da una curva C1 all’altra C2. Per due curve che si avvolgono lungo un asse rettilineo, Tw è pari all’angolo di rotazione dei vettori diviso per 2π. Il caso di una curva circolare planare è analogo. Più in generale, qualora le curve non siano lineari o planari, e sia definibile la superficie di un “nastro” che le collega,

In generale il Tw può non essere intero e cambia a seguito di deformazioni della curva C1 o della superficie che collega C1 a C2.

Il numero di Twist del DNA È il numero di volte che una catena si avvolge sull’altra. questo numero è positivo se l’elica è destrogira, negativo se è levogira.

Il Twist (Tw) non è necessariamente un numero intero, e nella maggior parte dei casi non lo è.

In genere la lunghezza del DNA ed il suo passo in soluzione permettono di definire Tw=lunghezza(bp)/passo(bp/spira)

Il numero di WritheÈ il numero di volte che l’asse dell’elica si avvolge su se stesso nello spazio. Il writhe (Wr) dipende solamente dalla traiettoria dell’asse della doppia elica nello spazio, non dal fatto che il DNA abbia 2 eliche avvolte l’una sull’altra.

Wr non ha necessariamente un valore intero. Se la traiettoria del DNA giace su un piano, Wr è sempre 0. Wr=0 anche se la traiettoria del DNA giace su una superficie sferica.

Come mostrato in una delle diapositive precedenti, il DNA può avvolgersi nello spazio in due modi, essenzialmente: se si avvolge attorno a se stesso lo fa generalmente nel modo plectonemico (intrecciato), se si avvolge intorno ad un oggetto, lo fa in modo solenoidale. In soluzione il writhe isomerizza tra le due forme.

Il legame tra Tw, Wr e LkLa relazione fondamentale che lega i tre descrittori del superavvolgimento è:

Lk=Tw+WrChe lega una proprietà topologica, il linking (intero), con due proprietà geometriche, il twisting ed il writhing (interi o frazionari). Per ogni valore di Lk, esiste una distribuzione di forme all’equilibrio che ripartiscono il Tw ed il Wr in modo differente. Nelle forme a basso Wr (in valore assoluto), la tensione torsionale è principalmente a carico del twist dell’elica (l’elica è sotto tensione, con un numero diverso di basi/spira rispetto allo stesso DNA lineare in soluzione); nelle forme ad alto Wr, la tensione torsionale è scaricata grazie al superavvolgimento dell’asse dell’elica, mentre localmente il DNA non è alterato.

Il superavvolgimento negativo (ottenuto mediante legame in forma di superelica sinistrorsa con le proteine) è un modo per immagazzinare tensione elastica che può essere spesa per svolgere un certo numero di spire d’elica, processo necessario per il funzionamento degli enzimi che interagiscono con una catena del DNA alla volta (le polimerasi, ad esempio.

Supercoiling e trascrizioneDurante la trascrizione, il complesso RNAPol-RNAnascente rappresenta un oggetto molto grande, probabilmente anche associato ad altre parti della cellula, per cui praticamente stazionario. Il DNA deve muoversi relativamente alla polimerasi, passandogli attraverso. Ci deve essere un moto rotatorio relativo tra DNA e RNAPol; Il moto in avanti causerebbe un accumulo di twist di fronte alla proteina ed un deficit alle spalle. Questo dovrebbe, di conseguenza, manifestarsi come un superavvolgimento positivo di fronte ed uno negativo alle spalle della polimerasi. Siccome la trascrizione non rompe le catene di DNA, la tensione non può scaricarsi da sola. Se il meccanismo avviene in un plasmide libero in soluzione, supercoiling positivo e negativo possono ricombinarsi per annullarsi (per visualizzarlo, Liu e Wang misero in soluzione una topoisomerasi in grado di rilassare istantaneamente solo il superavvolgimento negativo ...)

In modo simile si possono formare le giunzioni di Holliday

Sequenze palindromiche possono estrudere strutture cruciformi

Come posso determinare il superavvolgimento?

L’effetto degli intercalanti:Un intercalante contiene una struttura planare aromatica, usualmente policiclica, che si può inserire tra due coppie di basi del DNA. Questo causa uno svolgimento locale dell’elica, che risulta in un incremento del numero di basi per spira (helical repeat) quindi una diminuzione del twist.

Ad esempio, il Bromuro di etidio lega fortemente il DNA a doppia catena (ed ha un grande incremento della fluorescenza quando è legato) ed il legame di ogni molecola di etidio causa uno svolgimento locale di 26°.

NC2H5NH2

Br

NH2

NCl

NHN(C2H5)2

CH3

Bromuro di etidio

Clorochina

Dall’equazione generale ∆Lk= ∆Tw + ∆Wr, un decremento del Tw corrisponde ad un incremento del Wr, per cui un aumento della quantità di etidio nel DNA corrisponderà ad una transizione verso valori sempre più positivi di Wr. Si noti che la concentrazione di 1µg/ml utilizzata abitualmente per la gel elettroforesi satura completamente il DNA di etidio.

L’effetto del bromuro di etidio sul DNA superavvolto

+EthBr +EthBr

+EthBr Topoisomerasi I –EthBr

Le topoisomerasi sono enzimi che agiscono sullo stato topologico del DNA, tagliandolo e ricucendolo. La Topoisomerasi I, ad esempio, rilassa il DNA superavvolto (riduzione del Wr).

Wr<0 Wr=0 Wr>0

Wr=0 Wr>0 Wr=0 Wr<0

La misura sperimentale del superavvolgimento:Sono svariati i metodi che possono dare informazioni sul DNA superavvolto, i metodi più diretti sono l’osservazione microscopica, con particolare riguardo ai metodi che possono dare informazioni tridimensionali (AFM, CryoEM). Le prime osservazioni al microscopio elettronico risalgono al lavoro di Vinograd del 1963, l’anno a cui si fa risalire la scoperta del DNA circolare (avvenuta grazie a studi di velocità di sedimentazione di DNA di polyoma virus) e del superavvolgimento del DNA. Dalle osservazioni microscopiche si nota molto bene il fenomeno del “branching” per il quale la tensione elastica del superavvolgimento può dare vita a strutture plectonemiche ramificate, nello stesso modo in cui può generare strutture plectonemiche lineari.

Dalle osservazioni al microscopio, congiunte a quelle biochimiche si è giunti alla conclusione che il ∆Lk si ripartisce per circa il 70% in writhing e per il restante 30% in twisting. Questa ripartizione dipende dal rapporto tra le elasticità torsionale e flessurale del DNA: se costa molta più energia torcere il DNA che piegarlo, allora la tensione elastica del sottoavvolgimento si scarica soprattutto sul writhe, che consente di recuperare una torsione di equilibrio; viceversa, se costa molta più energia piegare il DNA piuttosto che torcerlo, la tensione dell’avvolgimento si localizzerà prevalentemente a livello di twisting, senza aumentare il writhing (che comporta una piegatura più accentuata di sezioni del DNA).

Si può prevedere che sezioni del DNA che possono assumere forme curvate, siano più facilmente localizzate nei “loop” delle forme intrecciate, piuttosto che nei pressi degli incroci, dove il DNA è più dritto. Si può comunque prevedere che la barriera energetica per l’interconversione sia piuttosto bassa, probabilmente sotto kT, per cui possa facilmente avvenire uno slittamento del DNA che, associato al “branching” consentirà ad un tratto di DNA di essere presente alternativamente in zone di loop o di incrocio.

Un campione di DNA superavvolto al microscopio: nella maggioranza delle preparazioni sono compresenti molecole superavvolte, molecole circolari “nicked” che restano rilassate e molecole lineari (la frazione di queste ultime forme aumenta se il campione viene “maltrattato” perché il DNA sotto tensione di superavvolgimento è fragile e basta anche un solo “nick” per permettergli di rilassare il superavvolgimento).

Un esempio sperimentale: la determinazione di Wr in microscopiaPer misurare Wr i metodi di microscopia ad alta risoluzione sono tra i più utilizzati, poiché permettono di determinare direttamente la traiettoria dell’asse della doppia elica del DNA nello spazio (o più spesso in un piano).

Un esempio: TEM di DNA superavvolto

Una immagine AFM di DNA superavvolto (molecola di pBR322, 4361 bp): l’AFM ottiene direttamente informazioni tridimensionali e può determinare direttamente e semplicemente la traiettoria tridimensionale dell’asse molecolare della molecola osservata, per poterne calcolare il Wr: si determina direttamente la chiralità del superavvolgimento.

Studi mediante gel-elettroforesiLa mobilità elettroforetica del DNA superavvolto dipende dal grado di superavvolgimento: è facile, in opportune condizioni, distinguere i vari topoisomeri. La mobilità elettroforetica aumenta in modo monotono con l’aumento del valore assoluto del numero di Linking. Questo è dovuto al fatto che topoisomeri dotati di maggiore differenza di linking, hanno maggiore writhe, per cui sono più compatti. Questo è vero a meno che non avvengano transizioni conformazionali che alterino lo stress del superavvolgimento.

Per i campioni di DNA superavvolto nativo di tipo circolare (plasmidi), la distribuzione di topoisomeri è spesso molto stretta ed a valori molto alti, per cui non è facile distinguere su una normale elettroforesi i vari topoisomeri che costituiscono la popolazione.

Una corsa elettroforetica di DNA superavvolto con ∆Lk variabile da 0 a 8. Ogni banda contiene DNA assolutamente uguale (stessa sequenza, lunghezza e peso molecolare) che differisce solo per Lk. OC rappresenta DNA “open circular” in cui le catene fosfoesteree sono state rotte almeno in un punto di una catena, per cui il DNA può rilassare, mantenendo una forma circolare. Una digestione con un enzima di restrizione avente un sito unico su questo DNA produrrebbe una sola banda in un gel elettroforetico analogo (banda che generalmente migra più velocemente di OC).

pBR322 nativoPozzetti

Circolare rilassatoLineare

Superavvolto

Gel elettroforesi + intercalantiNel 1975, Keller introdusse un metodo nuovo per caratterizzare il Lk del DNA superavvolto: l’introduzione di una quantità variabile di bromuro di etidio nel DNA durante la corsa elettroforetica modifica lo stress del superavvolgimento, in ragione di N/360, dove è il numero di molecole di intercalante che si lega per coppia di basi, è l’angolo di svolgimento della doppia elica indotto dall’intercalante, N è il numero di coppie di basi.

Una quantità opportuna di etidio aggiunta al DNA “nativo” (che è molto sottoavvolto e appare come una sola banda a migrazione veloce) lo svolge parzialmente fino a portarlo in un campo in cui i vari topoisomeri hanno mobilità visibilmente dipendente dal grado di superavvolgimento.

a b c

Lo stesso DNA nativo di SV40 fatto migrare su tre distinti (simili) gel elettroforetici contententi 0 (a), 0.016 (b), 0.06 µg/ml (c) di etidio bromuro. In (a) si notano solo la banda contenente tutti i topoisomeri, in (b) i topoisomeri sono stati separati grazie all’intercalazione, in (c) una maggiore concentrazione di etidio ha rilassato tutti i topoisomeri.

Se sono contenuti e risolti tutti i topoisomeri da Lk=0 a Lk nativo, uno può semplicemente contare il valore di Lk.

Un modo per contare ed assegnare direttamente i topoisomeri è l’elettroforesi bidimensionale, la cui introduzione si deve a James Wang

Un esempio reale di elettroforesi bidimensionale per un campione contenente molti topoisomeri

La risoluzione nella prima dimensione giunge a saturazione per topoisomeri oltre il 18-esimo.