technische universität induktion von phytoalexinen in...

Technische Universität

München

Induktion von Phytoalexinen in Vitis

vinifera Kalluskulturen durch

Hefeisolate

Fachgebiet Obstbau der Technischen Universtität München

Weihenstephan (Prof. Dr. Treutter)

Susanne Rü[email protected]


München

Induktion von Resveratrol-Derivaten durch epiphytische Stämme von Aureobasidium pullulans in Vitis vinifera Kalluskulturen

Rühmann Susanne, Dieter Treutter

Fachgebiet für Obstbau, Technische Universität München Weihenstephan, Alte Akademie 16, 85350 Freising, Germany

Pilzliche Pathogene wie Botrytis cinerea rufen weltweit erhebliche Ernteverluste im Weinanbau hervor. Untersuchungsansätze für einen umwelt-,

anwender- und gesundheitsfreundlichen Pflanzenschutz im Obstanbau weisen auf die mögliche Nutzung von nicht-pathogenen Mikroorganismen, wie zum

Beispiel Hefen, zur Eindämmung von pilzlichen Erregern hin. Ferner steht immer häufiger die Beteiligung von phenolischen Verbindungen als

wirkungsvoller Abwehrmechanismus gegen Pathogene im Mittelpunkt von Untersuchungen. In der vorliegenden Arbeit konnte durch Behandlungen mit

einem Kulturfiltrat des nicht-pathogenen, hefeähnlichen Pilzes Aureobasidium pullulans sowohl eine Induktion von konstitutiven phenolischen

Verbindungen als auch eine Neusynthese von abwehrrelevanten Resveratrol-Derivaten in Weinkalli hervorgerufen werden.

Es standen für diese Untersuchung Kalluskulturen der Rotweinsorten „Regent“ und „Nero“ (Vitis vinifera) als Versuchssystem und vier von Apfelblättern

endophytisch lebenden Isolate der Gattung Aureobasidium pullulans zur Verfügung. Die Kalli wurden in vitro auf modifizierten MS-Medien (Murashige

und Skoog) kultiviert. Nach einer 14-tägigen Vorkultur wurde das Hefekulturfiltrat dem Kulturmedium zugeführt und die Proben 5, 10, 24 und 48 Stunden

nach der Behandlung (HNB) entnommen. Der Phenylpropanoidgehalt der Kalli wurde mittels HPLC-Analyse bestimmt.

Durch eine Behandlung von Weinkalli mit dem Hefekulturfiltrat von Aureobasidium pullulans wurde sowohl eine signifikante Zunahme des

Phenylpropanoidgehaltes als auch eine von der Elicitor-Konzentration abhängige Ausrichtung des Sekundärstoffwechsels festgestellt. Eine niedrige

Elicitor-Konzentration führte zu einer deutlichen Indukltion der Flavonoidsynthese bei geringfügiger Resveratrol-Akkumulation, eine hohe Elicitor-

Konzentration resultierte in einer gesteigerten Akkumulation von Resveratrol-Derivaten bei verminderter Flavonoidbiosynthese. Ferner zeigten elicitierte

Weinkalli einen verzögerten Krankheitsverlauf nach einer Infektion mit Botrytis cinerea , was auf ein gesteigertes Resistenzpotential von Wein

Kalluskulturen durch eine Elicitation mit dem Hefekulturfiltrat hin deutet.


München

Beteiligung von phenolischen Verbindungen als

wirkungsvoller Abwehrmechanismus gegen Pathogene


München



Die mögliche Nutzung von nicht-pathogenen

Mikroorganismen zur Eindämmung von Pathogenen


München



Die mögliche Nutzung von nicht-pathogenen

Mikroorganismen zur Eindämmung von Pathogenen

Nutzung von nicht-pathogenen Mikroorganismen zur

Induktion von abwehrrelavanten Sekundärstoffen


MünchenWeinkallus

• Versuchsmaterial:

etablierte Weinkalli der Sorten „Regent“ und

„Nero“

• Kulturmedium:

(K2) ein MS-Medium (Murashige und Skoog) mit

5 ppm Indolessigsäure (IES) und 0,2 ppm BAP

• Die Weinkalli werden 14 Tage auf dem K2-Medium

bei 16 Stunden Belichtung und 22 °C vorkultiviert,

bevor die Elicitation erfolgt


München

Aureobasidium pullulans

(Bild: Mold Inspector Laboratory International)

Aureobasidium pullulans Hyphen und Sporen.

(Enius AG 2005)

Reich: Pilze

Stamm: Ascomycota

Unterstamm: Pezizomycotina

Ordnung: Eurotiomycetes

Familie: Dothioraceae

Gattung: Aureobasidium

Art: pullulans


München

Elicitorbehandlung von Weinkallus mit Hefekulturfiltrat

Probename nach

5h, 10h, 24h, 48h

Kontrolle Hefekulturfiltrat

5% und 50%

Hefe kultiviert

auf Plate Count-

Agar-Platten

Hefe 48 h auf dem

Schüttler mit 100

U/min in flüssigem K2

kultiviert

Hefesuspension:

• autoklavieren (abtöten der Zellen)

• abzentrifugieren

• Überstand => pH-Wert: 5,7

HefekulturfiltratWeinkulturmedium K2


München

• Gefriergetrocknete Kalli wurden methanolisch extrahiert, evt.

enzymatisch hydrolisiert.

• Extrakte wurden charakterisiert mittels:

• HPLC (Hochdruckflüssigkeitschromatographie)

• UV-Spektroskopie

• Dünnschichtchromatogrphie

Analysemethoden


München

Konstitutive Verbindungen


München

Pro

cyan

idin

B3

Pro

cyan

idin

B1

Cat

ech

in

Ep

icat

ech

ingal

lat

Ep

icat

ech

in

Flavanole von Weinkallus

Sta

nd

ard


München

Phenolische Säuren von

WeinkallusP

roto

cate

cusä

ure

Gal

luss

äure

der

ivat

P-C

um

arsä

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-Der

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arsä

ure

-Der

ivat

acyli

erte

s K

affe

esäu

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eriv

at

Sta

nd

ard


München

Flavonole und Anthocyane von

Weinkallus

Qu

erce

tin

-Glu

cosi

d

Qu

erce

tin

-Glu

cosi

d

An

tho

cyan

An

tho

cyan


München

Stilbene (Reveratrol-Derivate)

von Weinkallus

tran

s-R

esv

erat

rol

tran

s-P

icei

d

cis-

Pic

eid

tran

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esv

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Der

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Der

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Res

ver

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at


München

Kutikula

Epidermis

Botrytis cinerea Konidie

Abwehrverhalten von Vitis vinifera


München

Kutikula

Epidermis


Das Pathogen gibt Zellwand auflösende Enzyme ab



München

Kutikula

EpidermisResveratrol

Das Pathogen gibt zellwandauflösende Enzyme ab

Die pflanzliche Zelle erkennt diese Enzyme und reagiert mit einer

Akkumulation von Resveratrol-Derivaten


Resveratrol Resveratrol

1-3 mm



München

Kutikula

EpidermisResveratrol

Das Pathogen gibt zellwandauflösende Enzyme ab

Die pflanzliche Zelle erkennt diese Enzyme und reagiert mit einer

Akkumulation von Resveratrol-Derivaten

Resveratrol-Derivate bewirken :

Hemmung der Konidienatmung, vermindertes Mycelwachstum,

reduzierte Konidienkeimung, absterben der Pilzspore


Resveratrol Resveratrol

1-3 mm



München

Resveratrol-Derivate sind Pytoalexine


München

R6

R5

R4

R3

R2

R1 R2

R1

R3

R5

R6 R4

Stilbene R1 R2 R3 R4 R5 R6

Resveratrol OH H OH H OH H

Piceid GlcO H OH H OH H

Astringin (3‘-OH-Piceid) GlcO H OH OH OH H

Piceatannol OH OH H OH H OH

Pterostilben OCH3 H OCH3 H OH H

Resveratrolosid OH H OH H GlcO H

trans-Isomer cis-Isomer



München

HO

HO

HO

O

HO

OH

HO

HO

HO

OH

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O

-Viniferin

-Viniferin

R6

R5

R4

R3

R2

R1R2

R1

R3

R5

R6 R4











München

HO

HO

HO

O

HO

OH

HO

HO

HO

OH

OH

O

-Viniferin

-Viniferin

R6

R5

R4

R3

R2

R1R2

R1

R3

R5

R6 R4









fungizider Wirkungsgrad

Resveratrol < Pterostilben < ε-Viniferin



München

HO

HO

HO

O

HO

OH

HO

HO

HO

OH

OH

O

-Viniferin

-Viniferin

R6

R5

R4

R3

R2

R1R2

R1

R3

R5

R6 R4









fungizider Wirkungsgrad

Resveratrol < Pterostilben < e-Viniferin

glucosidierte Derivate < Aglykone



München

induzierte und neu synthetisierte

Verbindungen


München

HPLC-Chromatogramm von Weinkallus „Regent“ nach

einer Kontroll-Behandlung (100-198 min.)

tran

s-R

esv

erat

rol

tran

s-P

icei

d

cis-

Pic

eid


München


einer Kontroll-Behandlung (100-198 min.)tr

ans-

Pic

eid

cis-

Pic

eid

tran

s-R

esv

erat

rol


München


einer Hefe-Behandlung (100-198 min.)tr

ans-

Pic

eid

cis-

Pic

eid

tran

s-R

esv

erat

rol


München


einer Hefe-Behandlung (100-198 min.)tr

ans-

Pic

eid

cis-

Pic

eid

tran

s-R

esv

erat

rol

Res

ver

atro

l-D

eiv

at

Pall

ido

le

(dim

ere

Res

ver

atro

l-D

eriv

ate

oligomere Resveratrol-Derivate(Viniferine)

Res

ver

atro

l-D

eiv

at


München

0

5000

10000

15000

20000

Sum m e

Gesam t

0

200

400

600

800

Spekt.2 Hyd.Zim ts. Flavonole Anthocy.

0

2500

5000

7500

ein fache

Phenole

phenolische

Säure

monomere

Catech ine

oligomere

Catech ine

0

300

600

900

1200

1500

1800

Resveratrol m on.trans-

Resv.-D.

m on.cis-

Resv.-D.

Pallidol-D. olig.trans-

Resv.-D.

olig.cis-

Resv.-D.

olig.

trans/cis-

Resv.-D.

µg/g T S µg/g T S

unbehandelt behandelt mit behandelt mit

5% Hefefiltrat 50% Hefefiltrat

TS: Trockensubstanz

Spekt. 2: Verbindungen der Stoffgruppe Spektrum 2

Hyd. Zimts.: Hydroxyzimtsäuren

Anthocy.: Anthocyane

mon. trans-Resv.-D.: monomere trans-Resveratrol-Derivate

mon. cis-Resv.-D.: monomere cis-Resveratrol-Derivate

oligo. trans-Resv.-D.: oligomere trans-Resveratrol-Derivate

oligo. cis-Resv.-D.: oligomere cis-Resveratrol-Derivate

oligo. trans/cis-Resv.-D.: oligomere trans/cis-Resveratrol-

Derivate

Stoffgruppen phenolischer Inhaltstoffe von unbehandelten

und elicitierten Weinkalli


München

0

5000

10000

15000

20000

Sum m e

Gesam t

0

200

400

600

800


0

2500

5000

7500

ein fache

Phenole

phenolische

Säure

monomere

Catech ine

oligomere

Catech ine

0

300

600

900

1200

1500

1800


Resv.-D.

m on.cis-

Resv.-D.


Resv.-D.

olig.cis-

Resv.-D.

olig.

trans/cis-

Resv.-D.

µg/g T S µg/g T S

TS: Trockensubstanz









Derivate






München

0

5000

10000

15000

20000

Sum m e

Gesam t

0

200

400

600

800


0

2500

5000

7500

ein fache

Phenole

phenolische

Säure

monomere

Catech ine

oligomere

Catech ine

0

300

600

900

1200

1500

1800


Resv.-D.

m on.cis-

Resv.-D.


Resv.-D.

olig.cis-

Resv.-D.

olig.

trans/cis-

Resv.-D.

µg/g T S µg/g T S



TS: Trockensubstanz









Derivate




München

Phenylalanin

CO2H

NH2

Biosynthese von Stilbenen und Flavonoiden (Stoessl 1982)

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

1800

Summe

gesamtSumme

Phenole




München

Biosynthese von Stilbenen und Chalkonen nach Stoessl 1982

(Jeandet et al. 2002)

Phenylalanin

para-

Cumarsäure

CO2H

NH2

COOH

OH


0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

1800

Summe

gesamt0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

1800

p-

Cumarsäurep-Cumarsäure

Summe



p-Cumarsäure


München


(Jeandet et al. 2002)

Phenylalanin

para-

Cumarsäure

CO2H

NH2

COOH

OH


0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

1800

Summe

gesamt0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

1800

p-


Summe



+ 3 Malonyl-CoAp-cumaroyl-CoA

p-Cumarsäure


München

StilbenChalkon

Phenylalanin

para-

Cumarsäure

p-cumaroyl-CoA

CO2H

NH2

COOH

OH

OH

OH

OHOH

OH

OH O

OH

Chalkonsynthase Stilbensynthase


Flavonole

Anthocyane

Catechine

+ 3 Malonyl-CoA

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

1800

Summe

gesamt0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

1800

p-


Summe



Flavonoide

p-Cumarsäure


München

StilbenChalkon

Phenylalanin

para-

Cumarsäure

p-cumaroyl-CoA

CO2H

NH2

COOH

OH

OH

OH

OHOH

OH

OH O

OH



Flavonole

Anthocyane

Catechine

+ 3 Malonyl-CoA

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

1800

Summe

gesamt0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

1800

p-


Summe

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

1800

CatechineCatechine



Flavonoide

p-Cumarsäure


München

StilbenChalkon

Phenylalanin

para-

Cumarsäure

p-cumaroyl-CoA

CO2H

NH2

COOH

OH

OH

OH

OHOH

OH

OH O

OH



Flavonole

Anthocyane

Catechine

+ 3 Malonyl-CoA

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

1800

Summe

gesamt0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

1800

p-


Summe

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

1800

CatechineCatechine



Flavonoide?

p-Cumarsäure


München

StilbenChalkon

Phenylalanin

para-

Cumarsäure

p-cumaroyl-CoA

CO2H

NH2

COOH

OH

OH

OH

OHOH

OH

OH O

OH



Flavonole

Anthocyane

Catechine

+ 3 Malonyl-CoA

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

1800

Summe

gesamt

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

1800

Resveratrol

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

1800

p-

Cumarsäure

Resveratrol-Derivaten

p-Cumarsäure

Summe

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

1800

CatechineCatechine



Flavonoide

p-Cumarsäure


München

StilbenChalkon

Phenylalanin

para-

Cumarsäure

p-cumaroyl-CoA

CO2H

NH2

COOH

OH

OH

OH

OHOH

OH

OH O

OH



Flavonole

Anthocyane

Catechine

+ 3 Malonyl-CoA

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

1800

Summe

gesamt

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

1800

Resveratrol

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

1800

p-

Cumarsäure

Resveratrol

p-Cumarsäure

Summe

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

1800

CatechineCatechine



Flavonoide


p-Cumarsäure


München

StilbenChalkon

Phenylalanin

p-Cumarsäure

p-cumaroyl-CoA

CO2H

NH2

COOH

OH

OH

OH

OHOH

OH

OH O

OH



Flavonole

Anthocyane

Catechine

+ 3 Malonyl-CoA

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

1800

Summe

gesamt

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

1800

Resveratrol

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

1800

p-

Cumarsäure

Resveratrol

p-Cumarsäure

Summe

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

1800

CatechineCatechine



Flavonoide



München

StilbenChalkon

Phenylalanin

para-

Cumarsäure

p-cumaroyl-CoA

CO2H

NH2

COOH

OH

OH

OH

OHOH

OH

OH O

OH

Chalkonsynthase

Stilbensynthase


Flavonole

Anthocyane

Catechine

+ 3 Malonyl-CoA

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

1800

Summe

gesamt

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

1800

Resveratrol

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

1800

p-

Cumarsäure

Resveratrol

p-Cumarsäure

Summe

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

1800

CatechineCatechine



Flavonoide


p-Cumarsäure


München

Der Gesamtgehalt an phenolischen Inhaltstoffen wird durch eine Elicitation mit Hefekulturfiltrat induziert

Der Grad der Induktion erfolgt unabhängig von der Elicitorkonzentration

Gesamtphenole

Ergebnisse


München

Der Gesamtgehalt an phenolischen Inhaltstoffen wird durch eine Elicitation mit Hefekulturfiltrat induziert


Gesamtphenole

Aktivierung der Genexpression von PAL (Phenylalanin-Ammonium-Lyase)

erhöhte Enzymaktivität von PAL

Ergebnisse

Judith Pfeiffer (Lehrstuhl für Zierpflanzenbau und Gartenbauliche Pflanzenzüchtung WZW)


MünchenErgebnisse

Verschiedene Gruppen der phenolischen Stoffe

Das p-Cumarsäure -Derivat wird durch eine Elicitation mit Hefekulturfiltrat induziert


Aktivierung der Genexpression von PAL (Phenylalaninamooniumlyase)

erhöhte Enzymaktivität von PAL



MünchenErgebnisse


Das p-Cumarsäure -Derivat wird durch eine Elicitation mit Hefekulturfiltrat induziert


Das Ausgangssubstrat sowohl für den Flavonoid- als auch

für den Stilbenstoffwechsel

ist bei beiden Elicitokonzentrationen in gleichem Maß vorhanden


MünchenErgebnisse


Catechine werden durch eine Elicitation mit Hefekulturfiltrat induziert

Eine erhöhte Elicitorkonzentration führt zu einer verminderten Stoffakkumulation


MünchenErgebnisse




Naringenin

+ 3 Malonyl-CoApara-cumaroyl-CoA

Phenylalanin

Zimtsäure

PAL

CHS

Leukoanthocyanidin

Anthocyanidin

Catechin

Epicatechin

LAR

ANR

Hemmung der Genexpression von CHS (Chalkonsynthase),

LAR(Leukoanthocyanidinreduktase) und

ANR (Anthocyanidinreduktase)

unveränderte Enzymaktivität der CHS



MünchenErgebnisse









Resveratrol-Derivate werden induziert

Eine erhöhte Elicitorkonzentration führt zu einer erhöhten

Stoffakkumulation

Naringenin


Phenylalanin

Zimtsäure

PAL

CHS

Leukoanthocyanidin

Anthocyanidin

Catechin

Epicatechin

LAR

ANR


MünchenErgebnisse









Resveratrol-Derivate werden induziert

Eine erhöhte Elicitorkonzentration führt zu einer erhöhten

Stoffakkumulation

Aktivierung der Genexpression von

STS (Stilbensynthase)

erhöhte Enzymaktivität der STS

Naringenin


Phenylalanin

Zimtsäure

PAL

CHS

Leukoanthocyanidin

Anthocyanidin

LAR

ANR

STS

Resveratrol

Catechin

Epicatechin


München

Was heißt das für die Pathogenabwehr?


München

komplett mit Mycel überzogen, Kallus braun

komplett mit Mycel überzogen, Kallus hell

die Hälfte des Kallus mit Mycel überzogen

leichte Mycelbildung

keine Mycelbildung makroskopisch sichtbar

0%

50%

100%

24 48 24 48

Befa

lls

stä

rke

unbehandelte

Kalli

mit Hefe

vorbehandelte Kalli

Stunden nach Inokulation

Krankheitsverlauf von Botrytis cinerea bei Weinkallus mit

und ohne Elicitation durch Hefekulturfiltrat


MünchenZusammenfassung

Aureobasidium pullulans Kulturfiltrat wirkt als Elicitor auf Vitis vinifera

Kalluskulturen. Konstitutive Verbindungen akkumulieren; neue Verbindungen

werden synthetisiert

Die Elicitor-Konzentration hat keinen Einfluß auf die Induktion der Summe

aller untersuchten phenolischen Verbindungen, nimmt aber Einfluß auf die

Ausrichtung innerhalb des Stoffwechsels

Flavonoide (Catechine) erfahren durch eine erhöhte Elicitorkonzentration eine

verminderte Akkumulation, Resveratrol und auch dessen Derivate erfahren

durch eine erhöhte Elicitorkonzentration eine gesteigerte Akkumulation

Ein verzögerter Krankheitsverlauf nach eine Inokulation mit Botrytis cinerea

könnte auf die deutliche Akkumulation an Resveratrol-Derivaten

zurückzuführen sein.

technische universität induktion von phytoalexinen in...

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