BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-----------------------------

Họ và tên tác giả luận văn: Nguyễn Thị Thanh Hoa

TÊN ĐỀ TÀI LUẬN VĂN:

SÀNG LỌC ĐỘT BIẾN GEN RB1 THỂ DI TRUYỀN TRÊN CÁC

BỆNH NHÂN UNG THƢ TẠI VIỆT NAM

LUẬN VĂN THẠC SĨ: SINH HỌC THỰC NGHIỆM

Hà Nội- 2019

BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-----------------------------

Họ và tên tác giả luận văn: Nguyễn Thị Thanh Hoa

TÊN ĐỀ TÀI LUẬN VĂN

SÀNG LỌC ĐỘT BIẾN GEN RB1 THỂ DI TRUYỀN TRÊN CÁC

BỆNH NHÂN UNG THƢ TẠI VIỆT NAM

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 8420114

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC THỰC NGHIỆM

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC:

TS.Nguyễn Hải Hà

Hà Nội- 2019

Lời cam đoan

Tôi xin cam đoan mọi kết quả của đề tài: “Sàng lọc đột biến gen RB1 thể

di truyền trên các bệnh nhân ung thƣ tại Việt Nam” là công trình nghiên cứu của

cá nhân tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chƣa đƣợc

công bố trong các công trình khác. Nếu không đúng nhƣ đã nêu trên, tôi xin hoàn

toàn chịu trách nhiệm về đề tài của mình.

Hà Nội, tháng năm 2019

Học viên

Nguyễn Thị Thanh Hoa

Lời cảm ơn

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS.Nguyễn Hải Hà – Phó Trƣởng

Phòng phân tích hệ gen, Viện nghiên cứu hệ gen, ngƣời thầy - ngƣời chị không

chỉ hƣớng dẫn, tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp đỡ, chia sẻ những khó khăn

cùng tôi trong suốt quá trình làm việc và hoàn thành luận văn mà còn trong cuộc

sống hàng ngày. Thái độ làm việc chuyên nghiệp của chị đã truyền cảm hứng

cho tôi và giúp tôi cải thiện bản thân mình rất nhiều sau thời gian thực tập này.

Tôi cũng xin gửi lòng cảm ơn đặc biệt đến TS.Nguyễn Đăng Tôn –Trƣởng

Phòng phân tích hệ gen, Ths.Nguyễn Phƣơng Nhung, Ths.Ma Thị Huyền

Thƣơng và Ths. Trần Thị Bích Ngọc đã luôn theo sát giúp đỡ và chỉ bảo tôi

trong suốt quá trình thực hiện luận văn. Qua đây tôi cũng xin cảm ơn tất cả các

cô, các anh, chị trong Viện Nghiên cứu hệ gen đã giúp đỡ tôi rất nhiều trong suốt

thời gian tôi thực tập tại đây. Để có đƣợc những hiểu biết về kiến thức chuyên

ngành, tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo ở khoa Công nghệ sinh học -

Học viện Khoa học và Công nghệ đã truyền đạt cho tôi những kiến thức bổ ích

trong suốt 2 năm học qua.

Cuối cùng, tôi xin gửi lời tri ân tới bố mẹ, những ngƣời thân trong gia đình

và bạn bè đã luôn ủng hộ, khích lệ và động viên tinh thần tôi trong suốt thời gian

thực tập để hoàn thành tốt luận văn thạc sĩ của mình.

Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, tháng năm 2019

Học viên

Nguyễn Thị Thanh Hoa

Danh mục các ký hiệu và chữ viết tắt

UNBVM U nguyên bào võng mạc

RB1 Retinoblastoma 1

DNA Deoxyribonucleic acid

RNA Ribonucleic acid

cDNA Complement deoxyribonucleic acid

mRNA Messenger ribonucleic acid -RNA thông tin

bp Base pair

dNTPS Deoxyribonucleotide Triphosphate

PCR Polymerase chain reaction

MLPA Multiplex ligation-dependent probe amplification

UV Ultra violet

TAE Tris-axit axetic-EDTA

qPCR Quantitative polymerase chain reaction

EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid

DMSO Dimethyl sulfoxide

Danh mục các bảng biểu và hình ảnh

BẢNG BIỂU

Bảng 1.1 Hệ thống phân loại Reese Ellsworth cho phân loại u nguyên bào võng

mạc ............................................................................................................................. 8

Bảng 1.2 Hệ thống phân loại quốc tế cho u nguyên bào võng mạc nội nhãn . …….10

Bảng 1.3 Đánh giá nguy cơ mang đột biến RB1 của các thành viên trong gia đình

có trẻ bị UNBVM ..................................................................................................... 14

Bảng 2.1 Các cặp mồi đặc hiệu cho phản ứng PCR……………………….……26

Bảng 3.1 Đặc điểm lâm sàng của các đối tƣợng nghiên cứu. .................................. 36

Bảng 3.2 Nồng độ DNA tổng số của các mẫu bệnh nhi UNBVM. ......................... 40

Bảng 3.3 Đột biến RB1 đƣợc xác định ở bệnh nhân UNBVM bằng phƣơng pháp

giải trình tự Sanger .......……………………………………………………………44

Bảng 3.4 Mối liên hệ giữa giá trị DQ và số bản sao. .............................................. .47

Bảng 3.5 Các đột biến mất đoạn lớn trên gen RB1 đƣợc xác định bằng phƣơng

pháp MLPA…………………………………………………………………......49

HÌNH ẢNH

Hình 1.1 Hình ảnh siêu âm của UNBVM .................................................................. 7

Hình 1.2 Hình ảnh cắt lớp vi tính của UNBVM ........................................................ 7

Hình 1.3 Soi đáy mắt trƣớc điều trị hóa chất giảm tế bào ....................................... 12

Hình 1.4 Soi đáy mắt trƣớc điều trị hóa chất giảm tế bào ....................................... 12

Hình 1.5 Giải th ch về mặt di truyền đột biến mất chức năng gen RB1 .................. 16

Hình 1.6 Tái tổ hợp trong nguyên phân ................................................................... 17

Hình 1.7 Hoạt động bất thƣờng của DNA polymerase trong sao ch p DNA .......... 18

Hình 1.8 Sự phân chia bất thƣờng của nhiễm sắc thể trong nguyên phân ............... 19

Hình 1.9 Vị trí gen RB1 trên nhiễm sắc thể số 13 .................................................... 19

Hình 1.10 Cấu trúc gen và protein RB1 ................................................................... 20

Hình 3.1 Ảnh minh hoạ điện di đồ sản phẩm DNA tổng số tách chiết t mẫu máu

bệnh nhân và gia đình .............................................................................................. 39

Hình 3.2 Ảnh minh hoạ điện di đồ sản phẩm PCR t mẫu UNBVM ...................... 42

Hình 3.3 Sơ đồ biểu diễn các đột biến trên gen RB1 đƣợc phát hiện ở 23 bệnh

nhân. ......................................................................................................................... 44

Hình 3.4 Kết quả dạng biểu đồ sóng (electrophotogram) sau khi phân tích MLPA…49

Hình 4.1 Hình ảnh minh họa trình tự các đột biến mới đƣợc phát hiện ở bệnh

nhân UNBVM .......................................................................................................... 52

Hình 4.2 Sơ đồ phả hệ của các gia đình mắc UNBVM. .......................................... 53

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU ................................................................................................................ 1

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................ 4

1.1. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ BỆNH U NGUYÊN BÀO VÕNG MẠC ............ 4

1.1.1. Tình hình u nguyên bào võng mạc trên thế giới và ở Việt Nam ......... 4

1.1.2. Biểu hiện lâm sàng của UNBVM. ...................................................... 6

1.1.3. Chẩn đoán UNBVM. ........................................................................... 6

1.1.4. Phân loại UNBVM .............................................................................. 8

1.1.5. Điều trị UNBVM ............................................................................... 10

1.1.6. Tƣ vấn di truyền cho bệnh nhân u nguyên bào võng mạc ................ 13

1.1.7. Cơ chế gây bệnh u nguyên bào võng mạc ......................................... 15

1.1.7.1. t p tron n u n p n ........................................................... 17

1.1.7.2. Hoạt độn t t n N po m r s tron t n p N .. 17

1.1.7.3. p n t t n n m s t ..................................... 18

1.2. GIỚI THIỆU VỀ GEN RB1........................................................................... 19

1.3. CÁCH TIẾP CẬN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU, KỸ THUẬT

SỬ DỤNG NHẰM XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN GEN RB1 TRÊN THẾ GIỚI VÀ

VIỆT NAM ........................................................................................................... 21

CHƢƠNG 2: NGUYÊN VẬT LİỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHİÊN CỨU ..... 23

2.1. VẬT LİỆU NGHİÊN CỨU ........................................................................... 23

2.1.1. Đối tƣợng nghiên cứu. ....................................................................... 23

2.1.2. Dụng cụ, trang thiết bị ....................................................................... 23

2.1.3. Hóa chất ............................................................................................. 24

2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHİÊN CỨU ................................................................. 24

2.2.1. Phƣơng pháp lấy mẫu ........................................................................ 25

2.2.2. Phƣơng pháp tách chiết DNA genomic............................................. 25

2.2.3. Phƣơng pháp khuếch đại gen (PCR) ................................................. 26

2.2.4. Phƣơng pháp giải trình tự gen ........................................................... 30

2.2.5. Phƣơng pháp Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification

(MLPA) .......................................................................................................... 31

2.2.6. Phƣơng pháp phân t ch kết quả ......................................................... 34

CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ....................................................... 36

3.1. KẾT QUẢ ...................................................................................................... 36

3.1.1. Thu thập mẫu nghiên cứu .................................................................. 36

3.1.2. Tách chiết DNA tổng số .................................................................... 39

3.1.3. PCR khuếch đại các đoạn gen RB1 ................................................... 41

3.1.4. Phát hiện đột biến bằng giải trình tự gen RB1 ................................. 43

3.1.5. Phát hiện thay đổi cấu trúc gen bằng MLPA .................................... 46

3.2. THẢO LUẬN ................................................................................................ 50

CHƢƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ....................................................... 55

4.1. KẾT LUẬN ................................................................................................. 55

TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................... 56

1

MỞ ĐẦU

U nguyên bào võng mạc (retinoblastoma, UNBVM) là bệnh u ác tính

mắt thƣờng gặp ở trẻ em dƣới 5 tuổi, gây ra bởi đột biến trên gen RB1

(retinoblastoma 1). UNBVM xuất hiện với tỷ lệ khoảng 1/15000 đến 1/20000 trẻ

tƣơng ứng với khoảng 9000 trƣờng hợp mới mỗi năm, bệnh xảy ra ở cả hai giới

tính nam và nữ, không phụ thuộc vào nguồn gốc chủng tộc [5-8]. Trên thế giới,

ƣớc tính có khoảng 3001 đến 3376 trẻ em chết do UNBVM hàng năm. Tỷ lệ tử

vong ở châu Á (39%) cao hơn nhiều so với châu Âu, Canada và Mỹ (3–5%) do

khoảng cách về tiếp cận y tế [9]. Hầu hết các trƣờng hợp UNBVM đều liên quan

đến sự mất chức năng của cả hai alen của gen áp chế khối u RB1 nằm trên nhiễm

sắc thể số 13 [7]. Khoảng 40% trẻ UNBVM là thể di truyền trong khi 60%

trƣờng hợp còn lại là thể không di truyền [10]. RB1 là gen áp chế khối u đầu tiên

đƣợc tìm thấy, nằm tại vị tr 13q14.2, có k ch thƣớc DNA là 183 kb. Cho đến

nay, hơn 1750 đột biến gen RB1 khác nhau phát hiện đƣợc ở bệnh nhân UNBVM

và đã đƣợc công bố trên ngân hàng dữ liệu đột biến gen RB1 (RB1 Gene

Mutation Database) [11], và các đột biến gen RB1 gây bệnh UNBVM không

đồng nhất và xuất hiện rải rác trên vùng promoter và 27 exon. Việc xác định đột

biến gen RB1 gây bệnh trên bệnh nhân UNBVM và gia đình là cơ sở để thực

hiện điều trị cho bệnh nhân hiệu quả và tƣ vấn di truyền cho gia đình bệnh nhân.

Việc chẩn đoán sớm và phƣơng pháp điều trị th ch hợp có vai trò quan

trọng trong việc tiên lƣợng và khả năng sống sót của bệnh nhân UNBVM [12]. Ở

các nƣớc phát triển, mục tiêu của điều trị là bảo tồn thị lực và việc kiểm tra gen

RB1 đã đƣợc áp dụng nhƣ là một kiểm tra định kì ở nhóm bệnh nhân UNBVM

[13-16]. Ở Việt Nam, phần lớn bệnh nhân nhập viện ở giai đoạn muộn nên bị lỡ

cơ hội điều trị bảo tồn mắt. Mặc dù rất nhiều kinh ph đã đƣợc đầu tƣ cho việc

2

phát triển các kỹ thuật điều trị lâm sàng nhƣng phát triển các kĩ thuật sinh học

phân tử phục vụ chẩn đoán sớm của bệnh UNBVM gần đây mới thực sự phát

triển. Một số bệnh nhân đƣợc sinh ra trong gia đình có tiền sử bệnh UNBVM đã

cho thấy vai trò của yếu tố di truyền với khả năng sinh bệnh, do đó việc phát

hiện sớm đột biến trên gen RB1 đóng vai trò quan trọng trong quản lý lâm sàng

cũng nhƣ dự đoán nguy cơ mắc bệnh của các thành viên trong gia đình ngƣời

bệnh. Cho đến nay, việc điều trị cho bệnh nhân UNBVM ở giai đoạn sớm đã

đƣợc thực hiện khá hiệu quả ở Việt Nam, tuy nhiên hiểu biết về cơ chế phân tử

và nguyên nhân di truyền đối với bệnh này còn rất hạn chế. Các công tác tƣ vấn

di truyền hầu nhƣ chƣa đƣợc thực hiện nhằm đem lại sự hiểu biết cần thiết cho

gia đình bệnh nhân, đặc biệt trong các gia đình đã có ngƣời mắc bệnh nhƣ

cha/mẹ hay anh/chị em ruột.

Do nhu cầu thực tiễn của bệnh nhân UNBVM, luận văn: “Sàng lọc đột

biến gen RB1 thể di truyền trên các bệnh nhân ung thƣ tại Việt Nam” đƣợc tiến

hành với muc tiêu: Sàng lọc đột biến gen RB1 thể di truyền gây bệnh ở trẻ em

mắc u nguyên bào võng mạc. Nội dung nghiên cứu nhƣ sau:

Thu thập mẫu máu của những bệnh nhi UNBVM ở Bệnh viện Mắt Trung

ƣơng, và ngƣời thân trong gia đình nhƣ mẫu bố/mẹ, anh chị em ruột (nếu có).

Sử dụng kỹ thuật PCR để nhân các đoạn gen RB1, giải trình tự chuỗi DNA tại

vùng điều khiển, vùng nối exon-intron và toàn bộ vùng mang mã của gen

RB1.

Sử dụng kỹ thuật MLPA (Multiplex ligation-dependent probe amplification)

nhằm phát hiện các đột biến thêm/mất đoạn lớn trên gen RB1.

Phân t ch kết quả nhằm phát hiện đột biến gen ở bệnh nhân UNBVM tại Việt

Nam.

3

nghĩa của đề tài: Nghiên cứu này bƣớc đầu tao ra cơ sở dữ liệu đột biến

gen của bênh nhân UNBVM ở Việt Nam. Kết quả thu đƣợc có thể làm sáng

tỏ nguyên nhân gây bệnh ở mức độ phân tử và làm cơ sở cho công tác chẩn

đoán, chữa trị và tƣ vấn di truyền cho các bệnh nhân và gia đình ngƣời bệnh

UNBVM.

4

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ BỆNH U NGUYÊN BÀO VÕNG MẠC

1.1.1. Tình hình u nguyên bào võng mạc trên thế giới và ở Việt Nam

U nguyên bào võng mạc là bệnh ác tính nội nhãn phổ biến ở trẻ em phát

sinh t các tế bào võng mạc nguyên thủy, bệnh thƣờng gặp ở trẻ em dƣới 5 tuổi,

gây ra bởi đột biến trên gen RB1 (retinoblastoma 1). Có khoảng 9000 trƣờng hợp

UNBVM mới đƣợc phát hiện mỗi năm, tỷ lệ xuất hiện khoảng 1/15000 đến

1/20000 trẻ tƣơng ứng với, bệnh xảy ra ở cả hai giới tính nam và nữ, không phụ

thuộc vào nguồn gốc chủng tộc [5-7]. Trên thế giới, ƣớc tính có khoảng 3001

đến 3376 trẻ em chết do UNBVM hàng năm. Mỗi năm có 175.000 ca UNBVM

mắc mới đƣợc phát hiện ở các nƣớc đang phát triển, với tỷ lệ tử vong cao dƣới

15%. Tỷ lệ tử vong ở châu Á (39%) cao hơn nhiều so với châu Âu, cao thứ hai

thế giới (sau châu Phi 70%), Canada và Mỹ (3–5%) do khoảng cách về tiếp cận y

tế [9]. Trong 100 năm qua, có sự tiến bộ đáng kể trong việc chẩn đoán và quản lý

UNBVM theo nguyên tắc ƣu tiên: Sống sót, Toàn cầu & Thị lực (Life, Globe &

Vision) [9, 17].

Ở Việt Nam, chƣa có số liệu đầy đủ về tỷ lệ mắc UNBVM hàng năm. Tại

Bệnh viện Mắt trung ƣơng, số bệnh nhân mắc u nguyên bào võng mạc hàng năm

tăng t 29 ngƣời (2004) lên 68 ngƣời (2016), chủ yếu tập trung ở trẻ em lứa tuổi

t 2-3 tuổi (theo hội thảo quốc tế chuyên đề về UNBVM ở Bệnh viện Mắt Trung

ƣơng năm 2017). Tuy số lƣợng không nhiều so với các bệnh lý khác nhƣng đây

là căn bệnh hiểm nghèo, nếu không đƣợc điều trị đúng, xử lý sớm sẽ ảnh hƣởng

tới thị lực thậm tr t nh mạng ngƣời bệnh. Phần lớn bệnh nhân nhập viện ở giai

đoạn muộn nên bị lỡ cơ hội điều trị bảo tồn mắt. Một số bệnh nhân đƣợc sinh ra

trong gia đình có tiền sử bệnh UNBVM đã cho thấy vai trò của yếu tố di truyền

5

với khả năng sinh bệnh. Hiện nay, ở Việt Nam, chẩn đoán phân tử bệnh

UNBVM đã bắt đầu phát triển và đã đạt đƣợc một số thành tựu. Năm 2005,

Nguyễn Công Kiệt và Nguyễn Tr Dũng đã sử dụng kỹ thuật di truyền tế bào

nghiên cứu 30 ca võng mạc ở Việt Nam và xác định đƣợc một bệnh nhân bị đột

biến mất đoạn ở vị tr nhiễm sắc thể 13q14 [1]. T năm 2013 nhóm nghiên cứu

của chúng tôi, đứng đầu là tiến sỹ Nguyễn Hải Hà, đã bắt đầu xây dựng quy trình

sàng lọc biến đổi di truyền cho bệnh nhân UNBVM Việt Nam sử dụng kỹ thuật

giải trình tự trực tiếp. Năm 2014, nhóm đã công bố hai đột biến gen thể di phát

hiện đƣợc t mẫu máu của bệnh nhân UNBVM [2]. Năm 2016, nhóm đã xây dựng

thành công phƣơng pháp sàng lọc đột biến gen RB1 thông qua phân t ch bản

phiên mã của gen này [3]. Kết hợp hai phƣơng pháp x t nghiệm trên DNA và

cDNA trong sàng lọc đột biến gen RB1 ở một gia đình có hai con mắc bệnh ung

thƣ võng mạc đã phát hiện đƣợc ngƣời cha và hai con đều mang đột biến gây ảnh

hƣởng tới sự tổ hợp lại mRNA của RB1. Năm 2017, chúng tôi đã sử dụng

phƣơng pháp MLPA nhằm phát hiện những đột biến mất đoạn/lặp đoạn lớn trên

gen RB1 ở những bệnh nhân UNBVM [4]. Kết quả nghiên cứu cho thấy phƣơng

pháp này hoàn toàn đáng tin cậy để áp dụng nhằm tăng độ nhạy trong chẩn đoán

di truyền của bệnh UNBVM. Năm 2018, nhóm nghiên cứu đã công bố một số

kết quả bƣớc đầu của nghiên cứu đặc điểm di truyền của gen RB1 của 34 bệnh

nhân UNBVM trên tạp ch Molecular Vision (Mỹ), [18]. Cũng trên tạp ch này

gần đây nhất, nhóm nghiên cứu ph a Nam của giáo sƣ Nguyễn Công Kiệt đã

công bố kết quả kiểm tra di truyền trên mẫu máu và mẫu u của 50 bệnh nhân

UNBVM điều trị tại Bệnh viện mắt thành phố Hồ Ch Minh. Với nghiên cứu

này, các tác giả đã xác định dƣợc phổ đột biến gen RB1 bao gồm cả đột biến sinh

dƣỡng và đột biến dòng mầm trên nhóm bệnh nhân này [19]

6

1.1.2. Biểu hiện lâm sàng của UNBVM.

Biểu hiện UNBVM rất đa dạng bao gồm đồng tử có màu trắng, lác mắt,

giảm thị lực và rung giật nhãn cầu, ngoài ra ở giai đoạn muộn có thể thấy các

triệu chứng khác nhƣ: mắt đỏ, đau nhức do tăng nhãn áp thứ phát, nhìn mờ, lồi

mắt, viêm tổ chức quanh hốc mắt, đồng tử giãn, mủ tiền phòng, mống mắt dị sắc,

trẻ chậm phát triển...[20]. Đồng tử trắng là dấu hiệu phổ biến nhất ở trẻ bị

UNBVM chiếm 60%, khi nhìn vào mắt bé, cha mẹ thấy có ánh trắng (nhất là vào

ban đêm hoặc trong phòng tối vì khi đó đồng tử giãn), cũng có thể thấy 1 hoặc 2

đồng tử màu trắng hay vàng khi chụp ảnh buổi tối có dùng đèn flash. Dấu hiệu

nhận biết chính thứ hai là trẻ bị lác/lé, chiếm 20%. Đặc biệt, nếu bé bị lác trong

vòng 6 tháng tuổi thì nên nghi ngờ có UNBVM [21].

1.1.3. Chẩn đoán UNBVM.

Chẩn đoán UNBVM có thể tiến hành theo các phƣơng pháp sau:

* Chẩn đoán lâm sàng: Soi đáy mắt là khám nghiệm quan trọng để chẩn

đoán bệnh. Tổn thƣơng ở võng mạc có biểu hiện khác nhau tùy theo hƣớng phát

triển của u. Các phƣơng pháp chẩn đoán hình ảnh giúp xác định chẩn đoán.

Khám siêu âm và chụp cắt lớp có thể thấy rõ k ch thƣớc và vị tr khối u hoặc

thấy hình ảnh canxi hóa trong khối u-dấu hiệu đặc trƣng của UNBVM. Ngoài ra

còn có thể xác định sự phát triển của khối u ra ngoài nhãn cầu hay vào nội sọ.

Chụp MRI cho ph p khảo sát hình ảnh nhãn cầu, hốc mắt và não [22]. Quét

xƣơng toàn thân bằng Technetium-99m và chụp cắt lớp phát xạ positron

Fluorine-18 pos ourodeoxyglucose (PET CT) cũng rất hữu ch để phát hiện sớm

di căn [23]. Hầu hết trẻ em bị UNBVM không cần phải tiến hành chụp xƣơng.

Phƣơng pháp này thƣờng chỉ sử dụng khi UNBVM bị nghi ngờ rằng có thể đã

lan rộng ra khỏi mắt [11].

7

Hình 1.1 Hình ảnh siêu âm của

UNBVM

Hình 1.2Hình ảnh chụp cắt lớp vi

t nh của UNBVM

N uồn: https://bacsinoitru.vn/content/chan-doan-va-dieu-tri-u-nguyen-bao-

vong-mac-1236.html

* Kiểm tra mô bệnh học và phân t ch nhiễm sắc thể. Chẩn đoán UNBVM

có thể đƣợc xác định bằng kiểm tra mô bệnh học. Kiểm tra cẩn thận các dây thần

kinh thị giác là cần thiết để xác định khả năng xâm nhập của các tế bào khối u.

Phân t ch di truyền học tế bào lympho máu ngoại vi đƣợc sử dụng để phát hiện

mất đoạn hay sự sắp xếp lại liên quan đến 13q14.1-14q2, tìm thấy trên khoảng

5% các trƣờng hợp bị UNBVM một bên mắt và khoảng 7.5% các trƣờng hợp bị

cả hai bên mắt [20].

* Kiểm tra di truyền phân tử:

Phát hiện sớm trẻ em có nguy cơ phát triển UNBVM là rất quan trọng để

bảo tồn cuộc sống và thị lực. X t nghiệm di truyền đã trở thành một phần quan

trọng trong việc chăm sóc cho những bệnh nhân bị UNBVM. Gen RB1 là gen ức

chế khối u đầu tiên đƣợc xác định, phần lớn các đột biến RB1 là riêng cho t ng

gia đình, và đƣợc phân bố trên khắp gen RB1 bao gồm vùng promoter, vùng mã

hóa exon, và khu vực nối của intron [24]. Việc chẩn đoán UNBVM thể di truyền

đƣợc tiến hành ở các bệnh nhân mang bệnh hoặc có tiền sử gia đình, trong đó

phần lớn các bệnh nhân bị bệnh không có tiền sử gia đình. Do đó việc xác định

8

một biến thể gây bệnh dòng mầm dạng dị hợp tử trên gen RB1 trong x t nghiệm

di truyền phân tử là cần thiết để xác định xem UNBVM có phải là dạng di truyền

hay không và cho ph p chẩn đoán, sàng lọc sớm nguy cơ cho các thành viên

trong gia đình [20].

1.1.4. Phân loại UNBVM

Chẩn đoán UNBVM đƣợc tiến hành trên cơ sở các phát hiện lâm sàng và

x t nghiệm hình ảnh. Xác định giai đoạn khối u tại thời điểm chẩn đoán là rất

quan trọng để quản lý th ch hợp, do đó kiến thức về hệ thống phân loại u nguyên

bào võng mạc là rất quan trọng. Phân loại Reese Ellsworth (Bảng 1.1) đƣợc phát

triển vào những năm 1960 bởi Tiến sĩ Algernon Reese và Tiến sĩ Robert

Ellsworth là hệ thống phân loại đƣợc sử dụng rộng rãi nhất đối với các khối u nội

nhãn và dựa trên vị tr , số khối u và k ch thƣớc của khối u [25].

Bảng 1.1: Hệ thống phân loại Reese Ellsworth cho phân loại u nguyên bào võng

mạc [25]

Nhóm Khả năng bảo tồn thị lực Đặc điểm

I Khả năng bảo tồn thị lực

rất cao

a, Khối u đặc, k ch thƣớc <4 DD, tại hoặc sau

đƣờng x ch đạo

b, Nhiều khối u, k ch thƣớc > 4 DD, tất cả đều tại

hoặc sau đƣờng x ch đạo.

II Khả năng bảo tồn thị lực

cao

a, Khối u đặc, k ch thƣớc 4-10 DD, tại hoặc sau

đƣờng x ch đạo.

b, Nhiều khối u, k ch thƣớc 4-10 DD, sau đƣờng

x ch đạo.

III Có thể bảo tồn thị lực a, Bất kỳ tổn thƣơng nào ở trƣớc đƣờng x ch đạo.

b, Khối u đặc > 10 DD, ở sau đƣờng x ch đạo

9

IV Không thuận lợi trong bảo

tồn thị lực

a, Nhiều khối u, một số > 10 DD

b, Bất kỳ tổn thƣơng nào lan về ph a trƣớc tới bờ

răng cƣa.

V Rất khó khăn trong bảo

tồn thị lực

a, Những khối u lớn xâm lấn quá một nửa võng

mạc.

b, Gieo mầm vào pha lê thể.

Hệ thống phân loại Reese Ellsworth về cơ bản đƣợc thiết kế để dự đoán

kết quả điều trị bằng xạ trị chùm tia ngoài (EBRT), đƣợc sử dụng phổ biến nhƣ

là phƣơng pháp điều trị bảo tồn mắt ch nh cho đến khi điều trị bằng hóa trị liệu

đƣợc sử dụng vào những năm 1990. Một số nhƣợc điểm của hệ thống phân loại

này nhƣ sau: các khối u ngoại biên, nhiều khối u và khối u lớn đƣợc cho là nguy

hiểm hơn trong giai đoạn điều trị bằng xạ trị chùm tia ngoài và có tiên lƣợng xấu

hơn ở mắt. Hệ thống phân loại Reese Ellsworth không giải quyết đƣợc vấn đề

gieo hạt dƣới võng mạc và không phân biệt giữa gieo hạt vào thủy tinh khu trú

và khuếch tán [26]. Do đó, cần phải đề xuất một hệ thống phân loại mới có thể

dự đoán kết quả điều trị bằng hóa trị liệu ch nh xác hơn. Nhiều trung tâm đã

tham gia và thống nhất một hệ thống phân loại duy nhất đƣợc thiết kế bởi

Murphree và các cộng sự (Bảng 1.2) [27]

10

Bảng 1.2: Hệ thống phân loại quốc tế cho u nguyên bào võng mạc nội nhãn [27]

Nhóm Đặc điểm lâm sàng

A

Nguy cơ rất

thấp

Tất cả các khối u có k ch thƣớc 3 mm hoặc nhỏ hơn, giới hạn ở

võng mạc và nằm cách dây thần kinh thị giác t nhất 1.5 mm. Không

gieo hạt vào thủy tinh thể

B

Nguy cơ thấp

Các khối u võng mạc có bất kỳ k ch thƣớc hoặc vị tr nào không

thuộc nhóm A. Không gieo hạt vào thủy tinh thể. Một lƣợng nhỏ

dịch k o dài không quá 5 mm t nh t khối u đƣợc cho ph p.

C

Nguy cơ trung

bình

Gieo rắc hạt tại chỗ. Hạt thủy tinh có thể k o dài không quá 3 mm t

khối u. Có thể có tới một phần tƣ dịch dƣới màng lƣới.

D

Nguy cơ cao

Gieo rắc hạt lan tràn, khối u có thể to hơn một phần tƣ của võng

mạc.

E

Nguy cơ rất cao

Ngoài ra còn mắc một số bệnh về mắt nhƣ: Bệnh tăng nhãn áp thứ

phát, xuất huyết nội nhãn, viêm tổ chức hốc mắt không nhiễm

khuẩn, khối u xâm lấn vào thủy tinh thể, UNBVM di căn.

1.1.5. Điều trị UNBVM

Mục tiêu đầu tiên của điều trị là đảm bảo t nh mạng của ngƣời bệnh và

sau đó là thị lực. Bên cạnh việc phân loại mắt và giai đoạn khối u thì cần lựa

chọn phƣơng pháp điều trị dựa trên nhiều yếu tố bao gồm: số lƣợng các ổ khối u

(bị một bên và chỉ có một khối u; bị một bên và có nhiều khối u; bị cả hai bên

mắt), vị tr và k ch thƣớc khối u trong mắt, có gieo mầm vào pha lê thể và dƣới

võng mạc hay không, khả năng bảo tồn thị lực và tuổi bệnh nhân. Các phƣơng

pháp đƣợc sử dụng trong điều trị UNBVM bao gồm:

* Phẫu thuật khoét bỏ nhãn cầu: Thƣờng chỉ định khi khối u lớn (hơn 60%

thể t ch nhãn cầu) không còn thị lực, mù, mắt đau hoặc khối u xâm lấn vào thần

11

kinh thị. Ngƣời ta hay kho t bỏ nhãn cầu hơn cho những mắt đã thất bại với các

phƣơng pháp điều trị bảo tồn trƣớc đó. Ngoài ra, kho t bỏ nhãn cầu đƣợc chỉ

định cho trƣờng hợp tăng nhãn áp thứ phát, gieo mầm vào thủy tinh, hoặc xâm

lấn ra tiền phòng.

* Lạn đôn : Chỉ định cho khối u nhỏ cho những u nhỏ (< 6 mm đƣờng

k nh và < 3 mm độ dày) và ở ph a trƣớc. Trong quá trình lạnh đông, một chất rất

lạnh nhƣ nitơ lỏng, đƣợc đặt trong hoặc gần các tế bào ung thƣ.Một khi các tế

bào đóng băng, chất lạnh đƣợc loại bỏ và các tế bào tan băng. Quá trình đóng

băng và tan băng này, lặp đi lặp lại một vài lần trong mỗi đợt trị liệu, khiến các

tế bào ung thƣ bị chết. Biến chứng của phƣơng pháp này gồm bong võng mạc tơ

huyết thoáng qua, che khuất mạch máu võng mạc, kéo dãn võng mạc và xơ hóa

tiền võng mạc.

* Liệu pháp laser: Hồ quang xenon hoặc laser (argon và krypton): chỉ định

cho u nhỏ và ở ph a sau. Quang đông (photocoagnlation) là dùng sức nóng của

laser Argon để phá hủy mạch máu nuôi dƣỡng tế bào khối u.

* Tia xạ: Tia xạ với nguồn tia t ngoài vào (External beam radiotherapy viết

tắt EBRT) là phƣơng pháp điều trị bảo tồn nhãn cầu đầu tiên trong UNBVM. Tia

xạ có thể chỉ định với những khối u lớn hai bên, gieo mầm vào thủy tinh, các

khối u gần dây thần kinh thị trong mắt có khả năng còn thị lực hoặc nhiều khối u

mà các khối u lại quá lớn không thể điều trị bằng phƣơng pháp lạnh hoặc quang

đông.

* Điều trị bằng các tấm có hoạt t nh phóng xạ: Liệu pháp tia phóng xạ để gần

(I – 125) là dùng các tấm mỏng có hoạt t nh phóng xạ áp vào thành mắt ở góc của

khối u, có thể áp dụng nhƣ là phƣơng pháp điều trị ban đầu hoặc hỗ trợ cho phẫu

12

thuật. Tuy nhiên, không phải là tất cả các bệnh nhân đều đƣợc điều trị bằng phƣơng

pháp này [22] [28].

* Liệu pháp hóa học: UNBVM là một bệnh ác t nh nhạy cảm với hóa chất.

Hóa chất có hoạt t nh nhất nhƣ carboplatin, vincristin, có hoặc không có

etoposide.

Hó t ảm tế ào: Do hầu hết bệnh nhân có khối u lớn tại thời điểm

chẩn đoán nên ngƣời ta sử dụng hóa chất giảm tế bào để giảm k ch thƣớc khối u,

giúp tăng hiệu quả của các phƣơng pháp điều trị tại chỗ. Hóa chất giảm tế bào

trở thành một phần quan trọng trong điều trị ban đầu UNBVM và làm tăng khả

năng bảo tồn nhãn cầu. Hóa chất giảm tế bào còn nhằm chống lại sự phát triển

của UNBVM ba bên [29].

Hình 1.3: Soi đáy mắt trƣớc điều trị

hóa chất giảm tế bào

Hình 1.4: Soi đáy mắt sau điều trị hóa

chất giảm tế bào

Nguồn: http://bacsinoitru.vn/content/chan-doan-va-dieu-tri-u-nguyen-bao-vong-mac-1.

Trƣớc đây, việc loại bỏ nhãn cầu đã đƣợc sử dụng để điều trị cho những

bệnh nhân mắc UNBVM nặng. Hiện nay có bằng chứng cho thấy cách tiếp cận

phối hợp nhiều phƣơng pháp bao gồm hóa trị thu nhỏ khối u, phẫu thuật loại bỏ

nhân, EBRT và hóa trị ngăn ng a có hiệu quả trong các trƣờng hợp khối u lan ra

13

ổ mắt và thần kinh thị giác, do đó không cần phải kho t bỏ nhãn cầu và khả năng

sống sót tốt hơn [30]. Cách tiếp cận này bao gồm 3-6 chu kỳ hóa trị liệu hệ thống

liều cao, gây ra sự thu nhỏ khối u và làm cho mắt có thể điều chỉnh đƣợc. Kiểm

soát khối u hiệu quả hơn và an toàn hơn đã đƣợc quan sát với phƣơng pháp VEC

khi so sánh một phác đồ 5 thuốc bao gồm carboplatin và etoposide, xen kẽ với

cyclophosphamide, idarubicin và vincristine. Hóa trị liệu liều cao đƣợc tiếp tục

trong 12 chu kỳ và theo dõi chặt chẽ với mục đ ch loại bỏ hoàn toàn khối u bằng

cách soi đáy mắt và ngăn ng a di căn [31]. Chawla và cộng sự phân t ch một

nhóm nhỏ trẻ em mắc UNBVM đã phát hiện ra rằng 39,2% trẻ em còn sống

không bị tái phát/di căn, 9% trẻ bị di căn và 51,8% trẻ tử vong. Di căn đến hệ

thần kinh trung ƣơng đƣợc ghi nhận ở 15,7% trẻ và mang tiên lƣợng xấu. Các

khối u ác t nh thứ phát đáng quan tâm trong đó có u xƣơng là phổ biến nhất [32].

1.1.6. Tƣ vấn di truyền cho bệnh nhân u nguyên bào võng mạc

Nguy cơ mắc UNBVM có thể đƣợc xác định t mối quan hệ của trẻ sơ

sinh với thành viên trong gia đình đã đƣợc chẩn đoán bị bệnh (Bảng 1.3) [33].

Trong trƣờng hợp chƣa thực hiện hoặc không thể thực hiện đƣợc xét nghiệm di

truyền, nguy cơ mắc bệnh ƣớc tính có thể xác định đƣợc bằng cƣờng độ kiểm tra.

Tuy nhiên, nguy cơ mắc bệnh của một đứa trẻ có thể đƣợc xác định chính xác

hơn bằng phân tích di truyền của gia đình, thƣờng bắt đầu với việc thực hiện xét

nghiệm di truyền toàn bộ gen RB1 của một thành viên trong gia đình bị UNBVM

để xác định khả năng di truyền; nếu di truyền, đột biến gây bệnh sẽ đƣợc kiểm

tra một cách kĩ lƣỡng ở những ngƣời có nguy cơ cao.

14

Bảng 1.3: Đánh giá nguy cơ mang đột biến RB1 của các thành viên trong gia

đình trẻ mắc UNBVM [33]

Mối quan hệ với bệnh

nhân

Nguy cơ mang đột biến gây bệnh (%)

Bệnh nhân mắc Rb

hai mắt (100)

Bệnh nhân mắc Rb

một mắt (15)

Con cái (trẻ sơ sinh) 50 7.5

Bố mẹ 5 0.8

Anh/chị/em ruột 2.5 0.4

Cháu trai/gái 1.3 0.2

Chú/dì 0.1 0.007

Anh chị em họ gần nhất 0.05 0.007

Ngƣời bình thƣờng 0.007

Xét nghiệm phân tử xác định đột biến RB1 giúp làm rõ nguy cơ mắc

UNBVM của các thành viên trong gia đình, do đó có thể giảm cƣờng độ kiểm tra

mắt chuyên khoa ở một số trẻ em, cho phép trẻ trải qua tầm soát t hơn. X t

nghiệm và tƣ vấn di truyền cho UNBVM là một vấn đề phức tạp và cần sự phối

hợp chặt chẽ giữa bác sĩ với các chuyên gia di truyền (cố vấn di truyền hoặc các

nhà di truyền y học) có kinh nghiệm. Ví dụ, mặc dù bố mẹ của một đứa trẻ bị

UNBVM cả hai bên mắt có thể xét nghiệm âm tính với đột biến RB1, nhƣng vẫn

có 5% nguy cơ sinh ra những đứa trẻ tiếp theo bị bệnh vì khả năng có thể bố mẹ

bị đột biến RB1 dạng khảm dòng mầm. Việc sàng lọc trƣớc sinh là rất quan trọng

đối với những gia đình có tiền sử mắc UNBVM. Nếu có tiền sử gia đình mắc

UNBVM mang đột biến gen RB1 thì trẻ sinh ra cũng có nguy cơ cao mang khối

u võng mạc. Khi cha mẹ có mong muốn kiểm tra trong thai kỳ để phát hiện đột

15

biến gen RB1 của bào thai, các kĩ thuật sinh thiết gai nhau (t tuần thai 11-14) và

chọc ối (t tuần thai 16 trở đi) sẽ đƣợc thực hiện. Sau khi sinh, việc kiểm tra khối

u mắt (thực hiện khi gây mê trẻ) càng sớm càng tốt sẽ đảm bảo kiểm soát sự xâm

lấn của khối u nếu có. Trong trƣờng hợp thai nhi đƣợc xác định là mang đột biến

gen RB1 thì sẽ đƣợc chỉ định sinh sớm hơn thời gian dự kiến (t tuần 36-38 của

thai kỳ), t đó có thể phát hiện và kiểm soát tốt hơn sự tiến triển của khối u kể t

khi khối u vẫn còn nhỏ, đồng thời giúp bảo tồn thị lực của trẻ [33, 34].

1.1.7. Cơ chế gây bệnh u nguyên bào võng mạc

Dựa vào những biểu hiện lâm sàng của UNBVM, ngƣời ta đƣa ra các giả

thuyết về cơ chế phân tử của bệnh: chịu trách nhiệm cho sự hình thành khối u là

gen RB1, protein RB (pRB) tác động vào chu kỳ tế bào. Khi gắn với yếu tố phiên

mã E2F, pRB ức chế sự sinh sản tế bào. Khi không có pRB, các phôi bào sinh

sản bất tận dẫn đến bệnh ung thƣ. Hoạt động tƣơng tác giữa pRB và E2F đƣợc

điều hòa bởi các yếu tố nhƣ cyclin D1, cdk4 và p16 [35]. Một alen hoạt động của

gen RB1 cũng có khả năng ngăn chặn sinh ung thƣ, do đó, sự chuyển dạng ác

tính của các tế bào võng mạc xảy ra khi cả 2 alen của gen RB1 bị đột biến mất

chức năng. Phát hiện này củng cố giả thuyết “two hit” của Knudson, cho rằng

UNBVM hình thành cần có hai cú hích gây tổn thƣơng di truyền: lần 1 (đột biến

dòng mầm tế bào sinh dục) đột biến xảy ra trên các exon của gen RB1, lần 2 (đột

biến thể soma) làm sai lệch sinh sản tế bào dẫn đến sự hình thành khối u [36]

[37]. Cơ chế bệnh sinh này đƣợc giải thích tốt nhất bằng việc khảo sát sự di

truyền của UNBVM.

Với bệnh nhân mà gia đình không có tiền sử bệnh: ngay tại hợp tử không

mang gen RB1 đột biến, tế bào cần trải qua hai sự kiện đột biến tế bào soma trên

2 alen của cùng một gen RB1 [38]. Đối với bệnh nhân mà gia đình có tiền sử gây

16

bệnh, ngay tại giai đoạn hợp tử bệnh nhân đã mang một gen RB1 đột biến, chỉ

cần trải qua một sự kiện đột biến trên tế bào soma là có khả năng gây nên kiểu

hình ung thƣ. Bất kể các đột biến ban đầu là do di truyền hay do phát sinh trên tế

bào soma, các tế bào võng mạc chỉ trở thành ác tính khi bị mất bản sao bình

thƣờng còn lại của RB1. Mất alen RB1 chức năng thứ hai có thể là do một đột

biến soma riêng biệt (~30% các khối u), sự methyl hóa quá mức (tỷ lệ nhỏ các

khối u), hoặc mất trạng thái dị hợp tử (~70% các khối u). Mất trạng thái dị hợp

xảy ra do tái tổ hợp trong nguyên phân bào, phân ly bất thƣờng của nhiễm sắc

thể, hoặc mất đoạn lớn [39].

Hình 1.5: Giải th ch về mặt di truyền đột biến mất chức năng gen RB1[40]

T đó, ngƣời ta đƣa ra một số giả thuyết gây nên hiện tƣợng đột biến

trên gen Rb1 gồm: Tái tổ hợp trong nguyên phân, hoạt động bất thƣờng của

DNA polymerase trong tổng hợp DNA và sự phân chia bất thƣờng của nhiễm

sắc thể [40].

17

1.1.7.1. t p tron n u n p n

Hai nhiễm sắc thể tƣơng đồng mang 2 alen dị hợp, tại giai đoạn pha S,

bộ gen nhân đôi, đồng thời nhiễm sắc thể mang gen đột biến mất chức

năng Rb cũng đƣợc nhân đôi; tại pha G2 và M xảy ra hiện tƣợng tái tổ hợp trong

nguyên phân một phần của hai nhiễm sắc thể tƣơng đồng. Khi các nhiễm sắc thể

sắp xếp trên mặt phẳng x ch đạo của thoi vô sắc, quá trình phân chia nhiễm sắc

thể một cách ngẫu nhiên diễn ra và có thể tạo thành dạng tế bào mang đồng thời

hai đoạn gen chứa hai alen đột biến của gen RB1 [40].

Hình 1.6: Tái tổ hợp trong nguyên phân [40].

1.1.7.2. Hoạt độn t t n N po m r s tron t n p

DNA

Trong quá trình này, enzyme tham gia quá trình tự sao là DNA

polymerase nhảy khỏi mạch khuôn ban đầu của nó, chuyển sang mạch khuôn của

gen tƣơng đồng và tổng hợp một đoạn. Khi tổng hợp xong, DNA polymerase lại

nhảy trở lại mạch khuôn ban đầu và tiếp tục tổng hợp kéo dài mạch bổ sung của

nó. Kết quả là sau khi đƣợc sao ch p, mạch mới sẽ mang một phần vật liệu di

18

truyền của cặp tƣơng đồng. Nếu gen ức chế khối u bị đột biến mất chức năng

nằm trên đoạn gen này, bộ nhiễm sắc thể sau sao ch p sẽ mang ba alen đột biến

và trong quá trình phân ly nhiễm sắc thể về hai cực của tế bào, có khả năng hình

thành tế bào mang 2 alen đột biến mất chức năng và sinh ung thƣ [40].

Hình 1.7: Hoạt động bất thƣờng của DNA polymerase trong sao ch p DNA [40].

1.1.7.3. p n t t n n m s t

Trong quá trình này, nhiễm sắc thể của cặp tƣơng đồng vẫn nhân đôi

bình thƣờng để chuẩn bị cho quá trình nguyên phân phân chia nhiễm sắc thể về

hai tế bào con. Tuy nhiên, quá trình phân chia này diễn ra không chính xác, một

tế bào con giữ ba nhiễm sắc thể (triploid – tam bội) của cặp tƣơng đồng, còn một

tế bào con chỉ chứa một nhiễm sắc thể. Tế bào chứa ba nhiễm sắc thể tƣơng đồng

sẽ có xu hƣớng loại bỏ bớt một nhiễm sắc thể không cần thiết và nếu nhiễm sắc

thể đó mang gen có chức năng, hai nhiễm sắc thể đƣợc giữ lại đều mang hai alen

đột biến, hiện tƣợng mất trạng thái dị hợp đã diễn ra, có thể dẫn đến ung thƣ

[40].

19

Hình 1.8: Sự phân chia bất thƣờng của nhiễm sắc thể trong nguyên phân

[40].

1.2. GIỚI THIỆU VỀ GEN RB1

Theo thống kê, khoảng 40% ca UNBVM là thể di truyền trong khi 60% số

ca còn lại là thể không di truyền. Khi quan sát các trƣờng hợp UNBVM có yếu

tố gia đình hoặc không có yếu tố gia đình, ngƣời ta cho rằng tất cả các trƣờng

hợp UNBVM là hậu quả của đột biến mất chức năng gen RB1 nằm trên

NST13q14 [7]. Gen RB1 có 27 exon và 26 introns với khối lƣợng phân tử là

180kb đƣợc tạo thành t 31-1889 cặp base. Sản phẩm gen là phosphoprotein

p110 (có trọng lƣợng phân tử là 110 kDa) có 928 acid amin.

Hình 1.9: Vị tr gen RB1 trên nhiễm sắc thể số 13.

20

Hình 1.10: Cấu trúc gen và protein RB1

RB1 mã hóa cho protein RB, protein này hoạt động nhƣ một chất kiềm

chế khối u, có nghĩa là nó điều chỉnh sự tăng trƣởng tế bào và giữ cho tế bào

không phân chia quá nhanh hoặc theo một cách không kiểm soát đƣợc.

Cơ chế gây bệnh: RB1 bị ức chế khi bị phosphoryl hóa bởi các enzyme

kinase phụ thuộc cyclin (cyclin dependent kinase) nhƣng sẽ ở trạng thái hoạt

động khi không bị phosphoryl hóa một cách tƣơng đối. Ở trạng thái hoạt động,

pRB gắn với các thành phần trong phức hệ phiên mã E2F và bất hoạt chúng,

phức hệ này có vai trò quan trọng trong việc thúc đẩy tế bào bƣớc vào giai đoạn

S, giai đoạn tổng hợp DNA trong chu kỳ tế bào cho nên khi pRb hoạt động sẽ

làm đình chỉ quá trình tăng sinh tế bào. Với t nh năng nhƣ vậy bình thƣờng pRb

hoạt động nhƣ một cái “hãm” cho hoạt động sinh sản tế bào và khi pRb bị bất

hoạt do bị phosphoryl hóa thì hoạt động sinh sản tế bào mới bắt đầu trở lại. Khi

xảy ra các đột biến làm mất chức năng của gen RB1 hoặc trong những trƣờng

hợp gia tăng sự methyl hóa vùng 5’ của gen này có thể dẫn tới tình trạng bất hoạt

thƣờng xuyên của gen, khi đó cơ chế kìm hãm hoạt động sinh sản của tế bào

không còn nữa, tế bào sẽ tăng sinh không kiểm soát gây ung thƣ [41].

Knudson đã đƣa ra giả thuyết lần một đột biến xảy ra trên các exon của

gen RB1, lần hai đột biến soma làm sai lệch tế bào sinh sản dẫn đến sự hình

21

thành khối u. Các đột biến trong gene RB1 mang t nh chất không đồng nhất và

phân bố trên cả vùng promoter cũng nhƣ 27 exon. Hơn hai phần ba các đột biến

trong gen RB1 đƣợc dự đoán là tạo nên kết thúc dịch mã sớm-dẫn tới hình thành

protein RB không hoàn chỉnh [42]. Một báo cáo năm 2005 đã thống kê đƣợc 16

điểm nóng đột biến của gen RB1 bao gồm các dạng đột biến vô nghĩa, đột biến

ảnh hƣởng tới phân cắt mRNA và đột biến sai nghĩa. Phần lớn các đột biến tái

phát xảy ra do sự thay đổi C>T trong 11 bộ ba CGA tại các exon 8, 10, 11, 14,

15, 17, 18 và 23 [43]. Cho đến nay, hơn 1700 đột biến đã đƣợc đƣa vào cơ sở dữ

liệu đột biến gen RB1 (RB1 Gene Mutation Database).

1.3. CÁCH TIẾP CẬN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU, KỸ THUẬT

SỬ DỤNG NHẰM XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN GEN RB1 TRÊN THẾ GIỚI

VÀ VIỆT NAM

Phƣơng pháp x t nghiệm phân tử để xác định các bệnh nhân UNBVM có

phải thuộc dạng di truyền hay không bao gồm các xét nghiệm đơn gen, đối với

các bệnh nhân bị UNBVM một bên mắt, 2 bên mắt hoặc bị một bên mắt nhƣng

có nhiều khối u. Phân tích trình tự và phân tích mất/lặp đoạn lớn gen RB1 đƣợc

thực hiện trên DNA máu ngoại vi. Đối với các bệnh nhân bị UNBVM một bên

mắt nhƣng có nhiều khối u và không có tiền sử gia đình, nếu không có mẫu mô

khối u, phân tích trình tự và phân tích mất/lặp đoạn lớn gen RB1 đƣợc thực hiện

trên DNA máu ngoại vi. Nếu có mẫu mô khối u, phân tích trình tự và phân tích

mất/lặp đoạn lớn gen RB1 đƣợc thực hiện trên DNA mẫu mô trƣớc sau đó tiến

hành trên DNA t máu để kiểm tra sự có mặt của biến thể này. Phân tích trình tự

nhằm phát hiện các đột biến điểm có khả năng gây bệnh hoặc gây bệnh điểm trên

vùng promoter, trên các exon và cả vùng nối intron-exon của gen RB1. Biến thể

gây bệnh có thể bao gồm các mất/lặp đoạn nhỏ và các biến thể vô nghĩa, sai

22

nghĩa và các điểm cắt nối tạo mRNA; tuy nhiên phƣơng pháp này không phát

hiện đƣợc các đột biến mất/lặp đoạn lớn. Các phƣơng pháp phân t ch mất/ lặp

đoạn đƣợc sử dụng bao gồm PCR định lƣợng (qPCR), long-range PCR,

multiplex ligation-dependent probe amplification (MLPA) và microarray [20].

Bên cạnh đó, một nghiên cứu năm 2016 tại Mỹ đã sử dụng công nghệ giải trình

tự thế hệ mới cho ph p xác định đƣợc các đột biến điểm, các indels nhỏ và mất

đoạn/lặp đoạn lớn trên toàn bộ gen RB1. Phƣơng pháp này cũng cho ph p xác

định đƣợc những đột biến dạng khảm trong mẫu máu [8]. Hiện nay, quy trình

thông thƣờng cho xét nghiệm đột biến gen RB1 là kết hợp sàng lọc các vùng mã

hóa bằng giải trình tự với các phân tích mất đoạn/lặp đoạn lớn bằng MLPA. Một

số kết quả nghiên cứu cho thấy khi kết hợp hai kĩ thuật giải trình tự và MLPA đã

làm tăng độ nhạy trong chẩn đoán. Cụ thể, nghiên cứu của nhóm Trung Quốc

cho thấy tỉ lệ phát hiện đột biến tăng t 78.6% (sử dụng kĩ thuật giải trình tự) lên

92.3% (kết hợp giải trình tự với MLPA) [44]. Nghiên cứu trên các bệnh nhân

ngƣời Malaysia cũng báo cáo tỉ lệ phát hiện đột biến là 52.6% (kết hợp giải trình

tự với MLPA)-cao hơn 36.8% (sử dụng kĩ thuật giải trình tự) và 15.8% (sử dụng

kĩ thuật MLPA) [45]. Ngoài ra, kĩ thuật MLPA kết hợp với giải trình tự gen

cũng đã đƣợc sử dụng trong sàng lọc đột biến gen RB1 trên các bệnh nhân u

nguyên bào võng mạc ở Iran, Brazil, Argentina và Singapore [30] [46] [47] [48].

23

CHƢƠNG 2: NGUYÊN VẬT LİỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHİÊN CỨU

2.1. VẬT LİỆU NGHİÊN CỨU

2.1.1. Đối tƣợng nghiên cứu.

Đối tƣợng nghiên cứu là ba mƣơi bệnh nhi đã đƣợc chẩn đoán UNBVM

trên lâm sàng và cận lâm sàng t năm 2013 đến 2018 tại Bệnh viện Mắt trung

ƣơng. Chẩn đoán UNBVM đƣợc thiết lập theo tiêu chuẩn nhãn khoa và mô học.

Độ tuổi chẩn đoán là t 3 đến 36 tháng tuổi. Cha mẹ các bệnh nhi đồng ý tham

gia nghiên cứu tự nguyện. Mẫu máu ngoại vi của bệnh nhân và ngƣời thân trong

gia đình đƣợc thu thập và đƣợc bảo quản ở - 20°C cho đến khi tách chiết DNA.

Khi một bệnh nhân đƣợc xác định là có đột biến dòng mầm, cha mẹ và anh chị

em của bệnh nhân sẽ đƣợc tƣ vấn di truyền để kiểm tra đột biến ở cùng vị trí

nucleotide trên gen RB1. Nghiên cứu này đã đƣợc chấp thuận của Hội đồng Đạo

đức trong nghiên cứu Y Sinh học (Institutional Review Board-IRB) của Viện

Nghiên cứu hệ gen, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Phƣơng

pháp nghiên cứu phù hợp với các quy định của Tuyên bố Helsinki và Hiệp hội

nghiên cứu về thị lực và nhãn khoa (Research in Vision and Ophthalmology-

ARVO) trên các đối tƣợng con ngƣời.

2.1.2. Dụng cụ, trang thiết bị

Các máy móc, thiết bị phục vụ cho nghiên cứu này thuộc Viện nghiên

cứu hệ gen, Viện hàn lâm khoa học và Công nghệ Việt Nam. Các thiết bị sử

dụng chính bao gồm: Máy ly tâm Eppendorf (Đức) và máy ly tâm lạnh đa năng

5810R* (Đức); Máy PCR Mastercycler pro S (Đức); Máy soi gel và chụp ảnh tự

động DigiDoc-It® Imaging System của Ultra-violet production (Mỹ); Máy đo

24

quang phổ (UV- Vis BioSpectrometer Basic, Đức); Máy đọc trình tự gen ABI

3500 Genetic Analyzer của Applied Biosciences (Mỹ)…

2.1.3. Hóa chất

*Hó t đ t ết N : Sử dụng kit E.Z.N.A.® Blood

DNA Minicủa OMEGA bio-tek, Mỹ.

*Hó t đ đ ện d :

Agarose của Affymetrix, Cleveland, Mỹ; Dung dịch TAE 1X; Loading

Buffer 6X; Ethidium bromide.

*Hó t t ện kỹ t uật PCR:

Taq 2X Master Mix của New England Biolab, Mỹ; dNTPs, Nƣớc 3D

(deionized double distilled (3D) water) và DMSO t bioWORLD, Mỹ; Các đoạn

mồi đƣợc đặt hàng t Intergated DNA Technologies (IDT), Mỹ.

* Hó t đ t n sạ sản p ẩm PCR:

Sử dụng kit Gen JETTM PCR purification của Thermo Scientific, Mỹ.

* Hó t ả trìn t n:

Ethanol của Merk, Mỹ; Kit giải trình tự Big Dye Terminator v3.1 của

Applied Biosciences.

* Hó t t ện p ản ứn MLP :

Bộ kit SALSA MLPA P047-D1 RB1 Probemix (MRC-Holland,

Amsterdam, Hà Lan)

2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHİÊN CỨU

Quá trình nghiên cứu đƣơc thực hiện theo sơ đồ sau:

25

2.2.1. Phƣơng pháp lấy mẫu

Bệnh nhân đƣợc lấy 2 mL máu tĩnh mạch, cho vào ống chứa chất chống

đông EDTA với hàm lƣợng 1,5 mg/mL. Quy trình lấy máu đảm bảo vô trùng

tuyệt đối và bảo quản ở -20°C cho đến khi tách chiết DNA.

2.2.2. Phương pháp tách chiết DNA genomic

Mẫu máu của các đối tƣợng nghiên cứu đƣợc tách chiết DNA tổng số

bằng cách sử dụng kit E.Z.N.A Blood DNA mini (Promega) theo hƣớng dẫn của

nhà sản xuất. Sản phẩm DNA sau khi tách chiết đƣợc xác định nồng độ bằng kit

Qubit Fluorometer BR (Broad-range) DNA. Nguyên lý của phƣơng pháp này là

khi hòa hỗn hợp có Qubit dye với DNA tổng số, dye sẽ gắn kết với DNA sợi đôi

và đạt trạng thái bão hòa trong 2 phút. Tín hiệu huỳnh quang của dye sẽ tỉ lệ

26

thuận với nồng độ DNA mà dye gắn kết vào. T đó, Qubit Fluorometer thu nhận

tín hiệu huỳnh quang và tính nồng độ DNA sợi đôi dựa trên đƣờng chuẩn nồng

độ DNA đƣợc xây dựng t hai mẫu chuẩn (đƣợc cung cấp theo bộ kit).

2.2.3. Phƣơng pháp khuếch đại gen (PCR)

2.2.3.1. ết kế mồ o PCR và s qu n n .

Cặp mồi nhân vùng điều khiển gen đƣợc thiết kế dựa trên trình tự nhân

chuẩn của RB1 mang accession number NM.000321.2 trong ngân hàng

GenBank. Các cặp mồi này đều cho ph p nhân đƣợc toàn bộ exon đ ch và 50-

100bp thuộc hai intron liền kề.

Bảng 2.1 Các cặp mồi đặc hiệu cho phản ứng PCR

Vùng K ch thƣớc(bp) Mồi Trình tự 5’-3’

Promoter

696

Prom F CTGGACCCACGCCAGGTTTC

Prom R GTTTTGGGCGGCATGACGCCTT

RB exon 1 1F CCGGTTTTTCTCAGGGGACGTTG

1R TTGGCCCCGCCCTACGCACAC

RB exon 2 331 2F CTATTGAAACAAGTATGTACTG

2R GGGTAATGGAATTATTATTAGC

RB exon 3 281 3F CAGTTTTAACATAGTATCCAG

3R AGCATTTCTCACTAATTCAC

RB exon 4 365 4F GTAGTGATTTGATGTAGAGC

4R CCCAGAATCTAATTGTGAAC

RB exon 5 194 5F GCATGAGAAAACTACTATGAC

5R CTAACCCTAACTATCAAGATG

27

RB exon 6 222 6F CACCCAAAAGATATATCTGG

6R ATTTAGTCCAAAGGAATGCC

RB exon 7 256 7F CCTGCGATTTTTCTCTCATAC

7R ATGTTTGGTACCCACTAGAC

RB exon 8 380 8F AGTAGTAGAATGTTACCAAG

8R TACTGCAAAAGAGTTAGCAC

RB exon 9 222 9F TGCATTGTTCAAGAGTCAAG

9R AGTTAGACAATTATCCTCCC

RB exon 10 291 10F TCTTTAATGAAATCTGTGCC

10R GATATCTAAAGGTCACTAAG

RB exon 11 245 11F GAGACAACAGAAGCATTATAC

11R CGTGAACAAATCTGAAACAC

RB exon 12 310 12F GGCAGTGTATTTGAAGATAC

12R AACTACATGTTAGATAGGAG

RB exon 13 342 13F CTTATGTTCAGTAGTTGTGG

13R TATACGAACTGGAAAGATGC

RB exon 14

808

14F GTGATTTTCTAAAATAGCAGG

14R TGCCTTGACCTCCTGATCTG

RB exon

15+16

15+16F CAATGCTGACACAAATAAGG

15+16R AGCATTCCTTCTCCTTAACC

RB exon 17 339 17F AAAAATACCTAGCTCAAGGG

17R TGTTAAGAAACACCTCTCAC

RB exon 18 340 18F TGTACCTGGGAAAATTATGC

28

18R CTTTATTTGGGTCATGTACC

RB exon1 9 273 19F ATAATCTGTGATTCTTAGCC

19R AAGAAACATGATTTGAACCC

RB exon 20 335 20F AAAGAGTGGTAGAAAAGAGG

20R CAGTTAACAAGTAAGTAGGG

RB exon 21 328 21F AAACCTTTCTTTTTTGAGGC

21R TACATAATAAGGTCAGACAG

RB exon 22 313 22F TAATATGTGCTTCTTACCAGTC

22R TTTAATGTTTTGGTGGACCC

RB exon 23 287 23F ATCTAATGTAATGGGTCCAC

23R CTTGGATCAAAATAATCCCC

RB exon 24 273 24F GAATATAGTTTGTCAGTGGTTC

24R GTGTTTGAATAACTGCATTTGG

RB exon 25

834

25F GGTTGCTAACTATGAAACAC

25R AGAAATTGGTATAAGCCAGG

RB exon 26 26F AGTAAGTCATCGAAAGCATC

26R AACGAAAAGACTTCTTGCAG

RB exon 27 237 27F CGCCATCAGTTTGACATGAG

2.2.3.2. P ơn p p PCR

ến àn PCR

Tổng phản ứng là 25 µl bao gồm 20 ng DNA genome, 0.4 pmol mồi mỗi

loại, và 12.5 µl Taq 2X Master Mix (New England Biolab, Ipswich, MA).

29

Dimethyl sulfoxide (DMSO) đƣợc bổ sung vào phản ứng khuếch đại cho đoạn

promoter-exon1.

Quá trình khuếch đại đƣợc thực hiện trong các điều kiện sau đây: giai đoạn

biến t nh ban đầu là 2 phút ở 95°C, tiếp theo là 35 chu kỳ của giai đoạn biến tính

ở 95°C trong 30 giây; nhiệt độ gắn mồi đặc hiệu cho mỗi mồi trong 30 giây;

68°C trong 30 giây đến 1 phút và bƣớc cuối cùng ở 68°C trong 5 phút.

Thành phần Thể t ch (μL)

Taq 2X Master Mix 12.5

Mồi xuôi (10pmol/ µl) 1

Mồi ngƣợc (10pmol/ µl) 1

DNA (20 ng/µl) 1

Nƣớc cất 9.5

Tổng 25

Sản phẩm PCR đƣợc phát hiện bằng điện di trên gel agarose 1.2 % có

nhuộm ethidium bromide và quan sát dƣới ánh sáng UV.

n sạ sản p ẩm PCR

Sản phẩm PCR sau đó đƣợc tinh sạch bằng kit Gen JETTM PCR

purification (Thermo Scientific) theo hƣớng dẫn của nhà sản xuất.

Bổ sung Binding Buffer vào các ống eppendorf có chứa mẫu với tỷ lệ thể

t ch Binding/ mẫu là 1:1

30

Chú ý: Kiểm tra màu sắc của dung dịch. Màu vàng là chỉ thị cho pH tối ƣu

của DNA Binding. Nếu dung dịch có màu da cam hoặc tím thì bổ sung 10μL

sodium acetate 3M, pH 5.2 và mix đều.

Chuyển hỗn hợp sang cột tinh sạch. Ly tâm 14000rpm trong 1 phút ở

25°C. Sau đó loại bỏ dịch.

Bổ sung 700μL Wash Buffer vào cột tinh sạch. Ly tâm 14000rpm trong 1

phút ở 25°C. Sau đó loại bỏ dịch.

Chuyển cột tinh sạch sang ống eppendorf 1.5mL.

Bổ sung 35μL Elution Buffer vào ch nh giữa cột tinh sạch. Ủ 5 phút ở

nhiệt độ phòng. Ly tâm 14000rpm trong 1 phút ở 25°C.

Loại bỏ cột tinh sạch. Thu sản phẩm

Bảo quản ở -20°C.

Sản phẩm thu đƣợc sẽ đƣợc kiểm tra bằng phƣơng điện di trên gel agarose

2.2.4. Phƣơng pháp giải trình tự gen

PCR cho giải trình tự.

Sản phẩm PCR tinh sạch sẽ đƣợc sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR

sử dụng bộ kit BigDye Terminator V3.1 theo hai chiều xuôi và ngƣợc cho mỗi

đoạn cần đọc. Mỗi phản ứng PCR cho giải trình tự gen bao gồm: 1 µl BigDye

sequencing Buffer 5X, 1 µl mồi xuôi hoặc mồi ngƣợc 1.6 pmol/µl, 1 µl Big Dye,

2 µl DNA đã đƣợc tinh sạch, 5.5 µl nƣớc khử ion vô trùng.

Kỹ thuật PCR cho giải trình tự gen đƣợc tiến hành trên máy luân nhiệt

(MJ Research) với chu trình nhiệt nhƣ sau: biến t nh ban đầu với 96°C trong

vòng 1 phút, tiếp theo là 25 chu kỳ của sự biến tính ở 96°C trong 10 giây; 50°C

31

trong 5 giây; 60°C trong 4 phút. Giảm nhiệt nhanh đến 4°C và giữ cho đến khi

sử dụng.

Tinh sạch sản phẩm PCR cho sequencing

Sau khi PCR cho giải trình tự, 3µl EDTA và 60µl ethanol 100% đƣợc bổ

sung vào sản phẩm PCR, tiếp theo tiến hành ly tâm 4000rpm trong 30 phút ở 4ºC

và sau đó DNA kết tủa đƣợc sấy khô ở nhiệt độ phòng trong 15 phút.

Biến t nh mẫu

Bổ sung 10 μL Hi-Di vào t ng mẫu. Sau đó mix đều mẫu. Tiếp theo mẫu

đƣơc biến tính bằng máy PCR ở 95°C trong 2 phút trƣớc khi làm lạnh nhanh

bằng đá.

Mẫu đã sẵn sàng cho giải trình tự.

Chạy điện di mao quản trên máy giải trình tự gen ABI 3500 Gentic

Analyzer

Các nucleotid trên đoạn gen sẽ đƣợc biểu hiện bằng các đỉnh (peak) với

4 màu tƣơng đƣơng với 4 loại nucleotid A, T, G, C.

2.2.5. Phƣơng pháp Multiplex Ligation-dependent Probe

Amplification (MLPA)

Để xác định mất đoạn/ thêm đoạn trong gen RB1, kĩ thuật MLPA đã

đƣợc thực hiện theo hƣớng dẫn của nhà sản xuất bộ kit SALSA MLPA P047-D1

RB1 Probemix. P047-D1 RB1 probemix chứa các đầu dò cho 26 trong số 27

exon RB1. Không có đầu dò nào để kiểm tra sự có mặt của exon 15, bởi vì exon

này nằm rất gần với các exon lân cận. Có 5 mẫu dò để kiểm tra exon 1, 2 mẫu dò

cho exon 12 và 2 mẫu dò cho exon 27. Hơn nữa, probemix này chứa các mẫu dò

32

ở vùng nối của gen RB1 (ph a trƣớc 48 kb, ph a sau gen 35 kb) cũng nhƣ một

mẫu dò cho gen DLEU1 và hai mẫu dò cho gen PCDH8 tƣơng ứng là 1,6 Mb và

4,5 Mb ở phía sau của RB1. Ngoài ra, probemix có 13 mẫu dò tham chiếu, phát

hiện một số vị trí khác nhau trên nhiễm sắc thể thƣờng.

* Th c hiện phản ứng MLPA

Để chuẩn bị cho phản ứng MLPA, DNA tổng số đƣợc pha loãng về nồng

độ 10ng/μl trong đệm TE 50ng DNA tổng số với thể t ch 5μl đƣợc sử dụng cho

phản ứng MLPA. Các bƣớc đƣợc tiến hành nhƣ sau:

Ngày thứ nhất

Bƣớc 1: Biến tính DNA

Thêm 5μl DNA tổng số (50ng) vào mỗi ống PCR 0.2ml. Biến tính DNA

tổng số bằng máy PCR trong 5 phút ở 980C, làm lạnh mẫu xuống 25

0, sau đó đƣa

mẫu ra khỏi máy PCR.

Bƣớc 2: Phản ứng lai

- Vortex đều MLPA buffer và MLPA probemic trƣớc khi sử dụng, spin down

nhẹ các ống mẫu.

- Chuẩn bị hỗn hợp phản ứng lai (hybridization mastermix):

[1.5 μl MLPA buffer + 1.5 μl probemix]/1 phản ứng lai. Trộn đều hỗn hợp bằng

pipetting hoặc vortex.

- Thêm 3 μl hỗn hợp phản ứng lai vào mỗi mẫu DNA đã đƣợc biến t nh trƣớc đó,

trộn đều bằng pipetting.

- Tiếp tục chu trình nhiệt: ủ trong 1phút ở 950C, 16-20 giờ ở 60

0C.

Ngày thứ hai

33

Bƣớc 3: Phản ứng gắn kết

- Vortex đều 2 Buffer ligase

- Chuẩn bị hỗn hợp Ligase 65:

[25 μl DDW + 3 μl Ligase Buffer A + 3 μl Ligase Buffer B]/1 phản ứng. Sau đó

thêm 1 μl Ligase 65 enzyme và trộn đều hỗn hợp bằng pipetting (không vortex).

Tiếp tục chu trình nhiệt: hạ nhiệt độ t 600 xuống 54

0 và giữ ở nhiệt độ này.

- Khi mẫu đang ở 540C trong máy PCR, thêm 32 μl hỗn hợp ligase 65 vào mỗi

ống mẫu, trộn đều bằng pipetting.

- Tiếp tục chu trình nhiệt: ủ 15 phút ở 540C (gắn kết hai phần của đầu dò), ủ 5

phút ở 980C (bất hoạt enzyme ligase 65). D ng ở 20

0C. Lúc này các ống mẫu

có thể đƣợc lấy ra khỏi máy PCR.

Bƣớc 4: Phản ứng PCR

- Vortex Salsa PCR primer mix. Làm ấm Polymerase trong tay 10 giây để giảm

độ nhớt.

- Chuẩn bị hỗn hợp enzyme polymerase:

[7.5 μl DDW + 2 μl Salsa PCR primer + 0.5 μl Salsa polymerase]/ 1 phản ứng.

Trộn đều bằng pipetting và giữ hỗn hợp này trên đá.

- Khi các ống mẫu ở nhiệt độ phòng, thêm 10 μl hỗn hợp chứa polymerase vào

mỗi ống mẫu. Trộn đều bằng pipetting.

- Tiếp tục chu trình nhiệt: 35 cycles x (950C: 30 giây, 60

0C: 30 giây, 72

0C: 60

giây); 720C: 10 phút; 15

0C: pause

Sản phẩm PCR đƣợc lƣu ở 40 (1 tuần) hoặc -25

0C (lƣu giữ lâu dài), bọc

trong giấy bạc hoặc hộp tối và tránh ánh sáng

34

* Đ ện di mao quản p n t đoạn

- 0.7 μl sản phẩm PCR đƣợc sử dụng để điện di mao quản nhằm phân tách các

phân đoạn đã đƣợc khuếch đại theo k ch thƣớc.

- Chuẩn bị hỗn hợp:

[0.7 μl sản phẩm PCR + 0.2 μl sản phẩm PCR LIZ (GS500) + 9 μl HiDi

formamide]. Đĩa phản ứng đƣợc làm nóng ở 860C trong 3 phút, sau đó làm lạnh

xuống 40C trong 2 phút. Lúc này, hỗn hợp đã sẵn sàng cho điện di mao quản.

- Các thông số điện di mao quản đƣợc thiết lập nhƣ sau:

Thiết bị Mao quản Cài đặt

ABI-3500 8 mao quản- 50cm Run module: Fragment analysis

Injecttion voltage: 1.6kV

Injection time: 15sec

Run voltage: 15kV

Run time: 1800s

Oven temperature: 600C

Polymer: POP 7

2.2.6. Phƣơng pháp phân tích kết quả

2.2.6.1. Phân tích kết quả giải trình t gen

So sánh trình tự gen của bệnh nhân với trình tự gen chuẩn của RB1 trong

ngân hàng GenBank với mã số NM_000321.2 bằng phần mềm BioEdit để xác

định các đa hình, đột biến.

35

Kết hợp các cơ sở dữ liệu database của gen RB1 (http://Rb1-lsdb.d-

lohmann.de/variants.php?action=search_unique&select_db=RB1) để xác định

vai trò của các đa hình/đột biến đối với quá trình hình thành và tiến triển của

bệnh.

2.2.6.2. Phân tích kết quả MLPA

Phân tích kết quả bằng phần mềm Coffalyzer.net: Sau khi chạy điện di

mao quản trên máy ABI 3500, dữ liệu đƣợc phân tích bằng phần mềm

Coffalyzer.net. Tín hiệu huỳnh quang đƣợc xác định bởi điện di mao quản

không đƣợc sử dụng để trực tiếp tính toán số bản sao, do tín hiệu huỳnh quang

này còn bị ảnh hƣởng bởi nhiều biến số. Đầu tiên, giá trị tín hiệu huỳnh quang

của mỗi đầu dò sẽ đƣợc chuẩn hóa trong mỗi mẫu. Sau đó, các mẫu khác nhau sẽ

đƣợc so sánh với nhau để xác định mẫu nào có số bản sao thay đổi bất thƣờng.

Quá trình chuẩn hóa của MLPA bao gồm 2 bƣớc: chuẩn hóa trong 1 mẫu-

intrasample normalization (so sánh các đỉnh tín hiệu của các đầu dò khác nhau

trong cùng một mẫu) và chuẩn hóa giữa các mẫu-intersample Normalization (so

sánh các đỉnh tín hiệu của mỗi đầu dò tƣơng ứng giữa các mẫu khác nhau).

Những mẫu không có sự thay đổi nào về bản sao của gen RB1 sẽ cho hình ảnh

các đỉnh tín hiệu của các đầu dò giống với hình ảnh kết quả của mẫu đối chứng

khỏe mạnh. Tỉ lệ của các đầu dò sau bƣớc chuẩn hóa thứ 2 sẽ là ~ 1. Đối với

trƣờng hợp mất đoạn dị hợp tử, tỉ lệ này sẽ là ~ 0.5. Tỉ lệ cuối cùng này còn đƣợc

gọi là Dosage Quotient (DQ). Phần mềm Coffalyzer.net sẽ tính toán DQ cho

t ng đầu dò và đƣa ra kết quả cuối cùng.

36

CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. KẾT QUẢ

3.1.1. Thu thập mẫu nghiên cứu

Tổng số có 30 mẫu bệnh nhi mắc UNBVM đã đƣợc chẩn đoán trên lâm

sàng và cận lâm sàng và cha mẹ của các bệnh nhi. Trong đó bao gồm 21 nữ

(70%) và 9 nam (30%). Có 9 bệnh nhi bị UNBVM một bên mắt (30%) và 21

bệnh nhi bị UNBVM cả hai bên mắt (70%). Xét về tính chất di truyền, có 21

bệnh nhi là trƣờng hợp tự phát (70%) trong khi đó có 9 bệnh nhi thuộc trƣờng

hợp thể gia đình (30%). Trong số những ca gia đình, có một bệnh nhân mã số

RB15 ban đầu đƣợc chẩn đoán là UNBVM hai mắt thể tự phát nhƣng sau đó

đƣợc phân loại lại vào nhóm có tiền sử gia đình do có em gái phát triển UNBVM

sau đó. Thông tin lâm sàng của các đối tƣợng nghiên cứu đƣợc tóm tắt trong

bảng 3.1.

Bảng 3.1. Đặc điểm lâm sàng của các đối tƣợng nghiên cứu.

Mã

bệnh

nhi

Giới

t nh/tuổi

(tháng)

Kiểu hình

Điều trị

Mẫu bố/

mẹ thu

đƣợc Số mắt bị

UNBVM

Thể tự phát (S) or

theo gia đình (Fa)

RB2 Nữ/12 Một mắt S NA Mẹ

RB5 Nữ Hai mắt S NA Mẹ

RB6 Nữ Một mắt

(mắt trái) S NA Mẹ

RB7 Nam Hai mắt Fa, Anh trai bị

UNBVM đã chết NA Mẹ

37

RB8 Nữ Hai mắt Fa, chị gái bị

UNBVM đã chết

Đã loại bỏ nhãn

cầu (mắt trái) Mẹ

RB10 Nam Một mắt

(mắt trái) S NA Mẹ

RB11 Nam Một mắt

(mắt phải) S Hóa trị Mẹ

RB12 Nữ Hai mắt S

Đã loại bỏ nhãn

cầu (mắt trái),

laser (mắt phải)

Mẹ

RB13 Nữ Hai mắt Fa, Anh trai và chị

gái bị UNBVM NA Mẹ

RB15* Nữ Hai mắt S, em gái bị

UNBVM (RB24)

Đã loại bỏ nhãn

cầu (mắt trái), hóa

trị

Bố mẹ

RB16 Nam Hai mắt S NA Mẹ

RB17 Nam Một mắt

Fa, Bố bị UNBVM

mắt phải, đã loại bỏ

nhãn cầu.

NA Bố mẹ

RB20 Nam Hai mắt

Fa, Bố bị UNBVM

mắt phải, đã loại bỏ

nhãn cầu.

NA Bố mẹ

RB21 Nam Hai mắt

Fa, Bố bị UNBVM

một mắt, đã loại bỏ

nhãn cầu.

NA Bố

RB23 Nữ Một mắt) S NA Mẹ

RB24* Nữ Một mắt

(mắt phải)

Fa, chị gái bị

UNBVM (RB15) Laser (mắt phải) Bố mẹ

38

RB25 Nữ Hai mắt S Đã loại bỏ nhãn

cầu (mắt trái), hóa

trị

NA

RB26 Nữ Hai mắt S NA Mẹ

RB28 Nữ Hai mắt S

Đã loại bỏ nhãn

cầu (mắt phải),

hóa trị

Mẹ

RB35 Nữ Hai mắt

Fa, Bố bị UNBVM

mắt phải, đã loại bỏ

nhãn cầu.

Đã loại bỏ nhãn

cầu (mắt phải),

laser (mắt trái)

Mẹ

RB36 Nữ Hai mắt S Đã loại bỏ nhãn

cầu (mắt trái) Bố mẹ

RB38 Nữ Hai mắt S

Đã loại bỏ nhãn

cầu (mắt trái),

laser (mắt phải)

Bố mẹ

RB39 Nam Hai mắt S

Đã loại bỏ nhãn

cầu (mắt trái),

laser (mắt phải)

Bố mẹ

RB40 Nữ Hai mắt S

Đã loại bỏ nhãn

cầu (mắt phải),

laser (mắt trái)

Bố mẹ

RB43 Nam Hai mắt S

Đã loại bỏ nhãn

cầu (mắt phải),

laser (mắt trái)

Bố mẹ

RB44 Nữ Hai mắt S

Đã loại bỏ nhãn

cầu (mắt phải),

laser (mắt trái)

Mẹ

RB45 Nữ Hai mắt S

Đã loại bỏ nhãn

cầu (mắt trái),

laser (mắt phải)

Bố mẹ

RB47 Nữ Một mắt S Đã loại bỏ nhãn

cầu (mắt phải),

Bố mẹ

39

laser (mắt trái)

RB48 Nữ Một mắt S

Đã loại bỏ nhãn

cầu (mắt phải),

laser (mắt trái)

NA

RB49 Nữ Hai mắt S

Đã loại bỏ nhãn

cầu (mắt trái),

laser (mắt phải)

Bố mẹ

*: anh chị em; S: UNBVM thể tự phát; Fa: UNBVM thể gia đình; NA: không

thu đƣợc mẫu

3.1.2. Tách chiết DNA tổng số

DNA tổng số sau khi tách chiết, đƣợc kiểm tra bằng cách điện di trên gel

agarose 0.8%. DNA tổng số có k ch thƣớc và trọng lƣợng phân tử lớn nhất nên

dƣới tác dụng của dòng điện một chiều, DNA tổng số sẽ di chuyển chậm và

chiếm vị trí cao trên bản gel. DNA trên bản gel sau đó đƣợc nhuộm bằng EtBr.

Do cấu trúc của DNA có các liên kết hydro giữa mạch đơn nên trong quá trình

nhuộm, các phân tử EtBr sẽ bám vào liên kết này. Phân tử EtBr có khả năng phát

quang dƣới ánh sáng của tia UV, nên ta có thể phát hiện đƣợc băng vạch khi

chiếu bản gel dƣới đèn UV.

Hình 3.1: Ảnh minh hoạ điện di đồ sản phẩm DNA tổng số tách chiết t mẫu

máu bệnh nhân và gia đình

40

Trong nghiên cứu này, hầu hết sản phẩm DNA tổng số tách chiết đƣợc cho

thấy các dải băng rõ ràng và sáng tập chung ở khu vực có k ch thƣớc DNA

khoảng 20 kb trên bản gel. Điều này cho thấy sản phẩm DNA tổng số thu đƣợc

không bị đứt gẫy nhiều và có độ tinh khiết cao, đảm bảo yêu cầu về chất lƣợng

cho các bƣớc sàng lọc gen tiếp theo.

Tiếp theo, các mẫu DNA tổng số đƣợc xác định nòng độ bằng bộ kit

Qubit Fluorometer BR (Broad-range). Kết quả chúng tôi đã xác định đƣợc nồng

độ DNA tổng số của các mẫu bệnh nhi nằm trong khoảng t 29.5 đến 62.3 ng/µl

(Bảng 3.2).

Bảng 3.2: Nồng độ DNA tổng số của các mẫu bệnh nhi UNBVM

Mẫu bệnh nhi Nồng độ DNA

(ng/µl)

Mẫu bệnh nhi Nồng độ DNA

(ng/µl)

RB2 33.6 RB24 39.7

RB5 42.9 RB25 40.1

RB6 29.5 RB26 42.8

RB7 31.2 RB28 41.4

RB8 49.3 RB35 44.2

RB10 47.7 RB36 38.3

RB11 37.6 RB38 32.1

RB12 50.7 RB39 54.8

RB13 55.7 RB40 62.3

RB15 41.6 RB43 59.1

RB16 36.4 RB44 48.5

41

RB17 37.9 RB45 39.3

RB20 39.0 RB47 36.6

RB21 34.1 RB48 41.4

RB23 38.9 RB49 53.8

3.1.3. PCR khuếch đại các đoạn gen RB1

DNA tổng số tinh sạch t mẫu máu bệnh nhi UNBVM đƣợc sử dụng làm

khuôn cho PCR. Để tiến hành nhân đoạn gen RB1 bằng kỹ thuật PCR, mồi là

một chỉ tiêu quan trọng nhất để đạt đƣợc sự khuếch đại đặc hiệu và có hiệu quả

cao. Các cặp mồi nhân vùng điều khiển gen đƣợc thiết kế dựa trên trình tự nhân

chuẩn của RB1 mang mã số NM.000321.2 trong ngân hàng GenBank. Các cặp

mồi này đều cho ph p nhân đƣợc toàn bộ exon đ ch và 50-100bp thuộc hai intron

liền kề.

Đối với phản ứng PCR, việc xây dựng một chu trình nhiệt phù hợp là một

trong những yếu tố quyết định, bởi vì nhiệt độ thích hợp sẽ đảm bảo cho sự giãn

xoắn, tách sợi của phân tử DNA, cũng nhƣ việc gắn mồi và kéo dài chuỗi. Chu

trình nhiệt tối ƣu cho phản ứng PCR trình bày ở mục 2.2.3. Chúng tôi tiến hành

khuếch đại vùng điều khiển và 27 exon của gen RB1 bằng 23 phản ứng với các

cặp mồi đặc hiệu trong đó promoter và exon 1; exon 14,15 và 16; exon 22 và 23;

exon 25 và 26 đƣợc khuếch đại chung. Vùng điểu khiển và exon 1 đƣợc khuếch

đại riêng với các exon còn lại do cần điều chỉnh nhiệt độ bám mồi cao hơn. Sản

phẩm của phản ứng PCR đƣợc tiến hành kiểm tra trên gel agarose 1.2% và thu

kết quả trình bày trên hình 3.2.

42

Hình 3.2: Ảnh minh hoạ điện di đồ sản phẩm PCR t mẫu UNBVM

(A) M: thang DNA chuẩn (marker 100bp), Pr: sản phẩm PCR vùng điều khiển, 1-

7: sản phẩm PCR của các exon 1 đến 7. (B) M: thang DNA chuẩn -100bp, 8-27:

sản phẩm PCR của các exon 8 đến 27

Nhƣ vậy, kết quả cho thấy sản phẩm của các phản ứng PCR là một băng

đặc hiệu, sáng rõ. Các đoạn DNA đƣợc nhân lên bằng cặp mồi tƣơng ứng có kích

thƣớc t 194 bp đến 834 bp.

A

B

43

3.1.4. Phát hiện đột biến bằng giải trình tự gen RB1

Kết quả giải trình tự và sàng lọc đột biến gen t 30 mẫu bệnh nhân cho

thấy tỷ lệ đột biến dị hợp tử gây bệnh là 60.0% (18/30). Trong số các đột biến

này, 13 trƣờng hợp (72.22%) bị ảnh hƣởng cả hai mắt và năm trƣờng hợp

(27.78%) bị ảnh hƣởng một bên mắt. Trong số 18 đột biến có 33.33% (6/18) là

đột biến vô nghĩa, 33.33 % (6/18) là đột biến dịch khung, 27.78% (5/18) là thay

đổi vị trí cắt nối (Splicing) và chỉ 5.56% (1/18) là đột biến sai nghĩa. Sự phân bố

của các đột biến trong gen RB1 đƣợc thể hiện trong Hình 3.3. Trong số các đột

biến đƣợc phát hiện, 83.33% (15/18) nằm ở các vùng mã hóa cho domain A

(exons 12-18) và B (exons 19 -23 ) của pocket pRb. Đây là các vùng tƣơng tác

và ức chế các yếu tố phiên mã E2F làm cho protein pRb đóng vai trò quan trọng

trong việc điều hòa chu kỳ tế bào, ức chế G1/S và hạn chế tăng trƣởng [49].

Trong đó, có ch n ca là tự phát (7 ca bị hai mắt và 2 ca bị một mắt), và sáu ca

còn lại là UNBVM gia đình (4 ca bị hai mắt và 2 ca bị một mắt).

44

Hình 3.3: Sơ đồ biểu diễn các đột biến trên gen RB1 đƣợc phát hiện ở 23 bệnh

nhân. Domain A và B đƣợc biểu diễn bởi 2 hình bầu dục xám, số lƣợng các ô

tƣơng ứng với các exon. ● đột biến sai nghĩa, ▲ đột biến splicing, ♦ đột biến vô

nghĩa và ■ đột biến lệch khung. Đột biến mất một phần hoặc toàn bộ gen đƣợc

biểu thị bởi các thanh ngang. Tất cả các đột biến điểm và mất đoạn đều đƣợc xác

định ở trạng thái dị hợp tử.

Bảng 3.3: Đột biến RB1 phát hiện ở bệnh nhân UNBVM bằng phƣơng pháp giải

trình tự Sanger.

Mã

bệnh

nhi

Vị trí trên gen Exon/

intron

Vị trí trên

cDNA Kết quả

Th a hƣởng t

mẹ/bố TLTK

RB6 g.76434insTA Exon 14 c.1337insTA Frameshift Không/NA Mới

RB7 g.77028-

77029delTA Exon 16

c. 1449-

1450delTA Frameshift Không/NA Mới

45

RB8 g.39445G>T Intron 2 c.265-1G>T Splicing Không/NA LOVD

RB12 g.73849delT Exon 13 c.1312delT Frameshift Không/NA Mới

RB13 g.160835G>A Intron

21

c.2211+1G>

A Splicing Không/NA LOVD

RB15* g.153353G>A Exon 19 c.1960G>A Splicing Không/Có LOVD

RB16 g.73843C>T Exon 13 c.1306C>T p.Gln436X Không/NA LOVD

RB17 g.16237T>G Exon 23 c.2439T/G p.Tyr813X Không/Có LOVD

RB23 g.156713C>T Exon 20 c.1981C>T p.Arg661Tr

p Không/NA LOVD

RB24* g.153353G>A Exon 19 c.1960G>A Splicing Không/Có LOVD

RB28 g.70330G>A Intron12 c.1215+1G>

A Splicing Không/NA LOVD

RB35 g.77073T>G Exon 16 c.1494T>G p.Tyr498X Có,

Khảm/Không LOVD

RB39 g.162237C>T Exon 23 c.2359C>T p.Arg787X Không/Không LOVD

RB43 g.73867C>T Exon 13 c.1330C>T p.Gln444X Không/Không LOVD

RB44 g.156761G>T Exon 20 c.2029G>T p.Glu667X Không/NA LOVD

RB45 g.153332-

153333delTC; Exon 19

c.1939-

1940delTC Frameshift Không/Không LOVD

RB48 g.64341-

64344delTCTT Exon 10

c.951-

954delTCTT Frameshift NA/NA LOVD

RB49 g.39551-

39552delTA Exon 3

c.371-

372delTA Frameshift Không/Không LOVD

Trình tự nucleotide của DNA và cDNA trong ngân hàng GenBank với mã

số L11910.1 và NM_000321.2. Trình tự tham chiếu cho protein pRB, NP-

000312.2 *: anh chị em; Frameshift: Đột biến dịch khung; Splicing: Đột biến tại

46

vị trí cắt nối; X: Đột biến tạo mã kết thúc; NA: không có sẵn; NY: mẫu chƣa

đƣợc kiểm tra

Chỉ có một đột biến sai nghĩa thay thế arginine thành tryptophan tại codon

661 (p.Arg661Trp) trong exon 20 đƣợc tìm thấy trong nhóm nghiên cứu và đột

biến có liên quan đến biểu hiện nhẹ của UNBVM một bên mắt thể tự phát. Bốn

đột biến thay thế đã đƣợc xác định ở intron 2 (c.265–1G>T), intron 21 (c.2211 +

1G> A), intron 12 (c.1215 + 1G> A) và exon 19 (c.1960G> A) làm thay đổi tín

hiệu tại vị trí cắt nối của gen.

3.1.5. Phát hiện thay đổi cấu trúc gen bằng MLPA

Kỹ thuật MLPA đƣợc áp dụng cho 12 mẫu bệnh nhi âm tính với kết quả

sàng lọc đột biến gen bằng phƣơng pháp giải trình tự trƣớc đó. Kết quả phân

t ch đƣợc hiển thị dƣới dạng bảng số liệu và biểu đồ sóng (electropherogram).

Mỗi đỉnh tín hiệu (peak) là sản phẩm khuếch đại của một probe. K ch thƣớc mỗi

peak đƣợc so sánh với thang k ch thƣớc chuẩn (LIZ-GS 500) và so sánh với mẫu

đối chứng (mẫu của ngƣời khỏe mạnh), t đó t nh đƣợc tỉ lệ DQ (Dosage

quotients). Chiều cao của peak thay đổi cho thấy sự thay đổi số bản sao của đoạn

DNA có trình tự bổ sung với probe tƣơng ứng. Bảng 3 đƣa ra các thông số của

nhà sản xuất về mối liên hệ giữa số bản copy và sự phân bố điển hình của giá trị

DQ (số bản sao là 2 đƣợc coi là bình thƣờng). Bên cạnh đó, kết quả phân tích là

đáng tin cậy khi độ lệch chuẩn (standard deviation) của mỗi đầu dò của mẫu đối

chứng nhỏ (< 10%), các đầu dò cho tín hiệu đồng thời tăng hoặc giảm tại các

exon liền kề nhau (thể hiện mất/lặp đoạn nhiều exon liền nhau). Ngƣợc lại, kết

quả phân t ch không đáng tin cậy khi các đầu dò bổ sung với các exon không liền

kề cho tín hiệu tăng hoặc giảm (ví dụ kết quả cho thấy mất exon 3 và exon 17).

47

Hoặc trong cùng một mẫu mà một hay nhiều đầu dò chuẩn (reference probes)

cho kết quả số bản copy bất thƣờng.

Bảng 3.4: Mối liên hệ giữa giá trị DQ và số bản sao

Phân bố giá trị DQ Số bản copy

DQ = 0 0 copy (mất đoạn đồng hợp tử)

0.4 < DQ < 0.65 2=> 1 copy (mất đoạn dị hợp tử)

0.8 < DQ < 1.2 2 copies-Bình thƣờng

1.3 < DQ < 1.65 2=> 3 copies (lặp đoạn dị hợp tử)

1.75 < DQ < 2.15 2=> 4 copies

Giá trị khác Kết quả không rõ ràng

Kết quả phân tích MLPA cho thấy cho thấy 20% (6/30) bệnh nhân bị mất

toàn bộ hoặc một phần gen ở trạng thái dị hợp tử, trong đó tất cả đều là các bệnh

nhi bị UNBVM cả hai bên mắt. Có hai trƣờng hợp bị mất toàn bộ một alen đƣợc

xác định là di truyền t ngƣời cha (bệnh nhân RB20 và RB21) (Hình 3.4b). Ở

bệnh nhân mã số RB38, phát hiện thấy mất một phần gen t exon 4 đến exon 27

của gen RB1 (Hình 3.4c). Các đột biến mất đoạn lớn trên gen RB1 đƣợc tóm tắt

trong Bảng 3.5.

48

(a)

(b)

Rb21 RB21

Ngƣời khỏe mạnh

49

(c)

Hình 3.4: Kết quả dạng biểu đồ sóng (electrophotogram) sau khi phân tích

MLPA

Bảng 3.5: Các đột biến mất đoạn lớn trên gen RB1 đƣợc xác định bằng phƣơng

pháp MLPA

Mã bệnh nhân Mất đoạn Th a hƣởng t mẹ/bố

RB5 Mất toàn bộ alen NY/NY

RB20 Mất toàn bộ alen NY/Có

RB21 Mất toàn bộ alen NY /Có

RB25 Mất toàn bộ alen NA/NY

RB38 Mất exon 4-27 NY/NY

RB40 Mất toàn bộ alen NY/NY

NY: mẫu chƣa đƣợc kiểm tra

RB38

50

3.2. THẢO LUẬN

U nguyên bào võng mạc là một khối u ác tính nội nhãn nguyên phát xảy ra

ở trẻ em và có nguy cơ tử vong cao. Việt Nam là một trong mƣời nƣớc có tỷ lệ

mắc bệnh cao ở khu vực châu Á - Thái Bình Dƣơng [50]. Đây là nghiên cứu đầu

tiên sàng lọc toàn diện các đột biến dòng mầm trên gen RB1 ở bệnh nhân Việt

Nam mắc u nguyên bào võng mạc. Cho đến nay có hơn 1750 đột biến khác nhau

trên gen RB1 đã đƣợc báo cáo và các đột biến này nằm rải rác trên toàn bộ gen.

Tuy nhiên, các đột biến điểm đƣợc tìm thấy trong nghiên cứu này phân bố với

mật độ cao hơn ở hai vùng: một là exon 3 và vùng trình tự mã hóa hai pocket

pRb A và B (Hình 3.3). Đây là các vùng tƣơng tác và ức chế các yếu tố phiên mã

E2F làm cho protein pRb đóng vai trò quan trọng trong việc điều hòa chu kỳ tế

bào, ức chế G1/S và hạn chế tăng trƣởng [49]. Do đó, các đột biến nằm trên các

vùng điểm nóng đột biến cho thấy tần số cao hình thành khối u trong nhiều loại

ung thƣ, bao gồm u nguyên bào võng mạc [51]. Trong số 30 bệnh nhân, các đột

biến dẫn đến sự vắng mặt hoặc kết thúc chuỗi sớm bao gồm đột biến thêm hoặc

mất, đột biến vô nghĩa và đột biến dịch khung liên quan đến khả năng tiến triển

bệnh cao đƣợc tìm thấy ở 60% bệnh nhân. Ngƣợc lại, đột biến sai nghĩa và đột

biến ở vị trí cắt nối splicing có liên quan đến khả năng tiến triển bệnh thấp đƣợc

tìm thấy ở 20% bệnh nhân.

Trong nghiên cứu này, 17 mẫu mẹ và 10 mẫu bố có con dƣơng t nh với

đột biến đã đƣợc kiểm tra để xác định sự di truyền của các đột biến. Có ba đột

biến điểm và hai đột biến mất đoạn lớn đƣợc truyền t những ngƣời bố. Trong

đó có một đột biến đã đƣợc xác định ở một bệnh nhi nam 6 tháng tuổi (RB17) và

cha của bệnh nhi này có mắt phải đã đƣợc loại bỏ nhãn cầu. Đột biến điểm thứ

hai có nguồn gốc t bố đứa trẻ đƣợc xác định là một đột biến ở vị trí cắt nối

51

slipcing (c.1960G>A) đã đƣợc phát hiện ở hai chị em (RB15, UNBVM hai bên

mắt; RB24, UNBVM một bên mắt) và tuy nhiên đột biến này ở bố của hai bệnh

nhi không phát triển thành bệnh. Đột biến thể khảm duy nhất đƣợc tìm thấy ở mẹ

của bệnh nhi RB35 có mắt phải bị loại bỏ nhãn cầu trong khi con gái của cô ấy

có một đột biến ở trạng thái dị hợp tử (Hình 4.2).

Trong nghiên cứu này, có một đột biến thêm nucleotide và hai đột biến

mất nucleotide mới trong gen RB1 đã đƣợc tìm thấy, chiếm 16.67% (3/18) tất cả

các đột biến đã xác định đƣợc trong nhóm bệnh nhi nghiên cứu. Đáng chú ý, tất

cả các đột biến mới này đều nằm ở các vị trí gắn protein quan trọng của vùng

chức năng A trên pocket pRb (c.1337insTA trên exon 14, c.1449–1450delTA

trên exon 16, và c.1312delT trên exon 13; Hình 4.1). Các đột biến mới trong

nghiên cứu là các đột biến dịch khung, phần lớn các đột biến dòng mầm liên

quan đến UNVBM cả hai mắt và khả năng biểu hiện bệnh cao (> 90%) [52].

Kiểu đột biến này có tác động lớn đến kiểu hình vì nó làm mất hoàn toàn chức

năng hoạt động của một alen. Do đó, những bệnh nhân có đột biến dịch khung

rất có thể sẽ phát triển khối u ở cả hai mắt [53]. Hai bệnh nhân (RB7 và RB12)

đƣợc chẩn đoán bị UNBVM cả hai mắt. Tuy nhiên, sự thay đổi của khung đọc

mở RB1 trong trƣờng hợp bệnh nhân RB6 (nữ) đƣợc chẩn đoán chỉ biểu hiện

một khối u ở một mắt lúc 3 tháng tuổi. Do đó, mắt còn lại của bệnh nhi nên đƣợc

theo dõi chặt chẽ để phát hiện khả năng có thể hình thành khối u.

52

Hình 4.1: Hình ảnh minh họa trình tự các đột biến mới đƣợc phát hiện ở bệnh

nhân UNBVM.

A: c.1337insTA đột biến dị hợp tử ở bệnh nhân RB6. B: c.1449–1450delTA đột

biến dị hợp tử ở bệnh nhân RB7. C: c.1312delT đột biến dị hợp tử ở bệnh nhân

RB12.

53

Hình 4.2: Sơ đồ phả hệ của các gia đình mắc UNBVM.

A: Một đột biến c.1960G>A gây ra sự biến đổi tại điểm cắt nối ở bệnh nhân anh

chị em ruột RB15 và RB24. B: đột biến dị hợp tử c.1494T> G của bệnh nhân

RB35 và mẹ bệnh nhân. C: đột biến c.1939–1940delTC gây lệch khung ở bệnh

nhân RB45. Các ký hiệu màu đen và nửa màu đen tƣơng ứng với Rb hai mắt và

một mắt.

54

MLPA gần đây đã đƣợc xem nhƣ là một kỹ thuật có độ nhạy cao và đặc

hiệu để phát hiện các bất thƣờng về tế bào học và các exon đơn lẻ trong một

lƣợng nhỏ mẫu DNA của ngƣời [54]. Khoảng 15-25% trƣờng hợp UNBVM do

các đột biến thêm/mất đoạn lớn đã đƣợc báo cáo trong các nghiên cứu trƣớc

đây [11, 55]. Trong nghiên cứu này, phƣơng pháp kết hợp giải trình tự DNA và

MLPA đã nâng cao hiệu suất chẩn đoán khi phát hiện đột biến trên gen RB1

(80%) trong khi tỷ lệ phát hiện bằng cách sử dụng giải trình tự DNA chỉ là

60%. Do đó cả hai phƣơng pháp (giải trình tự DNA và MLPA) nên đƣợc sử

dụng để thực hiện x t nghiệm di truyền gen RB1 ở bệnh nhân Việt Nam mắc

UNBVM.

Trong nghiên cứu có sáu ca không tìm thấy đột biến gen RB1 trong mẫu

máu của bệnh nhân bằng phƣơng pháp giải trình tự Sanger và MLPA, chiếm

20% tổng số bệnh nhân đƣợc nghiên cứu. Trong số các ca này có bốn ca bị

UNBVM một bên mắt (66.67%) và hai ca bị UNBVM cả hai bên mắt

(33.33%). Nguyên nhân gây bệnh có thể do có bệnh nhân bị hai đột biến sinh

dƣỡng (soma) ở 2 alen của gen RB1 hoặc các yếu tố khác, chẳng hạn nhƣ gen

sinh ung thƣ MYCN (ID Gene: 4613; OMIM 164840) [56], thay đổi

phosphoryl pRB do gen PIN1 (ID Gene: 5300; OMIM 601052) [57] , nhiễm

virus[58] hoặc methyl hóa quá mức của các đảo giàu CpG trong vùng

promoter của gen RB1 [59]. Do đó, các nghiên cứu sâu hơn về sàng lọc các

yếu tố khác cần đƣợc kiểm tra để tìm ra nguyên nhân gây bệnh. Tuy nhiên,

những bệnh nhân này có thể mang đột biến khảm ở mức độ thấp hoặc đột biến

nằm sâu trong các intron, không phát hiện đƣợc với các phƣơng pháp sàng lọc

hiện tại. Trong những trƣờng hợp này, một cách tiếp cận khác để phát hiện ra

các đột biến nhƣ giải trình tự thế hệ mới là cần thiết [25].

55

CHƢƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

4.1. KẾT LUẬN

U nguyên bào võng mạc là bệnh u ác tính mắt thƣờng gặp ở trẻ em dƣới 5

tuổi, gây ra bởi đột biến trên gen RB1 (retinoblastoma 1). Khoảng 40% trẻ bị ảnh

hƣởng thuộc thể di truyền cho thấy vai trò quan trọng của xét nghiệm gen RB1

đối với việc quản lý bệnh. Nghiên cứu này đã xây dựng và hoàn thiện đƣợc các

điều kiện kỹ thuật cho ph p xác định các đột biến trên gen RB1 của 30 mẫu bệnh

nhi mắc UNBVM với việc sử dụng kết hợp 2 phƣơng pháp giải trình tự gen

nhằm phát hiện các đột biến điểm trên gen RB1 và phƣơng pháp MLPA phát

hiện thay đổi cấu trúc gen. Kết quả giải trình tự cho thấy tỷ lệ đột biến dị hợp tử

gây bệnh là 60% (18/30), trong đó có 13 trƣờng hợp bị ảnh hƣởng cả hai mắt và

5 trƣờng hợp bị ảnh hƣởng một bên mắt. Trong số 18 đột biến có 6 đột biến vô

nghĩa, 6 đột biến dịch khung, 5 đột biến ảnh hƣởng tới splicing và 1 đột biến sai

nghĩa. Luận văn đã sử dụng phƣơng pháp MLPA để phát hiện thay đổi cấu trúc

gen và phát hiện 6 bệnh nhân bị mất toàn bộ hoặc một phần của gen ở trạng thái

dị hợp tử và tất các các bệnh nhân bị UNBVM cả hai bên mắt. Với những kết

quả đạt đƣợc, nghiên cứu này đã cung cấp dữ liệu của các đột biến dòng mầm

trong gen RB1 ở bệnh nhân UNBVM ph a Bắc Việt Nam. Sàng lọc đột biến ở

gen RB1 có vai trò quan trọng trong việc xác định nguyên nhân di truyền của

bệnh UNBVM, làm cơ sở cho công tác chẩn đoán, chữa trị và tƣ vấn di truyền

cho các bệnh nhân và gia đình ngƣời bệnh UNBVM.

56

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tiếng Việt

1 Nguyễn Công kiệt, Nguyễn Tr Dũng, 2005, Đặc điểm di truyền trong u nguyên

bào võng mạc, ạp í Y ọ àn p ố Hồ C í M n , (9), pp. 99-103.

2. Nguyễn Hải Hà, Đỗ Mạnh Hƣng, Lê Thúy Quỳnh, Nguyễn Thùy Dƣơng,

Nguyễn Đăng Tôn, 2014, Phát hiện đột biến gen RB1 ở trẻ em u nguyên bào

võng mạc, ạp í ôn n ệ s n ọ , (1), pp. 23-29.

3. Vũ Phƣơng Nhung, Lê Thúy Quỳnh, Nguyễn Đăng Tôn, Nguyễn Thị Xuân,

Nguyễn Hải Hà, 2016, Xây dựng phƣơng pháp sàng lọc gen RB1 thông qua

mRNA, ạp í ôn n ệ s n ọ 14(2).

4. Vu Phuong Nhung, Nguyễn Thị Thanh Hoa, Ma Thi Huyen Thuong, Tran Thi

Bich Ngoc, Nguyen Dang Ton, Nguyen Thuy Duong, Nong Van Hai, Nguyen

Hai Ha, 2017, Study on application of multiplex ligation-dependent probe

amplification (MLPA) in molecular diagnosis of retinoblastoma, Journal of

Biotechnology, 4(15), p. 625-631.

Tiếng Anh

5. F, Vogel, 1979, Genetics of retinoblastoma, Hum Genet, (52), pp. 1-54.

6. T, Kivela, 2009, The epidemiological challenge of the most frequent eye cancer:

retinoblastoma, an issue of birth and death, Br J Ophthalmol (93), pp. 1129-31.

7. Dimaras H, Kimani K, Dimba EA, Gronsdahl P, White A, Chan HS, Gallie BL.

, 2012, Retinoblastoma, Lancet (37), pp. 1436-46.

8. Li WL, Buckley J, Sanchez-Lara PA, Maglinte DT, Viduetsky L, Tatarinova

TV, Aparicio JG, Kim JW, Au M, Ostrow D, Lee TC, O'Gorman M, Judkins A,

Cobrinik D, Triche TJ, 2016, A Rapid and Sensitive Next-Generation

Sequencing Method to Detect RB1 Mutations Improves Care for

Retinoblastoma Patients and Their Families, J Mol Diagn 4(18), pp. 480-93.

9. T, Kivelä, 2009, 200 years of success initiated by James Wardrop’s 1809

monograph on retinoblastoma, Actaophthalmologic, (8), pp. 810–2.

57

10. Gao YJ, Qian J, Yue H, Yuan YF, Xue K, Yao YQ, 2011, Clinical

characteristics and treatment outcome of children with intraocular

retinoblastoma: a report from a Chinese cooperative group, Pediatr Blood

cancer (57), pp. 1113-6.

11. Ming-yan He, Yu An, Yi-jinGao, Xiao-wen Qian, Gang Li, Jiang Qian, 2014,

Screening of RB1 gene mutation in Chinese patients with retinoblastoma and

preliminary exploration of genotype-phenotype correlations, Mol Vis (20), pp.

545-552.

12. Abramson DH, Beaverson K, Sangani P, Vora RA, Lee TC, Hochberg HM,

Kirszrot J, Ranjithan M, 2003, Screening for retinoblastoma: presenting signs as

prognosticators of patient and ocular survival, (112), pp. 1248–55.

13. Robson ME, Storm CD, Weitzel J, Wollins DS, Offit K, 2010, American

Society of Clinical Oncology policy statement update: genetic and genomic

testing for cancer susceptibility, J Clin Oncol 5(28), pp. 893-901.

14. Broaddus E, Topham A, Singh AD, 2009, Survival with retinoblastoma in the

USA: 1975–2004, Br J Ophthalmol, (93), pp. 24–7.

15. MacCarthy A, Birch JM, Draper GJ, Hungerford JL, Kingston JE, Kroll ME,

Stiller CA, Vincent TJ, Murphy MF, 2009, Retinoblastoma: treatment and

survival in Great Britain 1963 to 2002, Br J Ophthalmol, (93), pp. 38–9.

16. MacCarthy A, Draper GJ, Steliarova-Foucher E, Kingston JE, 2006,

Retinoblastoma incidence and survival in European children (1978–1997).

Report from the Automated Childhood Cancer Information System project, Eur

J Cancer, (42), pp. 2092–102.

17. DH, Abramson, 2005, Retinoblastoma in the 20th century: past success and

future challenges the Weisenfeld lecture, Invest Ophthalmol & Vis Sci, (46), pp.

2684–91.

18. Ha Hai Nguyen, Hoa Thi Thanh Nguyen, Nhung Phuong Vu, Quynh Thuy Le,

Chau Minh Pham, Thuong Thi Huyen Ma, Hung Manh Do, Hang Le Bich

Pham, Ton Dang Nguyen, Hien Thi Thu Le, Hai Van Nong, 2018, Mutational

58

screening of germline RB1 gene in Vietnamese patients with retinoblastoma

reveals three novel mutations, Molecular vision, (24), pp. 231-238.

19. Nguyen Cong Kiet, Le Thai Khuong, Do Duc Minh, Nguyen The Vinh, Nguyen

Huynh Minh Quan, Phan Thi Xinh, Nguyen Ngoc Chau Trang, Nguyen Thanh

Luan, Nguyen Minh Khai, Hoang Anh Vu, 2019, Spectrum of mutations in the

RB1 gene in Vietnamese patients with retinoblastoma, Molecular Vision, (25),

pp. 215-221.

20. Dietmar R Lohmann, MD and Brenda L Gallie, MD, 2015, Retinoblastoma.,

GenReviews.

21. Balmer A1, Zografos L, Munier F, 2006, Diagnosis and current management of

retinoblastoma, Oncogene, (38), pp. 5341-9.

22. Singh AD, Shields CL, Shields JA, 2000, Prognosis factors in retinoblastoma, .

Journal of Pediatric Ophthalmology and Strabismus, (3), pp. 134-141.

23. Moll AC, Hoekstra OS, Imhof SM, Comans EF, Schouten-van Meeteren AY,

van der Valk P, Boers M, 2004, Fluorine-18 fluorodeoxyglucose positron

emission tomography (PET) to detect vital retinoblastoma in the eye:

preliminary experience, Ophthalmic Genet, (25), pp. 31–5.

24. Richter S, Vandezande K, Chen N, Zhang K, Sutherland J, Anderson J, Han L,

Panton R, Branco P, Gallie, 2003, Sensitive and efficient detection of RB1 gen

mutations enhances care for families with retinoblastoma, Am J Hum Gent, (2),

pp. 253-69.

25. Reese AB, Ellsworth RM, 1963, The evaluation and current concept of

retinoblastoma therapy, Trans Am Acad Ophthalmol Otolaryngol. 67, pp. 164-

72.

26. Shields CL, Mashayekhi A, Au AK, Czyz C, Leahey A, Meadows AT, Shields

JA., 2006, The International Classification of Retinoblastoma predicts

chemoreduction success, Ophthalmology. 113, pp. 2276–80.

27. A, Linn Murphree, 2005, Intraocular retinoblastoma: the case for a new group

classification., Ophthalmol Clin North Am. 18(1), pp. 41-53.

59

28. Al-Nawaiseh I1, Jammal HM, Khader YS, Jaradat I, Barham R, 2014,

Retinoblastoma in Jordan, 2003-2013: ocular survival and associated factors,

Ophthalmic Epidemiol. 6, pp. 406-11.

29. Chantada G, Fandiño A, Dávila MT, Manzitti J, Raslawski E, Casak S,

Schvartzman E, 2004, Results of a prospective study for the treatment of

retinoblastoma, Cancer, (4), pp. 834-42.

30. Honavar SG, Manjandavida FP, Reddy VA, 2017, Orbital retinoblastoma: An

update. , Indian J Ophthalmol, pp. 65:435.

31. Chawla B, Hasan F, Seth R, Pathy S, Pattebahadur R, Sharma S, Upadhyaya A,

Azad R., 2016, Multimodal therapy for stage III retinoblastoma (International

Retinoblastoma Staging System): A prospective comparative study,

Ophthalmology, (123), pp. 1933–9.

32. Chawla B, Hasan F, Azad R, Seth R, Upadhyay AD, Pathy S, Pandey RM,

2015, Clinical presentation and survival of retinoblastoma in Indian children, Br

J Ophthalmol, (100), pp. 172–8.

33. Skalet AH, Gombos DS, Gallie BL, Kim JW, Shields CL, Marr BP, Plon SE,

Chévez-Barrios P, 2018, Screening children at risk for retinoblastoma:

consensus report from the American Association of Ophthalmic Oncologists and

Pathologists, Ophthalmology, (125), pp. 453-8.

34. AlAli, A., et al., 2018, Retinoblastoma for Pediatric Ophthalmologists, Asia Pac

J Ophthalmol (Phila).

35. Lee WH, Bookstein R, Hong F, Young LJ, Shew JY, Lee EY, 1987, Human

retinoblastoma susceptibility gen: cloning, identification, and sequence, Science,

(4794), pp. 1394-9.

36. Jr, Knudson AG, 1971, Mutation and cancer: statistical study of retinoblastoma,

Proc Natl Acad Sci U S A, (4), pp. 820-3.

37. Ali MJ1, Parsam VL, Honavar SG, Kannabiran C, Vemuganti GK, Reddy VA,

2010, RB1 gen mutations in retinoblastoma and its clinical correlation, Saudi J

Ophthalmol, (4), pp. 119-23.

60

38. Wiggs J, Nordenskjöld M, Yandell D, Rapaport J, Grondin V, Janson M,

Werelius B, Petersen R, Craft A, Riedel K, 1988, Prediction of the risk of

hereditary retinoblastoma, using DNA polymorphisms within the retinoblastoma

gen, N Engl J Med, (3), pp. 151-7.

39. Cavenee WK, Dryja TP, Phillips RA, Benedict WF, Godbout R, Gallie BL,

Murphree AL, Strong LC, White RL, 1983, Expression of recessive alens by

chromosomal mechanisms in retinoblastoma, Nature, (305), pp. 779-84.

40. http://23pairsofchromosomes.com/search/RETINOBLASTOMA. The Molecular

and Cell Biology of Cancer

41. Sage, Deborah L.Burkhart & Julien, 2008, Cellular mechanisms of tumour

suppression by the retinoblastoma gen, Nature Reviews Cancer, (8), pp. 671-

682.

42. JW, Harbour, 1998, Overview of RB gene mutations in patients with

retinoblastoma. Implications for clinical genetic screening, Ophthalmology

8(105), pp. 1442-7.

43. Valverde JR, Alonso J, Palacios I, Pestana A, 2005, RB1 gene mutation up-date,

a meta-analysis based on 932 reported mutations available in a searchable

database., BMC Genet (6), pp. 53.

44. He MY, An Y, Gao YJ, Qian XW, Li G, Qian J, 2014, Screening of RB1 gene

mutations in Chinese patients with retinoblastoma and preliminary exploration

of genotype-phenotype correlations, Mol Vis, (20), pp. 545-52.

45. Mohd Khalid MK, Yakob Y, Md Yasin R, Wee Teik K, Siew CG, Rahmat J,

Ramasamy S, Alagaratnam J, 2015, Spectrum of germ-line RB1 gene mutations

in Malaysian patients with retinoblastoma, Mol Vis (21), pp. 1185-90.

46. Ahani A, Akbari MT, Saliminejad K, Behnam B, Akhondi MM, Vosoogh P,

Ghassemi F, Naseripour M, Bahoush G, Khorshid HR, 2013, Screening for

large rearrangements of the RB1 gene in Iranian patients with retinoblastoma

using multiplex ligation-dependent probe amplification, Mol Vis (19), pp. 454-

62.

61

47. Barbosa RH, Aguiar FC, Silva MF, Costa RA, Vargas FR, Lucena E, Carvalho

de Souza M, de Almeida LM, Bittar C, Ashton Prolla P and others. 2013, 2013,

Screening of RB1 alterations in Brazilian patients with retinoblastoma and

relatives with retinoma: phenotypic and genotypic associations., Invest

Ophthalmol Vis Sci 5(54), pp. 3184-94.

48. Parma D, Ferrer M, Luce L, Giliberto F, Szijan I, 2017, RB1 gene mutations in

Argentine retinoblastoma patients. Implications for genetic counseling, PLoS

One 12(12).

49. RA, Weinberg, 1995, The retinoblastoma protein and cell cycle control., Cell

81, pp. 323-30.

50. Usmanov RH, Kivelä T, 2014, Predicted Trends in the Incidence of

Retinoblastoma in the Asia-Pacific Region, Asia Pac J Ophthalmol (Phila).

3(151-7).

51. NJ., Dyson, 2016, RB1: a prototype tumor suppressor and an enigma., Genes

Dev. 30, pp. 1492-502.

52. Lohmann DR, Gallie BL. , 2004, Retinoblastoma: Revisiting the model

prototype of inherited cancer., Am J Med Genet C Semin Med Genet. 129C, pp.

23-8.

53. De Falco G, Giordano A. , 2006, pRb2/p130: a new candidate for

retinoblastoma tumor formation., Oncogene 25, pp. 5333.

54. Schouten JP, McElgunn CJ, Waaijer R, Zwijnenburg D, Diepvens F, Pals G. ,

2002, Relative quantification of 40 nucleic acid sequences by multiplex ligation-

dependent probe amplification, Nucleic Acids Res. 20, pp. e57-57.

55. Ahani A, Behnam B, Khorram Khorshid HR, Akbari MT. , 2011, RB1 Gene

mutations in Iranian patients with retinoblastoma: report of four novel

mutations., Cancer Genet. 204, pp. 316- 22.

56. Rushlow DE, Mol BM, Kennett JY, Yee S, Pajovic S, Théri- ault BL, Prigoda-

Lee NL, Spencer C, Dimaras H, Corson TW, Pang R, Massey C, Godbout R,

Jiang Z, Zacksenhaus E, Paton K, Moll AC, Houdayer C, Raizis A, Halliday W,

62

Lam WL, Boutros PC, Lohmann D, Dorsman JC, Gallie BL. , 2013; ,

Characterisation of retinoblastomas without <em>RB1</em> mutations:

genomic, gene expression, and clinical studies, Lancet Oncol 14, pp. 327-34. .

57. Rizzolio F, Lucchetti C, Caligiuri I, Marchesi I, Caputo M, Klein-Szanto AJ,

Bagella L, Castronovo M, Giordano A. , 2012, Retinoblastoma tumor-

suppressor protein phosphorylation and inactivation depend on direct interaction

with Pin1, Cell Death Differ. 19, pp. 1152-61.

58. Palazzi MA, Yunes JA, Cardinalli IA, Stangenhaus GP, Bran- dalise SR,

Ferreira SA, Sobrinho JSP, Villa LL. , 2003, Detection of oncogenic human

papillomavirus in sporadic retinoblastoma., Acta Ophthalmol Scand. 81, pp.

396-8.

59. M, Esteller, 2002, CpG island hypermethylation and tumor suppressor genes: a

booming present, a brighter future, Oncogene 21, pp. 5427.