LAPORAN PRAKTIKUM BIOKIMIA IIUJI AKTIVITAS AMILASESenin, 20 April 2015Kelompok ISenin, Pukul 13.00 16.00 WIB

Oleh:Hasna Nur Syahidah 260110130001Marita Isti Wulandari260110130002Anisa Rosdiana260110130003Intan Merita260110130004Nujaimah R. Sholeh260110130005Oryza Sativa S.260110130006

LABORATORIUM BIOKIMIAFAKULTAS FARMASIUNIVERSITAS PADJADJARAN2015Uji Aktivitas Amilase dari Buah Jeruk (Citrus sp)

Hasna Nur Syahidah, Marita Isti Wulandari, Anisa Rosdiana,Intan Merita, Nujaimah R. Sholeh, Oryza Sativa S.Biokimia II, Fakultas Farmasi Universitas Padjadjaran

Abstrak : Percobaan yang dilakukan yaitu menguji aktivitas amilase yang ada pada buah jeruk. Amilase (alfa, beta, glukoamilase) merupakan enzim yang penting dalam bidang pangan dan bioteknologi. Amilase mengacu pada sekelompok enzim katalis yang berfungsi untuk menghidrolisis gula dan pati. Amilase mencerna karbohidrat (polisakarida) menjadi unit-unit disakarida yang lebih kecil dan mengubahnya menjadi monosakarida seperti glukosa. Adapun tujuan dari percobaan adalah untuk menentukan aktivutas amilase dari fraksi protein. Prinsip ynag mendasari percobaan ini adalah metode Caraway-Somogyi, absorbansi, dan hidrolisis gula. Langkah kerja yang dilakukan dalam menentukan aktivitas amilase pada fraksi protein yaitu membuat kurva baku dengan larutan pati dengan variasi suhu 37o dan 57o serta variasi pH 3,7 daN pH 5,6. Selanjutnya diukur absorbansinya spektrofotometer dari masing-masing variasi suhu dan pH. Hasil yang diperoleh pada sampel fraksi 1 dengan ph 3,5 memberikan hasil absorbansi 1,742 sedangkan ph 5,6 memberikan hasil 1,6. Sedangkan pada perbedaan suhu dengan menggunakan sampel fraksi 1, pada suhu 370 C menghasilkan absorbasi 0,932 sedangkan pada suhu 570 C memberikan hasil absorbansi 1,148.Kata kunci : Amilase, Metode Caraway-Somogyi, Absorbansi

Abstract: Experiments were performed which tested the activity of amylase that exist in citrus fruits. Amylase (alpha, beta, glucoamylase) is an enzyme that is important in the field of food and biotechnology. Amylase enzyme catalyst refers to a group that works to hydrolyze sugars and starches. Amylase digests carbohydrates (polysaccharides) into units smaller disaccharide and turn it into monosaccharides such as glucose. The purpose of the trial is to determine aktivutas amylase protein fraction. Ynag principle underlying this trial is Caraway-Somogyi method, absorbance, and sugar hydrolysis. Step work done in determining the amylase activity in the protein fractions that make standard curve with starch solution with a temperature variation of 37o and 57 as well as variations in pH 3.7 and pH 5.6. Furthermore spectrophotometer measured absorbance of each variation of temperature and pH. The results obtained on the sample fractions 1 to pH 3.5 gives the results of the absorbance of 1.742 while the ph of 5.6 1.6 results. While the temperature difference by using the sample fractions 1, at a temperature of 370 C to produce absorbasi 0.932 while at a temperature of 570 C provide the results of absorbance 1.148.Keywords: Amylase, Caraway-Somogyi method, Absorbance

PENDAHULUANAmilase (alfa, beta, glukoamilase) merupakan enzim yang penting dalam bidang pangan dan bioteknologi. Amilase mengacu pada sekelompok enzim katalis yang berfungsi untuk menghidrolisis gula dan pati. Amilase mencerna karbohidrat (polisakarida) menjadi unit-unit disakarida yang lebih kecil dan mengubahnya menjadi monosakarida seperti glukosa. Amilase dapat diperoleh dari berbagai sumber seperti tanaman, binatang dan mikroorganisme. Enzim pada umumnya diproduksi oleh mikroorganisme melalui proses fermentasi.Amilase yang berasal dari mikroorganisme banyak digunakan dalam industri, hal ini dikarenakan mikroorganisme periode pertumbuhanya pendek. Amilase pertama kali yang diproduksi adalah amilase yang berasal dari fungi pada tahun 1894 (Oliveira,2004).Secara umum amilase dibedakan menjadi tiga berdasarkan hasil pemecahan dan letak ikatan yang dipecah, yaitu:1. Enzim alfa-amilase, merupakan endoenzim yang memotong ikatan alfa-1,4 amilosa dan amilopektin dengan cepat pada larutan pati kental yang telah mengalami gelatinisasi. Proses ini juga dikenal dengan nama proses likuifikasi pati. Produk akhir yang dihasilkan dari aktivitasnya adalah dekstrin beserta sejumlah kecil glukosa dan maltosa. Alfa-amilase akan menghidrolisis ikatan alfa-1-4 glikosida pada polisakarida dengan hasil degradasi secara acak di bagian tengah atau bagian dalam molekul.2. Enzim beta-amilase atau disebut juga alfa-l,4-glukanmaltohidrolas E.C. 3.2.1.2. bekerja pada ikatan alfa-1,4-glikosida dengan menginversi konfigurasi posisi atom C(l) atau C nomor 1 molekul glukosa dari alfa menjadi beta. Enzim ini memutus ikatan amilosa maupun amilopektin dari luar molekul dan menghasilkan unit-unit maltosa dari ujung non-pereduksi pada rantai polisakarida.Bila tiba pada ikatan alfa-1,6 glikosida aktivitas enzim ini akan berhenti.3. Glukoamilase dikenal dengan nama lain alfa-1,4- glukan glukohidro-lase atau EC 3.2.1.3. Enzim ini menghidrolisis ikatan glukosida alfa-1,4, tetapi hasilnya beta-glukosa yang mempunyai konfigurasi berlawanan dengan hasil hidrolisis oleh enzim alfa-amilase.Selain itu, enzim ini dapat pula menghidrolisis ikatan glikosida alfa-1,6 dan alfa-1,3 tetapi dengan laju yang lebih lambat dibandingkan dengan hidrolisis ikatan glikosida a-1,4 (Biogen, 2008).Aktivitas alfa-amilase secara umum ditentukan dengan mengukur hasil degradasi pati, biasanya dari penurunan kadar pati yang larut atau dari kadar dekstrinnya dengan menggunakan substrat jenuh. Hilangnya substrat dapat diukur dengan pengurangan derajat pewarnaan iodium terhadap substrat. Pati yang mengandung amilosa bereaksi dengan iodium menghasilkan warna biru, sedangkan dekstrin bereaksi dengan iodium berwana coklat. Keaktifan alfa-amilase juga dapat dinyatakan dengan pengukuran viskositas dan jumlah produksi yang terbentuk. Laju hidrolisis akan meningkat bila polimerisasi menurun dan laju hidrolisis akan lebih cepat pada rantai lurus (Winarno, 1986).Metode Caraway-Somogyi iodin/kalium iodida dalam Afiukwa, et. al (2009), Tahap pertama metode ini adalah gelatinisasi atau likuifikasi pati sehingga menghasilkan larutan starch yang baku. Larutan ini kemudian digunakan sebagai substrat dalam mereaksikan dengan sampel yang mengandung enzim amilase. Enzim amilase yang terdapat pada sampel akan bereaksi dan menghidrolisis pati menjadi monosakarida dalam waktu tertentu dan suhu optimum 37oC. Reaksi ini kemudian dhentikan dengan menambahkan larutan HCl 10%. Setelah itu ditambahkan indikator iodin-kalium iodida. Menurut Teodoro dan Meire (2000), larutan indikator dibuat dengan 0,05% iodin dalam 0. 5% KI. Sisa pati yang tidak terhidrolisis akan bereaksi dengan indikator sehingga menghasilkan warna tertentu. Absorbansi sampel kemudian diukur pada panjang gelombang 620 nm. Proses tersebut merupakan pengukuran pada jam ke-0. Langkah pengujian aktivitas enzim diulang (dari proses penambahan HCl 10%) setiap 15 menit selama 60 menit. Jumlah pati yang terhidrolisis dalam satu satuan waktu kemudian diukur dengan kurva standar pati (substrat) antara konsentrasi dengan absorbansi.Glikogen merupakan sumber polisakarida utama pada sel hewan,seperti pati pada sel tumbuhan. Seperti amilopektin, glikogen merupakan polisakarida bercabanag dari D-glukosa dalam ikatan(14), tetapi pada glikogen, lebih banyak terdapat percabangan dan strukturnya lebihkompak pada ikatan percabangan (16). Glikogen terutama banyak terdapat dalam hati, dapat mencapai sampai 7% berat basah; glikogen jugaterdapat pada otot kerangka. Di dalam sel hati, glikogen ditemukansebagai granula besar, yang merupakan kumpulan dari granula kecil.Glikogen dihidrolisa di dalam saluran pencernaan oleh amylase, yangdisekresikan ke dalam saluran pencernaan. Cairan air liur dan pancreasmengandung -amilase, yang meghidrolisa ikatan (14) pada cabang sebelah luar glikogen dan amilopektin, menghasilkan D-glukosa, sejumlahkecil maltose, dan suatu inti yang tahan hidrolisa disebut limit dekstrin.Dekstrin membentuk dasar dari pasta perekat. Limit dekstrin tidak dihidrolisalebih jauh oleh -amilase, yang tidak dapat memecahkan ikatan(16) pada titik -titik cabang. Untuk menguraikan ikatan ini, diperlukansuatu enzim pemecah cabang (16) -glukosidase. Enzim ini dapatmenghidrolisa ikatan cabang jadi membuka pengikat cabang berikatan(14) lain terhadap aktivitas -amilase. Aktivitas gabungan amilasedan (16) -glukosidase, dapat menguraikan glikogen dan amilopektinsecara sempurna menjadi glukosadansejumlah kecil maltose. Enzim amilase pada malt (tunas jelai) berbeda dari -amilase, karena -amilasemenghidrolisaikatan (14) yang terletak pasa setiap dua residu, sehingga menghasilkan terutama maltose dan sedikit glukosa(Lehninger, 1982).Enzim berperan sebagai katalisator. Reaksi biologik biasanya terjadi sangat lambat apabila tidak ada katalisator. Katalisator adalah suatu zat yang meningkatkan kecepatan reaksi yang terjadi tanpa iasendiri berubah. Katalisator bekerja dengan mengurangi energi barier antara reaktan dan produk, karena itu membuat reaktan lebih mudahmencapai keadaan transisi. Katalisator tidak mengubah perbedaan energy bebas antara reaktan dan produk oleh karena itu tidak mempengaruhi hasilreaksi. Enzim bekerja sangat spesifik pada reaksi yang dikatalis dan padasenyawa (substrat) dimana mereka bekerja. Mekanisme pengaturanaktivitas enzimatik ada empat macam antara lain pengaturan alosterik,modifikasi kovalen, proteolisis terbatas, dan pengaturan pembentukanturnover enzim (Colby, 1988).Enzim amylase dapat memecah ikatan-ikatan amilum hinggaterbentuk maltose. Ada tiga macam enzim amylase, yaitu -amilase, -amilase dan -amilase. -amilase terdapat pada saliva (ludah) dan pancreas. enzim ini memecah ikatan 1-4 yang terdapat pada amilum dandisebut endoamilase sebab enzim ini memecah bagianbagian dalam sodium nitrat jugamerupakan sumber nitrogen yang baik bagi amilase.Kestabilan amilase dan protease berada pada suhu lebih dari 50, pH 4.95,dan pada 53,4, ph3.87 namun keduanya sangat sensitif pada suhu 70 ataulebih (Montgomery, 1993).METODEAlat: Tabung reaksi, Beaker glass, Batang pengaduk, Gelas ukur, Pipet tetes.Bahan: Pati larut, Kalium dihidrogen fosfat, Dikalium hydrogen fosfat, HCl, Iodin, Kalium iodide.a. Gelatinisasi pati larutPertama ditambahkan 40 mL pati larut 1% pada 50 mL aquades mendidih dalam beaker glass, sambil diaduk, Genapkan hingga 100 mL dengan air kemudian larutan pati tergelatinisasi dibiarkan dingin pada suhu kamar (konsentrasi pati 4 mg/mL) setelah itu diambil 1 mL larutan pati tergelatinisasi, encerkan hingga 100 mL dengan aquades, Larutan ini digunakan sebagai larutanstok (substrat) untuk pengujian (konsentrasi 0,04 mg/mL = 40 g/mL). b. Pembuatan kurva standar pati (duplo) Tabung reaksi diisi 2,5 mL larutan stok, 1,75 mL dapar fosfat 0,1 M pH 5,6 dan 0,75 mL aquades. Ambil campuran reaksi (variasi volume, lihat tabel) dan pindahkan ke tabung reaksi lain berisi 1,5 mL HCl 10% untuk menghentikan reaksi lalu tambahkan 1,5 mL indicator (larutan iodin-kalium iodida) kemudian Absorbansi dibaca pada 620 nm, Buat blanko. Blanko dibuat dengan komposisi yang sama dengan campuran reaksi kecuali tanpa penambahan indikator. c. Uji aktivitas amylase pada variasi suhu (duplo) Tabung reaksi diisi 2,5 mL larutan stok, 1,75 mL daparfosfat 0,1 M pH 5,6 dan 0,75 mL ekstrak amylase kemudian campuran reaksi diinkubasi pada 37o dan 57C selama 30 menit lalu ambil 1 mL campuran reaksi dan pindahkan ke tabung reaksi lain berisi 3 mL HCl 10% untuk menghentikan reaksi lalu tambahkan 3 mL indicator (larutan iodin-kalium iodida) absorbansi dibaca pada 620 nm, jangan lupa konsentrasi pati terhidrolisis dikalikan dengan factor pengenceran, Buat blanko jumlah pati terhidrolisis per satuan waktu ditentukan dari kurva standar konsentrasi pati (substrat) terhadap absorbansi. d. Uji aktivitas amylase pada variasi pH (duplo) Tabung reaksi diisi 2,5 mL larutan stok, 1,75 mL dapar pH 3,5 dan pH 5,6. Kemudian 0,75 mL ekstrak amylase lalu campuran reaksi diinkubasi pada 37 C selama 30 menit kemudian ambil 1 mL campuran reaksi dan pindahkan ketabungr eaksi lain berisi 3 mL HCl 10% untuk menghentikan reaksi setelah itu tambahkan 3 mL indikator (larutan iodin-kalium iodida), absorbansi dibaca pada 620 nm, jangan lupa konsentras ipati terhidrolisis dikalikan dengan factor pengenceran. Buat blanko jumlah pati terhidrolisis per satuan waktu ditentukan dari kurva standar konsentrasi pati (substrat) terhadap absorbansi.HASIL PENGAMATANPada pembuatan gelatinisasi pati, pati larut sebanyak 40ml dilarutkan dalam 50ml aquadest mendidih patimenjadi larut lalu ditambahkan sampai tanda batas 100ml larutan menjadi lebih encer dinginkan lalu diencerkan lagi dengan cara diambil 1ml larutan lalu digenapkan hingga 100 ml larutan menjadi lebih bening maka konsentrasi stok menjadi 0,04 mg/ml.Kemudian dibuat kurva baku yaitu larutan stok diambil sebanyak 2,5ml, ditambah dapar fosfat 0,1 M pH 5,6 dan aquadest 0,75 ml didapat campuran larutan yang akan bereaksi tambahkan 3 ml HCL10%, lalu tambahkan indicator iodin/ kalium iodine warna menjadi coklat, dibaca absorbansi dengan detector spektro uv maka didapat nilai absorbansinya kembudian buat kuva baku dan dibuat pula blanko tanpa penambahan indikator. Lalu dilakukan pengujian aktifitas amylase pada variasi suhu, tabung reaksi diisi stok dengan perbandingan 2,5 ml lalu ditambah dapar fosfat 0,1 M pH 5,6 dan ekstrak amylase 0,75 ml didapatkan campuran larutan yang telah ditambah ekstrak dari fraksi yang telah didapat, kemudian di inkubasi dengan suhu yang berbeda yaitu 370 dan 570 larutan menjadi hangat, lalu diambil 0,2ml lalu stok ditambah 0,6 ml HCL 10% dan 0,6 ml indicator iodine larutan menjadi berwarna coklat kemudian diukur absorbansinya dengan detector spektro uv pada panjang gelombang 620 nm, hasilnya didapat nilai absorbansi 370 yaitu 0,932 dan 570 .yaitu 1,14 dibuat blanko dan jumlah pati terhidrolisis persatuan waktu ditentukan dari kurva standar konsentrasi pati terhadap absorbansinya.Melakukan pengujian aktifitas amylase pada variasi pH dilakukan seperti prosedur pertama tapi larutan dapar menjadi pH 3,5 untuk tabung reaksi 1 dan pH 5,6 untuk tabung reaksi kedua diinkubasi dalam suhu 370 selama 30 menit lalu diambil 0,2 ml lalu stok ditambah 0,6 ml HCL 10% dan 0,6 ml indicator iodine larutan menjadi berwarna coklat kemudian diukur absorbansinya dengan detector spektro uv pada panjang gelombang 620 nm hasilnya didapat nilai absorbansi pH 3,5 yaitu 1,742 dan 5,6 .yaitu 1,6 dibuat blanko dan didapat nilai absorbansinya 0,383 dan jumlah pati terhidrolisis persatuan waktu ditentukan dari kurva standar konsentrasi pati terhadap absorbansinya.PEMBAHASANPada praktikum kali ini yaitu berjudul uji aktivitas amilase, yang bertujuan untuk menentukan aktivtas amilase dari fraksi protein yang telah didapat. Fraksi protein yang akan diuji yaitu fraksi protein dari buah jeruk. Prinsip percobaan kali ini adalah metode caraway-somogyi, absorbansi, dan hidrolisis gula. Enzim amilase bekerja dengan cara memutuskan ikatan glikosidik ( 14) di antara satuan glukosa yang membentuk polimer, seperti pati. Pati terdiri atas amilosa dan amilopektin, yang tersususn atas satuan glukosa rantai lurus dan rantai bercabang. Hasil hidrolisis pati oleh amilase adalah glukosa. Glukosa yang nantinya akan diukur absorbansinya.Hal yang pertama dilakukan yaitu membuat pereaksi, berikut penjelasan pembuatannya :1. Pembuatan larutan pati larut 1 % yang akan digunakan sebagai pengukuran dan perhitungan kurva standar pati. Cara membuatannya yaitu dengan melarutkan 1 gram pati dengan aquaedst dalam labu ukur sebanyak 100 ml.2. Pembuatan larutan HCL 10 % yang akan digunakan sebagai penghenti reaksi dari kerja enzim amilase. Cara membuatnya dengan mengencerkan 10 ml HCL pekat kedalam 100 ml aquadest.3. Pembuatan larutan iodin-kalium iodida (iodin lugol) yang akan digunakan sebagai indikator atas adanya pati dalam senyawa organik, dengan mana larutan ini bereaksi dengan mengubah warna biru-gelap/hitam. Larutan unsur iodium seperti Lugol akan mewarnai pati/kanji karena interaksi iodium dengan struktur lingkar polisakarida. Pati termasuk pati tanaman amilosa dan amilopektin, serta glikogen pada sel hewan. Larutan Lugol tidak akan mendeteksi gula-gula sederhana seperti glukosa atau fruktosa. Pada kondisi patologis, depositamiloid(yaitu, deposit yang berwarna seperti pati, tetapi tidak) dapat begitu berlimpah bahwa organ yang terkena dampak juga akan ternoda terlalu positif untuk reaksi Lugol untuk pati. Cara membuatnya yaitu Larutan 5% terdiri atas iodin 5 % dan KI 10% dicampur dalam aquades dan memiliki kandungan iodin total 126,5 mg/mL.4. Pembuatan larutan bufer fosfat 0,1 M pH 3,5 dan pH 5,6. Larutan bufer ini akan digunakan untuk menguji aktivitas enzim yang dipengaruhi oleh pH. Cara membuat bufer fosfat pH 3,5 yaitu melarutkan 13,6 g kalium dihidrogen fosfat dalam 900 mL aquades. Cek pH dan atur pH hingga mencapai pH 3,5 dengan asam fosfat, mengencerkan hingga 1000 mL dengan aquades. Untuk bufer fosfat pH 5,6 yaitu dengan melarutkan 0,908 kalium dihidrogen fosfat dengan aduades dalam labu ukur 100 mL dan genapkan hingga tanda batas (larutan I). Larutkan 1,161 g dikalium hidrogen fosfat dengan aduades dalam labu ukur 100 mL dan genapkan hinggatanda batas (larutan II). Campurkan 94,4 mL larutan I dan 5,6 mL larutan II. Cek pH dan atur pH hingga dicapai pH 5,6.Tahap selanjutnya yaitu melalukan gelatinisasi pati larut, dengan penambahan 40m ml pati larut 1 % pada 50 ml aquadest mendidihdalam beaket glass, tambahkan aquadest hingga 100 ml. Larutan pati tergelatinisasi didiamkan hingga dingin pada suhu kamar (konsentrasi pati 4 mg/ml). Kemuadian 1 ml larutan pati tergelatinisasi diencerkan hingga 100 ml dengan aquadest. Larutan ini digunakan sebagai larutan stok (substart) untuk pengujian). Pada proses gelatinisasi, ikatan hidrogen yang mengatur integritas struktur granula pati akan melemah. Terdapatnya gugus hidroksil yang bebas akan menyerap molekul air sehingga terjadi pembengkakan granula pati. Ketika granula mengembang, amilosa akan keluar dari granula. Granula hanya mengandung amilopektin,rusak, dan terperangkap dalam matriks amilosa membentuk gel. Selanjutnya yaitu meakukan pembuatan kurva standar pati. Kurva standar merupakan standar dari sampel tertentu yang dapat digunakan sebagai pedoman ataupun acuan untuk sampel tersebut pada percobaan. Pembuatan kurva standar bertujuan untuk mengetahui hubungan antara konsentrasi larutan dengan nilai absorbansinya sehingga konsentrasi sampel dapat diketahui. Tahap pembuatannya itu dengan menyiapkan tabung reaksi berisi 2,5 ml larutan stok, 1,75 ml dapar fosfat 0,1 M pH 5,6 dan 0,75 ml aquadest. Lakukan variasi volume antara campuran reaksi dan volume aquadest dari 0 : 1 sampai 1 : 0. Dan pindahkan kedalam tabung reaksi yang berisi 1,5 ml HCL 10% yang berfungsi untuk menghentikan reaksi. Tambahkan 1,5 ml indikator lugol. Dan mengukur absorbansinya pada panjang gelombang 620 nm. Tidak lupa membuat blanko tanpa penambahan indikator sebagai pembanding.Uji aktivitas pada variase suhu. Enzim bekerja optimal pada suhu 36C 38C, pada percobaan kali ini yaitu melihat aktivitas enzim dalam beberapa variase suhu dan mencari suhu yang sesuai dimana enzim amilase ini bekerja optimal. Jika suhu terlalu tinggi melebihi batas maka struktur enzim akan terdenaturasi atau rusak dan tidak bisa efektif kembali karena irreversibel. Jika suhu terlalu rendah maka enzim tidak akan aktif bekerja. Tahapan pengerjaannya yaitu menyiapkan dua bung reaksi yang berisi 2,5 ml larutan stok, 1,75ml dapar fosfat 0,1 M pH 5,6 dan 0,75 ml fraksi sampel. Tabung petama diinkubasi pada suhu 37C dan tabung kedua diinkubasi pada suhu 57C. Proses inkubasi dilakuakan selama 30 menit. Pindahkan 1 ml dari masing-masing tabung ke tabung yang berbeda yang berisi 3 ml HCL 10% untuk menghentikan reaksi dan tambahkan 3 ml indikator lugol, buat juga blanko untuk perbandingan. Dan ukur absorbansinya pada panjang gelombang 620 nm. Suatu kerja enzim dapat dilihat dari nilai absorbansinya.Uji aktivitas amilase pada variase suhu. Selain dipengaruhi oleh suhu kerja enzim pun dipengaruhi oleh pH, enzim akan bekerja optimal pada suhu 3 5. Jika pH berada di atas 5 atau di bawah 3 enzim akan rusak dan kerjanya tidak akan optimal. Tahapan pengerjaannya yaitu hampir sama dengan uji aktivitas amilase yang dipengaruhi suhu, tapi yang diubah disini yaitu ada dua pH, yang pertama dengan pH 3,5 dan yang kedua dengan pH 5,6. Dan kedua tabung diinkubasi pada suhu 37C selama 30 menit. Dan dibaca absorbansinya pada panjang gelombang 620 nm.Setelah melakukan uji absorbasi pada baku, dibuat kurva baku. Dengan x adalah konsentrasi dan y adalah absorbansi. Konsentrasi pati dihitung pada konsentrasi akhir larutan tergelatinisasi yaitu 40 g/ml, kemudian dikalikan 2,5 ml menjadi 100 g/ml. Dan dikali dengan volume yang sesuai dengan prosedur yaitu dikalikan 0 untuk tabung 1 , 0,2 untuk tabung 2 dan seterusnya. Sehingga didapat konsentrasi dari tabung 1 6 , yaitu 0 g/ml, 20 g/ml, 40 g/ml, 60 g/ml, 80 g/ml, 100 g/ml.

Dan dibuat persamaanya, didapat y=1,556x-0,001. Dengan r atau koefisien korelasi persamaan garis kurva baku ini tidak mendekati 1, sehingga sebenarnya tidak bisa dijadikan sumber perhitungan untuk mencari konsentrasi pada sampel uji. Hal ini bisa disebabkan oleh tidak akuratnya dalam pembuatan baku dengan berbagai konsentrasi, sehingga absorbansi yang terbaca menjadi tidak akurat. Setelah dilakukan spektrofotometri pada sampel fraksi 1 dengan ph 3,5 memberikan hasil absorbansi 1,742 sedangkan ph 5,6 memberikan hasil 1,6. Apabila menggunakan persamaan y=1,556x-0,001 , konsentrasi pati pada pH 3,5 adalah 1,12 g/ml dan pada pH 5,6 adalah 1,028 g/ml. Enzim alfa amilase memiliki pH optimal adalah 4,8-8,5, dimana pada pH tersebut enzim akan memberikan kerja yang maksimal dalam mendegradasi pati. Pada Ph 3,5, absorbansi yang dihasilkan lebih besar daripada Ph 5,6. Dan berdasarkan perhitungan konsentrasi pati pada pH 3,5 lebih banyak dibandingkan pada pH 5,6. karena pada pH 3,5 enzim yang merupakan bentuk dari asam amino yang dipengaruhi salah satunya oleh pH, akan mengalami denaturasi sehingga enzim akan menjadi tidak memiliki aktifitas. Sehingga pada pH 3,5, banyak pati yang tidak terhidrolisis oleh enzim, karena enzim sudah terdenaturasi.Sedangkan pada perbedaan suhu dengan menggunakan sampel fraksi 1, pada suhu 370 C menghasilkan absorbasi 0,932 sedangkan pada suhu 570 C memberikan hasil absorbansi 1,148. Apabila menggunakan persamaan y=1,556x-0,001 , konsentrasi pati pada suhu 370 C adalah 0,599 g/ml dan pada suhu 570 C adalah 0,738 g/ml. Enzim amilase memiliki suhu optimal adalah 370 C, dimana pada suhu tersebut enzim masih memberikan kerja yang optimum dalam mendegradasi pati. Pada suhu 570 C, absorbansi yang dihasilkan lebih besar dibandingkan dengan suhu 570 C. Dan berdasarkan perhitungan dengan menggunakan persamaan dari kurva baku, konsentrasi pati pada suhu 570 C lebih banyak dibandingkan suhu 370 C. Karena pada suhu 570 C, enzim yang merupakan bentuk asam amino yang strukturnya dipengaruhi salah satunya oleh suhu, akan mengalami denaturasi pada suhu yang ekstrim sehingga enzim menjadi tidak mengalami aktifitas. Sehingga pada suhu 570 C, banyak pati yang tidak terhidrolisis oleh enzim, karena enzim sudah terdenaturasi. Konsentrasi yang didapat sebenarnya tidak akurat karena persamaan dari kurva baku memiliki r yang sangat kecil. Tetapi pada praktikum ini bertujuan untuk melihat aktivitas amilase, sehingga bersifat kualitatif bukan kuantitatif. Parameter yang dilihat bukan pada nilai konsentrasinya, tetapi pada perubahan dan perbedaan nilai konsentrasinya.KESIMPULANSuhu dan pH berpengaruh pada aktivitas amilase. Terlihat dari nilai konsentrasi pati pada suhu 570 C lebih besar dibanding suhu 370 C, karena tidak didegradasi maksimal oleh enzim amilase. Begitupun pada pH 3,5 konsentrasi pati lebih besar dibanding pH 5,6, karena enzim amilase tidak mendagradasi maksimal pati sehingga konsentrasinya tetap banyak.

DAFTAR PUSTAKAAfiukwa, et. al. 2009. Determination of amylase activity of crude extract from partially germinated mango seeds (Mangifera oraphila).African Journal of Biotechnology Vol. 8 (14), pp. 3294-3296, 20 July, 2009. ISSN 16845315 dapat diakses secara online pada http://www.academicjournals.org/AJB [diakses pada 21 April 2015].Biogen. 2008. Amilase dapat diakses secara online pada http://biogen.litbang.deptan.go.id/terbitan/agrobio/abstrak/agrobio_vol [diakses pada 21 April 2015].Colby, Diane S. 1988.Ringkasan Biokimia Harper.BukuKedokteran EGC.Jakarta.Lehninger, Albert L. 1982. Dasar-dasar Biokimia Jilid 1. Erlangga. Jakarta.Montgomery, Rex. 1993. Biokimia. Gadjah Mada University Press. Yogyakarta.Oliveira.2004.Rhizobia Amylase Production Using Various Starchy Substances as Carbon Substrates dapat diakses secara online pada http://www.scielo.br/pdf/bjm/v31n4/a11v31n4.pdf [diakses pada 21 April 2015].Teodoro, Carlos Eduardo de Souza and Meire Lelis Leal Martins. 2000. Culture Conditions For The Production Of Thermostable Amylase by Bacillussp. Brazilian Journal of Microbiology (2000) 31:298-302. ISSN 1517-8382Winarno, F.G. 1986.Enzim Pangan. Jakarta:Gramedia.