Çukurova Ünİversİtesİaroma maddelerinin belirlenmesinde gaz kromatografisi-alev İyonlaşma...
TRANSCRIPT
ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ
FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ
DOKTORA TEZİ
Murat YILMAZTEKİN
BİYOTEKNOLOJİK YOLDAN DOĞAL İZOAMİL ASETAT VE ETİL
ASETAT AROMALARININ ÜRETİMİ ÜZERİNDE ARAŞTIRMALAR
GIDA MÜHENDİSLİĞİ ANABİLİM DALI
ADANA, 2009
ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ
FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ
Murat YILMAZTEKİN
DOKTORA TEZİ
GIDA MÜHENDİSLİĞİ ANABİLİM DALI
Bu tez 11/02/2009 Tarihinde Aşağıdaki Jüri Üyeleri Tarafından Oybirliği ileKabul Edilmiştir.
İmza................................. İmza ............................. İmza .............................Prof. Dr. Turgut CABAROĞLU Doç. Dr. Hüseyin ERTEN Prof.Dr. Ahmet CANBAŞI. DANIŞMAN II. DANIŞMAN ÜYE
İmza…………………... İmza……………………Prof. Dr. Filiz ÖZÇELİK Prof. Dr. E. Sultan VAYISOĞLU GİRAYÜYE ÜYE
Bu tez Enstitümüz Gıda Mühendisliği Anabilim Dalında hazırlanmıştır.
Kod No :
Prof. Dr. Aziz ERTUNÇ Enstitü Müdürü İmza ve Mühür
Bu Çalışma Çukurova Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri ve TÜBİTAK-TOVAGTarafından Desteklenmiştir.Proje Numaraları: ZF2004D34, ZF2004BAP13, ZF2004BAP20 ve TÜBİTAK-TOVAG-3393
Not: Bu tezde kullanılan özgün ve başka kaynaktan yapılan bildirişlerin, çizelge, şekil ve fotoğraflarınkaynak gösterilmeden kullanımı, 5846 sayılı Fikir ve Sanat Eserleri Kanunundaki hükümlere tabidir.
BİYOTEKNOLOJİK YOLDAN DOĞAL İZOAMİL ASETAT VE ETİL
ASETAT AROMALARININ ÜRETİMİ ÜZERİNDE ARAŞTIRMALAR
I
ÖZDOKTORA TEZİ
Murat YILMAZTEKİN
ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİFEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ
GIDA MÜHENDİSLİĞİ ANABİLİM DALI
I. Danışman : Prof. Dr. Turgut CABAROĞLUII. Danişman : Doç. Dr. Hüseyin ERTEN
Yıl: 2009, Sayfa: 103Jüri : Prof. Dr. Ahmet CANBAŞ
Prof. Dr. Filiz ÖZÇELİKProf. Dr. Turgut CABAROĞLUProf. Dr. E. Sultan VAYISOĞLU GİRAYDoç. Dr. Hüseyin ERTEN
Bu çalışmada, Williopsis saturnus mayası kullanılarak melastan fermantasyon yoluyla vemelas ortamında fuzel yağı ilavesiyle biyodönüşüm yoluyla izoamil asetat üretimi; Pichia mayasıkullanılarak melastan fermantasyon yoluyla etil asetat üretimi ele alınmıştır. Araştırmada 3 farklıWilliopsis saturnus maya ırkının (HUT 7087, IAM 12217 ve NCYC 22), sıcaklığın (15 ºC ve 25 ºC)ve havalandırmanın (havalandırmasız, yarı havalandırmalı ve havalandırmalı) izoamil asetat üretimineetkisi saptanmış ve daha sonra belirlenen en uygun koşullarda ortama ilave edilen fuzel yağınınbiyodönüşümü ile izoamil asetat üretiminin arttırılması hedeflenmiştir. Etil asetat üretiminde isePichia cinsine ait 2 farklı mayanın (Pichia anomala NCYC 432 ve Pichia subpelliculosa NCYC 436),sıcaklığın (15 ºC ve 25 ºC) ve havalandırmanın (havalandırmasız, yarı havalandırmalı vehavalandırmalı) etkileri araştırılmıştır.
Fermantasyon denemeleri kontrollü koşullar altında fermentörlerde, biyodönüşüm denemeleriise orbital karıştırıcıda erlenmayerler içerisinde gerçekleştirilmiştir. Aroma maddelerininbelirlenmesinde Gaz Kromatografisi-Alev İyonlaşma Dedektörü kullanılmıştır.
Elde edilen bulgulara göre ele alınan 3 maya ırkı içerisinde Williopsis saturnus HUT7087’nin en yüksek miktarda izoamil asetat üreten ırk olduğu ve bu maya ırkı ile 25 ºC’de 15 ºC’yegöre, yarı havalandırmalı ortamda havalandırmasız ve havalandırmalı ortama göre daha fazla izoamilasetat üretildiği belirlenmiştir. Saptanan en uygun koşullarda ortama ilave edilen % 1 oranında fuzelyağı izoamil asetat üretiminde 3 kat artışa neden olmuş ve üretilen izoamil asetat miktarı 354 mg/Lolarak belirlenmiştir. Pichia cinsine ait mayalardan ise Pichia anomala NCYC 432 melastan en fazlaetil asetat üreten maya olmuştur. 25 ºC’de 15 ºC’ye göre ve yarı havalandırmalı ortamdahavalandırmasız ve havalandırmalı ortama göre daha fazla etil asetat üretilmiş ve belirlenen en uygunfermantasyon koşullarında ulaşılan en yüksek etil asetat miktarı yaklaşık 6.7 g/L olmuştur.
Anahtar Kelimeler: Doğal aroma, Williopsis saturnus, Pichia, fermantasyon, biyodönüşüm
BİYOTEKNOLOJİK YOLDAN DOĞAL İZOAMİL ASETAT VE ETİL
ASETAT AROMALARININ ÜRETİMİ ÜZERİNDE ARAŞTIRMALAR
II
ABSTRACTPhD THESIS
Murat YILMAZTEKİN
DEPARTMENT OF FOOD ENGINEERINGINSTITUTE OF NATURAL AND APPLIED SCIENCES
UNIVERSITY OF CUKUROVA
I. Supervisor : Prof. Dr. Turgut CABAROĞLUII. Supervisor : Assoc. Prof. Dr. Hüseyin ERTEN
Year: 2009, Pages: 103Jury : Prof. Dr. Ahmet CANBAŞ
Prof. Dr. Filiz ÖZÇELİKProf. Dr. Turgut CABAROĞLUProf. Dr. E. Sultan VAYISOĞLU GİRAYAssoc. Prof. Dr. Hüseyin ERTEN
In this study, the production of isoamyl acetate using Williopsis saturnus from sugarbeetmolasses by fermentation and from fusel oil in a molasses based medium by bioconversin; and theproduction of ethyl acetate using Pichia yeasts by fermentation were studied. For isoamyl acetateproduction the effects of 3 different strains of Williopsis saturnus (HUT 7087, IAM 12217 and NCYC22), temperature (15 ºC and 25 ºC) and aeration (aerated, semi-aerated and unaerated) on theproduction of isoamyl acetate were determined and enhancement of isoamyl acetate production bybioconversion with addition of fusel oil at the most suitable conditions was aimed. For ethyl acetateproduction, the influence of 2 different yeasts (Pichia anomala NCYC 432 and Pichia subpelliculosaNCYC 436), temperature (15 ºC and 25 ºC) and aeration (aerated, semi-aerated and unaerated) wereexamined.
Fermentation and bioconversion trials were performed with batch fermentors at controlledconditions and with orbital shaker in flasks, respectively. Flavour compunds were determined with gaschromatography-flame ionization detector.
According to the results obtained, Williopsis saturnus HUT 7087 was the highest isoamylacetate producer among Williopsis saturnus strains, and that strain formed higher amount of ester at25 ºC than at 15 ºC, at semi-aerated medium than aerated and unaerated mediums. The addition of 1%of fusel oil into medium caused a 3 fold increase in isoamyl acetate production and the maximumamount of isoamyl acetate produced was 354 mg/L. Pichia anomala NCYC 432 produced higher levelof ethyl acetate than that of Pichia subpelliculosa NCYC 436 from molasses. The highest amount ofethyl acetate was determined at 25 ºC than at 15 ºC, at semi-aerated medium than aerated andunaerated mediums, and the maximum amount was found about 6.7 g/L.
Keywords: Natural flavour, Williopsis saturnus, Pichia, fermentation, bioconversion
INVESTIGATIONS ON THE BIOTECHNOLOGICAL PRODUCTION OF
NATURAL ISOAMYL ACETATE AND ETHYL ACETATE
III
TEŞEKKÜR
Doktora tez çalışmam sırasında araştırma konusunun belirlenmesi,
araştırmanın planlanması ve sonuçların değerlendirilmesinde tecrübelerinden
faydalandığım başta birinci danışmanım sayın Prof. Dr. Turgut CABAROĞLU
olmak üzere, ikinci danışmanım sayın Doç. Dr. Hüseyin ERTEN’e, tezin yürütülmesi
sırasında yapmış oldukları katkılardan dolayı Tez İzleme Komitesi üyeleri sayın
Prof. Dr. Ahmet CANBAŞ ve sayın Prof. Dr. E. Sultan VAYISOĞLU GİRAY’a ve
tez jürisinde yer alarak tezimi değerlendiren sayın Prof. Dr. Filiz ÖZÇELİK’e sonsuz
teşekkürlerimi sunarım.
Çalışmalarım sırasında maddi ve manevi desteğini gördüğüm başta değerli
arkadaşım Arş. Gör. Adnan BOZDOĞAN’a, bölüm hocalarıma, acı ve tatlı pek çok
anıyı paylaştığım çalışma arkadaşlarıma ve bölüm çalışanlarına minnet duyduğumu
belirtmek isterim.
Araştırmam sırasında kullanılan melası sağlayan Özmaya A.Ş. (Ceyhan,
ADANA)’ne, fuzel yağının temin edilmesinde yardımcı olan Malatya Şeker
Fabrikası’na, maya suşlarını sağlayan HUT, IAM ve NCYC kültür koleksiyonlarına,
tez çalışmamı maddi olarak destekleyen Çukurova Üniversitesi Araştırma Projeleri
Destekleme Birimi’ne ve Türkiye Bilimsel ve Teknolojik Araştırmalar Kurumu’na
teşekkür ederim.
Son olarak, bu günlere gelmemde sonsuz emekleri olan ve maddi manevi
desteklerini esirgemeyen anneme, babama ve kardeşlerime, son beş yıldır hayatımı
renklendiren sevdiğim insana minnettarlığımı ifade etmek isterim.
IV
Sonsuz sevgi, ilgi ve destekleri ile her zaman yanımda olan anneme ve babama…
V
İÇİNDEKİLER Sayfa No
ÖZ ............................................................................................................................ I
ABSTRACT ............................................................................................................II
TEŞEKKÜR .......................................................................................................... III
İÇİNDEKİLER……. ...............................................................................................V
ÇİZELGELER DİZİNİ .......................................................................................... IX
ŞEKİLLER DİZİNİ .................................................................................................X
RESİMLER DİZİNİ.............................................................................................XIII
SİMGELER VE KISALTMALAR ......................................................................XIV
1. GİRİŞ ................................................................................................................. 1
2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR.................................................................................. 4
2.1. Aroma Maddelerinin Sınıflandırılması .......................................................... 4
2.2. Biyoteknolojik Yollarla Doğal Aroma Maddelerinin Üretim Yöntemleri ....... 5
2.2.1. Mikrobiyal Yolla Üretim ........................................................................ 5
2.2.1.1. Fermantayon Yoluyla Üretim........................................................... 6
2.2.1.2. Biyodönüşüm Yoluyla Üretim ......................................................... 8
2.2.2. Enzimatik Yolla Üretim.........................................................................10
2.3. Esterler.........................................................................................................11
2.3.1. Biyoteknolojik Yollarla Esterlerin Üretimi ............................................12
2.3.2. Esterlerin Oluşum Mekanizması ............................................................13
2.3.3. Ester Oluşumunu Etkileyen Faktörler ....................................................15
2.3.3.1. Maya Cinsi .....................................................................................15
2.3.3.2. Ortam Bileşimi ...............................................................................17
2.3.3.3. Sıcaklık...........................................................................................18
2.3.3.4. Havalandırma .................................................................................19
2.3.3.5. Substrat Miktarı ..............................................................................22
2.4. Biyoteknolojik Yolla Aroma Üretiminde Gıda Sanayi Artıklarının Kullanımı
....................................................................................................................23
2.4.1. Melas.....................................................................................................24
2.4.2. Fuzel Yağı .............................................................................................26
VI
3. MATERYAL ve METOT .................................................................................27
3.1. Materyal.......................................................................................................27
3.1.1. Mayalar .................................................................................................27
3.1.2. Besiyerleri ve Kimyasallar.....................................................................27
3.1.3. Melas.....................................................................................................27
3.1.4. Fuzel Yağı .............................................................................................28
3.1.5. Fermentör..............................................................................................29
3.2. Metot ...........................................................................................................29
3.2.1. Fermantasyon ve Biyodönüşümde Kullanılan Melas Çözeltisinin
Hazırlanması .........................................................................................29
3.2.2. Aşılama Kültürünün Hazırlanması .........................................................30
3.2.3. Fermantasyon Koşulları .........................................................................30
3.2.3.1. Havalandırmalı Fermantasyon.........................................................31
3.2.3.2. Havalandırmasız Fermantasyon ......................................................31
3.2.3.3. Yarı-Havalandırmalı Fermantasyon ................................................31
3.2.4. Biyodönüşüm Koşulları .........................................................................31
3.2.5. Fuzel Yağı Toksisitesinin Belirlenmesi..................................................32
3.2.6. Örneklerin Alınması ..............................................................................32
3.2.7. Örnekler Üzerinde Yapılan Analizler.....................................................32
3.2.7.1. Maya Sayımı ve Canlılık Oranı .......................................................32
3.2.7.2. Yoğunluk........................................................................................33
3.2.7.3. pH ..................................................................................................33
3.2.7.4. Etil Alkol........................................................................................33
3.2.7.5. Aroma Maddelerinin Analizi...........................................................34
3.2.7.5.(1). Cevap Faktörünün Hesaplanması ...........................................36
3.2.7.5.(2). Miktar Tayini ........................................................................37
3.2.8. İstatistiksel Değerlendirme ....................................................................37
4. ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA .................................................38
4.1. İzoamil Asetat Üretimi .................................................................................38
4.1.1. W. saturnus Mayası ile İzoamil Asetat Üretimi ......................................38
4.1.1.1. Maya Gelişimi ve Canlılık Oranı.....................................................38
VII
4.1.1.2. Fermantasyonun Gidişi ...................................................................39
4.1.1.3. pH ..................................................................................................40
4.1.1.4. Etil Alkol Üretimi ...........................................................................41
4.1.1.5. 2-Metil-1-butanol ve 3-Metil-1-butanol Üretimi..............................42
4.1.1.6. İzoamil Asetat/Amil Alkol Oranı ....................................................44
4.1.1.7. İzoamil Asetat Üretimi....................................................................45
4.1.2. W. saturnus HUT 7087 Mayası Kullanılarak Fermantasyon Yoluyla
İzoamil Asetat Üretimi ..........................................................................47
4.1.2.1. W. saturnus HUT 7087 Mayası Kullanılarak Fermantasyon Yoluyla
İzoamil Asetat Üretiminde Sıcaklığın Etkisi.....................................47
4.1.2.1.(1). Maya Gelişimi ve Canlılık Oranı ...........................................47
4.1.2.1.(2). Fermantasyonun Gidişi ..........................................................49
4.1.2.1.(3). pH .........................................................................................50
4.1.2.1.(4). Etil Alkol Üretimi..................................................................51
4.1.2.1.(5). 2-Metil-1-butanol ve 3-Metil-1-butanol Üretimi ....................52
4.1.2.1.(6). İzoamil Asetat Üretimi ..........................................................55
4.1.2.2. W. saturnus HUT 7087 Mayası Kullanılarak Fermantasyon Yoluyla
İzoamil Asetat Üretiminde Havalandırmanın Etkisi..........................57
4.1.2.2.(1). Maya Gelişimi ve Canlılık Oranı ...........................................57
4.1.2.2.(2). Fermantasyonun Gidişi ..........................................................58
4.1.2.2.(3). pH .........................................................................................60
4.1.2.2.(4). Etil Alkol Üretimi..................................................................60
4.1.2.2.(5). 2-Metil-1-butanol ve 3-Metil-1-butanol Üretimi ....................62
4.1.2.2.(6). İzoamil Asetat Üretimi ..........................................................63
4.1.3. W. saturnus HUT 7087 Mayası Kullanılarak Biyodönüşüm Yoluyla
İzoamil Asetat Üretimi ..........................................................................66
4.1.3.1. Fuzel Yağının Maya Gelişimi ve Canlılık Oranına Etkisi ................66
4.1.3.2. Fuzel Yağının Yoğunluğa Etkisi .....................................................68
4.1.3.3. Fuzel Yağının Etil Alkol Üretimine Etkisi.......................................68
4.1.3.4. 2-Metil-1-butanol ve 3-Metil-1-butanol Miktarlarındaki Değişimler69
4.1.3.5. Fuzel Yağının İzoamil Asetat Üretimine Etkisi ...............................72
VIII
4.2. Etil Asetat Üretimi .......................................................................................74
4.2.1. P. anomala ve P. subpellicolasa Mayaları ile Etil Asetat Üretimi ..........74
4.2.2. P. anomala NCYC 432 Mayası Kullanılarak Fermantasyon Yoluyla Etil
Asetat Üretimi .......................................................................................75
4.2.2.1. P. anomala NCYC 432 Mayası Kullanılarak Fermantasyon Yoluyla
Etil Asetat Üretiminde Sıcaklığın Etkisi...........................................75
4.2.2.1.(1). Maya Gelişimi ve Canlılık Oranı ...........................................75
4.2.2.1.(2). Fermantasyonun Gidişi ..........................................................76
4.2.2.1.(3). pH .........................................................................................77
4.2.2.1.(4). Etil Alkol Üretimi..................................................................78
4.2.2.1.(5). Etil Asetat Üretimi.................................................................79
4.2.2.2. P. anomala NCYC 432 Mayası Kullanılarak Fermantasyon Yoluyla
Etil Asetat Üretiminde Havalandırmanın Etkisi................................80
4.2.2.2.(1). Maya Gelişimi ve Canlılık Oranı ...........................................80
4.2.2.2.(2). Fermantasyonun Gidişi ..........................................................82
4.2.2.2.(3). pH .........................................................................................82
4.2.2.2.(4). Etil Alkol Üretimi..................................................................83
4.2.2.2.(5). Etil Asetat Üretimi.................................................................85
5. SONUÇ ve ÖNERİLER ....................................................................................88
KAYNAKLAR ......................................................................................................91
ÖZGEÇMİŞ ........................................................................................................103
IX
ÇİZELGELER DİZİNİ Sayfa No
Çizelge 2.1. Fermantasyon ve mikrobiyal biyodönüşümlerin genel özellikleri.......... 6
Çizelge 2.2. Mikrobiyal biyodönüşümle üretilen bazı aroma maddeleri.................... 9
Çizelge 2.3. Fermantasyon sırasında ester oluşumunu etkileyen faktörler................15
Çizelge 2.4. Farklı maya türleri tarafından üretilen esterler .....................................17
Çizelge 2.5. Aerobik mayalar tarafından farklı fermantasyon koşullarında üretilen
şaraplarda tespit edilen etil asetat miktarları........................................21
Çizelge 2.6. Aerobik mayalar tarafından farklı fermantasyon koşullarında üretilen
şaraplarda tespit edilen izoamil asetat miktarları .................................21
Çizelge 2.7. Aroma maddelerinin üretiminde kullanılan bazı gıda artıkları ..............24
Çizelge 2.8. Şeker pancarı melasının kimyasal bileşimi...........................................25
Çizelge 3.1. Melasın fiziksel ve kimyasal özellikleri ...............................................28
Çizelge 3.2. Biyodönüşüm denemelerinde kullanılan fuzel yağının bileşimi............28
Çizelge 3.3. Aroma maddelerinin kalibrasyon verileri.............................................35
Çizelge 4.1. W. saturnus mayaları ile gerçekleştirilen fermantasyonlarda izoamil
asetat/amil alkol oranı……. ................................................................44
Çizelge 4.2. W. saturnus mayaları tarafından üretilen izoamil asetat miktarları ve
üretim hızları ......................................................................................46
Çizelge 4.3. Farklı sıcaklıklarda W. saturnus HUT 7087 tarafından üretilen izoamil
asetat miktarları ve üretim hızları........................................................55
Çizelge 4.4. Farklı havalandırma koşullarında W. saturnus HUT 7087 tarafından
üretilen izoamil asetat miktarları ve üretim hızları...............................65
Çizelge 4.5. Fuzel yağı konsantrasyonunun amil alkollerin biyodönüşümü üzerine
etkisi...................................................................................................72
Çizelge 4.6. Farklı konsantrasyonlarda fuzel yağı ilavesinde W. saturnus HUT 7087
tarafından üretilen izoamil asetat miktarları ve üretim hızları ..............73
Çizelge 4.7. Farklı sıcaklıklarda P. anomala NCYC 432 tarafından üretilen etil asetat
miktarları ve üretim hızları .................................................................79
Çizelge 4.8. Farklı havalandırma koşullarında P. anomala NCYC 432 tarafından
üretilen etil asetat miktarları ve üretim hızları .....................................86
X
ŞEKİLLER DİZİNİ Sayfa No
Şekil 2.1. Tipik bir fermantasyon işlemi. .................................................................. 8
Şekil 2.2. Aroma sanayinde kullanılan bazı önemli esterler .....................................12
Şekil 2.3. Esterlerin kimyasal ve biyokimyasal yolla sentezlenmesi. .......................13
Şekil 2.4. Mayalarda ester oluşumunun biyokimyası. ..............................................14
Şekil 3.1. Etil alkol analizlerinde elde edilen örnek kromatogram ...........................34
Şekil 3.2. Aroma maddelerinin analizlerinde elde edilen örnek kromatogram..........36
Şekil 4.1. W. saturnus mayalarının gelişimi.............................................................39
Şekil 4.2. W. saturnus mayaları ile gerçekleştirilen fermantasyonlara ait yoğunluk
değerleri ................................................................................................40
Şekil 4.3. W. saturnus mayaları ile gerçekleştirilen fermantasyonlara ait pH değerleri
..............................................................................................................41
Şekil 4.4. W. saturnus mayaları ile gerçekleştirilen fermantasyonlardaki etil alkol
üretimi...................................................................................................42
Şekil 4.5. W. saturnus mayaları ile gerçekleştirilen fermantasyonlardaki 2-metil-1-
butanol üretimi ......................................................................................43
Şekil 4.6. W. saturnus mayaları ile gerçekleştirilen fermantasyonlardaki 3-metil-1-
butanol üretimi ......................................................................................44
Şekil 4.7. W. saturnus mayaları ile gerçekleştirilen fermantasyonlardaki izoamil
asetat üretimi .........................................................................................46
Şekil 4.8. W. saturnus HUT 7087 mayası ile farklı sıcaklıklarda yürütülen
fermantasyonlardaki canlı maya sayısı ...................................................48
Şekil 4.9. W. saturnus HUT 7087 maya ile farklı sıcaklıklarda yürütülen
fermantasyonlardaki yoğunluk değişimi.................................................49
Şekil 4.10. W. saturnus HUT 7087 maya ile farklı sıcaklıklarda yürütülen
fermantasyonlardaki pH değişimi ..........................................................50
Şekil 4.11. W. saturnus HUT 7087 maya ile farklı sıcaklıklarda yürütülen
fermantasyonlarda etil alkol üretimi.......................................................51
Şekil 4.12. W. saturnus HUT 7087 maya ile farklı sıcaklıklarda yürütülen
fermantasyonlarda 2-metil-1-butanol üretimi .........................................53
XI
Şekil 4.13. W. saturnus HUT 7087 maya ile farklı sıcaklıklarda yürütülen
fermantasyonlarda 3-metil-1-butanol üretimi .........................................53
Şekil 4.14. W. saturnus HUT 7087 maya ile farklı sıcaklıklarda yürütülen
fermantasyonlarda izoamil asetat üretimi ...............................................55
Şekil 4.15. W. saturnus HUT 7087 mayası ile farklı havalandırma koşullarında
yürütülen fermantasyonlardaki canlı maya sayısı ...................................57
Şekil 4.16. W. saturnus HUT 7087 mayası ile farklı havalandırma koşullarında
yoğunluk değişimi .................................................................................59
Şekil 4.17. W. saturnus HUT 7087 mayası ile farklı havalandırma koşullarında pH
değişimi.................................................................................................60
Şekil 4.18. W. saturnus HUT 7087 mayası ile farklı havalandırma koşullarında etil
alkol üretimi ..........................................................................................61
Şekil 4.19. W. saturnus HUT 7087 mayası ile farklı havalandırma koşullarında 2-
metil-1-butanol üretimi..........................................................................62
Şekil 4.20. W. saturnus HUT 7087 mayası ile farklı havalandırma koşullarında 3-
metil-1-butanol üretimi..........................................................................63
Şekil 4.21. W. saturnus HUT 7087 mayası ile farklı havalandırma koşullarında
izoamil asetat üretimi.............................................................................64
Şekil 4.22. Biyodönüşüm süresince canlı maya sayısı .............................................67
Şekil 4.23. Biyodönüşüm süresince canlılık oranı....................................................67
Şekil 4.24. Biyodönüşüm süresince gözlenen yoğunluk değerleri ............................68
Şekil 4.25. Biyodönüşüm süresince etil alkol üretimi ..............................................69
Şekil 4.26. Biyodönüşüm süresince 2-metil-1-butanol miktarlarındaki değişim.......70
Şekil 4.27. Biyodönüşüm süresince 3-metil-1-butanol miktarlarındaki değişim.......71
Şekil 4.28. Biyodönüşüm süresince üretilen izoamil asetat miktarlarındaki değişim 73
Şekil 4.29. P. anomala NCYC 432 mayası ile farklı sıcaklıklarda gerçekleştirilen
fermantasyonlardaki maya gelişimi........................................................75
Şekil 4.30. P. anomala NCYC 432 mayası ile farklı sıcaklıklarda gerçekleştirilen
fermantasyonlardaki yoğunluk değerleri ................................................76
Şekil 4.31. P. anomala NCYC 432 mayası ile farklı sıcaklıklarda gerçekleştirilen
fermantasyonlardaki pH değerleri ..........................................................77
XII
Şekil 4.32. P. anomala NCYC 432 mayası ile farklı sıcaklıklarda gerçekleştirilen
fermantasyonlarda üretilen etil alkol miktarları ......................................78
Şekil 4.33. P. anomala NCYC 432 mayası ile farklı sıcaklıklarda gerçekleştirilen
fermantasyonlarda üretilen etil asetat miktarları .....................................79
Şekil 4.34. P. anomala NCYC 432 mayası ile farklı havalandırma koşullarında
yürütülen fermantasyonlardaki canlı maya sayısı ...................................81
Şekil 4.35. P. anomala NCYC 432 mayası ile farklı havalandırma koşullarında
yürütülen fermantasyonlardaki yoğunluk değerleri.................................82
Şekil 4.36. P. anomala NCYC 432 mayası ile farklı havalandırma koşullarında
yürütülen fermantasyonlardaki pH değerleri ..........................................83
Şekil 4.37. P. anomala NCYC 432 mayası ile farklı havalandırma koşullarında
yürütülen fermantasyonlardaki etil alkol üretimi ....................................84
Şekil 4.38. P. anomala NCYC 432 mayası ile farklı havalandırma koşullarında
yürütülen fermantasyonlardaki etil asetat üretimi...................................85
XIII
RESİMLER DİZİNİ Sayfa No
Resim 3.1. Fermantasyon denemelerinde kullanılan fermentörler………………….29
XIV
SİMGELER VE KISALTMALAR
W : Williopsis
P : Pichia
S : Saccharomyces
AATaz : Alkol asetiltransferaz
ATF1 ve ATF2 : Alkol asetiltransferaz I ve Alkol asetiltransferaz II
enzimlerini kodlayan genler
NCYC : National Collection of Yeast Cultures (Ulusal Maya
Kültür Koleksiyonu, İngiltere)
IAM : Institute of Applied Microbiology Culture Collection
(Uygulamalı Mikrobiyoloji Enstitüsü Kültür
Koleksiyonu, Japonya)
HUT : Hiroshima University Culture Collection (Hiroşima
Üniversitesi Kültür Koleksiyonu, Japonya)
MEA : Malt Ekstrakt Agar
MEB : Malt Ekstrakt Broth
GC : Gas Chromatography (Gaz Kromatografisi)
FID : Flame Ionization Detector (Alev İyonlaşma Dedektörü)
1. GİRİŞ Murat YILMAZTEKİN
1
1. GİRİŞ
Aroma maddeleri burun yoluyla ve ürün ağızdayken geniz yoluyla algılanan
uçucu ve koku veren özellikteki alifatik ve aromatik yapılı kimyasal bileşiklerdir.
Gıdanın tüketici tarafından tercih edilmesinde birinci derecede rol oynayan aroma
maddeleri, gıdanın en önemli kalite kriterlerinden birini oluşturmaktadır. Bu
bileşikler gıdalarda çok sayıda ve nanogram ile miligram gibi düşük miktarlarda
bulunmalarına rağmen gıdanın kendine özgü duyusal özelliğini belirler. Gıdaların
aroması aldehitler, alkoller, ketonlar, esterler, laktonlar, terpenler, pirazinler, uçucu
fenoller ve kükürtlü bileşikler gibi çeşitli kompleks gruplardan oluşmaktadır
(Reineccius, 2006).
Bir gıdanın aroması hammaddenin doğal yapısından, ürünün işlenmesi
sırasında uygulanan kesme, sıkma, ezme, haşlama, pişirme, kızartma, kavurma,
fermantasyon, tütsüleme vb. çeşitli işlemlerden veya ürüne dışarıdan ilave edilen
aroma bileşiklerinden ileri gelir. Gıdalarda arzu edilen aromanın yeterli olmaması,
üretim sırasında ortaya çıkan kayıpları geri kazandırmak, gıdada doğal olarak
bulunan bir kokuyu maskelemek, aromasız gıdalara başka bir aroma kazandırmak
veya ürünü farklılaştırmak gibi çeşitli nedenlerle ürünlere aroma maddesi ilavesi
yapılmaktadır (Elmacı, 2001; Reineccius, 2006; Bayrak, 2006).
Aroma maddeleri özellikle gıda sanayinde sıkça kullanılan katkı maddeleri
arasında gelmektedir. Uzun zamandan beri bitkiler aroma maddelerinin esas kaynağı
olmuşlardır. Ancak bunların düşük miktarlarda bulunmaları, saflaştırılmalarının zor
olması ve pahalı olmaları nedeniyle günümüzde kimyasal yolla sentezlenen aroma
maddeleri daha çok kullanılmaktadır. Bugün piyasada kullanılan aroma maddelerinin
yaklaşık % 80’den fazlasını sentetik aroma maddeleri oluşturmaktadır (Krings ve
Berger, 1998). Ancak son zamanlarda müşteri taleplerinin doğal ürünlere kayması,
kimyasal ürünlerin insan sağlığını ve çevreyi tehdit etmesi ve uluslararası
mevzuatlarda kimyasal yollarla elde edilen ürünlere getirilen kısıtlamalar alternatif
yolların ortaya çıkmasına neden olmuştur.
Aroma maddelerinin üretiminde son dönemlerde oldukça ilgi gören
yöntemlerden biri de biyoteknolojik işlemlerin kullanılmasıdır. Modern
1. GİRİŞ Murat YILMAZTEKİN
2
biyoteknolojide yaşanan gelişmeler sonucunda doğal aroma maddelerinin
mikroorganizmalar, izole edilmiş enzimler ve bitki hücre kültürlerinden
yararlanılarak üretilmesi mümkün olmuştur. Günümüzde yaklaşık 100 kadar doğal
aroma bileşiği biyoteknolojik yöntemlerle üretilmektedir (Reineccius, 2006).
Prensipte biyoteknolojik yolla aroma maddesi üretiminde iki yöntem yaygın olarak
kullanılmaktadır. Birincisi mikroorganizmaların kullanıldığı fermantasyon yoluyla
üretim (de novo sentezi), ikincisi ise mikroorganizmaların veya enzimlerin
kullanıldığı biyodönüşüm yoluyla üretimdir (Janssens ve ark., 1992). Biyoteknolojik
yöntemlerin sağladığı en önemli avantajlar, tarımsal üretimde karşılaşılan
sorunlardan (iklim, bitkisel hastalıklar, pestisit kullanımı, pazar arayışı, tarım
politikaları vb.) bağımsız olması ve endüstriyel ölçekte uygulanabilir olmasıdır
(Krings ve Berger, 1998). Biyoteknolojik üretimin kimyasal yolla üretime göre
avantajları ise, daha esnek reaksiyon koşullarına, yüksek ürün ve substrat
spesifikliğine sahip olması ve çevreyi daha az kirletmesidir (Xu ve ark., 2007).
Kısa zincirli yağ asitleriyle alkoller arasında meydana gelen esterler, aroma
maddeleri arasında önemli bir grup olup meyve aroması veren bileşikler olarak
tanınırlar. İzoamil asetat ve etil asetat gıdalara meyvemsi tat ve koku verdiklerinden
gıda endüstrisinde sıklıkla kullanılan aroma maddeleridir. Bunların doğal
kaynaklardan elde edilen formları hem pahalı olmakta, hem de miktar olarak yetersiz
kalmaktadır. Bu yüzden aroma maddelerinin üretiminde son yıllarda oldukça ilgi
gören biyoteknolojik yollarla üretim, doğal izoamil asetat ve etil asetat üretiminde de
alternatif yöntemlerden biri olarak görülmektedir.
Ülkemizde gıda sanayi artıklarının yeterince değerlendirilememesi hem çevre
sorunlarına hem de ekonomik kayıplara yol açmaktadır. Biyoteknolojik yöntemlerle
aroma maddelerinin üretiminde, gıda sanayi artıkları karbon ve azot kaynağı olarak
fermantasyon işlemlerinde kullanılabilmektedir. Bu şekilde gıda artıklarının
değerlendirilmesiyle hem doğal aroma maddelerinin üretiminde maliyetin
düşürülmesi, hem de ülke ekonomisine katkı sağlanması düşünülmektedir.
Değerlendirilebilecek gıda artıkları arasında melas hem içerik bakımından, hem de
ucuz temin edilebilmesi açısından potansiyel oluşturabilecek niteliktedir.
1. GİRİŞ Murat YILMAZTEKİN
3
Tarımsal hammaddelerden etil alkol üretiminde yan ürünlerden biri de
damıtma işlemi sonrasında ortaya çıkan damıtma artıklarıdır. Damıtma işleminden
sonra geride kalan kuyruk (son kısım) fuzel yağları olarak da adlandırılan yüksek
alkolleri ve özellikle amil alkolleri içerir. Mayalar özellikle izoamil asetatı ve bazı
uçucu asetatları yüksek alkollerden üretebilmektedir. Bu durumda, ucuz bir yan ürün
olan damıtma artıkları izoamil asetat üretimi için önemli bir kaynak olarak
görünmektedir.
Bu çalışmada karbon kaynağı olarak melas kullanarak W. saturnus mayası ile
izoamil asetat ve P. anomala ve P. subpelliculosa mayaları ile etil asetat üretimi ele
alınmış ve,
· W. saturnus mayası ile izoamil asetat üretiminde;
- En uygun maya ırkının belirlenmesi
- Fermantasyon yoluyla üretim sırasında sıcaklık (15 ve 25 ºC) ve
havalandırmanın (havalandırmalı, yarı havalandırmalı ve havalandırmasız)
etkisi ve
- Biyodönüşüm yoluyla üretim sırasında ortama farklı konsantrasyonlarda (%
1, 2 ve 3) fuzel yağı ilavesinin etkisi,
· P. anomala ve P. subpelliculosa ile etil asetat üretiminde ise;
- Fermantasyon yoluyla üretim sırasında sıcaklık (15 ve 25 ºC) ve
havalandırmanın (havalandırmalı, yarı havalandırmalı ve havalandırmasız)
etkisi araştırılmıştır.
2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Murat YILMAZTEKİN
4
2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR
2.1. Aroma Maddelerinin Sınıflandırılması
Aroma maddeleri genel olarak doğal ve yapay aroma maddeleri olarak
gruplandırılır. Aroma maddelerinin elde edildikleri kaynakların çok farklı ve çok
çeşitli olması, uluslararası mevzuatlarda kesin tanımlarının yapılmasına neden
olmuştur. Amerika Birleşik Devletleri’nde aroma maddeleri doğal ve yapay olmak
üzere iki gruba ayrılmış ve doğal aroma maddeleri, “esansiyel yağlar; yağlı reçineler;
esanslar; protein hidrolizatları; baharat, meyve suyu, sebze veya sebze suyu, maya
ekstraktları, bitki tomurcuk, kabuk, kök ve yaprakları, et, deniz ürünleri, kümes
hayvanları, yumurta ve süt ürünlerinin kızartılması, ısıtılması ve enzimle muamele
edilmesinden sonra elde edilen destilatları veya esas işlevi aroma vermek olan
fermantasyon ürünleri“ şeklinde tanımlanmıştır. Avrupa Birliği Aroma
Yönergesi’nde ise doğal aroma maddeleri, “bitkisel veya hayvansal kaynaklardan
fiziksel, enzimatik veya mikrobiyolojik yollarla elde edilen aroma verici madde veya
madde karışımları” olarak ifade edilmiştir (Vandamme ve Soetaert, 2002). Her iki
tanımdan da anlaşıldığı gibi aroma maddelerinin doğal olarak adlandırılabilmesi için
elde edildiği hammaddenin de (substrat veya ön bileşik) doğal olması gerekmektedir.
Doğal bir aroma maddesinin adı “Doğal Çilek Aroması” ifadesinde olduğu gibi bir
gıda maddesine veya bir aroma kaynağına referans oluşturuyorsa, bu aromanın
tamamının uygun fiziksel, enzimatik veya mikrobiyolojik yollarla bu gıdadan veya
kaynaktan elde edilmesi zorunludur. Aksi durumda “doğal” ifadesi kullanılamaz
(Anonim, 1997a).
Birçok Avrupa ülkesinde doğal ve yapay aroma maddelerinin yanında doğala
özdeş aroma maddeleri ayrı bir sınıf olarak kabul edilmektedir. Kimyasal yollarla
sentezlenen bu bileşikler, doğal formlarıyla aynı özellikleri gösterirler (Janssens ve
ark., 1992; Vandamme ve Soetaert, 2002). Türk Gıda Kodeksi Yönetmeliğine göre
aroma maddeleri, “doğal aroma maddeleri”, “doğala özdeş aroma maddeleri” ve
“yapay aroma maddeleri” olarak sınıflandırılmaktadır (Anonim, 1997a).
2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Murat YILMAZTEKİN
5
2.2. Biyoteknolojik Yollarla Doğal Aroma Maddelerinin Üretim Yöntemleri
2.2.1. Mikrobiyal Yolla Üretim
İnsanoğlu yüzyıllardan beri farklı teknikler kullanarak hoş kokulu ve aromalı
gıdalar üretmiş, fakat aroma oluşumunda mikroorganizmaların rol oynadığını ancak
geçtiğimiz yüzyılda mikrobiyoloji ve biyokimyada yaşanan gelişmeler sayesinde
öğrenebilmiştir. Yapılan araştırmalar sonucunda mikroorganizmaların, birçoğu
önemli aroma bileşiği olan ikincil ürünleri ürettiği belirlenmiştir (Vanderhaegen ve
ark., 2003).
Biyoteknolojik yolla doğal aroma maddesi üretim yöntemlerinden birisi de
mikroorganizmaların kullanılmasıdır. Mikroorganizmaların kullanıldığı üretim
tekniklerinde fermantasyon ve mikrobiyel biyodönüşüm olmak üzere temel olarak iki
yöntemden yararlanılmaktadır; Birinci yöntemde, ortamda bulunan karbonhidrat, yağ
ve protein gibi maddeler fermantasyona uğramakta ve yıkıma uğrayan bileşiklerden
aroma maddeleri üretilmektedir (de novo sentezi). İkinci yöntemde ise, ortama ilave
edilen ve reaksiyonu başlatan ön bileşiklerden (prekursör) az basamaklı
reaksiyonlarla aroma maddeleri üretilmektedir (Janssens ve ark., 1992).
Fermantasyonla üretimde karbon ve azot kaynaklarına ihtiyaç duyulurken,
mikrobiyel biyodönüşümde uygun bir substrat yeterli olmaktadır. Her iki yöntemin
genel özellikleri karşılaştırılarak Çizelge 2.1’de verilmiştir.
2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Murat YILMAZTEKİN
6
Çizelge 2.1. Fermantasyon ve mikrobiyel biyodönüşümlerin genel özellikleri(Winterhalter ve Schreier, 1993)
Özellik Fermantasyon Mikrobiyal biyodönüşüm
Mikroorganizmalar Çoğalan hücreler Çoğalma evresindeki ve durgun
evredeki hücreler
Reaksiyon Birden fazla reaksiyon Basit (tek veya birkaç basamaklı)
katalitik reaksiyonlar
Reaksiyon süresi Uzun Kısa
Substrat Ucuz karbon ve azot
kaynakları
Spesifik (bazen pahalı)
Ürün Doğal Doğal veya yapay
Ürün miktarı Az Yüksek
Ürünün
saflaştırılması
Zor Kolay
2.2.1.1. Fermantasyon Yoluyla Üretim
Fermantasyon, çok eski zamanlardan beri gıda biliminde sürekli kullanılan bir
yöntemdir. Biyokimyasal yönden fermantasyon, mikroorganizmalar tarafından
salgılanan enzimlerin organik maddelerde oluşturduğu parçalanma veya kimyasal
değişiklikler olarak tanımlanır (Canbaş, 1988). Biyoteknolojide ise, bir ürünün
mikroorganizma kültürleri vasıtasıyla uygun koşullarda üretilmesidir. Oluşan ürün
biyokütle, enzimler ve metabolitler olabildiği gibi, bazı bileşiklerin modifikasyonu
da gerçekleştirilebilmektedir (Stanbury ve ark., 1995). Aynı zamanda organik
asitlerin, antibiyotiklerin, amino asitlerin ve nükleik asit türevlerinin üretimi için de
uygun bir yöntemdir. Bu teknikte ucuz karbon ve azot kaynakları kullanılmakta ve
amaçlanan ürün, mikroorganizmaların karmaşık metabolik etkinlikleri sonucu
meydana gelmektedir (Korukluoğlu, 1998).
Mikroorganizmaların bazı aroma maddelerini sentezleyebilme yeteneğinde
oldukları uzun zamandan beri bilinmektedir. Üretiminde fermantasyonun temel rol
oynadığı şarap, bira, yoğurt, ekmek gibi birçok geleneksel gıdanın karakteristik
2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Murat YILMAZTEKİN
7
özelliğini ve aromasını mikroorganizmaların faaliyeti sonucunda oluşmaktadır
(Janssens ve ark., 1992). Mikroorganizmalar karbonhidrat, alkol, protein, yağ gibi
çeşitli maddeleri kullanarak aroma maddelerini üretebilmektedir. Fermantasyon
yoluyla aroma maddelerinin üretiminde yüzey kültür ve derin kültür yöntemleri
olmak üzere başlıca iki yöntem kullanılmaktadır (Berger, 1995). Yüzey kültür
yönteminde mikroorganizmalar sıvı, yarı katı veya katı substratların yüzeylerinde
gelişir. Bu sistemde metabolizma ürünü, mikroorganizma türüne göre hücre içinde
kaldığı gibi hücre dışına da salgılanabilir veya her iki halde de bulunabilir. Üretim
sırasında yüzey alanı arttırıldıkça havadan oksijen sağlanması ve mikroorganizmanın
substrat içerisinde homojen bir şekilde dağılımı daha kolay olmakta ve verimde artış
sağlanmaktadır (Pekin, 1993; Najafpour, 2007). Bu amaçla son yıllarda döner
tamburlu ve daldırmalı biyoreaktörler geliştirilmiştir (Longo ve Sanromán, 2006).
Derin kültür yönteminde ise mikroorganizmalar substratın içerisinde gelişir. Gereken
hava/gaz karışımı çoğunlukla uygun bir havalandırma düzeneği ile fermantasyon
ortamına verilir. Bu amaçla karıştırma ve havalandırma özelliğine sahip fermentörler
kullanılır (Pekin, 1993; Najafpour, 2007). Aroma üretiminde yüzey kültür yöntemi
daha yaygın kullanılır ve özellikle ucuz tarımsal atıklardan aroma eldesinde tercih
edilir. Kullanılan bu iki yöntem kıyaslanacak olursa, yüzey kültür yöntemi derin
kültür yöntemine göre düşük maliyetle daha yüksek verimde ve daha iyi özellikte
ürün elde edilmesini sağlamaktadır (Couto ve Sanromán, 2006). Fermantasyon
yoluyla aroma maddesi üretiminde izlenecek yol sırasıyla aşağıda verilmiştir (Şekil
2.1) (Stanbury ve ark., 1995).
-Fermantasyon ortamının formülasyonu veya bileşiminin belirlenmesi,
-Fermantasyon ortamının, fermentörün ve kullanılacak ekipmanların sterilizasyonu,
-Üretim fermentörünün aşılanması için yeterli miktarda aktif saf kültürün üretilmesi,
-Ürün oluşumu için fermentördeki mikroorganizmaların en uygun şartlarda
gelişmesi,
-Ürünün fermantasyon ortamından ekstraksiyonu ve saflaştırılması
-İşlem sonrası oluşan atıkların arıtılması.
2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Murat YILMAZTEKİN
8
Stokkültür Orbital
karıştırıcı Aşılamafermentörü
Üretimfermentörü
Biyokütle
Sıvı kısım
AtıklarınarıtılmasıÜrünün
saflaştırılması
Fermantasyonsıvısı
Hücreayırma
Ürün ekstraksiyonu
Ürününpaketlenmesi
Ortam hammaddesi
Ortamın formülasyonu
Ortamın sterilizasyonu
Mikroorganizmaların fermantasyon sırasında oluşturdukları başlıca aroma
maddeleri yüksek alkoller, esterler, uçucu asitler, karbonil bileşikleri, terpenler,
laktonlar, pirazinler ve kükürtlü bileşiklerdir (Reineccius, 2006).
Şekil 2.1. Tipik bir fermantasyon işlemi (Stanbury ve ark., 1995).
2.2.1.2. Biyodönüşüm Yoluyla Üretim
Mikroorganizmaların bir bileşiği yapısal yönden kendisine benzer başka bir
bileşiğe dönüştürmesi olayına mikrobiyel biyodönüşüm denir (Crueger ve Crueger,
1990). Bir başka deyişle, mikroorganizmalar tarafından katalizlenen kimyasal
dönüşümlerdir. (Telefoncu, 1995). Biyodönüşüm olayına en klasik örnek olarak
asetik asit bakterileri tarafından etil alkolden asetik asit üretimi gösterilebilir.
Günümüzde mikrobiyel biyodönüşümle üretilen birçok aroma maddesi olmasına
karşın bunların halen büyük çoğunluğu araştırma düzeyindedir. Bunlardan önemli
bulunanlar ve endüstriyel düzeyde üretilenler Çizelge 2.2’de verilmiştir.
2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Murat YILMAZTEKİN
9
Çizelge 2.2. Mikrobiyal biyodönüşümle üretilen bazı aroma maddeleriBileşik Mikroorganizma Substrat Oluşan koku
Vanilin Serratia Ferulik asit Vanilya
Amycolatopsis Öjenol
Pseudomonas İzoöjenol
γ-Dekalakton Candida Risinoleik asit Şeftali
Yarrowia
Sporobolomyces
Benzaldehit Ischnoderma L-Fenilalanin Badem
İzoamil asetat W. saturnus Amil alkol Muz
2-Feniletanol Saccharomyces L-Fenilalanin Gül benzeri
Kluyveromyces
Mikrobiyel biyodönüşüm sırasında gerçekleşen bazı reaksiyon türleri arasında
oksidasyon, hidroliz, esterleşme, dehidrasyon, fosforilasyon, C-C bağlarının
koparılması, indirgenme reaksiyonları gelmektedir. Biyodönüşümde genellikle verim
çok yüksektir. Verimi etkileyen faktörler arasında mikroorganizma türü, pH, sıcaklık,
hücre zarı geçirgenliği, ürün inhibisyonu, substratların ortamda çözünürlük derecesi
gibi özellikler sayılabilir. Birçok mikrobiyal biyodönüşüm olayında iki substrat
gereklidir. Bunlardan biri mikroorganizmaların gelişmesi için gereklidir. Diğeri ise,
dönüşüme uğrayacak substrattır. Mikroorganizma gelişimi için gerekli substrat doğal
kaynaklardan ucuz olarak karşılanabileceğinden maliyet düşürülmüş olur (Crueger
ve Crueger, 1990).
Biyoteknolojide kullanılan farklı mikrobiyal biyodönüşüm teknikleri vardır.
Bunlar;
Çoğalan hücreler ile biyodönüşüm: Hücreler ideal besi ortamında üretilir ve
yapılan testlerle belirlenen şekilde biyodönüşüme uğratılacak substrat ortama katılır,
2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Murat YILMAZTEKİN
10
Durgun evredeki hücreler ile biyodönüşüm: Mikroorganizma ideal
besiyerinde üretilir, filtrasyon veya santrifüj ile ayrıldıktan sonra biyodönüşüm
ortamına ilave edilir,
Sporlar ile biyodönüşüm: Küfler spor oluşumu için ideal koşullarda üretilir ve
sporlar misellerden ayrılıp soğukta saklanır. Biyodönüşüm yapılacağı zaman bu
sporlardan yararlanılır,
İmmobilize hücreler ile biyodönüşüm: Mikroorganizmalar ürün ve substratın
geçişine izin veren bir polimer matrikste (poliakrilamid, kapa-karragenan, alginat,
selüloz, nişasta vb.) tutuklanır veya bir polimere bağlanır. İmmobilize hücreler
istenildiği anda ortamdan uzaklaştırılabilir, yeniden kullanılabilir, kesikli ve kesiksiz
fermantasyonlara uygundur (Telefoncu, 1995).
Mikrobiyel biyodönüşüm yüksek substrat seçiciliği, az miktarda yan ürün
oluşumu ve asıl ürünün kolay izole edilmesi ve saflaştırılması gibi önemli avantajlara
sahip olması nedeniyle daha çok tercih edilmektedir. Bu yöntem aroma maddelerinin
yanında bazı katkı maddelerinin endüstriyel ölçekli üretimlerinde de sıklıkla
kullanılmaktadır (Xu ve ark., 2007).
2.2.2. Enzimatik Yolla Üretim
Enzimler mikrobiyel hücrelere nazaran substratların ürüne dönüşümünde
yüksek stereo- ve enantio-seçiciliğe sahip oldukları için aroma maddeleri üretiminde
etkin bir biçimde kullanım alanı bulmuşlardır (Berger, 1995). Lipazlar, esterazlar,
proteazlar, nükleazlar ve farklı glukozidazlar aroma bileşiklerinin ekstraksiyonu
işlemlerinde kullanılan enzimlerden bazılarıdır. Kofaktörden bağımsız olarak çalışan
bu enzimler hidroliz ve transesterifikasyon reaksiyonlarıyla optikçe saf alifatik ve
aromatik esterlerin ve laktonların üretiminde potansiyel oluşturmaktadırlar (Krings
ve Berger, 1998).
Enzimatik biyodönüşüm aroma üretiminde yaygın olarak kullanılmaktadır.
Bu yöntem yaygın olarak ester üretiminde kullanılmaktadır. Lipaz enzimi
kullanılarak asit ve alkolden ester sentezlenebilmektedir (Abbas ve Comeau, 2003).
2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Murat YILMAZTEKİN
11
Enzim katalizli reaksiyonların kimyasal katalizli reaksiyonlara göre bazı
önemli üstünlükleri vardır (Telefoncu, 1995). Bunlar;
Spesifiklik: Enzimatik reaksiyonlarda prensip olarak yan ürün oluşmaz (etki
spesifikliği) ve çoğu enzimler yalnız belirli bir substrat ile oluşan reaksiyonu
katalizlerler (substrat spesifikliği),
Reaksiyon Koşullarının Ilımlılığı: Enzimatik reaksiyonlar sulu ortamda nötral
pH dolayında ve genellikle 40 º C’ den daha düşük sıcaklıklarda gerçekleşir,
Aktivasyon Enerjisinin Düşürülmesi: Enzimatik reaksiyonlarda ara madde
katalizi mekanizması sonucu aktivasyon enerjisi çok düşmekte ve reaksiyon yüksek
hızla gerçekleşmektedir. Bu üstünlükler kimyasal olarak çok karmaşık yollardan
gerçekleştirilebilen veya hiç gerçekleştirilemeyen birçok reaksiyonun enzimler
yardımıyla kolayca yürümesine olanak sağlar.
2.3. Esterler
Aroma maddeleri arasında esterler ayrı bir öneme sahiptir. Organik
bileşiklerin önemli bir sınıfını oluşturan esterler farklı yollarla sentezlenirler. Alkol
ve karboksilik asitlerin reaksiyonu sonucu (esterifikasyon); açil gruplarının esterlerle
asitler arasında (asidiolizis), esterle alkoller arasında (alkolizis) ve esterlerin kendi
aralarında (transesterifikasyon) karşılıklı değişimi sonucu meydana
gelebilmektedirler. Uzun zincirli asitlerle alkoller arasında meydana gelen
reaksiyonlar sonucu oluşan esterler gıda, deterjan, kozmetik ve farmakoloji
endüstrilerinde katkı maddesi olarak kullanılmakta, kısa zincirli asitlerle alkollerin
ürünleri ise önemli aroma maddelerini oluşturmaktadır. Fermente içeceklerde en
büyük ve en önemli aroma maddeleri grubunu uçucu esterler oluştururlar. Uçucu
esterler kendi aralarında iki grupta toplanırlar. Birinci grup asetat esterleridir. En
önemlileri etil asetat, izoamil asetat ve feniletil asetat’tır. İkinci grup esterleri ise orta
zincirli yağ asidi etil esterleri oluşturur. Etil hekzanoat, etil oktanoat ve etil dekanoat
yağ asidi etil esterlerine örnek olarak verilebilirler (Verstrepen ve ark., 2003a).
Birçok alkol asetatları ticari olarak önemli bileşikler olup bunlardan etil asetat ve
2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Murat YILMAZTEKİN
12
izoamil asetat aroma sanayinde yaygın olarak kullanılmaktadır (Şekil 2.2). Özellikle
izoamil asetat keskin muz aroması vermesi nedeniyle gıda sanayinde tüketimi
oldukça fazladır ve yıllık üretimi 74 ton civarındadır (Krishna ve ark., 2001; Güvenç
ve ark., 2002; Buzzini ve ark., 2003).
O
O
O
O
O
O
Etil asetat İzoamil asetat Feniletil asetat
O
O
O
O
İzobütil asetat Etil kaproat
Şekil 2.2. Aroma sanayinde kullanılan bazı önemli esterler (Verstrepen ve ark.,2003a).
2.3.1. Biyoteknolojik Yollarla Esterlerin Üretimi
Esterlerin doğal formları oldukça pahalı ve zor temin edilirler. Kimyasal
olarak sentezlenenler ise ucuz ama doğal olmadıkları için tercih edilmemektedir
(Vadali ve ark., 2004). Bu nedenle son dönemlerde bu aroma maddelerinin doğal
formlarının enzim ve mikroorganizmalar yardımıyla üretimi üzerine yapılan
çalışmalar artmıştır. Özellikle esterazlar ve lipazlarla üretimleri üzerine yapılmış
çalışmalar fazladır (Horton ve ark., 2003). Genellikle farklı kaynaklardan elde edilen
serbest ve immobilize lipazlarla organik çözücülerde üretimleri üzerine çalışmalar
yapılmıştır. Güvenç ve ark. (2002), Mucor miehei’ den elde ettikleri serbest lipazları
kullanarak heptan içerisinde esterifikasyonla 37˚C’de 24 saat içerisinde 26 g/L (% 80
verimle) izoamil asetat elde edildiğini ve Candida cylindraccea’dan elde edilen
2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Murat YILMAZTEKİN
13
immobilize lipazlarla hekzan içerisinde, 30˚C’ de 24 saatlik bir süre sonunda % 100
verimle (17 g/L) izoamil asetat üretiminin gerçekleştirildiğini bildirmişlerdir.
2.3.2. Esterlerin Oluşum Mekanizması
Esterler, kimyasal veya biyokimyasal yolla sentezlenirler (Şekil 2.3).
Kimyasal yol, yani alkol ve asit arasındaki basit ve kondensasyon reaksiyonu ile
oluşum oldukça yavaştır. Bu nedenle, esterler mikroorganizmalar tarafından
genellikle biyokimyasal yolla üretilir (Şekil 2.4).
- Kimyasal sentez (kondensasyon reaksiyonu):
R’-OH + R-COOH R-COO-R’ + H2O
- Biyokimyasal sentez (alkol asetiltransferaz reaksiyonu):
R’-OH + R-CO ~ SCoA R-COO-R’ + CoASH
Şekil 2.3. Esterlerin kimyasal ve biyokimyasal yolla sentezlenmesi (Mason veDufour, 2000).
Maya hücresi esterleri, alkol ve asetil koenzim A arasında meydana gelen ve
çeşitli enzimler tarafından katalizlenen reaksiyonlar sonucunda oluşturur (Peddie,
1990; Mason ve Dufour, 2000; Quilter ve ark., 2003; Verstrepen ve ark., 2003a).
Ester üretiminde etkili olan en önemli enzimler ATF1 ve ATF2 genleri ile kodlanan
alkol asetiltransferazlardır (AATaz I ve AATaz II; EC 2.3.1.84). Ester üretiminden
sorumlu olan enzimlerle esterleri hidroliz eden esterazlar arasındaki denge, oluşan
net ester miktarı açısından önemlidir. Bu yüzden, esteraz aktivitesindeki artış oluşan
ester miktarında düşüşlere neden olabilmektedir (Verstrepen ve ark., 2003a). S.
cerevisiae ile izoamil asetat ve etil asetat gibi asetat esterlerinin üretiminde alkol
asetiltransferaz, etanol asetiltransferaz ve izoamil alkol asetiltransferaz olmak üzere
2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Murat YILMAZTEKİN
14
üç farklı enzimin rol oynadığı bildirilmektedir (Peddie, 1990; Erten ve Canbaş,
2003).
Şekil 2.4. Mayalarda ester oluşumunun biyokimyası (Verstrepen ve ark., 2003a).
Mayaların esterleri neden oluşturduğu konusunda kesin bir bilgi
bulunmamaktadır. Ancak bu konuda çeşitli varsayımlar ileri sürülmüştür (Peddie,
1990; Dufour ve Malcorps, 1995). Bu varsayımlara göre;
1. Esterler, alkol fermantasyonu sırasında şekerlerin metabolizmasından ortaya
çıkan bileşikler olabilir ve hücre için önemli değillerdir,
2. Ester oluşumu asetil yükünün kontrolü açısından önemli olabilir, çünkü asetil
koenzim A ve serbest-koenzim A miktarları ara reaksiyonlar için önemlidir,
3. Ester üretimi, toksik maddeleri uzaklaştırma mekanizması ile ilgili olabilir;
özellikle C8-C14 arasındaki yağ asitleri maya için toksiktir; ester oluşumu ile bu yağ
asitlerinin maya hücresine olumsuz etkileri ortadan kaldırılır.
Fermantasyonun başlangıcında yani logaritmik çoğalma evresinde esterlerin
sentezi oldukça düşüktür. Bunun sebebi, maya gelişimi için asetil koenzim A’ya
duyulan metabolik ihtiyaçtır. Oksijen ve asetil koenzim A doymamış yağ asitlerinin
Azotmetabolizması
Yüksekalkol
Şeker ve lipidmetabolizması
Asetil koenzim A
OksijenDoymamış yağ asitleri Fermente edilebilir şeker
Azot
Ester
Ester
AATaz genleri(ATF 1, ATF 2)
Ester sintaz
2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Murat YILMAZTEKİN
15
ve sterollerin üretiminde hızla tüketilir. Daha sonra, doymamış yağ asitleri ve
sterollerin üretimi ile ester üretimi için kullanılan asetil koenzim A miktarı
dengelenir. Bu evre ester üretiminin ilk aşamasını oluşturur ve fermantasyonun ilk
sekiz saatinde gerçekleşir. Yağ asitlerinin ve sterollerin sentezi sona erdiğinde
ortamdaki asetil koenzim A miktarı (ve asetil yükü) artar ve en yüksek seviyesine
ulaşır. Kısa süren bu evre ise, ester oluşumun ikinci aşamasını oluşturur ve
fermantasyonun ortalarında (yirminci ve otuzuncu saatler arası) yani durgun evrede
görülür. Ancak, esterlerin büyük bir kısmı bu aşamada oluşturulur (Peddie, 1990).
2.3.3. Ester Oluşumunu Etkileyen Faktörler
Fermantasyon işlemlerinde esterlerin oluşumuna etki eden birçok teknolojik
parametre vardır. Bu parametreler Çizelge 2.3’te verilmiştir.
Çizelge 2.3. Fermantasyon sırasında ester oluşumunu etkileyen faktörler (Dufour veMalcorps, 1995)
Maya Karakteristiği Ortam bileşimi Fermantasyon koşulları
Maya türü Lipidler Sıcaklık
Fizyolojik durum Oksijen Basınç
Aşılama oranı Şeker içeriği Karıştırma
Kullanılabilir azot Fermentör dizaynı
Çinko Fermantasyon yöntemi
2.3.3.1. Maya cinsi
Maya ester üretimini etkileyen önemli faktörler arasındadır. Her mayanın
kendine has karakteristik ester profili vardır ve bazı esterleri diğerlerinden fazla
üretebilmektedirler (Peddie, 1990). Mayalar arasındaki ester üretim farklılıkları ise
büyük ölçüde mayalardaki AATaz aktiviteleri ile ilişkilendirilmektedir. Bu yüzden
mayalar arasındaki bu tip genetik farklılıklar ester üretiminin optimizasyonunda bir
2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Murat YILMAZTEKİN
16
kriter olarak kullanılmaktadır (Verstrepen ve ark., 2003a). Ortama aşılanan maya
miktarının artması üretilen ester miktarını azaltmaktadır. Peddie (1990), aşılanan
maya miktarının normal miktarın iki katı olması durumunda sadece etil asetat
miktarında önemsiz artışlara neden olduğunu bildirmiştir. Quilter ve ark. (2003) ise,
ortama aşılanan maya miktarında 12 g/L’lik bir artışın sadece izoamil asetat ve amil
alkol miktarlarında çok az bir artışa neden olduğunu belirlemiştir. Pichia ve
Hanseniaspora cinsine ait mayaların etil alkol, jeraniol, izoamil alkol ve 2-
feniletanol gibi alkollerin esterifikasyonunu sağlayarak meyvemsi aromaya sahip
esterleri üretirken (Mingorance-Cazorla ve ark., 2003), benzer şekilde, Williopsis,
Candida, Debaryomyces, Hanseniaspora ve Issatchenkia cinslerine ait mayaların
kullanıldığı fermantasyonlarda izoamil alkol ve izoamil asetat’ın uçucu bileşikler
arasında en yüksek konsantrasyona sahip bileşikler olduğu belirlenmiştir (Buzzini ve
ark., 2003). Kluyveromyces marxianus’un ise elma posası, melas, ayçiçeği kepeği ve
hurma kepeği gibi farklı ortamlarda fermantasyonla aroma bileşiklerini ürettiği
belirlenmiş ve üretilen bileşikler arasında en fazla etil asetat, etanol ve asetaldehite
rastlanmıştır (Medeiros ve ark., 2000). Farklı maya türleri tarafından üretilen çeşitli
esterler Çizelge 2.4’te verilmiştir.
2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Murat YILMAZTEKİN
17
Çizelge 2.4. Farklı maya türleri tarafından üretilen esterler (mg/L) (Fleet ve Heard,1993; Erten, 1997; Erten ve Campbell, 2001; Zöhre ve Erten, 2003)
Maya türleriEtil
asetat
İzobütil
asetat
Etil
bütirat
İzoamil
asetat
Etil
hekzanoat
Etil
oktanoat
S. cerevisiae 6-970 0.1-0.4 0.05-3.7 0.1-16 0.01-3.2 0.01-1.5
Kloeckera
apiculata 25-870 0.2 - 0.04-5 0.02-1 0.04-0.8
Hansenula
(Pichia*)
anomala
137-
2150 - - 1-11 - -
P. fermentans 92-554 0.04-0.8 0.04-0.4 0.5-9 0.75 1.3
P.
membranefaciens 30 - - - - -
Hansenula
(Pichia*)
subpelliculosa 21 - - - - -
Hansenula
(Williopsis*)
saturnus 385 - - 27 - -
*KURTZMAN, 1998’a göre
2.3.3.2. Ortam bileşimi
Fermantasyon ortamında bulunan lipitler ester oluşumunu etkileyen faktörler
arasında yer alır. Oleik, linoleik ve linolenik gibi doymamış yağ asitlerini fazla
miktarda içeren fermantasyon ortamlarında sentezlenen ester miktarı düşük
olmaktadır ve bu durumun birkaç nedeninin olduğu tahmin edilmektedir. Bunlar;
doymamış yağ asitlerinin hücreye alınması sırasında hücre membranının
geçirgenliğinin değişmesi, ATTaz enziminin aktivitesinde azalma ve doymamış yağ
asitlerinin hücre gelişimini teşvik ederek ortamda ester sentezi için yeterli miktarda
asetil koenzim A’nın bulunmamasına yol açmasıdır (Peddie, 1990; Dufour ve
Malcorps, 1995). Dufour ve Malcorps (1995), bira şırasına 178 μM linoleik asit
2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Murat YILMAZTEKİN
18
ilavesinden sonra oluşan etil asetat miktarında yaklaşık % 80 oranında bir düşüş
olduğunu belirlemişlerdir.
Fermantasyon ortamında bulunan toplam şeker miktarının yanında, fermente
olabilir şeker içeriği de ester oluşumunu etkiler. Genellikle yüksek glukoz ve fruktoz
içeriğine sahip ortamlarda yüksek maltoz içeren ortamlara nazaran daha fazla ester
oluşumu gözlenmiştir. Bunun sebebi henüz açığa kavuşturulmuş değildir. Fakat,
glukoz metabolizmasında yüksek seviyelerde asetil koenzim A üretiminin
gerçekleştiği ve böylece ester üretiminde artış olduğu tahmin edilmektedir. Diğer
varsayımlar ise, glukoz içeren ortamda gelişen hücrelerin daha fazla yüksek alkol
ürettikleri veya glukozun AATaz’ı kodlayan ATF1 ve ATF2 genlerini daha fazla
açığa çıkardığı doğrultusundadır (Younis ve Stewart, 1998; Verstrepen ve ark.,
2003b). Plata ve ark. (2003), farklı kaynaklardan elde edilen P. subpelliculosa,
Kluyveromyces marxianus, Torulaspora delbrueckii ve S. cerevisiae türlerine ait
mayalarla, fermente edilebilir şeker olarak 250 g/L glukoz içeren sentetik şırada
gerçekleştirilen fermantasyon denemelerinde en yüksek izoamil asetat ve etil asetat
üretiminin fermantasyonun ilk 72 saatinde gerçekleştiğini bildirmişlerdir. Ester
üretiminin fermantasyonun ilk safhasında gerçekleşmesinin muhtemel nedeni olarak
AATaz enziminin aktivitesinden kaynaklandığı ileri sürülmüştür. Diğer bir çalışmada
ise, melasta S. cerevisiae ile gerçekleştirilen fermantasyonlarda, ortam yoğunluğu
yani şeker içeriği arttıkça izoamil asetat miktarının 4.2 mg/L’den 17.4 mg/L’ye
yükseldiği belirlenmiştir (Quilter ve ark., 2003).
2.3.3.3. Sıcaklık
Sıcaklık ester oluşumunu etkileyen önemli faktörlerden biridir. Genellikle 10-
25 ºC aralığında artan ortam sıcaklığı üretilen ester miktarını arttırmıştır. 12 ºC’de
üretilen ester miktarının 10 ºC’de üretilen ester miktarından % 75 oranında daha
fazla olduğu bildirilmiştir. Aynı şekilde, ortam sıcaklığı 10 ºC’den 16 ºC’ye
çıkarıldığında üretilen ester miktarındaki artış % 40-50 olarak bulunmuştur (Peddie,
1990; Verstrepen ve ark., 2003a). Fakat mayalar, farklı ester türleri göz önüne
2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Murat YILMAZTEKİN
19
alındığında farklı sıcaklık profilleri gösterirler. Etil asetat ve 2-feniletil asetat 20
ºC’de en fazla üretilirken, izoamil asetat ve etil kaprilat 15 ºC’de en yüksek verimle
üretilmektedir. Ancak, elde edilen bu bulgular bütün mayalar için söz konusu
değildir. Ester üretimindeki bu değişim, muhtemelen farklı sıcaklıklarda değişen
AATaz aktivitesine bağlıdır (Verstrepen ve ark., 2003a). Peddie (1990) ise bu
durumu sıcaklıkla beraber hücre membranı geçirgenliğinin artması ve dolayısıyla
hücre dışına salınan ester miktarın artması olarak açıklamaktadır. Sıcaklığın artması
ile ester üretimindeki artışa, ortamda fazla miktarda oluşan yüksek alkolün neden
olabileceği de bir diğer görüştür. Yüksek sıcaklıklarda gerçekleştirilen
fermantasyonlarda ise, buharlaşmaya bağlı olarak uçucu özellikteki esterlerin
miktarlarında azalma olabilmektedir. Ancak bu olay, fermantasyon sonuna doğru
yani, ester konsantrasyonunun yüksek olduğu durumlarda söz konusu olabilmektedir
(Verstrepen ve ark., 2003a).
2.3.3.4. Havalandırma
Fermantasyon ortamında bulunan çözünmüş oksijen uçucu esterlerin
oluşumunu baskılamaktadır. Oksijen maya gelişimini ve dolayısıyla asetil koenzim
A’nın kullanılabilirliğini etkilemektedir. AATaz enzimini kodlayan ATF1 ve ATF2
genleri oksijen tarafından baskılanmakta, dolayısıyla düşen AATaz miktarı ile
paralel olarak ester üretiminde düşüşler meydana gelmektedir. Diğer taraftan, oksijen
miktarı düşük olduğu zaman (<1 mg/L) maya gelişimi yetersiz olmakta ve buna bağlı
olarak ester üretiminde azalmalar görülmektedir (Verstrepen ve ark., 2003a). Çünkü,
oksijen maya gelişimi için gerekli olan doymamış yağ asitlerinin ve sterollerin
sentezi için gereklidir. Havalandırma sonucu maya hücresi lipidlerin, proteinlerin ve
nükleik asitlerin sentezi için daha fazla asetil koenzim A’ya ihtiyaç duyar ve
dolayısıyla ortamda ester oluşumu için yeterli asetil koenzim A bulunmadığından
ester üretimi azalır (Peddie, 1990; Erten, 1997). Ester üretiminde maksimum verime
ancak belirli oksijen seviyelerinde ulaşılır (Verstrepen ve ark., 2003a). Pichia ve
Williopsis cinsine ait mayalarla düşük alkollü şarap üretimi üzerine yapılan bir
2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Murat YILMAZTEKİN
20
çalışmada, P. anomala, P. subpelliculosa ve W. saturnus türlerinin havalandırmasız
fermantasyon koşullarında yüksek miktarlarda etil asetat ürettikleri, buna karşın
havalandırmalı koşullarda üretilen etil asetat miktarının daha az olduğu
belirlenmiştir. Aynı sonuca izoamil asetat için de varılmıştır. Elde edilen bulgular
Çizelge 2.5 ve Çizelge 2.6’da verilmiştir (Erten, 1997; Erten ve Campbell, 2001). Bu
çalışmada W. saturnus türü ile elde edilen sonuçlarda, etil asetat’ın aksine izoamil
asetat üretimi karıştırmalı fermantasyonlarda statik fermantasyonlara göre daha fazla
bulunmuştur. Ester oluşumunda önemli rol oynayan asetil koenzim A farklı
fermantasyon koşullarında farklı şekillerde kullanılabilmektedir. W. saturnus izoamil
asetat sentezinde rol alan izoamil alkolü yüksek miktarlarda üretmiştir. Karıştırmalı
fermantasyon koşullarında izoamil asetat miktarının artması muhtemelen fazla
miktarda üretilen izoamil alkolden kaynaklanmaktadır. Etil asetat ve izoamil asetat
miktarları fermantasyonun belirli evrelerinde maksimuma ulaşmış ve daha sonra
düşmeye başlamıştır. Üretilen ester miktarındaki düşüşün ise, ortamda bulunan ester
sentezinden sorumlu enzimlerin ters çalışarak oluşan esterleri metabolize
etmelerinden kaynaklandığı bildirilmiştir (Dufuor ve Malcorps, 1995; Erten, 1997).
Yapılan diğer bir çalışmada ise, P. anomala türü havalandırmalı şartlarda 48
saat sonunda 4143 mg/L etil asetat ve 1.93 mg/L izoamil asetat üretirken,
havalandırmanın kısıtlı olduğu şartlarda etil asetat üretimi 668.6 mg/L ile sınırlı
kalmış, izoamil asetat ise belirlenememiştir (Rojas ve ark., 2001). Valero ve ark.
(2002), yaptıkları çalışmada şarap fermantasyonundan önce cibreyi havalandırmanın
fermantasyon sırasında yüksek alkol ve ester üretimine etkisini araştırmışlardır. Elde
edilen sonuçlara göre, fermantasyondan önce havalandırılan cibrelerden elde edilen
şaraplardaki yüksek alkol ve ester miktarı, kontrol şarabındaki yüksek alkol ve ester
miktarından daha fazla bulunmuştur.
2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Murat YILMAZTEKİN
21
Çizelge 2.5. Aerobik mayalar tarafından farklı fermantasyon koşullarında üretilenşaraplarda tespit edilen etil asetat miktarları (Erten, 1997; Erten veCampbell, 2001)
Üretilen etil asetat miktarı (mg/L)Fermantasyon
Koşulları W P 1 P 2 P 3 S
GJ 20 13 ºC S 200 656 3810 5.5 39
GJ 20 20 ºC S 183 337 3460 6.8 20
GJ 20 A 22 303 732 1 -
GJ 20 F 701 988 2400 13 28
GJ 15 F 456 1730 3600 36 13
GJ 10 F 1000 2110 3650 36 15
GJ 6 F 510 2220 3560 27 9.6
GJ 6, 10, 15, 20: % 6, 10, 15 ve 20 (w/w) şeker içeriğine sahip şıralar. F: Statik fermantasyon, S:Karıştırmalı fermantasyon, A: Havalandırmalı ve karıştırmalı fermantasyon. P1: P. subpelliculosa, P2:P. anomala, P3: P. membranaefaciens, W: W. saturnus, S: S. cerevisiae.
Çizelge 2.6. Aerobik mayalar tarafından farklı fermantasyon koşullarında üretilenşaraplarda tespit edilen izoamil asetat miktarları (Erten, 1997; Erten veCampbell, 2001)
Üretilen izoamil asetat miktarı (mg/L)Fermantasyon
Koşulları W P 1 P 2 P 3 S
GJ 20 13 ºC S 7 0.2 1.3 n.d. 0.5
GJ 20 20 ºC S 3 0.4 0.9 n.d. 0.4
GJ 20 A 0.2 0.7 0.4 n.d. -
GJ 20 F 2.7 0.1 0.5 n.d. 0.8
GJ 15 F 1.8 0.2 0.6 n.d. 0.6
GJ 10 F 3.1 0.3 0.6 n.d. 0.2
GJ 6 F 2.6 0.2 0.3 n.d. 0.1
GJ 6, 10, 15, 20: % 6, 10, 15 ve 20 (w/w) şeker içeriğine sahip şıralar. F: Statik fermantasyon, S:Karıştırmalı fermantasyon, A: Havalandırmalı ve karıştırmalı fermantasyon. P1: P. subpelliculosa, P2:P. anomala, P3: P. membranaefaciens, W: W. saturnus, S: S. cerevisiae.
2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Murat YILMAZTEKİN
22
2.3.3.5. Substrat Miktarı
Ester oluşumunda substrat olarak rol oynayan asetil koenzim A ile yüksek
alkollerin konsantrasyonları ve ester oluşumunda ve yıkımında etkili olan enzimlerin
toplam aktiviteleri ester oluşumu için çok önemlidir. Bu nedenle, substrat
konsantrasyonunu ve enzim aktivitesini etkileyen tüm faktörler ester üretimini
etkilemektedir. Sıcaklık, doymamış yağ asidi miktarı, azot ve oksijen seviyeleri
ortamdaki asetil koenzim A miktarını etkilemektedir (Verstrepen ve ark., 2003a).
Bazı araştırmacılar ortamdaki oksijenin, katı maddelerin ve lipitlerin maya gelişimini
ve dolayısıyla asetil koenzim A kullanımını arttıracağından ester üretimi için gerekli
asetil koenzim A miktarında da azalmaya yol açabileceğini bildirmişlerdir (Thurston
ve ark., 1982). Yoshioka ve Hashimoto (1984) ise, fermantasyon koşullarının asetil
koenzim A miktarı üzerinde etkili olmadığını savunmuşlardır. Ortamdaki diğer bir
sınırlayıcı faktör olan yüksek alkollerin konsantrasyonları ester üretiminde etkili
olabilmektedir. Fermantasyon ortamına 3-metil bütanol ilavesinin izoamil asetat
üretimini arttırdığı belirlenmiştir. Fakat, ester oluşumunu sadece ortamdaki yüksek
alkol miktarıyla ilişkilendirmek doğru değildir. Örneğin, yüksek oksijen ve
doymamış yağ asidi miktarları, yüksek alkol miktarını arttırırken ester üretimini
azaltmaktadır (Verstrepen ve ark., 2003a).
Mayalarda yüksek alkol üretimi ile amino asit metabolizması arasındaki ilişki
birçok çalışmaya konu olmuştur. Mayalar özellikle izoamil asetat’ı ve bazı uçucu
asetatları yüksek alkollerden üretebilmektedir. Valin, lösin ve izolösin amino asitleri
bu asetatların doğal ön bileşikleri olup mayalar tarafından sırasıyla izobütanol, 2-
metil-1-bütanol ve 3-metil-1-bütanol gibi yüksek alkollere metabolize edilmekte ve
yüksek alkoller de AATaz’lar tarafından katalizlenerek sırasıyla izobütil asetat, 2-
metilbütil asetat ve 3-metilbütil asetat üretilmektedir. (Janssens ve ark., 1989; Gent
ve Slaughter, 1994; Verstrepen ve ark., 2003a). Geotrichum klebahnii mayasının, hoş
kokulu meyve aromasına sahip dallanmış karboksilik asitlerin etil esterlerini ürettiği,
özellikle izolösin ilavesi ile etil-2-metilbütirat’ın esas ürün olarak elde edildiği;
Geotrichum fragrans mayasının ise, L-lösin’i oksidatif deaminasyon yoluyla
2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Murat YILMAZTEKİN
23
metabolize ederek etil alkol varlığında etilizovalerat ürettiği belirlenmiştir
(Vandamme ve Soetaert, 2002; Vandamme, 2003).
2.4. Biyoteknolojik Yolla Aroma Üretiminde Gıda Sanayi Artıklarının
Kullanımı
Biyoteknolojik işlemlerde önemli hususlardan biri üretimin endüstriyel
boyutta uygulanıp uygulanamayacağıdır. Endüstriyel ölçekte bir üretimin
yapılabilmesi için de göz önüne alınması gereken en önemli konu üretim
maliyetleridir. Karşılaşılan en önemli sorunlar arasında genellikle hammadde
maliyetinin yüksek oluşu, düşük ürün konsantrasyonu ve ürün saflaştırma maliyeti
gelmektedir.
Endüstriyel boyutta gerçekleştirilen fermantasyonlarda toplam üretim
maliyetinin yaklaşık % 30’unu hammadde teşkil eder (Rivas ve ark., 2004; Lee,
2005). Özellikle büyük çaplı üretimlerde kullanılacak hamaddenin çok ucuz olması
istenir. Bu tip proseslerde karbon ve azot kaynağı olarak genellikle tarım, orman ve
kimya endüstrisi yan ürünleri kullanılmaktadır (Miller ve Churchill, 1986).
Kullanılan karbon kaynakları arasında ise şeker pancarı ve şeker kamışından elde
edilen melas ilk sırayı almaktadır (Hahn-Hagerdal ve ark., 2005).
Dünyada üretilen gıdaların yaklaşık % 30’u daha tüketiciye ulaşmadan
bozulmaktadır. Gıda üretim işlemlerinde oluşan artıklar da göz önüne alındığında
büyük bir ekonomik kayıp ve çevre kirliliği tehlikesi karşımıza bir sorun olarak
çıkmaktadır. Bu artıkların yok edilmesi ise büyük maliyet gerektirmektedir (Stanbury
ve ark., 1995). Gıda artıklarının çoğunu meyve ve sebzelerin kabukları ve
çekirdekleri, hayvan ve balık artıkları, karbonhidratça zengin hububat artıkları,
tarımsal artıklar (buğday, mısır, şeker kamışı, melas, peynir altı suyu, patates v.b.) ve
fermantasyon endüstrisi artıkları oluşturmaktadır. Bu artıklar içerik bakımından
büyük bir enerji potansiyeli oluşturmaktadır (Lee, 1996). Biyoteknolojik işlemlerde
hammadde olarak kullanılan en elverişli substratlardan biri gıda artıklarıdır. Bu
nedenle, gıda artıklarının özellikle aroma maddelerinin üretimi için substrat olarak
2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Murat YILMAZTEKİN
24
kullanılması son dönemlerde yoğunluk kazanmıştır. Çizelge 2.7’de aroma
maddelerinin üretiminde kullanılan bazı gıda artıkları verilmiştir (Laufanberg ve ark.,
2003).
Çizelge 2.7. Aroma maddelerinin üretiminde kullanılan bazı gıda sanayi artıkları(Laufanberg ve ark., 2003)
SubstratAroma maddesi
(karakteristiği)Mikroorganizma
Elma posası, küspe,
havuç posası
Etil bütirat (ananas), Etil
pentaonat (elma), İzoamil
asetat (muz)
Ceratocystis fimbriata
Şeker pancarı pulpu Vanilin Pycnoporus cinnabarinus,
Aspergillus niger
Risin yağı keki γ – Dekalakton (şeftali) Yarrowia lipolytica
Pycnoporus pulmonarius
Hint yağı keki 6-Pentil-α-piron
(Hindistan cevizi)
Trichoderma harzanium
Zeytin presi keki δ – Dekalakton Ceratocystis moniliformis
Soya fasulyesi kepeği Pirazin (kızartma kokusu) Bacillus subtilis
2.4.1. Melas
Biyoteknolojik işlemlerde, özellikle ekmek mayası üretiminde substrat olarak
kullanılabilecek hammaddelerden biri, şeker pancarı ve şeker kamışından şeker
üretiminde kristalizasyon aşamasından sonra yan ürün olarak elde edilen melastır.
Diğer şekerli hammaddelerden daha ucuz olan melas koyu renkli ve kıvamlı bir
şurup olup; içeriğinde su, % 47-60 oranında toplam şeker (sakkaroz), protein,
vitamin, amino asitler, organik asitler ve demir, bakır, çinko, manganez, magnezyum,
ve kalsiyum gibi ağır metaller vardır (Canbaş, 1995; Roukas, 1998; Waites ve ark.,
2001; Kalogiannis ve ark., 2003; Göksungur ve ark., 2004). Şeker pancarından elde
edilen melasın kimyasal bileşimi Çizelge 2.8’de verilmiştir. Bileşimi yıllara ve şeker
2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Murat YILMAZTEKİN
25
fabrikalarına göre değişmektedir. Özellikle içerdiği pantotenik asit, inositol, bazı
elementler ve az miktarda biotinden dolayı fermantasyon işlemlerinde kullanımı
oldukça yaygındır (Kalogiannis ve ark., 2003). Son yıllarda, proteince zengin hayvan
yemi, enzim, amino asit, organik asit, farmakolojik ürünler ve özellikle aroma
maddeleri melasın substrat olarak kullanıldığı biyoteknolojik yöntemlerle üretilmekte
ve bu alanda yapılan çalışmalar giderek artmaktadır (Pandey ve ark., 2000).
Çizelge 2.8. Şeker pancarı melasının kimyasal bileşimi (Curtin, 1983; Keshk ve ark.,2006)
Parametre Bileşim
Briks (Toplam çözünmüş madde) (%) 80-83
İndirgen şeker (%) 0.1-2.7
Toplam şeker (%) 48-57
Toplam kurumadde (%) 73-79
Kül (%) 8-10
Kalsiyum (%) 0.2-0.5
Fosfor (%) 0.05-0.3
Potasyum (%) 3-5
Sodyum (%) 1
Sülfür (%) 0.5
Protein (%) 11-12
Özgül ağırlık 1.40
pH 5-7
Fermente edilebilir şeker kaynağı olarak kullanılan melasın fermantasyonu
sırasında, içerisinde doğal olarak bulunan amino asitlerin deaminasyonu sonucu fuzel
yağı olarak ta bilinen yüksek alkoller oluşur. Aroma endüstrisi için önemli doğal
hammaddeleri oluşturan bu yüksek alkoller arasında 2-metil-1-butanol, 3-metil-1-
butanol, 1-propanol ve feniletanol gelir. Bu yüksek alkoller kısmi distilasyonla
ayrılabildiği gibi, fermantasyon sırasında kendi asitlerine de dönüşebilmektedir.
Örnek olarak 2-metil-1-butanolun, aynı zamanda önemli bir aroma maddesi olan, 2-
2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Murat YILMAZTEKİN
26
metil-1-butirik asite dönüşümü verilebilir. Bu dönüşümler sırasında meydana gelen
ara ürünlerden biride aldehitlerdir ve bu bileşikler de yine önemli aroma maddelerini
oluştururlar. Meydana gelen asitlerin yüksek alkollerle esterifikasyonu sonucu ise
aroma aktif esterler oluşur (Gatfield ve ark., 2003).
2.4.2. Fuzel Yağı
Fermantasyonla etil alkol üretiminde damıtma işlemi son derece önemli bir
aşamadır. Damıtma işleminin sonunda elde edilen yan ürünlerden biri de, fuzel yağı
olarak da adlandırılan ve amil alkolleri fazla miktarda içeren kısımdır. Bileşiminde
yaklaşık olarak 390 g/L izoamil alkol, 158 g/L izobütil alkol, 28.4 g/L etil alkol, 16.6
g/L metil alkol, 11.9 g/L propil alkol bulunmakta ve bu bileşikler toplam ağırlığın %
77 sini oluşturmaktadır (Perez ve ark., 2001). Fuzel yağı bu zengin bileşiminden
dolayı bazı kimyasal bileşiklerin üretilmesi için kullanılabilen ve çok ucuz temin
edilebilen bir hammadde olarak değerlendirilmektedir. Mayalar özellikle izoamil
asetatı ve bazı uçucu asetatları yüksek alkollerden üretebilmektedir. Bu durumda,
ucuz bir yan ürün olan fuzel yağı izoamil asetat üretimi için önemli bir hammadde
olabilecek niteliktedir.
Ortama substrat olarak ilave edilen yüksek alkollerin W. saturnus mayası
tarafından biyodönüşüm yoluyla asetatlara dönüştürüldüğü ve 3-metilbütanol’ün en
hızlı ve en yüksek verimle esterleştirildiği belirlenmiştir. İzoamil asetat, üretilen
esterler arasında en yüksek verime (% 91) sahiptir. Üretilen ester miktarının
biyodönüşümde kullanılan karbon ve azot kaynaklarına ve ortama ilave edilen
spesifik ön bileşiklerin özelliklerine bağlı olduğu ve aynı zamanda biyodönüşümün
kontrollü şartlarda (sıcaklık ve havalandırma gibi) gerçekleştirilmesinin önemli
olduğu belirlenmiştir (Janssens ve ark., 1987; Janssens ve ark., 1989). Quilter ve ark.
(2003) tarafından S. cerevisiae ile yapılan çalışmada, melas içeren fermantasyon
ortamına fuzel yağı (% 54.5 amil alkol, % 17.8 2-metil bütanol, % 11.2 izobütanol,
% 9.6 propanol) ilavesinin ester üretimine etkisi araştırılmıştır. Ortama ilave edilen
fuzel yağının izoamil asetat üretiminde 4.4 kat artışa neden olduğu tespit edilmiştir.
3. MATERYAL ve METOT Murat YILMAZTEKİN
27
3. MATERYAL ve METOT
3.1. Materyal
3.1.1. Mayalar
İzoamil asetat üretim denemelerinde W. saturnus HUT 7087 (Japonya), W.
saturnus IAM 12217 (Japonya), W. saturnus NCYC 22 (İngiltere), etil asetat
denemelerinde P. anomala NCYC 432 (İngiltere) ve P. subpelliculosa NCYC 436
(İngiltere) mayaları kullanılmıştır. Kültür koleksiyonlarından liyofilize halde temin
edilen mayalar MEB içeren sıvı besiyerinde aktif hale getirilmiş ve MEA içeren katı
besiyerinde çoğaltılmıştır. Kültürler aynı besiyerini içeren yatık agarlarda + 4 ºC’de
muhafaza edilmiş ve her altı ayda bir yenilenmiştir.
3.1.2. Besiyerleri ve Kimyasallar
Mayaların aktif hale getirilmesinde, çoğaltılmasında ve saklanmasında MEB
(Merck) ve MEA (Merck) kullanılmıştır. Fermantasyon ortamının hazırlanmasında
kullanılan H2SO4, NaOH ve örneklerin etil alkol ve aroma maddeleri analizlerinde
kullanılan etil alkol, 1-butanol, 3-pentanol, 2-metil-1-butanol (aktif amil alkol), 3-
metil-1-butanol (izoamil alkol), izoamil asetat ve etil asetat Merck firmasından temin
edilmiştir.
3.1.3. Melas
Fermantasyon ortamı olarak kullanılan melas Özmaya A.Ş. (Ceyhan,
Adana)’dan temin edilmiştir. Denemelerde kullanılan melasın fiziksel ve kimyasal
özellikleri Çizelge 3.1’de verilmiştir.
3. MATERYAL ve METOT Murat YILMAZTEKİN
28
Çizelge 3.1. Melasın fiziksel ve kimyasal özellikleriÖzellik Değer
Briks 80
Kurumadde % 78
Nem % 22
pH 7
İndirgen Şeker % 2
Toplam Şeker % 53
3.1.4. Fuzel Yağı
Biyodönüşüm denemelerinde kullanılan fuzel yağı Malatya Şeker
Fabrikası’ndan temin edilmiştir. Fuzel yağı 5000 devir/dakika (d/d)’da santrifüj
edilerek yabancı maddeler uzaklaştırılmış, daha sonra 0.45 µm gözenek çaplı steril
filtreden süzülmüş ve biyodönüşüm ortamına ilave edilmiştir. Kullanılan fuzel
yağının bileşimi Çizelge 3.2’de verilmiştir.
Çizelge 3.2. Biyodönüşüm denemelerinde kullanılan fuzel yağının bileşimiBileşen Miktar (g/L) Bileşim (%)
1-propanol 17.4 1.7
2-metil-1-propanol 52.5 5.3
1-butanol 1.1 0.1
2-metil-1-butanol 229.0 22.9
3-metil-1-butanol 236.9 23.7
Etil alkol - 28.7
Su - 17.6
3. MATERYAL ve METOT Murat YILMAZTEKİN
29
3.1.5. Fermentör
Fermantasyon denemelerinde 3 litre hacimli kesikli, karıştırmalı, sıcaklık ve
havalandırma kontrollü fermentörler (BioFlo110, New Brunswick, ABD)
kullanılmıştır. Fermantasyon denemelerinde kullanılan fermentörler Resim 3.1’de
verilmiştir.
Resim 3.1. Fermantasyon denemelerinde kullanılan fermentörler.
3.2. Metot
3.2.1. Fermantasyon ve Biyodönüşümde Kullanılan Melas Çözeltisinin
Hazırlanması
Fermantasyon ve biyodönüşüm ortamı olarak kullanılan melas 10 ºBriks
olacak şekilde saf suyla seyreltilmiştir. Melasın içerisinde mayalar için toksik etki
3. MATERYAL ve METOT Murat YILMAZTEKİN
30
yapabilecek ağır metal iyonlarının ve yabancı maddelerin uzaklaştırılması amacıyla
melas çözeltisinin pH’sı 10 N sülfürik asit kullanılarak 3’e ayarlanmış ve 24 saat
bekletilmiştir. Bekletilen melas çözeltisi kaba filtre kağıdı ile süzülmüş ve yabancı
maddeler uzaklaştırılmıştır (Çalık ve ark., 2001). Daha sonra elde edilen melas
çözeltisinin pH’sı 10 N NaOH ile 5’e ayarlanmış ve fermantasyon ve biyodönüşüm
denemelerinde kullanılmıştır.
3.2.2. Aşılama Kültürünün Hazırlanması
MEA’da geliştirilen mayalar 250 mL’lik steril erlenmayerler içerisinde
bulunan 100 mL 10 ºBriks fermantasyon ortamına aşılanmış ve daha sonra
erlenmayerler orbital karıştırıcıya yerleştirilerek 25 ºC’de, 160 d/d’da, 48 saat süreyle
çoğaltılmıştır. 48 saatlik süre sonunda erlenmayerdeki kültür sıvısı steril tüpler
içerisinde +4 ºC’de, 4000 d/d’da, 10 dk. santrifüj edilmiş ve mayalar +4 ºC’deki
steril suyla 2 defa yıkanmıştır. Maya hücrelerinin oluşturduğu pellet 5 mL steril
fermantasyon ortamına aktarılmış, mikroskop altında sayılmış ve daha sonra 1x107
hücre/mL olacak şekilde fermantasyon veya biyodönüşüm ortamına aşılanmıştır.
3.2.3. Fermantasyon Koşulları
Fermantasyon denemeleri farklı havalandırma (havalandırmalı, yarı-
havalandırmalı ve havalandırmasız) ve sıcaklık (15 ve 25 °C) koşullarında
gerçekleştirilmiştir. Fermentörlerde paralelli olarak gerçekleştirilen denemelerde her
bir fermentöre 2 L fermantasyon ortamı konulmuş, otoklavda 121 ºC’de 15 dk. steril
edilmiş ve daha sonra soğutulmuştur. Ortama çoğaltılan kültürden aşılanmış ve
karıştırma 100 d/d olacak şekilde ayarlanmıştır.
3. MATERYAL ve METOT Murat YILMAZTEKİN
31
3.2.3.1. Havalandırmalı Fermantasyon
Havalandırmalı fermantasyon denemeleri fermentörlerde gerçekleştirilmiştir.
Havalandırma kompresör yardımıyla yapılmış ve ortama verilen steril hava miktarı
200 mL/L/dk olacak şekilde ayarlanmıştır.
3.2.3.2. Havalandırmasız Fermantasyon
Havalandırmasız fermantasyon denemeleri aynı şekilde fermentörlerde
gerçekleştirilmiştir. Fermantasyondan önce fermentörlere azot gazı verilerek
ortamdaki oksijen uzaklaştırılmıştır.
3.2.3.3. Yarı-havalandırmalı Fermantasyon
Yarı-havalandırmalı fermantasyon denemeleri orbital karıştırıcıda ağızları
steril pamukla kapatılmış erlenmayerlerde gerçekleştirilmiştir.
3.2.4. Biyodönüşüm Koşulları
Biyodönöşüm denemeleri W. saturnus HUT 7087 mayası ile fermantasyon
denemelerinde belirlenen en uygun sıcaklık ve havalandırma koşullarında
gerçekleştirilmiştir. İçerisinde 200 mL melas çözeltisi bulunan ağızları pamukla
kapatılmış 1 L’lik erlenlere 1x107 hücre/mL olacak şekilde maya kültürü
aşılanmıştır. Orbital karıştırıcıya paralelli olarak yerleştirilen 4 erlen içerisindeki
melas çözeltileri 25 °C ve 100 d/d’da mayalar durgun faza girinceye kadar fermente
edilmiş, daha sonra bir örnek tanık olarak alınmış ve diğer örneklerde ortama,
sırasıyla, % 1, % 2 ve % 3 oranlarında fuzel yağı ilave edilerek diğer koşullar aynı
kalmak şartıyla biyodönüşüm gerçekleştirilmiştir.
3. MATERYAL ve METOT Murat YILMAZTEKİN
32
3.2.5. Fuzel Yağı Toksisitesinin Belirlenmesi
Biyodönüşüm denemelerinde kullanılacak olan fuzel yağının mayalar
üzerindeki etkisini belirlemek amacıyla maya aşılanmış melas çözeltilerine farklı
oranlarda fuzel yağı ilave edilmiştir. Fuzel yağı ilavesini takip eden her 24 saatte bir
maya sayımı yapılarak canlılık oranları belirlenmiştir.
3.2.6. Örneklerin Alınması
Fermantasyon ve biyodönüşüm süresince 24 saat aralıklarla ortamdan 25
mL’lik örnek alınmıştır. Alınan örnekten 1 mL maya sayımı için kullanılmış ve
geriye kalan kısım mayaları uzaklaştırmak amacıyla +4 ºC’de, 4000 d/d’da 10 dk.
santrifüj edilmiştir. Elde edilen süpernatant yoğunluk ve pH ölçümlerinden sonra
aroma maddelerinin analizleri için – 18 ºC’de muhafaza edilmiştir.
3.2.7. Örnekler Üzerinde Yapılan Analizler
Tüm analizler iki kez tekrarlanarak yapılmış ve sonuçlar ortalama olarak
verilmiştir.
3.2.7.1. Maya Sayımı ve Canlılık Oranı
Maya sayımı ve canlılık oranı için örnekler aseptik koşullarda alınmış ve
sayımlar metilen mavisi kullanılarak Thoma lamı ile mikroskop altında
gerçekleştirilmiştir (Anonim, 1997b).
3. MATERYAL ve METOT Murat YILMAZTEKİN
33
3.2.7.2. Yoğunluk Tayini
Yoğunluk tayini “Mettler Toledo Densito 30PX (İsviçre)” marka dijital
yoğunluk ölçer ile 20 ºC’de gerçekleştirilmiştir. Fermantasyon ve biyodönüşüm
denemeleri yoğunluk değerindeki düşüş ile izlenmiştir (Erten, 1997).
3.2.7.3. pH
pH ölçümünde ortamdan örnek alımı sırasında fermentör kontrol panelinde
okunan pH değerleri ve örnek alındıktan sonra pH metre ile ölçülen değerler dikkate
alınmıştır.
3.2.7.4. Etil Alkol Miktarının Belirlenmesi
Etil alkol miktarı Shimadzu GC-14B (Kyoto, Japonya) marka GC-FID
kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Örnekler % 1’in altında etil alkol içerecek şekilde
saf suyla seyreltildikten sonra iç standart ilave edilerek gaz kromatografisine direkt
enjekte edilmiştir. Standart olarak % 1’lik (h/h) etil alkol (mutlak, % 99.9) ve iç
standart olarak % 1’lik (h/h) 1-butanol kullanılmıştır (Erten ve Campbell, 2001). Etil
alkol analizlerinde elde edilen örnek kromatogram Şekil 3.1’de verilmiştir. GC
koşulları aşağıdaki gibidir;
Enjeksiyon : Split (1:70)
Dedektör : FID
Kolon : CP-WAX 57-CB (Chrompack, Hollanda) 60 m uzunluk, 0.25
mm iç çap ve 0.4 µm film kalınlığında fused silika kapiler
kolon
Enjeksiyon Sıcaklığı : 180 ºC
Dedektör Sıcaklığı : 200 ºC
3. MATERYAL ve METOT Murat YILMAZTEKİN
34
Fırın Sıcaklığı : 70 ºC izotermal
Taşıyıcı Gaz : Helyum (3 mL/dk.)
Diğer Gazlar : Kuru hava (350 mL/dk.) ve Hidrojen (35 mL/dk.)
Enjeksiyon Miktarı : 1 µL
Maddelerin Alıkonma Zamanları:
Bileşen Alıkonma Zamanı (dakika)
Etil Alkol 5.576
n-butanol (iç standart) 12.385
min0 2 4 6 8 10 12
Norm.
12.5
15
17.5
20
22.5
25
27.5
30
32.5
ADC1 A, ADC1 CHANNEL A (MURAT\04070510.D)
5.5
76 -
ETI
L A
LKO
L
12.
385
- N
-BU
TAN
OL
Şekil 3.1. Etil alkol analizlerinde elde edilen örnek kromatogram.
3.2.7.5. Aroma Maddelerinin Analizi
Örneklerdeki izoamil asetat, etil asetat, 2-metil-1-butanol ve 3-metil-1-
butanol miktarları iç standart yöntemiyle belirlenmiştir (Kelly ve ark., 1999).
Analizlerde Shimadzu GC-14B (Kyoto, Japonya) marka alev iyonlaşma dedektörlü
GC kullanılmıştır. Alıkonma zamanları standart maddelerin tek tek GC’ne enjekte
edilmesi ile belirlenmiştir. 5 farklı konsantrasyondaki kalibrasyon çözeltileri gaz
kromotografisine 3 kez tekrarlanarak enjekte edilmiş ve elde edilen piklerin alanları
temel alınarak her bir bileşik için cevap faktörü hesaplanmıştır. Aroma maddelerinin
3. MATERYAL ve METOT Murat YILMAZTEKİN
35
miktarı cevap faktörleri kullanılarak hesaplanmıştır (Anonim, 2002). Kalibrasyon
grafiklerinin değerlendirilmesiyle elde edilen veriler Çizelge 3.3’te verilmiştir.
Çizelge 3.3. Aroma maddelerinin kalibrasyon verileri
BileşiklerKorelasyon
(R2)
Standart
Sapma
Doğrusal Kalibrasyon
Denklemi
Etil Asetat
İzoamil Asetat
2-metil-1-bütanol
3-metil-1-bütanol
0.9998
0.9997
0.9996
0.9996
0.01239
0.02343
0.03227
0.03165
y = 0.54682x+0.5433
y = 0.65432x+0.0032
y = 1.04388x+0.1238
y = 1.05023x+0.7654
İç standart olarak 58.4 mg/L konsantrasyonunda 3-pentanol kullanılmıştır.
Aroma maddelerinin analizlerinde elde edilen örnek kromatogram Şekil 3.2’de
verilmiştir. GC koşulları aşağıdaki gibidir (Erten ve Campbell, 2001);
Enjeksiyon : Split (1:50)
Dedektör : FID
Kolon : CP-WAX 57-CB (Chrompack, Hollanda) 60 m uzunluk, 0.25
mm iç çap ve 0.4 µm film kalınlığında fused silika kapiler
kolon
Enjeksiyon Sıcaklığı : 160 ºC
Dedektör Sıcaklığı : 180 ºC
Fırın Sıcaklığı : 40 ºC’de 4 dk. izotermal
40 ºC’denà 94 ºC’ye 1.8 ºC/dk. artış
94 ºC’denà 180 ºC’ye 30 ºC/dk. artış
180 ºC’de 4 dk. izotermal
Taşıyıcı Gaz : Helyum (1.3 mL/dk.)
Diğer Gazlar : Kuru hava (350 mL/dk.) ve Hidrojen (35 mL/dk.)
Enjeksiyon Miktarı : 1 µL
3. MATERYAL ve METOT Murat YILMAZTEKİN
36
Maddelerin Alıkonma Zamanları:
Bileşen Alıkonma Zamanı (dakika)
Etil Asetat 9.174
İzoamil Asetat 22.028
3-pentanol (iç standart) 22.471
2-metil-1-butanol 29.807
3-metil-1-butanol 30.003
min5 10 15 20 25 30
mAU
11
11.2
11.4
11.6
11.8
12
12.2
12.4
12.6
ADC1 A, ADC1 CHANNEL A (MURAT\15060502.D)
9.1
74 -
ETI
L AS
ETAT
22.
028
- IZ
OA
MIL
ASE
TAT
22.
471
- 3-
PEN
TANO
L
29.
807
- 2-
MET
IL-1
-BU
TAN
OL
30.
003
- 3-
MET
IL-1
-BUT
ANO
L
Şekil 3.2. Aroma maddelerinin analizlerinde elde edilen örnek kromatogram.
3.2.7.5.(1). Cevap Faktörünün Hesaplanması
Her bir aroma maddesi için cevap faktörü aşağıdaki formül yardımıyla
hesaplanmıştır (Anonim, 2002).
RF= (Ast / Ai) x (Ci / Cst)
Ci : Bileşiğin konsantrasyonu (mg/L)
Ai : Bileşiğin pik alanı
Ast : İç standardın pik alanı
Cst : İç standardın konsantrasyonu (mg/L)
RF : Cevap faktörü.
3. MATERYAL ve METOT Murat YILMAZTEKİN
37
3.2.7.5.(2). Miktar Tayini
Örneklerdeki aroma maddelerinin konsantrasyonları aşağıdaki formül
yardımıyla hesaplanmış, sonuçlar mg/L cinsinden verilmiştir (Kelly ve ark., 1999).
Ci = (Ai / Ast) x Cst x RF
3.2.8. İstatistiksel Değerlendirme
İki kez tekrarlanarak yürütülen denemelerden elde edilen sonuçlar SPSS 10.0
(Özdamar, 1999) istatistik yazılım programı kullanılarak değerlendirilmiştir.
Faktörlerin etkisini belirlemek amacıyla elde edilen araştırma bulguları tek yönlü
varyans analizine tabi tutulmuştur. Önemli çıkan gruplar arasındaki farklılıklar
Duncan çoklu karşılaştırma testi ile % 5 önem düzeyinde belirlenmiştir. İkili
karşılaştırmalarda ise Student-t testi kullanılmıştır.
4. ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA Murat YILMAZTEKİN
38
4. ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA
4.1. İzoamil Asetat Üretimi
4.1.1. FarklıW. saturnus Mayaları ile İzoamil Asetat Üretimi
Farklı kültür koleksiyonlarından temin edilen W. saturnus HUT 7087
(Japonya), W. saturnus IAM 12217 (Japonya) ve W. saturnus NCYC 22 (İngiltere)
mayaları ile melas ortamında fermantasyon denemeleri kurulmuş ve en iyi izoamil
asetat üreten maya belirlenmiştir. Fermantasyon denemelerinden elde edilen sonuçlar
aşağıda verilmiştir.
4.1.1.1. Maya Gelişimi ve Canlılık Oranı
Maya gelişimi, canlı maya sayısı ve canlılık oranı ile izlenmiştir.
Fermantasyon süresince canlılık oranı bütün maya ırkları için % 100 bulunmuştur.
Maya gelişim grafiği Şekil 4.1’de verilmiştir. W. saturnus HUT 7087 ve W. saturnus
NCYC 22 mayaları durgun faza 48. saatte sırasıyla 9.7x107 hücre/mL ve 9.0x107
hücre/mL canlı maya sayısı ile girerken, W. saturnus IAM 12217 mayası yine 48.
saatte 5.1x107 hücre/mL canlı maya sayısı ile girmiştir. Fermantasyon sonunda ise
canlı maya sayıları W. saturnus HUT 7087, W. saturnus IAM 12217 ve W. saturnus
NCYC 22 mayaları için sırasıyla 5.8x107, 3.7x107 ve 5.5x107 hücre/mL olarak
saptanmıştır.
4. ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA Murat YILMAZTEKİN
39
0
2
4
6
8
10
12
0 12 36 72 108 132 156 180 204 228
Fermantasyon süresi (saat)
Canlı m
aya
sayısı
(x10
7 hüc
re/m
L)HUT 7087 IAM 12217 NCYC 22
Şekil 4.1. W. saturnus mayalarının gelişimi.
4.1.1.2. Fermantasyonun Gidişi
Fermantasyonun gidişi yoğunluk düşüşü ile takip edilmiştir ve yoğunluk
değerlerindeki düşüşler Şekil 4.2’de verilmiştir. Fermantasyon sonunda yoğunluk
değerleri tüm maya ırkları için 1.014 g/cm3 değerine kadar düşmüştür.
Fermantasyonlar son 36 saat yoğunlukta değişme olmayınca sonlandırılmıştır. W.
saturnus HUT 7087, W. saturnus IAM 12217 ve W. saturnus NCYC 22 mayaları ile
gerçekleştirilen fermantasyonlar sırasıyla 228., 192. ve 204. saatlerde son bulmuştur.
4. ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA Murat YILMAZTEKİN
40
1.000
1.010
1.020
1.030
1.040
1.050
0 12 36 72 108 132 156 180 204 228
Fermantayon süresi (saat)
Yoğu
nluk
(g/c
m3 )
HUT 7087 IAM 12217 NCYC 22
Şekil 4.2. W. saturnus mayaları ile gerçekleştirilen fermantasyonlara ait yoğunlukdeğerleri.
4.1.1.3. pH
Fermantasyonlar süresince pH’da meydana gelen değişimler Şekil 4.3’te
verilmiştir. W. saturnus HUT 7087 mayası ile gerçekleştirilen fermantasyon
denemesinde pH 4.84’e kadar düşmüş ve fermantasyon sonunda 4.90 olarak
belirlenmiştir. W. saturnus NCYC 22 mayası ile yürütülen fermantasyon denmesinde
benzer şekilde 4.83 değerine kadar düşmüş ve fermantasyon sonunda bu değer 5.01
olarak saptanmıştır. W. saturnus IAM 12217 mayası ile yürütülen fermantasyon
denemesinde ise pH diğer denemelerin aksine fermantasyon süresince düşmeye
devam etmiş ve fermantasyon sonunda 4.80 olarak belirlenmiştir.
Mayalar genellikle asidofilik mikroorganizmalar olarak kabul edilirler ve
asidik ortamlarda daha iyi gelişirler. Mayaların gelişimi için en uygun pH aralığı 4-6
arasında olup, optimum pH 4.5 civarındadır ki bu ortam sıcaklığına, ortamda bulunan
oksijene ve maya cinsine göre değişebilmektedir. Fermantasyon başlangıcında maya
gelişimi ile birlikte fermantasyon ortamının pH’sında genellikle bir düşüş gözlenir.
4. ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA Murat YILMAZTEKİN
41
pH’daki bu düşüşün farklı bir kaç mekanizma sonucu oluşabileceği tahmin
edilmektedir. Fermantasyon sırasında ortamda H+ iyonları ve CO2 oluşması ve daha
sonra oluşan CO2 su ile reaksiyona girerek daha fazla H+ iyonları oluşturarak ortamın
pH’sını düşürmesi bunlardan biridir. Maya hücresi fermantasyon sırasında hücre
içerisinde meydana gelen biyokimyasal olayları devam ettirebilmek için hücre içi
pH’sını içeriye veya dışarıya H+ iyonu pompalayarak optimum bir değerde tutmaya
çalışır (Chang, 2000).
4.600
4.700
4.800
4.900
5.000
5.100
0 12 36 72 108 132 156 180 204 228
Fermantasyon süresi (saat)
pH
HUT 7087 IAM 12217 NCYC 22
Şekil 4.3. W. saturnus mayaları ile gerçekleştirilen fermantasyonlara ait pH değerleri.
4.1.1.4. Etil Alkol Üretimi
Şekil 4.4’te W. saturnus HUT 7087, W. saturnus IAM 12217 ve W. saturnus
NCYC 22 mayaları ile gerçekleştirilen fermantasyon denemeleri süresince etil alkol
üretimindeki değişim verilmiştir. Bütün maya ırklarıyla yürütülen fermantasyon
denemelerinde üretilen etil alkol miktarı fermantasyon sonuna kadar sürekli artış
göstermiştir. En yüksek etil alkol üretimi hacim olarak % 3.3 ile W. saturnus HUT
4. ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA Murat YILMAZTEKİN
42
7087 mayası ile gerçekleşmiştir. Fermantasyon sonunda belirlenen etil alkol
miktarları ise W. saturnus HUT 7087, W. saturnus IAM 12217 ve W. saturnus
NCYC 22 mayaları için sırasıyla hacim olarak % 3.3, 3.2 ve 3.0 olarak tespit
edilmiştir. Mayalar etil alkolü hücre içerisinde metabolik yolla üretilen asetaldehitten
oluşturur. Asetaldehidin etil alkole dönüşümü sırasında reaksiyon alkol dehidrogenaz
enzimi tarafından katalizlenir. Etil alkol hücre içerisinde sentezlenmeye başladıktan
sonra hücre membranından ortama geçer ve ortamda biriken etil alkol, glukoz
azaldığı zaman karbon kaynağı olarak CO2’in ve suyun glioksilat yolu ile
oksidasyonu için kullanılabilmektedir (Fredlund, 2004).
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
0 24 48 72 96 120 144 168 192 204 228
Fermantasyon süresi (saat)
Etil
alk
ol (%
, h/h
)
HUT 7087 IAM 12217 NCYC 22
Şekil 4.4. W. saturnus mayaları ile gerçekleştirilen fermantasyonlardaki etil alkolüretimi.
4.1.1.5. 2-Metil-1-butanol ve 3-Metil-1-butanol Üretimi
W. saturnus HUT 7087, W. saturnus IAM 12217 ve W. saturnus NCYC 22
mayaları ile fermantasyonlar süresince üretilen 2-metil-1-butanol ve 3-metil-1-
butanol’ün miktarlarındaki değişimler, sırasıyla, Şekil 4.5 ve 4.6’da verilmiştir.
Kullanılan bütün maya ırklarında fermantasyon süresince üretilen 2-metil-1-butanol
4. ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA Murat YILMAZTEKİN
43
ve 3-metil-1-butanol miktarları sürekli bir artış göstermiştir. Fermantasyon sonunda
ortamda bulunan 2-metil-1-butanol miktarı W. saturnus HUT 7087, W. saturnus IAM
12217 ve W. saturnus NCYC 22 mayaları için sırasıyla 24.7, 22.4 ve 21.7 mg/L’dır.
3-Metil-1-butanol için belirlenen miktar ise yine, sırasıyla, 24.3, 19.6 ve 22.2
mg/L’dir.
0
5
10
15
20
25
30
0 12 36 72 108 132 156 180 204 228
Fermantasyon süresi (saat)
2-M
etil-
1-bu
tano
l (m
g/L)
HUT 7087 IAM 12217 NCYC 22
Şekil 4.5. W. saturnus mayaları ile gerçekleştirilen fermantasyonlardaki 2-metil-1-butanol üretimi.
4. ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA Murat YILMAZTEKİN
44
0
5
10
15
20
25
30
0 12 36 72 108 132 156 180 204 228
Fermantasyon süresi (saat)
3-M
etil-
1-bu
tano
l (m
g/L)
HUT 7087 IAM 12217 NCYC 22
Şekil 4.6. W. saturnus mayaları ile gerçekleştirilen fermantasyonlardaki 3-metil-1-butanol üretimi.
4.1.1.6. İzoamil Asetat/Amil Alkol Oranı
W. saturnus HUT 7087, W. saturnus IAM 12217 ve W. saturnus NCYC 22
mayaları ile gerçekleştirilen fermantasyon denemelerinde saptanan izoamil
asetat/amil alkol oranları Çizelge 4.1’de verilmiştir.
Çizelge 4.1. W. saturnus mayaları ile gerçekleştirilen fermantasyonlarda izoamilasetat/amil alkol oranı
Maya ırkı İzoamil asetat/amil alkol oranıx
HUT 7087 4.66ay±0.029
IAM 12217 1.48b±0.099
NCYC 22 4.46a±0.019
Önem düzeyi *x: İzoamil asetat/amil alkol oranı denemeler sırasında en yüksek izoamil asetat miktarına ulaşılansaatlerde hesaplanmıştır. y: Aynı sütunda değişik harflerle gösterilen değerler arasındaki farkistatistiksel olarak önemlidir (p<0.05). *: p<0.05, HUT 7087: W. saturnus HUT 7087; IAM 12217:W. saturnus IAM 12217; NCYC 22: W. saturnus NCYC 22
4. ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA Murat YILMAZTEKİN
45
Ester/yüksek alkol oranı fermente içkilerde duyusal özellikler üzerinde etkili
bir parametre olarak görülmektedir. Üretilen ester miktarının yüksek ve yüksek alkol
miktarının düşük olduğu durumlarda hoşa giden meyve aromalarının daha çok
hissedildiği belirtilmiştir (Iwase, 1995; Valero ve ark., 2002). Kullanılan maya ırkları
arasında izoamil asetat/amil alkol oranları açısından W. saturnus HUT 7087 ve W.
saturnus NCYC 22 mayaları arasında istatistiksel açıdan fark bulunmazken (p>0.05),
W. saturnus IAM 12217 mayası ile diğer iki maya arasındaki fark önemli
bulunmuştur (p<0.05). Inoue ve ark. (1997), Hansenula mrakii ve S. cerevisiae
kültürlerinde izoamil asetat/izoamil alkol oranını sırasıyla 1.33 ve 0.0054 olarak
bulmuşlardır. Farklı W. saturnus ırkları ile gerçekleştirilen bu araştırmada ise en
yüksek izoamil asetat/amil alkol oranı 4.66 ile W. saturnus HUT 7087 mayası ile
gerçekleştirilen fermantasyon denemesinde saptanmıştır.
4.1.1.7. İzoamil Asetat Üretimi
W. saturnus HUT 7087, W. saturnus IAM 12217 ve W. saturnus NCYC 22
mayaları ile gerçekleştirilen fermantasyon denemeleri süresince izoamil asetat
üretimindeki değişim Şekil 4.7’de, bu mayalar tarafından üretilen izoamil asetat
miktarları ve üretim hızları ise Çizelge 4.2’de verilmiştir.
4. ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA Murat YILMAZTEKİN
46
0
5
10
15
20
25
0 12 36 72 108 132 156 180 204 228
Fermantasyon süresi (saat)
İzoa
mil
aset
at (m
g/L)
HUT 7087 IAM 12217 NCYC 22
Şekil 4.7. W. saturnus mayaları ile gerçekleştirilen fermantasyonlardaki izoamilasetat üretimi.
Çizelge 4.2. W. saturnus mayaları tarafından üretilen izoamil asetat miktarları veüretim hızları
Maya Irkıİzoamil asetat miktarı
(mg/L)
İzoamil asetat üretim hızıx
(mg/L/saat)
HUT 7087 20.71±0.27 0.157ay±0.0020
IAM 12217 19.55±0.35 0.146a±0.0027
NCYC 22 18.75±0.78 0.130b±0.0054
Önem düzeyi ö.d. *x: İzoamil asetat üretim hızları denemeler sırasında en yüksek değere ulaşılan saatlerdehesaplanmıştır. y: Aynı sütunda değişik harflerle gösterilen değerler arasındaki fark istatistikselolarak önemlidir (p<0.05). *: p<0.05, ö.d.: önemli değil, HUT 7087: W. saturnus HUT 7087; IAM12217: W. saturnus IAM 12217; NCYC 22: W. saturnus NCYC 22
Denemelerde kullanılan maya ırkları arasında izoamil asetat üretim miktarı
bakımından istatistiksel olarak fark bulunmazken (p>0.05), izoamil asetat üretim
hızları açısından önemli farklılık gözlenmiştir (p<0.05). Yapılan Duncan çoklu
karşılaştırma testine göre izoamil asetat üretim hızları açısından W. saturnus HUT
7087 ve W. saturnus IAM 12217 mayaları arasındaki farklılık önemsiz bulunurken,
4. ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA Murat YILMAZTEKİN
47
bu mayalar ile W. saturnus NCYC 22 mayası arasındaki farklılık önemli
bulunmuştur (p<0.05). Ancak, W. saturnus HUT 7087 mayasının izoamil asetat
üretim hızı diğer mayalardan yüksek olduğu için araştırmanın ileri safhalarında bu
maya ırkı kullanılmıştır.
4.1.2. W. saturnus HUT 7087 Mayası Kullanılarak Fermantasyon Yoluyla
İzoamil Asetat Üretimi
W. saturnus HUT 7087 ile izoamil asetat üretiminde sıcaklığın ve
havalandırmanın etkisini araştırmak amacıyla melas kullanılarak önce
havalandırmasız ortamda, 15 ºC ve 25 ºC’de fermantasyon denemeleri kurulmuştur.
Havalandırmanın etkisini araştırmak amacıyla ise yine melas ortamında ve belirlenen
en uygun sıcaklıkta, havalandırmalı (200 mL/L/dakika), havalandırmasız ve yarı
havalandırmalı ortamlarda fermantasyon denemeleri gerçekleştirilmiştir.
Havalandırmalı ve havalandırmasız fermantasyon denemeleri havanın kontrollü
olarak verildiği fermentörlerde gerçekleştirilirken, yarı havalandırmalı fermantasyon
denemeleri orbital karıştırıcıda erlenmayerler içerisinde gerçekleştirilmiştir. Bu
denemelerden elde edilen bulgular aşağıda verilmiştir.
4.1.2.1. W. saturnus HUT 7087 Mayası Kullanılarak Fermantasyon Yoluyla
İzoamil Asetat Üretiminde Sıcaklığın Etkisi
4.1.2.1.(1). Maya Gelişimi ve Canlılık Oranı
W. saturnus HUT 7087 ile izoamil asetat üretiminde fermantasyon süresince
her iki sıcaklıkta da canlılık oranı % 100 bulunmuştur ve maya gelişimi Şekil 4.8’de
verilmiştir.
4. ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA Murat YILMAZTEKİN
48
0
2
4
6
8
10
12
0 36 72 108 144 180 216 264 300 372 444 516
Fermantasyon süresi (saat)
Can
lı m
aya
sayısı
(x10
7 hüc
re/m
L)15 °C 25 °C
Şekil 4.8. W. saturnus HUT 7087 mayası ile farklı sıcaklıklarda yürütülenfermantasyonlardaki canlı maya sayısı.
25 ºC’de yürütülen fermantasyon denemesinde mayalar logaritmik çoğalma
evresini 15 ºC’de yürütülen fermantasyon denemesine nazaran daha hızlı ve daha
fazla sayıda maya ile tamamlamıştır. 25 ºC’de gerçekleştirilen denemede durgun faza
48. saatte girilirken, 15 ºC’de 84. saatte girilmiştir. 25 ºC’de gerçekleştirilen
fermantasyonda maya sayısı 72. saatte 1.1x108 hücre/mL ile en yüksek değerine
ulaşmıştır. 15 ºC’de yürütülen fermantasyonda ise maya sayısı fermantasyonun 180.
saatinde 7.2x107 hücre/mL ile en yüksek değere ulaşmıştır. Fermantasyon sonunda
ise maya sayısı 25 ºC’de ve 15 ºC’de, sırasıyla, 5.6x107 ve 5.1x107 hücre/mL
bulunmuştur. Alkol fermantasyonunda maya popülasyonunu ve mayalar tarafından
gerçekleştirilen biyokimyasal olayları etkileyen en önemli faktörlerden biri de
sıcaklıktır (Fleet ve Heard, 1993). Literatürde alkol fermantasyonu sırasında
sıcaklığın S. cerevisiae (Epifanio ve ark., 1999) ve farklı mayaların (Sharf ve
Margalith, 1983; Heard ve Fleet, 1988; Mateo ve ark., 1991) gelişimleri üzerine
etkisini konu alan farklı çalışmalar yapılmıştır. 20 ve 30 ºC’de gerçekleştirilen
fermantasyonlarda, genellikle kısa lag, logaritmik, durgun ve ölüm evrelerini içeren
4. ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA Murat YILMAZTEKİN
49
alışılmış mikroorganizma gelişme eğrisi gözlenirken, 35 ºC gibi yüksek sıcaklıklarda
büyük miktarda maya canlı kalmamaktadır (Torija ve ark., 2003). Literatürdeki diğer
bulgular da sıcaklıktaki artışla beraber maya canlılık oranında düşüşlerin meydana
geldiğini bildirmektedir (Ough, 1966; Nagodawithana ve ark, 1974; Casey ve ark.,
1984). Erten (1997) yaptığı çalışmada, W. saturnus mayasının 20 ºC’de 13 ºC’den
1.2 kat daha fazla geliştiğini bildirmiştir. Torija ve ark. (2003) tarafından yapılan
araştırmada ise, 15 ºC’de ulaşılan maksimum maya sayısı 1.2x108 hücre/mL
bulunurken, 25 ºC’de bu değer 1.7x108 hücre/mL olarak saptanmıştır. Casellas
(2005), 25 ºC’de maya gelişiminin ve fermantasyon hızının 13 ºC’den daha yüksek
olduğunu bildirmiştir.
4.1.2.1.(2). Fermantasyonun Gidişi
Fermantasyonun gidişi yoğunluk düşüşü ile izlenmiştir. Yoğunluk değerindeki
düşüşler Şekil 4.9’da verilmiştir.
1.000
1.010
1.020
1.030
1.040
1.050
0 36 72 108 144 180 216 264 300 372 444 516
Fermantasyon süresi (saat)
Yoğ
unlu
k (g
/cm
3 )
15 °C 25 °C
Şekil 4.9. W. saturnus HUT 7087 maya ile farklı sıcaklıklarda yürütülenfermantasyonlardaki yoğunluk değişimi.
4. ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA Murat YILMAZTEKİN
50
25 ºC’de gerçekleştirilen fermantasyon denemesi 210 saatte tamamlanırken,
15 ºC’de gerçekleştirilen fermantasyon denemesi ise 540 saatte tamamlanmıştır. 15
ºC’de yürütülen fermantasyonda yoğunluk değerindeki düşüş, 25 ºC’de
gerçekleştirilen fermantasyondan daha yavaş ve daha az olmuştur. Fermantasyon
sonunda 25 ºC’de yürütülen denemede yoğunluk 1.040 g/cm3’ten 1.016 g/cm3’e
düşmüştür. 15 ºC’de gerçekleştirilen fermantasyon sonunda ise yoğunluk 1.022
g/cm3 değerine kadar düşmüştür. Fermantasyon sıcaklığındaki düşüşe paralel olarak
ortamdaki fermente edilebilir şekerlerin tüketim hızında da düşüşler yaşanmıştır. Her
iki sıcaklıkta yürütülen fermantasyonda ortamda mayalar tarafından tüketilemeyen
şeker kalmış, ancak 15 ºC’de fermente edilemeyen şeker miktarı daha fazla olmuştur.
Sıcaklık maya gelişimi ve fermantasyon hızı üzerine etkilidir. Düşük sıcaklıklarda
gerçekleştirilen fermantasyonlarda fermantasyon hızı düşük, fermantasyon süresi ise
uzundur (Fleet ve Heard, 1993; Ribereau-Gayon ve ark., 2000).
4.1.2.1.(3). pH
Fermantasyon süresince pH değişimi Şekil 4.10’da verilmiştir.
4.6
4.7
4.8
4.9
5.0
5.1
5.2
0 36 72 108 144 180 216 264 300 372 444 516
Fermantasyon süresi (saat)
pH
15 °C 25 °C
Şekil 4.10. W. saturnus HUT 7087 maya ile farklı sıcaklıklarda yürütülenfermantasyonlardaki pH değişimi.
4. ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA Murat YILMAZTEKİN
51
25 ºC’de gerçekleştirilen fermantasyon denemesinde pH logaritmik fazda
hızlı bir düşüş ile 4.81 değerine gerilerken, 15 ºC’de gerçekleştirilen denemede pH 5
civarında bulunmuştur. 25 ºC’de gerçekleştirilen denemede pH durgun fazda tekrar
yükselmeye başlamış ve fermantasyon sonunda 4.85 değerine ulaşmıştır. 15 ºC’de
yürütülen denemede ise pH 5.15 olarak ölçülmüştür. Benzer sonuçlar Janssens ve
ark. (1987) tarafından da bulunmuştur. Fermantasyon başlangıcında pH, ortamda
oluşan yağ asitleri, amino asitler ve organik asitlerden dolayı düşmektedir. Oluşan bu
asitler daha sonra maya tarafından metabolik olaylarda kullanılmakta, dolayısıyla
miktarları azaldığından ortam pH’sı tekrar yükselmektedir (Boulton ve Quain, 2001).
4.1.2.1.(4). Etil Alkol Üretimi
Fermantasyon süresince oluşan etil alkol miktarı Şekil 4.11’de verilmiştir.
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
0 72 120 168 216 252 300 348 396 444 492 540
Fermantasyon süresi (saat)
Etil
alko
l (%
, h/h
)
15 °C 25 °C
Şekil 4.11. W. saturnus HUT 7087 maya ile farklı sıcaklıklarda yürütülenfermantasyonlarda etil alkol üretimi.
4. ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA Murat YILMAZTEKİN
52
Fermantasyon süresince hacim olarak % 3.2 ile en fazla etil alkol 25 ºC’de
üretilirken, 15 ºC’de gerçekleştirilen denemede bu değer % 2.8 bulunmuştur. 25
ºC’de etil alkol miktarı fermantasyonun sonunda % 3.2, 15 ºC’de ise en yüksek etil
alkol miktarı fermantasyonun 444. saatinde hacim olarak % 2.8 bulunmuş ve bu
değer fermantasyon sonunda % 2.3’e düşmüştür. Etil alkol üretimini etkileyen
önemli faktörlerden biri maya cinsidir. Saccharomyces cinsi mayalar ile
karşılaştırıldığında Pichia, Williopsis gibi aerobik mayalar düşük alkol üretme
yeteneğine sahiptir (Erten, 1997). Bunun yanında, maya gelişimini etkileyen tüm
faktörler aynı zamanda etil alkol üretimini de etkilemektedir. Sıcaklığın maya
gelişiminde çok önemli bir etken olduğu, dolayısıyla etil alkol üretimini de etkilediği
belirtilmiştir. Genel görüşe göre, sıcaklıktaki artış fermantasyon hızında da artışı
beraberinde getirmekte, ancak etil alkol veriminde düşüşe yol açmaktadır (Ribereau
Gayon ve ark., 1975; Llaurado ve ark., 2002; Torija ve ark., 2003). Ancak, farklı
sıcaklıklarda üretilen etil alkol miktarı maya cinsi ile yakından ilgilidir. Heard ve
Fleet’e (1988) göre, üzüm suyunda 10 ve 25 ºC’de Candida stelleta, sırasıyla,
hacimce % 6.1 ve 6.3, Candida krusei % 6.6 ve 6.3, Candida pulcherrima % 4 ve
2.5, Hansenula anomala % 3.5 ve 4.3 ve S. cerevisiae % 9.5 ve 13.9 etil alkol
üretirken, Klockera apiculata her iki sıcaklıkta hacimce % 2.7 etil alkol üretmiştir.
4.1.2.1.(5). 2-Metil-1-butanol ve 3-Metil-1-butanol Üretimi
Fermantasyon süresince 15 ºC’de ve 25 ºC’de üretilen 2-metil-1-butanol ve 3-
metil-1-butanol’ün miktarlarındaki değişim, sırasıyla, Şekil 4.12 ve Şekil 4.13’te
verilmiştir. Her iki sıcaklıkta amil alkol miktarları fermantasyon sonunda kadar
artmıştır. 25 ºC’de gerçekleştirilen denemede en yüksek 2-metil-1-butanol ve 3-
metil-1-butanol değerleri fermantasyonun sonunda, sırasıyla, 24.8 ve 24.9 mg/L
olarak tespit edilmiştir. 15 ºC’de ise en yüksek 2-metil-1-butanol ve 3-metil-1-
butanol miktarları yine fermantasyonun 444. saatinde, sırasıyla, 19.2 ve 12.4 mg/L
değerleriyle elde edilmiş ve fermantasyonun sonunda 15.9 ve 11.1 mg/L değerlerine
düşmüştür.
4. ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA Murat YILMAZTEKİN
53
0
5
10
15
20
25
30
0 36 72 108 144 180 216 264 300 372 444 516
Fermantasyon süresi (saat)
2-M
etil-
1-bu
tano
l (m
g/L)
15 °C 25 °C
Şekil 4.12. W. saturnus HUT 7087 maya ile farklı sıcaklıklarda yürütülenfermantasyonlarda 2-metil-1-butanol üretimi.
0
5
10
15
20
25
30
0 36 72 108 144 180 216 264 300 372 444 516
Fermantasyon süresi (saat)
3-M
etil-
1-bu
tano
l (m
g/L)
15 °C 25 °C
Şekil 4.13. W. saturnus HUT 7087 maya ile farklı sıcaklıklarda yürütülenfermantasyonlarda 3-metil-1-butanol üretimi.
4. ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA Murat YILMAZTEKİN
54
Yüksek alkoller fermantasyon sırasında iki farklı metabolik yolla sentezlenirler.
Birincisi, ortamdaki karbohidratların kullanıldığı pirüvat yolu (anabolik yol), ikincisi
ise amino asit asimilasyonu (katabolik veya Ehrlich yolu)’dur (Ouchi ve ark., 1980;
Berry, 1995; Oshita ve ark., 1995). Her iki yolda da ön bileşik olarak 2-okso (α-keto)
asitler oluşur. Bu asitler bir aldehit oluşturmak üzere dekarboksile edilir ve daha
sonra ilgili alkollere indirgenirler. Anabolik yolda 2-okso asit, amino asit sentezinde
kullanılan biyokimyasal yollarda pirüvattan veya asetil-CoA’dan elde edilir.
Katabolik yolda ise, 2-okso asit bir amino asidin transaminasyonu ile oluşur (Boulton
ve Quain, 2001). Ancak, mayalarda yüksek alkollerin üretiminde daha çok Ehrlich
yolunun kullanıldığı ileri sürülmektedir (Erten, 1997). Fermantasyon sırasında
yüksek alkollerin oluşumunu kontrol eden üç etken vardır. Bunlar maya cinsi,
fermantasyon ortamının bileşimi (özellikle azot miktarı) ve sıcaklık, havalandırma
gibi fermantasyon koşullarıdır. Maya cinsi yüksek alkollerin üretiminde en önemli
faktör olarak göze çarparken, maya gelişimini teşvik eden havalandırma, ortamdaki
doymamış yağ asidi ve steroller de yüksek alkol üretimini arttırmaktadır. Yüksek
sıcaklıklarda yürütülen fermantasyonlarda maya gelişiminde düşük sıcaklıklara
nazaran artış gözlendiği ve buna paralel olarak sıcaklığın yüksek alkollerin
miktarında da artışa neden olduğu belirtilmektedir (Hammond, 1993; Boulton ve
Quain, 2001). Landaud ve ark. (2001), 16 ºC’de 10 ºC’ye nazaran iki kat fazla
yüksek alkol üretildiğini bildirmişlerdir. Araştırmacılara göre, fermantasyon
sıcaklığındaki artış ortamdaki amino asit ve şekerlerin kullanımını teşvik etmekte ve
dolayısıyla bu besin maddelerinin metabolizması sonucu oluşan yüksek alkollerin
miktarında da artışlar gözlenmektedir. Ough ve Amerine (1967), 2-metil-1-butanol
ve 3-metil-1-butanol’ün daha çok 21-27 ºC arasında oluştuğunu, Calderbank ve
Hammond (1994) ise sıcaklıktaki artışa paralel olarak oluşan izoamil alkol
miktarında da artışlar meydana geldiğini bildirmişlerdir. Bu çalışmada da sıcaklıktaki
artışa paralel olarak 2-metil-1-butanol ve 3-metil-1-butanol miktarlarında da artışlar
gözlenmiştir.
4. ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA Murat YILMAZTEKİN
55
4.1.2.1.(6). İzoamil Asetat Üretimi
Fermantasyon süresince üretilen izoamil asetat miktarındaki değişim Şekil
4.14’te, üretilen izoamil asetat miktarları ve izoamil asetat üretim hızları ise Çizelge
4.3’te verilmiştir.
0
5
10
15
20
25
30
35
0 36 72 108 144 180 216 264 300 372 444 516
Fermantasyon süresi (saat)
İzoa
mil
aset
at (m
g/L)
15 °C 25 °C
Şekil 4.14. W. saturnus HUT 7087 maya ile farklı sıcaklıklarda yürütülenfermantasyonlarda izoamil asetat üretimi.
Çizelge 4.3. Farklı sıcaklıklarda W. saturnus HUT 7087 tarafından üretilen izoamilasetat miktarları ve üretim hızları
Sıcaklıkİzoamil asetat miktarı
(mg/L)
İzoamil asetat üretim hızıx
(mg/L/saat)
15 °C 29.43±0.10 0.136±0.0005
25 °C 20.72±0.02 0.432±0.0004
Önem düzeyi *** ***x: İzoamil asetat üretim hızları denemeler sırasında en yüksek değere ulaşılan saatlerdehesaplanmıştır. ***: p<0.001.
4. ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA Murat YILMAZTEKİN
56
Üretilen izoamil asetat miktarları ve izoamil asetat üretim hızları bakımından
25 ºC’de gerçekleştirilen fermantasyon denemesi ile 15 ºC’de gerçekleştirilen
fermantasyon denemesi arasındaki farklılık istatistiksel olarak önemli bulunmuştur
(p<0.001). 25 ºC’de üretilen izoamil asetat miktarı fermantasyonun 48. saatinde 20.7
mg/L ile en yüksek seviyesine ulaşırken, 15 ºC’de üretilen izoamil asetat miktarı ise
fermantasyonun 216. saatinde 29.4 mg/L ile en yüksek seviyesine ulaşmıştır. 15
ºC’de üretilen izoamil asetat miktarı 25 ºC’de üretilen izoamil asetat miktarından
fazla bulunurken, izoamil asetat üretim hızlarında aksine bir durum söz konusudur.
Calderbank ve Hammond (1994), artan sıcaklığa paralel olarak ester üretim hızında
da artış olduğunu bildirmişlerdir. Fermantasyon sonunda üretilen izoamil asetat
miktarları 25 ºC ve 15 ºC için, sırasıyla, 14 ve 20 mg/L’dir. Üretim verimliliği
açısından birim zamanda üretilen izoamil asetat miktarı yani üretim hızı göz önüne
alındığında, 25 ºC’de daha fazla izoamil asetat üretilmiştir.
Fermantasyon sırasında mayalar tarafından üretilen ester miktarı başta maya
cinsi olmak üzere, ester oluşumu için gerekli substratların (asetil koenzim A ve
yüksek alkoller) konsantrasyonuna ve ester oluşumunda ve yıkımında rol alan
enzimlerin toplam aktivitelerine bağlıdır. Dolayısıyla substrat konsantrasyonunu ve
enzim aktivitesini etkileyen tüm faktörler ester oluşumunu etkilemektedir (Peddie,
1990; Hammond, 1993; Boulton ve Quain, 2001; Verstrepen ve ark., 2003a;
Verstrepen ve ark., 2003b; Dufour ve ark., 2003). Genellikle, 10-25 ºC arasında
sıcaklık artışına paralel olarak oluşan ester miktarı da artmaktadır. Bazı çalışmalarda,
12 ºC’de 10 ºC’den % 75 daha fazla ester oluştuğu, fermantasyon sıcaklığının 10
ºC’den 16 ºC’ye yükseltildiğinde oluşan ester miktarının % 40-50 civarında arttığı
belirtilmiştir. Daudt ve Ough (1973)’e göre esterler farklı sıcaklık profilleri
gösterebilmektedirler. Örneğin, etil asetat ve feniletil asetat en fazla 20 ºC’de
üretilirken, izoamil asetat ve etil oktanoat 15 ºC’de daha fazla üretilmektedir. Fakat,
bu durum bütün mayalar için geçerli değildir. Sıcaklığın oluşan ester miktarını neden
etkilediği henüz tam olarak netlik kazanmamıştır. Ancak, sıcaklığın AATaz
aktivitesini etkilediği tahmin edilmektedir. Bazı araştırmacılar, sıcaklığın mayalarda
hücre içi yağ asidi bileşimini değiştirdiğini, dolayısıyla doymamış yağ asitlerinden
etkilenen AATaz enziminin aktivitesinde değişimlere yol açarak ester üretimini
4. ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA Murat YILMAZTEKİN
57
etkilediğini belirtmişlerdir (Fujii ve ark., 1997; Kajiwara ve ark., 1997). Bunun
yanında, sıcaklıkta meydana gelen değişimlerin ester oluşumu için gerekli olan
yüksek alkollerin miktarında da değişime neden olduğu bilinmektedir (Hammond,
1993; Dufour ve ark., 2003; Cole ve Noble, 2003; Verstrepen ve ark., 2003b).
4.1.2.2. W. saturnus HUT 7087 Mayası Kullanılarak Fermantasyon Yoluyla
İzoamil Asetat Üretiminde Havalandırmanın Etkisi
4.1.2.2.(1). Maya Gelişimi ve Canlılık Oranı
Fermantasyon süresince mayalar havalandırmalı ve yarı havalandırmalı
ortamlarda havalandırmasız ortama göre daha hızlı ve daha fazla gelişmişlerdir.
Bütün denemelerde canlılık oranı % 100 bulunmuştur. Maya gelişimi Şekil 4.15’te
verilmiştir.
0
5
10
15
20
25
30
0 12 36 72 90 114 138 162 186 210
Fermantasyon süresi (saat)
Can
lı m
aya
sayısı
(x10
7 hüc
re/m
L)
Havalı Havasız Yarı havalı
Şekil 4.15. W. saturnus HUT 7087 mayası ile farklı havalandırma koşullarındayürütülen fermantasyonlardaki canlı maya sayısı.
4. ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA Murat YILMAZTEKİN
58
Mayalar durgun faza, havalandırmalı ve yarı havalandırmalı fermantasyonlarda
24. saatte girerken, havalandırmasız fermantasyonda 48. saatte girmişlerdir. Yarı
havalandırmalı fermantasyonda 24. saatte 2.8x108 hücre/mL ile en yüksek maya
sayısına ulaşılırken, havalandırmalı ve havalandırmasız gerçekleştirilen
fermantasyonlarda maya sayıları sırasıyla 78. ve 150. saatlerde 2.2x108 ve 1.1x108
hücre/mL ile en yüksek maya sayısına ulaşmıştır. Fermantasyon sonunda yarı
havalandırmalı fermantasyonda maya sayısında bir değişiklik olmazken,
havalandırmalı ve havalandırmasız fermantasyonlardaki maya sayılarında azalma
olmuştur. Havalandırmanın maya gelişimini teşvik ettiği yapılan farklı çalışmalarla
ortaya konulmuştur. Kuriyama ve Kobayashi (1993) ve Erten (1997) yaptıkları
çalışmalarda havalandırma ve karıştırmanın fermantasyon sırasında maya gelişim
hızı ve miktarını arttırdığını bildirmişlerdir. Mauricio ve ark. (1997) ise
havalandırmasız ortamda gerçekleştirilen fermantasyonun maya gelişimini inhibe
ettiğini bildirmişlerdir. Nitekim oksijen maya gelişimi için gerekli olan sterollerin ve
doymamış yağ asitlerinin üretimi için gereklidir (Peddie, 1990).
4.1.2.2.(2). Fermantasyonun Gidişi
Fermantasyonun gidişi yoğunluktaki düşüş ile izlenmiştir. Yoğunluk
değerindeki düşüşler Şekil 4.16’da verilmiştir.
4. ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA Murat YILMAZTEKİN
59
1.0000
1.0100
1.0200
1.0300
1.0400
1.0500
0 24 48 78 102 126 150 174 198
Fermantasyon süresi (saat)
Yoğ
unlu
k (g
/cm
3 )Havalı Havasız Yarı havalı
Şekil 4.16. W. saturnus HUT 7087 mayası ile farklı havalandırma koşullarındayoğunluk değişimi.
Havalandırmalı ortamda gerçekleştirilen denemede fermantasyon 168. saatte,
havalandırmasız ortamda gerçekleştirilen denemede 210. saatte ve yarı
havalandırmalı ortamda gerçekleştirilen denemede ise 126. saatte tamamlanmıştır.
Havalandırmalı ortamda 48. saatten sonra şeker tüketimi oldukça yavaşlamıştır.
Fermantasyon sonunda, havalandırmalı ortamda gerçekleştirilen denemede yoğunluk
1.020 g/cm3’e düşerken, yarı havalandırmalı ve havalandırmasız ortamda
gerçekleştirilen denemelerde bu değer 1.016 g/cm3 olarak ölçülmüştür. Mayalar
logaritmik fazda ortamdaki fermente edilebilir şekeri kullanarak gelişirler.
Havalandırmalı fermantasyonlarda, ortamda bulunan şeker miktarı azalınca maya
hücresi oksijeni kullanarak solunum metabolizması ile enerji üretmeye devam eder.
“Dioksik shift (değişim)” adı verilen bu geçiş noktasından sonra maya ortamda
bulunan etil alkolü karbon kaynağı olarak kullanarak daha yavaş bir gelişme sürecine
girer (Erten, 1997; Herman, 2002). Havalandırma yapılan denemede mayanın 48.
saatte “diauxic shift (değişim)” safhasına girerek ortamda bulunan şekeri daha fazla
tüketemediği ve bu saatten sonra etil alkolü kullanmaya başladığı düşünülmektedir
(Şekil 4.16).
4. ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA Murat YILMAZTEKİN
60
4.1.2.2.(3). pH
Fermantasyon süresince pH’da meydana gelen değişim Şekil 4.17’de
verilmiştir. Fermantasyon süresince havalandırmalı ve yarı havalandırmalı
ortamlarda gerçekleştirilen denemelerde pH başlangıç değerine göre artış
gösterirken, havalandırmasız ortamda düşüş göstermiştir. Fermantasyon sonunda pH
değerleri havalandırmalı, yarı havalandırmalı ve havalandırmasız ortamda
gerçekleştirilen denemeler için, sırasıyla, 5.74, 5.70 ve 4.85 olarak bulunmuştur.
4.50
5.00
5.50
6.00
0 12 36 72 90 114 138 162 186 210
Fermantasyon süresi (saat)
pH
Havalı Havasız Yarı havalı
Şekil 4.17. W. saturnus HUT 7087 mayası ile farklı havalandırma koşullarında pHdeğişimi.
4.1.2.2.(4). Etil Alkol Üretimi
Fermantasyon süresince oluşan etil alkol miktarları Şekil 4.18’de verilmiştir.
Fermantasyon süresince en fazla etil alkol yarı havalandırmalı ortamda
gerçekleştirilen denemede hacim olarak % 4.15 ile fermantasyonun 48. saatinde
gözlemlenirken, en düşük etil alkol üretimi havalandırmalı ortamda gerçekleştirilen
4. ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA Murat YILMAZTEKİN
61
denemede 24. saatte kaydedilmiştir. Havalandırmalı ve yarı havalandırmalı ortamda
fermantasyonun ilerleyen saatlerinde etil alkol miktarlarında azalma görülürken,
havalandırmasız ortamda yürütülen denemede fermantasyon sonuna kadar artış
göstermiştir. Fermantasyon sonunda ortamda bulunan etil alkol miktarları
havalandırmalı, yarı havalandırmalı ve havalandırmasız denemelerde sırasıyla %
0.85, 0.90 ve 3.20 olarak belirlenmiştir.
Birçok maya etil alkolü karbon kaynağı olarak kullanabilir. Havalandırma
yapılan fermantasyonlarda glikoliz ve glukoneogenesis olmak üzere iki safha vardır.
Glikoliz safhasında şekerler etil alkole fermente edilir. Ortamda şeker
konsantrasyonunun azaldığı durumlarda ise glikoliz sırasında oluşan etil alkol hücre
gelişimi için karbon kaynağı olarak kullanılır ki bu safha glukoneogenesis safhasıdır
(Wales ve ark., 1980; Van Urk ve ark., 1989; Erten, 1997). Havalandırmalı ve yarı
havalandırmalı ortamlarda gerçekleştirilen fermantasyon denemelerinde etil alkol
miktarı sırasıyla 24. ve 72. saatten sonra düşmeye başlamıştır ki bu düşüşlerin
glukoneogenesis safhasından kaynaklandığı ve oluşan etil alkolün daha sonra maya
tarafından karbon kaynağı olarak kullanılmaya başlandığı düşünülmektedir.
0
1
2
3
4
5
0 24 48 72 96 120 144 168 192 216 240
Fermantasyon süresi (saat)
Etil
alk
ol (%
, h/h
)
Havalı Havasız Yarı havalı
h
Şekil 4.18. W. saturnus HUT 7087 mayası ile farklı havalandırma koşullarında etilalkol üretimi.
4. ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA Murat YILMAZTEKİN
62
4.1.2.2.(5). 2-Metil-1-butanol ve 3-Metil-1-butanol Üretimi
Fermantasyon süresince havalandırmalı, havalandırmasız ve yarı
havalandırmalı ortamlarda gerçekleştirilen denemelerde üretilen 2-metil-1-butanol ve
3-metil-1-butanol miktarlarındaki değişim, sırasıyla, Şekil 4.19 ve 4.20’de
verilmiştir. 2-metil-1-butanol ve 3-metil-1-butanol en fazla yarı havalandırmalı
fermantasyon denemesinde üretilmiştir. Yarı havalandırmalı denemede üretilen 2-
metil-1-butanol ve 3-metil-1-butanol miktarları fermantasyonun 72. saatinde sırasıyla
92.8 ve 43.8 mg/L ile gerçekleşmiştir. Havalandırmasız fermantasyon denemesinde
üretilen en yüksek 2-metil-1-butanol ve 3-metil-1-butanol miktarları sırasıyla 29.4 ve
6.3 mg/L bulunurken, havalandırmasız fermantasyon denemesinde bu değerler
fermantasyon sonunda 24.8 ve 24.9 mg/L olarak belirlenmiştir.
0
20
40
60
80
100
0 12 36 72 90 114 138 162 186 210
Fermantasyon süresi (saat)
2-M
etil-
1-bu
tano
l (m
g/L)
Havalı Havasız Yarı havalı
Şekil 4.19. W. saturnus HUT 7087 mayası ile farklı havalandırma koşullarında 2-metil-1-butanol üretimi.
4. ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA Murat YILMAZTEKİN
63
0
10
20
30
40
50
0 12 36 72 90 114 138 162 186 210
Fermantasyon süresi (saat)
3-M
etil-
1-bu
tano
l (m
g/L)
Havalı Havasız Yarı havalı
Şekil 4.20. W. saturnus HUT 7087 mayası ile farklı havalandırma koşullarında 3-metil-1-butanol üretimi.
Maya cinsi, sabit ortam koşullarında oluşan yüksek alkol miktarını etkileyen
en önemli parametredir. Farklı kaynaklarda, fermantasyon koşulları dikkate
alındığında ise yüksek pH, yüksek sıcaklık ve havalandırmanın yüksek alkol
üretimini arttırdığına dair bulgulara rastlanmıştır (Crowel ve Guymon, 1963; Berry,
1995; Mauricio ve ark., 1997; Bisson ve ark., 1998; Boulton ve Quain, 2001;
Verstrepen ve ark., 2003b; Ribéreau-Gayon ve ark., 2006). Guymon ve ark. (1961),
havalandırmanın fermantasyon sırasında oluşan yüksek alkollerin miktarında
yaklaşık 5 kat artışa neden olduğunu bildirmişlerdir. Araştırmada elde edilen verilere
göre, yarı havalandırmalı koşullarda gerçekleştirilen fermantasyon denemesinde
oluşan 2-metil-1-butanol ve 3-metil-1-butanol miktarları daha yüksek bulunmuştur.
4.1.2.2.(6). İzoamil Asetat Üretimi
Fermantasyon süresince havalandırmalı, havalandırmasız ve yarı
havalandırmalı ortamlarda gerçekleştirilen denemelerde üretilen izoamil asetat
4. ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA Murat YILMAZTEKİN
64
miktarındaki değişimler Şekil 4.21’de, üretilen izoamil asetat miktarları ve izoamil
asetat üretim hızları ise Çizelge 4.4’te verilmiştir.
0
20
40
60
80
100
120
140
0 24 48 78 102 126 150 174 198
Fermantasyon süresi (saat)
İzoa
mil
aset
at (m
g/L)
Havalı Havasız Yarı havalı
Şekil 4.21. W. saturnus HUT 7087 mayası ile farklı havalandırma koşullarındaizoamil asetat üretimi.
Fermantasyon sırasında üretilen izoamil asetat miktarları ve izoamil asetat
üretim hızları açısından uygulanan havalandırma koşulları arasındaki farklılıklar
istatistiksel olarak önemli bulunmuştur (p<0.001). En yüksek izoamil asetat miktarı
yarı havalandırmalı ortamda gerçekleştirilen fermantasyon denemesinde 90. saatte
118.1 mg/L olarak saptanırken, en düşük izoamil asetat miktarına 8.8 mg/L ile
havalandırmalı ortamda yürütülen denemede 108. saatte rastlanmıştır. İzoamil asetat
hızları karşılaştırıldığında ise, en yüksek izoamil asetat üretim hızı 0.703 mg/L/saat
ile yarı havalandırmalı fermantasyon denemesinde saptanmıştır. Fermantasyon
sonunda ortamda bulunan izoamil asetat miktarları ise havalandırmalı,
havalandırmasız ve yarı havalandırmalı ortamlarda gerçekleştirilen denemeler için,
sırasıyla, 8.5, 14 ve 80 mg/L olarak belirlenmiştir.
4. ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA Murat YILMAZTEKİN
65
Çizelge 4.4. Farklı havalandırma koşullarında W. saturnus HUT 7087 tarafındanüretilen izoamil asetat miktarları ve üretim hızları
Havalandırma
koşulu
İzoamil asetat miktarı
(mg/L)
İzoamil asetat üretim hızıx
(mg/L/saat)
Havalandırmalı 8.84c±0.08 0.082cy±0.0005
Havalandırmasız 20.72b±0.02 0.432b±0.0004
Yarı havalandırmalı 118.05a±5.59 0.703a±0.0333
Önem düzeyi *** ***x: İzoamil asetat üretim hızları denemeler sırasında en yüksek değere ulaşılan saatlerdehesaplanmıştır. y: Aynı sütunda değişik harflerle gösterilen değerler arasındaki fark istatistikselolarak önemlidir (p<0.05). ***: p<0.001.
Mauricio ve ark. (1997)’na göre, Bertrand ve Torres-Alegre (1984)
fermantasyon ortamına oksijen ilavesinin etil asetat ve yağ asidi etil esterlerini
arttırdığını bildirmişlerdir. Nykanen (1986) ise, havalandırmasız ortamda üretilen
izoamil asetat miktarının havalandırmalı ortamda üretilenden sekiz kat fazla
olduğunu bildirmiştir. Havalandırmalı ortamda gerçekleştirilen fermantasyonlarda
oksijen maya gelişimini hızlandırmakta ve dolayısıyla ortamda bulunan asetil
koenzim A’nın büyük bir kısmı maya gelişimi için gerekli doymamış yağ asidi ve
sterollerin üretiminde kullanılmakta ve ester üretimi için gerekli asetil koenzim A
yeterince sağlanamadığından oluşan ester miktarı azalmaktadır (Peddie, 1990;
Hammond, 1993; Boulton ve Quain, 2001; Lewis ve Young, 2002; Verstrepen ve
ark., 2003b). Genellikle, havasız ortamlarda yarı havalandırmanın yapıldığı
ortamlarla kıyaslandığında butil asetat, izoamil asetat, feniletil asetat ve hekzil asetat
miktarlarında düşüşler gözlenmiştir (Mauricio ve ark., 1997). Yarı havalandırmalı
koşullarda, ortamda oluşan ester miktarı artarak bir pik yapar ve daha sonra azalmaya
başlar. Bunun nedeni, fermantasyon sonuna doğru aktivitelerinde artış gözlenen
hücre içi esterazların oluşan esterleri hidroliz etmesidir (Mauricio ve ark., 1993). Bu
çalışmada da yarı havalandırmalı koşullarda üretilen izoamil asetat miktarı,
havalandırmalı ve havalandırmasız koşullarda üretilen izoamil asetat miktarlarından
yaklaşık 6-15 kat fazla bulunmuştur.
4. ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA Murat YILMAZTEKİN
66
4.1.3. W. saturnus HUT 7087 Mayası Kullanılarak Biyodönüşüm Yoluyla
İzoamil Asetat Üretimi
Melas ortamında 25 °C’de yarı havalandırmalı koşullarda W. saturnus HUT
7087 mayası ile substrat olarak farklı oranlarda fuzel yağı kullanılarak biyodönüşüm
yoluyla izoamil asetat üretim denemeleri gerçekleştirilmiştir. Fuzel yağı mayalar
durgun faza girdiği anda ortama % 1, % 2 ve % 3 oranında ilave edilmiştir.
Biyodönüşüm denemelerinde fuzel yağı ilavesinin maya gelişimi, maya canlılık
oranı, ortam yoğunluğu, etil alkol üretimi, 2 ve 3-metil-1-butanol miktarı ve izoamil
asetat miktarı üzerine etkisi aşağıda verilmiştir.
4.1.3.1. Fuzel Yağının Maya Gelişimi ve Canlılık Oranına Etkisi
Maya gelişimi, canlı maya sayısı ve canlılık oranı ile izlenmiştir.
Denemelerde tespit edilen canlı maya sayısındaki değişim ve canlılık oranı sırasıyla
Şekil 4.22 ve Şekil 4.23’te verilmiştir. Fuzel yağı maya gelişiminin 72. saatinde yani
durgun faza girildiği anda ilave edilmiştir. Biyodönüşüm süresince kontrol
denemesindeki mayalar fuzel yağı ilave edilen denemelerdeki mayalardan daha fazla
gelişmişlerdir. Kontrol denemesini % 1 ve % 2 fuzel yağı ilave edilen denemeler
takip etmiştir. Ortama fuzel yağı ilave edildikten sonra tespit edilen en yüksek maya
sayısı % 1, 2 ve 3 fuzel yağı ilave edilen denemeler için, sırasıyla, 2.1x108, 2x108 ve
1.4x108 hücre/mL olarak bulunmuştur. % 3 fuzel yağı ilave edilen denemedeki canlı
maya sayısında düşüş % 1 ve 2 fuzel yağı ilave edilen denemelere nazaran fazla
bulunmuştur. Biyodönüşüm sonunda tespit edilen canlılık oranı kontrol denemesi
için % 97 olurken, % 1, 2 ve 3 oranında fuzel yağı ilave edilen denemelerde sırasıyla
% 95, 89 ve 72 olarak bulunmuştur. Ortama ilave edilen fuzel yağının belirli bir
konsantrasyondan sonra maya gelişimini olumsuz etkilediği daha önce yapılan
çalışmalarda da tespit edilmiştir (Quilter ve ark., 2003).
4. ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA Murat YILMAZTEKİN
67
0
5
10
15
20
25
30
0 24 48 72 96 120 144 168 192 216 240
Süre (saat)
Can
lı m
aya
sayısı
(x10
7 hüc
re/m
L)Kontrol 1% 2% 3%
Şekil 4.22. Biyodönüşüm süresince canlı maya sayısı (fuzel yağı ilave edilen saatokla gösterilmiştir).
60
70
80
90
100
110
0 24 48 72 96 120 144 168 192 216 240
Süre (saat)
Canlılı
k O
ranı
(%)
Kontrol 1% 2% 3%
Şekil 4.23. Biyodönüşüm süresince canlılık oranı (fuzel yağı ilave edilen saat oklagösterilmiştir).
4. ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA Murat YILMAZTEKİN
68
4.1.3.2. Fuzel Yağının Yoğunluğa Etkisi
Yoğunluk değerindeki düşüşler Şekil 4.24’de verilmiştir. Ortamdaki fermente
edilebilir şeker miktarı yoğunluk düşüşü ile takip edilmiştir. Yoğunluk
değerlerindeki düşüşler bütün denemelerde benzer bir seyir izlemiştir. Ortama ilave
edilen fuzel yağının, mayaların ortamdaki şekerleri kullanabilme yeteneğine önemli
bir etkisi olmamıştır.
1
1.01
1.02
1.03
1.04
1.05
0 24 48 72 96 120 144 168 192 216 240
Süre (saat)
Yoğu
nluk
(g/c
m3 )
Kontrol 1% 2% 3%
Şekil 4.24. Biyodönüşüm süresince gözlenen yoğunluk değerleri (fuzel yağı ilaveedilen saat okla gösterilmiştir).
4.1.3.3. Fuzel Yağının Etil Alkol Üretimine Etkisi
Biyodönüşüm süresince üretilen etil alkol miktarları Şekil 4.25’de verilmiştir.
Fuzel yağı ilave edildikten sonra, kontrol hariç diğer denemelerde gözlenen etil alkol
değerleri, fuzel yağında bulunan etil alkolden dolayı kontrol denemesine göre
yükselmiştir. Etil alkol üretimi bütün denemelerde durgun faza girildikten sonra
4. ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA Murat YILMAZTEKİN
69
azalma eğilimi göstermiştir. Biyodönüşüm sonunda belirlenen etil alkol miktarı
kontrol, % 1, 2 ve 3 fuzel yağı ilave edilen denemeler için, sırasıyla, hacmen % 0.9,
2.5, 2.5, ve 3.1 olarak bulunmuştur.
0
1
2
3
4
5
0 24 48 72 96 120 144 168 192 216 240
Süre (saat)
Etil
alko
l (%
, h/h
)
Kontrol 1% 2% 3%
Şekil 4.25. Biyodönüşüm süresince etil alkol üretimi (fuzel yağı ilave edilen saatokla gösterilmiştir).
4.1.3.4. 2-Metil-1-butanol ve 3-Metil-1-butanol Miktarlarındaki Değişimler
Biyodönüşüm süresince ortamda bulunan 2 ve 3-metil-1-butanol miktarları
Şekil 4.26 ve 4.27’de verilmiştir. Fuzel yağı ilave edildikten sonra, % 1, % 2 ve % 3
fuzel yağı ilave edilen denemelerdeki 2-metil-1-butanol miktarları, sırasıyla, 948.2,
1923.1 ve 2450.5 mg/L bulunurken, 3-metil-1-butanol’ün miktarları ise, sırasıyla,
989.2, 1889 ve 2607.3 mg/L bulunmuştur. Biyodönüşüm sonunda 2-metil-1-butanol
miktarları, sırasıyla, 344.7, 1558.6 ve 2371.4 mg/L, 3-metil-1-butanol miktarları ise
yine, sırasıyla, 188.4, 1564.7 ve 2494.1 mg/L olarak belirlenmiştir. Görüldüğü gibi
2- ve 3-metil-1-butanol’ün miktarları fuzel yağı ilavesini takiben sadece % 1 fuzel
4. ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA Murat YILMAZTEKİN
70
yağı ilave edilen denemede belirgin şekilde azalmıştır. Meydana gelen bu azalma 2-
metil-1-butanol ve 3-metil-1-butanol’ün, sırasıyla, 2-metil-1-butil asetat ve 3-metil-
1-butil asetat’a yani izoamil asetat’a dönüşmesinden dolayıdır.
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
0 24 48 72 96 120 144 168 192 216 240
Süre (saat)
2-M
etil-
1-bu
tano
l (m
g/L)
Kontrol 1% 2% 3%
Şekil 4.26. Biyodönüşüm süresince 2-metil-1-butanol miktarlarındaki değişim (fuzelyağı ilave edilen saat okla gösterilmiştir).
4. ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA Murat YILMAZTEKİN
71
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
0 24 48 72 96 120 144 168 192 216 240
Süre (saat)
3-M
etil-
1-bu
tano
l (m
g/L)
Kontrol 1% 2% 3%
Şekil 4.27. Biyodönüşüm süresince 3-metil-1-butanol miktarlarındaki değişim (fuzelyağı ilave edilen saat okla gösterilmiştir).
Ortama ilave edilen fuzel yağının izoamil asetata dönüşüm oranları Çizelge
4.5’de verilmiştir. 2-Metil-1-butanol ve 3-metil-1-butanol’ün biyodönüşüm verimleri
kıyaslandığında, fuzel yağı ilave edilen denemeler arasındaki farklılık istatistiksel
açıdan önemli bulunmuştur (p<0.01). En yüksek biyodönüşüm verimleri 2-metil-1-
butanol ve 3-metil-1-butanol için %1 fuzel yağı ilave edilen denemede belirlenmiştir.
Ancak, 3-metil-1-butanol’ün dönüşüm oranı 2-metil-1-butanol’ün dönüşüm
oranından yüksek bulunmuştur. Daha önce yapılmış çalışmalarda da benzer sonuçlar
elde edilmiştir (Janssens ve ark., 1989; Quilter ve ark., 2003). Hammond ve Pye
(1996), alkollerin esterlerine dönüşüm oranlarının, alkollerin zincir uzunluklarına ve
yapılarına bağlı olduğunu bildirmişlerdir. Araştırmacılar, 2-metil-1-butanol ve 3-
metil-1-butanol’ün AATaz tarafından substrat olarak kullanılmaları durumunda Km
değerlerinin birbirlerine yakın olduğunu, ancak 2-metil-1-butanol’ün Vmax değerinin
3-metil-1-butanol’ün sadece %60’ı kadar olduğunu belirtmişlerdir. Dolayısıyla bu iki
yüksek alkolden izoamil asetat oluşum dereceleri farklı olmaktadır.
4. ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA Murat YILMAZTEKİN
72
Çizelge 4.5. Fuzel yağı konsantrasyonunun amil alkollerin biyodönüşümü üzerineetkisi
Fuzel yağı
konsantrasyonu
(%)
2-Metil-1-butanol
biyodönüşüm verimix
(%)
3-Metil-1-butanol
biyodönüşüm verimix
(%)
1 63.5a±4.9 80.1ay±0.8
2 18.9b±1.0 18.5b±2.0
3 3.2c±1.8 5.4c±1.3
Önem düzeyi ** **x:Biyodönüşüm verimleri biyodönüşüm sonunda tüketilen amil alkol miktarları göz önüne alınarakhesaplanmıştır. y: Aynı sütunda değişik harflerle gösterilen değerler arasındaki fark istatistikselolarak önemlidir (p<0.05). **: p<0.01.
4.1.3.5. Fuzel Yağının İzoamil Asetat Üretimine Etkisi
Biyodönüşüm süresince üretilen izoamil asetat miktarındaki değişimler Şekil
4.28’de, üretilen izoamil asetat miktarları ve izoamil asetat üretim hızları ise Çizelge
4.6’da verilmiştir. Biyodönüşüm sırasında üretilen izoamil asetat miktarları ve
izoamil asetat üretim hızları açısından ilave edilen fuzel yağı miktarları arasındaki
farklılıklar istatistiksel açıdan önemli bulunmuştur (p<0.001). Fuzel yağı ilave
edildikten sonra %1 ve %2 fuzel yağı ilave edilen denemelerde en yüksek izoamil
asetat miktarları 144. saatte, sırasıyla, 354.1 ve 71.2 mg/L olarak bulunmuştur. %3
fuzel yağı ilave edilen denemede ise izoamil asetat miktarında düşüş gözlenmiştir.
Biyodönüşüm sonunda ortamda bulunan izoamil asetat miktarları kontrol ve %1, %2
ve %3 fuzel yağı ilave edilen denemeler için, sırasıyla, 80, 140, 24.1 ve 14.2 mg/L
olarak bulunmuştur. İzoamil asetat miktarı en fazla %1 fuzel yağı ilave edilen
denemede tespit edilmiştir. Fuzel yağı ilavesi izoamil asetat üretiminde yaklaşık 3
kat artışa neden olmuştur.
4. ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA Murat YILMAZTEKİN
73
0
50
100
150
200
250
300
350
400
0 24 48 72 96 120 144 168 192 216 240
Süre (saat)
İzoa
mil
aset
at (m
g/L)
Kontrol 1% 2% 3%
Şekil 4.28. Biyodönüşüm süresince üretilen izoamil asetat miktarlarındaki değişim(fuzel yağı ilave edilen saat okla gösterilmiştir).
Çizelge 4.6. Farklı konsantrasyonlarda fuzel yağı ilavesinde W. saturnus HUT 7087 tarafından üretilen izoamil asetat miktarları ve üretim hızları
Fuzel yağı
konsantrasyonu
(%)
İzoamil asetat miktarı
(mg/L)
İzoamil asetat üretim hızıx
(mg/L/saat)
Kontrol 118.05b±5.59 0.703by±0.0333
% 1 354.05a±1.20 2.459a±0.0083
% 2 71.15c±4.31 0.494c±0.0300
% 3 57.65d±1.48 0.801b±0.0206
Önem düzeyi *** ***x: İzoamil asetat üretim hızları denemeler sırasında en yüksek değere ulaşılan saatlerde hesaplanmıştır.y: Aynı sütunda değişik harflerle gösterilen değerler arasındaki fark istatistiksel olarak önemlidir(p<0.05). ***: p<0.001.
Fuzel yağının biyodönüşümle izoamil asetat üretiminde substrat olarak
kullanıldığı ilk çalışma Janssens ver ark. (1989) tarafından gerçekleştirilmiştir. Daha
sonra, Calderbank ve Hammond (1994), S. cerevisiae ile gerçekleştirilen
fermantasyonda ortama ilave edilen 3-metil-1-butanol’ün hem izoamil asetat oluşum
4. ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA Murat YILMAZTEKİN
74
hızında hem de oluşan izoamil asetat miktarında artışlara neden olduğunu ve ilave
edilen 400 mg/L 3-metil-1-butanol’ün ise izoamil asetat üretimini 7 kat arttırdığını
bildirmişlerdir. Ortama ilave edilen 3-metil-1-butanol’ün miktarı 800 mg/L’ye
çıkarıldığında ise izoamil asetat miktarında herhangi bir değişim olmadığı, bunun
yanında fermantasyon hızında azalma gözlendiği belirlenmiştir. Araştırmacılar,
ortama ilave edilen 3-metil-1-butanol miktarının 400 mg/L’nin üzerinde olduğu
durumda AATaz enziminin doymuş hale geldiğini ve dolayısıyla daha fazla izoamil
asetat üretilmediğini ileri sürmüşlerdir. Quilter ve ark. (2003) ise, S. cerevisiae ile
melas ortamında gerçekleştirdikleri çalışmada ortama ilave edilen fuzel yağının
izoamil asetat üretiminde 4.4 kat artışa neden olduğunu ve ilave edilen fuzel yağı
konsantrasyonunun 1 g/L üzerinde olduğu durumda izoamil asetat miktarında daha
fazla artış gözlenmediğini bildirmişlerdir. Bu çalışmada, En yüksek izoamil asetat
miktarı 354.1 mg/L ile % 1 fuzel yağı ilave edilen denemede bulunmuştur.
4.2. Etil Asetat Üretimi
4.2.1. P. anomala ve P. subpellicolasa Mayaları ile Etil Asetat Üretimi
NCYC kültür koleksiyonundan elde edilen P. anomala NCYC 432 ve P.
subpelliculosa NCYC 436 mayalarının etil asetat üretimlerini karşılaştırmak
amacıyla 25 ºC’de melas içeren erlenmayerlerde orbital karıştırıcı kullanılarak
fermantasyon denemeleri gerçekleştirilmiştir. P. anomala NCYC 432 mayası
fermantasyon sonunda yaklaşık 1400 mg/L etil asetat üretirken, P. subpelliculosa
NCYC 436 mayası 850 mg/L etil asetat üretebilmiştir. P. anomala NCYC 432
mayası daha fazla etil asetat ürettiği için sıcaklığın ve havalandırmanın etil asetat
üretimine etkisini görmek amacıyla yürütülen denemelerde bu maya kullanılmıştır.
P. anomala NCYC 432 ile etil asetat üretiminde sıcaklığın etkisini araştırmak
amacıyla melas kullanılarak önce havalandırmasız ortamda, 15 ºC ve 25 ºC’de
4. ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA Murat YILMAZTEKİN
75
fermantasyon denemeleri kurulmuştur. Havalandırmanın etkisini araştırmak amacıyla
ise yine melas ortamında ve belirlenen en uygun sıcaklıkta, havalandırmalı (200
mL/L/dakika), havalandırmasız ve yarı havalandırmalı ortamlarda fermantasyon
denemeleri gerçekleştirilmiştir.
4.2.2. P. anomala NCYC 432 Mayası Kullanılarak Fermantasyon Yoluyla Etil
Asetat Üretimi
4.2.2.1. P. anomala NCYC 432 Mayası Kullanılarak Fermantasyon Yoluyla Etil
Asetat Üretiminde Sıcaklığın Etkisi
4.2.2.1.(1). Maya Gelişimi ve Canlılık Oranı
P. anomala NCYC 432 ile etil asetat üretiminde her iki sıcaklıkta yürütülen
fermantasyon denemelerinde canlılık oranı % 100 bulunmuştur. Fermantasyonlar
süresince maya gelişimi Şekil 4.29’da verilmiştir.
0
2
4
6
8
10
0 24 48 72 96 120 144 168 192 216 240 276 324
Fermantasyon süresi (saat)
Can
lı m
aya
sayısı
(x10
7 hüc
re/m
L)
15 °C 25 °C
Şekil 4.29. P. anomala NCYC 432 mayası ile farklı sıcaklıklarda gerçekleştirilenfermantasyonlardaki maya gelişimi.
4. ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA Murat YILMAZTEKİN
76
25 ºC’de yürütülen fermantasyon denemesinde mayalar, 15 ºC’de yürütülen
fermantasyon denemesine nazaran daha hızlı gelişmişlerdir. 25 ºC’de gerçekleştirilen
fermantasyon denemesinde mayalar durgun faza 60. saatte girerken, 15 ºC’de
yürütülen denemede 120. saatte girmiştir. 25 ºC’de gerçekleştirilen fermantasyonda
maya sayısı 60. saatte 8.2x107 hücre/mL ile en yüksek değerine ulaşmıştır. 15 ºC’de
yürütülen fermantasyonda ise maya sayısı fermantasyonun 120. saatinde 7.9x107
hücre/mL ile en yüksek değere ulaşmıştır. Fermantasyon sonunda ise maya sayısı her
iki sıcaklıkta yürütülen denemeler için 6x107 hücre/mL bulunmuştur.
4.2.2.1.(2). Fermantasyonun Gidişi
Fermantasyon süresince her iki sıcaklıkta tespit edilen yoğunluk değerleri
Şekil 4.30’da verilmiştir.
1
1.01
1.02
1.03
1.04
1.05
0 24 48 72 96 120 144 168 192 216 240 276 324
Fermantasyon süresi (saat)
Yoğ
unlu
k (g
/cm
3 )
15 °C 25 °C
Şekil 4.30. P. anomala NCYC 432 mayası ile farklı sıcaklıklarda gerçekleştirilenfermantasyonlardaki yoğunluk değerleri.
4. ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA Murat YILMAZTEKİN
77
25 ºC’de gerçekleştirilen fermantasyon denemesi 192. saatte tamamlanırken,
15 ºC’de gerçekleştirilen fermantasyon denemesi ise 348. saatte tamamlanmıştır.
Yoğunluk değerlerindeki azalmaya bakıldığında, 15 ºC’de yürütülen fermantasyonda
yoğunluk değerindeki azalma, 25 ºC’de gerçekleştirilen fermantasyondan daha yavaş
ve daha az olmuştur. Fermantasyon sonunda 25 ºC’de yürütülen denemede yoğunluk
1.040 g/cm3’ten 1.016 g/cm3’e düşerken, 15 ºC’de gerçekleştirilen fermantasyon
sonunda ise yoğunluk 1.015 g/cm3 olarak belirlenmiştir. Fermantasyon sıcaklığındaki
düşüşe paralel olarak ortamdaki fermente edilebilir şekerlerin tüketim hızında da
düşüşler yaşanmıştır.
4.2.2.1.(3). pH
Fermantasyon süresince takip edilen pH değerleri Şekil 4.31’de verilmiştir.
4.5
4.6
4.7
4.8
4.9
5
5.1
0 24 48 72 96 120 144 168 192 216 240 276 324
Fermantasyon süresi (saat)
pH
15 °C 25 °C
Şekil 4.31. P. anomala NCYC 432 mayası ile farklı sıcaklıklarda gerçekleştirilenfermantasyonlardaki pH değerleri.
Her iki sıcaklıkta gerçekleştirilen fermantasyon denemelerinde pH, maya
gelişiminin ilk evresinde yani logaritmik fazda hızlı bir düşüş sergilemiştir. 25 ºC’de
4. ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA Murat YILMAZTEKİN
78
gerçekleştirilen denemede pH 4.73 değerine kadar düşerken, 15 ºC’de bu düşüş
4.76’ya kadar olmuştur. Fermantasyon sonunda her iki sıcaklık için pH değerlerinde
artışlar kaydedilmiştir. 25 ºC’de son pH 4.77 olurken, bu değer 15 ºC için 4.83 olarak
kaydedilmiştir.
4.2.2.1.(4). Etil Alkol Üretimi
Fermantasyon sırasında üretilen etil alkol miktarları Şekil 4.32’de verilmiştir.
00.5
11.5
22.5
33.5
44.5
0 24 48 72 96 120 144 168 192 216 240 276 324
Fermantasyon süresi (saat)
Etil
alko
l (%
, h/h
)
15 °C 25 °C
Şekil 4.32. P. anomala NCYC 432 mayası ile farklı sıcaklıklarda gerçekleştirilenfermantasyonlarda üretilen etil alkol miktarları.
Fermantasyon süresince her iki sıcaklıktaki etil alkol üretimlerinde iniş ve
çıkışlar gözlenmiştir. Her iki sıcaklıkta yürütülen denemelerde en fazla etil alkol
üretimi % 3.5 olarak saptanmıştır. Fermantasyon sonunda ortamda bulunan etil alkol
miktarları 25 ºC ve 15 ºC’de yürütülen denemeler için, sırasıyla, % 3 ve % 1.7 olarak
bulunmuştur.
4. ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA Murat YILMAZTEKİN
79
4.2.2.1.(5). Etil Asetat Üretimi
Fermantasyon süresince üretilen etil asetat miktarındaki değişimler Şekil
4.33’de, üretilen etil asetat miktarları ve etil asetat üretim hızları ise Çizelge 4.7’de
verilmiştir.
0
50
100
150
200
250
300
350
0 24 48 72 96 120 144 168 192 216 240 276 324
Fermantasyon süresi (saat)
Etil
aset
at (m
g/L)
15 25
Şekil 4.33. P. anomala NCYC 432 mayası ile farklı sıcaklıklarda gerçekleştirilenfermantasyonlarda üretilen etil asetat miktarları.
Çizelge 4.7. Farklı sıcaklıklarda P. anomala NCYC 432 tarafından üretilen etil asetatmiktarları ve üretim hızları
Sıcaklık Etil asetat miktarı (mg/L) Etil asetat üretim hızıx (mg/L/saat)
15 °C 102.9±0.64 0.572±0.0035
25 °C 319±0.85 1.893±0.0054
Önem düzeyi ** **x: Etil asetat üretim hızları denemeler sırasında en yüksek değere ulaşılan saatlerde hesaplanmıştır.**: p<0.01.
Fermantasyon sırasında üretilen etil asetat miktarları ve etil asetat üretim
hızları bakımından sıcaklıklar arasındaki farklılık istatistiksel olarak önemli
bulunmuştur (p<0.01). 25 ºC’de üretilen etil asetat miktarı fermantasyonun 168.
4. ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA Murat YILMAZTEKİN
80
saatinde 319 mg/L ile en yüksek seviyesine ulaşırken, 15 ºC’de üretilen etil asetat
miktarı ise fermantasyonun 276. saatinde 102.9 mg/L ile en yüksek seviyesine
ulaşmıştır. Fermantasyon sonunda üretilen etil asetat miktarları 25 ºC ve 15 ºC için,
sırasıyla, 207.8 ve 65.2 mg/L’dir. Etil asetat üretim hızlarına bakıldığında, 25 ºC’de
gerçekleştirilen denemede üretim hızı 1.893 mg/L/saat olarak bulunurken, bu değer
15 ºC için 0.572 mg/L/saat olmuştur.
Genellikle 10-25 ºC arasında sıcaklık arttıkça oluşan ester miktarı da
artmaktadır. Sıcaklığın ester üretimine etkisi üzerine yapılan çalışmalarda, 12 ºC’de
10 ºC’den % 75 daha fazla ester oluştuğu, fermantasyon sıcaklığının 10 ºC’den 16
ºC’ye yükseltildiğinde oluşan ester miktarının % 40-50 civarında arttığı belirtilmiştir.
Ancak, ester üretimi farklı sıcaklık profilleri gösterebilmektedirler (Peddie, 1990).
Saerens ve ark. (2008), S. cerevisiae ile 14-26 °C arasında gerçekleştirdikleri
denemelerde artan sıcaklıkla beraber oluşan etil asetat miktarının da arttığını ve en
çok artışın 20 ile 26 °C aralığında gerçekleştiğini bildirmişlerdir.
4.2.2.2. P. anomala NCYC 432 Mayası Kullanılarak Fermantasyon Yoluyla Etil
Asetat Üretiminde Havalandırmanın Etkisi
4.2.2.2.(1). Maya Gelişimi ve Canlılık Oranı
Fermantasyon süresince havalandırmalı ve yarı havalandırmalı ortamlarda
gerçekleştirilen denemelerde mayalar, havalandırmasız ortama göre daha hızlı ve
daha fazla gelişmişlerdir. Denemelerin tümünde canlılık oranı % 100 bulunmuştur.
Maya gelişimi Şekil 4.34’te verilmiştir.
4. ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA Murat YILMAZTEKİN
81
0
5
10
15
20
25
30
35
40
0 12 24 36 48 60 72 84 96 10 12 13 14 15 16 18 19
Fermantasyon süresi (saat)
Can
lı m
aya
sayısı
(x10
7 hüc
re/m
L)Havalı Havasız Yarı havalı
Şekil 4.34. P. anomala NCYC 432 mayası ile farklı havalandırma koşullarındayürütülen fermantasyonlardaki canlı maya sayısı.
Havalandırmalı ve yarı havalandırmalı ortamda yürütülen denemelerde maya
durgun faza 24. saatte girerken, havasız denemede 60. saatte girmiştir. Fermantasyon
süresince ulaşılan en yüksek canlı maya sayıları havalandırmalı ve yarı
havalandırmalı denemeler için 3.6x108 hücre/mL olurken, havalandırmasız
denemede 8.1x107 hücre/mL bulunmuştur. Fermantasyon sununda ortamda bulunan
canlı maya sayıları ise havalandırmalı, yarı havalandırmalı ve havalandırmasız
ortamlarda yürütülen denemeler için, sırasıyla, 1.8x108, 2.6x108 ve 6x107 hücre/mL
olarak saptanmıştır. Fredlund ve ark. (2004a), P. anomala’nın havalandırmalı
koşullarda oksijensiz ortama nazaran daha hızlı ve daha çok geliştiğini
bildirmişlerdir. Diğer bir çalışmada ise ortama verilen kısıtlı oksijenin P.
anomala’nın gelişimini de kısıtladığını bildirilmiştir (Fredlund ve ark., 2004b).
4. ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA Murat YILMAZTEKİN
82
4.2.2.2.(2). Fermantasyonun Gidişi
Fermantasyon gidişi yoğunluktaki azalma ile takip edilmiştir. Fermantasyon
süresince kaydedilen yoğunluk düşüşleri Şekil 4.35’de verilmiştir.
1
1.01
1.02
1.03
1.04
1.05
0 12 24 36 48 60 72 84 96 10 12 13 14 15 16 18 19
Fermantasyon süresi (saat)
Yoğu
nluk
(g/c
m3 )
Havalı Havas ız Yarı havalı
Şekil 4.35. P. anomala NCYC 432 mayası ile farklı havalandırma koşullarındayürütülen fermantasyonlardaki yoğunluk değerleri.
Yarı havalandırmalı ortamda gerçekleştirilen fermantasyon denemesindeki
yoğunluk düşüşü diğer denemelerden daha hızlı olmuştur. Fermantasyon sonunda
ölçülen yoğunluk değerleri ise havalandırmalı, yarı havalandırmalı ve
havalandırmasız ortamlarda yürütülen denemeler için, sırasıyla, 1.017, 1.014 ve
1.016 g/cm3’dir.
4.2.2.2.(3). pH
Fermantasyon süresince pH’da meydana gelen değişim Şekil 4.36’da
verilmiştir.
4. ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA Murat YILMAZTEKİN
83
4.3
4.44.5
4.64.7
4.84.9
55.1
0 12 24 36 48 60 72 84 96 10 12 13 14 15 16 18 19
Fermantasyon süresi (saat)
pHHavalı Havasız Yarı havalı
Şekil 4.36. P. anomala NCYC 432 mayası ile farklı havalandırma koşullarındayürütülen fermantasyonlardaki pH değerleri.
Fermantasyon süresince tüm denemelerde pH değerinde düşüşler yaşanmıştır.
Fermantasyon sonunda pH değerleri havalandırmalı, yarı havalandırmalı ve
havalandırmasız ortamda gerçekleştirilen denemeler için, sırasıyla, 4.67, 4.57 ve 4.77
olarak bulunmuştur.
4.2.2.2.(4). Etil Alkol Üretimi
Fermantasyon süresince oluşan etil alkol miktarları Şekil 4.37’de verilmiştir.
4. ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA Murat YILMAZTEKİN
84
00.5
11.5
22.5
33.5
44.5
0 24 48 72 96 120 144 168 192
Fermantasyon süresi (saat)
Etil
alko
l (%
, h/h
)Havalı Havasız Yarı havalı
Şekil 4.37. P. anomala NCYC 432 mayası ile farklı havalandırma koşullarındayürütülen fermantasyonlardaki etil alkol üretimi.
Fermantasyon süresince yarı havalandırmalı ortamda etil alkol üretimi 24.
saate kadar artış göstermiş ve daha sonra düşmeye başlamıştır. Havalandırmalı ve
havalandırmasız ortamlarda gerçekleştirilen denemelerde ise etil alkol üretimi
fermantasyon sonuna kadar genel olarak artarak devam etmiştir. En fazla etil alkol
üretimi fermantasyonun 180. saatinde % 3.48 ile havalandırmasız ortamda
gerçekleşmiştir. Fermantasyon sonunda ortamda bulunan etil alkol miktarları
havalandırmalı, yarı havalandırmalı ve havalandırmasız denemelerde, sırasıyla, %
1.80, 3.01 ve 0.40 olarak belirlenmiştir.
Fredlund (2004), P. anomala’nın havalandırmalı ve havalandırmasız ortamda
etil alkol oluşturduğunu, ancak havalandırmalı ortamda üretilen etil alkolün tekrar
hücre tarafından kullanılırken, havalandırmasız ortamda fermantasyon bitene kadar
ortamda birikmeye devam ettiğini bildirmiştir. Bu çalışmada, havalandırmanın
yapıldığı denemelerde oluşan etil alkolün tekrar maya tarafından kullanıldığı,
havalandırmasız ortamda ise fermantasyon süresince sürekli ortamda birikmeye
devam ettiği gözlenmiştir.
4. ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA Murat YILMAZTEKİN
85
4.2.2.2.(5). Etil Asetat Üretimi
Fermantasyon süresince havalandırmalı, havalandırmasız ve yarı
havalandırmalı ortamlarda gerçekleştirilen denemelerde üretilen etil asetat
miktarındaki değişimler Şekil 4.38’de, üretilen etil asetat miktarları ve etil asetat
üretim hızları ise Çizelge 4.8’de verilmiştir.
0
50
100
150
200
250
300
350
0 24 48 72 96 120 144 168 192
Fermantasyon süresi (saat)
Hav
alı v
e H
avasız
Etil
aset
at (m
g/L)
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
Yarı
hav
alı E
til a
seta
t(m
g/L)
Havalı Havasız Yarı havalı
Şekil 4.38. P. anomala NCYC 432 mayası ile farklı havalandırma koşullarındayürütülen fermantasyonlardaki etil asetat üretimi.
Fermantasyon sırasında üretilen etil asetat miktarları ve etil asetat üretim
hızları açısından uygulanan havalandırma koşulları arasındaki farklılıklar istatistiksel
olarak önemli bulunmuştur (p<0.001). Denemeler sırasında üretilen en yüksek etil
asetat miktarı yarı havalandırmalı ortamda fermantasyonun 144. saatinde 6706.5
mg/L olarak saptanırken, en düşük etil asetat miktarına 146 mg/L ile havalandırmalı
ortamda fermantasyonun 96. saatinde rastlanmıştır. Etil asetat üretim hızları
karşılaştırıldığında, en yüksek değer 23.287 mg/L/saat ile yarı havalandırmalı
fermantasyon denemesinde saptanmıştır. Fermantasyon sonunda ortamda bulunan
etil asetat miktarları ise havalandırmalı, yarı havalandırmalı ve havalandırmasız
4. ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA Murat YILMAZTEKİN
86
ortamlarda gerçekleştirilen denemeler için sırasıyla 91, 1920 ve 207.8 mg/L olarak
belirlenmiştir.
Çizelge 4.8. Farklı havalandırma koşullarında P. anomala NCYC 432 tarafındanüretilen etil asetat miktarları ve üretim hızları
Havalandırma
koşulu
Etil asetat miktarı
(mg/L)
Etil asetat üretim hızıx
(mg/L/saat)
Havalandırmalı 145.98c±2.02 1.521by±0.0210
Havalandırmasız 319b±0.85 1.893c±0.0054
Yarı havalandırmalı 6706.55a±4.88 23.287a±0.0169
Önem düzeyi *** ***x: Etil asetat üretim hızları denemeler sırasında en yüksek değere ulaşılan saatlerde hesaplanmıştır. y:Aynı sütunda değişik harflerle gösterilen değerler arasındaki fark istatistiksel olarak önemlidir(p<0.05). ***: p<0.001.
Mayalarda etil asetat, ya AATaz aktivitesi ile etil alkol ve asetil koenzim
A’dan veya ters esteraz aktivitesi ile etil alkol ve asetat’tan üretilir. Bu iki enzimin
etil asetat üretimine katkısı maya cinsine göre farklılık gösterir. Etil asetat üretimine
neden olarak iki farklı mekanizmanın olduğu düşünülmektedir. Bunlardan biri maya
için toksik etki yapabilecek asetat ve etil alkolün hücreden uzaklaştırılması, diğeri ise
serbest koenzim A sirkülasyonunun sağlanmasıdır (Fredlund, 2004; Fredlund ve ark.,
2004a ). P. anomala’nın glukoz içeren ve havalandırmanın yapıldığı ortamda etil
asetat ürettiği ve oksijen miktarının arttırıldığı zaman üretilen etil asetat miktarında
düşüş olduğu farklı kaynaklarda bildirilmiştir (Gray, 1949; Davies ve ark., 1951;
Tabachnick ve Joslyn, 1953; Fredlund ve ark., 2004a). Passoth ve ark. (2004),
ortama verilen oksijen miktarının kısıtlandığı durumlarda etil asetat miktarında 10
kat artışın meydana geldiğini bildirmişlerdir. Rojas ve ark. (2001) ise bu görüşün
aksine oksijenin kısıtlandığı koşullarda üretilen etil asetat miktarının oksijenli ortam
koşullarına nazaran daha az olduğunu belirtmişlerdir.
Bu araştırmada, havalandırmasız ortamda üretilen etil asetat miktarı
havalandırmalı ortamda üretilenin yaklaşık iki katı bulunmuştur. Yarı havalandırmalı
ortamda ise havalandırmalı ortamda üretilen etil asetat miktarının 45 katına
ulaşılmıştır. Havalandırmanın kısıtlı yapıldığı durumda ortamda oluşan etil asetat
4. ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA Murat YILMAZTEKİN
87
miktarının arttığı gözlenmiştir. Benzer sonuçlar Passoth ve ark. (2004) tarafından da
belirlenmiştir.
5. SONUÇ ve ÖNERİLER Murat YILMAZTEKİN
88
5. SONUÇ ve ÖNERİLER
Bu çalışmada, W. saturnus türüne ait üç farklı maya ırkı ile melastan
fermantasyon yoluyla izoamil asetat üretimi gerçekleştirilmiş; en iyi verime sahip W.
saturnus ırkı kullanılarak farklı sıcaklıklarda ve havalandırma koşullarında
fermantasyon denemeleri kurularak sıcaklığın ve havalandırmanın izoamil asetat
üretimine etkisi araştırılmış; saptanan en uygun koşullarda melas ortamına farklı
konsantrasyonlarda fuzel yağı ilave edilerek biyodönüşüm yoluyla izoamil asetat
üretiminin arttırılması hedeflenmiştir. Benzer şekilde Pichia cinsine ait iki farklı
maya kullanılarak fermantasyon yoluyla melastan etil asetat üretimi
gerçekleştirilmiş; en fazla etil asetat üreten maya kullanılarak farklı sıcaklıklarda ve
havalandırma koşullarında fermantasyon gerçekleştirilerek sıcaklığın ve
havalandırmanın etil asetat üretimine etkisi araştırılmıştır.
İzoamil Asetat Üretiminde; W. saturnus türüne ait üç farklı maya ırkından en
fazla izoamil asetat üretenin W. saturnus HUT 7087 olduğu tespit edilmiştir. İzoamil
asetat üretim miktarı açısından yapılan karşılaştırmada bütün maya ırklarının
birbirine yakın olduğu, ancak birim saatte üretilen izoamil asetat miktarı yani üretim
hızı dikkate alındığında mayalar arasındaki farkın önemli olduğu bulunmuştur
(p<0.05).
W. saturnus HUT 7087 mayası ile üretilen izoamil asetat miktarları ve
izoamil asetat üretim hızları bakımından 25 ºC’de gerçekleştirilen fermantasyon
denemesi ile 15 ºC’de gerçekleştirilen fermantasyon denemesi arasındaki farklılık
istatistiksel açıdan önemli bulunmuştur (p<0.001). 25 ºC’de üretilen izoamil asetat
miktarı 20.7 mg/L ile en yüksek seviyesine ulaşırken, 15 ºC’de üretilen izoamil asetat
miktarı 29.4 mg/L ile en yüksek seviyesine ulaşmıştır. Ancak, üretim verimliliği
açısından birim zamanda üretilen izoamil asetat miktarı yani üretim hızı göz önüne
alındığında, 25 ºC’de daha fazla izoamil asetat üretilmiştir.
Aynı maya ırkı kullanılarak farklı havalandırma koşullarında gerçekleştirilen
denemelerde ise izoamil asetat miktarları ve izoamil asetat üretim hızları açısından
uygulanan havalandırma koşulları arasındaki farklılıklar istatistiksel açıdan önemli
5. SONUÇ ve ÖNERİLER Murat YILMAZTEKİN
89
bulunmuştur (p<0.001). En yüksek izoamil asetat miktarı yarı havalandırmalı
ortamda 118.1 mg/L olarak saptanmıştır.
Fermantasyon denemeleri ile belirlenen en uygun koşullarda biyodönüşüm
yoluyla izoamil asetat üretiminin arttırılmasına yönelik gerçekleştirilen denemelerde
ise, % 1 fuzel yağı ilavesiyle üretilen izoamil asetat miktarı 3 kat artmıştır (354
mg/L). Ortama ilave edilen fuzel yağının belirli bir konsantrasyondan sonra maya
gelişimini olumsuz etkilediği belirlenmiştir. Fuzel yağında büyük oranda bulunan ve
izoamil asetat üretiminde substrat olarak kullanılan 2-metil-1-butanol ve 3-metil-1-
butanol’ün biyodönüşüm verimleri kıyaslandığında, fuzel yağı ilave edilen
denemeler arasındaki farklılık önemli bulunmuştur (p<0.01). En yüksek
biyodönüşüm verimi 2-metil-1-butanol ve 3-metil-1-butanol için %1 fuzel yağı ilave
edilen denemede saptanmıştır. Ancak, 3-metil-1-butanol’ün dönüşüm oranı 2-metil-
1-butanol’ün dönüşüm oranından yüksek bulunmuştur. Ortama ilave edilen fuzel
yağı miktarının % 1’in üzerinde olduğu zaman AATaz enziminin doymuş hale
geldiğini ve dolayısıyla daha fazla izoamil asetat üretilemediği sonucuna varılmıştır.
Etil Asetat Üretiminde; Pichia cinsine ait mayalardan P. anomala NCYC 432
mayasının P. subpelliculosa NCYC 436 mayasına göre daha fazla etil asetat ürettiği
saptanmıştır. P. anomala NCYC 432 mayası ile üretilen etil asetat miktarları ve etil
asetat üretim hızları bakımından uygulanan sıcaklıklar arasındaki farklılık önemli
bulunmuştur (p<0.01). 25 ºC’de üretilen etil asetat miktarı 319 mg/L ile en yüksek
seviyesine ulaşırken, 15 ºC’de üretilen etil asetat miktarı ise 102.9 mg/L ile sınırlı
kalmıştır. Yine aynı şekilde, üretilen etil asetat miktarları ve etil asetat üretim hızları
açısından uygulanan havalandırma koşulları arasındaki farklılık önemli bulunmuştur
(p<0.001). Üretilen en yüksek etil asetat miktarı yarı havalandırmalı ortamda 6.7 g/L
olarak saptanırken, en düşük etil asetat miktarı 146 mg/L olarak belirlenmiştir. Etil
asetat üretim hızları karşılaştırıldığında, en yüksek değer 23.29 mg/L/saat ile yarı
havalandırmalı fermantasyon denemesinde saptanmıştır.
Araştırmadan elde edilen sonuçlara göre dikkate değer bazı önemli hususlar
ve öneriler aşağıda belirtilmiştir;
· Şeker endüstrisinin bir yan ürünü olan melas izoamil asetat ve etil asetat üretimi
için uygun bir fermantasyon ortamı olarak kullanılabilir. Damıtma artığı olan
5. SONUÇ ve ÖNERİLER Murat YILMAZTEKİN
90
fuzel yağı ise biyodönüşümle izoamil asetat üretiminde uygun bir substrat olarak
değerlendirilebilir.
· Araştırmada kullanılan fermentör, peristaltik pompa düzeneğine sahip olmadığı
için ortam pH’sının kontrolü sağlanamamıştır. Dolayısıyla ileriki çalışmalarda
fermantasyon sırasında üretimde etkili olabilecek önemli bir parametre olan
pH’nın sürekli sabit tutularak farklı pH koşullarının denenmesi yararlı olacaktır.
· Fermantasyon başlangıcında ortama yeterli miktarda hava verilerek maya
gelişiminin teşvik edilmesinin ve daha sonra, mayalar durgun faza girdiği zaman,
verilen hava miktarı azaltılarak fermantasyona devam edilmesinin, üretilen
izoamil asetat ve etil asetat miktarını arttırabileceği düşünülmektedir.
· Üretilen izoamil asetat miktarı şu ana kadar W. saturnus mayası ile elde edilen en
yüksek miktar olmasına rağmen endüstriyel ölçekli üretim için düşüktür. Bu
yüzden, izoamil asetat üretimini arttırmak için başta kullanılan maya türünün
genetik olarak iyileştirilmesine olanak sağlayacak yeni çalışmalara ihtiyaç vardır.
· P. anomala mayası ile üretilen etil asetat miktarının tatminkar olduğu
düşünülmekte ve bundan sonraki aşamalarda üretilen aroma maddesinin
ortamdan izole edilmesi ve saflaştırılması amacıyla yapılacak yeni çalışmalara
gerek duyulmaktadır.
· Biyoteknolojik yolla doğal izoamil asetat ve etil asetat üretiminde, bu alanda
faaliyet gösteren kuruluşlar ve fabrikalar ile karşılıklı işbirliğine gidilerek yeni
projeler geliştirilmesi ve bu projeler sonucunda üretim miktarının arttırılarak
ekonomik açıdan endüstriyel ölçekte üretilebilir seviyelere taşınması, hem gıda
sanayinde doğal aroma maddelerinin kullanılmasına olanak sağlayacak hem de
ülke ekonomisine katkı sağlayacaktır.
91
KAYNAKLAR
ABBAS, H. ve COMEAU, L., 2003. Aroma synthesis by immobilized lipase from
Mucor sp. Enzyme and Microbial Technology, 32(5), 589-595.
ANONİM, 1997a. Türk Gıda Kodeksi Yönetmeliği (16 Kasım 1997). Dünya
Yayıncılık, İstanbul.
ANONİM, 1997b. Methods of Analysis. The Institute of Brewing, London.
ANONİM, 2002. Reference Methods fort he Analysis of Spirit Drinks. Official
Journal of the European Communities, Council regulation (EEC) No:
2870/2000, 47s.
BAYRAK, A. 2006. Gıda Aromaları. Gıda Teknolojisi Derneği Yayın No:32, s.1-44.
BERGER, R.G., 1995. Aroma Biotechnology. Springer, Berlin Heidelberg New
York, s.35-50.
BERRY, D.R., 1995. Alcoholic Beverage Fermentations (Lea, A.G.H. ve Piggott,
J.R editörler). Fermented Beverage Production, Blackie, London, s.169-213.
BERTRAND, A. ve TORRES-ALEGRE, V., 1984. Incidence de L’action de
L’oxygene sur la formation des produits secondaires de la fermentation
alcoolique du mout de raisin, Science des Aliments, 4, 45-64.
BISSON, L.F., KUNKEE, R.E. ve SINGLETON, V.L., 1998. Principles and
Practices of Winemaking. Springer Verlag, New York.
BOULTON, C. ve QUAIN, D., 2001. Brewing Yeast and Fermentation. Blackwell
Science, Great Britain, 644s.
BUZZINI, P., MARTINI, A., PAGNONI, U. M. ve DAVOLI, P., 2003. Production
of flavoured organic compounds (VOCs) by Candida oleophia GK10
optimisation using factorial design and response surface analysis. Enzyme
and Microbial Technology, 33, 668-675.
CALDERBANK, J. ve HAMMOND, J.R.M., 1994. Influence of Higher Alcohol
Availability on Ester Formation by Yeast, Journal of American Society of
Brewing and Chemistry, 52(2), 84-90.
92
CANBAŞ, A., 1988. Gıda Bilimi ve Teknolojisi. Çukurova Üni. Ziraat Fak. ders
kitabı, No:78, Çukurova Üni. Ziraat Fak. Ofset ve Teksir Atölyesi, Adana,
199s.
CANBAŞ, A., 1995. Ekmek Mayacılığı. Gıda Teknolojisi Derneği Yayınları, Yayın
No: 22, Ankara, 44s.
CASELLAS, G.B., 2005. Effect of low temperature fermentation and nitrogen
content on wine yeast metabolism. Universitat Roviari Virgili, Facultat
D’Enologia, Doktora Tezi, Tarragona.
CASEY, G.P., MAGNUS, C.A. ve INGLEDEW, W.M., 1984. High gravity brewing:
effects of nutrition on yeast composition, fermentative ability and alcohol
production. Applied and Environmental Microbiology, 48, 639.
CHANG, R., 2000. Physical Chemistry for the Chemical and Biological Sciences,
1st Edition, University Science Books, Sausalito, 1018s.
COLE, V.C. ve NOBLE, A.C., 2003. Flavor Chemistry, (Lea, A.G.H. ve Piggott,
J.R. editörler) Fermented Beverage Production, 2nd. ed., Kluwer
Academic/Plenum Publishers, New York, 423s.
COUTO, S.R., ve SANROMÁN, M.A, 2006. Application of solid-state fermentation
to food industry-A review. Journal of Food Engineering, 76, 291–302.
CROWEL, E.A. ve GUYMON, J.F., 1963. Influence of aeration and suspended
material on higher alcohols, acetoin, and diacetyl during fermentation. The
Annual Meeting of the American Society of Enologist, Sacremento,
California, 219-222.
CRUEGER, W. ve CRUEGER, A., 1990. Biotechnology: A Textbook of Industrial
Microbiolory. 2nd ed., Sinauer Associates, Inc., USA, 357s.
CURTIN, L.V., 1983. Molasses-General Consideration. Molasses in Animal
Nutrition, National Feed Ingredients Association, West Des Moines, Iowa,
11s.
ÇALIK, G., BERK, M., BOYACI, F.G., ÇALIK, P., TAKAÇ, S. ve ÖZDAMAR,
T.H., 2001. Pretreatment Processes of Molasses for the Utilization in
Fermentation Processes. Engineering and Manufacturaing for Biotechnology,
21-28.
93
DAUDT, C.E. ve OUGH, C.S., 1973. Variations in some volatile acetate esters
formed during grape juice fermentations: effects of fermentation temperature,
SO2, yeast strain and grape variety. American Journal of Enology and
Viticulture, 24, 130-135.
DAVIES, R., FALKINER, E.A., WILKINSON, J.F. ve PEEL, J.L., 1951. Ester
formation by yeast. 1. Ethyl acetate formation by Hansenula species.
Biochemical Journal, 49, 58-60.
DUFOUR, J.-P., MALCORPS, P. ve SILCOCK, P., 2003. Control of Ester Synthesis
During brewery Fermentation, (Smart K. editör), 2nd ed., Oxford Brookes
University, Blackwell Science, Oxford, U.K., 308s.
DUFOUR, J-P. ve MALCORPS, P., 1995. Ester synthesis during fermentation:
enzyme characterization and modulation mechanism. Proceedings of the 4th
Aviemore Conference on Malting, Brewing and Distilling, (Cambell I. ve
Priest, F.G. editörler), Institute of Brewing, London, s.137-151.
ELMACI, Y., 2001. Lezzet Maddeleri. Gıda Katkı Maddeleri, (Altuğ, T. editör),
Meta Basım, İzmir, s.143-159.
EPIFANIO, S.I., GUTIERREZ, A.R., SANTAMARI´A, M.P. ve LO´PEZ, R., 1999.
The influence of enological practices on the selection of wild yeast strains in
spontaneous fermentation. American Journal of Enology and Viticulture, 50
(2), 219– 224.
ERTEN, H. ve CAMPBELL, I., 2001. The production of low-alcohol wines by
aerobic yeasts. Journal of Institute of Brewing, 107 (4), 207-215.
ERTEN, H. ve CANBAŞ, A., 2003. Alkol fermantasyonu sırasında oluşan aroma
maddeleri. Gıda, 28(6), 615-619.
ERTEN, H., 1997. The Production of Low Alcohol Wines by Aerobic Yeasts.
Doktora Tezi, Department of Biological Sciences and Centre for Brewing and
Distilling, Heriot-Watt University, Edinburgh, 201s.
FLEET, G.H. ve HEARD, G.M., 1993. Yeasts-Growth during fermentation. Wine
Microbiology and Biotechnology, (Fleet, G.H. editör), Harwood Academic
Publishers, Switzerland, 510s.
94
FREDLUND, E., BLANK, L.M., SCHNURER, J., SAUER, U. ve PASSOTH, V.,
2004a. Oxygen- and glucose-dependent regulation of central carbon
metabolism in Pichia anomala. Applıed nnd Envıronmental
Mıcrobıology, 70(10), 5905-5911.
FREDLUND, E., BROBERG, A., BOYSEN, M.E., KENNE, L. ve SCHNURER, J.,
2004b. Metabolite profiles of the biocontrol yeast Pichia anomala J121
grown under oxygen limitation. Applied Microbiology and Biotechnology,
64, 403-409.
FREDLUND, E., 2004. Central carbom metabolism in the biocontrol yeast Pichia
anomala: Influence of oxygen limitation. Doktora Tezi, Swedish University
of Agricultural Sciences, Uppsala, 54s.
FUJII, T., KOBAYSHI, O., YOSHIMOTO, H., FURUKAWA, S. ve TAMAI, Y.,
1997. Effect of aeration and unsaturated fatty acids on expression of the
Saccharomyces cerevisiae alcohol acetyltransferase gene. Applied and
Environmental Microbiology, 63(3), 910-915.
GATFIELD, I.L., HILMER, J.M. ve BERTRAM, H.J., 2003. The alcohol
fermentation process as a source of natural flavour materials. Intitute of Food
Technologist Annual Meeting, Chicago.
GENT, D.P. ve SLAUGHTER, J.C., 1994. Intracellular distribution of amino acids
and higher alcohol production during fermentation. Proceedings of the 4th
Aviemore Conference on Malting, Brewing and Distilling, (Cambell I. ve
Priest, F.G. editörler), Institute of Brewing, London, 294-297.
GÖKSUNGUR, Y., UÇAN, A. ve GÜVENÇ, U., 2004. Production of pullulan from
beet molasses and synthetic medium by Aureobasidium pullulans. Turkish
Journal of Biology, 28, 23-30.
GRAY, D.W., 1949. Initial studies on the metabolism of Hensenula anomala
(Hansen) Sydow. American Journal of Botany, 36, 475-480.
GUYMON, J.F., INGRAHAM, J.L. ve CROWELL, E.A., 1961. Influence of
Aeration upon the formation of Higher Alcohols by Yeasts. American Journal
of Enology and Viticulture, 12(2), 60-66.
95
GÜVENÇ, A., KAPUCU, N. ve MEHMETOĞLU, Ü., 2002. The production of
isoamyl acetate using immobilized lipases in a solvent-free system. Process
Biochemistry, 38, 379-386.
HAHN-HAGERDAL, B., KARHUMAA, K., LARSSON, C.U., GORWA-
GRAUSLUND, M., GORGENS, J. ve H van ZYL, W., 2005. Role of
Cultivation media in the development of yeast strains for large scale
industrial use. Microbial Cell Factories, 4(31), 1-16.
HAMMOND, J. R. M. ve PYE, J., 1996. Acetate ester synthesis: The role of alcohol
acetyl transferase. Brewing Technology, The Market and The Environment,
Proceedings of the 6th International Brewing Technology Conference,
Harrogate, North Yorkshire, 421-430.
HAMMOND, J.R.M., 1993. Brewer’s yeast, (Rose, H.A. ve Harrison, J.S. editörler),
The Yeasts, Vol: 5, Academic Pres, London, s. 7-67.
HEARD,G.M. ve FLEET, G.M.,1988. The effects of temperature and pH on the
growth of yeast species during the fermentation of grape juice. Journal of
Applied Bacteriology, 65, 23-28.
HERMAN, P.K., 2002. Stationary phase in yeast. Current Opinion in Microbiology,
5, 602-607.
HORTON, C.E., HUANG, K.-X., BENNETT, G.N. ve RUDOLPH, F.B., 2003.
Heterologous expression of the Saccharomyces cerevisiae alcohol
acetyltransferase genes in Clostridium acetobutylicum and Escherichia coli
for the production of isoamyl acetate. Journal of Industrial Microbiology and
Biotechnology, 30, 427-432.
INOUE, Y., TREVANICHI, S., FUKUDA, K., IZAWA, S., WAKAI, Y. ve
KIMURA, A., 1997. Roles of esterase and alcohol acetyltransferase on
production of isoamyl acetate in Hansenula mrakii. Journal of Agriculture
and Food Chemistry, 45, 644-649.
IWASE, T., MORİKAWA, T., FUKUDA, H., SASAKİ, K. ve YOSHİTAKE, M.,
1995. Production of Fruity Odor by Genus Williopsis. Journal of Brewery
Society of Japan, 90(5), 394-396.
96
JANSSENS, L., DE POOTER, H.L., SCHAMP, N.M. ve VANDAMME, E.J., 1992.
Production of flavours by microorganisms. Process Biochemistry, 27, 195-
215.
JANSSENS, L., DE POORTER, H.L., VANDAMME, E.J. ve SCHAMP, N.M.,
1987. Production of flavours by the yeast Hansenula mrakii. Med. Fac.
Landbouwwet., Rijksuniv. Gent, 54 (4), 1907-1913.
JANSSENS, L., DE POORTER, H.L., DE MEY, L., VANDAMME, E.J. ve
SCHAMP, N.M., 1989. Fusel oil as a precursor for the microbial production
of fruity flavours. Med. Fac. Landbouwwet., Rijksuniv. Gent, 54 (4a), 1387-
1391.
KAJIWARA, Y., OGAWA, K., TAKASHITA, H., OMORI, T., SHIMODA, M. ve
WADA, H., 1997. Intracellular fatty acid formation and alcohol acetyl
transferase gene expression in brewing yeast (Saccharomyces cerevisiae)
treated with heat shock. Journal of Fermentation and Bioengineering, 84(6),
594-598.
KALOGIANNIS, S., IAKOVIDOU, G., LIAKOPOULOU-KYRIAKIDES, M.,
KYRIAKIDIS, D.A. ve SKARACIS G.N., 2003. Optimization of xanthan
gum production by Xanthomonas campestris grown in molasses. Process
Biochemistry, 39(2), 249-256.
KELLY, J., CHAPMAN, S. ve BRERETON, P., 1999. Gas Chromatographic
Determination of Volatile Congeners in Spirit Drinks: Interlaboratory Study.
Journal of AOAC International, 82(6), 1375-1388.
KESHK, S.M.A.S., RAZEK, T.M.A. ve SAMESHIMA, K., 2006. Bacterial
Cellulose Production from Beet Molasses. African Journal of Biotechnology,
5(17), 1519-1523.
KORUKLUOĞLU, M., 1998. Doğal aroma maddeleri üretiminde
mikroorganizmalar. Gıda, 23(1), 48-50.
KRISHNA, S.H., DİVAKAR, S., PRAPULLA, S.G. ve KARANTH, N.G., 2001.
Enzymatic synthesis of isoamyl acetate using immobilized lipaze from
Rhizomucor miehei. Journal of Biotechnology, 87, 193-201.
97
KRINGS, U. ve BERGER, R.G., 1998. Biotechnological production of flavours and
fragrances. Applied Microbiology and Biotechnology, 49, 1-8.
KURIYAMA, H. ve KOBAYASHI, H., 1993. Effects of oxygen supply on yeast
growth and metabolism in continuous fermentation. Journal of Fermentation
and Bioengineering, 75, 364-367.
KURTZMAN, C.P., 1998. Pichia E.C. Hansen emend. Kurtzman. (Kurtzman, C.P.
ve. Fell, J.W. editörler) The Yeasts, a Taxonomic Study, 4th ed., Elsevier,
Amsterdam, 273-352.
LANDAUD, S. KATRİLLE, E. ve CORRİEU, G., 2001. Top pressure and
temperature control the fusel alcohol/ester ratio through yeast growth in beer
fermentation. Journal of The Institute of Brewing, 107(2), 107-117.
LAUFENBERG, G., KUNZ, B. ve NYSTROEM, M., 2003. Transformation of
vegetable waste into value added products: (A) the upgrading concept; (B)
practical implementations. Bioresource Technology, 87, 167-198.
LEE, B.H., 1996. Fundamentals of Food Biotechnology. VCH Publishers Inc., USA,
431s.
LEE, K., 2005. A media design program for lactic acid production coupled with
extraction by electrodialysis, Bioresource Technology, 96, 1505-1510.
LEWIS, M.J. ve YOUNG, T.W., 2002. Brewing, 2nd ed., Kluwer Academic/Plenum
Publishers, New York, 398s.
LLAURADO, J., ROZES, N., BOBET, R., MAS, A. ve CONSTANTI, M., 2002.
Low temperature alcoholic fermentations in high sugar concentration grape
musts. Journal of Food Science, 67(1), 268-273.
LONGO, M.A. ve SANROMÁN, M.A, 2006. Production of Food Aroma
Compounds. Food Technology and Biotechnology 44 (3), 335–353.
MASON, A.B. ve DUFOUR, J-P., 2000. Alcohol acetyltranferases and the
significance of ester synthesis in yeast. Yeast, 16, 1287-1298.
MATEO, J.J., JIMENEZ, M., HUERTA, T. ve PASTOR, A., 1991. Contribution of
different yeasts isolated from musts of monastrell grapes to the aroma of
wine. International Journal of Food Microbiology, 14, 153-160.
98
MAURICIO, J.C., MORENO, J., ZEA, L., ORTEGA, J.M. ve MEDINA, M., 1997.
The Effect of Grape Must Fermentation Conditions on Volatile Alcohols and
Esters Formed by Saccharomyces cerevisiae, Journal of Science of Food and
Agriculture, 75, 155-160.
MAURICIO, J.C., MORENO, J.J., VALERO, E.M., ZEA, L., MEDINA, M. ve
ORTEGA, J.M., 1993. Ester formation and specific activities of in vitro
alcohol acetyltransferase and esterase by Saccharomyces cerevisiae during
grape juice fermentation. Journal of Agriculture and Food Chemistry, 41,
2086-2091.
MEDEIROS, A.B., PANDEY, A., FREİTAS, R.J.S., CHRİSTEN, P. ve SOCCOL,
C.R., 2000. Optimization of the production of aroma compounds by
Kluyveromyces marxianus in solid-state fermentation using factorial design
and response surface methodology. Biochemical Engineering Journal, 6, 33-
39.
MILLER, T.L. ve CHURCHILL, B.W., 1986. Substrates for large scale
fermentations. (Demain, A.L. ve Solomon, N.A. editörler), Industrial
Microbiology and Biotechnology, American Society for Microbiology,
Washington, D.C., 122-136.
MINGORANCE-CAZORLA, L., CLEMENTE-JIMENEZ, J.M., MARTINEZ-
RODRIGUEZ, S. ve LAS HERAS-VASQUEZ, F.J., 1993. Contribution of
different natural yeasts to the aroma of two alcoholic beverages. World
Journal of Microbiology and Biotechnology, 19, 297-304.
NAGODAWITHANA, T.W., CASTELLANO, C. ve STEINKRAUS, K.H., 1974.
Effect of dissolved oxygen, temperature, initial cell count and sugar
concentration on the viability of Saccharomyces cerevisiae in rapid
fermentations. Applied Microbiology, 28, 383.
NAJAFPOUR, G.D., 2007. Biochemical Engineering and Biotechnology. Elsevier
Press, Amsterdam. s.1-13.
NYKANEN, L., 1986. Formation and occurance of flavor compounds in wine and
distilled alcoholic beverages. American Journal of Enology and Viticulture,
37(1), 84-95.
99
OSHITA, K., KUBATO, M., UCHIDA, M. ve ONO, M., 1995. Clarification of the
relationship between fusel alcohol formation and amino acid assimilation by
brewing yeast using 13C-labeled amino acid. Proceedings of the 25th
European Brewery Congress, Brussels, IRL, Oxford, s 387-394.
OUCHI, K., YAMAMOTO, Y., TAKAGISHI, M. ve AKIYAMA, H., 1980.
Regulation of isoamyl alcohol formation via Erlich pathway in
Saccharomyces cerevisiae. Journal of Fermentation Technology, 58, 301-309.
OUGH, C.S. ve AMERINE, M.A., 1967. Studies with controlled fermentation. X.
Effect of fermentation temperature on some volatile compounds. American
Journal of Enology and Viticulture,12,117-128.
OUGH, C.S., 1966. Fermentation rates of grape juice. III. Effects of initial ethyl
alcohol, pH and fermentation temperature. American Journal of Enology and
Viticulture, 17, 74.
ÖZDAMAR, K., 1999. Paket programlar ile istatistiksel veri analizi. Kaan Kitabevi,
Eskişehir, 535s.
PANDEY, A., SOCCOL, R.C., NIGAM, P. ve SOCCOL, V.T., 2000.
Biotechnological potential agro-industrial residues. I. Sugarcane bagasse.
Biosesource Technology, 74, 69-80.
PASSOTH, V., FREDLUND, E., DRUVEFORS, U.A. ve SCHNURER, J., 2006.
Biotechnology, physiology and genetics of the yeast Pichia anomala. FEMS
Yeast Research, 6, 3-13.
PEDDIE, A.B.H., 1990. Ester formation in brewery fermentations. Journal of
Institute of Brewing, 96, 327-331.
PEKİN, B., 1993. Biyokimya Mühendisliği (Biyoteknoloji). Ege Üniversitesi Kimya
Fakültesi Yayınları, No: 3, Mas Ambalaj, s.1-89.
PEREZ, E.R., CARDOSO, D.R. ve FRANCO, D.W., 2001. Análıse Dos Álcooıs,
Ésteres E Compostos Carbonílıcos Em Amostras De Óleo Fúsel, Quim. Nova,
Vol. 24, No. 1, 10-12.
PLATA, C., MILLAN, C., MAURICIO, J.C. ve ORTEGA, J.M., 2003. Formation of
ethyl acetate and isoamyl acetate by various spicies of wine yeasts. Food
Microbiology, 20, 217-224.
100
QUILTER, M.G., HURLEY, J.C., LYNCH, F.J. ve MURPHY, M.G., 2003. The
production of isoamyl acetate from amyl alcohol by Saccharomyces
cerevisiae. Journal of Insitute of Brewing, 109 (1), 34-40.
REINECCIUS, G., 2006. Flavor Chemistry and Technology, CRC Press, Boca
Raton. s.123-298.
RIBÉREAU-GAYON, P., DUBOURDIEU, D., DONÈCHE, B. ve LONVAUD, A.,
2006. Handbook of Enology, Vol. 1, 2nd edition, The Microbiology of Wine
and Vinifications, Wiley, 512s.
RIBE´REAU-GAYON, J., PEYNAUD, E., RIBE´REAU-GAYON, P. ve
SUDRAUD, P., 1975. Sciences et Techniques du vinTraite´ d’Oenologie II.
Dunod, Paris.
RIBE´REAU-GAYON, P., DUBOURDIEU, D., DONE`CHE, B. VE LONVAUD,
A., 2000. Handbook of Enology. The Microbiology of Wine and
Vinifications, vol. I. Wiley, West Sussex, England.
RIVAS, B., MOLDES, A.B., DOMINGUEZ, J.M. ve PARAJO, J.C., 2004.
Development of culture medium containing spent yeast cells of Debaromyces
hansenii and corn step liquor for lactic acid production with Lactobacillus
rhamnosus. International Journal of Food Microbiology, 97, 93-98.
ROJAS, V., GIL, J.V., PINAGA, F. ve MANZANARES, P., 2001. Studies on
acetate ester production by non-Saccharomyces wine yeasts. International
journal of Food Microbiology, 70, 283-289.
ROUKAS, T., 1998. Pretreatment of beet molasses pullulan production to increase
pollulan production. Process Biochemistry, 33(8), 805-810.
SAERENS, S.M.G., DELVAUX, F., VERSTREPEN, K.J., DIJCK, P.V.,
THEVELEIN, J.M. ve DELVAUX, F.R., 2008. Parameters affecting ethyl
ester production by Saccharomyces cerevisiae during fermentation. Applied
and Environmental Microbiology, 74(2), 454-461.
SHARF, R. ve MARGALITH, P., 1983. The effect of temperature on spontaneous
wine fermentation. European Journal of Applied Microbiology and
Biotechnology, 17, 311-313.
101
STANBURY, P. F., WHITAKER, A. ve HALL, S. J., 1995. Principles of
Fermentation Technology, 2nd ed., Pergamon, U. K., 357s.
TABACHNICK, J. ve JOSLYN, M.A., 1953. Formation of esters by yeast. I. The
production ethyl acetate by standing surface cultures of Hansenula anomala.
Journal of Bacteriology, 65, 1-9.
TELEFONCU, A., 1995. Biyoteknoloji. Ege Üniversitesi Fen Fakültesi Yayınları,
No: 152, Ege Üniversitesi Basımevi, İzmir, 357s.
THURSTON, P.A., QUAİN, D.E. ve TUBB, R.S., 1982. Lipid-Metabolism and The
Regulation of Volatile Ester Synthesis in Saccharomyces cerevisiae. Journal
of the Institute of Brewing, 88(2), 90-94.
TORIJA, M.J., ROZE`S, N., POBLET, M., GUILLAMO´N, J.M. ve MAS, A., 2003.
Effects of fermentation temperature on the strain population of
Saccharomyces cerevisiae. International Journal of Food Microbiology, 80,
47-53.
VAN URK, H., POSTMA, E., SCHEFFERS, W.A. ve VAN DIJKEN, J., 1989.
Glucose transport in Crabtree-positive and Crabtree-negative yeasts. Journal
of General Microbiology, 135, 2399-2406.
VADALI, R.V., HORTON, C.E., RUDOLPH, F.B., BENNETT, G.N. ve SAN, K.–
Y., 2004. Production of isoamyl acetate in ackA-pta and/or ldh mutants of
Ecsherichia coli with overexpression of yeast ATF2. Applied Microbiology
and Biotechnology, 63(6), 698-704.
VALERO, E., MOYANO, L., MILLAN, M.C., MEDINA, M. ve ORTEGA, J.M.,
2002. Higher alcohol and ester production by Saccharomyces cerevisiae.
Influence of initial oxygenation of the grape must. Food Chemistry, 78, 57-
61.
VANDAMME, E. J. ve SOETAERT, W., 2002. Bioflavours and fragrances via
fermentation and biocatalysis. Journal of Chemical Technology and
Biotechnology, 77, 1323-1332.
VANDAMME, E.J., 2003. Bioflavours and fragrances via fungi and their enzymes.
Fungal Diversity, 13, 153-165.
102
VANDERHAEGEN, B., NEVEN, H., COGHE, S., VERSTREPEN, K. J.,
DERDELINCKX, G. ve VERACHTERT, H., 2003. Bioflavouring and beer
refermentation. Applied Microbiology and Biotechnology, 62, 140-150.
VERSTREPEN, K.J., DERDELİNCKX, G., DUFOUR, J-P., WİNDERİCKX, J.,
THEVELEİN, J.M., PRETORİUS, I.S. ve DELVAUX, F.R., 2003a. Flavor-
active esters: Adding fruitiness to beer. Journal of Bioscience and
Bioengineering, 96 (2), 110-118.
VERSTREPEN, K.J., DERDELİNCKX, G. ve DELVAUX, F.R., 2003b. Esters in
beer-part 2: Controlling ester levels during beer fermentation: a biochemical
approach. Cerevisiae, 28 (4).
WAITES, M. J., MERGAN, N. L., ROCKEY, J. S. ve HIGTON, G., 2001. Industrial
Microbiology: An Introduction, Blackwell Science Ltd., USA, 288s.
WALES, D.S., CARTLEDGE, T.G. ve LLOYD, D., 1980. Effect of Glucose and
aerobiosis on the activities and subcellular distribution of Tricarboxylic acid
cycle and associated enzymes in Saccharomyces carlsbergensis. Journal of
General Microbiology, 116, 93-98.
WINTERHALTER, P. ve SCHREIER, P., 1993. Biotechnology: Challenge for the
Flavor Industry. Flavor Science, American Chemical Society, 225-258.
XU, P., HUA, D. ve MA, C., 2007. Microbial transformation of propenylbenzenes
for natural flavour production. Trends in Biotechnology 25, 571-576.
YOSHIOKA, K. ve HASHIMOTO, N., 1984. Ester Formation By Brewers-Yeast
During Sugar Fermentation, Agricultural and Biological Chemistry, 48 (2):
333-340.
YOUNIS, S.O. ve STEWART, G.G., 1998. Sugar uptake and subsequent ester and
higher alcohol production by Saccaharomyces cerevisiae. Journal of Institute
of Brewing, 104, 255-264.
ZÖHRE, D. E. ve ERTEN, H., 2003. The influence of Kloeckera apiculata and
Candida pulcherrima yeasts on wine fermentation. Process Biochemistry, 38
(3): 319-324.
103
ÖZGEÇMİŞ
1975 yılında Şanlıurfa’da doğdu. İlk öğrenimini Şanlıurfa’da tamamladıktan
sonra 1994 yılında İnönü Üniversitesi Mühendislik Fakültesi Gıda Mühendisliği
Bölümü’nde lisans öğrenimine başladı. 1998 yılında bu bölümden mezun olduktan
sonra aynı yıl Harran Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Gıda Mühendisliği
Anabilim Dalı’nda Yüksek Lisans öğrenimine başladı. 2000 yılında İnönü
Üniversitesi Mühendislik Fakültesi Gıda Mühendisliği Bölümü’ne araştırma
görevlisi olarak atandı. 2001 yılında yüksek lisans öğrenimini tamamladıktan sonra
2003 yılında Yüksek Öğretim Kurulu Kanunu’nun 35. maddesi gereğince Çukurova
Üniversitesi Ziraat Fakültesi Gıda Mühendisliği Bölümü’ne atanarak doktora
öğrenimine başladı. Halen aynı bölümde araştırma görevlisi olarak akademik
hayatına devam etmektedir.