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UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE
BAJA CALIFORNIA SUR
Área de Conocimiento de Ciencias del Mar y de la Tierra
Departamento Académico de Ciencias Marinas y Costeras
TESIS
USO DE MARCADORES MOLECULARES PARA LA
DIFERENCIACIÓN GENÉTICA DE POBLACIONES
CULTIVADAS DE CAMARÓN BLANCO
Litopenaeus vannamei.
Que como requisito para obtener el título de:
Biólogo Marino
Presenta:
Víctor Suárez López
Director:
Ricardo Pérez Enríquez
La Paz, Baja California Sur, Mayo de 2016.
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5
AGRADECIMIENTOS
A mis padres “Negro José” y “La Nena”, a mis hermanas “Lupita y Alma”, a
mis hermanos “kike y Pepe”, muchas gracias por apoyarme y cuidarme en todo
momento de mi vida. A mis amigos, familia, maestros y mucha gente que he
conocido en esta aventura, les digo muchas gracias por alentarme para seguir
adelante.
A mi director de tesis, Dr. Ricardo Pérez, por darme la oportunidad,
confianza y apoyo en cada momento, gracias por la paciencia y su disposición.
A Susana Ávila, Adriana Max y Armando Medina por su apoyo y paciencia
para enseñarme a trabajar en laboratorio. A Mayra Vargas y Jesús Aguilar por su
apoyo para el mantenimiento y cultivo de los camarones. Al Dr. Rangel y Dr.
Cadena por su apoyo y confianza. A mí amada UABCS por todo lo que me ha
dado.
A las estrellas por dejarme vivir y soñar.
La tesis formó parte del proyecto PROGRAMA DE INNOVACION
TECNOLOGICA MEXICO-FRANCIA PARA EL MEJORAMIENTO GENETICO
DEL CAMARON DE CULTIVO LITOPENAEUS VANNAMEI LIBRE DE
PATOGENOS ESPECIFICOS”, en convenio entre ACUACULTURA MAHR, S.A.
DE C.V. y el CIBNOR.
6
DEDICATORIA
Mi trabajo es dedicado a mis padres “Nena” y “Pepe” que me
aman sin condición, para mis hermanos que me dan su amor y apoyo,
les digo muchas gracias por todos los consejos y regaños, para mis
sobrinas y sobrino que me motivan para aportar lo mejor de mí a la
sociedad y sus niños.
A mis amigos; Chuch, Beno, Checo, Magui, Yuri, Danga, Irving,
Mariana, Ana, Sandy, Paola, Dianis, Diana Lux, Blanca, Jazmine Le,
Carlos L, Mariana, y muchas personas más que en mi vida he
conocido, gracias por el empujón y las palabras de apoyo.
Para Víctor Suárez López, por seguir adelante y no dejar de
luchar a pesar de tantas dificultades…
7
INDÍCE GENERAL
1. INTRODUCCIÓN ............................................................................................. 9
2. ANTECEDENTES .......................................................................................... 12
3. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA ............................................................ 13
3.1 Hipótesis ................................................................................................. 14
3.2 Objetivos ................................................................................................. 14
4. MATERIAL Y MÉTODOS .............................................................................. 14
4.1 Obtención de muestras ........................................................................... 14
4.2 Extracción y análisis de ADN .................................................................. 16
4.3 Análisis de datos ..................................................................................... 17
5 RESULTADOS .............................................................................................. 18
5.1 Caracterización genética de los lotes 1 y 2. ............................................ 18
5.2 Frecuencia de alelos por locus y diferenciación genética para el Lote 1 y Lote 2. ............................................................................................................... 20
5.3 Análisis de Coordenadas Principales para la asignación de individuos. . 26
6 DISCUSIÓN ................................................................................................... 28
6.1 Uso de microsatélites .............................................................................. 28
6.2 Ventajas de microsatélites para este estudio .......................................... 30
6.3 Caracterización de Lotes. ........................................................................ 31
6.4 Prueba Fst ............................................................................................... 32
6.5 Análisis de Coordenadas Principales para la asignación de individuos .. 33
7. CONCLUSIÓN ............................................................................................... 35
8. REFERENCIAS ............................................................................................. 36
8
INDÍCE DE FIGURAS
Figura 1. Producción Nacional Acuícola de camarón blanco del Pacífico por
entidad federativa (2010)...................................................................................... 10
Figura 2. Frecuencias obtenidas de alelos en el Lote 1 y Lote 2 para el locus
Pvan1815. ............................................................................................................ 20
Figura 3. Frecuencias obtenidas de alelos en el Lote 1 y Lote 2 para el locus
Pvan1758. ............................................................................................................ 20
Figura 4. Frecuencias obtenidas de alelos en el Lote 1 y Lote 2 para el locus
Lvan05.................................................................................................................. 21
Figura 5. Frecuencias obtenidas de alelos en el Lote 1 y Lote 2 para el locus
TUMXlv10.312. ..................................................................................................... 22
Figura 6. Frecuencias obtenidas de alelos en el Lote 1 y Lote 2 para el locus
TUMXlv8.256. ....................................................................................................... 23
Figura 7. Frecuencias obtenidas de alelos en el Lote 1 y Lote 2 para el locus
Livann51. .............................................................................................................. 24
Figura 8. Frecuencias obtenidas de alelos en el Lote 1 y Lote 2 para el locus
Livann60. .............................................................................................................. 25
Figura 9. Distribución bidimensional de los individuos de los Lote 1 y Lote 2 de
acuerdo a su composición genética basada en 7 locus. ...................................... 26
Figura 10. Indica la asignación de individuos del Lote mezcla. ............................ 27
INDÍCE DE TABLAS Tabla 1. Caracterización genética del Lote 1 y Lote 2; n=número de organismos;
na=número de alelos; Ho=Heterocigocidad observada; He=Heterocigocidad
esperada; HW= Hardy-Weinberg. ........................................................................ 19
Tabla 2. Valores de Z estandarizada a la prueba de signos entre Lote 1 y 2. ...... 19
Tabla 3. Asignación de individuos del Lote Mezcla a Lote 1 y Lote 2. ................. 27
Tabla 4. Muestra los resultados obtenidos para las pruebas F de Fisher y t
Student, para los pesos del lote mezcla. .............................................................. 28
9
1. INTRODUCCIÓN
El camarón blanco Litopenaeus vannamei es una especie de suma
importancia comercial. Este crustáceo es originario de la costa oriental del
Océano Pacífico y se distribuye desde el norte de México hasta las costas de
Perú; es considerado un organismo de zona tropical, debido a que la temperatura
del agua marina en donde habita oscila normalmente por arriba de los 20 ºC
durante todo el año; los organismos adultos habitan y se reproducen en mar
abierto, las postlarvas migran a la costa en donde pasarán su etapa juvenil, las
etapas de adolecente y preadultas las viven en estuarios, lagunas costeras y
manglares, (FAO, 2015). El camarón blanco es uno de los recursos pesqueros
más importantes y con ello ha recibido un notable impacto pesquero y un
deterioro ambiental de su hábitat. Debido a esto se han buscado nuevas
alternativas como es el cultivo en granjas a nivel industrial para la obtención de
esta proteína. Diferentes técnicas como son los microsatélites han demostrado la
perdida de variabilidad genética y la baja de productividad en cultivos de camarón
blanco (Artiles et al., 2011).
En la década de los años 70’s en la Florida se logró por primera vez la
reproducción artificial de camarón blanco Litopenaeus vannamei, para esto se
utilizaron nauplios procedentes de Panamá, debido a los resultados positivos el
cultivo comercial de esta especie comenzó en Centro y Sudamérica, tiempo
después la mejora en las técnicas para su cultivo y el buen rendimiento dio lugar a
su cultivo intensivo en Hawaii y áreas continentales en Norte, Centro y
Sudamérica. Para el año 2004 se registró una producción de 111,600 toneladas
de camarón blanco, esto por arriba de otras especies de camarón cultivado como
es P. monodon en China; sin embargo los temores a la proliferación de
enfermedades exóticas han mantenido al camarón blanco bajo restricciones para
su cultivo en varios países de Asia, en Latinoamérica en la mayoría de los países
se han determinado programas de sanidad acuícola y temporadas de cultivo
(FAO, 2015).
10
En México la camaronicultura tuvo su inicio en la década de los 80’s, para
el año de1985 se registran incrementos en las áreas de cultivo. En años recientes
el cultivo de camarón se ha considerado como la actividad acuícola más
importante en el país, estudios realizados por CONAPESCA registra una
producción por cultivo de camarón blanco en México de 60,292 toneladas para
2013, con un promedio desde 2007 de 107,187 toneladas (CONAPESCA, 2013).
La producción de camarón blanco a nivel nacional se ha incrementado, con ello
las técnicas y las instalaciones para su cultivo a niveles industriales. Los estados
más destacados en 2010 con el mayor número de unidades de producción
acuícola en operación son: Sinaloa, Jalisco y Sonora (Fig. 1); estos estados han
adoptado buenas prácticas de manejo y llegan a reducir su capacidad de cultivo si
es necesario (INAPESCA, 2012).
Figura 1. Producción Nacional Acuícola de camarón blanco del Pacífico por entidad
federativa (2012).
La mayor producción de camarón blanco se da en el Noreste del país, se
distinguen cinco principales estados productores de camarón blanco, cuatro
pertenecen a esta región (INAPESCA, 2012).
El crecimiento de esta industria es acelerado y se han generado nuevas
técnicas de cultivo para camarón y registrar así un aumento en la producción, no
obstante las mejoras para aumentar la producción de camarón blanco aún es
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dependiente de factores que limitan su desarrollo, un punto muy importante a
considerar es la disponibilidad de reproductores viables para la obtención de una
postlarva de alta calidad, por ello se han implementado diversos programas para
evitar la insuficiencia en cantidad y calidad de postlarvas, se busca ofrecer un
producto con mayor rendimiento para camaronicultores. Una insuficiencia común
fue la dependencia a reproductores silvestres que eran utilizados para la
producción de postlarva; para subsanar estas insuficiencias se realizaron
acuerdos entre productores, como el hecho en 2002 en la reunión para el
desarrollo de la acuicultura realizado en Bangkok en donde se establecieron
programas de mejoramiento animal que incluían el desarrollo y el uso de mejores
prácticas para el manejo de bancos de reproductores para la obtención de larvas
de primera calidad, esto bajo prácticas de mejoramiento genético.
Se ha constatado que los programas genéticos son una herramienta
importante para el aumento de la productividad y beneficio de esta industria, las
características en las que se busca incidir son en aspectos tales como un número
menor de muertes en cultivos, mejor rendimiento de los recursos y menor riesgo
ambiental (Borrel et al., 2006).
Programas genéticos aplicados en el cultivo de camarón han tenido
resultados positivos, la selección y técnicas genéticas aplicadas en reproductores
son en día comúnmente utilizadas, el uso de marcadores moleculares para el
seguimiento de linajes de interés es una práctica iterativa en tiempos actuales,
esto mediante la combinación de técnicas génicas que buscan potenciar la
actividad acuícola (Borrel et al., 2006). Grandes esfuerzos se han realizado para
la selección de reproductores, la selección de caracteres deseados es
acompañada de un programa de seguimiento genético que se considera clave
para obtener los mejores resultados.
Los marcadores moleculares son indispensables para estudios genéticos
en poblaciones cultivadas o silvestres, las técnicas para estimar variaciones
genéticas con base en el ADN son aplicadas para el análisis de poblaciones,
permiten identificar poblaciones con baja diversidad genética y posiblemente con
una alta vulnerabilidad a cambios ambientales; también es posible distinguir
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subpoblaciones genéticamente diferenciadas del resto y con ello dar seguimiento
al linaje de interés, ya sea con objeto de conservación o comercial; son útiles para
determinar genealogías génicas y conocer el parentesco entre organismos para
posibles cruzas evitando altos niveles de endogamia y posible depresión biológica
(González, 2003).
Técnicas útiles para estudios genéticos son conocidas por sus siglas en
inglés; SNPs (Nucleótidos polimórficos simples), los AFLPs (Amplificación del
largo del fragmento polimórfico), los VNTRs (Número variable de tándem
repetidos), los RFLPs (Largo de fragmentos polimórficos de restricción) y los
SSRs (repeticiones de secuencias cortas) comúnmente llamados microsatélites,
(González, 2003). Estas técnicas están basadas en polimorfismos y con ellas es
posible diferenciar entre individuos en una población, familias y especies. Los
microsatélites se encuentran distribuidos ampliamente en el ADN, en los
cromosomas de todas las células, la información genética es heredable y basada
en esquemas mendelianos, consisten de varias copias de secuencias simples
repetidas (SSR) dispuestas en tándem que varían en tamaño desde 1 a 6 pares
(Valdez, 2013).
2. ANTECEDENTES
Se han generados diversos estudios genéticos en camarón blanco en los
cuales se aplica la técnica de los microsatélites para obtener marcadores
moleculares. Cruz et al. (2002) utilizaron la técnica de microsatélites para evaluar
la variabilidad genética en dos generaciones de crías de camarón blanco. La
técnica fue utilizada por Valles et al. (2005) quienes realizaron un estudio sobre la
variación genética en la estructura poblacional del camarón blanco silvestre del
Pacífico, de las costas Mexicanas hasta Panamá; Borrel et al. (2006) realizaron
un estudio en Cuba en el cual determinaron la variabilidad genética de los
primeros lotes que fueron introducidos a esta isla con fines de acuacultura, se
pensó en establecer un banco de reproductores a partir de estas primeras
introducciones. Para determinar la variabilidad genética ellos utilizaron cuatro
marcadores moleculares tipo microsatélites.
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Luvesuto et al. (2007) generan un estudio sobre la variación genética de
una línea cerrada de cultivo de camarón blanco en Brasil, para ello emplean
marcadores moleculares tipo microsátelite. Artiles et al. (2011) en Cuba estimaron
la variabilidad genética de la quinta introducción de Litopenaeus vannamei en la
isla; con el uso de cuatro marcadores moleculares tipo microsatélites los
investigadores determinaron una baja variabilidad en el camarón blanco del
Pacífico que fue introducido, y el cual proviene del Centro de mejora de camarón
en Estados Unidos (Shrimp Improving System: SIS), con el fin de su cultivo y
comercialización.
Más recientemente, en China han generado un estudio con marcadores
moleculares tipo microsatélites para identificar una nueva variedad de selección
de “camarón blanco” Litopenaeus vannamei; estos investigadores han
complementado el análisis de regiones microsatélites con regiones controles
mitocondriales (Yu et al., 2015).
3. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
En la actualidad el aumento en la demanda de camarón blanco ha
fomentado la producción de nauplios y postlarvas a partir de la selección y cruza
en cautiverio de organismos silvestres, también se han establecido programas de
mejoramiento genético para obtener líneas de reproductores capaces de
garantizar semillas de alta calidad (Martínez, 1999).
Las granjas productoras de nauplios o postlarvas de camarón se han
dedicado a satisfacer la demanda de semillas, y ofrecer las mejores del mercado
para las empresas dedicadas a la engorda y comercialización de “camarón
blanco”, para estas empresas productoras de semillas es importante identificar su
producto y distinguirlo genéticamente de otros generados por distintos
laboratorios dedicados a producir nauplios, con ello es posible realizar
evaluaciones en igualdad de condiciones con productos de otras empresas y
probar un mejor desempeño.
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3.1 Hipótesis
Es posible mediante marcadores microsatélites diferenciar individuos de
camarón blanco Litopenaeus vannamei de diferente origen en una población de
cultivo con la mezcla de ambos orígenes.
3.2 Objetivos
General:
Diferenciar genéticamente individuos con diferente origen de una población
mezclada de camarón blanco Litopenaeus vannamei. Comprobar el éxito de un
método de seguimiento molecular de organismos no invasivo.
Particulares:
1. Caracterizar genéticamente de manera separada dos poblaciones (Lotes
de cultivo) de diferente origen.
2. Caracterizar genéticamente a la población de cultivo mezclada y
determinar el origen de cada individuo de una muestra aleatoria.
4. MATERIAL Y MÉTODOS
Para realizar este trabajo de investigación se llevaron a cabo actividades
que involucran el trabajo en campo para obtener muestras, el trabajo de
laboratorio que sirvió para procesar las muestras obtenidas; el trabajo de
laboratorio fue llevado a cabo en el “Laboratorio de Genética Acuícola y
Mejoramiento Animal del CIBNOR”. El análisis de alelos obtenidos y la redacción
del documento se han consideran como trabajo de escritorio.
4.1 Obtención de muestras
Se tomaron postlarvas de camarón blanco Litopenaeus vannamei de
distinta procedencia, las postlarvas fueron provistas por dos laboratorios
productores cuyos nombres se mantienen en confidencialidad; dichas postlarvas
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fueron producidas bajo diferentes condiciones en cada laboratorio, cada
laboratorio ha seguido una selección diferente de organismos para obtener su
línea de reproductores y de características deseadas.
Para realizar este estudio se sembraron las postlarvas de los Lotes 1 y 2
(100,000 postlarvas de cada lote) en un estanque de mareas con un tamaño de
aproximadamente 1 hectárea propiedad del CIBNOR (estanque no. 3) los días 1 y
2 de mayo de 2014, respectivamente. La engorda de estos organismos se realizó
por ende bajo las mismas condiciones ambientales y con la misma rutina de
alimentación y cuidados.
Se realizaron dos muestreos. El primero fue de las postlarvas antes de la
siembra en el estanque de mareas, para ambos lotes por separado. El tamaño de
la muestra fue de 48 postlarvas por cada lote, se colocaron en frascos
conteniendo etanol al 80%. Las larvas fueron consideradas entre PL-15 a PL-20.
El segundo muestreo se realizó cuatro meses después (4 de septiembre
del 2014) en el estanque de mareas con la mezcla de ambos lotes, la cosecha se
realizó cuando los organismos alcanzaron un peso de 18gr aproximadamente. El
lote de organismos se nombró Lote mezcla (Lote 3). La muestra fue tomada
mediante un muestreo aleatorio y en diferentes puntos del estanque para tener un
total de 120 individuos, los organismos se colocaron dentro de una hielera y se
llevaron al laboratorio para obtener el tejido.
El tejido de los organismos del Lote mezcla se obtuvo de la base del
segundo par de pleópodos, también se registró el peso total de cada organismo
muestra con una balanza digital marca Ohaus; para obtener el tejido se utilizó
material de disección como pinzas y guantes, este material se esterilizó con
alcohol entre cada muestra tomada para evitar la contaminación de tejido, el tejido
muestra se guardó en tubos de centrifugación de 1.6 mL, con 1mL de etanol al
80%. Se mantuvieron en refrigeración hasta el día que se procesaron en el
laboratorio.
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4.2 Extracción y análisis de ADN
Se preparó la mezcla para la solución de digestión celular (Solución
nucleolisis-200µl, 0.5 MEDTA (pH 8.0)-50µl, RNASE A Solución, 4mg/ml-5µl,
Proteínasa K 20mg/ml-20µl) que se agregó a cada postlarva y cada tejido muestra
del lote mezcla; las muestras se dejaron en baño María bajo una temperatura de
56°C durante 20hr. Para extraer el ADN se utilizó el kit Wizard ® SV 96 Genomic
DNA Purification System de la marca PROMEGA, la técnica emplea una cámara
de vacío para purificar y extraer el ADN.
Para la amplificación del ADN se utilizaron 7 marcadores moleculares tipo
microsatélites: Pvan1758 y Pvan1815 (Cruz et al., 2002), TUMXLv10.312 y
TUMXLv8.256 (Meehan et al., 2003); Lvan05 (Perez-Enriquez et al., 2009) y
Livann51 y Livann60 (Pérez-Enríquez, datos no publicados). La amplificación de
los marcadores moleculares se realizó mediante la técnica de PCR y se utilizaron
un termocicladores BIO-RAD (modelos Dyad y C1000). Los protocolos para la
amplificación de los marcadores seleccionados se reportan en el Anexo 1.
Para preparar la mezcla de reacción para la PCR se utilizó en todos los
casos 11µl de volumen final que íntegra lo siguiente: 1µl de ADN, 2.2 µl de Buffer
1x, 1.54µl de MgCl2, 0.275µl de dNTP’s, 0.429µl de cada iniciador, 0.055µl de Taq
polimerasa, y 5.072µl de agua MilliQ. Los componentes se mezclaron
profundamente mediante Vortex (VWR).Los materiales de laboratorio que se
utilizaron fueron esterilizados con rayos UV. La técnica para separar el producto
de PCR fue por medio de electroforesis vertical con gel de poliacrilamida al 5% y
Urea a 7.5 M. La corrida del gel con las muestras se realizó en una cámara para
secuenciación (Thermo Scientific) bajo las siguientes condiciones 2100 V, 70 W,
70 mA. Para la visualización de los alelos se vertió sobre el gel de poliacrilamida
una capa de la mezcla de agarosa al 1% con el colorante Sybr Gold (Invitrogen) a
0.1X. El cristal con el gel revelado se colocó en un escáner FMBIOIII (Hitachi), se
obtuvo la imagen de cada locus por lote para determinar el tamaño de los alelos
presentes, para ello se utilizó una referencia o escalera de 10pb (10pb DNA
Ladder de Invitrogen). Se llevó el registro de las imágenes obtenidas de las
electroforesis para obtener el genotipo de los individuos por locus, primero de los
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lotes 1 y 2 para su caracterización, después del lote mezcla para la
caracterización y asignación de individuos.
4.3 Análisis de datos
Se estimaron parámetros de diversidad genética para cada lote, se
consideró en cada locus el número de alelos presentes, así como su
heterocigosidad. Se utilizó el programa GenAlEx 6.501 (Peakall and Smouse,
2012) para determinar el equilibrio Hardy-Weinberg (EHW) por locus para los
Lotes 1 y 2. Para comparar la diversidad genética de los Lotes 1 y 2 se realizaron
pruebas no paramétricas de signos; número de alelos, He, Ho, y EHW, para ello
se analizaron mediante una prueba Z estandarizada. También se realizaron las
pruebas F de Fisher y t Student para comparar lo pesos del lote mezcla. (Daniel,
2002).
Se realizó la prueba Fst (Wright, 1951) para medir la variación de las
frecuencias alélicas entre los Lotes 1 y 2 (Daniel, 2002). También se realizó un
Análisis de Coordenadas Principales para dimensionar gráficamente los dos lotes
y observar la distancia entre ellos con base en su genotipo. El análisis de
coordenadas principales (en inglés Principal Coordinates Analysis), (PCoA) es
una técnica multivariada que permite encontrar y trazar los patrones dominantes
en un conjunto de datos multivariados, en este caso múltiples loci y múltiples
muestras. La prueba de asignación de lotes se basó en el procedimiento de
“Prueba de asignación” propuesto por Waser y Strobeck (1998) mediante el
análisis de coordenadas principales.
18
5 RESULTADOS
5.1 Caracterización genética de los lotes 1 y 2.
Los resultados obtenidos para los siete locus utilizados mostraron
divergencia entre sí. En el locus Pvan1815 se presentaron cinco alelos para el
Lote 1 y cuatro alelos para el Lote 2, con un total de cinco alelos registrados (Fig.
2); el Lote 1 fue el único que mostró una desviación significativa del EHW. El
locus Pvan1758 presentó cuatro alelos para Lote 1 y cinco para el Lote 2 (Fig. 3)
y, no se presentó desviación significativa del EHW. Lvan05 con ocho alelos, Lote
1 con cuatro y Lote 2 con siete (Fig. 4), presenta la mayor desviación significativa
para ambos lotes. TUMXlv10.312 presenta seis alelos, cinco para ambos lotes
(Fig. 5) y sin desviación significativa del EHW. TUMxlv8.256 presenta ocho alelos,
cinco para ambos lotes (Fig. 6) y con desviación significativa del EHW, siendo
mayor en el Lote 1. En Livann51 se registraron ocho alelos, 8 para el Lote 1 y 7
para el lote 2 (Fig. 7) y no presenta desviación significativa del EHW. Livann60
presenta diez locus, siete para el Lote 1, ocho para el Lote 2 y solo con desviación
significativa del EHW para este último (Fig. 8).
El Lote 1 presentó tres locus que se alejaron del equilibrio de Hardy–
Weinberg, estos fueron Pvan1815, Lvan05, TUMxlv8.256, con resultados
estadísticamente significativos; el promedio de alelos registrados fue de 5.5
(Tabla 1).
En el Lote 2 se presentaron tres locus con desequilibrio, estos son Lvan05,
TUMxlv8.256, Livann60, con valores estadísticamente significativos; el promedio
de alelos es de 6.1 (Tabla 1).
La diversidad genética (número de alelos, Ho y He) entre los Lotes 1 y 2 no
fue estadísticamente diferente (P > 0.05) (Tabla 2).
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Tabla 1. Caracterización genética del Lote 1 y Lote 2; n=número de organismos;
na=número de alelos; Ho=Heterocigocidad observada; He=Heterocigocidad esperada;
HW= Hardy-Weinberg.
Locus Lote 1 Lote 2 Pvan1815 N 47 46
Na 5 4 Ho 0.596 0.609 He 0.735 0.660
HW 0.007** 0.161 Pvan1758 N 44 47
Na 4 5 Ho 0.682 0.723 He 0.646 0.675
HW 0.775 0.913 Lvan05 n 43 41
na 4 7 Ho 0.349 0.366 He 0.578 0.725
HW <0.000*** <0.000*** TUMXlv10.312 n 48 42
na 5 5 Ho 0.646 0.714 He 0.676 0.642
HW 0.132 0.728 TUMxlv8.256 N 47 48
Na 6 7 Ho 0.532 0.667 He 0.796 0.757
HW <0.000*** 0.043* Livan51 N 48 48
Na 8 7 Ho 0.896 0.604 He 0.823 0.625
HW 0.154 0.978 Livann60 N 47 46
Na 7 8 Ho 0.681 0.609 He 0.686 0.830
HW 0.341 0.014* Promedios n 46.2 45.4
Na 5.5 6.1 Ho 0.626 0.613 He 0.706 0.702
* P<0.05, ** P<0.01, *** P<0.001
Tabla 2. Valores de Z estandarizada a la prueba de signos entre Lote 1 y 2.
N. Alelos He Ho
0.810 1.133 0.377
20
5.2 Frecuencia de alelos por locus y diferenciación genética para el Lote 1
y Lote 2.
Las siguientes graficas muestran los resultados con el loci seleccionado de
siete locus (Pvan1815, Pvan1758, Lvan05, TUMXlv10.312, TUMxlv8.256,
Livann51, Livann60) para el Lote 1 y Lote 2, por cada locus se obtuvieron las
siguientes frecuencias de alelos.
Figura 2. Frecuencias obtenidas de alelos en el Lote 1 y Lote 2 para el locus Pvan1815.
Se distingue el alelo 134 como exclusivo del Lote 1, los alelos que se
obtuvieron con mayor frecuencia son 142, seguido del alelo 133 también para el
Lote 2, el alelo 132 se presentó aproximadamente con la misma frecuencia en
ambos lotes y el 136 mostró una frecuencia ligeramente mayor en el Lote 1 (Fig.
2).
El alelo 174 se encuentra con mayor frecuencia en el Lote 1 a diferencia
del Lote 2; él alelo 187 registró baja frecuencia y diferencia mínima entre los dos
lotes, se encuentran dos alelos exclusivos para Lote 2 y uno para Lote 1, locus
Pvan1758 (Fig. 3).
21
Figura 3. Frecuencias obtenidas de alelos en el Lote 1 y Lote 2 para el locus Pvan1758.
El locus Lvan05 registró 8 alelos (157, 159, 165, 167, 173, 177, 186, 198)
de estos se encontraron cuatro alelos exclusivos del Lote 2, con frecuencias
bajas; el alelo 165, el 167, el 173 y el 198. Para el Lote 1 se obtuvo un alelo
exclusivo este es el 186.
El alelo con mayor frecuencia fue el 177 para ambos lotes, se encontró con
mayor frecuencia en el Lote 1. El alelo 157 se presentó en ambos lotes aunque
con mayor frecuencia en el Lote 2. El alelo 159 se presentó en ambos lotes pero
con mayor frecuencia en el Lote 1 (Fig. 4).
Figura 4. Frecuencias obtenidas de alelos en el Lote 1 y Lote 2 para el locus Lvan05.
22
Para el locus TUMXlv10.312 se obtuvieron seis alelos (176, 179, 181, 182,
183, 184) de estos el 179 es exclusivo del Lote 2, el alelo 184 es exclusivo del
Lote 1 y se presentó en ambos Lotes con baja frecuencia.
El alelo con mayor frecuencia en ambos lotes es el 182. El alelo 176 se
presentó con mayor frecuencia en el Lote 1, pero con baja frecuencia en ambos
lotes. El alelo 181 se presentó con mayor frecuencia en el Lote 2; para el alelo
183 se obtuvo una mayor frecuencia para el Lote 1 (Fig. 5).
Figura 5. Frecuencias obtenidas de alelos en el Lote 1 y Lote 2 para el locus
TUMXlv10.312.
El locus TUMxlv8.256 presentó 8 alelos (152, 153, 154, 156, 159, 160, 161,
162) dos alelos se registraron solo en el Lote 2 y con frecuencia baja.
El alelo 159 se registró solo en el Lote 1; el alelo con mayor frecuencia en
ambos lotes es el 152, este alelo se presenta mayormente en el Lote 2 (Fig. 6).
23
Figura 6. Frecuencias obtenidas de alelos en el Lote 1 y Lote 2 para el locus
TUMXlv8.256.
El alelo 156 se presentó en ambos lotes y con similares frecuencias, para
el Lote 1 y para el Lote 2. El alelo 160 se presentó con una frecuencia mayor en el
Lote 1 que en el Lote 2. El alelo 161 se presentó con mayor frecuencia en el Lote
2; el alelo 162 es registrado en ambos lotes y con frecuencias similares (Fig. 6).
Para el locus Livann51 se registraron ocho alelos (160, 162, 164, 166, 168,
170, 176, 178) de estos solo el 160 fue exclusivo del Lote 1; el alelo 162 registró
una mayor frecuencia para el Lote 2, el alelo 164 registra una baja frecuencia para
ambos lotes aunque se registró con mayor frecuencia para el Lote 1.
El alelo 166 con mayor frecuencia para el Lote 1; el alelo 168 se registró
para ambos lotes sin embargo la frecuencia obtenida para el Lote 1 es mucho
más baja; el alelo 170 registró mayor frecuencia para el Lote 1.
24
Figura 7. Frecuencias obtenidas de alelos en el Lote 1 y Lote 2 para el locus Livann51.
El alelo 176 presentó similares frecuencias para ambos lotes pero muy
bajas, estas frecuencias. El alelo 178 registró una frecuencia mayor para el Lote
1, la diferencia es mínima entre las frecuencias registradas para ambos lotes.
Cabe mencionar que aunque el locus presentó 8 alelos diferentes estos se
encuentran con una baja frecuencia (Fig. 7).
Para el locus Livann60 se registraron 10 alelos (273, 277, 284, 286, 288,
301, 310, 319, 348, 380) siendo el locus más polimórfico en este trabajo. De estos
alelos 5 fueron exclusivos de algún lote, el 301 es exclusivo del Lote 1 y el alelo
348, también se presentaron alelos exclusivos para el Lote 2, estos son el 310,
319 y 380.
El alelo con mayor frecuencia en ambos lotes es el 286, con mayor
frecuencia en el Lote 1; el alelo 284 posee la segunda mayor frecuencia para
ambos lotes y se encuentra principalmente en el Lote 1. El alelo 277 se presentó
con mayor frecuencia en el Lote 2, para el alelo 273 las frecuencias fueron
similares para ambos lotes. El alelo 288 presentó mayor frecuencia en el Lote 2
(Fig. 8).
25
Figura 8. Frecuencias obtenidas de alelos en el Lote 1 y Lote 2 para el locus Livann60.
Se registraron alelos que son exclusivos para ambos lotes, estos alelos son
determinantes para caracterizar genéticamente los dos Lotes; para el locus
Pvan1815 el alelo 134 para el Lote 1; Pvan1758 presenta tres alelos exclusivos,
para el Lote 1 se registró el alelo 193, para el Lote 2 se registraron los alelos 189,
y 191; Lvan05 presenta cinco alelos exclusivos, el 186 para el Lote 1, para el Lote
2 son el 165,167, 173 y 198; TUMXlv10.312 registró dos alelos exclusivos, el 184
para el Lote 1 y 179 para el Lote 2; TUMxlv8.256 con tres alelos exclusivos, para
el Lote 1 el alelo 159, para el Lote 2 los alelos 153 y 154; Livann51 presentó un
alelo el 160; Livann60 mostró cinco alelos, el 301 y 348 para el Lote 1, 310, 319 y
380 para el Lote 2.
El resultado de la prueba Fst de diferenciación entre ambos lotes fue de
0.060 siendo estadísticamente significativa (P<0.001). Es decir que el Lote 1 es
genéticamente distinto al Lote 2 y por lo tanto, individuos de un lote determinado
pueden ser asignados a su lote de origen.
26
5.3 Análisis de Coordenadas Principales para la asignación de individuos.
El Análisis de Coordenadas Principales determinó como poblaciones
diferentes al Lote 1 y Lote 2; para el primer análisis de diferenciación, ambas
poblaciones son marcadas con cuadros de color, para el Lote1 se utilizó el color
azul y para el Lote 2 se utiliza el color rojo, los puntos que se encuentran más
lejanos se consideran debido a que poseen algún alelo exclusivo de la población,
ya sea para Lote 1 o Lote 2 (Fig. 9).
Figura 9. Distribución bidimensional de los individuos de los Lote 1 y Lote 2 de acuerdo a
su composición genética basada en 7 locus.
Para el análisis que involucra el Lote mezcla se generó una figura similar a
la número 9, a diferencia de esta se marca con triángulos de color verde a los
individuos pertenecientes al Lote Mezcla (Fig. 10). Con base al análisis de
coordenadas los individuos que fueron asignados a cada uno de los Lotes se
muestra en la Tabla 3.
27
Figura 10. Indica la asignación de individuos del Lote mezcla.
Tabla 3. Asignación de individuos del Lote Mezcla a Lote 1 y Lote 2.
Lote 1 Lote 2
8; 10; 12; 20; 22; 26: 32; 33; 34;35; 40; 44; 49; 52; 55; 57; 58; 59; 62; 65; 69; 72; 74; 75; 77; 78; 80; 83; 86; 87; 89; 90; 93; 95; 104; 106; 107; 110; 111; 112, 116; 119.
1; 2; 3; 4; 5; 6; 7; 9; 11; 13; 14; 15; 16; 17; 18; 19; 21; 23; 24; 25; 27; 28; 29; 30; 31; 36; 37; 38; 39; 41; 42; 43; 45; 46; 47; 48; 50; 51; 53; 54; 56; 60; 61; 63;64; 66; 67; 68; 70; 71; 73; 76; 79; 84, 85; 88; 91; 92; 94; 96; 97; 98; 99; 100; 101;102; 103; 105; 108; 109; 113; 114; 115; 117; 118; 120.
La cantidad de individuos asignados a uno u otro lote representa su la
sobrevivencia relativa. Para el Lote 1 se registraron 42 individuos (sobrevivencia =
35%) y, para el Lote 2 se registró un total de 78 individuos lo que significa
aproximadamente el doble de organismos asignados (sobrevivencia = 65%).
Se realizó una prueba de F de Fisher para determinar la homogeniedad de
las varianzas de los pesos registrados, así también una prueba t de Student para
diferenciar los pesos totales relativos de ambos lotes, (Daniel, 2002).
28
Tabla 4. Muestra los resultados obtenidos para las pruebas F de Fisher y t Student, para
los pesos del lote mezcla.
F de Fisher t de Student
Estadístico
0.60 0.54
Valor crítico
0.62 1.98
Se registró varianzas iguales para ambos lotes F. No hay diferencia
estadística en cuanto a los pesos relativos obtenidos para ambos lotes, t de
Student (Tabla 4).
6 DISCUSIÓN
6.1 Uso de microsatélites
El uso de pruebas genéticas se ha enfocado en estudios de variabilidad y
con ello confirmar la heterocigosis de la población de interés, dentro de los
componentes que se piensa están relacionados a la heterocigosis es el
crecimiento de los organismos, la viabilidad, la fertilidad, actividad locomotora,
sobrevivencia, velocidad de desarrollo, estabilidad; sin embargo diversos estudios
no han encontrado la correlación positiva entre componentes como el crecimiento
y la heterocigosis lo que indica una asociación no universal y posiblemente
dependiente de otros factores (Rivera-García et al., 2006). Acceder a la
información sobre la variabilidad genética es de suma importancia para diseñar e
implementar el manejo apropiado de especies de interés acuícola, también es útil
para estudiar la condición genética de poblaciones y una información confiable
para la evaluación de las poblaciones de interés, el uso de marcadores
moleculares como son los microsatélites son comúnmente usados para estudios
de diversidad genética.
29
Los microsatélites son marcadores moleculares que han servido como
herramienta para el análisis genético y han demostrado su alta utilidad en
programas de cultivos de especies, manejo de crías y selección de reproductores,
se presentan en el eukary-genoma y por ello son utilizados como marcadores
genéticos de varias especies (Beckmann et al., 1990). Tienen uso potencial para
la determinación de la herencia alélica en poblaciones y para determinar
presumibles padres de una o varias poblaciones, la técnica también es útil en
poblaciones híbridas. Con ellos se puede determinar la diversidad genética entre
poblaciones o familias de organismos cultivados, o inclusive entre poblaciones
silvestres debido a su alta resolución y sensibilidad (Borrel et al., 2006).
Uno de los primeros usos de microsatélites se basó en la delimitación de
líneas genéticas de organismos silvestres o cultivados con un alto grado de
sanidad, es decir libres de virus y patógenos. Con la delimitación de familias libres
de patógenos se obtiene mayor rendimiento en cultivos de producción comercial a
nivel nacional. La forma de crear una nueva línea genética es mediante la
selección de individuos que a su vez puede generar un cuello de botella
poblacional; la certeza de una línea pura es obtener un producto uniforme y
atender con ello la selección y características genéticas (Rivera-García et al.,
2006). Un resultado considerado negativo de la selección dirigida de organismos
es el incremento de la endogamia y con ello la pérdida de variabilidad genética, la
repercusión de baja variabilidad puede agravarse en generaciones sucesivas
como se ha demostrado en estudios realizados en camarón (Freitas et al., 2005).
Diversos autores mencionan que la baja del crecimiento de organismos y la
susceptibilidad a enfermedades puede ser resultado de la baja variabilidad
genética, aunque como se mencionó anteriormente, no se puede concluir que sea
un hecho universal; en lo que sí se coincide es el considerar a los microsatélites
como una herramienta viable para el estudio de variabilidad genética de
poblaciones (Wolfus et al., 1996).
Es importante para los productores de larvas a nivel nacional el poder
ofrecer a las diferentes empresas dedicadas a la producción de camarón blanco
una larva de alta calidad, es decir un producto que asegure un alto rendimiento y
con ello una mayor producción. Debido a la gran producción de camarón blanco a
30
nivel mundial, y siendo un producto acuícola de alto valor comercial para México,
es necesario implementar programas de seguimiento genético e identificación de
organismos de diferentes poblaciones para implementar programas de mejoras
génicas, y así lograr satisfacer las demandas requeridas de productores
mexicanos, el objetivo es tener el nivel productivo de otros países como China,
Tailandia, Indonesia, Brasil, Ecuador (FAO, 2015).
6.2 Ventajas de microsatélites para este estudio
En este estudio se han utilizado los microsatellites como herramienta
debido a que otros marcadores moleculares como las aloenzimas no han logrado
identificar polimorfismos en la mayoría de los peneidos. Cruz et al. (2004)
menciona que las aloenzimas han mostrado baja variabilidad en estudios de
crustáceos por lo cual es recomendable utilizar marcadores genéticos como lo
son los microsatélites; otra desventaja de este tipo de marcadores es que
obtienen de una cantidad significativa de músculo, hígado, riñón, etc., lo que
significa el sacrifico de individuos, (González, 2003). Otros marcadores
moleculares como los RAPDs (Random Amplification of Polymorphic DNA) y los
AFLPs (Amplified Fragment Length Polymorphism) combinados con la
amplificación tipo PCR ofrecen la ventaja de ser de fácil manejo en el laboratorio y
con un costo económico bajo, pero con la desventaja de ser dominantes y
generados al azar, no convenientes para pruebas de asignación de individuos
(González, 2003). Los microsatélites como marcadores moleculares
codominantes permiten dar seguimiento a la segregación de genes aportados por
el padre y la madre, son idóneos para la determinación de parentesco e
identificación de individuos.
Para el uso de otras técnicas de seguimiento como en el marcaje físico se
utilizan organismos de considerable masa; en este caso se trabajó con larvas de
muy poca masa muscular y su marcaje es viable con microsatélites. Diversas son
las ventajas que poseen los microsatélites, una de ellas es la amplificación en
cadena de la polimerasa (PCR) la cual permite utilizar poco tejido y de poca
calidad, también son útiles para el estudio de ADN con alta degradación, su
utilidad es mayor a otras técnicas que también utilizan ADN nuclear como son
31
RFLPs o los RAPDs, los microsatélites son apropiados para el estudio de
genética de poblaciones, en especial con especies genéticamente consideradas
en cuello de botella (González, 2003). Los microsatélites son indispensables para
mantener el grado de endogamia en niveles aceptables y dar seguimiento al
pedigrí de las especies de interés acuícola, o para fines de conservación de
poblaciones silvestres vulnerables por su baja variabilidad genética, con base en
la información obtenida de este tipo de marcadores moleculares es posible
diseñar un programa de manejo adecuando de la población de interés.
6.3 Caracterización de Lotes.
En Pvan1815 (Luvesuto et al., 2007) obtuvieron como resultado 14 alelos y
registró una Ho (0.30), He (0.93) con desviación con respecto al equilibrio de
Hardy–Weinberg, en este estudio se obtuvo 9 alelos menos que los reportados lo
que significa menos polimorfismo para nuestro estudio, la desviación resultó
significativa parar el Lote 1 con Ho (0.59), He (0.73); por otra parte para el locus
Pvan1758 los resultados no son semejantes a los reportados anteriormente por
(Cruz et al., 2004) que reportan 10 alelos, seis más que en este estudio,
significando menos polimorfismo en cuanto a este locus; también reporta He
(0.71) y Ho (0.70) y se registró un resultado similar a dicho autor para el Lote 2
con Ho (0.723) y He (0.675) lo que significa similar heterocigosidad a lo reportado
por dicho autor. Para el locus Lvan05 (Pérez-Enríquez et al., 2009) reportan 9
alelos, uno más que en este estudio, las He (0.67) y Ho (0.49) no coinciden con
las reportadas para ambos Lotes; para el locus TUMXlv10.312 reporta el mismo
autor 6 alelos los mismos que se reportan en este estudio, con He (0.69) similar a
lo obtenido en Lote 1 y 2, la Ho (0.67) similar solo al Lote 1; TUMxlv8.256 el autor
reporta 8 alelos los mismos que se reportan por este estudio significando igualdad
en polimorfismo, también reporta He de (0.78) y Ho (0.44) los que difieren para
este estudio (Tabla 1). Aún no existen estudios previos publicados para Livan51 y
Livann60.
Para obtener alta caracterización genética de poblaciones se requiere de
marcadores moleculares que muestren un alto grado de polimorfismo (Ortiz et al.,
2005). Para este estudió el locus que presentó mayor grado de polimorfismo fue
32
Livann 60, seguido de Livann 51. Para el equilibrio de Hardy–Weinberg, las
desviaciones significativas se pueden explicar por la presencia de alelos nulos
(Ortiz et al., 2005), en este estudio Lvan 05 presentó con mayor significancia
desequilibrio en ambos lotes, seguido de TUMxlv 8.256 para el Lote 1.
Autores como Cruz et al. (2004), mencionan que la heterocigosidad es una
medida no efectiva de la variabilidad debido a que se debe de considerar el
número de alelos por locus y su distribución; en este estudio la variabilidad no fue
del todo efectiva para caracterizar genéticamente ambos lotes estudiados, los
resultados obtenidos no diferencian con gran resolución entre Lote 1 y 2 en
cuanto al número de alelos registrados la Ho y He, la diferencia es
estadísticamente inexistente según la prueba de signos realizada (Tabla 2), para
una diferenciación con mayor resolución estadística es necesario ampliar el
número de muestra, es decir utilizar mayor número de organismos o un loci que
considere locus más polimórficos.
6.4 Prueba Fst
La prueba Fst mide la reducción en la distancia entre las proporciones
medias de genotipos heterocigotos, entre localidades o poblaciones (Goudet,
2001). En un estudio realizado por Valles et al. (2005) ellos obtienen como
resultado un valor de Fst de (0.055) encontrado diferencias sustanciales entre
poblaciones; otro estudio de (Levesuto et al., 2007) registran un Fst (-0.004) lo
que concluye en alta homogeneidad entre generaciones sin poder diferenciarlas,
también menciona que la selección fenotípica y un bajo número de reproductores
contribuyen al aumento significativo en la similitud genética de poblaciones
cautivas.
Con base en los genotipos obtenidos en este estudio se reporta como
resultado de la prueba Fst (0.060) con (P<0.001), muy similar a lo registrado por
Valles et al. (2005) lo que significa diferencia estadística entre Lote 1 y 2 con base
en esta prueba.
33
6.5 Análisis de Coordenadas Principales para la asignación de individuos
No se tienen registros previos sobre trabajos en Peneidos en donde sea
aplicado el Análisis de Coordenadas Principales para la asignación de individuos
de una población, menos aún aplicados con microsatélites. Existen trabajos como
el de realizado por Breinholt et al. (2009), en donde estudia poblaciones de
Astragalus ampullarioides una planta endémica de Utah en EUA; ellos aplican el
Análisis de Coordenadas Principales con marcadores moleculares AFLP; otro
trabajo como el de Kym et al. (2006) en el cual utilizan microsatélites con el
método Bayesiano para la asignación de individuos de poblaciones coleópteros
(Curculionidae).
El Análisis de Coordenadas Principales (PCoA) es una prueba multivariable
la cual permite encontrar y trazar los principales patrones dentro un conjunto
multivariado de datos (por ejemplo, loci múltiples y múltiples muestras). La base
matemática es compleja, pero en esencia PCoA es un proceso mediante el cual
los ejes principales de la variación se encuentran dentro de un conjunto de datos
multidimensionales. Cada eje sucesivo explica proporcionalmente menos de la
variación total, de tal manera que cuando hay grupos distintos, los primeros 2 o 3
ejes típicamente revelan la mayoría de las la separación entre ellos (Peakall et al.,
2012).
Para la asignación de individuos es necesario dimensionar mediante un
Análisis de Coordenadas Principales los Lotes 1, 2 y Lote mezcla (Figura 9 y 10).
Con el uso de marcadores moleculares como son los microsatélites es posible
determinar con base en su genotipo la identidad de cada individuo dentro de una
población (Vivanco et al., 2004).
Para obtener el perfil genético de una población se debe de contar con el
mayor número de marcadores moleculares posibles polimórficos, esto debido a
que la procedencia puede ser de una línea genética similar que se han ido
alejando debido a la selección inadvertida de caracteres deseados por
productores de larvas, la consecuencia de ello en la mayoría de los casos es una
pérdida de variabilidad genética (Pérez-Enríquez et al., 2009).
34
Este trabajo ha logrado los objetivos planteados; es recomendable para
estudios posteriores trabajar con técnicas combinadas como el estudio realizado
por Yu, et al. (2015) el cual utiliza regiones mitocondriales para caracterizar
genéticamente las poblaciones. El uso de marcadores moleculares tipo
microsatélites es muy útil para diferenciar poblaciones silvestres, cultivadas o
asignar individuos a determinada población, también son importantes para poder
identificar larvas de camarón blanco de diferentes laboratorios productores, de
esta forma dichos productores de larvas pueden identificar su producto de entre
otros laboratorios productores; esto es importante cuando se desea comparar el
rendimiento de larvas de diferente procedencia cultivadas en igualdad de
condiciones, a lo que se le conoce como “prueba reto” y así ofrecer la de mayor
rendimiento. Los microsátelites ofrecen mayores ventajas en comparación con
otras técnicas de marcaje físico como el realizado por Campos-Montes et al.
(2012) en el cual se considera la sobrevivencia y el peso registrado en una serie
de cultivos de camarón blanco; diversos factores como la densidad de organismos
por jaula, la ubicación de las mismas dentro del estanque, la mortalidad dentro de
ellas las mismas y la incertidumbre derivada por el factor humano al momento de
alimentar a los organismos, son puntos a considerar para la viabilidad del marcaje
físico y la consideración del peso registrado al final del estudio.
En este estudio no se registraron diferencias en cuanto a los pesos de los
organismos asignados para ambos lotes (Tabla 3), en lo que sí se presenta
diferencia es en la sobrevivencia de organismos, registrándose mayor número
para el Lote 2. Debido a la igualdad de condiciones para su crecimiento y un
muestreo aleatorio no dirigido, se deduce que los organismos asignados para el
Lote 2 poseen características genéticas que comprueban el mejoramiento
genético y con ello mayor sobrevivencia. Por lo anterior se sostiene que es
necesario para la industria implementar planes de manejo que involucren el
seguimiento genético de camarón blanco y así ofrecer una mejor larva para su
cultivo, y con ello reducir costos y aumentar la producción a nivel nacional entre
camaronicultores.
35
7. CONCLUSIÓN
Se logró la caracterización genética de ambos lotes y con ello la
diferenciación entre ellos mediante una prueba Fst realizada con base en los
genotipos obtenidos. También mediante la prueba PCoA fue posible realizar la
asignación de individuos del lote mezcla, por lo que se concluye que dichos
marcadores son adecuados para realizar este tipo de estudio.
No hubo diferencias entre pesos registrados en los Lotes 1 y Lote 2; sin
embargo se obtuvo una sobrevivencia diferencial entre lotes teniendo el Lote 2
mayor sobrevivencia.
Para las empresas productoras de larvas de camarón es importante
identificar su producto y con el uso de los microsatélites es posible.
Recomendaciones
El marcaje molecular de organismos es recomendable por ser un método
más sencillo y específico que el marcaje físico, son factibles para trabajar con
organismos de poca masa muscular, como lo son larvas de camarón.
Es muy útil para dar seguimiento a una población de interés en un medio
de cultivo o silvestre; son poder identificar organismos en una población en donde
pueden encontrarse individuos de distinta procedencia.
Con el uso de marcadores moleculares es posible establecer parentesco
entre organismos, son muy útiles para apoyar al mejoramiento genético de
especies comerciales.
Estas técnicas se pueden combinar con métodos apropiados de recaptura
y marcaje físico para poblaciones silvestres.
36
8. REFERENCIAS
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1-10.
40
Anexo 1. Protocolos utilizados para realizar la PCR, de los 7 locus.
Locus Temperatura Tiempo Ciclos
Pvan1815 Desnaturalización
inicial 94°C 4 min
Desnaturalización 94°C 1 min
Alineamiento 55°C 1 min 35
Alineamiento 72°C 1 min
Extensión final. 72°C 5 min
Pvan1758
Desnaturalización inicial
94°C 4 min
Desnaturalización 94°C 1 min
Alineamiento 55°C 1 min 35
Alineamiento 72°C 1 min
Extensión final. 72°C 5 min
Lvan05 Desnaturalización
inicial 94°C 1 min
Desnaturalización 94°C 45 seg
Alineamiento 58°C 45 seg
Alineamiento 72°C 45 seg 35
Extensión final. 72°C 5 min
TUMXlv10.312 Desnaturalización
inicial 94°C 3 min
Desnaturalización 94°C 1 min
Alineamiento 52°C 1 min 21
Alineamiento 72°C 1 min
Extensión final. 72°C 10 min
TUMxlv8.256 Desnaturalización
inicial 94°C 3 min
Desnaturalización 94°C 1 min
Alineamiento 58°C 1 min 21
Alineamiento 72°C 1 min
Extensión final. 72°C 10 min Livann51 Desnaturalización
inicial
Desnaturalización 94°C 3 min
Alineamiento 94°C 1 min 25
Alineamiento 58°C 1 min
Extensión final. 72°C 1 min
Livann60 72°C 10 min
Desnaturalización inicial
Desnaturalización 94°C 3 min
Alineamiento 94°C 1 min 25
Alineamiento 58°C 1 min
Extensión final. 72°C 1 min
72°C 10 min
41
Anexo 2. Genotipos obtenidos por locus para cada individuo (alelos en columnas). Lote 1
(1-48); Lote 2 (49-96); Lote 3 (97-216).
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
Pvan1815 142 136 142 136 142 142 142 142 142 133 142 142 142 133 142
132 133 142 136 142 133 133 142 133 133 133 133 142 133 132
Pvan1758 184 187 187 184 187 184 193 184 184 193 184 184 184 174 174
174 174 184 184 184 174 184 174 174 184 174 174 174 0 157
Lvan05 177 177 177 177 177 186 159 177 177 177 186 177 177 0 157
177 177 159 177 159 177 159 177 177 177 177 177 177 177 177
TUMXlv10.312 183 182 182 183 183 182 181 183 183 183 182 183 183 181 183
181 182 181 183 182 182 176 182 182 183 182 182 181 176 176
TUMxlv8.256 160 156 160 161 160 159 160 159 152 156 159 159 152 160 156
152 156 152 156 152 159 156 152 152 152 152 152 152 160 156
Livann51 178 178 170 170 170 170 178 170 170 170 166 170 170 178 166
162 170 160 170 160 162 178 162 162 162 162 162 160 170 162
Livann60
286 286 348 284 301 286 286 286 286 286 348 0 288 286 286
284 284 286 284 288 273 286 273 273 284 286 0 273 273 286
42
16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30
Pvan1815 142 132 136 136 134 142 133 142 142 142 142 142 133 142 142
134 132 133 133 134 132 133 132 142 142 134 133 133 133 133
Pvan1758 184 174 187 174 193 193 184 184 184 184 0 0 0 184 184
184 174 174 174 174 184 174 174 184 174 0 0 0 174 184
Lvan05 177 177 0 0 159 159 186 186 177 186 177 159 159 186 0
177 177 177 177 177 177 177 177 177 177 177 177 177 177 177
TUMXlv10.312 183 182 183 183 184 182 182 183 183 183 183 183 182 183 182
181 182 183 183 183 182 176 182 181 182 183 182 182 182 176
TUMxlv8.256 156 159 161 156 156 160 160 160 162 159 160 160 162 160 160
156 159 156 156 156 152 152 152 160 159 152 152 162 160 152
Livann51 170 178 170 178 166 166 176 178 164 166 162 178 176 178 178
162 170 162 170 162 160 162 162 160 162 160 178 170 176 176
Livann60
284 301 286 301 348 284 286 286 286 286 286 286 284 286 284
284 286 284 286 284 273 284 284 286 286 286 286 284 284 284
43
Locus 31 32 33 34 35 36 37 37 39 40 41 42 43 44 45
Pvan1815 142 142 134 136 142 133 132 142 0 142 133 142 133 133 142
134 134 132 133 132 133 132 134 0 132 132 142 133 132 132
Pvan1758 184 187 187 174 193 193 174 174 184 174 193 0 184 184 174
184 184 184 174 184 184 174 174 174 174 174 0 184 174 174
Lvan05 177 177 159 177 177 159 177 177 0 159 186 186 159 159 177
177 177 177 177 177 177 177 177 177 177 177 177 177 177 177
TUMXlv10.312 183 182 183 183 182 183 183 183 182 183 183 182 182 183 181
183 182 181 182 181 183 182 181 181 183 182 182 182 182 176
TUMxlv8.256 162 152 162 156 0 161 156 161 160 160 161 156 162 160 160
160 152 156 156 0 156 156 152 160 152 156 152 162 160 160
Livann51 164 166 166 162 170 178 178 170 170 176 170 166 176 178 176
160 164 162 162 166 176 170 164 166 162 166 162 170 170 166
Livann60
286 284 284 301 348 286 286 286 348 286 286 348 284 284 286
286 273 273 286 286 284 284 286 286 284 286 286 284 273 273
44
Locus 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 57 59 60
Pvan1815 142 132 136 142 133 136 133 132 142 132 142 133 142 142 142
133 132 136 142 132 133 133 132 132 132 133 133 133 142 142
Pvan1758 193 193 184 187 189 191 0 191 184 184 184 191 189 184 189
187 184 184 184 184 184 0 184 174 174 184 187 184 184 184
Lvan05 177 177 177 165 177 177 157 0 177 177 177 177 173 177 173
177 177 177 177 177 177 177 177 177 177 177 177 177 177 177
TUMXlv10.312 183 181 183 182 181 182 182 182 181 181 182 183 182 183 182
181 176 182 181 181 181 182 181 181 181 181 182 182 182 182
TUMxlv8.256 161 161 160 152 161 160 156 153 161 161 152 156 161 162 156
161 161 152 152 161 156 156 152 152 152 152 152 152 156 152
Livann51 178 178 168 162 168 162 166 166 170 166 170 170 166 162 166
178 176 162 162 162 162 162 162 162 162 166 168 162 162 162
Livann60
301 286 284 319 286 310 284 319 380 286 319 319 286 286 319
286 286 277 319 284 273 277 284 284 284 284 284 284 286 319
45
Locus 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75
Pvan1815 142 0 142 142 142 142 142 133 133 142 142 142 142 132 0
133 0 133 142 133 133 133 132 132 133 136 142 142 132 0
Pvan1758 184 184 187 191 187 191 189 191 184 191 187 191
191 184 189
174 184 184 184 174 184 184 184 184 189 184 184 174 184 189
Lvan05 177 167 173 177 177 177 173 198 173 167 177 157 177 177 177
177 177 177 177 177 177 177 177 177 177 177 177 177 177 177
TUMXlv10.312 181 182 182 182 0 183 0 182 0 182 183 182 183 182 181
181 179 182 181 0 181 0 182 0 179 182 176 182 182 179
TUMxlv8.256 161 161 162 153 161 160 161 161 156 162 152 156 162 152 156
156 152 152 152 156 152 156 152 156 152 152 156 162 152 152
Livann51 162 178 176 166 176 170 178 162 162 176 162 162 162 162 178
162 170 162 162 162 162 168 162 162 168 162 162 162 162 162
Livann60
284 284 284 319 319 286 310 319 0 0 319 277 284 288 319
284 284 284 284 284 173 286 277 0 0 286 277 284 277 286
46
Locus 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90
Pvan1815 142 142 142 142 142 142 142 142 142 136 142 133 133 142 133
142 142 142 133 133 133 133 142 142 133 136 133 133 133 132
Pvan1758 184 187 191 191 189 184 184 191 184 187 184 187 191 189 184
184 174 187 184 184 184 174 189 184 184 174 184 184 174 184
Lvan05 177 0 0 0 0 177 177 157 165 0 177 173 177 159 177
177 177 177 177 177 177 177 177 177 177 177 177 177 177 177
TUMXlv10.312 183 182 0 182 182 183 183 0 183 182 183 182 183 183 182
182 181 0 181 181 182 182 0 181 182 182 181 181 182 181
TUMxlv8.256 161 161 156 161 161 161 161 152 156 162 160 156 161 156 156
152 152 152 152 152 161 156 152 152 154 160 152 156 156 156
Livann51 162 168 176 168 162 178 178 178 164 162 176 178 162 168 162
162 166 162 162 162 162 178 162 162 162 162 162 162 162 162
Livann60
286 284 286 286 288 286 288 273 277 273 288 288 277 277 319
273 273 273 286 277 284 277 273 277 273 277 284 273 277 288
47
Locus 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105
Pvan1815 133 142 133 133 142 136 142 142 142 133 136 142 142 133 142
132 133 132 132 133 132 142 142 133 133 133 142 136 132 133
Pvan1758 191 191 191 184 184 184 191 184 187 184 187 189 191 184 191
184 184 191 174 184 184 189 184 187 174 187 174 174 184 191
Lvan05 177 173 0 167 177 177 177 177 177 177 173 177 198 171 157
177 177 177 177 177 177 177 177 177 177 177 177 177 177 177
TUMXlv10.312 183 182 183 0 182 183 182 0 182 182 183 182 182 183 182
182 182 182 0 182 182 181 0 182 182 183 181 181 183 181
TUMxlv8.256 160 152 162 161 160 162 152 161 161 152 162 162 156 159 160
152 152 162 152 153 152 152 152 156 152 154 162 152 152 156
Livann51 170 178 162 162 178 168 168 162 176 170 178 178 178 170 168
162 176 162 162 178 162 162 162 162 162 162 168 162 162 168
Livann60
286 273 277 319 277 319 319 319 284 319 286 284 284 0 277
286 273 277 319 277 288 273 277 284 319 277 284 284 0 277
48
Locus 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120
Pvan1815 142 142 142
142 136 142 142 142 142 142 136 142 142 142 133
142 142 132 142 132 142 133 133 142 133 133 136 132 135 133
Pvan1758 187 174 0 191 189 184 184 184 187 187 174 189 184 184 191
184 174 0 174 184 184 174 184 18 184 174 184 184 184 174
Lvan05 177 173 0 177 177 177 157 157 173 0 177 173 159 177 177
177 177 177 177 177 177 177 177 177 177 177 177 177 0 177
TUMXlv10.312 183 182 183 182 183 183 0 183 183 183 183 183 182 182 182
182 181 176 181 181 182 0 182 182 182 182 182 181 181 182
TUMxlv8.256 160 161 0 152 161 152 161 152 156 152 160 156 162 161 162
160 152 0 152 152 152 156 152 152 152 160 156 152 161 156
Livann51 162 176 170 178 162 178 162 178 162 162 178 162 168 176 162
162 176 166 168 162 168 162 162 157 162 162 162 160 166 162
Livann60
380 284 286 319 0 277 319 288 319 0 284 319 286 284 284
273 284 286 273 0 277 306 277 288 0 284 284 286 273 284
49
Locus 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135
Pvan1815 142 133 142 142 142 142 142 142 132 133 133 133 142 142 142
133 132 133 133 133 142 132 133 132 133 133 133 132 133 136
Pvan1758 187 184 191 184 187 189 191 193 174 193 184 0 184 191 187
174 174 184 174 174 184 184 174 174 184 174 0 184 184 184
Lvan05 0 177 177 177 177 177 0 177 177 177 186 0 0 171 0
177 177 177 177 177 177 177 177 177 177 177 177 177 177 177
TUMXlv10.312 182 183 182 182 182 183 182 183 183 183 182 182 182 183 183
181 182 182 182 182 181 181 176 182 182 182 182 181 176 183
TUMxlv8.256 152 0 152 162 162 161 156 161 156 152 159 161 160 162 161
152 0 152 152 162 152 156 161 156 152 159 152 156 156 153
Livann51 162 162 178 178 168 178 176 178 170 170 166 178 162 178 166
162 162 162 162 162 178 168 178 162 166 162 168 162 162 162
Livann60
319 286 286 286 284 284 277 286 286 348 286 319 319 277 309
277 286 284 277 284 277 273 286 284 348 273 273 319 277 277
50
Locus 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150
Pvan1815 142 142 142 142 133 142 133 142 142 0 133 142 133 142 133
132 133 132 133 133 132 132 133 142 0 133 136 132 136 133
Pvan1758 185 191 191 184 184 189 191 191 189 174 187 187 193 174 184
184 184 184 184 174 189 184 191 174 174 184 184 184 174 184
Lvan05 159 177 165 177 186 167 177 173 0 186 177 177 177 167 165
177 177 177 177 177 177 177 177 177 177 177 177 177 177 177
TUMXlv10.312 183 182 182 182 182 182 182 182 183 183 183 183 183 181 182
182 181 181 181 182 182 181 182 182 182 181 182 182 179 182
TUMxlv8.256 160 156 160 152 152 156 156 156 161 152 160 161 154 161 161
156 152 156 152 152 152 152 152 152 152 156 152 154 156 152
Livann51 170 178 168 162 166 162 162 178 170 166 168 166 170 176 168
160 168 162 162 166 162 162 168 168 162 160 162 166 162 162
Livann60
301 0 319 288 286 319 284 284 380 310 288 288 348 286 284
301 0 288 288 273 319 284 284 319 286 288 273 286 277 284
51
Locus 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165
Pvan1815 136 142 133 142 136 142 142 142 142 142 132 142 142 142 142
132 142 133 142 133 142 142 142 133 142 132 133 142 132 134
Pvan1758 193 184 184 189 174 189 189 0 184 0 193 0 0 0 189
184 184 184 187 174 184 185 0 184 0 184 0 0 0 184
Lvan05 177 177 177 177 177 0 177 0 177 177 186 177 167 173 177
177 177 177 177 177 177 177 177 177 177 177 177 177 177 177
TUMXlv10.312 182 182 182 183 183 183 183 0 183 0 183 0 181 182 183
176 181 181 182 183 181 182 0 182 0 182 0 181 181 182
TUMxlv8.256 160 161 154 160 159 162 152 152 161 161 161 152 161 161 156
160 152 154 152 159 162 152 152 156 156 159 152 152 152 156
Livann51 178 162 178 170 178 0 0 0 168 162 178 168 178 178 166
166 162 170 162 162 0 0 0 162 162 162 162 162 178 162
Livann60
348 288 286 286 301 286 273 286 380 286 286 0 273 319 380
286 284 286 273 286 273 273 286 286 273 286 0 273 286 286
52
Locus 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180
Pvan1815 142 142 0 0 0 0 0 132 142 142 133 133 142 132 142
133 133 0 0 0 0 0 132 132 133 133 132 136 132 133
Pvan1758 184 189 0 189 0 193 184 184 184 184 184 0 184 184 184
174 184 0 174 0 184 184 174 184 184 184 0 174 174 184
Lvan05 177 177 0 177 171 171 177 177 159 177 177 177 167 177 177
177 177 177 177 177 177 177 177 177 177 177 177 177 177 177
TUMXlv10.312 182 0 0 183 0 181 0 0 183 183 182 181 0 183 183
182 0 0 182 0 176 0 0 181 182 181 179 0 181 181
TUMxlv8.256 162 152 0 152 160 0 0 160 160 161 0 161 161 152 160
152 152 0 152 152 0 0 160 156 156 0 152 153 152 156
Livann51 178 178 0 168 178 170 168 178 162 162 170 166 162 166 162
162 166 0 162 170 166 162 162 162 162 166 162 162 166 162
Livann60
288 286 284 286 286 286 284 286 286 319 348 288 284 284 0
284 284 284 286 273 273 284 284 273 273 286 284 284 284 0
53
Locus 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195
Pvan1815 142 142 142 142 136 142 142 134 134 142 142 142 142 133 142
136 133 142 142 133 142 142 132 134 133 134 142 142 133 133
Pvan1758 191 184 193 189 191 184 184 189 184 191 187 184 191 191 184
184 174 174 189 184 184 174 189 174 184 174 184 174 184 184
Lvan05 177 177 159 177 175 177 159 159 167 167 177 177 173 177 173
177 177 177 177 177 177 177 177 177 177 177 177 177 177 177
TUMXlv10.312 183 183 183 182 183 182 181 182 181 182 183 182 182 183 182
182 182 182 181 182 176 181 181 181 182 183 181 182 181 182
TUMxlv8.256 156 162 156 152 160 161 162 162 156 161 162 152 156 161 152
152 152 152 152 152 152 162 156 152 152 160 152 152 154 152
Livann51 178 178 166 166 170 178 178 166 178 162 170 162 176 178 168
162 162 162 162 170 178 176 166 178 162 162 162 168 178 162
Livann60
286 0 0 0 301 273 277 380 286 288 286 288 319 0 277
277 0 0 0 301 273 277 286 286 273 286 288 319 0 277
54
Locus 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210
Pvan1815 142 142 142 142 142 142 133 142 142 133 0 133 142 133 142
132 133 142 136 132 132 132 132 142 133 0 133 133 133 142
Pvan1758 191 187 191 174 184 184 187 184 0 0 193 184 187 191 191
189 187 191 174 184 184 174 184 0 0 184 184 184 187 191
Lvan05 167 177 177 173 171 177 157 177 167 159 171 177 177 177 177
177 177 177 177 177 177 177 177 177 177 177 177 177 177 177
TUMXlv10.312 182 183 183 182 181 183 183 181 182 183 183 182 183 183 183
181 182 183 182 176 182 183 181 181 182 183 181 181 181 182
TUMxlv8.256 162 162 160 152 160 161 160 156 161 152 161 160 160 156 156
152 156 152 152 160 152 156 152 152 152 159 156 156 152 152
Livann51 178 166 176 178 176 162 164 170 176 168 178 178 168 178 162
168 162 162 162 166 162 162 162 162 162 166 162 160 162 157
Livann60
284 319 288 284 286 288 284 286 319 0 286 284 301 286 286
284 288 277 284 273 273 284 284 284 0 286 284 288 277 286
55
Locus 211 212 213 214 215 216
Pvan1815 142 134 136 142 134 142
133 132 133 142 132 136
Pvan1758 191 174 189 184 189 0
191 174 174 184 184 0
Lvan05 177 159 177 177 0 173
177 177 177 177 177 177
TUMXlv10.312 182 183 182 182 182 183
181 181 182 182 181 182
TUMxlv8.256 161 161 161 161 152 162
156 152 152 161 152 152
Livann51 168 168 168 178 170 168
164 162 162 162 164 168
Livann60
319 301 284 319 380 319
286 284 273 277 284 288
56