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UNIVERSIDAD DE MALAGA

FACULTAD DE MEDICINA DEPARTAMENTO DE FARMACOLOGIA

“Influencia genética de las moléculas de

histocompatibilidad de clase II en la expresión del

daño hepático en la hepatotoxicidad idiosincrásica

debida a fármacos”

ANA ISABEL ALONSO DIAZ

Tesis doctoral realizada en el Departamento de Medicina de la Facultad de Medicina de la Universidad de Málaga, bajo la dirección de la Profesora Dra. Doña Maria Isabel Lucena Gonzalez (Dpto. de Farmacología y Pediatría), el Profesor Dr. Don Raúl J. Andrade Bellido (Dpto. De Medicina) y el Catedrático Dr. Don Felipe Sánchez de la Cuesta (Dpto. de Farmacología y Pediatría). El estudio ha sido parcialmente financiado por una beca FISS nº 01/1088 del Ministerio de Sanidad y Consumo, Fondo de Investigación Sanitaria y la Agencia Española de Medicamento.

Doña Ana Isabel Alonso Diaz Málaga, noviembre de 2003

DOÑA MARIA ISABEL LUCENA GONZALEZ, PROFESORA TITULAR DEL

DEPARTAMENTO DE FARMACOLOGÍA Y PEDIATRÍA DE LA FACULTAD

DE MEDICINA DE LA UNIVERSIDAD DE MÁLAGA

CERTIFICA: Que Doña ANA ISABEL ALONSO DIAZ, con DNI: 29138395, ha

obtenido y estudiado bajo mi dirección el material necesario para la realización

de su Tesis Doctoral titulada “Influencia genética de las moléculas de

histocompatibilidad de clase II en la expresión del daño hepático en la

hepatotoxicidad idiosincrásica debida a fármacos”, la cual ha finalizado con

todo aprovechamiento, habiendo revisado su Tesis y estando conforme para

ser juzgada.

Y para que conste, en cumplimiento de las disposiciones vigentes, expido el

presente certificado en Málaga a veintinueve de noviembre de dos mil tres.

Fdo: Maria Isabel Lucena

Directora Tesis Doctoral

DON RAÚL JESÚS ANDRADE BELLIDO, PROFESOR TITULAR DEL

DEPARTAMENTO DE MEDICINA DE LA FACULTAD DE MEDICINA DE LA

UNIVERSIDAD DE MÁLAGA







ser juzgada.



Fdo: Raúl J. Andrade Bellido

Director Tesis Doctoral

DON FELIPE SÁNCHEZ DE LA CUESTA, CATEDRÁTICO DE

FARMACOLOGÍA Y TERAPÉUTICA CLÍNICA DE LA FACULTAD DE

MEDICINA DE LA UNIVERSIDAD DE MÁLAGA,







ser juzgada.



Fdo: Felipe Sánchez de la Cuesta

Director Tesis Doctoral

AGRADECIMIENTOS

A la Dra. Doña. Maribel Lucena y al Dr. Don Raúl J. Andrade, los cuales son un

ejemplo de eficacia y dedicación al trabajo, por dedicarme su tiempo,

enseñarme y darme su confianza.

Al Dr. Don Felipe Sánchez de la Cuesta, catedrático y director del

Departamento de Farmacología de la Facultad de Medicina de la Universidad

de Málaga y en general a todos los integrantes del Departamento, en especial

a Maria Rosario Cabello por sus constantes muestras de cariño y a Rosi.

A la Unidad de Farmacología Clínica y Servicio de Aparato Digestivo de todos

los hospitales colaboradores del estudio, sin los cuales no se hubiera podido

realizar este trabajo.

A Don Rafael Benítez, cuyos conocimientos en el campo de la inmunología

han sido de valiosa ayuda.

A la Dra. Dña. Pilar Morata, profesora titular del Departamento de Bioquímica

de la Facultad de Medicina de la Universidad de Málaga y a sus

colaboradores, Maribel y Guillermo.

Al Dr. Don Antonio Alonso y a Don Abelardo Caballero del Laboratorio de

Inmunología del Hospital Carlos Haya en Málaga.

A Don Ramón Hidalgo, del Centro de Cálculo de la Universidad de Málaga.

A Don Alfonso Serrano, del laboratorio de inmunología del Hospital Clínico

Universitario de Málaga.

Al personal de la hemeroteca de de la Facultad de Medicina de la Universidad

de Málaga.

A toda mi familia, por su apoyo incondicional, a quien dedico este trabajo.

CENTROS COLABORADORES DE ESTE ESTUDIO

Hospital Clínico Universitario de Málaga en Málaga: Miren García-Cortés, Raquel Camargo, Ramiro Alcántara, Elena García, Raúl J Andrade, Maribel Lucena, CENTRO COORDINADOR. Hospital Torrecárdenas en Almería: Mª Carmen Fernández, Gloria Pelaez, José Luis Vega, Marta Casado. Hospital Vírgen de la Nieves en Granada: Rafael Martín-Vivaldi, Flor Nogueras. Hospital Clínico Universitario San Cecilio en Granada: Javier Salmerón, Mª Angeles López-Garrido. Hospital Costa del Sol en Málaga: José Mª Navarro. Hospital Nuestra Señora de Valme en Sevilla: Manuel Romero, Raquel Corpas. Hospital Vírgen de la Macarena en Sevilla: José Antonio Durán, Manuel Jiménez Hospital Central de Asturias en Oviedo: Luis Rodrigo.

ÍNDICE

Páginas

Capítulo I.- JUSTIFICACIÓN……………………………………………1

Capítulo II.- INTRODUCCIÓN

І.- Metabolismo de fármacos; papel del hígado en la formación de metabolitos reactivos…………………………………………………..............................8

Ι.1.- Reacciones de Fase I………………………………………………………................8

І.1.a.- Metabolismo oxidativo: citocromo P450…………………………………..……13

Ι.2.- Reacciones de Fase II……………………………………………………………......15

І.3.- Reacciones de Fase III……………………………………………………………….20

Ι.3.a.- Sistemas de transporte canalicular de fármacos…………………………………24

ІІ.- Criterios diagnósticos…………………………………………………...30

ΙІ.1.- Escalas diagnósticas para el establecimiento de la relación de causalidad…………33

ΙΙΙ.- Definición y criterios clínicos de la hepatotoxicidad……………..........36

ІІΙ.1.- Criterios de laboratorio…………………………………………………………….36

ІІІ.2.- Criterios histológicos………………………………………………………………43

ΙV.- Importancia de las reacciones adversas hepatotóxicas………………...47

V.- Mecanismos de toxicidad hepática……………………………………..50

V.1.- Toxicidad intrínseca………………………………………………………………..50

V.2.- Reacciones idiosincrásicas………………………………………………………....54

V.2.a.- Idiosincrasia metabólica………………………………………………………..54

V.2.b.- Idiosincrasia inmunoalérgica…………………………………………………..58

VΙ.- La respuesta inmune……………………………………………...........67

VΙ.1.- Estructura del receptor de linfocitos T y los genes que lo codifican……………...69

VΙ.2.- Unión del receptor T al antígeno y al MHC………………………………............74

VІ.3.- Las moléculas correceptoras CD4 y CD8…………………………………………76

VΙ.4.- Efectos de la unión del antígeno al receptor en la superficie celular……………...80

VІ.5.- Citokinas…………………………………………………………………………..83

VΙ.6.- El complejo mayor de histocompatibilidad (MHC)……………………….............85

VΙ.6.a.- Las moléculas de clase I: estructura y organización genética…………………86

VІ.6.b.- Las moléculas de clase II: estructura y organización genética………………..90

VΙ.6.c.- Función de las moléculas de clase I y clase II………………………………...92

VІ.6.d.- Procesamiento del antígeno y ensamblaje a las moléculas de clase II………..95

VΙ.6.e.- Procesamiento del antígeno y ensamblaje a las moléculas de clase I…………97

VІ.7.- Polimorfismo y poligenia………………………………………………………….98

VΙ.8.- HLA y hepatotoxicidad………………………………………………...................102

VІ.9.- Técnicas para la determinación de especificidades HLA…………………………108

VΙΙ.- Factores del huésped que modulan la hepatotoxicidad de un fármaco.112

VІІІ.- Factores genéticos que contribuyen a la hepatotoxicidad…………....117

VΙΙΙ.1.- Polimorfismo de CYP2D6………………………………………………………118

VΙΙΙ.2.- Polimorfismo de CYP2C19…………………………………………………......120

VΙΙΙ.3.- Polimorfismo de CYP3A4………………………………………………………121

VΙΙΙ.4.- Polimorfismo en los sistemas de detoxificación de metabolitos reactivos……...122

VΙΙΙ.4.a.- Polimorfismo en la N-acetilación……………………………………………122

VΙΙΙ.4.b.- Polimorfismo de Sulfotransferasa…………………………………………...124

VΙΙΙ.4.c.- Polimorfismo de Glutation Sintetasa……………………………………..….124

VΙΙΙ.4.d.- Polimorfismo de Epoxido Hidrolasa………………………………………...125

VΙΙΙ.5.- Polimorfismo genético en los receptores u órganos diana………………………127

Capítulo III.- OBJETIVOS……………………………………………….130

Capítulo IV.- MATERIAL Y MÉTODOS

І.- Material y métodos………………………………………………………131

Ι.1.- Diseño de estudio…………………………………………………………………....131

І.2.- Pacientes………………………………………………………………………….....131

Ι.2.a.- Criterios de inclusión……………………………………………………………141

І.2.b.- Criterios de exclusión……………………………………………………………141

Ι.3.- Controles………………………………………………………………………….....142

І.4.- Obtención de muestras……………...……………………………………………….143

Ι.4.a.- Recogida de muestras…………………………………………………………...146

І.5.- Instrumental y aparatos……………………………………………………………...147

Ι.6.- Técnicas analíticas…………………………………………………………………..148

І.6.a.- Reactivos usados para la extracción de DNA…………………………………..148

І.6.b.- Extracción de DNA……………………………………………………………..148

Ι.6.c.- Reactivos usados en la prueba de PCR…………………………………………150

І.6.d.- Tipaje de la región DRB y DQB………………………………………………..150

ΙΙ.- Análisis estadístico………………………………………………….......154

Capítulo V.- RESULTADOS……………………………………………...156

Ι.- Pacientes……………………………………………………………………………….158

І.1.- Establecimiento de la Causalidad según la escala de CIOMS…………………….168

ΙΙ.- Distribución de los alelos HLA-DRB1* y DQB1* entre pacientes y controles……..168

ІІІ.- Distribución de los alelos HLA-DRB1* y DQB1* según los lugares de procedencia de las muestras……………………………………………………………………………….171

ΙV.- Distribución de los alelos HLA-DRB1* y DQB1* según el sexo…………………..172

V.- Distribución de los alelos HLA-DRB1* y DQB1* según el tipo de daño hepático….174

VІ.- Distribución de los alelos HLA-DRB1* y DQB1* según el mecanismo de lesión hepática…………………………………………………………………………………...179

VІІ.- Distribución de los alelos HLA-DRB1* y DQB1* por grupos farmacológicos…………………………………………………………………...……….182

VІІΙ.- Distribución de los alelos HLA-DRB1* y DQB1* en los pacientes que tomaron amoxicilina-clavulánico…………………………………………………………………..183

V ІІΙ.1.- Características generales.……………………………………………………...183

V ІІΙ.2.- Distribución de frecuencias……………………………………………………184

Capítulo VI.- DISCUSIÓN………………………………………………..189

Capítulo VII.- CONCLUSIÓN……………………………………………200

Capítulo VIII.- BIBLIOGRAFÍA…………………………………………202

Dedicado a la memoria de Idoia

“Borontatearen indarrak mendiak mugitzea dauka”

CAPÍTULO I

JUSTIFICACIÓN

CAPITULO I - JUSTIFICACIÓN

1

JUSTIFICACION

El daño hepático causado por fármacos supone aproximadamente del 2 al

5% de las hospitalizaciones por ictericia, el 10 % de los casos de hepatitis en

los adultos y más del 40 % de los casos de hepatitis en pacientes mayores

de 50 años. Es, además, una de las causas mas frecuentes de retirada de

fármacos del mercado. Hay que tener en cuenta que el hígado es un órgano

diana a través del cual pasan multitud de fármacos liposolubles que siguen

principalmente la vía de metabolización del citocromo P-450, formándose

metabolitos reactivos que en muchos casos son capaces de unirse

covalentemente a moléculas o DNA, incluso producir iones peróxido,

causando un daño hepático. Por otro lado, existe otra vía de metabolización

hepática por medio de la conjugación con glucurónido o glutatión, por la que

se neutralizan los metabolitos previamente formados y que podrían ser

altamente reactivos, evitandose así la producción de toxicidad. La dieta, la

edad, el consumo de alcohol, la presencia de otros fármacos, etc., pueden

actuar alterando estos enzimas e influenciando el metabolismo de los

fármacos. Es importante resaltar que variaciones genéticas en el

metabolismo de los fármacos pueden predisponer al desarrollo particular de


2

toxicidad en algunos individuos, dependiendo del grado de susceptibilidad

de éstos.

La hepatotoxicidad debida a fármacos puede resultar de una toxicidad

directa o dosis dependiente, con un periodo de latencia corto, en la que

dichos fármacos o sus metabolitos producen directamente el daño celular; el

compuesto o sus metabolitos activos interactúan con componentes de la

célula originando su muerte. Existe también un segundo tipo de reacción

hepatotóxica más impredecible y no dependiente de la dosis de fármaco, en

la que se distinguen dos tipos de mecanismos: a) en el primero se produce

un metabolismo alterado del fármaco con ausencia de transformación de un

precursor determinado o un aumento en la concentración de metabolitos

tóxicos en el paciente frente a otros indivíduos (idiosincrasia metabólica);

b) y en el segundo se produce la activación del sistema inmune, cuya

intervención se pone de manifiesto por la existencia en muchos casos de

signos de hipersensibilidad como rash, fiebre, eosinofilia...(idiosincrasia

inmunoalérgica). La transformación del fármaco en un metabolito reactivo y

su posterior unión, bien a la enzima que lo generó o bien a una proteína

plasmática propia, produce un neoantígeno que conlleva la activación del

sistema inmune específico.


3

La distinción entre un mecanismo metabólico y una reacción de

hipersensibilidad es más académica que práctica, ya que ambos

mecanismos suelen estar implicados al mismo tiempo aunque con variable

intensidad. Pongamos como ejemplo el caso de un anestésico general

como es el halotano, en cuyo metabolismo se produce una primera

activación metabólica con formación de metabolito reactivo, seguido de un

mecanismo de activación del sistema inmune.

Los procesos metabólicos de los fármacos tienen lugar preferentemente en

retículo endoplásmico, y allí se produce también la síntesis y ensamblaje de

las moléculas del Sistema Mayor de Histocompatibilidad (HLA o human

leucocyte antigen) con sus antígenos. Las moléculas de Clase II presentan

péptidos al receptor de los linfocitos T helper o T-CD4+, paso crucial en el

desencadenamiento de la respuesta inmune que incluye la activación de las

células T y B. Puesto que las moléculas HLA exhiben un alto grado de

polimorfismo y participan en la activación del sistema inmune específico, es

plausible que determinadas variantes alélicas o haplotipos presenten una

mayor capacidad para asociarse a los neoantígenos formados durante la

transformación metabólica del fármaco, pudiendo existir una relación entre el

haplotipo HLA particular del sujeto y su propensión al desarrollo de

reacciones hepatotóxicas inmunoalérgicas, debido a la capacidad estructural


4

de los neoantígenos para acomodarse a determinadas especificidades HLA

y no a otras.

Clásicamente se ha relacionado el sistema HLA con la susceptibilidad a

algunas enfermedades infecciosas y su posterior evolución (Hill, 1998). El

antígeno de clase II HLA-DR2 fue asociado con la susceptibilidad a la lepra

(van Eden et al., 1980) y a la tuberculosis (Singh et al., 1983),

particulármente en la población asiática.

Los polimorfismos de las moléculas del sistema HLA se han asociado

también con numerosas patologías de base autoinmune como la artritis

reumatoide, relacionada con el alelo DQA1*0301 (Zanelli et al., 1998), o la

diabetes mellitus insulin-dependiente en la que el alelo DQB1* 0602 parece

tener un papel protector (Pugliese et al., 1995).

También existen datos que relacionan determinadas reacciones

inmunoalérgicas a fármacos con el fenotipo HLA del sujeto. Así las

reacciones lupus-like producidas por la hidralacina son más frecuentes en

sujetos con HLA-DR4 (Batchelor et al., 1980).


5

Sin embargo, existe poca información publicada a cerca de la posible

relación entre el sistema HLA y las reacciones específicamente

hepatotóxicas. Esto es debido, en parte, a la dificultad que conlleva reunir un

grupo amplio de sujetos que hayan sufrido una reacción hepatotóxica al

mismo fármaco; o también porque estadísticamente los resultados obtenidos

no son significativos al corregirlos por el número de alelos tipados.

Los primeros estudios al respecto, como los realizados con el halotano, son

contradictorios, ya que en uno de ellos no encuentran asociación estadística

significativa entre la hepatotoxicidad por halotano y nigún alelo del HLA, y en

el segundo estudio sí encuentran asociación con el haplotipo Aw24-Bw52-

DR2 (Otsuka et al., 1985). Ambos estudios son diferentes tanto en el número

y selección de pacientes como en el origen de éstos y también la selección

del tipaje.

Parte de la información que hay es confusa, por ejemplo en lo que respecta

a la relación entre la hepatotoxicidad por nitrofurantoína y el HLA B8

(Maniatis, 1982), los datos que hay están basados en publicaciones de

casos aislados que a su vez se apoyan en datos de estudios previos, de la

década de los 70, en los que se relacionaba a las hepatitis crónicas activas


6

criptogénicas, de posible origen autoinmune, con el HLA-B8, década en la

que aún no era descartable la infección por VHC.

En los últimos años Berson y sus colaboradores (1994), usando métodos

serológicos, sí vieron asociación entre la hepatotoxicidad debida a la

asociación entre el diclofenac y los antidepresivos tricíclicos y el haplotipo

HLA-A11, así como el HLA-DR6 y la hepatotoxicidad por clorpromacina.

Pero en ámbos casos el análisis estadístico no arrojó significación al

corregirse por el número de comparaciones realizadas.

Más recientemente, Hautekeete y colaboradores (1999) realizan un estudio

con métodos genotípicos a pacientes con hepatotoxicidad debida al

consumo de amoxicilina-clavulánico, encontrándose asociación significativa

entre la aparición de esta toxicidad y el haplotipo HLA-DRB1*1501-

DRB5*0101-DQB1*0602, hipótesis corroborada unos años después en un

estudio de similares características (O´Donohue et al., 2001).

Estos datos, en que la reacción inmunoalérgica a un fármaco se asocia a un

haplotipo del HLA en particular, apoyan la hipótesis de que el reconocimiento

por parte de las moléculas del HLA, de los neoantígenos generados en el


7

metabolismo de los fármacos, jugaría un papel crucial en la patogenia de la

hepatotoxicidad por mecanismo inmunoalérgico.

Nuestro estudio pretende seguir ahondando más en la relación entre el HLA

del paciente y la susceptibilidad a desarrollar daño hepático debido a

fármacos. Para ello, hemos colaborado con hospitales en diferentes

provincias de la península que nos han remitido muestras de sangre de

pacientes con historia clínica de hepatotoxicidad debida a fármacos y previa

extracción de su DNA.

El objeto de nuestro estudio será examinar si existe asociación entre el

genotipo HLA del huesped y la predisposición de un determinado individuo a

desarrollar una reacción hepatotóxica idiosincrásica por fármacos.

CAPÍTULO II

INTRODUCCIÓN

CAPITULO II - INTRODUCCION

8

І.- METABOLISMO DE LOS FARMACOS ; PAPEL DEL HIGADO EN LA

FORMACION DE METABOLITOS REACTIVOS

El hígado, es el principal órgano detoxificador del ser humano, y por ello,

está predispuesto a fenómenos de toxicidad química.

En el hígado se concentran y metabolizan la mayoría de los fármacos y

toxinas introducidas en el organismo. Estos compuestos son procesados por

una gran variedad de enzimas solubles o unidos a membranas,

especialmente en el retículo endoplásmico.

La mayoría de los fármacos son liposolubles y para ser excretados por el

riñón o la bilis han sido transformadas en moléculas hidrosolubles en el

hígado. Existe una serie de reacciones que conducen a esta

biotransformación:

І.1.- REACCIONES DE FASE I

Son reacciones de oxidación, reducción o hidrólisis, la mayoría de las

cuales son catalizadas por la superfamilia del citocromo P450 (Nelson et al.,

1993)


9

Tabla 1. Isoenzimas del citocromo P450 más importantes en el metabolismo de fármacos en el hombre, fármacos representativos metabolizados, inductores e inhibidores así como sustancias empleadas para la determinación de las diferentes actividades metabólicas Isoenzimas Fármacos

Substrato Fármacos Inductores

Fármacos Inhibidores

Marcado Fenotipo

Genotipo

CYP1A2 Cafeína Clozapina Fluvoxamina Haloperidol Imipramina Olanzapina Propafenona Propranolol Tamoxifén Teofilina Tacrina

Omeprazol Ciprofloxacino Clozapina Enoxacino Fluvoxamina Mexiletina

Cafeína NO

CYP2C9 AINEs Fenitoina Tolbutamida Warfarina

Barbituricos Rifampicina

Sulfafenazol Diclofenac SI

CYP2C19 Amitriptilina Citalopram Diazepam Moclobemida Omeprazol

Rifampicina Tranilcipromina Mefenitoina Omeprazol

SI

CYP2D6 Nortriptilina Propranolol Risperidona Perhexilina Fluoxetina Codeina Propafenona dextrometorfan

_ Quinidina Debrisoquina Dextrometorfán

SI

CYP2E1 Clorzoxazona Enflurano Etanol Halotano Paracetamol

Etanol(usocrónico) Isoniacida

Disulfiram Clorzoxazona

SI

CYP3A4 Ciclosporina Carbamazepina Losartan Lansoprazol Lovastatina Terfenadina Ritonavir Triazolam Verapamil

Carbamazepina Fenitoína Glucocorticoides Rifampicina

Ketoconazol Eritromicina

Eritromicina Midazolam Omeprazol

NO

AINEs: Antiinflamatorios no esteroideos


10

Se han descrito al menos 30 isoformas del citocromo P450, que se agrupan

en familias y subfamilias. Cada enzima de la superfamilia del citocromo P450

está codificada por un gen distinto. Las más usadas son CYP2D6, CYP2E1 y

CYP3A4 (tabla 1). Cada subfamilia es específica del sustrato que

metaboliza, así como de los distintos fármacos que actúan como inductores

o inhibidores de los mismos (Ingelman-Sundberg, 1999).

Las principales causas de las variaciones en el metabolismo del fármaco a

través del hígado son:

-polimorfismos genéticos (Lee, 1997) - La industria farmacéutica está

empezando a considerar un tratamiento individualizado de la dosis del

fármaco basado en el genotipo específico del paciente, teniendo en cuenta

tanto los aspectos farmacocinéticos como farmacodinámicos.

La isoniazida es un efectivo antituberculoso cuya primera ruta en su

metabolismo es la acetilación a N-acetilisoniazida mediante la enzima NAT2

o N-acetiltransferasa. Se han hecho estudios del polimorfismo en la enzima

NAT2, viéndose diferencias entre lentos y rápidos acetiladores, y la relativa

proporción entre los dos fenotipos varía considerablemente entre los

diferentes grupos étnicos (Evans et al., 1960).


11

-Ciertos fármacos poseen en su molécula un núcleo quiral (núcleo

alrededor del cual puede girar la molécula) que hace que dicha molécula

posea dos enantiómeros con diferentes espectros de hepatotoxicidad. Esto

sugiere que el hígado los metaboliza de diferente manera. Estudios con

enantiómeros individuales nos muestran que en el caso de la molécula de

bufenadrina, el hígado no es capaz de metabolizar el enantiómero R -(--)-

bufenadrina en una cantidad suficiente como para prevenir la acumulación

de la sustancia, y por tanto, su toxicidad (Hespe et al., 1972).

-La inducción o inhibición debida a los tratamientos concomitantes de

fármacos o a factores medioambientales; por ejemplo, la dapsona es un

fármaco asociado a toxicidad hematológica y se ha demostrado que la N-

hidroxilación de un compuesto progenitor es un requisito para su toxicidad

(Uetrecht et al.,1988). La implicación del citocromo P450, concretamente

CYP2C9, CYP2E1 Y CYP3A4, ha sido confirmada in vivo con el uso de un

inhibidor no específico, la cimetidina, la cual bloquea la N-hidroxilación y por

tanto la hemotoxicidad de dapsona (Coleman et al., 1990 y 1992; Rhodes et

al., 1995).

En el caso del halotano, fármaco usado en anestesia general, existe un

inhibidor para su proceso metabólico oxidativo pero no para el reductivo. La


12

oxidación del halotano es mediada por el citocromo P450 mediante CYP2E1

y CYP2A6, y se ha demostrado que la preadministración una única dosis de

disulfiram disminuye este proceso oxidativo, y por tanto el posible efecto

tóxico de su intermediario electrofílico (peroxidación lipídica) (Kharasch et

al., 2000). No ocurre lo mismo con el proceso reductivo del halotano,

mediado por CYP2A6 y CYP3A4.

-Otro factor es la formulación del fármaco. El ácido nicotínico, usado en el

tratamiento de hiperlipidemias, tiene diversos efectos adversos entre los que

se encuentra una elevación de las enzimas hepáticas, que es más común en

pacientes a los que se les ha prescrito unos grandes incrementos de dosis

en cortos periodos de tiempo (Ferenchick and Rovner, 1989).

- Influyen factores geográficos, como en el caso del benoxaprofeno,

principio activo que fue asociado con serios problemas de fotosensibilidad, y

cuyo potencial hepatotóxico era más acusado en las zonas del norte de UK

(donde había menos horas de sol) que en el resto del país (Griffin, 1984).

- Dependiendo del tiempo de exposición, el fármaco puede producir daño

hepático agudo o crónico, ambos clínica e histológicamente diferentes. El

periodo de latencia del daño agudo es generalmente de menos de 6


13

semanas mientras el crónico oscila entre 6 semanas y 6 meses (Bénichou,

1990).

-También pueden influir, pero en menor medida, la edad del paciente

(Kamal and Koch, 1982) y el proceso patológico de base.

І.1.a.- Metabolismo oxidativo : citocromo P450

La reacción que básicamente se produce en cualquier citocromo P450 es:

NADPH + H+ + O2 + S NADPH+ H+ + H2O + S-OH

La interacción entre las proteínas del citocromo P450 y las reductasas se ve

facilitada por la bicapa de lípidos en la que están incluídas. El fármaco en

forma reducida se une en primer lugar al citocromo P450 oxidado (Fe3+),

después es reducido (Fe2+) por la reductasa, y el complejo fármaco-

citocromo interactúa con el oxígeno molecular para formar un complejo

terciario (el ferro-oxicitocromo P450-sustrato), que puede disociarse dando

lugar a un anión peróxido y regenerándose la hemoproteína férrica. Dentro

del complejo, un átomo de oxígeno es transferido al sustrato para oxidarlo, y

el otro reacciona con dos protones para formar agua; el sustrato oxidado se

libera y el citocromo P450 se regenera en forma férrica (Benet , 1996).


14

Figura 1: Secuencia de reacciones que se producen en el citocromo P450

En definitiva y como resultado de la actividad catalítica del citocromo P450,

podemos obtener sustancias menos activas que los sustratos primarios, pero

también tóxicas como los radicales epóxidos o carcinogénicos en algunas

circunstancias. Esta acción pone en entredicho la función detoxificante que

en un principio se atribuyó al citocromo P450.

P450

Fe3+

P450

Fe3+

P450 P450

Fe2+

P450

Fe3+-O2

P450

F - H

Fe2+-O2

Fe3+-O

F - H

F - H

F - H

F - OH F - H

O2

e -

2H +

H2O

e - F - H


15

Como resumen, podemos decir que las reacciones de FASE I conducen a la

bioinactivación de multitud de fármacos que se metabolizan en el hígado,

aunque no se puede olvidar que en muchos casos se generan metabolitos

reactivos que pueden originar una lesión orgánica por varios mecanismos: a)

por acción directa sobre la células hepáticas interfiriendo en su normal

función fisiológica y produciendo necrosis celular; b) por actuar como un

hapteno e iniciar una respuesta inmune de tipo humoral, celular o la

combinación de ambas. Esta respuesta inmune puede ser dirigida hacia el

propio fármaco, la proteína transportadora o el neoantígeno creado por la

combinación del fármaco y la proteína (Gillete et al., 1984; Boelsterli,1993)

І.2.- REACCIONES DE FASE II

Van dirigidas a completar el metabolismo de sustancias exógenas. Son

reacciones de conjugación con un grupo polar hidrosoluble como ácido

glucurónico, sulfato, acetato, glicina, glutation o grupo metilo. Tienen lugar

en el citoplasma. Como consecuencia de este metabolismo se produce

normalmente un descenso en la actividad farmacológica y un aumento en la

excrección (ej: acetaminofen, furosemida, bilirrubina).


16

Metabolito estable

Metabolito hidroxilado

Metabolito reactivo

Conjugación (glucurónido,sulfato,acetato)

Excreción

Detoxificación

Unión covalente a macromoléculas

Extrés oxidativo Aductos Fármaco-proteínas

Apoptosis Lesión inmunitaria

Idiosincrásica o metabólica

Idiosincrásica o metabólica

Idiosicrásica o metabólica

FASE I FASE II

FASE III

Fármaco lipofílico

FASE II

Necrosis celular

Glutation

TNFα FAS

Figura 2: Metabolismo de los fármacos


17

Tabla 2: Reacciones de conjugación o Fase II

Tipo de conjugacion

Sustancia endógena

Enzima transportador Tipo de xenobiótico y metabolito conjugado

Glucuronoconjugación UDP-ácido glucurónico UDPG transferasa (REL) Fenoles, alcoholes, ácidos carboxílicos, aminas primarias, hidroxilaminas, sulfonamidas

Dihidrodiol (formación) Agua Epóxido hidrolasa (citosol y REL)

Epóxidos alifáticos y óxidos de arena

Conjugación con aminoácidos

Glicina, glutamina, ornitina, arginina, taurina

Acyl CoA-glicina transferasa (mitocondria y citosol, por ejemplo)

CoA-derivados del ácido carboxílico

Conjugación con sulfato

PAP-sulfato Sulfotransferasa (citosol) Fenoles, alcoholes, aminas aromáticas

Metilación S-adenosil metionina Transmetilasa (citosol) Catecoles, fenoles, aminas, histamina

Conjugación con glutation

Glutation Glutation S-transferasa (microsoma y sobre todo citosol)

Bromobenceno, acetaminofen, aflatoxinas y otros agentes convertidos en metabolitos electrofílicos

Acetilación Acetil CoA N-acetiltransferasa (citosol) Hidracinas, arilaminas

CoA, coenzima A ; PAP-sulfato, fosfoadenosina 5´fosfosulfato ; REL, retículo endoplasmático liso ; UDP, uridina difosfato ; UDPG, uridina difosfoglucuronil

La glucuronoconjugación puede ocurrir directamente con el compuesto

progenitor o con el metabolito formado en la reacción de Fase I. El proceso

de glucuronoconjugación está implicado en reacciones adversas asociadas

con ciertos fármacos carboxilados, que pueden dar lugar a acilglucurónidos

responsables de dicha reacción adversa (Hoyumpa and Schennker, 1991).


18

Así, la alta incidencia de anafilaxis asociada al zomepirac, podría ser debida

al enlace covalente que se forma con su radical acilo, el cual se uniría a su

vez covaléntemente a proteínas hepáticas produciendo hepatotoxicidad en

pacientes tratados con este fármaco antiinflamatorio.

Se cree que en general el proceso oxidativo de los fármacos es tarea

metabólica que se ve inicialmente menos deteriorada en pacientes con

alteración de la función hepática, mientras que la vía de conjugación con

ácido glucurónico permanece relatívamente inalterada en dichos fármacos,

incluso en fase avanzada de la enfermedad (Howden et al., 1988; McLean

and Morgan, 1991). Sin embargo, Hoyumpa y Schenker (1991) cuestionaron

este concepto general de la no modificación del proceso de

glucuronoconjugación en pacientes con daño hepático, ya que en un estudio

realizado a partir de los datos de varios trabajos relativos al oxacepam,

zomepirac, acetaminofen y morfina, y relacionándolos entre sí, sugirieron

que la glucuronoconjugación en pacientes con daño hepático grave es

desigual, mientras que dicho proceso metabólico en pacientes con daño

hepático leve sí permanece sin cambios (Hoyumpa and Schenker, 1991).

Por otra parte, se ha estudiado el proceso de glucuronoconjugación en

pacientes cirróticos tratados con ciertos fármacos como el oxacepam y se ha


19

visto un descenso en el aclaramiento de dicho fármaco (Sonne, 1990), con lo

cual aumenta su concentración y por tanto su acción tóxica.

Tabla 3: Diferencias en el metabolismo de los procesos oxidativo y de conjugación

Características Oxidación Conjugación

Ppal.sistema enzimático Citocromo P450 Glucuroniltransferasa, ácetiltransferasa,sulfotransferasa

Distribución enzimática, fracción celular

Microsomal Quizás no microsomal (acetil y sulfotransferasa )

Localización en la membrana microsomal

Superficie Interior

Localización lobular Centrilobular o mediozonal Periportal

Asociación con el retículo endoplásmico

Retículo endoplásmico liso Retículo endoplásmico rugoso

Modificación en enfermedad Mayor Menor

Tabla 4: Influencia de diversos parámetros sobre el metabolismo de los fármacos

Condiciones FASE I ( Oxidación ) FASE II ( conjugación )

Edad Disminución Sin cambio

Hipoxia Disminución Menor cambio

Cimetidina Disminución Sin cambios

Disulfiran Disminución Sin cambios

Contraceptivos orales Disminución Aumento

Etanol : Agudo

Crónico

Disminución

Aumento

Relatívamente inalterable

Sin cambio

Daño hepático Disminución Relatívamente inalterable en daño leve ; disminución en daño grave


20

Otro método de detoxificación es mediante la enzima glutation S-transferasa.

El glutation formado se une fuertemente a compuestos electrofílicos dañinos

derivados de fármacos; luego, el glutation tiene que ser repuesto de nuevo

mediante una dieta rica en compuestos sulfidrilo o con fármacos que

contengan cisteína como N-acetilcisteína (Devarakonda, 1994). Fármacos

como el acetaminofeno siguen esta vía de detoxificación (Lee, 1995).

І.3.- REACCIONES DE FASE III

Ha sido reconocido en el hígado el notable papel de las proteínas

transportadoras a través de la membrana canalicular, en la excreción biliar

de fármacos y metabolitos. Pero no está del todo claro, ya que hay muchas

proteínas transportadoras involucradas en la captación de fármacos desde la

sangre hacia el hígado a través de la membrana sinusoidal, y necesitan ser

consideradas en el contexto de la distribución y excreción (Yamazaki et al.,

1996; Kim , 2000).


21

Absorción

Han sido identificadas varias familias de proteínas transportadoras

involucradas en la absorción de fármacos a través del tracto gastrointestinal,

como: -MDR (multidrug resistance P-gyicoprotein); -MRP (multidrug

resistance protein); -OATP (organic anion transporting polypeptide); -OCT

(organic cation transporter); -OAT (organic anion transporter).

Sin embargo, ha sido la P-glicoproteína o MDR1 la más estudiada. La

distribución de la P-glicoproteína no es uniforme a lo largo del intestino, ya

que el contenido de la expresión de RNAm fue medido a través de la

longitud total del tracto gastrointestinal humano, y los niveles de RNAm

parecían aumentar progresivamente desde el estómago hacia el colon

(Watkins, 1997).

Mas recientemente, han sido detectados polimorfismos en los genes de la P-

glicoproteína humana en Caucasianos y Afro-americanos (Hoffmeyer et al.,

2000; Kim et al., 2000).


22

Excrección

El primer paso en la excreción implica la captación de fármacos al hepatocito

desde la sangre, y el sitio de entrada es la membrana sinusoidal, la cual

contiene muchas microvellosidades que aumentan la superficie de contacto.

Como resultado, la membrana sinusoidal ocupa cerca de un 70% del área de

la superficie del hepatocito (Keppler and Arias, 1997).

Debido a las propiedades fisico-químicas de muchos fármacos, éstos

penetran a través de la membrana sinusoidal por difusión pasiva. Sin

embargo, otras lo hacen por otros sistemas de transporte, y tales fármacos

tienden a ser ionizados, con pesos moleculares mayores de 400 d., y con

frecuencia contienen grupos polares (puentes de hidrógeno) (Meijer et al.,

1990).

Una vez en el hepatocito, el segundo paso de la excrección hepatobiliar

implica el translado de los fármacos a los lugares metabólicos y/o a la

membrana del canaliculo biliar, mediante proteínas transportadoras

intracelulares y por un proceso de difusión pasiva (Le Blanc, 1994).


23

En el tercer paso de la excreción biliar es el paso a través de la membrana

canalicular, y pueden intervenir el fármaco sin modificar, los metabolitos

derivados de éste o la combinación de ambos. La membrana canalicular

constituye un pequeño porcentaje (10-15%) de la superficie total del

hepatocito comparada con la membrana sinusoidal, y es el transporte activo

el más eficaz sistema de excreción desde el hepatocito al conducto biliar.

Son varias las proteínas transportadoras que median este proceso (Keppler

and Arias,1997; Müller and Jansen,1997; Stieger and Meier, 1998). Veamos

algunas de las más importantes:

Algunos de los miembros de la familia OATP como OATP-C y OATP-8 se

expresan solo en el hígado (Tamai et al., 2000), y transportan solo

compuestos ácidos debido a sus propiedades más básicas que otros de los

miembros de dicha familia. Los estudios en ratas de Oatp-1, han demostrado

que su transporte a través de la membrana canalicular es saturable,

bidireccional, dependiente de alta temperatura y con glutation como un

factor de ayuda para la captación de sustancias. Más recientes estudios han

confirmado también en ratas que Oatp-2 funciona mediante transporte

bidireccional y con ayuda del glutation (Shi et al., 1995; Li et al., 1998).


24

Otra familia de proteínas transportadoras es OCT, que se expresa en

hígado, pulmón, células epiteliales e intestino (Zhang et al., 1998). El papel

de las proteínas transportadoras OCT en la excreción hepatobiliar es

considerada limitada.

La familia de transportadores OAT, se expresa en el hígado, pulmón y

cerebro (Sekine et al., 1999). Por ejemplo, OAT-2 se expresa solo en

hígado, y participa en la excreción renal activa de sustratos como cimetidina,

metrotexato, cidofovir y adefovir (Inui et al., 2000).

І.3.a.- Sistemas de transporte canalicular de fármacos

Una de las principales familias de transportadores implicados en la secreción

activa de fármacos al canalículo biliar es el complejo de transportadores

dependientes de ATP, que comprende a la P-glicoproteína o MRP1, BSEP

(bile salt export pump) y MRP2 (multidrug resistance protein 2). Se ha

demostrado que MRP2 y mrp2 (su homólogo en ratas) transportan

endobióticos (ej. Bilirrubina y conjugados) y también drogas aniónicas o

conjugados de ellas como: grepafloxacin, provastatin, metrotexato e

irinotecan. También son sustratos de la proteína MRP2 metabolitos activos

como SN-38 (metabolito del irinotecan) o metabolitos conjugados como


25

acetaminofen glucurónido y grepafloxacin glucurónido (Ayrton and Morgan,

2001).

Para entender el papel de MRP2 en la eliminación de fármacos a nivel

hepatobiliar, es esencial el estudio de las mutaciones de genes MRP2

humanos y el descubrimiento de la ausencia de expresión de MRP2 en los

resultados (Tsuji et al., 1999;Toh, 1999). El síndrome de Dubin-Johnson en

humanos es una disfunción hereditaria en un gen autosomal recesivo,

caracterizada por una hiperbilirubinemia conjugada unida a una

pigmentación excesiva, que es atribuído a la ausencia de la proteína

transportadora MRP2 en la membrana canalicular.

La P-glicoproteína o SPGP:

El papel funcional de la P-glicoproteína en la membrana del canalículo biliar

fue originalmente demostrado por Kamimoto y cols. (1989) en un estudio que

demostraba que la captación ATP- dependiente de daunomicina por la

membrana del canalículo biliar era inhibida por sustratos competitivos de la

P- glicoproteína. Más tarde, otros reafirmaron esta teoría como: Milne (2000)

con fexofenadin como sustrato inhibidor; Speeg y Maldonado (1994) con

colchicina y dexorubicin en ratas; Mayer (1997) con digoxina en ratones.


26

La P-glicoproteína es uno de los mejores transportadores responsables de la

excreción biliar de fármacos bipolares catiónicos, y se expresa en la

superficie luminar de los enterocitos, en la membrana canalicular de los

hepatocitos y en la membrana apical luminal de tanto las células epitelales

ductales del páncreas como las células epiteliales renales tubulares

(Thiebaut et al., 1987). Dependiendo de su nivel de expresión, se determina

la velocidad y extensión con el que los fármacos y sus metabolitos

atraviesan la barrera hematocefálica. En consecuencia, a igualdad de

concentraciones en sangre los niveles alcanzados en el lugar de acción

podrían variar ampliamente entre individuos, con las diferencias

consiguientes en respuesta farmacológica y efectos adversos (Chils et al.,

1995).

Fármacos como fenobarbital, dexometasona, clotrimazol, reserpina y

rifampicina son sustratos que se excretan mediante esta proteína

transportadora.

Está demostrado que la rifampicina es, a su vez, un potente inductor a nivel

intestinal de la expresión de la P-glicoproteína (Greiner et al., 1999).


27

Transportador de sales biliares o BSEP:

Los ácidos biliares son sintetizados en el hígado a partir del colesterol, y

secretados en el conducto biliar por un proceso activo a través del canalículo

(Setchell et al., 1997). La disminución de la secreción de ácidos biliares está

relacionada con la disminución del transportador de sales a través del

canalículo biliar conocido como BSEP (bile salt export pump). En ausencia

de secreción apropiada de ácidos biliares, debería ocurrir la activación de

otros procesos metabólicos compensatorios (Wang et al., 2001).

Tanto en ausencia de SPGP (P-glicoproteína o MRP1) como de BSEP, el

hígado acumula grandes cantidades de compuestos en forma de ácidos

tetra-hodroxilados, productores de toxicidad en el hígado. Recientes estudios

demuestran que entonces se pondría en marcha un receptor nuclear que

regula el citocromo CYP3A, el PXR o SXR (Pregnane X receptor / esteroide

y xenobiótico receptor), disminuyendo la hepatotoxicidad mediada por ácidos

biliares (Xie et al., 2001).(Hirohashi et al., 2000). Es decir, que una pérdida

de transporte de fármacos a través del canalículo biliar mediado tanto por

SPGP como por BSEP, produce un aumento del metabolismo de dichos

fármacos mediado por CYP3A, CYP2B, y también un aumento del

transporte mediado por algunos transportadores como ABC (ATP-binding


28

casete), produciendose una disminución de la hepatotoxicidad debida al

acúmulo de los fármacos en el hígado.

Todo este proceso anterior es de vital importancia en la aplicación de ciertos

ácidos biliares para disminuir el daño colestásico producido por algunos

fármacos en el hígado de los pacientes; por ejemplo, el tratamiento con

ácido ursodexoxicólico (UDCA), el cual no activa FXR (Repa and

Mangelsdorf, 1999), que es bajo inductor de SPGP en hepatocitos primarios

humanos, sino que UDCA activa PXR induciendo a CYP3A4 en los

hepatocitos humanos. También la rifampicina es un sustrato activador de

PXR/SXR, induciendo a CYP3A4 a metabolizar ciertos ácidos biliares

productores de hepatotoxicidad como el ácido litocólico (Xie et al., 1998).

La influencia del transporte de de fármacos en el daño hepatocelular debido

a fármacos puede reducirse a tres puntos (Fig. 3):

- Un fármaco A tiene un hipotético potencial tóxico, pero su rápida

excreción minimiza su exposición a los hepatocitos impidiendo el daño

hepático.


29

- En el centro, la excreción del mismo fármaco A decrece bien por una

disminución de la expresión en el complejo de transportadores (genética o

adquirida) o bien por competición con otro fármaco B actuando al mismo

tiempo. Entonces, se produce una mayor exposición del fármaco inicial A o

sus metabolitos en los hepatocitos, lo que producirá el daño hepatocelular.

- A la derecha del gráfico, la retención de un fármaco (C) debido a una

alteración en los sistemas de transporte canalicular, puede condicionar la

inducción del CYP, y de esta forma incrementar la formación de metabolitos

tóxicos del mismo o de otro fármaco (D).

Figura 3: Papel del transporte a través del canalículo biliar en el daño hepático debido a fármacos (Kaplowitz, 2002) (Fco = Fármaco).

Fármaco A

Toxicidad

Fco A

Toxicidad

Fco B

Toxicidad

Fco D

CYP

Fco C (-)

Normal ↓ Expresión del transportador Competición por el transportador

Inducción de CYP


30

ІІ.- CRITERIOS DIAGNOSTICOS

Es necesario un diagnóstico temprano de la hepatotoxicidad para poder

prevenir la evolución de formas de enfermedad más graves o crónicas y

evitar la recurrencia.

Pero el diagnóstico es difícil en la práctica y se basa en la asunción de una

serie de dificultades junto con la exclusión de otras causas de hepatopatía.

Tabla 5: Principales dificultades en el diagnóstico de la hepatotoxicidad (Larrey, 2000)

- Hallazgos clínicos inespecíficos - Alteración hepática por la propia enfermedad tratada (infección bacteriana)

- Ingesta concomitante de múltiples fármacos hepatotóxicos (combinación de

agentes antituberculosos)

- Compuestos considerados seguros (productos de herboristería)

- Prescripción farmacológica difícil de analizar:

·automedicación

·información enmascarada (compuestos ilegales)

·información olvidada (ancianos)

- Hepatitis fulminante


31

El principal objetivo clínico es identificar los agentes responsables y facilitar

la recuperación interrumpiendo la exposición (Farrell, 1994). Para ello, debe

realizarse una minuciosa anamnesis que tenga en cuenta todos los fármacos

consumidos (prescritos y de libre dispensación), productos de herboristería

(considerados erróneamente inocuos), alimentos tóxicos (setas), o

exposición a tóxicos domésticos o industriales.

Hay fármacos como los anticonvulsivantes, antituberculosos, AINEs y

antibióticos, que son más comúnmente involucrados que otros en la

producción de toxicidad hepática (Tablas 6a y 6b).

A veces se producen manifestaciones de hipersensibilidad (fiebre,

eosinofilia…), que junto a la reaparición de la enfermedad tras la

reexposición al agente sospechoso y normalmente de una manera más

grave, nos hacen sospechar que estamos tratando una hepatotoxicidad de

tipo inmunoalérgica, o una hepatitis autoinmune. Aunque la biopsia hepática

no es usualmente diagnóstica de hepatotoxicidad, la presencia ocasional de

necrosis de predominio centrozonal (área de mayor actividad del citocromo

P-450), infiltrado de eosinófilos y granulomas, apoyan la sospecha clínica.

Además, es preciso la exclusión de otras posibles causas de enfermedad.


32

Tabla 7: Exclusión de causas alternativas en el diagnóstico de

Hepatotoxicidad (Larrey, 2000).

Una reexposición positiva, con recurrencia del daño hepático, es la evidencia

definitiva de que el medicamento causó dicho daño. Pero una reexposición

deliberada tiene implicaciones éticas.

La detección de anticuerpos específicos inducidos por el fármaco es un test

específico, pero rara vez están presentes en reacciones hepáticas por

medicamentos, y solo en casos mediados inmunológicamente. Existen otros

test “in vitro“, para casos de hepatotoxicidad por idiosincrasia metabólica,

capaces de detectar deficiencias del sistema enzimático detoxificador. Se

requieren más ensayos en este sentido.

- Enfermedad hepática biliar previa

- Abuso de alcohol

- Hepatitis virales (VHA, VHB, VHC, CMV, Herpes…)

- Obstrucción biliar

- Hepatitis / colangitis autoinmune

- Isquemia hepática

- Enfermedad de Wilson

- Infección bacteriana (Lysteria, Campylobacter, Salmonella)


33

Tabla 8: Hallazgos histológicos sugestivos de hepatotoxicidad (Danan, 1988)

ІІ.1.- ESCALAS DIAGNOSTICAS PARA EL ESTABLECIMIENTO DE LA

RELACION DE CAUSALIDAD

El factor crítico en el diagnóstico de una reacción adversa a un fármaco es el

establecimiento de una relación causal entre el fármaco sospechoso y el

hecho clínico analizado. En la práctica clínica esto suele resultar difícil

debido al carácter ambiguo de las reacciones, a la ingesta simultánea de

más de un fármaco y a la imposibilidad de realizar una causa efecto

definitiva.

- Necrosis zonal

- Necrosis desproporcionada a la severidad clínica

- Microesteatosis, particularmente si es zonal o se acompaña de necrosis

- Predominio de eosinófilos en el infiltrado inflamatorio

- Colestasis atípica: colestasis periportal temprana en el curso de la enfermedad,

- y colestasis con hepatitis

- Granulomas con hepatitis o colestasis

- Lesión destructiva de ductus biliares

- Lesión vascular inusual como enfermedad venooclusiva o peliosis hepática


34

SOSPECHAHEPATOTOXICIDAD

RELACIÓN TEMPORAL ADECUADA ENTRE LA TOMA DEL FÁRMACO Y LA APARICIÓN DE LA ENFERMEDAD

EXCLUSIÓN DE CAUSAS ALTERNATIVAS

CRITERIOS POSITIVOS•Manifestaciones de hipersensibilidad•Efecto de la retirada (“dechallenge”)•Efecto de reexposición (“rechallenge”)•Hallazgos histológicos•Escalas diagnósticas

ENFERMEDAD HEPÁTICA

Desde la primera aproximación a un método operacional para la

identificación de reacciones adversas medicamentosas (Karch y Lasagna,

1977) hasta ahora, ha habido varios métodos propuestos con diferencias de

opinión considerables. La escala del Council for International Organizations

of medical Sciences (CIOMS) (Tabla 10), surgió del consenso de un grupo

de expertos que definieron una serie de parámetros para el diagnóstico de

hepatotoxicidad (Danan and Bénichou, 1993), y se ha definido como la más

Tabla 9: Fases en la diagnosis de la enfermedad hepática


35

completa en un estudio que comparaba dicha escala con otra posterior de

María y Vitorino (Lucena et al., 2001). Esta última clasifica peor los casos de

fármacos con un periodo de latencia largo y también la expresión de

colestasis, evolución a la cronicidad, fallo fulminante y muerte.

APARTADOS PUNTUACIÓN

CRITERIOS CRONOLÓGICOS

Desde ingesta del fármaco hasta inicio del evento +2 a +1

Desde retirada del fármaco hasta inicio del evento +1 a 0

Curso de la reacción -2 a +3

FACTORES DE RIESGO

Edad +1 a 0

Alcohol +1 a 0

Embarazo +1 a 0

OTROS

Medicación concomitante -3 a 0

Exclusión de causas no farmacológicas -3 a +2

Datos bibliográficos 0 a +2

Reexposición -2 a +3

La puntuación total puede ser clasificada en 5 categorías:<=0, Excluído; 1-2, Improbable; 3-5, Posible; 6-8, Probable; >8 altamente probable.

Tabla 10: Escala diagnóstica de CIOMS


36

ІІІ.- DEFINICION Y CRITERIOS CLINICOS DE LA HEPATOTOXICIDAD

ІІІ.1.- CRITERIOS DE LABORATORIO

Basándose en criterios de laboratorio, las reacciones hepatotóxicas pueden

clasificarse en:

1) Alteración bioquímica hepática: aumento de actividad de aspartato

aminotransferasa (ALT), fosfatasas alcalinas (FA) o bilirrubina total (BT),

entre N y 2N (N = límite superior de la normalidad) o cualquier incremento

aislado incluso > 2N en AST, FA o BT

2) Lesión hepática: si ALT > 2N o bilirrubina conjugada (BC) > 2N o

incrementos en AST, FA y BT (uno de ellos al menos > 2N). La lesión

hepática se subclasifica a su vez en: a) Lesión hepatocelular: incremento

aislado de ALT > 2N o R (actividad de ALT/FA expresada en múltiplos del

límite superior de la normalidad) > o = 5; b) Lesión hepática colestásica:

incremento aislado de FA > de 2N o R < o = 2; c) Lesión hepática mixta:

ALT > 2N, incremento de FA y R > de 2 pero < 5 (Bénichou, 1990).


37

*DAÑO HEPÁTICO

Si hay aumento superior a 2N en ALT

o un aumento superior a 2N en BC

o un aumento superior a 2N en: AST, y FA y BT

*DAÑO HEPATOCELULAR

Si hay un aumento superior a 2N en ALT

o si R es mayor o igual a 5

*DAÑO HEPATICO COLESTASICO

Si hay un aumento superior a 2N en FA

o si R es menor o igual a 2

*DAÑO HEPATICO MIXTO

Si hay un aumento superior a 2N en ALT y en FA

y R es superior a 2 e inferior a 5

N = Límite superior del valor normal ; ALT = alanin-aminotransferasa o glutámico-pirúvico transaminasa (SGPT) ; AST = aspartatoaminotransferasa o glutámico-oxalacético transaminasa (SGOT) ; BC = bilirrubina conjugada ; FA = fosfatasa alcalina ; BT = bilirrubina total ; R = relación actividad sérica de ALT / actividad sérica de FA.

Tabla 11: Terminología de las reacciones adversas hepatotóxicas según las anormalidades detectadas en las pruebas de laboratorio (Bénichou, 1990)


38

Según la expresión clínico-patológica, la clasificación de la hepatotoxicidad

es la siguiente:

1) Elevación asintomática de las transaminasas hepáticas: muchos

fármacos originan alteraciones del perfil hepático sin manifestaciones

clínicas asociadas. La elevacion de las transaminasas séricas (ALT o alanino

amino transferasa y AST o aspartato amino transferasa) es indicativo de

lesión hepatocelular, pero puede ser el primer indicio de evolución hacia una

necrosis hepática grave. El incremento de γ-GT o γ-glutamiltranspetidasa se

traduce en un fenómeno de inducción enzimática microsomal sin repercusión

patológica. El incremento en FA o fosfatasa alcalina puede asociarse al de γ-

GT durante el tratamiento con algunos medicamentos inductores

enzimáticos como los anticonvulsivantes (Andrade, 2002).

2) La lesión hepatocelular por fármacos no tiene hallazgos específicos,

simulando una hepatitis viral aguda (asintomática, astenia, anorexia o

ictericia de forma inconstante). Cursa con un incremento marcado de

transaminasas, y en la biopsia existe necrosis (de predominio centrolobular),

generalmente asociada a infiltrado inflamatorio (la existencia de eosinófilos

puede indicar la etiología tóxica) (Farrell, 1994). En la mayoría de los casos

la retirada del fármaco se sigue de una rápida mejoría y una recuperación

completa entre 1-3 meses. A veces, puede evolucionar a fallo fulminante o


39

subfulminante, con una evolución muy grave y una mortalidad alrededor del

90%. El riesgo de desarrollar este cuadro es alto cuando la administración

del fármaco se mantiene una vez que ha aparecido la ictericia. El curso de la

reacción puede ser más insidioso, con el desarrollo progresivo de una

hepatitis crónica e incluso cirrosis. En la lesión hepatocelular tóxica

producida por mecanismo inmunoalérgico son frecuentes las

manifestaciones de hipersensibilidad como fiebre, eosinofilia y exantema

cutáneo.

Una disminución del mecanismo de transporte en la excreción de fármacos a

través del canalículo biliar, bien por disminución en la expresión (genética o

adquirida) o bien por competición con otro sustrato, puede producir un daño

hepatocelular, es decir, una exposición del hepatocito a la acción tóxica del

fármaco o su metabolito (Kaplowitz, 2002).

3) La lesión hepática colestásica se puede presentar de dos formas

(Zimmerman, 1999):

-Colestasis pura: caracterizada por ictericia, prurito y coluria, con

aumento de FAS, bilirrubina conjugada y gammmaglutamiltranspeptidasa,

estando las transaminasas normales o levemente aumentadas. Esta lesión


40

se observa con derivados hormonales principalmente, y la retirada de estos

agentes se sigue de una completa resolución.

-Hepatitis aguda colestásica: además de las manifestaciones de la

anterior, se asocian dolor abdominal y fiebre, simulando una obstrucción

aguda biliar. Los hallazgos de hipersensibilidad son frecuentes y el

pronóstico suele ser mejor que en el daño hepatocelular. Dicha

susceptibilidad podría relacionarse con determinado haplotipo del HLA, dado

que una asociación entre el haplotipo DRB1*1501-DRB1*0101-DRB1*0601 y

la colestasis inducida por amoxicilina-clavulánico ha sido reciéntemente

demostrada (Hautekeete et al, 1999). Este tipo de lesión se debe a la

interrupción en la secreción biliar probablemente por alteración de proteínas

transportadoras específicas de la bilis (BSEP/SPGP) en individuos

susceptibles, y en este daño están involucrados ciertos fármacos como

rifampicina, ciclosporina A, sulindac, troglitazone, etc. Pero por otra parte, ya

vimos anteriormente que la rifampizina es a su vez un sustrato inhibidor del

factor promotor PXR/SXR, lo cual hace que se active CYP3A4 y así se

metabolizarán por este otro camino los ácidos biliares acumulados

productores de colestasis.


41

4) En el daño mixto existe una mezcla de los hallazgos observados en

los dos tipos de daño, hepatocelular y colestásico, siendo frecuente la

ictericia. El pronóstico suele ser bueno y se asocia frecuentemente a

manifestaciones de hipersensibilidad. Es decir, tanto el metabolito reactivo

como el conjugado formado con glucurónido o glutation, producen toxicidad

hacia las células del conducto biliar por el que son excretados, y esto se

traduce en una toxicidad directa del metabolito hacia dichas células o en la

formación de un hapteno que producirá el desencadenamiento de una

respuesta inmune (Kaplowitz, 2002). Dependiendo de que la mayor cantidad

de células dañadas sean hepatocitos o colangiocitos, así como de su relativa

capacidad defensiva, el daño hepático mixto será más bien hepatocelular o

colestásico respectivamente.


42

Aunque el hepatocito es la célula diana habitual del efecto tóxico de los

medicamentos en el hígado, cualquier célula hepática parenquimatosa o no

puede resultar afectada aisladamente o en combinación, dando lugar a casi

cualquier síndrome hepático agudo o crónico (Fig. 4).

Hepatocito •Hepatitis aguda •Colestasis •Hepatitis crónica •Cirrosis •Esteatosis •Hepatitis granulomatosa

Célula endotelial •Enfermedad veno-oclusiva •Dilatación sinusoidal •Peliosis hepatitis •Síndrome de Budd-Chiari

Célula de Ito •Fibrosis perisinusoidal

Colangiocito •Colangitis aguda y crónica •Colangitis esclerosante HIGADO

FARMACo

Figura 4: Células involucradas en la lesión celular inducida por fármacos (Larrey, 2000)


43

ІІІ.2.- CRITERIOS HISTOLOGICOS

Atendiendo a la célula diana afectada por el efecto tóxico del fármaco, se

considera lesión hepática aguda aquella que ocurre durante menos de tres

meses (necrosis, esteatosis, colestasis). Si las anormalidades bioquímicas

hepáticas persisten durante más de tres meses la lesión se define como

crónica (colestasis crónica, fosfolipidosis…) (Andrade y Lucena, 1997).

Los agentes tóxicos en general producen degeneración o necrosis de

hepatocitos (daño citotóxico), o también detienen el flujo de la bilis (daño

colestásico). El daño citotóxico puede ser debido a necrosis, esteatosis o

ambas. Dentro del daño citotóxico podemos encontrarnos con una esteatosis

crónica, colestasis crónica, fibrosis, lesión vascular, lesión granulomatosa,

neoplasias, fosfolipidosis…)

Lesion hepática aguda

- Necrosis: Puede ser zonal (afecta al lobulillo pero conservando sus

estructura) o no zonal (destrucción difusa del lobulillo). La necrosis zonal

puede ser centrolobulillar (zona 3), característica de lesión por paracetamol,

tetracloruro de carbono, halotano; periférica (zona 1); o mediozonal (zona 2).


44

Puede existir necrosis difusa con un patrón similar a la hepatitis vírica

(metildopa), o involucrar porciones significativas del hígado (ácido valproico).

Se caracteriza por niveles altos de transaminasas, con elevaciones 8 a 500

veces el límite alto de la normalidad (Pessayre and Larrey, 1988). Se pueden

observar cuatro formas clínicas: un incremento de transaminasas sin

síntomas clínicos, hepatitis anictérica, hepatitis ictérica, y hepatitis

fulminante. La degeneración de hepatocitos precede a la necrosis,

mostrando balonización, degeneración eosinofílica y cuerpos acidófilos libres

sinusoidales.

- Esteatosis: El contenido en grasa de un hígado normal es del 0.8-1.5% y

generalmente no es visible. Los cambios en dicho porcentaje pueden ocurrir

por cuatro mecanismos: incremento de su síntesis, disminución de su

eliminación, incremento de su transporte hacia el hígado y disminución de

este último (Shah, 1999).

La grasa está depositada fuera de los orgánulos celulares, en el citoplasma

de los hepatocitos. La infiltración de grasa en forma microvesicular no

produce alteraciones hepáticas graves, y a menos que produzca una

modificación en la arquitectura celular lo suficientemente grande, no causa


45

signos de disfunción hepática. Otro caso es la acumulación de grasa en

mayores cantidades.

La esteatosis es el resultado de la deposición de lípidos en el hígado

inducida por fármacos. Existen dos tipos principales: microvesicular

(tetraciclina, valproato) o macrovesicular (etanol, metotrexato).

Generalmente no produce alteración de los tests de la función hepática

(escepto algunos fármacos como el ácido valproico), y suele ser

asintomática, siendo la aparición de astenia, fiebre, ictericia, ascitis o edema,

indicadores de daño irreversible.

- Colestasis: Ya comentada anteriormente, sus principales manifestaciones

son prurito, ictericia, coluria y acolia. Los niveles de bilirrubina están

aumentados en todos los casos de forma moderada.

Lesión crónica

- Fosfolipidosis: está causada por medicamentos con carácter lipo-

hidrofílicos que se acumulan en los lisosomas (Lullman, 1978). Una

característica común de los fármacos productores de fosfolipidosis es que

son relatívamente pequeños y moléculas anfóteras (con fuertes grupos


46

hidrofóbicos e hidrofílicos en la misma molécula). Por ejemplo, perhexilina,

amiodarona, fármacos psicoactivos, algunos agentes quimioterapéuticos,

etc. Una vez que se produce su entrada dentro de los lisosomas, serán

atrapados allí en su forma iónica, debido al medioambiente ácido del

lisosoma. La acumulación de fármacos establece contacto con fosfolípidos e

inhiben la actividad de las fosfolipasas intralisosomales.

La lesión se caracteriza por hepatocitos granulares (Sheperd et al., 1987)

repletos de lisosomas camelados. La hepatomegalia es el hallazgo

predominante.

- Lesión granulomatosa: Los granulomas hepáticos pueden estar

acompañados de daño citotóxico o colestásico como parte de una reacción

de hipersensibilidad (alopurinol, metildopa, penicilina, fenitoína, quinidina,

sulfonamidas) o sin evidencia clínica de daño hepático (sales de oro) (Isaac,

1988).


47

ІV.- IMPORTANCIA DE LAS REACCIONES ADVERSAS

HEPATOTOXICAS

Teóricamente una reacción hepatotóxica no estaba presente en el momento

de comenzar la ingesta del fármaco sospechoso y se resuelve con la retirada

del mismo. A veces, un corto periodo de reexposición al agente sospechoso

podría ser insuficiente para generar una concentración crítica de metabolitos

tóxicos, dando lugar a falsos negativos. En todo caso, la readministración

puede ocasionar un cuadro más grave que el inicial y no debe indicarse

salvo que la enfermedad para la que se indica el fármaco problema sea

potencialmente letal y no se disponga de otras alternativas terapéuticas.

Dado que multitud de nuevos fármacos son introducidos cada año en

terapéutica y los estudios previos a la comercialización son insuficientes

para configurar con exactitud el potencial de hepatotoxicidad idiosincrásica

de cada agente, son necesarias medidas educacionales dirigidas a médicos

y pacientes para minimizar la ocurrencia de reacciones hepatotoxicas, a

veces con fatales consecuencias.

Los pacientes deberían conocer que la toxicidad hepática es una

complicación potencial de muchos tratamientos farmacológicos y ser


48

instruidos, al tiempo, sobre la necesidad de suspenderlos inmediatamente

ante cualquier signo clínico relacionado. Los médicos deben desarrollar una

actitud de cautela con la prescripción de fármacos, especialmente con las

recién introducidos en el mercado, y notificar cualquier posible reacción

hepatotóxica observada a centros regionales de Farmacovigilancia, cuyo

centro coordinador se encuentra en el Instituto de Salud Carlos III. La

identificación de varios casos de hepatotoxicidad atribuída a un fármaco en

un corto espacio de tiempo puede alertar a las autoridades sanitarias,

permitiendo disponer las oportunas medidas de regulación, incluyendo, si

fuera preciso, la retirada del mercado del agente en cuestión.

El Sistema Español de Farmacovigilancia se basa en la notificación

espontánea de reacciones adversas a través de la tarjeta amarilla. Además,

la enfermedad hepática crónica, por su propio carácter determina que el

paciente sea seguido por Unidades Especializadas, por el médico de familia

u otros especialistas que intervienen en el plan terapéutico, a veces sin el

nivel de coordinación necesario con el hepatólogo (Laporte, 1994).

La reacciones adversas hepatotóxicas (RAH) constituyen una de las causas

más frecuentes de retirada de medicamentos del mercado farmacéutico en

Europa y EEUU en las últimas décadas (Bakke et al., 1995). La aparición de


49

una RAH distorsiona la relación médico-paciente, crea una imagen negativa

en ambos del producto y del laboratorio que lo comercializa, lo que puede

afectar a sus ventas a pesar de su eficacia.

Tabla 12: Tabla de retirada de fármacos del mercado por hepatotoxicidad (Bakke

et al., 1994)

Fármaco País Año Clase Terapéutica

Bendazaco España 1993 Antiinflamatorio, prevención de cataratas

Benoxaprofeno UK, US, España 1982 Antiinflamatorio

Dilevalol UK 1990 Beta-bloqueante, vasodilatador

Perhexilina UK, España 1986 Vasodilatador, antianginoso

Pirprofen España 1990 Antiinflamatorio

Suloctidil España 1985 Vasodilatador

Ticrinafen

(ácido tienílico)

US 1980 Diurético

Zimeldina UK 1983 Antidepresivo

Droxicam España 1994 Antiinflamatorio

Ebrotidina España 1998 Antagonista H2

Tolcapone UK, España 1998 Antiparkinsoniano

Troglitazona US, Japón 1998 Antidiabético oral

Trovafloxacino UK, US, España 1999 Antibiótico

Nimesulide Israel, Portugal, España

1999 AINE

Tetrabramato España, Francia 2002 Deshabituación alcohólica

Pemolina España 2002 Estimulante SNC

UK= Reino Unido; US= Estados Unidos


50

V.- MECANISMOS DE TOXICIDAD HEPATICA

Los mecanismos de daño hepático pueden dividirse en dos amplios grupos:

V.1.- TOXICIDAD INTRINSECA

Es aquella relativa a fármacos que causan necrosis hepatocelular

reproducible en casi todas las especies de mamíferos de forma

independiente de la dosis. El periodo de latencia es corto y consistente. La

mortalidad es severa en ciertos casos y el daño puede ser hepatocelular

primario o puede afectar también a otros órganos.

El mecanismo de acción es el siguiente: el compuesto, por sí mismo o por

medio de sus metabolitos activos, interactúa con componentes de la célula

originando su muerte. Estos metabolitos pueden ser radicales libres

(producen peroxidación de lípidos de membrana), moléculas electrofílicas

que se unen covalentemente con proteínas del hepatocito, u oxígeno activo

(también produce peroxidación). La hepatotoxicidad directa de estos agentes

o sus metabolitos consiste en la destrucción de la membrana celular y de las

organelas a través de la peroxidación de lípidos de membrana, que culmina


51

en la necrosis hepatocitaria (Reed, 1990). El daño es usualmente citolítico,

pero puede ser colestásico si la necrosis afecta principalmente a los ductus

biliares. El tetracloruro de carbono produce necrosis zonal 3 y esteatosis por

este mecanismo.

Las hepatotoxinas que producen daño de forma indirecta, lo hacen a través

de la distorsión de moléculas esenciales o bloqueo selectivo de vías

metabólicas esenciales para la integridad celular. El daño hepático que

producen puede ser principalmente citotóxico (necrosis, esteatosis) o

colestásico (interferencia selectiva con mecanismos hepáticos para la

excreción de sustancias a canalículos biliares) (Zimmerman, 1987).

La mayoría de la drogas con hepatotoxicidad intrínseca están retiradas del

uso clínico, aunque algunas se siguen utilizando porque son hepatotoxicas

solo a altas dosis, como el acetaminofeno o el sulfato de hierro.

El paracetamol (acetaminofeno), es un ejemplo de agente que causa una

reacción tóxica directa (Fig. 5). Se metaboliza rápidamente mediante

conjugación con glucuronato o sulfato y una pequeña proporción (5%) utiliza

la vía del CYP2E1, formando un metabolito tóxico (N- acetil – p –

benzoquinoneimina o NAPQ1), que es detoxificado mediante su unión a


52

glutation. En dosis elevadas se sobrepasa el mecanismo protector del

glutation, por lo que se produce necrosis zonal 3 (mayor localización del

CYP en la mitocondria), por unión del NAPQ1 con macromoléculas

hepatocitarias. Así, la lesión producida depende de la dosis ingerida, de la

actividad del CYP y de las reservas de glutation. Las dosis terapéuticas de

paracetamol pueden producir lesión hepática en pacientes susceptibles,

particularmente alcohólicos, como consecuencia de la inducción del CYP2E1

(Sinclair, 1998) y la disminución de glutation propia de la desnutrición que

los caracteriza. También son más susceptibles los individuos que toman

isoniazida (provoca inducción del CYP) (Moulding, 1991), por el mismo

mecanismo que la interacción acetaminofen-alcohol (Sinclair, 1998). A dosis

bajas de acetaminofeno, se produce una respuesta del sistema inmune

innato (células Kupper y NK o natural killer), el cual regula la producción de

citokinas tóxicas: TNFα e IFNγ o su inhibición como mecanismo protector

mediante IL10 (interleukina 10) y MCP-1 (monocyte chemoattractant protein-

1) (Bourdi et al., 2002).

El efecto tóxico del paracetamol puede ser neutralizado con N-acetilcisteína

(O´Grady, 1997). Recientemente se ha descrito el primer caso de lesión

idiosincrásica inducida por paracetamol y confirmada tras reexposición

(Andrade y Lucena, 1998).


53

Figura 5: Metabolismo de paracetamol y posibles mecanismos que incrementan su toxicidad

Inductores: -Alcohol, isoniazida, obesidad -Omeprazol, consumo de cigarrillos -Fenobarbital, difenilhidantoína´carbamacepina

Glucuroniltransferasa

Glucuronato Sulfato

-CYP2E1 -CYP1A2 -CYP3A4

Ácido mercaptopúrico NAPQI Aductos-proteína NECROSIS

Inhibe: depleción de glutation por Ayuno o inhibición de su síntesis: alcoholismo Resultado: > toxicidad

Inhibe: ayuno, déficit de glucuroniltransferasa ( enfermedad de Gilbert ) Resultado: deriva su metabolismo por la vía del CYP450 Vías CYP > toxicidad

ACETAMINOFENO (Paracetamol)


54

V.2.- REACCIONES IDIOSINCRATICAS

Las principales características de este tipo de reacciones es que son

impredecibles, específicas de especie, no se reproducen en animales de

laboratorio y no existe relación constante entre la dosis y la aparición o

severidad de la reacción. El periodo de latencia entre la exposición del

fármaco y la aparición de la reacción es muy variable. Se distinguen dos

tipos de mecanismos para estas reacciones:

V.2.a.- Idiosincrasia metabólica Está condicionada por un metabolismo alterado del fármaco, que puede

condicionar bien a la ausencia de metabolismo de un precursor determinado

o bien a la génesis de una mayor cantidad de metabolitos tóxicos en el

paciente frente a otros individuos. Finalmente, el daño se debe a la acción

directa del fármaco o de su metabolito tóxico sobre la diana hepatocitaria. El

resultado de este proceso es la presencia intracelular de radicales epóxido o

compuestos electrofílicos que deplecionan de glutation las células, se unen

covalentemente a proteínas, lípidos o ácidos nucleicos, o también inducen

peroxidación lipídica. (Andrade y Lucena, 2002). Un nexo final común de

estas vías de daño celular parece ser un aumento sostenido en la

concentración de Ca++. Ciertos mediadores inflamatorios liberados por las

células no parenquimatosas (TNFα y Fas ligando) pueden contribuir a la


55

lesión hepática exacerbando la necrosis o estimulando la muerte celular o

apoptosis. Una disminución en los transportadores de sales biliares conlleva

a un aumento de los ácidos biliares tóxicos, los cuales producen un aumento

de Fas en la membrana que a su vez sensibilizará a Fas L, induciendo a una

apoptosis (Kaplowitz, 2002).

En una idiosincrasia metabólica, el periodo de latencia varía de semanas a

meses, y la recurrencia tras la reexposición puede variar de días a semanas

tras la misma. Los signos de hipersensibilidad están ausentes.

Un ejemplo de este tipo de toxicidad es la producida por la isoniazida (Fig.

6). La isoniazida es un fármaco antituberculoso que es importante causa

reconocida de lesión hepática. El sexo femenino y el alcoholismo

incrementan el riesgo, así como la edad avanzada, la hipoalbuminemia y la

tuberculosis diseminada (Pande, 1996).

La isoniazida es metabolizada en N-acetilisoniazida, la cual es hidrolizada a

ácido isonicotínico y acetilhidrazina. Por último, éste es acetilado de nuevo a

diacetilhidrazina o convertido en hidracina y otro metabolito tóxico por el

citocromo P-450 (Fig. 6).


56

Estudio tempranos aducen que en personas que son rápidos acetiladores de

isoniazida existe un aumento del riesgo de producción de reacción tóxica por

la formación de acetilhidralacina, que es transformado por el citocromo P450

en un reactivo metabólico. Sin embargo, últimos estudios indican que son los

acetiladores lentos de isoniazida los que evidencian un mayor riesgo en la

producción de hepatotoxicidad, debido a que la acetilación de acetilhidracina

en el metabolito no tóxico diacetilhidracina es una vía disminuída y por tanto

el proceso alternativo con la participación del citocromo P-450 sería el más

activo (Maddrey, 1981).

Tabla 13: Diferencias entre daño hepático idiosincrásico metabólico e inmunológico

Característica Inmunoalérgica Metabólica

Edad Rara en niños, más común > 40 años

Mayor riesgo con la edad

Sexo Mucho más en mujeres Algo más en mujeres Periodo de latencia 2-10 semanas, más o menos

constante 4-24 semanas, variable

Curso tras retirada del fármaco

Pronta mejoría Mejoría lenta, deterioro ocasional

Respuesta a reexposición

Invariable, fiebre en 12-72 horas

Usual, alteración tests hepáticos tras 3-30 días

Fiebre Usual, a veces primer síntoma Ocasional Rash, artralgia, linfadenopatía

Común Raro

Eosinofilia periférica 20-70% casos < 10% casos Eosinofilia tisular Usual, tipo celular más común Común, tipo celular menor Granulomas Común Raro Autoanticuerpos A veces presentes Raro Frecuencia Menor 1/155 exposiciones Rara ; 0,1-2% expuestos Ejemplos Nitrofurantoína, metildopa,

fenilbutazona, diclofenaco Isoniacida, niacina, ketoconazol, dantroleno


57

-CONHNH2 N

Isoniazida

CONHNHCOCH3 N

Acetilisoniazida

COOH N

Acido isonicotónico Acetilhidracina

CH3CONHNH2

CH3CONHNHCONH3 CH3CO

Diacetilhidracina ¿ Intermediario reactivo ?

Enlace covalente con proteínas hepáticas

Necrosis hepática

Figura 6: Metabolismo de isoniazida.

P450


58

V.2.b- Idiosincrasia inmunoalérgica

Se debe a una respuesta inmune contra el hepatocito. El periodo de latencia

entre el consumo del fármaco y la aparición de los síntomas va de una a

cinco semanas aproximadamente, y la recurrencia tras la reexposición al

fármaco es precoz. Entre los signos clínicos de hipersensibilidad están el

rash, la eosinofilia, la fiebre, la artritis, las artralgias, la adenopatía y la

leucocitosos. La lesión hepática más frecuente es la necrosis, generalmente

centrolobulillar acompañada de un infiltrado inflamatorio que puede contener

eosinófilos y/o granulomas. La presencia de anticuerpos en suero es

frecuente (Kenna,1997;Knowles,2000).

Existen unas evidencias clínicas que nos pueden hacer sospechar que

estamos tratando con una hepatotoxicidad de tipo inmunoalérgica: a)

Hepatitis frecuentemente asociada con síntomas de hipersensibilidad como

fiebre, rash, eosinofília y granulomas ; b) La enfermedad se reproduce más

rápidamente tras la readministración que tras la primera administración del

fármaco; c) Las lesiones del hígado a menudo incluyen infliltración del

parénquima hepático; d) Son detectados en algunos casos anticuerpos

específicos contra los constituyentes celulares (Berson et al., 1992).


59

En general se postula que el fármaco es transformado mediante los

citocromos, oxidasas, peroxidasas y sintetasas en un metabolito reactivo, el

cual se une bien a la enzima que lo generó o bien a otra proteína plasmática

formando un neoantígeno que actúa como diana a la respuesta inmune (el

neoantígeno será reconocido por los linfocitos T y B, a través del receptor

específico y asociados a moléculas de clase II, induciendo una respuesta

inmune que sería la responsable de la reacción hepatotóxica idiosincrásica ).

Dicha respuesta se caracteriza por la producción de anticuerpos que

reconocen bien a la proteína nativa, a la modificada o a otras proteínas

celulares.

Existen varios puntos importantes que condicionan el desarrollo de las

reacciones adversas hepatotóxicas de tipo inmunoalérgico como a) el

equilibrio entre las vías de detoxificación y el metabolismo del fármaco; b) la

naturaleza y cantidad de neoantígeno creado; y c) la respuesta inmune

individual (Beaune, 1997).

Los avances en el conocimiento del metabolismo de fármacos como el

halotano, el ácido tienílico, la dihidralacina y los anticonvulsivantes,

productores de reacciones hepatotóxicas presumiblemente inmunoalérgicas,

han servido para mejorar la comprensión del mecanismo subyacente a las


60

mismas. La mayoría de las veces, no existe una clara distinción entre un

mecanismo metabólico y una reacción de hipersensibilidad, ya que ambos


intensidad. Un determinado defecto genético en el metabolismo de los

fármacos puede bien disminuir la inactivación o bien aumentar la producción

de metabolitos reactivos, y esto supondría un aumento de las uniones

covalentes a proteínas plasmáticas, y por lo tanto del estímulo inicial de la

inmunización (Berson, 1994). Un ejemplo de fármaco con este tipo de

mecanismo de reacción mixto es el halotano.

El halotano, CF3CHClBr, es metabolizado principalmente por enzimas

hepáticas con función oxidativa dando lugar a un metabolito reactivo,

CF3COCl. En condiciones de hipoxia, el metabolismo del halotano es por un

proceso reductivo con formación de intermediarios electrofílicos inestables.

Los metabolitos reactivos derivados de ambos procesos pueden producir

hepatotoxicidad directa por mecanismos de peroxidación lipídica (por

ejemplo, necrosis hepática) (Kenna, 1997). El proceso de bioactivación

oxidativa está mediado por el CYP2E1 y así se puede explicar porqué son

más susceptibles al desarrollo de hepatitis por halotano los pacientes

obesos, ya que la obesidad está asociada con una elevada actividad del

CYP2E1 (O´Shea et al., 1994). Por otra parte, el disulfiram es potente


61

inhibidor del proceso oxidativo del halotano por inhibir la acción del CYP2E1

(Kharasch et al., 1996) y puede ser utilizado en materia de prevención.

Siguiendo con el halotano, primeramente CYP2E1 cataliza la formación de

las proteínas microsomales CF3CO. Después, éstas tendrán que emigrar

desde su sitio de generación, el retículo endoplásmico, a la superficie de los

hepatocitos, donde un aumento considerado de ellas podría desencadenar el

estímulo inicial de la inmunización. Luego, los anticuerpos producidos por el

sistema inmune atacarán directamente las proteínas hepáticas que han sido

trifuoroacetiladas por un metabolito reactivo del halotano. Es decir, se forma

un neoantígeno que reconoce la proteína modificada con la participación del

HLA. (Farrell, 1985). El mecanismo de presentación de dichos aductos al

sistema inmune es todavía desconocido.


62

CF3CHClBr

CYP2E1 Bioactivación metabólica

CF3CO-proteína microsomal hepática modificada

Tráfico subcelular

Expresión en la superficie celular de CF3CO

Presentación antigénica Respuesta inmune

Respuesta de anticuerpos Sensibilización celular

Ataque inmune a los hepatocitos

Daño hepático mediado por sistema inmune

CF3CHClBr

Oxidativo Reductivo

CF3COCl Metabolito reactivo

Toxicidad directa

Otros metabolitos

reactivos

Enlace covalente a proteínas hepáticas

Daño hepático mediado por sistema inmune

Figura 7: Metabolismo del halotano


63

Existe otra hepatotoxicidad, como en el caso del ácido tienílico o la

dihidralacina, en la que se pueden producir autoanticuerpos que atacarán

una forma específica del citocromo P-450, transformando el fármaco en

metabolitos reactivos que se unirán al anillo proteico de dicho citocromo P-

450 (Beaune, 1997). El ácido tienílico es metabolizado por la isoenzima

CYP2C9 en ácido 5-hidroxitienílico y en un intermediario metabolito reactivo,

probablemente un sulfóxido, capaz de unirse específicamente a la enzima

que lo generó y así actuar como un inhibidor suicida contra CYP2C9.

La dihidralacina es metabolizada por el CYP1A2 en un metabolito reactivo, el

cual tiene afinidad por dicha isoenzima. Además, la dihidralacina puede ser

detoxificada por N-acetilación y ser inductora del CYP1A2, por lo que la

toxicidad depende del equilibrio de estos procesos.

En contraste con el “neoantígeno“ desarrollado a partir del metabolito

formado durante el metabolismo oxidativo del halotano, los autoanticuerpos

producidos en estos casos son una respuesta a algunas proteínas nativas

hepáticas que funcionan como autoantígenos tras liberarse del metabolito

reactivo que provocó el daño hepático (Kenna, 1997).


64

Figura 8: Activación metabólica, modificación covalente e inmunogeneidad de P450 (Robin

et al., 1997)

Dihidralazina Acido Tienílico

Metabolito reactivo

Metabolito- P450 2C

Halotano

Autoanticuerpos Anti-LKM2

Metabolito reactivo

Metabolito- P450 1A2

Autoanticuerpos Anti-LM

Metabolito reactivo

Metabolito- P450 2E1

Autoanticuerpos Anti-2E1

P450 1A2 P450 2E1 P450 2C


65

En general, la respuesta inmune puede ir dirigida al fármaco, la proteína

transportadora (determinantes autoantigénicos) o el neoantígeno creado por

la combinación de fármaco y proteína. Finalmente, el metabolito reactivo

puede inducir un transtorno de la inmunorregulación produciendo una

hepatitis autoinmune clásica con la presencia de autoanticuerpos no órgano

específicos (Pirmohamed et al., 1994) (p.e., en la hepatitis por halotano se

combina una respuesta humoral y celular), u órgano específicos, con

anticuerpos anti LKM, que reaccionan contra enzimas microsomales (p.e., el

ácido tienílico, con formación de anticuerpos antiLKM contra CYP2C9)

(Tolman, 1998).

Con determinados fármacos se han hecho muchos progresos en el

conocimiento de las reacciones bioquímicas que originan las dianas de la

respuesta inmune, así como en la determinación de las especificidades de

los anticuerpos generados. Sin embargo, se conoce poco a cerca del

mecanismo de la reacción inmune, y tampoco se conoce si los anticuerpos

generados en estas reacciones son la causa del daño hepático o si existen

mecanismos de inmunidad celular implicados.


66

Daño hepático Enlace covalente u otra alteración de proteína hepática

Autoantígeno Neoantígeno

Ej: halotano Ej. Acido tienílico

Fármaco Metabolito reactivo Conjugado

Sistema inmune

Figura 9: Mecanismos de activación del sistema inmune mediante fármacos productores de hepatotoxicidad

CAPÍTULO II - INTRODUCCIÓN

67

VΙ.- LA RESPUESTA INMUNE

El sistema inmune define la capacidad de defensa del organismo frente a

agentes patógenos extraños a él, es decir, frente a la infección. Existe una

inmunidad innata o inespecífica que constituye una primera línea de

defensa contra numerosos microorganismos comunes, y por lo tanto,

producen una acción inmediata y urgente mediante receptores de superficie

invariantes que reconocen características comunes de dichos gérmenes

patógenos. Las células del organismo que actúan en la inmunidad innata

son principalmente las células polimorfonucleares (neutrófilos y macrófagos),

los cuales poseen vacuolas digestivas que engloban al microorganismo

mediante el fenómeno de la fagocitosis. Pero existen también otras células

que actúan de primera barrera en el organismo como eosinófilos, basófilos y

células natural killer.

La inmunidad específica o adaptativa se fundamenta en la selección

clonal de un repertorio de linfocitos, que posee receptores de superficie para

antígenos que son muy diversos y específicos, los cuales capacitan al

sistema inmunitario para reconocer cualquier antígeno extraño, y en caso de

reinfección se produce una respuesta más rápida y eficaz. La inmunidad


68

adaptativa está mediada por los linfocitos, que a su vez se diferencian en

linfocitos B y linfocitos T, los cuales poseen similitud estructural pero distinta

función efectora antígeno-específica (Paul, 1998).

Cuando un linfocito recirculante encuentra un antígeno extraño del que su

receptor es específico en los tejidos linfoides, experimenta un proceso de

activación y proliferación, y la progenie de células resultante se diferencia

entonces a células efectoras que pueden eliminar un agente infeccioso

específico (Janeway, 2000).

Las células efectoras poseen una vida limitada y, una vez eliminado el

antígeno, experimentan muerte celular programada o apoptosis. Sin

embargo, algunas persisten tras la eliminación del antígeno, previendo al

organismo de una memoria inmunológica que le garantiza una respuesta

más rápida y efectiva en un segundo encuentro con el germen patógeno.

La inmunidad específica se divide en humoral y celular. La inmunidad

humoral es mediada por los linfocitos B, los cuales producen anticuerpos

específicos contra el agente patógeno con la colaboración de los linfocitos T

CD4+. En la inmunidad celular se actúa por contacto entre células y son los

linfocitos T CD8+ las células que reconocen a los antígenos extraños.


69

Los linfocitos T poseen receptores que reconocen fragmentos peptídicos de

gérmenes patógenos intracelulares que han sido transportados a la

superficie celular por las glucoproteínas del complejo principal de

histocompatibilidad (MHC). Existen dos tipos de células T: las células T

citotóxicas (TCD8+) o Tc que aniquilan células diana infectadas, y las

células T helper (TCD4+) o T H1 y T H2 que activan principalmente

macrófagos y células B. Las células T H1 tienden a activar a los macrófagos,

a la expansión clonal de las células T, y a la activación de Tc y células NK.

Las células T H2 tienden a aumentar al producción de eosinófilos y de

mastocitos, así como favorecer la producción de anticuerpos, incluída la Ig

E. Esta inmunidad es llamada inmunidad celular y vemos que los linfocitos

T son indispensables en la inmunidad adaptativa, tanto para las respuestas

humorales como para las celulares (Paul, 1998).

VΙ.1.- ESTRUCTURA DEL RECEPTOR DE LINFOCITOS T (TCR) Y LOS

GENES QUE LO CODIFICAN

Cada receptor está formado por dos cadenas polipeptídicas distintas

denominadas cadenas α y β, unidas entre sí por puentes disulfuro. Estos

heterodímeros α:β son los responsables del reconocimiento antigénico de


70

linfocitos T. Existe una forma alternativa de receptor T formado por

diferentes cadenas polipeptídicas denominadas γ y δ .

Los receptores de células T son estructuralmente parecidos a lo receptores

de células B, pero se diferencian en que el receptor T es monovalente

(tiene un solo sitio de unión al antígeno) mientras la inmunoglobulina es

bivalente, y en que el receptor T nunca se secreta mientras que las

inmunoglobulinas se secretan tras activación de las células B (Garbozi et

al., 1996).

Figura 10: Estructura del receptor de células T

Figura 11: similitud estructural de ambos receptores : B y T


71

Los genes del receptor se organizan en diferentes segmentos genéticos. Los

segmentos génicos (V, J, D y C), se producen por sucesivos

reordenamientos de ADN que juntan los ADN que codifican las regiones V

(variable) y C (constante) del receptor. Los segmentos génicos J están

separados de los genes de la región C por ADN no codificante, y se unen a

ellos por procesamiento del ARN después de la transcripción, y no por

recombinación de ADN (Lansford et al., 1995).

Figura 12: Organización de los genes de las cadenas α y β del receptor T de ratón


72

Los genes de la cadena α del receptor T poseen muchos más segmentos J

que las cadenas ligeras de las inmunoglobulinas, y ello será de vital

importancia en el reconocimiento del antígeno por el receptor T. En

contraste, las funciones efectoras de las células T dependen de contactos

entre células como veremos más adelante, y no están mediadas

directamente por el receptor como en el caso de las células B, de manera

que los genes de la región constante del receptor T (que tienen la función

efectora) son mucho más simples que los de los anticuerpos.

La recombinación VDJ se produce entre segmentos génicos localizados en

el mismo cromosoma (Nadel et L., 1998) y es la responsable de la diversidad

estructural de los receptores, y por tanto, de la especificidad de éstos.

Cuando los dominios V (variables) de las dos cadenas se emparejan, las

regiones hipervariables de cada dominio se unen creando un solo sitio

hipervariable en el extremo que forma el sitio de unión al antígeno. Hay tres

regiones hipervariables que determinan la especificidad del receptor hacia el

antígeno y forman una superficie complementaria a él, llamadas regiones

determinantes de complementariedad o CDR (CDR1, CDR2 y CDR3)

(García et al., 1998).


73

La diversidad estructural de los receptores T se debe enteramente a la

diversidad combinatorial y de unión generada durante el proceso de

reordenamiento génico mediante un complejo de enzimas formados por

los genes RAG1 y RAG2 (genes de activación de la recombinación),

mientras en el caso de las inmunoglobulinas existe además otra diversidad

debida al fenómeno de hipermutación somática (mutaciones puntuales en

los genes reordenados de las regiones V) tras la estimulación de la célula B

por el antígeno, con lo cual la variabilidad de las regiones CDR1 y CDR2 en

las células T se limita a la de los segmentos génicos V en línea germinal

(Zheng et al., 1994). La explicación a esto puede ser que la ausencia de

hipermutación somática en las células T quizás ayude a asegurar que

durante el curso de una respuesta inmunitaria no aparezcan mutantes

somáticos que reconozcan proteínas propias e incluso reaccionen con

ellas, ya que las células T que reconocen antígenos propios son

rigurosamente purgadas durante el desarrollo. Esto es importante puesto

que las células T estimulan las respuestas inmunitarias humoral y celular, y

ya que las células B suelen requerir la cooperación de células T para

secretar anticuerpos, una célula B cuyo receptor experimenta mutación para

volverse reactivo a lo propio no podría producir anticuerpos por falta de

células T reactivas a lo propio que le proporcionasen cooperación.

También, el hecho de que los receptores T deben ser capaces de reconocer


74

moléculas de MHC propio como parte de su ligando, la mutación somática

podría dar lugar a la pérdida de reconocimiento y como consecuencia, a la

pérdida de respuesta. Por último, decir que la hipermutación somática es

una especialidad adaptativa solo de las células B, ya que éstas deben

producir anticuerpos de muy elevada afinidad para poder capturar toxinas

de los fluidos extracelulares.

VΙ.2.- UNION DEL RECEPTOR T AL ANTIGENO Y AL MHC

Los receptores T se unen diagonalmente a través de la hendidura de unión

al péptido, con sus dos asas CDR3 estableciendo contacto con los residuos

centrales del péptido. En particular, la interfase entre las asas CDR3 de Vα

y Vβ crea una oquedad profunda a la que se une una cadena lateral del

péptido (Ding et al., 1998).

El receptor T no se sitúa simétricamente sobre la molécula de MHC sino

que mientras las asas CDR1 y CDR2 de Vα se hallan en estrecho contacto

con el complejo péptido -MHC en extremo amino-terminal del péptido

unido, las asas CDR1 y CDR2 de la cadena β , que interaccionan con el

extremo carboxilo , parecen contribuir en mucho menor medida a la unión.


75

Parece ser que las asas CDR2 de receptor T establecen contacto solo con

la molécula de MHC y no con el péptido.

La forma de unión del complejo MHC- péptido con el receptor T varía

dependiendo de la diferente secuencia de aminoácidos para péptidos con

la misma longitud de unión, y también cuando se producen cambios en la

conformación de la misma molécula de MHC al unirse a diferentes

péptidos.

Figura 13: Unión del receptor T al complejo MHC-péptido. Contorno del sitio de unión al antígeno del receptor T (línea negra gruesa) superpuesto sobre la superficie superior del complejo MHC-péptido (el péptido se representa en gris oscuro). El receptor se sitúa cruzado en diagonal al complejo MHC-péptido, con las asas CDR3 de las cadenas α y β (amarillo y verde respectivamente) en contacto con el centro del péptido. Las cadenas α de las asas CDR1 y CDR2 (violeta claro y oscuro respectivamente) se hallan en contacto con las hélices del MHC en el extremo amino, mientras que las cadenas β de las asas CDR1 y CDR2 (azul claro y oscuro respectivamente) establecen contacto con el extremo carboxilo de las hélices del MHC (Janeway, 20000. Cortesía de I. A. Wilson)


76

VΙ.3.- LAS MOLECULAS CORRECEPTORAS CD4 Y CD8

Las células T se dividen en dos tipos principales que difieren en la clase de

molécula de MHC que reconocen cuando éste les presenta el péptido

antigénico en la superficie celular, y son: T CD4 y T CD8. Las células T

CD4 reconocen complejos MHC de clase II: péptido, y están especializadas

en activar otras células inmunitarias efectoras, como por ejemplo células B

o macrófagos, para que actúen contra los antígenos que han capturado.

Las células T CD8 reconocen complejos de MHC de clase I - péptido, y se

activan para destruir células que exhiben péptidos extraños derivados de

agentes patógenos citosólicos. CD4 y CD8 se denominan correceptores

porque durante el reconocimiento del antígeno, se asocian en la superficie

de la célula T con componentes del receptor T (Zamoyska, 1998).

El correceptor CD4 constituye una sola cadena polipeptídica compuesta por

cuatro dominios de inmunoglobulina. Los dos primeros (D1 y D2) se hallan

rígidamente unidos, luego hay una unión bisagra flexible entre los dos que

enlaza con el tercer y cuarto dominios, que están a su vez también unidos

entre sí. El CD4 se une a las moléculas de MHC clase II a través de una

región que se localiza en una cara lateral del primer dominio (D 1) y en

residuos del segundo. Se une a un sitio en el dominio β2 de la molécula de


77

clase II que está alejado del sitio de unión del receptor T y la unión es débil.

Pero el CD4 puede formar homodímeros a través de un sitio en el dominio

D4, y así es capaz de entrecruzar dos moléculas de clase II y por tanto,

también dos receptores T unidos a ellas, con lo cual resulta un aumento de

la sensibilidad de una célula T al antígeno presentado por moléculas de

clase II, haciendo disminuir en 100 veces la dosis necesaria para la

activación (Wu et al., 1997) (Figura 17).

El correceptor CD8 es un heterodímero formado por una cadena α y una

cadena β unidas por un puente disulfuro. Cada cadena contiene un solo

dominio de inmunoglobulina unido a la membrana por un segmento

extendido de cadena polipeptídica abundantemente glucosilado para

impedir su digestión por proteasas. Las cadenas CD8α también pueden

formar homodímeros, aunque no cuando las cadenas β están presentes.

El CD8 se une débilmente a un sitio en el dominio α3 de las moléculas

MHC de clase I, y además la cadena α interacciona con residuos en la

base del dominio α2 de la molécula de clase I, dejando la superficie superior

de la molécula de clase I expuesta y libre para interaccionar con un receptor

T. El CD8 también se une a la cinasa Lck a través del dominio citoplasmático

de la cadena α, por lo que la unión simultánea del receptor T y el CD8 al

mismo complejo MHC- péptido lleva a la cinasa Lck a las proximidades del


78

receptor, y ello aumenta la sensibilidad de las células T por el antígeno en

unas 100 veces (Gao et al., 1997).

La población más temprana de timocitos no expresa todavía los

correceptores CD4 y CD8, ni tampoco las moléculas del complejo del

Figura 14: Esquema de las estructuras de las moléculas correceptoras CD4 y CD8


79

receptor de las células T (CD3), y se denominan timocitos doble negativos.

La maduración de las células T α:β se produce a través de estadíos donde

ambos, CD4 y CD8, son expresados por la misma célula junto con el

receptor pre-T y posteriormente con niveles bajos del receptor T. Estas

células son conocidas como timocitos doble positivos. La mayoría de los

timocitos mueren en el timo después de convertirse en células pequeñas

doble positivas. Aquellas cuyos receptores se unen a moléculas de MHC

propio pierden la expresión de uno de los dos, CD4 y CD8 y aumentan el

nivel de expresión del receptor T. El resultado son los timocitos positivos

sencillos, que después de su maduración son exportados fuera del timo

como células T maduras positivas simples (Petrie et al., 1990).

Los genes de la cadena α del receptor de células T son sometidos a

reordenamientos sucesivos hasta alcanzar la selección positiva o la muerte

celular. El rescate de timocitos doble positivos de su muerte celular

programada y su posterior maduración a células CD4 y CD8 positivas

sencillas se denomina selección positiva. Las células doble positivas

también son sometidas a selección negativa: las células cuyos receptores

reconocen complejos péptido propio:MHC propio, mueren por apoptosis. La

selección positiva asegura que todas las células T maduras implicadas en la

respuesta inmune adaptativa tengan receptores funcionales capaces de


80

responder a péptidos presentados por moléculas de MHC propio en las

células presentadoras de antígeno, selecciona el correceptor apropiado, y

determina el compromiso funcional para la clase de molécula de MHC

reconocida. La selección negativa eliminará como ya hemos dicho las

células autorreactivas. Así se asegura la tolerancia a lo propio (Surh and

Sprent, 1994).

VΙ.4.- EFECTOS DE LA UNION DEL ANTIGENO AL RECEPTOR EN LA

SUPERFICIE CELULAR

Los receptores de la superficie celular son proteínas transmembrana que al

unirse a su ligando específico experimentan un cambio conformacional, que

en algunos casos abre un canal de iones en la célula que actúa como señal

intracelular, y en otros casos afecta a la porción citoplasmática del receptor y

de este modo le permite asociarse con proteínas y enzimas de señalización

intracelular y activarlas (Monks et al., 1997).

Al unirse el antígeno a los receptores específicos, éstos se agrupan sobre la

superficie celular, lo cual conduce a la activación de proteínas tirosincinasas

asociadas a receptores en la cara citoplasmática de la membrana plasmática

(Klemn et al., 1998). Éstas , a su vez, inician la señalización intracelular


81

fosforilando residuos de tirosina en las colas de los receptores agrupados, y

las tirosinas fosforiladas actúan como sitios de unión para enzimas cinasas

(como la familia Src) y otras moléculas de señalización con dominios SH2,

que amplifican la señal y la transmiten (Reth, 1989) .

La señalización desde el complejo del receptor de las células T depende de

la presencia de una secuencia de aminoácidos llamada motivos de

activación del inmunoreceptor basados en tirosina (ITAM), los cuales estan

presentes en las cadenas accesorias implicadas en la señalización desde el

receptor de células T (las cuatro cadenas CD3) (Cantrell, 1996). Los ITAM

se componen de dos residuos de tirosina separados por unos trece

aminoácidos; cuando el antígeno se une, los receptores se agrupan como ya

hemos dicho antes y las tirosinas de los ITAM se fosforilan por las

tirosincinasas asociadas al receptor (de la familia Scr-Fyn, Blk, y Lyn) (Bolen

and Brugge, 1997).

En resumen, diremos que los receptores de los linfocitos son complejos

multiproteicos formados por cadenas variables de unión a antígeno y por

cadenas invariables que transmiten la señal de que el antígeno se ha unido.


82

Las colas citoplasmáticas de las cadenas invariables contienen motivos de

aminoácidos llamados ITAM, cada uno posee dos residuos de tirosina, que

son marcados por proteínas tirosincinasas de la familia Scr asociadas al

receptor cuando se agregan los receptores. El receptor de células B se

asocia con cuatro de tales ITAM, mientras que el receptor de células T se

Figura 15: Receptor de células T


83

asocia con diez, el número más grande que permite al receptor de células T

una mayor flexibilidad en la señalización.

Una vez que se ha producido la cascada de señales por medio de las

enzimas fosforiladas, se producirá la activación de los factores de

transcripción (NFκB, NFAT, AP-1 y Junos) que actuarán en los cromosomas

de las células T, iniciándose una nueva transcripción génica que termina en

la diferenciación, proliferación y acciones efectoras de las células T (Jacinto,

1998).

VΙ.5.- CITOKINAS

Las citokinas son una serie de factores solubles no antígeno específico, que

se sintetizan fundamentalmente por los linfocitos, en respuesta a estímulos

antigénicos o inflamatorios, actuando por medio de su unión a receptores

específicos de la misma célula que las produce (acción autocrina), de células

cercanas (acción paracrina) o de células distantes (acción endocrina) (Gehr

et al. 1992).


84

Estas moléculas incluyen a las interleukinas (IL), linfokinas, interferones y

monokinas (Prieto et al., 1997). Sus funciones son variadas pudiendo actuar

como:

- Mediadores de la inmunidad natural (incluye a la IL1, IL6, factores de

necrosis tumoral o TNFα e interferones tipo I antivirales, que provienen

fundamentalmente de los fagotitos mononucleares).

- Regulando la activación, proliferación y diferenciación de los linfocitos T

y B (incluye a la IL2, IL4, el factor transformador del crecimiento-β o TGF-β,

secretados por los linfocitos T CD4+).

- Como mediadores del proceso inflamatorio (interferon γ, IL10, IL5 e IL2,

producidos por los linfocitos T CD4+ y CD8+).

- Como estimuladores de colonias .

IFγ, IL-2, TNFβ

TH

IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-13


85

VΙ.6.- EL COMPLEJO MAYOR DE HISTOCOMPATIBILIDAD

Las moléculas HLA constituyen un elemento clave en el desarrollo de la

respuesta inmune específica. Las siglas derivan de “human leucocyte

antigen“, y son glucoproteínas presentes en la superficie de membrana

codificadas por un complejo de diferentes genes localizados en el brazo

corto del cromosoma 6 (Klein J, 1986) y que abarcan una amplia región que

recibe el nombre de “Complejo Mayor de Histocompatibilidad (MHC)”. Este

complejo tiene una dimensión de 3500Kb.

En el MHC humano se diferencian tres regiones llamadas de clase I, clase II

y clase III. La región de clase I es la más telomérica, abarca 1900 Kb y

codifica para los antígenos clásicos HLA A, B y C, y para los no clásicos HLA

E, F y G. La región de clase II se localiza en la porción más centromérica

del complejo, abarca 900 Kb y codifica para las moléculas HLA –D (DR, DP,

DQ DM ), para las proteínas transportadoras de péptidos TAP1 y TAP2 , así

como para los proteosomas LMP (LMP2 y LMP7) (Bodmer JG, 1992;

Bodmer JG, 1991). La región de clase III tiene su ubicación entre las dos

anteriores, tiene unas dimensiones de 1000 Kb y hasta la fecha se han

identificado en ella 36 genes diferentes que codifican para diferentes

elementos, entre ellos los componentes C2 y C4 (C4A y C4B) y el factor Bf


86

del complemento, los genes A y B del TNF, y genes de las proteínas HSP70

(Milner CM and Campbell RD, 1990).

El conjunto de genes HLA de clase I y clase II se caracterizan por tres

importantes propiedades:

- El polimorfismo, es decir, la existencia de un gran número de alelos

para cada uno de estos genes.

- La codominancia o expresión de los dos alelos de un mismo gen.

- Ligamiento de los genes en el brazo pequeño del cromosoma 6.

VΙ.6.a.- Las moléculas de clase I

Estructura:

Las moléculas de clase I son heterodímeros glucoproteicos de la membrana

plasmática de todas las células nucleadas del organismo (Manns MP and

Krüger M, 1994). Están constituídas por dos cadenas, una pesada o α (44

kD) asociada no covalentemente a una cadena ligera o β (12kD) codificada

fuera del MHC, en concreto en el cromosoma 15.


87

La cadena pesada α presenta una porción extracelular, otra transmembrana

y una última intracitoplasmática. La porción extracelular tiene tres dominios

(α1, α2 y α3) constituídos por 90 aminoácidos cada uno, siendo los dos

Figura 16: Estructura de una molécula de MHC de clase I


88

primeros los de mayor polimorfismo. La región tramsmembrana posee 25

aminoácidos apolares y la intracitoplasmática otros 30 aminoácidos.

La cadena ligera β, llamada β2-microglobulina, está constituída por 99

aminoácidos y un solo dominio. No presenta polimorfismo alguno. Su

localización es extracelular, íntimamente asociada a la cadena pesada.

La molécula de clase I presenta una conformación caracterizada por la

existencia de un surco en su extremo aminoterminal, formado por

interacción espacial entre los dominios α1 y α2. Este surco es de vital

importancia, ya que va a albergar a los fragmentos de antígenos proteicos

procesados, y es de esta manera como el sistema inmune específico

reconoce a los antígenos (Janeway, 2000).

Organización genética:

La región de clase I contiene tres loci clásicos, HLA A, B y C, cada uno de

los cuales codifica para una cadena alfa diferente de las moléculas de clase

I.

Todos los genes presentan una organización similar. Comprenden 8 exones

separados por sus correspondientes intrones. El primer exón codifica para el


89

péptido líder; y el segundo, tercero y cuarto, para los dominios α1, α2, y α3 de

la cadena pesada. La región transmembrana es codificada por el quinto exón

y la región intracitoplasmática por los exones 6, 7 y 8 (Janeway, 2000).

El gen de la β2-microglobulina contiene cuatro exones, el primero codifica

para el péptido líder y los tres siguientes codifican para la molécula completa

(Janeway, 2000).

Polimorfismo de la cadena alfa:

Todas las moléculas clásicas HLA de clase I (HLA A, B y C), presentan un

alto grado de polimorfismo en cada uno de los tres loci, entendiendo por

polimorfismo las distintas variaciones en secuencia que puede presentar un

gen dentro de la población. Este polimorfismo obedece a cambios de la

secuencia en los exones 2 y 3, lo que se va a traducir en variaciones en la

secuencia de aminoácidos en los dominios α1 y α2 de la cadena pesada

(Marsh SG, 1998)


90

VΙ.6.b.- Las moléculas de clase II

Estructura:

Figura 17: Estructura de una molécula de MHC clase II


91

Básicamente, su estructura recuerda a las moléculas de clase I. Son también

glucoproteínas de membrana heterodiméricas, que resultan de la asociación

no covalente de dos cadenas llamadas alfa y beta, codificadas ambas dentro

de la región de HLA D. Las dos cadenas presentan la porción extracelular,

transmembrana e intracitoplasmática. En ambos casos la porción

extracelular está constituída por dos dominios llamados α1- α2 y β1- β2. En la

parte transmembrana existen unos 40 aminoácidos apolares y la región

intracitoplasmática posee los aminoácidos apolares típicos. Desde el punto

de vista cristalográfico y tridimensional, la asociación de las dos cadenas

forma también un surco en el extremo aminoterminal de la molécula de clase

II, de configuración más abierta que la anterior pero con la misma función, la

de albergar pequeños péptidos antigénicos (Brown et al., 1993). El surco se

forma entre los dominios α1 y β1

Organización genética:

Es mucho más compleja que la de clase I, ya que cada uno de los tres loci

(DR, DP y DQ) contiene dos genes, A y B, que codifican para las cadenas

alfa y beta respectivamente. Además, la subregión DR puede contener

genes adicionales responsables de la subdivisión de los genes DR en cuatro

grupos: DR1, DR8, DR52 y DR53 (Herberg et al., 1998).


92

Los genes A y B de los tres loci presentan una estructura similar. Los genes

A poseen exones que codifican para el péptido líder, dominio α1, dominio α2,

región transmembrana y `porción intracitoplasmática. Los genes B poseen

seis exones, a excepción de DQB que contiene cinco (Janeway, 2000).

Polimorfismo de las moléculas de clase II:

A diferencia de las moléculas de clase I, las de clase II presentan

polimorfismo en sus dos cadenas, la α y la β. De las dos cadenas, la más

polimórfica para los tres loci es la β, y dentro de ésta, la región β1 de la

molécula, codificada por el exon II.

VΙ.6.c.- Función de las moléculas de clase I y II

El descubrimiento de los antígenos HLA se debió a los estudios realizados

en rechazos de transplantes de órganos, sin embargo, ha sido más

recientemente cuando se ha logrado dilucidar su papel en la fisiologia normal

del sistema inmune.

Los linfocitos T no van a identificar al antígeno a través de su receptor

específico en su forma nativa, sino procesado en pequeños fragmentos

peptídicos de un tamaño de 8 a 24 aminoácidos y asociados a las moléculas


93

de clase I y clase II (Monaco JJ, 1992; Elliot T et al., 1990). Las células T

CD8+ reconocen al antígeno presentado por las moléculas de clase I,

mientras que las T CD4+ lo hacen asociadas a las moléculas de clase II. A

este proceso se le conoce con el nombre de restricción por el MHC

(Zinkernagel and Doherty, 1974 ).

La estructura cristalográfica de complejos péptido:MHC ha ayudado a

demostrar cómo un solo sitio de unión puede unir péptidos con alta afinidad

y a la vez conservar la capacidad de unir una gran variedad de péptidos

distintos.

Las moléculas de MHC une ligandos que son péptidos como parte integral

de la estructura molecular del MHC, y no son estables cuando no tienen

péptidos unidos. Las moléculas de MHC son altamente polimórficas en

ciertos sitios del surco de unión al péptido, y las interacciones entre las

cadenas laterales de los aminoácidos polimórficos y el péptido conllevan que

diferentes variantes alélicas de las moléculas de MHC puedan unir de forma

preferente diversos péptidos. Se ha demostrado que los péptidos que se

unen a una variante alélica determinada de MHC tienen los mismos (o muy

parecidos) residuos aminoácidos en dos o tres posiciones específicas de la

secuencia peptídica, llamados residuos de anclaje.


94

Los residuos de anclaje que se unen a una molécula particular de MHC no

tienen que ser idénticos, pero siempre se hallan relacionados. La mayoría de

los péptidos que se unen a moléculas de MHC de clase I tienen un residuo

de anclaje en el extremo carboxilo que es generálmente hidrofóbico, o en

algunos casos, básico.

Los péptidos que se unen a las moléculas de MHC de clase I tienen de 8 a

10 aminoácidos (Bouvier and Wiley, 1994). Un grupo de residuos de tirosina,

común a todas las moléculas de MHC de clase I, forma puentes de

hidrógeno con el extremo amino del péptido unido, mientras que un segundo

grupo de residuos forma puentes de hidrógeno e interacciones iónicas con el

esqueleto peptídico en el extremo carboxilo y con el propio extremo

carboxilo.

Los péptidos que se unen a moléculas de MHC de clase II presentan de 13

aminoácidos en adelante, y los extremos del péptido no están unidos

(Rudensky et al., 1991). El péptido adopta una conformación que se extiende

a lo largo del surco de unión de la molécula de clase II, y se mantiene en

éste mediante las cadenas laterales que sobresalen hacia cavidades

superficiales o profundas recubiertas por residuos variables de las moléculas

de clase II y por interacciones entre el esqueleto peptídico y las cadenas


95

laterales de residuos conservados de clase II que recubren todas las

hendiduras de unión de todas las moléculas de clase II. Las cavidades de

unión de las moléculas de MHC de clase II son más permisivas a la unión de

los aminoácidos, haciendo más difícil definir residuos de anclaje y predecir

qué péptidos serán capaces de unir determinadas moléculas de MHC de

clase II.

Las moléculas del MHC son glucoproteínas de membrana, por lo que su

síntesis tiene lugar en los ribosomas adosados a las membranas del retículo

endoplasmático rugoso y siguen la ruta exocítica de la célula, es decir, son

transportados al aparato de Golgi, donde sufren glucosilaciones y de allí se

desprenden en vacuolas que serán exocitadas al medio formando parte de la

membrana plasmática. Es simultáneamente en este tránsito cuando tiene

lugar el procesamiento y carga del antígeno en el surco que forma la

estructura de las moléculas de clase I y clase II.

VΙ.6.-d.- Procesamiento del antígeno y ensamblaje a las moléculas de

clase II

Después de la síntesis y asociación de las cadenas α y β en el retículo

endoplasmático rugoso (RER), el heterodímero se asocia rápidamente con


96

un tercer polipéptido llamado cadena invariante (li o CD74) (Brachet et al.,

1997). La cadena li tiene la función de evitar una carga prematura del

antígeno en la molécula de clase II.

Durante el transporte de las moléculas de clase II a la membrana plasmática

se produce su empaquetamiento en vesículas secretoras dentro del aparato

Golgi. Estas vesículas, en el tránsito a la membrana, se van a fusionar con

vacuolas digestivas (fusión de endosoma y lisosoma) formadas tras los

procesos de fagocitosis y picnocitosis, y que son los contenedores de

antígenos exógenos. La bajada de pH del endosoma provoca la liberación

de la cadena invariante y hace posible que las moléculas de clase II puedan

puedan captar los péptidos derivados de la digestión intracelular de los

antígenos exógenos. Finalmente, se produce la expresión de las moléculas

del MHC de clase II con el antígeno en la superficie celular, por fusión de las

vacuolas con la membrana plasmática, donde serán reconocidos por los

linfocitos T CD4+ (Chapman, 1998).

De esa manera, las moléculas de clase II unen péptidos de proteínas que se

degradan en vesículas endocíticas, y por tanto, capturan péptidos de

agentes patógenos que penetran en el sistema vesicular de macrófagos o


97

péptidos antigénicos específicos internalizados por los receptores de las

células de B (Sette A et al., 1987).

VΙ.6.e.- Procesamiento del antígeno y asociación a las moléculas de

clase I

La síntesis de la cadena pesada α y de la β2m, así como su ensamblaje

para formar una molécula de clase I, tiene lugar en el RER. Es en este

compartimento donde se une también al péptido antigénico (Pamer and

Cresswell, 1998).

En este caso los antígenos no son degradados en endosomas, sino en una

estructura proteica citoplasmática llamada proteosoma (Bai A and Foreman

J, 1997). El proteosoma consiste en un complejo multimérico de 16 a 20

proteínas de bajo peso molecular con actividad proteolítica amplia. La

estructura del complejo es cilíndrica, formada por la asociación de 4 anillos

proteicos (Djaballah et al., 1993), cada uno de los cuales posee seis o siete

subunidades. Algunas de las subunidades son codificadas por genes de

clase II, en concreto LMP2 y LMP7, cerca de los genes TAP1 y TAP2

(Herberg JA et al., 1998). Estos genes son inducidos por inteferón (gamma-

INF).


98

Las moléculas de clase I unen péptidos de proteínas degradadas en el

citoplasma de la célula y también péptidos derivados de proteínas de

membrana y secretadas, por ejemplo las proteínas de las envolturas víricas.

Degradados los antígenos, sus fragmentos deben pasar desde el citoplasma

al RER para ser cargados en las moléculas HLA de clase I (Towswnd A et

al., 1989).

VΙ.7.- POLIMORFISMO Y POLIGENIA

Dos propiedades del MHC hacen difícil que los agentes patógenos escapen

a las respuestas inmunitarias. Primero, el MHC es poligénico: existen

diversos genes de MHC de clase I y II que codifican proteínas con diferentes

espectros de especificidad de unión. En segundo lugar, el MHC es altamente

polimórfico: existen múltiples alelos para cada gen. Los genes variantes

individuales de un solo locus genético se denominan alelos. Existen más de

200 alelos en algunos loci de MHC, y cada alelo presenta una frecuencia

relativamente elevada en la población. Por ello, la posibilidad de que el locus

de MHC correspondiente en ambos cromosomas de un individuo codifique el

mismo alelo es reducida. La mayoría de los individuos son heterocigóticos

para dichos loci. Ambos alelos se expresan en la célula, por lo cual se dice


99

que la expresión es codominante (se expresan alelos de ambos haplotipos

de MHC, de cada progenitor, en cada indivíduo).

Sin embargo, con independencia de lo polimórficos que sean los genes,

ningún individuo puede expresar más de dos alelos de un gen dado. La

duplicación de los genes de MHC, que conduce a la poligenia, supera esta

limitación (Marsh, 1998).

Los péptidos se unen a moléculas de MHC por medio de anclajes

específicos, y las cadenas laterales de dichos residuos anclan el péptido por

unión a oquededes que cubren la hendidura de unión al péptido. El

polimorfismo en las moléculas de clase-I afecta a los aminoácidos que

cubren estas oquedades, y por tanto, a su especificidad de unión. En

consecuencia, los motivos de secuencia o residuos de anclaje de los

péptidos que se unen a cada veriante alélica son diferentes, y hacen posible

identificar péptidos en una proteína que puede unir la molécula de MHC

apropiada (Babbit et al, 1985).

En el caso de las moléculas de clase-II, es más difícil predecir que péptidos

se unirán debido a la estructura más abierta de la hendidura de unión al

péptido de clase-II y la mayor longitud de los péptidos unidos a este, lo cual


100

permite una mayor flexibilidad en la unión del péptido. A su vez, los péptidos

que se unen a moléculas DR son más promiscuos o a menudo se unen a

más de un alelo, que los unidos a DQ (Kwok et al., 1995).

En casos poco frecuentes, una proteína puede carecer de péptidos con un

motivo apropiado para unir alguna de las moléculas de MHC expresadas en

las células del individuo, y entonces el individuo no puede responder al

antígeno. Pero el polimorfismo de las moléculas de MHC garantiza un

número suficiente de moléculas distintas en un individuo que a su vez

garantice la respuesta inmune.

Desde el punto de vista del individuo, parecería que cuanto mayor sea el

número de genes diferentes de MHC, es decir, a mayor poligenia mejor

sería la protección frente a organismos infecciosos. Pero se ha demostrado

que el polimorfismo de unos pocos genes es preferible a la poligenia (Gaur

and Nepom, 1996). Lo explicamos: alrededor de un 5% de células T que son

seleccionadas positivamente por una molécula de MHC propio, serán

reactivas a péptidos propios presentados por una moléculas de MHC propio,

y por tanto deben ser deleccionadas en el timo para evitar reactividad a lo

propio. Además, si el número de moléculas diferentes de MHC aumenta, y

en cambio en número total de moléculas de MHC permanece constante, la


101

concentración de cada molécula de MHC disminuye, y como se requieren

alrededor de 100-200 complejos péptido -MHC idénticos para activar una

célula T y se estima que el nivel máximo de unión de cualquier péptido a

cualquier molécula de MHC dada es del 1%, cada molécula de MHC

diferente debe estar en la superficie celular en número para presentar de

manera eficiente los péptidos unidos a ella. Si se expresan demasiadas

moléculas de MHC diferentes, no habrá ningún complejo MHC-péptido

presente en el nivel necesario para activar las células T.

Polimorfismo y poligenia se combinan para producir la diversidad de

moléculas de MHC que posee un individuo. Además, procesos de

recombinación génica pueden crear nuevos alelos, con lo que aumenta la

diversidad molecular de MHC.


102

VΙ.8.- HLA Y HEPATOTOXICIDAD

La individualidad de la respuesta inmune podría explicar porqué la

hepatotoxicidad ocurre en algunos y no en otros sujetos. Así, sabemos que

el sistema HLA de clase I y II participa en la presentación de antígenos

peptídicos a las células del sistema inmune en la regulación de dicha

respuesta inmune.

DRB1*01 DRB1*04 DRB1*15

Figura 18: El polimorfismo de las moléculas de HLA se traduce en que su configuración permitirá, de forma preferente, albergar antígenos con una estructura determinada frente a otros (Restricción por el Sistema Mayor de Histocompatibilidad)


103

La expresión de las moléculas de HLA es genéticamente polimórfica; es

plausible pues, que determinados haplotipos del HLA modulen

determinadas respuestas inmunológicas y de esta forma intervengan en la

hepatotoxicidad debida a fármacos. Es decir, puede existir una relación entre

el haplotipo HLA particular del sujeto y su propensión al desarrollo de

reacciones hepatotóxicas inmunoalérgicas, por la capacidad estructural de

los neoantígenos para acomodarse a determinadas especificidades HLA y

no a otras (Kwok et al., 1995).

Se han hecho estudios de fenotipo HLA en pacientes que han desarrollado

reacciones de hipersensibilidad debidas a fármacos, encontrándose

asociaciones entre ambos. Sin embargo, aunque esas asociaciones pueden

usarse para predecir el riesgo de desarrollar reacción adversa, en absoluto

pueden predecir la susceptibilidad individual (Pirmohamed et al., 1996).

De todas formas, desde siempre se ha relacionado el sistema HLA con la

susceptibilidad a algunas enfermedades infecciosas y su posterior evolución,

así como con la predisposición a determinadas enfermedades neoplásicas

(Luppi et al., 1999). Los polimorfismos de las moléculas del sistema HLA se

han asociado también con patologías de base autoinmune (tablas 14 y 15).


104

Tabla 14: ASOCIACIÓN HLA Y REACCIONES ADVERSAS

FÁRMACO REACCIÓN ADVERSA ASOCIACIÓN HLA

Carbamazepina Reacción anafiláctica DR3, DQ2

Sulfonamidas Necrolisis epidérmica tóxica A29, B12, DR7

Clozapina Agranulocitosis B38, DR4, DQ3

Dipirona Agranulocitosis A24, B7, DQ1

Tabla 15: MOLÉCULAS HLA Y HEPATOTOXICIDAD

Fármaco HLA Autor

Halotano (n=17) A11 Eade et al. Tissue Antigens(1981)

Nitrofurantoína (n=9) DR6, DR2

A. tricíclicos (n=12) A11

Diclofenaco (n=4) A11

Clorpromacina (n=5) DR6

Berson et al.

J Hepatol. (1994)

Amoxi-Clav. (n=35) DRB1*1501

DQB1*0602

Hautekeete et al.

Gastroenterology, (1999)


105

Los primeros trabajos al respecto intentaban relacionar la hepatitis causada

por la anestesia con halotano con el HLA del paciente. Existen dos estudios

al respecto con resultados contradictorios; en el primero de ellos no

encuentran asociación estadística entre la hepatotoxicidad por halotano y

ningún alelo del HLA (Eade et al., 1981) y en el segundo sí encuentran

asociación significativa entre el haplotipo Aw24-Bw52-DR2 y el desarrollo de

hepatitis ictérica tras la anestesia con halotano (Otsuka et al., 1985).

Ambos estudios no son comparables entre sí pues la población es de origen

diferente, al igual que el número y selección de los pacientes. Además el

primero intenta determinar asociación con moléculas HLA de clase I,

mientras que el segundo, más completo, establece asociación con

haplotipos incluyendo las moléculas HLA clase II (DR), que desde el punto

de vista de fisiología del sistema inmune son cruciales en el

desencadenamiento de la respuesta inmune.

Parte de la información disponible del tema es confusa, por ejemplo en lo

que respecta a la relación entre la hepatotoxicidad por nitrofurantoína y el

HLA B8 (Lindberg et al., 1978), ya que los datos que hay están basados en

publicaciones de casos aislados que a su vez se apoyan en datos de

estudios previos, de la década de los 70, en los que se relacionaba a las


106

hepatitis crónicas activas criptogénicas, de posible origen autoinmune, con el

HLA-B8, década en la que aún no era descartable la infección por VHC.

También se ha intentado relacionar el HLA con la probabilidad de daño

hepático inducido por metotrexato en el tratamiento de la psoriasis,

encontrándose una mayor frecuencia de HLA-A3 en los pacientes con daño

hepático más severo, aunque sin alcanzar significación estadística.

Más recientemente Berson y cols. (1994) tipan las subregiones A y B del

HLA clase I y DR y DQ del HLA clase II, en un grupo de 71 pacientes que

habían sido diagnosticados con hepatotoxicidad debida a fármacos.

Interesantemente, el HLA-A11 estaba presente en el 50% de los pacientes

con hepatitis debida a antidepresivos tricíclicos y en el 75% de aquellos con

con hepatotoxicidad debida a diclofenac, frente a un solo 12% en la

población de control. Por otro lado el HLA-DR6 estaba presente en un 80%

de los pacientes con hepatitis debida a clorpromacina, frente a un 22% en

controles. A pesar de estas diferencias el análisis estadístico corregido por

el número de comparaciones realizadas no arrojó ninguna significación

(Berson et al., 1994). Esto puede deberse a que dichas asociaciones son

casuales, pero también y más probablemente a la dificultad de conseguir el

numero de pacientes suficientes para mantener la significación después de

las correcciones estadísticas.


107

Hautekeete y sus colaboradores (1999), consiguieron reunir a 35 pacientes

con hepatotoxicidad secundaria al consumo de amoxicilina-clavulánico a los

que tiparon las subregiones A y B del HLA clase I y las subregiones DQ y

DR de la clase II, encontrando una asociación significativa entre este tipo de

reacciones y el haplotipo HLA-DRB1*1501-DRB5*0101-DQB1*0602, que se

mantenía después de corregir por el número de comparaciones realizadas

(Hautekeete et al., 1999). Esta hipótesis ha sido corroborada unos años

después en un estudio de similares características con 22 pacientes del

oeste de Escocia tratados con amoxicilina-clavulánico que habían

desarrollado también ictericia, y en doce de los 18 pacientes (67%) se

obtuvo el haplotipo DRB1*1501 comparado con 27 de los 134 controles

empleados, incluso al corregirse por el número de comparaciones realizadas

(O´Donohue et al., 2001) ( No se correlacionó con datos de presentaciones

clínicas de la hepatotoxicidad; se desconoce la indicación que motivó la

prospección de amoxicilina-clavulánico).

Estos datos en los que la reacción inmunoalérgica a un fármaco se asocia a

un haplotipo del HLA en particular, apoyan la hipótesis de que el

reconocimiento por parte de las moléculas HLA de los neoantígenos

generados en el metabolismo de los fármacos, podría jugar un papel crucial


108

en el mecanismo inmunoalérgico de la hepatotoxicidad idiosincrásica debida

a fármacos.

Por tanto, es plausible la hipótesis de que el fenotipo HLA del huesped

pueda predisponer al desarrollo de reacciones inmunoalérgicas a fármacos.

Esta predisposición podría ser hacia cualquier tipo de fármaco, o tal y como

creemos más probable, hacia un tipo determinado de ellos. Esta última

suposición la apoyamos en los datos comprobados de especificidad de unión

a antígenos peptídicos de determinados haplotipos de HLA (Zanelli et al.,

1998).

VΙ.9.- TÉCNICAS PARA LA DETERMINACIÓN DE ESPECIFICIDADES HLA

El método serológico es un ensayo de microcitotoxicidad en el cual usamos

antisuero (o anticuerpos monoclonales) específico contra antígenos de clase

I y II. El enlace específico es detectado mediante la adición de complemento,

el cual producirá la lisis de las células. El método serológico determina

especificidades que presenta el producto de la expresión de un gen, es

decir, proteínas. Estas especificidades vienen determinadas por la

configuración tridimensional de la propia proteína y, por tanto, hay


109

probabilidades altas de reacción cruzada con otros alelos y poca resolución

o capacidad de diferenciar entre diferentes alelos de un mismo grupo (de ahí

que el DR6 incluya a todos los alelos de DRB1*13 y 14).

Entre las limitaciones que presentaban las técnicas serológicas había una

fundamental, y es que determinados alelos no se podían determinar por falta

de antisueros específicos, pudiéndose dar muchos resultados como

homocigóticos no siendo realmente así. Por ejemplo, un indivíduo con tipaje

genómico DRB1*1501 (DR2 en serológico) y DRB1*0408 (DR4 en

serológico), podría tiparse como DR2., DR2, ya que al faltar un suero que

detectase el producto génico de DRB1*0408 se podría pensar que era

homocigoto para DR2.

Tabla 16: Equivalencias entre especificidades serológicas y genómicas

Serológicas Genómicas (adn)

DR1 DRB1*01XX DR2 DRB1*15XX Y DRB1*16XX DR3 DRB1*03XX DR4 DRB1*04XX DR5 DRB1*11XX Y DRB1*12XX DR6 DRB1*13XX Y DRB1*14XX DR7 DRB1*07XX DR8 DRB1*08XX No hay DR9 DRB1*09XX DR10 DRB1*10XX DQ1 DQB1*05XX Y DQB1*06XX DQ2 DQB1*02XX DQ3 DQB1*03XX No hay DQ4 DQB1*04XX


110

El método genómico determina especificidades a nivel de ADN localizados

en una secuencia lineal de nucleótidos invariante para cada alelo y, por

tanto, los resultados no presentan duda alguna. Actualmente, la gran

mayoría de las mutaciones pueden detectarse mediante técnicas de PCR

(Polymerase Chain Reaction) o RFLP (Restriction Fragment Length

Polymorphism). Estos métodos genotípicos tienen unas ventajas ya que

podemos identificar rápidamente “outliers” desde el punto de vista

metabólico y distinguir malos cumplidores de la terapéutica o pacientes con

un problema farmaco-genético real. Además, podemos distinguir el grado de

modulación genética y/o ambiental en base a la comparación geno-fenotipo.

También se dispone últimamente de otras técnicas relacionadas con la

anterior como “Single Nucleotide Polymorphisms“ (SNPs), variaciones en

una base de nucleótidos en una posición determinada de la secuencia del

gen, con lo cual varía la respuesta farmacológica y por tanto el fenotipo del

paciente (Evans and Relling, 2000). Esto nos ayudará a elegir los pacientes

idóneos a incluir en las fases iniciales del desarrollo de un fármaco y que

puedan obtener un beneficio terapéutico, y también será de gran ayuda en la

determinación farmacogeneticamente orientada de los regímenes de

dosificación, y en el campo de la farmacovigilancia.


111

Polimorfismo genético

Farmacocinética Farmacodinamia

Absorción Receptores

Distribución Canales iónicos

Metabolismo Enzimas

Excreción Sistema inmune

Figura 19: Vías principales del polimorfismo genético en fármacos (Pirmohamed et al., 2001)


112

VΙІ.- FACTORES DEL HUESPED QUE MODULAN LA

HEPATOTOXICIDAD DE UN FARMACO

Numerosos factores relacionados con el huesped favorecen un desequilibrio

entre la generación de metabolitos producidos en las reacciones de fase I

(algunos tóxicos) y la velocidad a la que pueden ser inactivados. En la

mayoría de los casos no es posible identificar las razones específicas de

este equilibrio, y ello explica que las reacciones hepatotóxicas continúen

ocurriendo (Tabla 17).

Los ancianos presentan un riesgo de dos a tres veces mayor a todos los

tipos de reacciones adversas (Montamat et al., 1989). Varios factores

contribuyen a este aumento de la frecuencia de reacciones adversas en la

práctica geriátrica: la prescripción más frecuente, el uso concomitante de

múltiples fármacos y los efectos indirectos de enfermedades intercurrentes

(Andrade et al., 2002). Así, en hospitales geriátricos, los fármacos parecen

estar presentes en el 20% de los casos de ictericia (Eastwood, 1971)

mientras que en Francia, los fármacos son responsables del 43% de los

ingresos por hepatitis aguda en pacientes mayores de 50 años (Farrell,

1994).


113

Tabla 17: Factores del huesped que son riesgo para la aparición de hepatotoxicidad

CIRCUNSTANCIA FARMACOS RELEVANCIA CLINICA

Edad Paracetamol, isoniazida, halotano Adultos más susceptibles, ↑con la edad.

Acido acetilsalicílico, ácido valproico Niños más susceptibles

Sexo Metildopa, nitrofurantoína, diclofenac Mujeres más susceptibles, particularmente hepatitis crónica

Nutrición Halotano,acetaminofeno metrotexato ↑ con obesidad

Embarazo Acetaminofeno, tetraciclina malnutrición

Dosis Paracetamol, AAS Riesgo hepatotoxicidad proporcional a niveles plasmáticos

Tetraciclina, tacrina, isoniazida Idiosincrasia metabólica donde existe una cierta dosis-dependencia

Duración/dosis total Intervalo

Metrotexate, vitamina A Dosis total, frecuencia y duración . Dosis diaria > toxicidad que semanal. Mayor riesgo en embarazo

Vía administración Tetraciclina iv Vía oral es raramente tóxica

Historia previa de reacciones a fármacos

Eritromicina-amoxicilina clavulánico Halotano-enflurano

Casos aislados de reacción cruzada

Diclofenac-ibuprofeno-Aceclofenaco

Amoxicilina-amoxi/clavulanico

Interacción farmacológica Acido valproico y otros antiepilépticos Anticonceptivos orales y troleandomicina Paracetamol e Isoniacida

↑ riesgo hepatotoxicidad

↑ riesgo colestasis

↑ riesgo hepatotoxicidad

Difenilhidantoína isoniacida y rifampicina Más hepatotóxico que solos

Consumo alcohol Paracetamol Metotrexate, isoniazida

No superar dosis ≥ 2 g/d ↑ riesgo hepatotoxicidad

Enfermedad subyacente:

SIDA

Trimetropinsulfometoxazol, dapsona

>riesgo daño hepático

Diabetes.y obesidad Metrotexate > riesgo fibrosis hepática

Deterioro función renal Tetraciclinas, alopurinol > riesgo riesgo hepático

Ayuno prolongado Paracetamol > riesgo daño hepático

Transplante de órganos Azatioprina, busulfan > riesgo toxicidad vascular

Enf de Still Acido acetilsalicílico > riesgo daño hepático

Hipertiroidismo Acido acetilsalicílico > riesgo daño hepático


114

La hepatotoxicidad es muy rara en niños ya que pueden metabolizar muchos

fármacos con mayor rapidez que los adultos. Sin embargo, el ácido valproico

provoca hepatotoxicidad en niños menores de 3 años, y el ácido

acetilsalicílico es uno de los factores que incrementan el riesgo relativo de

síndrome de Reye en niños de 2 a 10 años (Neuberger, 1989).

La hepatotoxicidad es al menos el doble de frecuente en mujeres que en

hombres, sobre todo para los fármacos que causan hepatitis crónica activa

(oxifenisatina, alfametildopa, nitrofurantoína), y sobre todo en mujeres

perimenopáusicas (donde predomina la hepatitis autoinmune). Se ha

sugerido que los factores hormonales podrían modular el sistema

inmunológico de forma que predispongan a sufrir hepatotoxicidad (Farrell,

1994). Fármacos como la azatioprina producen lesión hepática sobre todo

en varones, especialmente después del transplante renal (Liaño et al., 1989).

Tanto las enfermedades endocrinas como el estado nutricional pueden

predisponer a la lesión hepática. En el primer caso, por ejemplo, el

hipertiroidismo y también el hipotiroidismo pueden alterar el aclaramiento

hepático de la antipirina (Farrell, 1994). Y ya hemos visto como la obesidad

influye en la lesión hepática por halotano, debido a un incremento en la

actividad de CYP2E1 (Farrell, 1985) y a un almacenamiento prolongado de


115

esta sustancia en el tejido adiposo (Bentley et al., 1982). El ayuno puede

aumentar el riesgo de hepatotoxicidad por paracetamol en alcohólicos

debido al aumento de la actividad de CYP2E1 así como la reducción de los

niveles de glutation (Zimmerman, 1995).

El antecedente de una reacción adversa aumenta las posibilidades de otra

reacción a un fármaco, lo que podría explicarse por una predisposición

genética a una respuesta inmunoalérgica, como en el caso de la penicilina y

la sulfamida. También puede existir reacción cruzada con otro fármaco de la

misma familia, como en el caso de las fenotiacinas y del halotano y el

metoxiflurano y/o enflurano (Andrade et al., 2002). Las interacciones entre

fármacos pueden predisponer a la hepatotoxidad, al actuar algunos

compuestos como inductores del CYP específico que metaboliza a otros,

aumentando la tasa de producción de metabolitos reactivos; por ejemplo el

mayor potencial hepatotóxico de la asociación de isoniazida con rifampicina

que el de isoniazida sola. Por otro lado, también puede existir una inhibición

enzimática como en el caso de la troleandomicina, la cual inhibe el

metabolismo de los estrógenos bloqueando la acción del CYP3A4; o el caso

del fenobarbital y los antidepresivos (Pessayre et al., 1999).


116

La enfermedad hepática previa a menudo condiciona alteraciones en el

metabolismo de numerosos medicamentos, que explican las variaciones

interindividuales en la respuesta farmacológica. Junto a ello debe tenerse en

cuenta que los pacientes con hepatopatía crónica manifiestan una respuesta

anómala a diversos fármacos (Reidenberg, 1998). El riesgo de

hepatotoxicidad idiosincrásica no está incrementado en la hepatopatía

crónica, excepto para el metrotexato, la vitamina A y el halotano en la

hepatopatía alcohólica. El paracetamol es el analgésico de elección en los

pacientes con hepatopatía cronica, ya que en su mayor parte se metaboliza

por glucuronoconjugación.

Por último, también el estado fisiológico del paciente puede contribuir en

ciertos casos a la acción hepatotóxica de un fármaco, como por ejemplo el

embarazo aumenta la toxicidad de tetraciclina y halopurinol. Tanto la

obesidad como la hipoxia producen un aumento en la toxicidad del halotano

(Bentley et al., 1982)


117

VΙІІ.- FACTORES GENETICOS QUE CONTRIBUYEN A LA

HEPATOTOXICIDAD

La eficiencia de los sistemas de biotransformación y detoxificación así como

la respuesta inmune, están influenciados por variaciones genéticas que

pueden modular la hepatotoxicidad de algunos fármacos.

Tabla 18: Factores genéticos que contribuyen a la hepatotoxicidad (Larrey, 2000).

METABÓLICOS : -Deficiencia en CYP2D6 Perhexilina

-Deficiencia en CYP2C19 Tetrabramato -Deficiencia en NAT2 Sulfamidas, dihidralacina -Deficiencia en sulfoxidación Clorpromacina -Deficiencia en glutation sintetasa Acetaminophen -Deficiencia en GSTasab tipo T ¿Tacrina ?

-Deficiencia en detoxificación Halotano,fenitoína, de metabolitos reactivos amineptino, sulfamidas,

carbamacepina SISTEMA HLA : A11 Halotano

DR6 y DR2 Nitrofurantoína A8 Clometacina A11 Antidepresivos triciclicos,

diclofenac

DR6 Clorpromacina DRBI*1501 y DQB1*0602 Amoxicilina-clavulánico ____________________ NAT2 : N-acetiltransferasa ; GTasa glutation S transferasa


118

Los factores genéticos determinan la actividad de las vías de metabolización

de fármacos, la efectividad de los factores protectores del huesped y la

regulación de la respueste inmune.

La existencia de polimorfismo genético de los CYP y las enzimas hepáticas

provocan una variabilidad individual en el metabolismo de los fármacos que

puede conducir a la aparición de hepatotoxicidad.

VΙІІ.1.- POLIMORFISMO DE CYP2D6

Como consecuencia del polimorfismo genético de CYP2D6, se puede

producir una deficiencia en dicha enzima, la cual es responsable de la

oxidación de debrisoquina / dextrometorfano. El locus genético está en el

cromosoma 22. Más de 25 fármacos utilizados en terapéutica del hígado son

metabolizados por CYP2D6 (beta bloqueantes, antidepresivos tricíclicos,

clorpromacina, dextrometorfan y maleato de perhexilina) (Gonzalez and Idle,

1994).

Una prolongada administración de perhexilina puede inducir daño hepático

con curso de hepatitis, esteatosis, fibrosis y cirrosis, asociado con

fosfolipidosis debido a la acumulación de fosfolípidos en lisosomas


119

(Pessayre and Larrey, 1991). Para explicar la hepatotoxicidad producida por

la perhexilina, se ha propuesto el siguiente mecanismo: en sujetos

deficientes en CYP2D6, la perhexilina puede acumularse en los hepatocitos,

lo cual conduciría a una fosfolipidosis y a una esteatohepatitis (acumulación

de grasa en forma de triglicéridos en los hepatocitos). La mayoría de los

pacientes con daño hepático debido a perhexilina eran lentos

metabolizadores de debrisoquina (Morgan et al., 1984).

En el lado opuesto están los metabolizadores rápidos, cuyo mecanismo

resulta de una variante alélica que resulta en la duplicación de todo el gen

CYP2D6. Este polimorfismo amplificador en las personas afectadas hace

que no se pueda obtener un efecto terapéutico tras la administración de

dosis convencionales de fármacos que son sustratos de esta enzima. Y se

ha demostrado que una gran capacidad por CYP2D6 pudiera aumentar la

formación de metabolitos reactivos capaces de producir hepatitis

inmunoalérgica (Watson et al., 1988).

Pero estos casos anteriores son, más bien, la excepción que la regla, ya

que también se ha demostrado que no existe una relación directa entre el

polimorfismo de CYP2D6 y la hepatotoxicidad debida a fármacos


120

metabolizados por este citocromo, como amineptina, amitriptilina, metoprolol,

amodiaquina, PHETORIL, y halotano ( Larrey et al., 1989 ).

Varios alelos polimórficos del CYP2D6 responsables de la deficiencia en

esta isoenzima han sido identificados por métodos de PCR: los mas

comunes son CYP2D6A, CYP2D6B y CYP2D6D (CYP2D6B representa el

80% de los alelos) (Gonzalez and Idle, 1994).

VΙІІ.2.- POLIMORFISMO DE CYP2C19

La familia CYP2C controla la hidroxilación de S- mefenitoína en multitud de

fármacos como benzodiacepinas, β-bloqueantes (propanolol y labetalol),

nilutamida, ácido tienílico, glucocorticoides, esteroides sexuales,

ketoconazol, omeprazol y warfarina (Bertz and Granneman, 1997).

Recientes estudios sugieren que la hepatotoxicidad por tetrabramato

(ATRIUM), un fármaco que contiene fenobarbital y derivados carbamato

(febarbamato y difebarbamato), podría estar asociada con la deficiencia de

S- mefenitoína oxidada (Horsmans Y et al., 1994). Pero requiere mayor

confirmación y estudios en más pacientes. Además, la molécula involucrada

en la hepatotoxicidad de ATRIUM* todavía no ha sido identificada.


121

Dos alelos defectuosos en CYP2C19 responsables de un metabolismo

deficiente, han sido identificados: CYP2C19m1 y CYP2C19m2. El

CYP2C19m1 es una mutación producida en un locus del exón 5. Esto

produce una lectura alterada y un acortamiento prematuro del codon. La

segunda mutación o CYP2C19m2, encontrada en japoneses que son

deficientes metabolizadores, consiste en una mutación en la posición G36

(guanina-36) del exón 4 de CYP2C19, produciéndose como antes un codon

alterado (Larrey and Pegaux,1997). El 3% de la población de raza caucásica

son metabolizadores lentos para este enzima, mientras que la frecuencia del

fenotipo metabolizador lento en orientales es del 20%.

VΙІІ.3.- POLIMORFISMO DE CYP3A

CYP3A está involucrado en el metabolismo oxidativo de más del 50% de los

fármacos usados en humanos, incluyendo ciclosporinas e

inmunosupresores, benzodiacepinas, dihidropiridinas y otros antagonistas de

los canales del Ca ( Andersson, 1996 ). Tres variedades alélicas son las más

importantes: CYP3A3, CYP3A4 y CYP3A5, y de todas ellas CYP3A4 es la

que se expresa más abundantemente en el hígado humano. Hallando el

fenotipo individual usando eritromicina, nos ha revelado un gran grado de


122

variabilidad interindividual, pero no evidencia la presencia de polimorfismo

genético (Gonzalez and Idle, 1994).

Una variedad de biotransformaciones han sido atribuídas a CYP3A,

incluyendo 6β hidroxilación de esteroides, aromatización, N-dialquilación y

oxidación alifática, a menudo con el mismo sustrato oxidado en diferentes

posiciones.

VΙІІ.4.- POLIMORFISMO EN LOS SISTEMAS DE DETOXIFICACION DE

METABOLITOS REACTIVOS

Determinados defectos metabólicos genéticos en los mecanismos de

protección pueden disminuir la inactivación de los metabolitos reactivos y

promover la unión covalente a proteínas hepáticas, incluso aumentando el

estímulo inicial de la inmunización.

VΙІІ.4.a.- Polimorfismo en la N-acetilación

La N- Acetiltransferasa (NAT) es responsable de la biotransformación de

procainamida en su metabolito activo N- acetilprocainamida (NAPA) y

también del metabolismo de otras drogas como isoniazida, sulfonamidas,

hidralazina, dapsona, cafeína, fenilecina, acebutolol (Reidenberg and Drayer,


123

1986). Aproximadamente el 50% de caucasianos y afroamericanos son

lentos acetiladores, un fenotipo que es raro entre los asiáticos. Esto se sabe

debido a la existencia de 2 isoformas del NAT que son producto de

diferentes genes. NAT1 se expresa en prácticamente todos los individuos,

mientras que NAT2 se expresa solo en acetiladores rápidos.

Acetiladores lentos de procainamida tienen mayores concentraciones de

dicha droga y más bajas concentraciones de NAPA que los acetiladores

rápidos. Esta acumulación de procainamida en lentos acetiladores produce

un aumento subsecuente de su degradación en metabolitos tóxicos que

darán lugar a enfermedades como el lupus eritematoso.

En el caso de las sulfonamidas, éstas son preferéntemente metabolizadas

por el citrocromo P 450 mediante oxidación en lentos acetiladores,

formándose metabolitos reactivos como hidroxilaminas, las cuales necesitan

proceso de detoxificación ya que si no pueden dar lugar a la producción de

hepatitis (aunque también influyen otros factores) (Rieder et al., 1991). El

fenotipo lento acetilador, es un factor que presupone un 50% de las hepatitis

debidas a sulfonamidas, aunque se ha demostrado que existen otros

factores involucrados en la detoxificación de los metabolitos reactivos debido

a sulfonamidas (Shear et al., 1986).


124

Similarmente es el caso de la dihidralazina, que en acetiladores rápidos es

detoxificada sobre todo por acetilación; en lentos acetiladores este proceso

metabólico es deficiente y la mayor parte del fármaco es oxidado por el

citocromo P450 (CYP 1A2), dando lugar a un radical epóxido que modifica

el propio CYP 1A2 y puede llegar a producir una hepatitis autoinmune con

producción de anticuerpos anti- CYP 1A2 (Bourdi et al., 1994).

VΙІІ.4.b.- Polimorfismo de Sulfotransferasa

El proceso de la sulfoxidación de importantes fámacos como D-penicilamina

y clorpromacina, ha sido descrito debido a la producción de un metabolito: S-

carboximetil- L – cisteína. En el caso de la clorpromacina, se ha especulado

que cuando la sulfoxidación es deficiente, gran parte del fármaco se

metaboliza por un proceso alternativo y se forman metabolitos tóxicos

reactivos capaces de provocar hepatitis inmunoalérgica (Price et al., 1989).

VΙІІ.4.c.- Polimorfismo de Glutation Sintetasa

Ha sido demostrada la influencia de la deficiencia de glutation sintetasa en la

hepatotoxicidad debida a fármacos, en particular por acetaminofeno

(Spielberg, 1984). El resultado de sus estudios indica que sujetos


125

heterocigotos para la deficiencia en glutation son más susceptibles a la

hepatotoxicidad por acetaminofeno, debido a su poca capacidad para

resintetizar el glutation en situaciones de gran utilización de éste. Los sujetos

homocigotos son todavía más susceptibles a dicha toxicidad por

acetaminofeno, y además parecen ser más susceptibles a fármacos

potencialmente hepatotóxicos como metronidazol y nitrofurantoína.

VΙІІ.4.d.- Polimorfismo de Epoxidohidrolasa

Un claro ejemplo lo tenemos en la fenitoína, cuya hepatotoxicidad ocurre en

personas con deficiencia en la enzima epoxidohidrolasa, la cual convierte la

fenitoína-epóxido, que es un intermediario electrofílico que se forma después

del metabolismo oxidativo de la fenitoína, en un compuesto inerte llamado

dihidrodiol (Farrell, 1985) (Fig. 20).


126

P-450

NADPH O2

Detoxificación

Incluído Epoxido Hidrolasa

Metabolito no tóxico

Oxido de arena

Enlace covalente a macromoléculas

Citotoxicidad Hapteno

Función alterada de linfocitos

NECROSIS HEPATOCELULAR

REACCIÓN INMUNOLÓGICA

Linfoadenopatía

Fenitoína

Figura 20: Metabolismo de la fenitoina


127

VΙІІ.5.- POLIMORFISMO GENETICO EN LOS RECEPTORES U ORGANOS

DIANA

La susceptibilidad a padecer enfermedades es determinada por un gran

número de genes polimórficos. Aunque el Sistema Mayor de

Histocompatibilidad continúa siendo el foco de la mayoría de los estudios de

las enfermedades infecciosas, está aumentando el interés en la

identificación de otros locus dentro del mapa genético posiblemente

relacionados con dichas enfermedades.

Sin embargo, la mayoría de los recientes estudios han encontrado

evidencias de un único gen predominante afectando a la susceptibilidad

hacia la enfermedad, junto con otros genes recesivos asociados que

pertenecen a locis modificados.

Es decir, la susceptibilidad a padecer enfermedades puede ser determinada

por un gran número de genes polimórficos distintos del HLA, que se

encuentran situados en una región del mapa genómico próxima a la del

propio HLA (Hill, 1998) (Fig.12). Así, variaciones en el TNFα (tumoral

necrosis factor), localizado en la región de clase III del Sistema Mayor de

Histocompatibilidad, han sido relacionadas con la susceptibilidad a la


128

malaria cerebral en niños de Gambia (McGuire et al., 1994). Esta condición

está asociada con unos marcados altos niveles de TNFα en suero,

viéndose en un ensayo realizado con células B humanas que esta variante

alélica es un mayor activador transcripcional que los alelos comunes

(Wilson et al., 1997). La misma variante alélica, que supone un cambio en

la posición 308 del TNFα, ha sido asociada a la leismaniosis mucocutanea

(Cabrera et al., 1995) y con la lepra (Roy et al., 1997). Otras asociaciones

posteriores de dicha variante alélica del TNFα son: con la mortalidad por

miningitis meningocócica (Nadel et al., 1996); con la infección persistente del

virus de la hepatitis B (Thursz et al., 1998); con el asma (Moffat and

Cookson, 1997); con una lenta progresión a tener HIV (Khoo et al., 1997). El

alelo TNFα2 ha sido asociado con la hipersensibilidad a la carbamacepina,

pero sin embargo se ha visto que dicha asociación está también ligada al

HLA-DR3 y HLA-DQ2, con lo cual no es descartable la posibilidad de que

sea el haplotipo TNF2-DR3-DQ2 el que sea determinante en la

susceptibilidad a la enfermedad (Pirmohamed et al., 2001)

Todos estos estudios sobre el TNFα han propiciado otros estudios sobre

también otros genes de citokinas y receptores con conocidos polimorfismos

como IL-4, IL-1 e IL-1, encontrándose algunas asociaciones con la

predisposición a sufrir ciertas enfermedades (Hill, 1998). La respuesta


129

inmune hacia los agentes que producen sensibilización (sustancias

químicas, proteínas alergénicas y ciertos fármacos) está regulada por

citokinas, así que una regulación de la respuesta inmune durante el daño

tisular, proveería de protección contra una respuesta autoinmune contra los

antígenos intracelulares durante el daño a los hepatocitos (Park et al., 2000).

Figura 21: Figura esquemática del cromosoma 6 en humanos

CYP21 TNF αααα HLA CLASE IIDQ DR

CYP21 TNF αααα CYP21 TNF αααα HLA CLASE IIDQ DR

HLA CLASE II

DQ DR

CAPÍTULO III

OBJETIVOS

CAPITULO III - OBJETIVOS

130

OBJETIVOS

1- Determinar si existe asociación entre los antígenos de histocompatibilidad

de clase II del huesped y el desarrollo de hepatotoxicidad idiosincrásica

debida a fármacos.

2- Determinar si existe una relación entre los antígenos de

histocompatibilidad de clase II y los mecanismos de hepatotoxicidad

idiosincrásica, así como con la expresión bioquímica de la lesión:

hepatocelular, colestásico o mixto.

CAPÍTULO IV

MATERIAL Y MÉTODOS

CAPITULO IV - MATERIAL Y MÉTODOS

131

І.- MATERIAL Y METODOS

Ι.1.- DISEÑO DEL ESTUDIO

Se ha llevado a cabo un estudio multicéntrico prospectivo de corte

transversal, coordinado desde la Unidad de Hepatología del Servicio de

Gastroenterología y el Servicio de Farmacología clínica del Hospital

Universitario y Facultad de Medicina de Málaga.

І.2.- PACIENTES

Se trata de pacientes mayores de 14 años que se encuentran ingresados, o

han sido ya dados de alta, a cargo del Servicio de Digestivo o Unidad de

Hepatología de los distintos hospitales del territorio nacional anteriormente

descritos, y con diagnóstico de hepatopatía debida a fármacos. Un conjunto

de especialistas tanto en hígado como en enfermedades digestivas,

medicina interna y farmacología clínica, trabajando en colaboración

identificaron pacientes cuya enfermedad hepática era sospechosa de ser

debida a fármacos, y trasladaron la información al centro de coordinación.

En total se reunieron 140 casos que se han incluído dentro de un Registro

de Hepatotoxicidad creado por la Unidad de Hepatología del Servicio de


132

Aparato Digestivo de Hospital Universitario de Málaga desde 1994, en

colaboración con el Servicio de Farmacología Clínica. Los datos se

recogieron utilizando un protocolo diseñado por estos servicios, que

consistía en un cuestionario estructurado en diferentes apartados

incluyendo:

a) Provincia y unidad clínica en la que se ha detectado la reacción,

variables demográficas del paciente, características del tratamiento al que se

imputa la reacción, medicación concomitante y curso del episodio.

b) Para cada medicamento se recoge información de la fecha de inicio y

final de uso, la dosis, la indicación, la evolución tras la retirada y también si

existe reexposición.

c) Variables para excluir causas alternativas de hepatopatía (con

información de antecedentes de patología biliar o hepática, consumo de

alcohol, adicción a fármacos, antecedentes de transfusión de hemoderivados

o cirugía en los 6 meses previos al episodio que motiva su inclusión en el

Registro)

d) Se revisarán cuidadosamente los datos clínicos y biológicos, así como

los anatomopatológicos de la biopsia hepática en aquellos pacientes en los

que se disponga de ella.

e) Variables de laboratorio durante la reacción (cúspide) y tras la

resolución, y en su caso, variables histológicas.

PROTOCOLO DE ESTUDIO DE HEPATOPATIAS ASOCIADAS A

MEDICAMENTOS

_____________________________________________________________________ Nº Historia Clínica ......................................................................... Nombre, Apellidos Edad (años) .................................................................................... Sexo: 1. Hombre 2. Mujer .......................................................... Peso (kg) ....................................................................................... Tallla (cm) ...................................................................................... Procedencia: 1. Hospital 2. Asistencia Primaria ............................. Localidad: 1 Almería 2. Cadiz 3. Córdoba 4. Granada 5. Huelva 6. Jaen 7. Málaga 8. Sevilla ......................... MEDICAMENTO(S) SOSPECHOSO(S) DE CAUSAR LA REACCION (principio activo) ESPECIALIDAD FARMACEUTICA (nombre comercial) Dosis diaria total (mg) .................................................................... Intervalo (h) ................................................................................ ... Vía administración: 1. Oral 2. I.V. 3. I.M. 4. Sublingual 5. Rectal 6. Aerosol 7. Otros ...................... Indicación que motivó su prescripción

__________________ Fechas del tratamiento desde: (día / mes/ año) ............................. hasta: (día/ mes/ año) ............................... Duración del tratamiento (dias) ....................................................... Dentro de este periodo ¿Cuando apareció la reacción?) ................. ¿Desapareció la reacción al suspender la medicación? 1.Si 2.No 3.No procede .................................................... ¿Reapareció al reemprender el medicamento? 1.Si 2.No 3. No procede ................................................... Tiempo de resolución de la reacción (días) ......................................

PROTOCOLO DE ESTUDIO DE HEPATOPATÍAS ASOCIADAS A

MEDICAMENTOS (Continuación 1)

DESCRIPCION DE LA(S) REACCION(ES) ADVERSA(S) (incluyendo resultados relevantes de exploración o de laboratorio) y signos/síntomas extrahepáticos. Ictericia : 1. Si 2. No Rash : 1. Si 2. No Eosinofilia : 1. Si 2. No MEDICAMENTOS CONCOMITANTES PRESCRITOS O POR AUTOMEDICACION (EXCLUYENDO LOS USADOS PARA TRATAR LA REACCION ADVERSA) Preparado Dosis Vía Indicación Duración diaria __________________________________________________________________ ___________ ________ ______ ___________ desde ............... hasta ............... ___________ ________ ______ ___________ desde ............... hasta ............... ___________ ________ ______ ___________ desde ............... hasta ............... ___________ ________ ______ ___________ desde ............... hasta ............... ___________ ________ ______ ___________ desde ............... hasta ...............

DATOS IMPORTANTES DE LA HISTORIA CLINICA (alergias, embarazo ...). PRUEBAS DIAGNOSTICAS (ECG TAC, colangiografía, etc..). BIOPSIA (descripción y fecha de su realización)

PROTOCOLO DE ESTUDIO DE HEPATOPATÍAS ASOCIADAS A MEDICAMENTOS (Continuación 2)

DESENLACE DE LA REACCION (señale lo que proceda) Resolución espontánea ............................................

Requirió tratamiento ................................................

Persistencia de la reacción adversa ...........................

Necesidad de hospitalización ...................................

Necesidad de prolongar hospitalización previa..........

Incapacidad permanente o significativa ....................

Recuperación ...........................................................

La vida del paciente ha estado en peligro ..................

Fallecimiento ............................................................

Otros datos de interés sobre el desenlace Médico notificador ................................... Fecha ................................................... Firma ................................................... Teléfono contacto ................................................... Fax ...................................................

ANTESTRAT(fecha)

INICIAL (Fecha)

EVOLUCION (fecha)

EVOLUCION (fecha)

AL ALTA (Fecha)

DATOS BIOQUIMICOS Glucosa Urea Creatinina Proteínas totales Albúmina alfa-1 (g/L) alfa-2 Beta Gammaglobulinas Bilirrubina total (n= ) Bilirrubina directa AST (rango ) ALT (rango ) GGT (rango ) F.Alcalina (rango ) Hierro Transferrina Cobre Ceruloplasmina Inmunoglobulina M Inmunoglobulina G Inmunoglobulina A HEMOGRAMA Hematies Hemoglobina Hematocrito VCM VSG Plaquetas Actividad Leucocitos PMN Linfocitos Monocitos Eosinófilos Basófilos

INICIALES (Fecha) EVOLUCION (Fecha)

ALTA(Fecha)

MARCADORES IgM anti HVA HBsAg Anti HBc Anti HCV : ELISA Anti HCV : RIBA Anti HCV : PCR Anti HEV CMV Ig M VEB Ig M Otros AUTOANTICUERPOS ANA AML AMA Anti LKM-1 Factor reumatoide Celulas LE


EXCLUSION DE OTRAS CAUSAS * Infecciones víricas - Hepatitis A, B, C - SIDA - Mononucleosis infecciosa - Otros * Infecciones bacterianas - Sepsis * Parasitosis * Enfermedades hepáticas - Antecedentes hepatitis tóxica - Enfermedades sistémicas que alteran función hepática: .Enf. inflamatoria intestinal .Artritis reumatoide .Otras enfermedades autoinmunes: SLE y poliarteritis nodosa .Linfoma .Insuficiencia cardiaca .Disfunción tiroidea .Traumatismo severo con múltiples transfusiones .Hipotensión aguda. - Otras enfermedades hepáticas, infiltrado difuso por neoplasia, granulomatoso. * Antecedentes de intervenciones quirúrgicas - Anestesias * Antecedentes de exploraciones radiológicas: pielografía, angiografía, otras. * Enfermedades neoplasicas (Hodgkin) * Embarazo * Tatuajes • Transfusiones • Productos herbales * Tóxicos - Tóxicos laborales (paraquat, colas, etc.). - Hábitos alcohólicos - Drogadicción


INGESTA ALCOHOL BEBIDA, TIPO:................................................................................................... CANTIDAD (conversión del volumen de bebida en gramos) Cahalan, 1981................ - caña cerveza ... (200 cc) = 5.12 gr. alcohol - tubo cerveza ... (300 cc) = 7.7 gr. " - quinto cerveza . (200 cc) = 5.12 gr. " - tercio cerveza .. (330 cc) = 8.5 gr. " - vaso de vino.... (200 cc) = 14.4 gr. " - vasito de vino... (100 cc) = 7.2 gr. " - copa de licor.... (45 cc) = 12.6 gr. " DURACION (meses) ........................................................


140

Junto al protocolo de recogida de datos en papel, se diseñó y desarrolló una

base de datos en ordenador para la gestión eficiente de los datos recogidos

en las diferentes etapas del estudio.

Los casos fueron evaluados por expertos aplicando la escala de causalidad

de CIOMS (Danan and Bénichou, 1993).

El patrón de lesión hepática fue definido de acuerdo a criterios del

Internacional Consensus Meeting (Bénichou C, 1990). Este sistema utiliza

datos biológicos (en ausencia de biopsia hepática) para ordenar las

reacciones hepatotóxicas en alteración biológica hepática y lesión hepática.

Esta última se clasificaba a su vez en: hepatocelular, colestásica y mixta,

según que el patrón de alteración enzimática fuera principalmente de las

enzimas de citolisis, de colestasis o intermedio respectivamente. Se intentó

asimismo establecer el mecanismo de lesión clasificando las reacciones en

intrínsecas (dependientes de la dosis) e idiosincrásicas. Estas últimas se

subclasificaron a su vez por hipersensibilidad cuando existían datos de

inmunoalergia (corto intervalo de tiempo entre la administración y la

aparición de la reacción hepatotóxica, rash cutáneo, adenopatías, fiebre y

eosinofilia periférica y/o en tejido periférico), y metabólica en todos los

demás casos.


141

Los fármacos responsables de la reacción hepática fueron clasificados de

acuerdo con la ATP (Anatomical Therapeutic Classification)(WHO, 1997).

El protocolo de estudio fue aprobado por el Comité Ético Local del centro

coordinador en el Hospital Virgen de la Victoria en Málaga.

Ι.2.a.- Criterios de inclusión

-Se incluyeron pacientes con hepatotoxicidad idiosincrásica con

consentimiento informado para obtener muestra de su sangre.

-Pacientes que hubieran sido remitidos al Registro de Estudio de

Hepatopatías Asociadas a Medicamentos y que su evaluación de la

causalidad utilizando la escala diagnóstica de CIOMS hubiera arrojado con

resultado de probable o definido.

І.2.b.- Criterios de exclusión

-En general se excluyeron todos los casos en que los hallazgos patológicos

no apoyaron la diagnosis de la enfermedad hepática idiosincrásica debida a

fármacos y su evaluación por la escala de CIOMS fuera posible, indefinida o

excluída.


142

-Pacientes cuya valoración de la enfermedad fuera considerada como una

alteración biológica en lugar de un daño hepático o se tuviera sospecha de

ser cualquier hepatitis no producida por fármacos.

-También se excluyeron pacientes con hepatotoxicidad por mecanismo

intrínseco debido a una sobredosificación al fármaco expuesto

(acetaminofeno) o a la acción tóxica de éste (plaguicidas).

І.3- CONTROLES

El estudio contó en total con 635 controles, que eran donantes sanos de

médula ósea o sangre, procedentes de tres provincias españolas (Málaga,

Granada y Sevilla), y de España en general. Dichos controles fueron

escogidos por pertenecer a las mismas áreas geográficas de España que los

pacientes sujeto de nuestro estudio.

Nº Controles

Sevilla 195

Granada 105

Málaga 160

España 176

TODOS 635


143

Los controles de Málaga pertenecían a un muestreo realizado por el Servicio

de Inmunología y Unidad de Enfermedades Autoinmunes del Hospital

Regional Carlos Haya, y en el que participaban 160 voluntarios sanos

donantes de médula ósea residentes en dicha provincia. Se recogieron

también controles de los laboratorios de Inmunología del Hospital Virgen de

las Nieves en Granada (Tissue Antigens 2001; 57: 138-143) y del Hospital

de Valme en Sevilla. Los controles de España se sacaron de un estudio

publicado para analizar la contribución del tipaje del genoma humano (HLA

A-B-C y DR-DQ) al estudio de los orígenes de los hispanos y vascos (Tissue

Antigens 1995; 45: 237-245).

Ι.4.- OBTENCIÓN DE MUESTRAS

Desde el año 2000 hasta el 2003 nos han sido remitidas muestras de

sangre de pacientes provenientes de diversos hospitales a los que se les

ha diagnosticado una reacción adversa hepatotóxica (RAH), y a los cuales

se les ha descartado infecciones bacteriana o virales reconocidas por los

procedimientos estándar. Para ello se contó con la colaboración de los

médicos de diversos hospitales de diferentes comunidades autónomas que

contribuyen desde hace años en la recogida de estos casos a un Registro

de Hepatotoxicidad. Así pues, se les envió a todos ellos un protocolo de


144

recogida de muestras con las instrucciones para su extracción, procesado y

almacenamiento hasta su envío a nuestro departamento. Los hospitales y

los médicos colaboradores fueron:

-Hospital Torrecárdenas, Almería: MC Fernandez, G Pelaez, JL Vega, M

Casado.

-Hospital Vírgen de la Nieves, Granada: R Martín-Vivaldi, F Nogueras.

-Hospital Clínico Universitario San Cecilio, Granada: MA Lopez-Garrido,

J Salmerón.

-Hospital Clínico Universitario de Málaga, Málaga: M García-Cortés,

Raquel Camargo, R Alcántara, E García, RJ Andrade, MI Lucena,

CENTRO COORDINADOR.

-Hospital Costa del Sol, Málaga: Jose M Navarro.

-Hospital Nuestra Señora de Valme, Sevilla: M Romero, R Corpas.

-Hospital Vírgen de la Macarena, Sevilla: JA Durán, M Jiménez.

-Hospital Central de Asturias, Oviedo: L Rodrigo.


145

Figura 22: Esquema de recogida y procesamiento de datos del Registro para el estudio de la Hepatopatías asociadas a medicamentos


146

A partir de dichas muestras de sangre, se procedió a la extracción del DNA

genómico de los pacientes en el laboratorio del departamento de

Farmacología de la Facultad de Medicina de la Universidad de Málaga, que

posteriormente se utilizó para el tipaje de las subregiones DR y DQ del HLA

de clase II. En 33 pacientes el tipaje fue realizado de 1 a 5 años después de

la resolución de la RAH, mientras que en 107 pacientes el tipaje fue un corto

periodo después de la resolución de ésta o incluso durante la evolución de la

misma.

І.4.a.- Recogida de muestras

En el momento de su inclusión en el estudio, se extrajo a los pacientes 6 ml

de sangre total en un tubo con EDTA. Se centrifugó a 200 rpm durante 15

minutos y se aspiró con una pipeta Pasteur el plasma sobrenadante sin tapar

la capa de células blancas que cubre a las células rojas, y se pasó a tubos

eppendorf, etiquetados para congelarlo a -70º. Se tapó el tubo con la sangre,

se mezcló y vierte en un tubo de polipropileno de 15 ml. Por último, se

etiquetó y congeló a -70º, para posteriormente mandarlo al centro

coordinador.


147

Ι.5.- INSTRUMENTAL Y APARATOS

-Balanza de precisión Selecta “Unitronic 320 OR”

-Baño termostatado con agitación Selecta “Agimatic-S”

-Ultracentrífuga Kontron

-Centrífuga refrigerada Sorvall

-Microcentrífuga Sorvall

-Estufas Heraus

-Cámara de hibridación Gel

-Ultracongelador Queue

-Congelador Hera

-Nevera Eurocold

-Espectrofotómetro Shimadzu UV-Visible (UV- 16039)

-Tubos Eppendorf

-Termociclador Perkin Elmer PCR System 2

-Pipetas autoclavables Nichipet 100-1000, 2- 10 y 20- 200 µ/l

-Purificador Milli-Q de Millipore

-Picadora de hielo Scotsman AF 100

-Guantes de latex Sempermed

-Gradillas metálicas Nahita


148

І.6.- TECNICAS ANALÍTICAS

Ι.6.a- Reactivos utilizados para la extracción del DNA

-Triton X - 100

-Agua destilada

-Edta 5 M

-Proteinasa K

-SDS al 20%

-Cloruro sódico 5 M

-Etanol puro

-Tris ClH 1 M

Ι.6.b.- Extracción de DNA

Se realizó la extracción de DNA de la muestra de sangre digerida con

proteinasa K, seguido de extracción con ClNa 5 M y precipitación con etanol

según protocolos estándares (método de salting out):

-Pipetear 200 ul de sangre congelada en eppendorf de 1,5 ml.

-Añadir 1ml. De buffer de lisis y agitar suávemente durante 30 segundos

(se rompen las células nucleadas).

-Centrifugar a 13.000 rpm 1 minuto.


149

-Desechar el sobrenadante.

-REPETIR ESTOS PASOS UNA VEZ MAS y cambiar de eppendorf.

-Lavar con agua (1 ml) destilada, resuspendiendo muy bien hasta que el

pellet esté blanco-rosado.

-Centrifugar a 13.000 rpm 1 minuto.

-Desechar el sobrenadadnte y eliminar el exceso de líquido.

-Resuspender el pellet en: 80 ul de buffer PasaK +30 ul de PasaK + 240

ul de agua destilada + 20 ul de SDS al 20%. (la PasaK o proteinasa K

degrada o digiere)

-Incubar con rotación 30 minutos a 55ºC.

-Enfriar a Tª ambiente.

-Añadir 100 ul de ClNa 5M (para precipitar).

-Agitar suávemente 15 segundos.

-Centrifugar a 13.000 rpm durante 6 minutos.

-Pipetear o verter sobrenadante a un nuevo tubo de 1,5 ml.

-Centrifugar de nuevo a 13.000 rpm durante 3 minutos.

-De nuevo pipetear o verter sobrenadante a un nuevo tubo de 1,5 ml.

-Añadirle 1 ml de etanol al 99,5% a Tª ambiente. Dejar precipitar el DNA

por agitación suave (hasta ver madeja de DNA).

-Centrifugar a 13.000 rpm durante 2 minutos.

-Desechar el etanol.


150

-Lavar con 1 ml de etanol al 70% y centrifugar 2 minutos a 13.000 rpm.

-Desechar el etanol.

-Eliminar el residuo interno con un bastoncillo, o centrifugando a 13.000

rpm durante 10 segundos y tomándolo con una pipeta.

-Disolver en 25-50 ul de agua destilada agitando en vortex durante 15

segundos o dejando a Tª ambiente durante toda la noche.

-Cuantificar en espectrofotómetro con un factor de dilución de 1:100 (10

de ADN en 1000 de agua destilada, o 12 en 1200).

-Ajustar la concentración a 50 ng de ADN/ul.

-Guardar a 4ºC.

І.6.c.- Reactivos utilizados en la prueba de PCR

-Kit Dynal RELI SSO HLA DRB Typing Kit (100 Tests, Oxoid)

-Kit Dynal RELI SSO HLA DQB Typing Kit (100 Tests, oxoid)

І.6.d.- Tipaje de la región DRB y DQB

Las especificidades de DR se tipificaron mediante tipaje molecular por

“Polymerase Chain Reaction” o PCR utilizando un test de PCR-SSO

(sequence specific oligonucleotide), en reverso comercial: Dynal RELI TM,

Oslo, Norway. Para la realización de la técnica se siguieron las instrucciones

de la casa comercial proveedora (Oxoid). El ensayo está basado en tres


151

procesos principales, la amplificación del segmento a estudiar por la

reacción de la polimerasa en cadena, la hibridación del producto amplificado

con sondas de oligonucleótidos específicas y la detección del complejo

sonda- segmento amplificado.

El proceso para la amplificación de las moléculas HLA DR fue el siguiente:

Amplificación:

-Añadir 15 ul de Master Mix por tubo (contiene los “primers” y la

TACpolimerasa).

-Añadir 100 a 200 ng de DNA en un volumen de 7,5 ul (Diluir con agua

destilada si es necesario).

-Pipetear 7,5 ul de CL2Mg.

-Poner los tubos en el termociclador con el programa HLA-DR. Ir

enchufando el baño y precalentando reactivos.

-Finalizada la amplificación, añadir 30 ul de solución de desnaturalización

y mezclar con la pipeta.

-Incubar durante 10 min a Tª ambiente. Si no se va a utilizar al momento,

guardar en nevera (max. una semana).

Detección en baño con agitación a 50ºC:

-Calentar Wash Buffer y Buffer de Hibridación a 50ºC en baño.

-Cortar las tiras por la mitad.


152

-Añadir 5 ml de buffer de hibridación precalentado.

-Añadir los 60 ul restantes de la amplificación y desnaturalización agitando

la placa entre muestra y muestra.

-Incubar a 50ºC en baño con agitación suave durante 30 min.

-Aspirar el contenido de cada pocillo, limpiar la tapa con papel.

-Añadir 5 ml de Wash Buffer a Tª ambiente y agitar la placa a mano unos

segundos.

-Aspirar el líquido y añadir 5 ml de Wash Buffer precalentado.

-Incubar 15 min en baño.

-(Preparar la solución conjugada. 16 ul de estreptavidina-HRP + 5,3 ml de

Wash Buffer a Tª ambiente).

Detección a Tª ambiente:

-Aspirar el líquido y colocar a partir de ahora las tiras de 2 en 2 o 3 en 3

en cada pocillo.

-Añadir 5 ml de solución conjugada por pocillo.

-Agitar por rotación orbital 15 min a Tª ambiente.

-Aspirar el contenido de los pocillos +, enjuagar y secar la tapadera.

-Lavar con 5 ml de Wash Buffer a Tª ambiente durante 5 min, 2 veces.

-Aspirar y añadir 5 ml de Buffer citrato.Agitar 5 min.

-(Preparar Working substrato: 4,4 ml de sustrato A + 1,1 ml de sustrato B

por pocillo).


153

-Aspirar Buffer citrato y añadir 5 ml de Working substrato. Agitar 10 min.

-Aspirar Working sustrato y añadir 5 ml de agua destilada. Agitar 5 min.

Repetir una vez más el último paso.

-Aspirar el agua y añadir 5 ml de Buffer citrato. Agitar 5 minutos.

-Sacar las tiras, secarlas con papel de filtro e interpretar.

El tipaje de la región HLA DQ se realizó por el mismo procedimiento que el

de a región DR.

La PCR (Polymerase Chaín Reaction) es un método para la amplificación de

secuencias específicas de DNA diseñado en 1983 por Kary Mullis. Consiste

en una batería de reacciones de amplificación con cebadores específicos

(uno o varios pares de cebadores por cada especificidad DQ o DR) y la

consiguiente visualización del producto amplificado en geles de agarosa. La

asignación de alelos se basa en la presencia o ausencia de producto

amplificado. Como la ausencia de amplificado puede deberse a problemas

técnicos como errores de pipeteo o presencia de inhibidores de la reacción,

se incluye una pareja de cebadores control en cada solución. Esta pareja de

cebadores amplifica un fragmento bien conservado de DNA humano y

verifica la eficiencia de la amplificación por PCR con un control interno.


154

ІІ.- ANALISIS ESTADÍSTICO

Primero se ha realizado un análisis descriptivo de todas las variables objeto

de estudio dispuestas en unas tablas de contingencia. Los estadísticos

calculados y los gráficos representados son los usuales en la investigación

científica.

Luego se han comparado las frecuencias HLA obtenidas con nuestros

pacientes, expresadas en porcentajes, con las del grupo control. Se dividió la

frecuencia de cada alelo entre el número total de alelos estudiados (n = 18).

Los resultados que eran homocigotos solo se contabilizaron una vez y no

dos.

Se analizaron las distintas frecuencias fenotípicas según el daño hepático, la

etiología hepática, el sexo, lugar de residencia, por grupos de fármacos y por

principios activos individuales. También hizo un estudio comparativo entre

las frecuencias obtenidas con amoxicilina-clavulánico según Hautekeete y

cols. (Gastroenterology,1999) y nuestro estudio.


155

Las frecuencias de cada alelo o de variables discretas fueron comparadas

por el test de chi-cuadrado y con la corrección de Yates, o mediante el Test

exacto de Fisher para comparar proporciones cuando el valor esperado era

menor que 5. Las significaciones (p) se corrigieron por el número de

comparaciones realizadas (n = 18) para disminuir la probabilidad de que un

incremento del nº de comparaciones pudiera alcanzar resultado significativo

por azar, dándonos así la p corregida de Bonferroni. Una diferencia de p<

0.05 después de la corrección de Bonferroni nos indicó que había una

diferencia significativa. Se calcularon el Odd Ratio y los intervalos de

confianza para estimar la fuerza de asociación para cada antígeno.

CAPÍTULO V

RESULTADOS

CAPITULO V - RESULTADOS

156

RESULTADOS

Se ha obtenido muestra de sangre de 140 pacientes que figuraban en el

Registro de Hepatopatías asociado a medicamentos, detectados en los

diferentes centros que colaboraban en el registro y distribuídos según

localidades: Almería, Granada, Sevilla, Oviedo y Málaga (tabla 19). Se

obtuvo de todos ellos una muestra de sangre para extracción de su DNA

genómico, realizándose posteriormente el tipaje de las subregiones DQ y

DR del HLA de clase II, el cual se expresó en frecuencias fenotípicas

calculadas como nº de alelos / nº total de individuos.

PROVINCIA N (%)

ALMERIA 40 28.6

GRANADA 17 12.1

MALAGA 43 30.7

OVIEDO 13 9.3

SEVILLA 27 19.3

TOTAL 140 100.0

Tabla 19: Pacientes de cada provincia y su frecuencia estadística


157

Dispusimos, a si mismo, de 635 controles procedentes de tres provincias

que son centros de referencia para nuestro estudio (Málaga, Granada y

Sevilla) y de España en general. En las siguientes tablas se expresan los

alelos HLA DR y DQ que son predominantes en los casos control,

expresados en tanto por ciento de prevalencia.

Alelos Controles N (%)

España N (%)

Málaga N (%)

Sevilla N (%)

Granada N (%)

DRB1* DRB1*01 86 (19.50) 40 (23) 31 (19.4) 41 (21) 15 (14.3) DRB1*15 90 (20.41) 37 (21) 34 (21.3) 28 (14.77) 19 (18.1) DRB1*16 20 (4.54) 7 (4) 6 (3.8) 8 (4.22) 7 (6.7) DRB1*03 119 (26.98) 48 (27) 41 (26.5) 41 (21) 30 (28.6) DRB1*04 108 (24.49) 46 (26) 38 (23.8) 44 (23) 24 (22.9) DRB1*11 101 (22.90) 32 (18) 41 (26.5) 42 (22) 28 (26.7) DRB1*12 3 (0.68) 0 2 (1.3) 6 (3) 1 (1) DRB1*13 89 (20.18) 28 (16) 35 (21.9) 57 (29) 26 (24.8) DRB1*14 25 (5.47) 9 (5) 11 (6.9) 8 (4) 5 (4.76) DRB1*07 154 (34.92) 67 (38) 55 (34.4) 71 (37) 32 (30.5) DRB1*08 21 (4.76) 14 (8) 7 (4.4) 9 (5) 0 DRB1*09 5 (1.13) 5 (3) 0 5 (3) 0 DRB1*10 19 (4.31) 12 (7) 4 (2.5) 4 (2) 3 (2.9) DQB1* DQB1*05 161 (36.51) 72 (41) 52 (32.6) 68 (31) 37 (35.2) DQB1*06 182 (41.27) 62 (35) 72 (45) 77 (39) 48 (45.7) DQB1*02 246 (55.78) 95(54) 93 (58.1) 108 (56) 58 (55.2) DQB1*03 236 (53.51) 97 (55) 84 (52.5) 106 (55) 55 (52.4) DQB1*04 18 (4.08) 11 (6) 7 (4.4) 10 (5) 0 n =635 n =176 n =160 n =194 n =105

Tabla 20: Comparación de frecuencias entre los controles de Granada (Ramal et al.,Tissue Antigens 2001), Málaga (Sanchez J et al.), Sevilla (Hospital de Valme, Laboratorio de Inmunología, Gonzalez F) y España (Martinez-Laso J et al., Tissue Antigens 1995) vs los controles totales (o suma de todos los anteriores ).


158

No hubo diferencias significativas entre las frecuencias de cada alelo en la

tabla suma de todos los controles con respecto a la frecuencia de los

alelos por separado en las tablas por provincias y de España, es decir,

existió una homogeneidad en los resultados, por lo cual hicimos el estudio

comparativo de frecuencias con los pacientes que desarrollaron

hepatotoxicidad debida a fármacos utilizando como controles la suma de

los controles de todos los centros utilizados.

Ι.- PACIENTES

Los casos de daño hepático idiosincrásico debido a fármacos fueron

recogidos del Registro Regional de Hepatotoxicidad y evaluados por al

menos tres expertos independientes que fijaron la causalidad, primero con

su juicio clínico y después aplicando la escala de CIOMS. Logramos

reunir 140 casos catalogados como definidos o probables, ya que fueron

rechazados los casos posibles e improbables, así como los casos de daño

hepático secundario debido a sobredosis de fármaco (acetaminofeno) o a

la exposición de un tóxico (plaguicidas).

Las características clínicas y demográficas de los pacientes con una RAH

(Reacción Adversa Hepatotóxica) que reunieron los criterios de inclusión,


159

están expuestas en la tabla 21. No existieron diferencias significativas

entre sexos, con 74 mujeres (52.9 %) y 66 hombres (47.1 %). La edad

media fue de 52 años (51.76 ± 18.26), oscilando entre 13 y 86 años.

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

20-30 30-40 40-50 50-60 60-70 70-80 80-90

HombresMujeres

Figura 23: Incidencia de hepatopatía tóxica por edad y sexo

Frecuencia (%)

Edad


160

En la figura 23 se observa la incidencia del daño hepático debido a

fármacos tanto en hombres como en mujeres y por grupos de edades.

Existe predominio de los hombres con respecto a las mujeres de edad

avanzada que sufren dicha enfermedad. Mientras que en las mujeres la

incidencia de la hepatotoxicidad está aumentada entre los 40 y 70 años

(18%), en los hombres existe un pico que corresponden a una mayor

incidencia de la enfermedad en 40-50 años (15%).

En la mayoría de los pacientes, tras la retirada del agente causal se

obtuvo una mejoría con resolución completa causal al fármaco causante

de la lesión hepática. Hubo una reexposición en 9 pacientes. En un caso

la enfermedad evolucionó hacia una colestasis crónica y en dos casos se

requirió transplante hepático .Tan solo 1 caso fue de éxitus, y el paciente

fallecido había sido tratado con pirazinamida.


161

43 (30,7)

23 (16,4)

20 (14,3)14 (10)

12 (8,6)

8 (5,7)

5 (3,6)

4 (2,9)9 (7,8)

Antiinfecciosos via general sistema nervioso central

aparato locomotor Aparato digestivo y metabolismo

antineoplásicos Aparato cardiovascular

Sangre y org. Hemapoyéticos Prep. Genito-urinarios y HO. Sexuales

Otros

De los medicamentos sospechosos de causar la reacción adversa

destacan según el grupo farmacológico y por orden de frecuencia:

antiinfecciosos generales (30.7%, 43/140; ej.:amoxicilina- clavulánico),

sistema nervioso central (16.4%, 23/140; ej.:bentazepam, tetrabramato,

Figura 24: Grupos farmacológicos implicados en las reacciones hepatotóxicas - N (%)


162

fluoxetina, paroxetina), aparato locomotor (14.3%, 20/140; ej,:diclofenac,

ibuprofeno, nimesulide, indometacina, rofecoxib), aparato digestivo y

metabolismo (ej.:ebrotidina, lansoprazol, famotidina), antineoplásicos

(ej.:azatioprina, asparraginasa), aparato cardiovascular (ej.:irbesartan,

losartan, captopril) y varios.

Amoxicilina-clavulánico, combinación de un antibiótico de amplio espectro

con un antiinfeccioso vía oral, fue el principio activo individual responsable

del mayor número de casos (n = 27) (Tabla 22).

En el grupo de aparato digestivo destaca la “miniepidemia” con ebrotidina.

Se trata de 4 pacientes que fueron tratados con dicho fármaco, retirado ya

del mercado debido a su gran potencial hepatotóxico, todos ellos con

lesión hepatocelular y mecanismo de acción metabólico (Tabla 23).

Otro fármaco predominante es la azatioprina, un antineoplásico derivado

de 6-mercaptopurina que puede causar daño colestásico además de

lesión vascular del tipo de la enfermedad venooclusiva y la peliosis

hepática.


163

La flutamida es otro antineoplásico que estuvo presente en dos casos de

lesión hepatocelular y otros dos de lesión hepática mixta, todos ellos con

etiología hepática de tipo metabólica (Tabla 23).

Entre los AINEs, el diclofenac fue prescrito en tres pacientes produciendo

en ellos daño hepatocelular, lo mismo que el inhibidor de la bomba de

protones omeprazol (Tabla 22).

Principio activo N %

Amoxi-clav 27 18.12

Numesulide 5 3.36

Ibuprofen 5 3.36

Ebrotidina 4 2.68

Azatioprina 4 2.68

Flutamida 4 2.68

Tetrabramato 4 2.68

Bentacepam 3 2.01

Diclofenac 3 2.01

Omeprazol 3 2.01

Tabla 22: Principios activos que predominan en nuestro estudio


164

Figura 25: Gráfico con las frecuencias de pacientes obtenidas según la etiología hepática

Figura 26: Gráfico con las frecuencias de pacientes obtenidas según el tipo de daño hepático

Según el patrón de lesión hepática, predominaron los pacientes cuyo

fármaco prescrito les provocó una lesión hepatocelular (75; 53.57%),

seguido de los que tuvieron daño mixto (33; 23.57%) y de daño hepático

colestásico (32; 22.86%) (Fig. 25).

Respecto a los mecanismos de lesión hepática (Fig. 26), la mayoría de las

RAH fueron reacciones idiosincráticas vía metabólica (107 casos,

76.42%), mientras que hubo 33 casos (23.58%) en las que se apreciaron

manifestaciones de hipersensibilidad como fiebre, rash y eosinofilia.

76%

24%

HipersensibilidadVía metabólica

54%

24%

23%

HepatocelularColestásicaMixta


165

En la tabla 23 se recogen todos los principios activos del estudio

relacionándolos según el tipo de daño hepático que producen y su y

mecanismo de lesión hepática. Del análisis de las características

demográficas, clínicas y bioquímicas de este grupo de pacientes que

sufrieron una reacción hepatotóxica y se incluyeron en el estudio,

debemos puntualizar que al ser una muestra aleatoria no resultó

sorprendente ver que esta población presentaba unas características

demográficas de fármacos involucrados, tipo de lesión y mecanismo

lesional superponibles a la población total (n = 400) de pacientes que

habían sufrido una RAH y se habían remitido al Registro de Hepatopatías

asociadas a medicamentos.

Podemos observar el predominio del daño hepático hepatocelular así

como el mecanismo de acción metabólico.


166

Mecanismos Tipo de daño hepático

Principio activo Hipersensibilidad Vía metabólica Colestásico Hepatocelular Mixto Acarbosa 1 1 Acido acetil salicílico 1 1 Acido Valproico 1 1 2 Acitromicina 1 1 Amitriptilina 2 2 Amoxicilina 2 2 3 1 Amoxicilina-Clavulánico 7 20 8 8 11 Ampicilina-Clavulánico 1 1 Anastrozol 1 1 Asparraginasa 1 1 Atorvastatina 1 1 Azatioprina 3 1 4 Bentazepam 3 2 1 Camelia sinensis 1 1 Captopril 1 1 Carbamacepina 2 1 3 Carbimazol 1 1 2 Casia angustifolia 1 1 Ceftriaxona 1 1 Celecoxib 1 1 Cinitaprida 1 1 Ciprofloxacina 1 1 Citalopram 1 1 Claritromicina 2 1 1 Clorpromacina 1 1 Clomifeno 1 1 Clopidogrel 1 1 Clotiazepam 1 1 Danazol 1 1 Diclofenaco 3 3 Diltiazem 1 1 Ebrotidina 4 4 Enalapril 1 1 Eritromicina 2 2 Estanozolol 1 1 Estramustina 1 1 Etinilestradiol 1 1 Extasis 1 1 Famotidina 1 1 Fenitoína 1 1 Fluorouracilo 1 1 Flutamida 4 2 2

Tabla 23: Relación entre los principios activos, daño hepático y mecanismos de acción


167

Mecanismos Tipo de daño hepático

Principio activo Hipersensibilidad Vía metabólica Colestásico Hepatocelular Mixto Gemfibrocilo 1 1 Glicofosfopeptical 1 1 Glucosaminoglican polisulfato 1 1 Ibuprofeno 1 4 2 3 Indometacina 1 1 Irbesartan 1 1 2 Isoniacida 2 2 Kava 1 1 Lamotrigina 1 1 Lansoprazol 1 1 Leflunomida 1 1 Losartán 1 1 Lovastatina 1 1 Metamizol sódico 1 1 Metformina 1 1 Midecamicina 1 1 Montelukast 1 1 Naproxeno 1 1 Nimesulida 3 2 1 4 Norfloxacina 1 1 Omeprazol 1 2 3 Paroxetina 1 1 Pirazinamida 1 1 Piroxicam 1 1 Propafenona 1 1 Ranitidina 2 1 1 Repaglinida 1 1 RIP+INH 1 1 RIP+INH+PIZ 2 1 1 Rofecoxib 1 1 Roxitromicina 1 1 Sertralina 1 1 Sinvastatina 1 1 Tamoxifeno 1 1 Tetrabamato 4 1 3 Tetracepam 1 1 Tibolona 1 1 Ticlopidina 2 2 Valeriana 1 1 Zafirlukast 1 1 Zolmitriptan 1 1

n = 84 n = 34 n = 116 n = 34 n = 80 n = 35


168

І.1.- Establecimiento de la Causalidad según la Escala de CIOMS

Hemos obtenido en total 149 evaluaciones de causalidad: 140 casos que

correspondieron a los 140 pacientes y 9 casos más que correspondieron a

los casos de pacientes que tomaban simultáneamente otro fármaco que

no podría descartarse fuera el causante de la RAH. Noventa y seis casos

fueron definidos y cincuenta y tres probables.

Casos Definidos Probables

149 96 53

ΙІ.- DISTRIBUCION DE LOS ALELOS HLA-DRB1* Y DQB1* ENTRE

PACIENTES Y CONTROLES

La distribución de los alelos HLA-DRB1 y DQB1 en los pacientes y

controles se muestra en la tabla 25. Se muestra una menor frecuencia de

DRB1*07 (22.9% vs. 35.4% en controles; p = 0.005) y DQB1*02 (43.6% vs

55.8%; p = 0.01) en los pacientes. También se observa un incremento en

Tabla 24: Resultados evolutivos según CIOMS


169

las frecuencias de DRB1*15 (37.1% vs 18.6% en controles) y DQB1*06

(50.7% vs 40.8). De todas formas, estas diferencias no son significativas.


Pacientes N (%)

p (pc)

DRB1*

DRB1*01 127 (20.00) 29 (20.70) NS

DRB1*15 118 (18.60) 38 (27.10) 0.025 (0.47)

DRB1*16 28 (4.40) 10 (7.10) NS

DRB1*03 160 (25.20) 32 (22.90) NS

DRB1*04 152 (23.90) 38 (27.10) NS

DRB1*11 143 (22.50) 23 (16.40) NS

DRB1*12 9 (1.40) 1 (0.70) NS

DRB1*13 146 (22.90) 38 (27.10) NS

DRB1*14 33 (5.20) 12 (8.60) NS

DRB1*07 225 (35.40) 32 (22.90) 0.0049 (0.09)

DRB1*08 30 (4.70) 5 (3.60) NS

DRB1*09 10 (1.60) 4 (2.90) NS

DRB1*10 23 (3.60) 6 (4.30) NS

DQB1*

DQB1*05 229 (36.10) 56 (40.00) NS

DQB1*06 259 (40.80) 71 (50.70) 0.035 (0.64)

DQB1*02 354 (55.80) 61 (43.60) 0.01 (0.18)

DQB1*03 342 (53.80) 73 (52.10) NS

DQB1*04 28 (4.40) 7 (5.00) NS

N = 635 N = 140

Tabla 25: Distribución de alelos HLA DRB1* y DQB1* en pacientes con enfermedad hepática idiosincrática debida a fármacos y comparándolos con los controles

*pc es la p corregida de Bonferroni (se aplica como factor de corrección 18, que es el número total de alelos diferentes comparados; NS = valor no significativo


170

0

5

10

15

20

25

30

35

40

DRB1*01 DRB1*15 DRB1*16 DRB1*03 DRB1*04 DRB1*11 DRB1*12 DRB1*13 DRB1*14 DRB1*07 DRB1*08 DRB1*09 DRB1*10

0

10

20

30

40

50

60

DQB1*05 DQB1*06 DQB1*02 DQB1*03 DQB1*04

Pacientes

Controles

Figura 27: Gráfico de comparación de las frecuencias (%) de los alelos HLA clase II DRB1* y DQB1*entre pacientes y controles

Alelos

Frecuencias

Frecuencias


171

ΙІΙ.- DISTRIBUCIÓN DE LOS ALELOS HLA DRB1* Y DQB1* SEGÚN

LOS LUGARES DE PROCEDENCIA DE LAS MUESTRAS

Tampoco se observan diferencias significativas al comparar los alelos

por sus diferentes lugares de procedencia.

Alelos Controles

N (%)

Málaga

N (%)

Almería

N (%)

Sevilla

N (%)

Granada

N (%)

Oviedo

N (%)

DRB1*

DRB1*01 127 (20.00) 4 (9.3) 8 (20.0) 9 (33.3) 4 (23.5) 4 (30.8)

DRB1*15 118 (18.60) 12 (27.9) 10 (25.0) 9 (33.3) 2 (11.8) 5 (38.5)

DRB1*16 28 (4.40) 3 (7.0) 2 (2.6) 3 (11.1) 1 (5.9) 1 (7.7)

DRB1*03 160 (25.2) 13 (30.2) 9 (22.5) 4 (14.8) 3 (17.6) 3 (23.1)

DRB1*04 152 (23.90) 10 (23.3) 10 (25.0) 9 (33.3) 7 (41.2) 2 (15.4)

DRB1*11 143 (22.50) 8 (18.6) 7 (17.5) 4 (14.8) 1 (5.9) 3 (23.1)

DRB1*12 9 (1.40) - 1 (2.5) - - -

DRB1*13 146 (22.90) 15 (34.9) 7 (17.5) 7 (25.9) 6 (35.3) 3 (23.1)

DRB1*14 33 (5.20) 3 (7.0) 3 (7.5) 3 (11.1) 3 (17.6) -

DRB1*07 225 (35.40) 7 (16.3) 14 (35.0) 4 (14.8) 4 (23.5) 3 (23.1)

DRB1*08 30 (4.70) 3 (7.0) 2 (5.0) - - -

DRB1*09 10 (1.60) 1 (2.3) 2 (5.0) - 1 (5.9) -

DRB1*10 23 (3.60) 1 (2.3) 2 (5.0) 2 (7.4) 1 (5.9) -

DQB1*

DQB1*05 229 (36.10) 11 (25.6) 15 (37.5) 16 (59.3) 9 (52.9) 5 (38.5)

DQB1*06 259 (40.80) 25 (58.1) 16 (40.0) 15 (55.6) 7 (41.2) 8 (61.5)

DQB1*02 354 (55.80) 19 (44.2) 20 (50.0) 9 (33.3) 6 (35.3) 7 (53.8)

DQB1*03 342 (53.80) 22 (51.2) 22 (55.0) 14 (51.9) 11 (64.7) 4 (30.8)

DQB1*04 28 (4.40) 3 (7.0) 4 (10.0) - - -

N =635 N = 43 N =40 N =27 N = 17 N = 13

Tabla 26: distribución de los alelos HLA DRB1* y DQB1* por provincias y comparándolos con los controles


172

ІV.- DISTRIBUCIÓN DE LOS ALELOS HLA DRB1* Y DQB1* SEGÚN EL

SEXO

El análisis de las frecuencias según sexo de los pacientes con RAH

debida a fármacos tampoco arrojó diferencias significativas entre

pacientes y controles


Hombre N (%)

Mujer N (%)

DRB1*

DRB1*01 127 (20.00) 10 (15.2) 19 (25.7)

DRB1*15 118 (18.60) 19 (28.8) 19 (25.7)

DRB1*16 28 (4.40) 5 (7.6) 5 (6.8)

DRB1*03 160 (25.20) 16 (24.2) 16 (21.6)

DRB1*04 152 (23.90) 16 (24.2) 22 (29.7)

DRB1*11 143 (22.50) 11 (16.7) 12 (16.2))

DRB1*12 9 (1.40) 1 (1.5) -

DRB1*13 146 (22.90) 19 (28.8) 19 (25.7)

DRB1*14 33 (5.20) 5 (7.6) 7 (9.5)

DRB1*07 225 (35.40) 15 (22.7) 17 (23)

DRB1*08 30 (4.70) 4 (6.1) 1 (1.4)

DRB1*09 10 (1.60) 1 (1.5) 3 (4.1)

DRB1*10 23 (3.60) 4 (6.1) 2 (2.7)

DQB1*

DQB1*05 229 (36.10) 25 (37.9) 31 (41.9)

DQB1*06 259 (40.80) 36 (54.5) 35 (47.3)

DQB1*02 354 (55.80) 28 (42.4) 33 (44.6)

DQB1*03 352 (53.8) 32 (48.5) 41 (55.4)

DQB1*04 28 (4.40) 5 (7.6) 2 (2.7)

n = 635 N = 66 N =74

Tabla 27: Distribución de los alelos DRB1*y DQB1* según el sexo y comparándolos con los controles


173

0

5

10

15

20

25

30

35

40


0

10

20

30

40

50

60


Hombres

Mujeres

Controles

Figura 28: Gráfico comparativo de frecuencias de los alelos HLA DRB1* y DQB1*según el sexo

Alelos

Alelos

Frecuencias

Frecuencias


174

V.- DISTRIBUCIÓN DE LOS ALELOS HLA DRB1* Y DQB1* SEGÚN EL

TIPO DE DAÑO HEPÁTICO


Hepatocelular N (%)

p (pc)

DRB1*

DRB1*01 127 (20.00) 16 (21.33) NS

DRB1*15 118 (18.60) 15 (20.00) NS

DRB1*16 28 (4.40) 9 (12.00) 0.07 (0.14)

DRB1*03 160 (25.20) 18 (24.00) NS

DRB1*04 152 (23.90) 23 (30.67) NS

DRB1*11 143 (22.50) 10 (13.33) NS

DRB1*12 9 (1.40) 1 (1.33) NS

DRB1*13 146 (22.90) 18 (24.00) NS

DRB1*14 33 (5.20) 5 (6.67) NS

DRB1*07 225 (35.40) 21 (28.00) NS

DRB1*08 30 (4.70) 2 (2.67) NS

DRB1*09 10 (1.60) 2 (2.67) NS

DRB1*10 23 (3.60) 5 (6.67) NS

DQB1*

DQB1*05 229 (36.10) 34 (45.33) NS

DQB1*06 259 (40.80) 31 (41.33) NS

DQB1*02 354 (55.80) 40 (53.33) NS

DQB1*03 352 (53.8) 37 (49.33) NS

DQB1*04 28 (4.40) 3 (4.00) NS

N = 635 N = 75

Tabla 28: distribución de las frecuencias de los alelos DRB1* y DQB1*de los pacientes con daño hepatocelular frente a los controles

*pc es la p corregida de Bonferroni (se aplica como factor de corrección 18, que es el número total de alelos diferentes comparados; NS = valor no significativo.


175


Colestásico N (%)

P (pc)

OR

DRB1*

DRB1*01 127 (20.00) 13 (20.0) NS

DRB1*15 118 (18.60) 23 (35.38) 0.0017 (0.03)

2.31

DRB1*16 28 (4.40) 1 (1.54) NS

DRB1*03 160 (25.20) 14 (21.54) NS

DRB1*04 152 (23.90) 15 (23.08) NS

DRB1*11 143 (22.50) 13 (20.00) NS

DRB1*12 9 (1.40) - -

DRB1*13 146 (22.90) 20 (30.77) NS

DRB1*14 33 (5.20) 7 (10.77) NS

DRB1*07 225 (35.40) 11 (16.92) 0.003 (0.059)

0.37

DRB1*08 30 (4.70) 3 (4.62) NS

DRB1*09 10 (1.60) 2 (3.08) NS

DRB1*10 23 (3.60) 1 (1.54) NS

DQB1*

DQB1*05 229 (36.10) 22 (33.85) NS

DQB1*06 259 (40.80) 40 (61.54) 0.001 (0.03)

2.32

DQB1*02 354 (55.80) 21 (32.31) 0.003 (0.007)

0.39

DQB1*03 352 (53.8) 36 (55.38) NS

DQB1*04 28 (4.40) 4 (6.15) NS

N = 635 N = 65

Tabla 29: Distribución de frecuencias de los alelos DRB1* y DQB1*de los pacientes con daño colestásico-mixto frente a los controles

*pc es la p corregida de Bonferroni (se aplica como factor de corrección 18, que es el número total de alelos diferentes comparados; NS = valor no significativo; OR = Odds ratio


176

Para la representación gráfica se han unido los casos de daño

colestásico con los de daño mixto, ya que en el estudio existe un

predominio del daño hepatocelular, con más del doble de los otros dos

daños considerados juntos. Según el tipo de daño hepático colestásico-

mixto (tabla 29), se ven las diferencias en los mismos alelos que vimos

en la tabla 25 de los pacientes frente a los controles, pero aquí los

resultados sí adquieren significación al corregirse por el número total de

alelos tipados. Están aumentadas las frecuencias de los alelos DRB1*15

(35.4% vs 18.6% en controles; p = 0.002; OR = 2.31{95% IC o intervalo

de confianza, 1.39-4.14}) y DQB1*06 (61.5% vs 40.8%; p = 0.001; OR =

2.32{95% IC, 1.39-3.92}). Por el contrario están disminuidas las

frecuencias de los alelos DRB1*07 (16.9% vs 35.4%; p = 0.003, OR =

0.37 {IC, 1.19-0.72}) y DQB1*02 (32.3% vs 55.8%; p = 0.0003; OR =

0.39 {95% IC, 0.22-065}). Es decir, el aumento en el haplotipo DRB1*15-

DQB1*06 así como la disminución en el haplotipo DRB1*07-DQB1*02 en

los pacientes con una posible RAH debida a fármacos, podría estar

relacionado con la adquisición de una lesión hepática de tipo colestásica-

mixta.

Las frecuencias de los alelos DRB1* y DQB1* entre pacientes y controles

según el tipo de daño hepatocelular fue muy similar, a excepción de un


177

aumento en la frecuencia de DRB1*16 del 12% comparada con un 4.4%

en los controles (pc = 0.14) (tabla 28).

Si nos fijamos en la última columna de la tabla 30, vemos que al

comparar los pacientes con daño colestático-mixto respecto a aquellos

que desarrollaron daño hepatocelular, se observan las mismas

asociaciones que identificamos entre el grupo de colestático-mixto y los

controles (tabla 29), pero sin alcanzar significación estadística.


178

0

5

10

15

20

25

30

35

40


0

10

20

30

40

50

60

70


Hepatocelular

Colestásico-Mixto

Controles

Figura 29: Gráfico comparativo de frecuencias de los alelos HLA DRB1* y DQB1* según el tipo de lesión hepática

Alelos

Alelos

Frecuencias

Frecuencias


179

VΙ.- DISTRIBUCIÓN DE LOS ALELOS HLA DRB1* Y DQB1* SEGÚN EL

MECANISMO DE LESIÓN HEPÁTICA

Según el mecanismo de lesión hepática, no existieron diferencias

significativas entre las frecuencias fenotípicas de los pacientes frente a

los controles. La mayoría de los pacientes responden a un daño hepático

metabólico (108 casos). Si nos fijamos en los casos de hipersensibilidad

(33), que son los que en teoría están más relacionados con el sistema

inmune, no se observan diferencias entre las frecuencias con respecto a

los controles.


180


Metabólica N (%)

Hiper sensibilidad N (%)

DRB1*

DRB1*01 127 (20.00) 20 (18.52) 10 (30.30)

DRB1*15 118 (18.60) 33 (30.55) 7 (21.21)

DRB1*16 28 (4.40) 8 (7.41) 2 (6.06)

DRB1*03 160 (25.20) 26 (24.07) 6 (18.18)

DRB1*04 152 (23.90) 29 (26.85 9 (27.27)

DRB1*11 143 (22.50) 20 (18.52) 3 (9.09)

DRB1*12 9 (1.40) 1 (0.92) -

DRB1*13 146 (22.90) 31 (28.70) 7 (21.21)

DRB1*14 33 (5.20) 9 (8.33) 3 (9.09)

DRB1*07 225 (35.40) 22 (20.37) 10 (30.30)

DRB1*08 30 (4.70) 3 (2.78) 3 (9.09)

DRB1*09 10 (1.60) 3 (2.78) 1 (3.03)

DRB1*10 23 (3.60) 5 (4.63) 1 (3.03)

DQB1*

DQB1*05 229 (36.10) 41 (37.96) 16 (48.48)

DQB1*06 259 (40.80) 58 (53.70) 13 (39.39)

DQB1*02 354 (55.80) 48 (44.44) 13 (39.39)

DQB1*03 352 (53.8) 58 (53.70) 15 (45.45)

DQB1*04 28 (4.40) 3 (2.78) 5 (15.15)

n = 635 n = 108 n = 33

Tabla 31: Distribución de frecuencias de alelos HLA DRB1* y DQB1* según la etiología hepática


181

0

5

10

15

20

25

30

35

40


0

10

20

30

40

50

60


Hipersensibilidad

Controles

Figura 30: Gráfico comparativo de frecuencias fenotípicas entre pacientes con hallazgos de hipersensibilidad frente a los controles

Alelos

Frecuencias

Frecuencias

Alelos


182

VΙІ.- DISTRIBUCIÓN DE FRECUENCIAS DE ALELOS HLA DRB1* Y

DQB1* POR GRUPOS FARMACOLÓGICOS


Antiinfecciosos N (%)

S.N.Central N (%)

Ap. Locomotor

N (%)

Ap Digestivo N (%)

DRB1*

DRB1*01 127 (20.00) 8 (18.6) 4 (17.4) 8 (40.0) -

DRB1*15 118 (18.60) 14 (32.6) 6 (26.1) 6 (30.0) 3 (21.4)

DRB1*16 28 (4.40) 1 (2.3) 3 (13.0) 2 (10.0) 3 (21.4)

DRB1*03 160 (25.20) 13 (30.2) 7 (30.4) 4 (20.0) 3 (21.4)

DRB1*04 152 (23.90) 11 (25.6) 5 (21.7) 5 (24.0) 3 (21.4)

DRB1*11 143 (22.50) 5 (11.6) 4 (17.4) 4 (20.0) 2 (14.3)

DRB1*12 9 (1.40) - - - -

DRB1*13 146 (22.90) 16 (37.2) 2 (8.7) 5 (25.0) 5 (35.7)

DRB1*14 33 (5.20) 2 (4.7) 1 (4.3) 1 (5.0) 2 (14.3)

DRB1*07 225 (35.40) 9 (20.9) 6 (26.1) 3 (15.0) 6 (42.9)

DRB1*08 30 (4.70) 3 (7.0) 1 (4.3) 1 (5.0) -

DRB1*09 10 (1.60) 1 (2.3) 2 (8.7) - -

DRB1*10 23 (3.60) - - 1 (5.0) 1 (7.1)

DQB1*

DQB1*05 229 (36.10) 11 (25.6) 8 (34.8) 12 (60.0) 6 (42.9)

DQB1*06 259 (40.80) 29 (67.4) 8 (34.8) 11 (55.0) 7 (50.0)

DQB1*02 354 (55.80) 21 (48.8) 11 (47.8) 6 (30.0) 9 (64.3)

DQB1*03 352 (53.8) 19 (44.2) 13 (56.5) 9 (45.0) 5 (35.7)

DQB1*04 28 (4.40) 3 (7.0) 1 (4.3) 2 (10.0) 1 (7.1)

n = 635 n = 43 n = 23 n =20 n =14

En el análisis de frecuencias no hubo diferencias significativas, tan solo

algunas diferencias más visibles debidas al tamaño muestral reducido.

Tabla 32: Distribución de frecuencias alélicas según los grupos farmacológicos predominantes


183

VІΙІ.- DISTRIBUCIÓN DE LAS FRECUENCIAS DE ALELOS HLA DRB1*

Y DQB1* EN LOS PACIENTES QUE TOMARON AMOXICILINA-

CLAVULÁNICO

VΙІΙ.1.- Características generales

En el presente estudio, la mayoría de los casos de amoxicilina-

clavulánico presentaron un patrón de lesión hepática colestásica-mixta

(Tabla 23). En la mayoría de ellos se prescribió este fármaco por

procesos infecciosos diversos: 16 por infección respiratoria, 3 por

infección urinaria y 2 por infección dentaria; el resto varían desde fiebre

hasta prostatectomía pasando por neumonía y lesión cutánea. La

duración del tratamiento osciló entre 2 días y 29 días, y en todos ellos no

existió otra medicación causante de la hepatotoxicidad. Tan solo en uno

de ellos hubo reexposición, y en su biopsia se detectó hepatitis

colestásica (Tabla 21).


184

VІΙΙ.2.- Distribución de Frecuencias

Al comparar con los resultados del estudio de Hautekeete y cols.

(Gastroenterology, 1999), en el presente estudio no se encuentra

asociación entre la hepatotoxicidad debida a amoxicilina-clavulánico y el

haplotipo HLA DRB1*1501-DQB1*0602. Curiosamente el grupo control de

la población belga era inferior en frecuencia al nuestro (DRB1*1501 15%

vs 18.60% nuestro, DQB1*06 30% vs 40.80%). En el estudio de

Hautekeete y cols., ellos encuentran una frecuencia de DRB1*15 del

57.1% frente al 33.3% nuestro y en el DQB1*06, un 62.8%, resultado más

igualado al nuestro que es de un 74.1%. No obstante, sí encontramos

diferencias significativas considerando independientemente el alelo

DQB1*06 (74.10% frente a un 40.80% de la población control).


185

Amoxcilina-clavulánico (Gastroenterology)

Amoxicilina-clavulánico (Nuestro estudio)

Alelos

Controles Pacientes Controles Pacientes p (pc) DRB1* DRB1*01 11 (18.3) 5 (14.3) 127 (20.0) 5 (18.52) NS DRB1*15 9 (15.0) 20 (57.1) 118 (18.6) 9 (33.33) NS DRB1*16 1 (1.7) 1 (2.9) 28 (4.4) - - DRB1*03 18 (30) 7 (20.0) 160 (25.2) 8 (29.63) NS DRB1*04 16 (26.7) 7 (20.0) 152 (23.9) 6 (22.22) NS DRB1*11 15 (25) 6 (17.0) 143 (22.5) 3 (11.11) NS DRB1*12 2 (3.3) 1 (2.9) 9 (1.4) - - DRB1*13 12 (20.0) 5 (14.3) 146 (22.9) 12 (44.44) 0.014

(0.26) DRB1*14 4 (6.7) 3 (8.6) 33 (5.2) 2 (7.41) NS DRB1*07 15 (25.0) 9 (25.7) 225 (35.4) 6 (22.22) NS DRB1*08 5 (8.3) 2 (5.7) 30 (4.7) 2 (7.41) NS DRB1*09 1 (1.7) - 10 (1.6) - DRB1*10 2 (3.3) - 23 (3.6) - DQB1* DQB1*05 19 (31.6) 9 (25.7) 229 (36.1) 7 (25.93) NS DQB1*06 18 (30.0) 22 (62.8) 259 (40.8) 20 (74.07) 0.0008

(0.015) DQB1*02 28 (46.7) 13 (37.1) 354 (55.8) 13 (48.15) NS DQB1*03 30 (50.0) 15 (43.0) 342 (53.8) 12 (44.44) NS DQB1*04 4 (6.7) 1 (2.9) 28 (4.4) 1 (3.70) NS n = 60 n = 35 n = 635 n = 27

Tabla 33: Tabla comparativa de distribución de alelos HLA DRB1* y DQB1* en nuestro estudio y en el de Hautekeete y cols.(Gastroenterology, 1999)

*pc es la p corregida de Bonferroni (se aplica como factor de corrección 18, que es el número total de alelos diferentes comparados); NS = valor no significativo


186

05

1015202530354045

DRB1*01 DRB1*15 DRB1*16 DRB1*03 DRB1*04 DRB1*11 DRB1*13

PacientesControles

0

10

20

30

40

50

60

DRB1*01 DRB1*15 DRB1*16 DRB1*03 DRB1*04 DRB1*11 DRB1*13

Pacientes(Hautekeete)controles (Hautekeete)

Figura 31: Gráfico comparativo de frecuencias DRB1 entre los pacientes de Hautekeete y sus controles frente a los pacientes y controles de este estudio

Alelos

Alelos

Frecuencias

Frecuencias


187

01020304050607080


PacientesControles

010203040506070


Pacientes (Hautekeete)Controles (Hautekeete)

Figura 32: Gráficos comparativos de frecuencias DQB1 entre los pacientes de Hautekeete y sus controles frente a los pacientes y controles de este estudio

Alelos

Alelos

Frecuencias

Frecuencias


188

DRB1*15-DQB1*06 Amoxicilina-clavulánico Características Presente

n = 9 Ausente n =18

p

Edad (años) 57.56 ± 15.96 55.33 ± 19.91 0.774 Sexo masculino 3 (21.43%) 11 (78.57%) Sexo femenino 6 (46.15%) 7 (53.85%)

0.173

Dosis de fármaco ingerido(grs) 1543.75± 90.38 1423.61± 723.98 0.648 Duración del tratamiento (días) 9 ± 7.84 10.33 ± 5.67 0.617 Presencia de hipersensibilidad 1 (16.6%) 5 (83.4%) 0.326 Presencia de eosinofilia 1 (14.29%) 6 (85.71%) 0.214 Presencia de daño colestásico-mixto 6 (31.87%) 13 (68.42%) Presencia de daño hepatocelular 3 (37.5%) 5 (62.5%)

0.766

No se observaron diferencias significativas cuando comparamos las

frecuencias de las características de edad, sexo, dosis de fármaco ingerido,

duración de tratamiento, tipo de daño hepático o mecanismo lesional de acción,

entre pacientes tratados con amoxicilina-clavulánico y que poseían el haplotipo

DRB1*15-DQB1*06 y los que carecían de dicho haplotipo.

Tabla 34: Comparación de las características clínicas, biológicas e histológicas entre pacientes tratados con amoxicilina-clavulánico que poseen los alelos DRB1*15-DQB1*06 y los que carecen de dichos alelos

CAPÍTULO VI

DISCUSIÓN

CAPITULO VI - DISCUSIÓN

189

DISCUSIÓN

La función de las moléculas HLA en la activación y desarrollo de la respuesta

inmune, así como el alto grado de conocimiento genético y molecular que

existe del Sistema Mayor de Histocompatibilidad, ha determinado el

desarrollo de estudios que intentan establecer una asociación entre las

moléculas HLA y patologías de diverso origen, como las de origen

autoinmune, infeccioso y alérgico. Todos estos estudios tienen como fin

último proporcionar una base genética para la explicación de la patogénesis y

la susceptibilidad a su desarrollo en determinados individuos.

Las implicaciones del sistema inmune en la patogénesis de la

hepatotoxicidad idiosincrásica se han supuesto de manifiesto en evidencias

aisladas tanto clínicas como histopatológicas. Entre las evidencias

histopatológicas destacan la presencia de infiltrados leucocitarios en las

biopsias hepáticas de los pacientes afectados o inflamación portal con daño

focal en conductos biliares interlobulares (Farrell, 1994).

Entre las evidencias clínicas destacan la presencia, en determinados casos,

de signos de hipersensibilidad (eosinofilia, rash, fiebre, IgE elevada,


190

exantema....), así como la presencia de memoria, es decir, un daño hepático

más rápido y efectivo tras la reexposición al fármaco.

Pero generalmente no existe una clara distinción entre mecanismos

idiosincrásicos de tipo metabólico e inmunoalérgico, ya que ambos


intensidad. Por ejemplo, en casos como el halotano, un determinado defecto

genético en su metabolismo puede disminuir la inactivación o aumentar la

producción de metabolitos reactivos, y esto supondría un aumento de las

uniones covalentes a proteínas plasmáticas, y por lo tanto, del estímulo inicial

de la inmunización (Berson, 1994).

Las moléculas HLA se caracterizan por su elevado polimorfismo, es decir,

por la existencia de una gran cantidad de variantes alélicas de cada gen. El

polimorfismo de las moléculas HLA implica que una variante alélica se unirá

preferentemente a un grupo concreto de péptidos antigénicos cuya estructura

comparta determinadas secuencias críticas llamadas residuos de anclaje. Es

por ello plausible que determinantes variantes alélicas estén asociadas a la

posibilidad a desarrollar también determinadas enfermedades. Así, se ha

descrito la asociación de los alelos DR3 y DQ2 en pacientes con shock

anafiláctico tratados con carbamacepina, o también la asociación de A29-


191

B12-DR7 con sulfonamidas (Pirmohamed, 2001), todos ellos por métodos

serológicos.

Nuestro estudio ha pretendido ahondar más en la relación entre el genotipo

HLA de clase II y la susceptibilidad individual o resistencia a desarrollar

enfermedad hepática idiosincrásica debida a fármacos, utilizando para ello un

número notable de pacientes procedentes de diferentes provincias (Málaga,

Granada, Sevilla, Almería y Oviedo) a los cuales se les diagnosticó una

hepatotoxicidad idiosincrásica debida a fármacos. La dificultad en conseguir

un número suficiente de casos con diagnóstico de dicha enfermedad ha

limitado hasta ahora el análisis de estudios de estas características. Además,

la hepatotoxicidad idiosincrásica debida a fármacos es un reto para los

investigadores clínicos debido a sus a veces inespecíficas manifestaciones

clínicas, al tratarse de un diagnóstico de exclusión y al carecer de

marcadores específicos, y al pobre conocimiento del mecanismo implicado

en el tejido dañado.

El hecho de que la hepatotoxicidad idiosincrásica sea un fenómeno raro o

poco frecuente, podría explicarse en base a que los individuos portadores de

determinados alelos HLA fuesen mas suceptibles de acoplar los

neoantígenos a sus alelos y así ser reconocidos por los linfocitos T


192

específicos. Por tanto, si se pusiese de manifiesto esta asociación, podrían

utilizarse las moléculas HLA como marcadores de riesgo.

En el presente estudio, se ha conseguido reunir 140 pacientes que

desarrollaron una reacción adversa hepatotóxica debida a distintos fármacos,

y el resultado de nuestros ensayos sugiere que no existe una asociación

entre un determinado alelo HLA clase II específico y la tendencia a

desarrollar una hepatotoxicidad idiosincrásica debida a fármacos.

Uno de los primeros intentos de establecer asociación del HLA con

reacciones hepatotóxicas frente a diversos fármacos fue el trabajo de Berson

y cols. (1994), con 75 casos de Reacciones Adversas Hepatotóxicas (RAH)

debida a distintos tipos de fármacos y usando metodología serológica,

aunque había pocos alelos HLA definidos en aquella época y por tanto

podían “escaparse” asociaciones. En sus resultados no encuentra asociación

entre toda la población afectada moléculas de HLA, pero no obstante

manifiesta una mayor prevalencia de algunos alelos HLA con fármacos

concretos, aunque debido al escaso tamaño muestral, esta asociación no fue

significativa.

Además, hay que tener en cuenta que los métodos serológicos no son tan

resolutivos para establecer asociaciones como los genotípicos usados en


193

estudios posteriores, y pueden darse reacciones cruzadas entre alelos de un

mismo grupo (ej.: DR2 incluye a los alelos de DRB1* 13 y 14).

Usando metodología genética DNA (sequence-specific oligonucleotide o

SSOP), de mayor sensibilidad que las serológicas empleadas por Berson y

cols.(1994), en la actualidad identificamos un mayor número de alelos,

existiendo así una menor probabilidad de perder asociaciones. Así pues,

coincidimos en la mayor frecuencia de alelos HLA con fármacos individuales:

DRB1*14-DQB1*05 en pacientes tratados con flutamida o DRB1*13 en los

tratados con amoxicilina-clavulánico, pero estos resultados no adquieren

significación por lo que podrían tratarse de resultados al azar.

Por tanto, al igual que Berson y cols., en el presente estudio no se ha

encontrado asociación entre alelos HLA DRB1 y DQB1 y la propensión al

desarrollo de hepatotoxicidad idiosincrásica debida a fármacos.

No obstante, al analizar los datos según el tipo de daño desarrollado,

conforme a criterios bioquímicos, sí se produce una evidencia de asociación

entre los alelos HLA-DRB1*15 y DQB1*06 y la expresión del daño hepático

colestásica-mixto, así como una reducción en la frecuencia de los alelos

DRB1*07 y DQB1*02. Esto sugiere la idea de que los alelos DRB1*15 y


194

DQB1*06 confieren susceptibilidad a sufrir daño hepático colestásico-mixto,

así como DRB1*07 y DQB1*02 serían alelos protectores para dicha

enfermedad. Tomando en consideración que un fármaco puede causar

diferentes tipos de daño hepático, nuestros hallazgos sugieren que la

expresión de un particular tipo de daño hepático tras la ingesta de un

fármaco observado en un determinado paciente podría estar ligada, al menos

en parte, a un determinado genotipo HLA heredado. Aunque debido al gran

desequilibrio de unión dentro de la región del cromosoma 6, es difícil

identificar si la susceptibilidad a sufrir daño colestásico/mixto está en

relación con el alelo dominante o más bien con la unión de alelos (haplotipo)

dentro de la misma zona.

Debe tenerse en cuenta de que las frecuencias de los alelos HLA de clase II

DRB y DQB fue similar en el grupo de pacientes con tipo de daño

hepatocelular con respecto a la población control. Y al compararse entre sí

ambos grupos, hepatocelular y colestásico-mixto, no se observaron

diferencias significativas entre estos grupos en la distribución de las

moléculas HLA DRB1 y DQB1 las frecuencias de alelos, lo cual pudiera ser

debido probablemente al pequeño número de casos de cada subgrupo de

alelos DR o DQ comparado con el conjunto total de alelos HLA de clase II


195

analizados. De todos modos, un estudio con un número de muestras aún

mayor que éste conllevaría una gran dificultad de llevarse a cabo.

Es importante resaltar que en el daño colestásico-mixto se produce un

deterioro en la formación y/o transporte de bilis debido a una modificación en

las proteínas transportadoras del canalículo biliar a causa del fármaco o su

metabolito reactivo formado a través del metabolismo del CYP (Bissell DM et

al., 2001). Influencias genéticas, incluyendo variaciones en los

transportadores canaliculares y también en citokinas/chemokinas y

receptores, mediadores inflamatorios y alelos o haplotipos específicos HLA,

podrían estar implicados en la susceptibilidad a desarrollar hepatotoxicidad

de tipo colestásica (Kaplowitz N, 2003). La haptenización de los

intermediarios tóxicos en el canalículo podría dar lugar a una respuesta

inmune directa contra las células del epitelio biliar ductal. Este proceso podría

ser favorecido por alelos específicos HLA de clase II.

Sin duda, las moléculas de clase II han sido identificadas como una fuente

determinante en el inicio de otros daños colestásicos de base autoinmune.

Hay evidencias de asociación genética entre el serotipo HLA-DR2 (que

comprende todos los alelos DRB1*15 y DRB*16) y la cirrosis biliar primaria

(Miyamori H et al., 1983), y también entre los alelos DR2 y DR3 y la


196

colangitis esclerosante primaria (Donaldson PT et al., 1991). Un incremento

en la expresión de HLA-DR ha sido también descrita tanto en la cirrosis biliar

primaria (Yasoshima et al., 1995) como en la colestasis debida a fármacos

(Barbatis et al., 1987).

Podríamos especular con que la presentación restrictiva de los epitopos

fármaco-proteína mediante el HLA a los receptores de las células T para dar

lugar a la subsecuente respuesta inmune y el daño a los ductus biliares, sería

más eficiente en pacientes con los alelos HLA-DRB1*15 y DQB1*06,

poseyendo dichos pacientes una mayor probabilidad de sufrir esa particular

expresión de la hepatotoxicidad. Sin embargo, hay que tener en cuenta que

estas expresiones genotípicas no explican todos los casos de pacientes con

daño colestásico-mixto de nuestro estudio; por lo tanto, las observaciones

manifestadas deberían de ser producidas además por la actividad de otro

gen (o genes) en desequilibrio de unión dentro de la región del cromosoma 6

(Park BK et al., 2000). Así, no podríamos descartar que existieran

asociaciones significativas también con alelos HLA de clase I.

Por otro lado la asociación negativa de los alelos DRB1*07 y DQB1*02 y el

daño colestásico mixto, sugiere tanto individualmente como en combinación

que ambos son alelos protectores. Es interesante destacar que en pacientes

que recibieron quimioterapia antituberculosa, el análisis del HLA de clase II


197

reveló que la asociación de alelos DQB1*0201-DRB1*0301 y DRB1*0701

ocurrió más frecuentemente en aquellos que desarrollaron hepatotoxicidad

(de tipo hepatocelular en todos los casos) que en pacientes que no sufrieron

una reacción adversa (Sharma SK et al., 2002).

Tampoco en nuestro estudio se encontraron diferencias de frecuencias entre

alelos en pacientes con hepatotoxicidad debido a fármacos, cuando se hizo

el análisis tanto por sexo, por lugar de procedencia de las muestras o por la

presencia de manifestaciones de hipersensibilidad. Estos hallazgos

representaron una sorpresa ya que si consideramos que las manifestaciones

de hipersensibilidad son una evidencia indirecta de una reacción mediada por

el sistema inmune, debería de haberse encontrado algún tipo de asociación.

No obstante, ha sido demostrado que las respuestas del tejido hepático

frente a la eosinofilia son tardías e inespecíficas (Pham BN et al., 2001).

Tampoco han sido establecidos marcadores consistentes inmunológicos o

funcionales para la toxicidad mediada por el sistema inmune. Y a pesar de

que una más exacta clasificación de pacientes con hepatitis inmunoalérgica

necesitaría determinar en suero autoanticuerpos específicos (Larrey D,

2000), y quizás realizar un test de transformación linfocitaria in vitro (Maria

VA and Vitorino RM, 1998), ésto no resultaría demasiado factible desde un

punto de vista práctico.


198

Recientemente, se han publicado dos trabajos en los que se pone de

manifiesto la asociación de un determinado haplotipo HLA y hepatotoxicidad

(Hautekeete et al 1999; Gastroenterology) o ictericia (O´Donohue et al 2000

Gut) inducida por amoxicilina clavulánico. En ambos trabajos la suceptibilidad

al desarrollo de hepatotoxicidad se asoció al haplotipo DRB1*1501-

DRB5*01-DQB1*0602. No obstante, la presencia de este haplotipo en los

pacientes afectados no explicó ni la presentación clínica ni las

manifestaciones de la hepatotoxicidad inducida por amoxicilina-clavulánico, y

curiosamente solo se asoció significativamente con el tipo de daño mixto

entre pacientes que presentaban el haplotipo.

Igualmente en nuestra serie, el fármaco que aisladamente se asoció a más

casos de hepatotoxicidad fue la amoxicilina-clavulánico (27 pacientes,

12.5%). Pero un análisis de la distribución de las frecuencias HLA de clase II

en los pacientes con amoxicilina-clavulánico, demostró solo una alta

frecuencia en los alelos DQB1*06 (74.07% vs 40.8%, pc=0.015). Una posible

explicación esta discrepancia entre los resultados fenotípicos de los

estudios belga e inglés (Hautekeete et al., 1999; O´Donohue et al., 2000) y el

nuestro, estriba en el diferente tipo de daño hepático producido por

amoxicilina-clavulánico en nuestros pacientes con respecto a los de ellos. A


199

diferencia del estudio belga y del inglés, que estaban casi exentos de casos

de daño hepatocelular (4/35, 11% y 1/22, 5%; respectivamente), este tipo de

daño estuvo presente en el 30% de nuestros pacientes. Es interesante

resaltar que en el estudio belga (Hautekeete et al., 1999) la presencia de

dicho haplotipo no tuvo influencia en la evolución clínica, bioquímica e

histológica, a excepción de un significativo gran número de pacientes con el

tipo de daño hepático colestásico-mixto entre aquellos que poseían el

haplotipo.

Parece razonable pensar que los alelos DRB1*15 y DQB1*06 puedan estar

ligados al daño colestásico-mixto pero no a la predisposición a sufrir

hepatotoxicidad debida a algún fármaco específico.

En conclusión, nuestros resultados soportan el hecho de que los alelos del

sistema HLA de clase II DRB1*15 y DQB1*06 podrían participar en el

incremento de la susceptibilidad a desarrollar daño hepático colestásico-

mixto en la hepatotoxicidad debida a fármacos, mientras los alelos DRB1*07

y DQB1*02 parecen ser protectores. Así pues, los alelos HLA de clase II

podrían ser importantes para explicar porqué un fármaco concreto puede

causar diferentes tipos de daño hepático.

TCTCTHTH

IL-2IL-2

IL-2IL-2

INF-gammaINF-gamma

IL-3, 4..etc.IL-3, 4..etc.

LBLB

HEPATOCITOHEPATOCITO

COLANGIOCITOCOLANGIOCITO

LA IMPLICACIÓN DE LAS MOLÉCULAS HLA DE CLASE II EN LA PRODUCCIÓN DE DAÑO COLESTÁSICO-MIXTO PODRÍAMOS RESUMIRLA DE LA SIGUIENTE MANERA:

Las células del epitelio biliar no expresan normalmente las Moléculas del Sistema Mayor de Histocompatibilidad de clase II. Pero tras una respuesta inflamatoria inicial, los

colangiocitos pueden convertirse en células presentadoras de antígenos no profesionales, expresando HLA de clase II.

Esto haría que en dichos pacientes se reconociesen de forma específica los metabolitos reactivos derivados del fármaco, es decir, se produciría la expresión de un péptido

inmunogénico mucho más eficiente, que sería reconocido por los linfocitos T CD4+ o T helper, los cuales a través de la liberación de una serie de citokinas se activarían a sí

mismos y además proporcionarían ayuda local a otras células efectoras del sistema inmune cercanas.

Por ejemplo, los linfocitos T CD8+ reconocerían los metabolitos reactivos unidos al HLA de clase I, que se encuentran normalmente expresados en la superficie de los

hepatocitos. Otro tipo de células efectoras son los linfocitos B, que con la ayuda local de citokinas segregarían una serie de anticuerpos específicos que reconocerían los

neoantígenos generados por el fármaco y dispuestos en la superficie tanto de hepatocitos como de colangiocitos.

Así, tras la acción de las células inmunológicas o linfocitos se produciría el daño a los ductus biliares y por tanto, el daño hepático de tipo colestásico-mixto.

Pero no en todos los pacientes que sufrieron daño colestásico-mixto se produjo esa expresión tan significativa de los alelos DRB1*15 y DQB1*06. Así pues, esta asociación

podría ser un fenómeno secundario asociado a la inflamación, y la prevalencia de los alelos HLA de clase II podría estar relacionada más bien con la existencia de un gran

desequilibrio de unión dentro de la región del cromosoma 6, lo cual hace que no pudiésemos descartar asociaciones con otros alelos como los de clase I u otros diferentes del

HLA e implicados por ejemplo en el metabolismo de los fármacos, y así juntos estarían implicados en la posibilidad a desarrollar daño colestásico-mixto en la hepatotoxicidad

por fármacos.

Pero no en todos los pacientes de nuestro estudio que sufrieron daño colestásico-mixto se produjo esa expresión tan significativa de los alelos DRB1*15 y DQB1*06. Así pues,

esta asociación podría ser un fenómeno secundario asociado a la inflamación, y la prevalencia de los alelos HLA de clase II podría estar relacionada más bien con la

existencia de un gran desequilibrio de unión dentro de la región del cromosoma 6, lo cual hace que no pudiésemos descartar asociaciones con otros alelos como los de clase I

u otros diferentes del HLA e implicados por ejemplo en el metabolismo de los fármacos, y así juntos estarían implicados en la posibilidad a desarrollar daño colestásico-mixto

en la hepatotoxicidad por fármacos.

CAPÍTULO VII

CONCLUSIONES

CAPITULO VII – CONCLUSIONES

200

CONCLUSIONES

1. No se ha podido establecer la existencia de una asociación entre los

antígenos de histocompatibilidad de clase II del huésped y el desarrollo

de hepatotoxicidad por fármacos, independientemente de si esta

reacción adversa está mediada por un mecanismo inmunoalérgico o

metabólico. Tampoco se ha observado esta asociación para fármacos

específicos como amoxicilina-clavulánico, que representa la serie mas

amplia (n=27).

2.- Los alelos DRB1*15 y DQB1*06 confieren una mayor susceptibilidad

al daño hepático de tipo colestásico-mixto, definido por criterios

bioquímicos, en tanto que los alelos DRB1*07 y DQB1*02 serían alelos

protectores frente a este tipo de lesión.

3.- Dado que esta asociación no explica todos los casos de expresión del

daño hepático colestásico-mixto, la actividad de otros gen(es) heredados

en desequilibrio de unión dentro de esta región del cromosoma 6,

podrían así mismo estar implicados en dicho fenómeno.

CAPITULO VII – CONCLUSIONES

201

4.- La influencia genética ligada a las moléculas de histocompatibilidad

HLA de clase II podría favorecer determinadas vías patogénicas y

explicar, al menos en parte, por qué un determinado fármaco causa

distintos tipos de daño hepático en diferentes pacientes.

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CAPÍTULO VIII

BIBLIOGRAFÍA

CAPITULO VIII - BIBLIOGRAFÍA

202

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DEBIDA A FÁRMACOS”(Hepatology 2004, en prensa)

Departamento de Farmacología y PediatríaFACULTAD DE MEDICINA. UNIVERSIDAD DE MÁLAGA

BECA FISS nº 01/1088

Causa retirada de fármacos del mercado

Ausencia marcadores diagnósticos específicos

Expresión clínico-patológica inespecífica

Dificultad identificación en desarrollo

Importancia identificar factores de riesgo

HEPATOPATÍAS TÓXICAS

FARMACOMETABOLITO

REACTIVOCYP

GlucuronidasaGSH transferasaEpóxido hidrolasa

Necrosis Colestasis

Hepatocito

GenesEnfermedadpreexistente

EdadSexo

Interacciónmedicamentosa

AlcoholObesidad

+/-+/-

+/- +/- +

?

?Desnutrición

-

Lesión inmune

MitocondriaColangiocito

CONJUGACION

Riñón

Hepatocito Colangiocitos

Bilis

TOXICO HAPTENO

RESPUESTA INMUNE

Metabolito

NecrosisTNF_, Fas

y Apoptosis

Circunstancias que modifican la susceptibilidad a presentar daño hepático debido a fármacos

Potencial Tóxicodel Fármaco

metabolitos reactivosacylglucuronidoefectos mitocondriales

Factores Genéticos

metabolismo del fármacodetoxificacióntransporteotros

Factores medioambientales

otros fármacosetanoledadenfermedad subyacente

Deficiencia en: CYP 2D6 Perhexilina CYP 2C19 Tetrabamato (AtriumR) NAT2 Sulfonamidas, dihidralacina Epoxido hidrolasa Fenitoína, carbamacepina

Formación de autoanticuerpos: Anti CYP 1A2 Dihidralacina Anti CYP 2E1 Halotano Autoanticuerpos anti-M6 Iproniazida Anticuerpos anti-LKM2 Ac. Tienílico Autoanticuerpos antimicrosomas Anticonvulsivantes Antimicrosomal epóxidohidrolasa Germander

FACTORES GENÉTICOS QUE CONTRIBUYEN A LAHEPATOTOXICIDAD

Hepatocito

Células Kuppfer, célulasendoteliales sinusoidales,linfocitos B

Linfocitos T CD8+

Citotoxicidad

Linfocitos T CD4+

Expansión clonal :- Linfocitos T CD8+- Linfocitos B- Citokinas

PRESENTACIÓN

PRESENTACIÓN

HLA clase I

HLA clase II

FUNCIÓN DEL MHC

CITOTOXICIDAD (T CD8+)INFLAMACIÓN (CITOKINAS)PRODUCCIÓN Igs (Linf. B)

LINFOCITO T CD4+

PRESENTACIÓN

MOLÉCULA HLADE CLASE IICADENA α Y β

PÉPTIDOANTIGÉNICO

ACTIVACIÓN

ANTÍGENOS

PROCESAMIENTOANTIGÉNICO

CARGA DELANTÍGENO

TRANSCRIPCIÓNGÉNICA

(_ TA M)

RECEPTORTCR

MOLECULA MHC (HLA CLASE II)MOLECULA MHC (HLA CLASE II)

POLIMORFISMO DE LAS MOLÉCULAS HLA

DRB1*01 DRB1*04 DRB1*15

ASOCIACIÓN HLA Y REACCIONES ADVERSAS

FÁRMACO REACCIÓNADVERSA

ASOCIACIÓN HLA

Carbamazepina Reacciónanafiláctica

DR3, DQ2

Sulfonamidas Necrolisisepidérmicatóxica

A29, B12, DR7

Clozapina Agranulocitosis B38, DR4, DQ3

Dipirona Agranulocitosis A24, B7, DQ1Pirmohamed, 2001

Estudios aislados.Pocos casos. Métodos serológicos.Necesidad de confirmación.

MOLÉCULAS HLA Y HEPATOTOXICIDAD

FÁRMACO

Halotano (n=17)Nitrofurantoína (n=9)

A. tricíclicos (n=12)

Diclofenaco (n=4)

Clorpromacina (n=5)

Amoxi-Clav. (n=35)

Amoxi-Clav. (n=22)

HLA

A11DR6, DR2

A11

A11

DR6

DRB1*1501DQB1*0602DRB1*1501

AUTOR

Eade et al. Tissue Antigens(1981)

Stricker et al. Hepatology (1988)

Berson et al.J Hepatol. (1994)

Hautekeete et al.Gastroenterology (1999)O´Donohue et al.,Gut (2001)

MÉTODOS SEROLÓGICOS; POCOS CASOS; NO ASOCIACIÓN SIGNIFICATIVA

MÉTODOS GENOTÍPICOS; ASOCIACIÓN SIGNIFICATIVA

OBJETIVOS1- Determinar si existe asociación entre losantígenos de histocompatibilidad de clase II delhuesped y el desarrollo de hepatotoxicidadidiosincrásica debida a fármacos.

2- Determinar si existe una relación entre losantígenos de histocompatibilidad de clase II y losmecanismos de producción de hepatotoxicidadidiosincrásica, así como con la expresiónbioquímica de la lesión: daño hepatocelular,colestásico o mixto.

DISEÑO DE ESTUDIO: prospectivo de corte transversal.

IMPUTABILIDAD DIAGNÓSTICA: Escala de CIOMS

COMITÉ ÉTICO LOCAL DE HOSPITAL VIRGEN DE LA VICTORIA

CLASIFICACIÓ N FÁRMACOS: Anatomical Therapeutic Classification(WHO,1997)

MECANISMO DE LESIÓN: Intrinseco: dependiente de la dosis ( y duración ) del tratamiento Idiosincrático: susceptibilidad individual, impredecible

CLASIFICACIÓN DE LA LESIÓN HEPÁTICA: Conferencia Internacionalde Consenso

MATERIAL Y MÉTODOS I

Daño hepatocelular: Aumento > 2N ALT ó si R ≥ 5.

Daño hepático colestásico: Aumento > 2N FAS ó si R ≤ 2.

Daño hepático mixto: Aumento > 2N ALT y FA. y R es > 2 y < 5.

N: Límite superior del valor normal. BC: Bilirrubina conjugada.BT: Bilirrubina total. ALT: Alanin-aminotransferasa.AST: Aspartatoaminotransferasa. FA: Fosfatasa Alcalina.R: Relación ALT / FA.

CLASIFICACION DAÑO HEPATICO(Conferencia Internacional de Consenso, 1993)

PROTOCOLO ESTRUCTURADO:

Variables demográficas Análisis medicación Curso episodio Exclusión causas alternativas

PACIENTES:

Criterios de inclusión: Casos probables o definidos

Criterios de exclusión: Casos posibles e indefinidos Alteración biológica Mecanismo intrínseco

MATERIAL Y MÉTODOS II

PACIENTESPACIENTES 157 157


TOXICIDAD INTRTOXICIDAD INTRÍÍNSECANSECA 4 4


CAUSAS ALTERNATIVASCAUSAS ALTERNATIVAS 13 13

DEFINIDOSDEFINIDOS 96 96

Exclusión

Exclusión

PROBABLESPROBABLES 53 53

MATERIAL Y MÉTODOS III

EXTRACCIÓN DE ADN: Método Salting Out a partir de sangre periférica

TIPAJE GENÓMICO HLA DQB Y DRB: Por reacción en cadena de la polimerasa y cebadores específicos; PCR- SSO (Sequence Specific Oligonucleotide)

ESTADÍSTICA: Estadística descriptiva Test de Chi Cuadrado, corrección de Yates Test exacto de Ficher para comparar proporciones P corregida de Bonferroni < 0,05 OR e IC para estimar fuerza de asociación

RESULTADOS

? 140 MUESTRAS: ? 635 CONTROLES:Málaga (n=43) Málaga (n=160)Almería (n=40) Sevilla (n=195)Sevilla (n=27) Granada (n=105)Granada (n=17) España (n=176)Oviedo (n=13)

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

20-30 30-40 40-50 50-60 60-70 70-80 80-90

Hombre Mujer

Incidencia

Edad

Incidencia de hepatopatía tóxica por edad y sexo

(54%)

(23%)

(23%)

Tipo de daño

(24%)

(76%)

Carece HipersensibilidadPresenta Hipersensibilidad

HepatocelularColestásicaMixta

Mecanismo

GRUPOS FARMACOLÓGICOS IMPLICADOS

APARATO DIGESTIVO Y

METABOLISMO10%

ANTIINFECCIOSOS VIA ORAL

30%

APARATO LOCOMOTOR

14%

SISTEMA NERVIOSO CENTRAL

16%

VARIOS24%

ANTINEOPLÁSICO9%

PRINICIPIOS ACTIVOS INVOLUCRADOS EN RAHPRINICIPIOS ACTIVOS INVOLUCRADOS EN RAH

Amoxicilina-Ac. Clavulánico: 27 (18,12%) Nimesulide: 5 (3,3%) Ibuprofeno: 5 (3,3%) Ebrotidina: 4 (2,7%) Azatioprina: 4 (2,7%) Flutamida: 4 (2,7%) Tetrabamato: 4 (2,7%) Bentacepam: 3 (2,01%) Diclofenac: 3 (2,01%) Omeprazol: 3 (2,01%)

0

10

20

30

40

50

60


PACIENTES

CONTROLES

0

5

10

15

20

25

30

35

40

DRB1*01 DRB1*15 DRB1*16 DRB1*03 DRB1*04 DRB1*07 DRB1*11 DRB1*13

DISTRIBUCIÓN DE FRECUENCIAS DE ALELOS HLACLASE II EN POBLACIÓN TOTAL (n=140)

DRB1*

DQB1*

0

10

20

30

40

50

60

70


PACIENTES

CONTROLES

0

5

10

15

20

25

30

35

40


DRB1*

DQB1*

DISTRIBUCIÓN DE FRECUENCIAS DE ALELOS ENPACIENTES PATRÓN COLESTÁSICO-MIXTO (n=65)

0

10

20

30

40

50

60


PACIENTES

CONTROLES

0

5

10

15

20

25

30

35

40


DISTRIBUCIÓN DE FRECUENCIAS DE ALELOS ENPACIENTES DAÑO HEPATOCELULAR (n= 75).

DRB1*

DQB1*

0

10

20

30

40

50

60

70

DRB1*15 DQB1*06 DRB1*07 DQB1*02

Control

Chol-mixed

Hcell

Pc = 0.03

Pc = 0.03

Pc = 0.059

Pc = 0.007

(%)

Andrade et al,2003

0

10

20

30

40

50

60


PACIENTES

CONTROLES

0

5

10

15

20

25

30

35

40


DISTRIBUCIÓN DE FRECUENCIAS DE ALELOS ENPACIENTES CON HIPERSENSIBILIDAD (n=33).

DRB1*

DQB1*

0

10

20

30

40

50

60

70

80


PACIENTES

CONTROLES

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50


DISTRIBUCIÓN DE FRECUENCIAS DE ALELOS ENPACIENTES CON AMOXICILINA-CLAVULÁNICO (n=27).

DRB1*

DQB1*

0

10

20

30

40

50

60

70

80

DRB1*01 DRB1*15 DRB1*03 DRB1*13 DQB1*05 DQB1*06

PA

CO

0

10

20

30

40

50

60

70

80

DRB1*01 DRB1*15 DRB1*03 DRB1*13 DQB1*05 DQB1*06

AMOXI-CLAV (n=22)

Hautekeete et al. Gastroenterology (1999)

**

8 (30%)1 (5%)4 (11%) DAÑOhepatocelular

272235Nº CASOSamoxi-clav

ESPAÑA(Nosotros, 2004)

INGLATERRA(O´Donohue y

cols, 2001)

BELGICA(Hautekeete y

cols, 1999)

Cols. = colaboradores ; amoxi-clav = amoxicilina-clavulánico

TCTCTHTH

IL-2IL-2

IL-2IL-2

INF-gammaINF-gamma

IL-3, 4..etc.IL-3, 4..etc.

LBLB

HEPATOCITOHEPATOCITO

COLANGIOCITOCOLANGIOCITO

CYP21 TNFαHLA CLASE IIDQ DR

CROMOSOMA 6

1. No se ha podido establecer la existencia de una

asociación entre los antígenos de histocompatibilidad de

clase II del huésped y el desarrollo de hepatotoxicidad por

fármacos, independientemente de si esta reacción adversa

está presumiblemente mediada por un mecanismo

inmunoalérgico o metabólico. Tampoco se ha observado

esta asociación para fármacos específicos como

amoxicilina-clavulánico, que representa la serie mas

amplia (n=27).

CONCLUSIONES

2.- Los alelos HLA de clase II DRB1*15 y DQB1*06

confieren una mayor susceptibilidad al daño hepático de

tipo colestásico-mixto, definido por criterios bioquímicos,

en tanto que los alelos DRB1*07 y DQB1*02 serían alelos

protectores frente a este tipo de lesión.

CONCLUSIONES

3.- Dado que esta asociación no explica todos los casos

de expresión del daño hepático colestásico-mixto, la

actividad de otros gen(es) heredados en desequilibrio de

unión dentro de esta región del cromosoma 6, podrían así

mismo estar implicados en dicho fenómeno.

CONCLUSIONES

4.- La influencia genética ligada a las moléculas de

histocompatibilidad HLA de clase II podría favorecer

determinadas vías patogénicas y explicar, al menos en

parte, por qué un determinado fármaco causa distintos

tipos de daño hepático en diferentes pacientes.

CONCLUSIONES

“INFLUENCIA GENÉTICA DE LASMOLÉCULAS DE HISTOCOMPATIBILIDAD

DE CLASE II EN LA EXPRESIÓN DEL DAÑOHEPÁTICO EN LA HEPATOTOXICIDAD

DEBIDA A FÁRMACOS”(Hepatology 2004, en prensa)

Departamento de Farmacología y PediatríaFACULTAD DE MEDICINA. UNIVERSIDAD DE MÁLAGA

BECA FISS nº 01/1088

P-450

NADPH O2

Detoxificación

Incluído EpoxidoHidrolasa

Metabolitono tóxico

Oxido de arena

Enlace covalentea macromoléculas

Citotoxicidad HaptenoFunción alteradade linfocitos

NECROSISHEPATOCELULAR

REACCIÓNINMUNOLÓGICA

Linfoadenopatía

Fenitoína

METABOLISMO DE FENITOINA

CF3CHClBr

CYP2E1 Bioactivaciónmetabólica

CF3CO-proteína microsomalhepática modificada

Tráfico subcelular

Expresión en la superficiecelular de CF3CO

Presentaciónantigénica Respuestainmune

Respuesta de anticuerposSensibilización celular

Ataque inmune alos hepatocitos

Daño hepático mediadopor sistema inmune

CF3CHClBr

Oxidativo Reductivo

CF3COCl Metabolitoreactivo

Toxicidaddirecta

Otrosmetabolitosreactivos

Enlace covalente aproteínas hepáticas

Daño hepático mediadopor sistema inmune

METABOLISMO DEL HALOTANO

Periodo de latencia variable y recurrencia precoz

Manifestaciones de hipersensibilidad: rash, eosinofilia,fiebre, artritis, artralgias, adenopatía, leucocitosis

Necrosis centrolobulillar con inflamación

Anticuerpos en suero

Mecanismo: Formación de neoantígeno

HEPATITIS INMUNOALÉRGICAS

RESPUESTA INMUNE

INMUNIDAD INNATA

Receptores superficie invariantes

Acción inmediata contra patógenos comunes

Células implicadas: macrófagos, neutrófilos,eosinófilos, básofilos, natural killer

INMUNIDAD ESPECÍFICA O ADAPTATIVA

Receptores superficie específicos

Existe memoria inmunológica

Inmunidad humoral: Linfocitos B

Inmunidad celular: Linfocitos T

RECEPTOR T(TCR)

MOLECULA CORRECEPTORA

Célula TCD4+ MHC clase II

Célula TCD8+ MHC clase I

DADAÑÑOOHEPHEPÁÁTICOTICO

IMPROBABLESIMPROBABLES

IDIOSINCRIDIOSINCRÁÁSICASSICAS149149

IMPOSIBLESIMPOSIBLES

ALTERACIONESALTERACIONESBIOLBIOLÓÓGICASGICAS

22

ACCIACCIÓÓN TN TÓÓXICAXICA11

SOBREDOSIFICACISOBREDOSIFICACIÓÓNN33


DOBLE MEDICACIDOBLE MEDICACIÓÓNN99

EXCLUIDASEXCLUIDAS

CARECER NCARECER Nºº REGISTRO REGISTRO3535

DEFINIDOSDEFINIDOS9696

PROBABLESPROBABLES5353

OTROS RESULTADOS

NO HUBO DIFERENCIAS SIGNIFICATIVAS PORSEXO

NO HUBO DIFERENCIAS SIGNIFICATIVAS PORGRUPOS FARMACOLÓGICOS

NO HUBO DIFERENCIAS SIGNIFICATIVAS PORLUGAR DE PROCEDENCIA

GRUPOS FARMACOLÓGICOS

43 (30,7%)

23 (16,4%)

20 (14,3%)14 (10%)

12 (8,6%)

8 (5,7%)Sistema nervioso

central

Aparato locomotorAparato digestivo

Antineoplásicos

Sistemacardiovascular

Antiinfecciosos vía oral

18 (14,3%)

Otros

FÁRMACO

METABOLITO REACTIVO

NEOANTÍGENO

HLA específico

Citocromosoxidasassintetasas

Unión a proteínas

Reconocimiento

0

10

20

30

40

50

60

70


PACIENTES

CONTROLES

0

10

20

30

40

50

60


FRECUENCIAS FENOTÍPICAS EN PACIENTES TRATADOS CONAMOXICILINA-CLAVULÁNICO (n=35) (Hautekeete et al.)

DRB1*

DQB1*

LinfocitoB

LinfocitoT CD8+

LinfocitoT CD4+

MHC clase II

CELULA DE KUPFFERAYUDA

(Expansión y maduración)

MHC clase I

Proteína de membranamodificada

HEPATOCITO

PACIENTES

EDAD: 52 ± 18 AÑOS

SEXO: Mujer 53%

TIPO DE DAÑOColestásico/mixto 46%Hepatocelular 54%

MECANISMO:(Manifestaciones hipersensibilidad)Ausencia 76%

Presencia 24%

MOLÉCULAS HLA Y HEPATOTOXICIDAD

FÁRMACO

Halotano (n=17)

Nitrofurantoína (n=9)

A. tricíclicos (n=12)

Diclofenaco (n=4)

Clorpromacina (n=5)

Amoxi-Clav. (n=35)

Amoxi-Clav. (n=22)

HLA

A11

DR6, DR2

A11

A11

DR6

DRB1*1501DQB1*0602DRB1*1501

AUTOR

Eade et al. Tissue Antigens(1981)

Stricker et al. Hepatology (1988)

Berson et al.J Hepatol. (1994)

Hautekeete et al.Gastroenterology (1999)O´Donohue et al.Gut (2001)

Hepatocito

Células Kuppfer, célulasendoteliales sinusoidales,linfocitos B

Linfocitos T CD8+

Citotoxicidad

Linfocitos T CD4+

Expansión clonal :- Linfocitos T CD8+- Linfocitos B- Citokinas

PRESENTACIÓN

PRESENTACIÓN

HLA clase I

HLA clase II

FUNCIÓN DEL MHC

0

10

20

30

40

50

60


PACIENTES

CONTROLES

0

5

10

15

20

25

30

35

40


DISTRIBUCIDISTRIBUCIÓÓN DE FRECUENCIAS DE ALELOS HLAN DE FRECUENCIAS DE ALELOS HLACLASE II EN POBLACICLASE II EN POBLACIÓÓN TOTAL (n=140)N TOTAL (n=140)

DRB1*DRB1*

DQB1*DQB1*

0

10

20

30

40

50

60

70


PACIENTES

CONTROLES

0

5

10

15

20

25

30

35

40


DRB1*

DQB1*

DISTRIBUCIDISTRIBUCIÓÓN DE FRECUENCIAS DE ALELOS ENN DE FRECUENCIAS DE ALELOS ENPACIENTES PATRPACIENTES PATRÓÓN COLESTN COLESTÁÁSICO-MIXTO (n=65)SICO-MIXTO (n=65)

0

10

20

30

40

50

60


PACIENTES

CONTROLES

0

5

10

15

20

25

30

35

40


DISTRIBUCIDISTRIBUCIÓÓN DE FRECUENCIAS DE ALELOS ENN DE FRECUENCIAS DE ALELOS ENPACIENTES DAPACIENTES DAÑÑO HEPATOCELULAR (n= 75).O HEPATOCELULAR (n= 75).

DRB1*

DQB1*

0

10

20

30

40

50

60


PACIENTES

CONTROLES

0

5

10

15

20

25

30

35

40


DISTRIBUCIÓN DE FRECUENCIAS DE ALELOS ENPACIENTES CON HIPERSENSIBILIDAD (n=33).

DRB1*DRB1*

DQB1*DQB1*

0

10

20

30

40

50

60

70

80


PACIENTES

CONTROLES

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50


DISTRIBUCIDISTRIBUCIÓÓN DE FRECUENCIAS DE ALELOS ENN DE FRECUENCIAS DE ALELOS ENPACIENTES CON AMOXICILINA-CLAVULPACIENTES CON AMOXICILINA-CLAVULÁÁNICO (n=27).NICO (n=27).

DRB1*

DQB1*

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