1

UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁINSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃOBIOLOGIA DE AGENTES INFECCIOSOS E PARASITÁRIOS

ASPECTOS BIOLÓGICOS E EPIDEMIOLÓGICOS DA CINOMOSE CANINA NAREGIÃO METROPOLITANA DE BELÉM/PA

MONIQUE ARAÚJO LUZ

Belém-Pará

2

2018

MONIQUE ARAÚJO LUZ

ASPECTOS BIOLÓGICOS E EPIDEMIOLÓGICOS DA CINOMOSE CANINA NAREGIÃO METROPOLITANA DE BELÉM/PA

Tese apresentada ao Programa dePós-Graduação em Biologia de AgentesInfecciosos e Parasitários do Instituto deCiências Biológicas da UniversidadeFederal do Pará como requisito parcial paraobtenção do grau de Doutor em Biologiade Agentes Infecciosos e Parasitários.

Orientador: Prof. Dr. Evonnildo CostaGonçalves

3

Belém-Pará2018

MONIQUE ARAÚJO LUZ

ASPECTOS BIOLÓGICOS E EPIDEMIOLÓGICOS DA CINOMOSE CANINA NAREGIÃO METROPOLITANA DE BELÉM/PA

Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biologia de Agentes Infecciosos eParasitários do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal do Pará comorequisito parcial para obtenção do grau de Doutor em Biologia de Agentes Infecciosos eParasitários.

Orientador: Prof. Dr. Evonnildo Costa Gonçalves Universidade Federal do Pará

Banca Examinadora: Profa. Dra. Elane Guerreiro Giese Universidade Federal Rural da Amazônia

Profa. Dra. Érika Renata Branco Universidade Federal Rural da Amazônia

Profa. Dra. Hilma Lúcia Tavares Dias Universidade Federal do Pará

Prof. Dr. Luiz Fernando Almeida Machado Universidade Federal do Pará

4

Belém, 15 de Março de 2018

2

AGRADECIMENTOS

Primeiramente a Deus por sempre se fazer presente em minha vida, me guiando

e me dando forças para seguir em frente.

Aos meus pais, Miguel Tadeu Lopes Luz e Bolivan Mendes Araújo, e meus

irmãos, Michelle Araújo Luz e Julio Thadeu Araújo Luz, por mesmo de longe me darem

todo apoio e incentivo na minha formação.

Ao meu marido, companheiro e amigo, Jorge Matos de Loureiro Júnior por todo

amor, carinho e dedicação e por aturar minhas crises de ansiedade, sempre me

incentivando a seguir em frente.

A todos meus amigos que sempre estiveram presentes, mesmo quando ausentes,

e que sempre me proporcionaram momentos de alegria e de descontração.

Ao meu orientador, Prof. Dr. Evonnildo Costa Gonçalves e a a toda equipe do

Laboratório de Tecnologia Biomolecular (LTB) que me ajudou de alguma forma nesse

estudo, em especial aos amigos Leopodo Moraes, Phamela Magalhães, Ana Larissa

Alves e Bruna Moreira que sempre estiveram presentes nessa caminhada, alegrando os

dias em que eu mais precisava.

Ao professor Ednaldo Da Silva Filho que disponibilizou grande parte do seu

tempo me ajudando na finalização deste trabalho.

A todos as pessoas que contribuíram de forma direta e indireta para o

desenvolvimento dessa pesquisa.

3

SUMÁRIO

RESUMO 3ABSTRACT 41. INTRODUÇÃO 5 1.1. CONSIDERAÇÕES GERAIS 5 1.2. HISTÓRICO DA CINOMOSE CANINA 6

1.3. CARACTERIZAÇÃO DO VÍRUS E GENOMA 7 1.4. REPLICAÇÃO VIRAL DO VCC 10 1.5. TRANSMISSÃO, PATOGENIA E SINAIS CLÍNICOS 12

1.6. DIAGNÓSTICO DA CINOMOSE CANINA 17 1.7. TRATAMENTO DA CINOMOSE CANINA 19 1.8. PROFILAXIA E CONTROLE 20

1.8.1. Imunidade e vacinas contra o VCC 211.9. EPIDEMIOLOGIA DA CINOMOSE CANINA 241.10. DIVERSIDADE GENÉTICA DO VCC 27

2. OBJETIVOS 262.1. GERAL 292.2. ESPECÍFICOS 29

3. MATERIAL E MÉTODOS 273.1. AMOSTRAGEM 303.2. PROCESSAMENTO DO MATERIAL 30

3.2.1. Extração do genoma viral 30 3.2.2. Transcrição reversa 31 3.2.3. nested-PCR para o gene N do VCC 31 3.2.4. Análise dos fragmentos amplificados 32 3.2.5. nested-PCR para o gene H do VCC 32

3.2.6. Purificação, sequenciamento e caracterização molecular 33 3.3. ANÁLISES ESTATÍSTICAS 344. RESULTADOS 35

4.1 nested-PCR para o gene N do VCC 35 4.1.1. Detecção do VCC em cão assintomático 41 4.1.2. (Re) infecção com VCC associado a caso de TVT 42 4.1.3. Coinfecções de VCC com outros microrganismos infecciosos 43

4.2. nested-PCR para o gene H do VCC 434.3. Purificação, sequenciamento e caracterização molecular 44

5. DISCUSSÃO 496. CONCLUSÕES 59REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 60

4

RESUMO

A cinomose é uma doença infectocontagiosa grave de distribuição mundial, causada

pelo vírus da cinomose canina (VCC), um membro da família Paramyxoviridae cujo

gênero Morbillivirus engloba outros vírus importantes e intimamente relacionados. A

vacinação é a medida profilática mais eficaz, ainda que casos de cinomose em animais

vacinados sejam frequentemente relatados. O presente estudo teve como objetivo

analisar os aspectos biológicos e epidemiológicos da cinomose canina na região

metropolitana de Belém/PA, avaliar a prevalência da doença e os fatores de risco para

sua ocorrência, bem como comparar as cepas obtidas na região com as cepas vacinais e

com algumas já descritas em outros lugares do Brasil e do mundo. Foram analisadas 378

amostras de sangue de cães encaminhadas entre junho de 2014 a dezembro de 2016 ao

projeto de extensão do Laboratório de Tecnologia Biomolecular (LTB) da Universidade

Federal do Pará (UFPA). Foram realizados protocolos de nested-PCR para o gene N e

para o gene H do VCC. Das 378 amostras analisadas, 86 (22,7%) foram positivas. Os

sinais neurológicos foram os mais relatados, não havendo diferenças significativas entre

o sexo, a raça e o status imunológico dos animais, no entanto, ocorrendo o inverso

quanto a faixa etária destes e a sazonalidade do vírus. As amostras isoladas formaram

dois grupos distintos separados do grupo das cepas vacinais, um somente com cepas do

presente estudo e outro formado com cepas do Sul e Sudeste do Brasil.

Palavras-chaves: cão, cinomose, VCC, detecção, América do Sul, Amazônia

5

ABSTRACT

Distemper is a serious, worldwide infectious and contagious disease caused by canine

distemper virus (VCC), a member of the Paramyxoviridae family of the Morbillivirus

family of other important and closely related viruses. Vaccination is the most effective

prophylactic measure, yet cases of distemper in animals are still frequently reported. The

objective of this study was to analyze the biological and epidemiological aspects of

canine distemper in the metropolitan region of Belém, PA, to evaluate the prevalence of

the disease and the risk factors for its occurrence, as well as to compare the obtained

regional strain with the vaccine strains and with some already described in other places

of Brazil and worldwide. A total of 378 blood samples from dogs were submitted

between June 2014 and December 2016 and analyzed by the extension project of the

Laboratory of Biomolecular Technology (LTB) of the Federal University of Pará

(UFPA). Nested-PCR protocols were performed for the N gene and for the VCC H

gene. Of the 378 samples analyzed, 86 (22.7%) were positive. Neurological signs were

the most reported, and there were no significant differences between the sex, race and

immunological status of the animals, however, the reverse of the age group and the

seasonality of the virus occurred. The isolated samples formed two distinct groups

separated from the group of the vaccine strains, one with the strains of the present study

and another one formed with strains of the South and Southeast of Brazil.

Keywords: dog, distemper, VCC, detection, South America, Amazon

6

1. INTRODUÇÃO

1.1. CONSIDERAÇÕES GERAIS

A Cinomose é uma doença viral multissistêmica, altamente contagiosa e

potencialmente fatal, causada pelo vírus da cinomose canina (VCC), membro do gênero

Morbillivirus, subfamília Paramyxovirinae, família Paramyxoviridae e ordem

Mononegavirales (Amude et al., 2010; Maclachlan & Dubovi, 2011; Carvalho et al.,

2012).

O gênero inclui outros vírus importantes e antigenicamente relacionados, como o

vírus do sarampo (MV), vírus de peste bovina (RPV), vírus da peste dos pequenos

ruminantes (PPRV), morbillivírus dos cetáceos (CeMV), vírus da cinomose focina

(PDV) e o recente descoberto morbilivírus dos felinos (FeMV). Filogeneticamente,

CDV e PDV são os mais estreitamente relacionados (Figura 1) (Radtanakatikanon et

al.,2013; Macedo et al., 2015; Budaszewski & Von Messling, 2016).

A doença é de ocorrência mundial e pode causar surtos letais em canídeos

domésticos e selvagens, além de uma ampla variedade de hospedeiros terrestres e

aquáticos das famílias Procyonidae, Pinnipedia, Mustelidae, Mephitidae, Hyaenidae,

Ailuridae, Ursidae e alguns Viverridae e Felidae (Martinez et al., 2008; Elia et al.,2008;

Martella et al., 2008; Arns et al., 2012; Headley et al., 2012; Temilade et al., 2015).

Apesar da suscetibilidade de algumas espécies de felinos selvagens, os felinos

domésticos parecem ser resistentes à infecção natural, no entanto, infecções

experimentais resultam em soro conversão sem apresentação de sinais clínicos nesses

animais (Martella et al., 2008; Carvalho et al., 2012).

O vírus é eliminado principalmente nas secreções oronasais dos animais

infectados, mas todas as suas secreções podem carrear o agente, infectando os animais

saudáveis quando estes entram em contato ou inalam esses fluidos contaminados.

Animais de todas as idades podem ser acometidos pela doença, sendo os animais mais

jovens e não vacinados os mais suscetíveis à infecção, com a morbidade e mortalidade

7

variando de espécie para espécie (Fisher et al., 2013; Freitas-filho et al., 2014; Temilade

et al.,2015;).

A doença apresenta uma progressão variável, as vezes de forma inaparente, mas

geralmente apresenta-se de forma aguda, atingindo os sistemas gastrointestinal,

respiratório e frequentemente o sistema nervoso central (SNC) (Amude et al., 2010

Temilade et al.,2015). Os sinais clínicos se manifestam poucos dias após a infecção e

variam de acordo com a virulência da cepa viral, das condições ambientais e da idade e

status imunológico do hospedeiro (Amude et al., 2010; Lempp et al., 2014).

A erradicação do VCC é considerada impossível devido à sua ampla variedade

de hospedeiros distribuídos mundialmente, portanto, o controle da doença se dá

principalmente por meio da vacinação de cães susceptíveis (Beineke et al., 2009;

Amude et al., 2010; Temilade et al.,2015).

Em 1950, vacinas com o vírus vivo atenuado (isto é, "vírus vivo modificado"

[MLV] ou vacinas atenuadas) foram desenvolvidas a partir das cepas clássicas

(Onderstepoort, Snyder Hill e Lederle) e desde então, têm sido amplamente utilizadas.

No entanto, apesar do uso de estratégias de vacinação para seu controle, surtos de

cinomose continuam acontecendo em diversas áreas geográficas, sendo considerada a

doença infecciosa viral mais importante entre os cães e causadora das maiores taxas de

mortalidade entre eles, ficando atrás apenas da raiva (Lednicky et al., 2004; Martella et

al., 2008; Zhao et al., 2010; Panzera et al., 2012; Fischer et al., 2013).

Dada a grande severidade desta doença viral, a aceleração do seu diagnóstico

para isolamento e tratamento dos animais infectados é de extrema importância, no

entanto, alguns destes animais são assintomáticos ou apresentam sinais clínicos

inespecíficos que se confundem com enfermidades causadas por outros agentes

infecciosos virais e/ou bacterianos e dificultam o diagnóstico clínico da doença

(Leisewitz et al., 2001; Amude et al., 2007; Beineke et al., 2009; Fisher et al., 2013).

Diante disto, algumas técnicas laboratoriais foram desenvolvidas e vêm sendo

empregadas para a detecção do VCC em diversas amostras clínicas, tais como o

isolamento viral, técnicas imunológicas e técnicas de biologia molecular, envolvendo

principalmente a reação em cadeia da polimerase precedida de transcrição reversa

(RT-PCR) (An et al., 2008; Wang et al., 2011; Fisher et al., 2013).

8

Figura 1- Árvore filogenética das diferentes espécies virais do gênero Morbillivirus

com seus respectivos hospedeiros. Fonte: adaptado de Budaszewski & Von Messling,

2016.

1.2. HISTÓRICO DA CINOMOSE CANINA

A cinomose canina foi primeiramente documentada no Peru em 1746 como uma

doença altamente contagiosa em cães. A partir de então a doença se disseminou pela

Europa vindo a atingir os Estados Unidos da América (EUA) em 1767, quando um

9

grande número de cães morreu em virtude da enfermidade, não ficando esclarecido se a

disseminação da mesma no país ocorreu através de cães infectados oriundos da Europa

ou da América do Sul (Blancou, 2004).

A etiologia viral da cinomose foi proposta em 1905 pelo veterinário Francês

Henri Carré, no entanto, essa teoria não foi cientificamente aceita na época e a

Bordetella bronchiseptica foi apontada como o agente etiológico, uma vez que essa

bactéria era comumente encontrada em cães com manifestações clínicas da doença. Em

1926 a etiologia viral foi finalmente confirmada pelo patologista Patrick Ladlaw e pelo

veterinário George Dunkin e a Bordetella bronchiseptica passou a ser compreendida

como causa de infecção bacteriana secundária (Appel & summers, 1999).

Durante a década de 40 houve a produção de vacinas de vírus inativados, porém,

essas vacinas não tiveram grande eficácia no controle da doença, que já era tida como

uma enfermidade fatal para os cães e comumente relatada em todo o mundo. A

diminuição no número de casos de cinomose somente ocorreu nos anos subsequentes,

com o aparecimento das vacinas de vírus vivo modificado (Appel & Summers, 1999;

Baumann, 2004).

1.3.CARACTERIZAÇÃO DO VÍRUS E GENOMA

A família Paramyxoviridae, da ordem Mononegavirales, é subdividida em duas

subfamílias, a Pneumovirinae e a Paramyxovirinae, nesta última está contido o gênero

Morbillivirus, no qual insere-se o vírus da cinomose canina (Canine distemper vírus -

CDV), um vírus pleomórfico, com diâmetro variando de 150 a 250 nm (Lamb & Parks,

2007; Amude et al., 2010; Maclachlan & Dubovi, 2011; Carvalho et al., 2012).

Por se tratar de um vírus envelopado, a sua infectividade é destruída por

solventes lipídicos, como clorofórmio e éter. Os vírus são inativados também por calor,

radiação ultravioleta (UV), formalina, fenol, agentes oxidantes e solução de hipoclorito.

São instáveis em pH acima de 10.4 ou abaixo de 4.4 e podem ser destruídos quando

expostos a temperaturas de 50ºC a 60ºC por 30 minutos, sobrevivendo, porém, por

semanas entre 0-4ºC e até por sete anos a temperaturas menores que -75ºC (Zee, 2003;

Quinn et al., 2005; Greene & Appel, 2006).

O genoma do VCC é constituído por uma molécula de RNA fita simples de

polaridade negativa, não segmentada, com aproximadamente 15.900pb. Possui seis

10

unidades transcricionais que codificam oito proteínas virais, sendo seis estruturais e

duas não estruturais. Dentre as estruturais estão a proteína do nucleocapsídeo (N), a

fosfoproteína (P), a proteína da matriz (M), a proteína de fusão (F), a hemaglutinina (H)

e a grande proteína (L) (Lamb & Parks, 2007; Maclachlan & Dubovi, 2011;

Budaszewski & Von Messling, 2016). A Figura 2 representa um esquema da estrutura e

genoma de um morbilivírus.

Figura 2- Esquema da estrutura da partícula viral e organização do genoma de ummorbilívirus. Adaptado de Budaszewski & Von Messling, 2016.

O genoma é delimitado pela extremidade 3` denominada líder, com

aproximadamente 50 nucleotídeos que sinaliza para o complexo polimerase o local de

início da transcrição ou replicação, e pela extremidade 5` chamada trailer, também

composta por 50 nucleotídeos e que representa o final do genoma viral. Estas regiões

11

controle são extracistrônicas e também estão presentes entre as unidades transcricionais

do vírus (Lamb & Parks, 2007; Budaszewski & Von Messling, 2016).

Quase todos os genes são monocistrônicos, exceto o gene P, que além da

fosfoproteína (P) também codifica as duas proteínas não estruturais denominadas C e V,

que são expressas pela sobreposição do quadro de leitura e pela edição do RNA

co-transcricional, respectivamente (Budaszewski & Von Messling, 2016).

Nos vírus intactos a única estrutura visível por microscopia eletrônica (ME) é o

envelope, que possui projeções de superfície (peplômeros) formadas pelas

glicoproteínas hemaglutinina (H) e de fusão (F), medindo 12 a 15 nm de comprimento

por 2 a 4 nm de largura, ambas desempenhando papel importante na patogenia das

infecções (Messling et al., 2001; Brown et al., 2005; Lamb & Parks, 2007; Maclachlan

& Dubovi, 2011).

O nucleocapsídeo, com simetria helicoidal simples, mede 600 a 800 nm de

comprimento por 13 a 18 nm de diâmetro e é composto pelo genoma associado à

nucleoproteína (N), à fosfoproteína (P) e à grande proteína (L), formando o complexo

ribonucléico (RNP). Preenchendo o espaço entre o envelope e o nucleocapsídeo viral

encontram-se múltiplas cópias da proteína da matriz, promovendo a estabilização do

vírus (Lamb & Parks, 2007; Arns et al., 2012).

A hemaglutinina é responsável pela adsorção do vírus à célula hospedeira

através da ligação à receptores celulares, tais como o CD150 (também conhecido com

SLAM - molécula de sinalização para ativação linfocítica) e a nectina-4 (também

conhecido como PVRL4 - poliovirus receptor-related 4 ou receptor relacionado a

poliovirus 4) e desempenha papel importante na indução da imunidade específica pelo

hospedeiro (Moss & Griffin, 2006; Sawatsky & Von Messling, 2010; Maclachlan &

dubovi, 2011; Mühlebach et al., 2011; Noyce et al., 2011; Noyce et al., 2013).

O gene que codifica a proteína H é altamente variável e por essa razão tem sido

alvo de estudos para avaliação de alterações genéticas entre os isolados de VCC. Como

essa proteína desempenha um papel essencial no tropismo celular, variações antigênicas

e de sequências podem afetar a virulência e a gama de hospedeiros do vírus (Pardo et

al., 2005; McCarthy et al., 2007; Zhao et al., 2010; Denzin et al., 2013).

Após a ligação do vírus com os receptores celulares, a proteína F, uma

glicoproteína do tipo II, promove a fusão do envelope viral com a membrana e permite a

12

entrada do nucleocapsídeo viral na célula, podendo também promover a formação de

sincício (uma “célula gigante multinucleada”), por meio da fusão de membrana entre as

células hospedeiras (Lamb et al., 2006; Moss & Griffin, 2006; Lamb & Parks, 2007;

Zhao et al., 2014).

Essa proteína é sintetizada como um precursor inativo (F0) que precisa ser

clivada por proteases presentes na célula do hospedeiro, processo essencial para a

infectividade e fator determinante da patogenicidade (Lamb & Parks, 2007; Maclachlan

& Dubovi, 2011). Isso ocorre no interior de vesículas do complexo de Golgi, nos

estágios finais da replicação, originando as subunidades F1 e F2. A clivagem deficiente

da F0 diminui a virulência da cepa viral, portanto, cepas que desempenham esse

processo com mais eficiência tendem a ser mais virulentas e infecciosas (Arns et al.,

2012).

A nucleoproteína (N) é uma proteína abundante e possui uma sequência

nucleotídica altamente conservada. Desempenha um papel importante na replicação e

transcrição, além de proteger o genoma através do empacotamento da cadeia de RNA

nascente durante a replicação. Interações com a proteína da matriz (M) também têm sido

observadas durante a montagem do vírion, demonstrando a participação da proteína N

na morfogênese das novas partículas virais (Lamb & Kolakofsky, 2001; Arns et al.,

2012).

A proteína M é a mais abundante do vírus e além de interagir com a

nucleoproteína, interage também com o envelope e com as glicoproteínas H e F,

desempenhando as funções de maturação e agrupamento das partículas virais e, além

disso, é implicada também no controle do nível de síntese de RNA (Maclachlan &

Dubovi, 2011; Arns et al., 2012).

A proteína L é a menos abundante do vírus (com aproximadamente 50 cópias) e

a sequência de nucleotídeos do gene que a codifica é bastante conservada nos membros

de uma mesma subfamília. Representa a subunidade catalítica da RNA-Polimerase

dependente de RNA (RdRp), no entanto, somente se liga ao complexo

ribonucleopreoteína (RNA:N) na presença da proteína P. Esta última regula a

transcrição, replicação e a eficiência com que a nucleopreoteína se insere e monta os

nucleocapsídeos (Moss & Griffin, 2006; Arns et al., 2012).

13

Embora as funções das proteínas não estruturais C e V não estejam totalmente

esclarecidas, estudos in vitro demonstram que a primeira inibe seletivamente a síntese

de RNA, auxiliando na transição da transcrição primária para a replicação do genoma

viral, enquanto que a segunda possui influência na síntese de mRNA. Ambas também

possuem participação na evasão da resposta imune inata pelo vírus (Arns et al., 2012).

1.4.REPLICAÇÃO VIRAL DO VCC

Como nos demais Mobillivirus a replicação do VCC ocorre no citoplasma da

célula hospedeira. Após a ligação do vírus com receptores compatíveis na superfície

celular e a fusão do envelope viral com a membrana plasmática da célula, ocorre a

liberação do nucleocapsídeo intacto no citoplasma, dando início à transcrição viral. O

receptor mais importante é o CD150, encontrado em macrófagos, linfócitos e células

dendríticas, explicando o forte tropismo desse vírus por esses tipos celulares (Lamb &

Parks, 2007; Maclachlan & Dubovi, 2011).

A transcrição é iniciada pela RNA polimerase viral com a formação de um RNA

(+) intermediário seguido da cópia do genoma viral RNA (-), uma vez que esse vírus

apresenta polaridade negativa. Os genes são transcritos a partir da extremidade 3`em

seis mRNA individuais, seguindo a ordem que aparecem no genoma, por um

mecanismo de síntese sequencial interrompida, devido a presença de uma região

intergênica podendo desintegrar a polimerase (Lamb & Parks, 2007; Maclachlan &

Dubovi, 2011).

Em cada gene há uma sequência de início de transcrição, que determina a adição

da estrutura “quepe” no início do mRNA que será transcrito e, em cada junção gênica, a

polimerase reconhece um sinal de terminação do gene (sequência de nucleotídeos

específica) determinando a inserção da cauda poli A no final do mRNA, que é liberado

após esse processo (Lamb & Parks, 2007).

Esse processo de terminação-reiniciação, em alguns casos, pode fazer com que a

polimerase se desprenda do genoma não transcrevendo o gene seguinte, dessa forma a

quantidade de mRNA individuais diminui com o aumento da distância da extremidade

3`do genoma, uma vez que os genes mais próximos dessa extremidade são transcritos

em maior quantidade em relação aos da extremidade 5’ (Lamb & Parks, 2007;

Maclachlan & Dubovi, 2011).

14

Todas as proteínas virais são traduzidas em ribossomos livres, com exceção das

proteínas de superfície H e F que são sintetizadas no reticulo endoplasmático rugoso e

posteriormente sofrem uma etapa final de processamento no complexo de golgi (Lamb

& Kolakofsky, 2001; Lamb & Parks, 2007).

As etapas de transcrição e tradução prosseguem até ocorrer o acumulo de

proteínas virais no citoplasma da célula infectada (Arns et al., 2012). Após a produção

de certa quantidade de proteínas a polimerase não reconhece mais os sinais de início e

de parada e cessa a transcrição dando início ao processo de replicação do genoma,

amplificando consideravelmente a síntese de proteínas virais (Lamb & Parks, 2007;

Arns et al., 2012; Maclachlan & Dubovi, 2011).

A montagem dos nucleocapsídeos ocorre ao mesmo tempo em que ocorre a

síntese do RNA antigenômico e do RNA genômico e os RNAs virais somente são

encontrados como nucleocapsídeos no interior da célula. Primeiramente ocorre a

associação entre as proteínas N e o genoma seguido da adição do complexo L-P. Os

nucleocapisídeos montados no citoplasma migram para a superfície celular se

associando à membrana plasmática, onde são inseridas as glicoproteínas H e F

transportadas em vesículas trans-Golgi (Lamb & Kolakofsky, 2001; Arns et al., 2012).

As moléculas de proteína M interagem com os nucleocapsídeos resultando na

protusão e brotamento através da membrana plasmática da célula infectada, onde os

vírions adquirem o envelope e são liberados (Arns et al., 2012). A Figura 3 ilustra um

esquema de replicação do vírus da cinomose canina.

15

Figura 3 - Representação esquemática do ciclo replicativo do VCC. Adaptado de Moss& Griffin, 2006.

1.5.TRANSMISSÃO, PATOGENIA E SINAIS CLÍNICOS

A cinomose é uma enfermidade de evolução aguda ou subaguda, podendo

também se manifestar de forma crônica. A excreção viral pode ocorrer nas fezes, saliva,

urina e exudatos conjuntivais e nasais dos animais infectados, independente de

manifestarem ou não sinais clínicos da doença. O VCC entra no novo hospedeiro pela

via nasal ou oral, sendo a inalação de aerossóis com partículas virais a principal forma

natural de infecção (Martella et al., 2008; Carvalho et al., 2012; Ke et al, 2015).

16

Assim como outros morbilívirus, o VCC tem um forte linfotropismo e é

altamente imunossupressivo, devido a presença do receptor CD150 em vários tipos de

células imunitárias. Esse receptor tem sua expressão aumentada nas células linfoides

após a infecção pelo vírus, o que parece ser uma estratégia para intensificar a sua

amplificação no hospedeiro (Beineke et al., 2009; Maclachlan & Dubovi, 2011).

A infecção inicia-se com a replicação viral em tecidos linfoides do trato

respiratório superior. Após esta replicação local, entre o quarto e sexto dia, ocorre a

viremia primária e o patógeno é então disseminado pelo sistema linfático e circulatório

para tecidos hematopoiéticos e linfoides distantes, como baço, timo, linfonodos e

medula óssea, além de se disseminar para tecidos linfáticos associados ao trato

gastrointestinal e para macrófagos teciduais, tais como as células de Kupffer no fígado

(Baumann, 2004; Vandevelde & Zurbriggen, 2005; Beineke et al., 2009; Maclachlan &

Dubovi, 2011; Greene, 2012).

Nessa fase ocorre o primeiro pico febril devido à alta taxa de multiplicação viral

nos órgãos linfoides, bem como uma leucopenia levando a um quadro de

imunossupressão, o que torna o animal menos capaz de combater tanto a infecção

primária pelo vírus quanto infecções bacterianas secundárias (Kerdiles et al., 2006;

Carvalho et al., 2012).

Os sinais clínicos iniciais observados, além do pico febril, são letargia,

desidratação, descarga nasal, tosse, anorexia e perda de peso. Animais capazes de

montar uma resposta imune rápida e efetiva conseguem eliminar o vírus e se recuperar

completamente, no entanto, uma falha na resposta imune do hospedeiro promove uma

viremia secundária ocorrendo entre o sexto e o nono dia da infecção (Vandevelde &

Zurbriggen, 2005; Arns et al., 2012) e coincidindo com o segundo pico febril

(Maclachlan & Dubovi, 2011).

A viremia secundária resulta na infecção de vários tecidos epiteliais e

mesenquimais, assim como do SNC. Neste estágio, o VCC infecta principalmente as

mucosas conjuntival, nasal, traqueal, bronquial e dos tratos urinário, reprodutor e

gastrointestinal, e, adicionalmente, pode ser encontrada nos queratinócitos, fibroblastos,

trombócitos, diferentes subconjuntos de células linfóides e células endoteliais de vários

parênquimas (Beineke et al., 2009; Carvalho et al., 2012).

17

Nessa fase, além de anorexia, conjuntivite e depressão, ocorrem sinais

relacionados ao acometimento do trato gastrointestinal e à inflamação do trato

respiratório superior, como vômito, diarreia aquosa, descarga nasal serosa ou

mucopurulenta, tosse produtiva, bronquite e pneumonia intersticial. O acometimento

dermatológico é caracterizado por pústulas abdominais e hiperqueratose do focinho e

das almofadas plantares (Maclachlan & Dubovi, 2011; Arns et al., 2012).

O VCC promove a fusão das células adjacentes, permitindo que o genoma viral

se espalhe de célula a célula sem nunca ser exposto a mediadores imunológicos do

hospedeiro, num processo importante para a propagação viral, principalmente dentro do

SNC (Murphy et al., 1999).

A infecção do SNC ocorre de forma tardia e apenas naqueles animais que não

desenvolvem resposta imune protetora suficientemente rápida para evitar essa

propagação (Maclachlan & Dubovi, 2011).

O vírus chega ao cérebro através do líquido cefalorraquidiano ou através das

células mononucleares infectadas que atravessam a barreira hematoencefálica

(Vandevelde & Zurbriggen, 2005) e a infecção dos neurônios e células gliais também

pode ocorrer por meio do receptor nectina-4, independente de CD150 (Pratakpiriya et

al., 2012).

Embora, na maioria dos casos, os cães com comprometimento nervoso

apresentem sinais multifocais, em outros a doença pode apresentar iníco agudo com

sinais nervosos focais, o que pode confundir o clínico veterinário (Amude et al., 2010)

O VCC pode afetar tanto a matéria branca quanto a matéria cinzenta do SNC,

desse modo vários sinais neurológicos podem ser observados, incluindo mudanças de

comportamento, convulsões, sinais cerebelares e vestibulares, déficits visuais, paresia,

paralisia, fraqueza muscular, tremores e mioclonias. Convulsões e mioclonias são

alterações tipicamente relacionadas a matéria cinzenta, enquanto déficits visuais e

diferentes formas de comprometimento motor são sinais principalmente de disfunções

da matéria branca (Martella et al., 2008; Maclachlan & Dubovi, 2011).

As mioclonias já foram consideradas patognomônicas da cinomose canina, no

entanto, um diagnóstico clínico baseado nessas manifestações deve ser feito com

cautela, uma vez que as mioclonias são comumente relatadas em outras desordens

18

inflamatórias do SNC, embora bem menos frequentes (Jones et al., 2000; Koutinas et

al., 2002; Amude et al., 2010).

Um resultado raro de infecção por VCC é a encefalomielite crônica de cães

adultos, denominado encefalite do cão velho (ODE), apresentando-se como um

desarranjo cortical progressivo com uma vasta gama de sinais clínicos. As lesões

frequentemente associadas são encefalite linfoplasmocitária parênquimal e perivascular

multifocal nos hemisférios cerebrais (Martella et al., 2008; Maclachlan & Dubovi,

2011).

A ODE parece se desenvolver em cães após a infecção aguda por VCC, quando

o vírus adquire a capacidade de persistir nos tecidos nervosos. Os mecanismos

moleculares que desencadeiam a persistência de VCC no SNC não são claros, no

entanto, alterações nas proteínas H, F e M, ou em suas interações, podem afetar a

fusogenicidade do VCC in vitro e provavelmente estão envolvidos na gênese da doença

(Plattet et al., 2005; 2007).

O período de incubação da cinomose pode variar de 1 a 4 semanas, com as

manifestações clínicas e o curso da enfermidade variando de acordo com a amostra

viral, idade e status imunológico do animal afetado, além da localização das lesões e das

complicações causadas por infecções bacterianas secundárias (Martella et al., 2008).

1.6. DIAGNÓSTICO DA CINOMOSE CANINA

O diagnóstico da cinomose geralmente baseia-se nos sinais clínicos típicos da

doença em um cão jovem (2-6 meses) que tenha um histórico de vacinações

inadequadas e possibilidades de exposição ao vírus. Portanto, identificar esses sinais

continua a ser o passo inicial e mais importante de diagnóstico, uma vez que a doença

geralmente tem um prognóstico ruim e tem um elevado potencial infeccioso, sendo

preferível a confirmação ante-mortem (Arns et al., 2012).

No entanto, por possuir sintomas inespecíficos, o diagnóstico clínico confiável

continua a ser bastante difícil e o diagnóstico diferencial deve ser realizado para outras

enfermidades como tosse dos canis, hepatite canina, parvovirose, coronavirose,

leptospirose e outras doenças neurológicas como toxoplasmose, neosporose, raiva e

intoxicação por chumbo e (Tilley & Smith, 2008; Amude et al.,2010).

19

O VCC deve ser considerado o agente etiológico em qualquer filhote com

doença febril e sinais multissistêmicos, bem como na ocorrência de lesão cutânea,

doença respiratória e digestiva em cães jovens, associada ou não com sinais

neurológicos sendo difícil o diagnóstico clínico em cães sem sinais sistêmicos

precedentes ou concomitantes (Tilley & Smith, 2008; Arns et al., 2012)

Os exames hematológicos comumente revelam linfopenia durante a fase inicial

da infecção, monocitose, trombocitopenia e anemia (Greene & Appel, 2006; Tilley &

Smith, 2008). A presença de inclusões descritas por Lentz em 1907 e Sinigaglia em

1912, denominadas Inclusões de Lentz ou de Sinigaglia-Lentz, não apresentam a mesma

frequência nos diversos tecidos, além de terem seu número reduzido em linfócitos e

principalmente em neutrófilos e hemácias, sendo, portanto, necessária precaução para

confirmação do diagnóstico de cinomose baseado na presença dessas inclusões (Corrêa,

1992).

A análise do líquido cefalorraquidiano (LCR) pode ser muito útil e baseia-se no

aumento de proteínas e pleocitose com predomínio de linfócitos, que são achados não

específicos, mas que sugerem etiologia viral, como o VCC. No entanto, durante a fase

aguda desmielinizante da doença, as reações inflamatórias são escassas e o teor de

proteínas e de células pode estar dentro da normalidade (Amude et al., 2006).

O isolamento viral representa a metodologia preferencial, uma vez que amostras

de tecidos ou de secreções dos animais infectados são introduzidos em células

permissivas ao VCC e após determinado período de incubação, é observado o efeito

citopático (ECP), caracterizado pela formação de sincícios, fornecendo material

suficiente para diversas análises, como sorológicas, morfológicas e moleculares. No

entanto, essa técnica pode se tornar demorada e difícil de ser utilizada para o

diagnóstico de rotina (Lamb & Kolakofsky, 2001; Fisher et al., 2013).

A avaliação sorológica não tem sido útil no diagnóstico de cinomose, uma vez

que altos títulos de anticorpos anti-VCC não diferenciam infecção natural de imunidade

passiva adquirida pela vacinação e os baixos títulos podem ser decorrentes às

propriedades imunossupressoras do VCC (Tilley & Smith, 2008).

Dentre os testes sorológicos, a imunofluorescência direta ou indireta, a

imunoperoxidase, o ensaio imunoenzimático (ELISA), a soroneutralização e a

imunohistoquímica são os mais comumente utilizados (Macedo et al., 2015).

20

Um kit comercial de ensaio imunocromatográfico para detecção da proteína F do

VCC é utilizado em clínicas e consultórios veterinários a partir de amostras de secreção

ocular (conjuntiva), secreção nasal (mucosa), saliva, urina, soro, plasma ou líquor.

(Curti et al., 2012).

Esse kit oferece resultado rápido, seguro, com leitura visual de fácil

interpretação e pode ser utilizado em cães vacinados desde que seja respeitado o

intervalo de 15 dias entre a vacinação e a sua realização, período em que os antígenos

virais da vacina não são mais detectados, evitando assim um resultado falso-positivo

(Curti et al., 2012).

Além disso, diferentes protocolos de RT-PCR foram desenvolvidos para a

detecção de VCC em amostras biológicas de cães com suspeita clínica de cinomose

(Frisk et al., 1999; Gebara et al., 2004; Shin et al., 2004; Castilho et al., 2007; Arns et

al., 2012; Fisher et al., 2013; Macedo et al., 2015).

Estes ensaios são direcionados ao gene da nucleoproteína (N), que é altamente

conservado e dessa forma parece ser o melhor alvo para a amplificação de todas as

espécies de VCC (Macedo et al., 2015).

Os três principais esquemas de amplificação descritos como ferramentas de

diagnóstico práticas, são: RT-PCR com eletroforese, nested RT-PCR com eletroforese e

RT-PCR em tempo real (Fisher et al., 2013).

O protocolo de nested RT-PCR é o mais utilizado por fornecer maior

positividade em todas as amostras testadas, quando comparada a técnica de RT-PCR

(Shin et al., 2004). Do mesmo modo, a RT-PCR em tempo real demonstra alta

sensibilidade e é capaz de quantificar as partículas virais nas amostras clínicas dos cães

infectados (Elia et al., 2006; 2008; Tozato et al., 2016).

1.7.TRATAMENTO DA CINOMOSE CANINA

Não há nenhum tratamento antiviral eficaz contra a cinomose e, portanto,

comumente se realiza um tratamento sintomático e de suporte dos animais infectados.

(Baumann, 2004; Martella et al., 2008). Antes de dar início à terapia, os proprietários

dos animais devem ser esclarecidos sobre a natureza infecciosa da doença, seu

prognóstico e a possibilidade do desenvolvimento de sinais neurológicos (Leisewitz et

al., 2001).

21

Devido à perda de líquidos causada pelos sinais clínicos gastrointestinais, é

necessária a fluidoterapia parenteral para o equilíbrio de fluidos e eletrólitos, incluindo o

uso de antieméticos e antidiarreicos, além da restrição de alimentos para redução do

trânsito intestinal e irritação da mucosa. Antibióticos de amplo espectro também devem

ser utilizados para o controle das infecções bacterianas secundárias que são frequentes

em animais imunossuprimidos (Sherding, 2003; Martella et al., 2008).

Como os macrófagos e seus produtos são importantes na indução da destruição

do tecido nervoso, antioxidantes como vitamina C e vitamina E podem ser

administrados conjuntamente e para a redução de um possível edema cerebral, pode-se

utilizar corticosteroides, como a dexametasona, por via intravenosa (Baumann, 2004;

Vandevelde & Zurbriggen, 2005).

Animais que se apresentam com quadro neurológico podem receber

anticonvulsivantes e relaxantes musculares como fenobarbital e diazepam, no entanto,

na encefalite multifocal progressiva causadora de tetraplegia, semicoma ou outras

alterações que comprometam a qualidade de vida do animal, a eutanásia é recomendada

(Leisewitz et al., 2001; Sherding, 2003).

No mais, bons cuidados de enfermagem são importantes, como manter o animal

quente e seco e realizar a limpeza de secreções nasal e oculares. Tratamentos

homeopáticos também já foram descritos, no entanto sem fundamentação científica

(Leisewitz et al., 2001).

1.8. PROFILAXIA E CONTROLE

Devido à distribuição mundial do VCC e a existência de uma grande diversidade

de hospedeiros susceptíveis, a eliminação do vírus se torna praticamente impossível,

sendo a imunização através da vacinação a única medida profilática eficaz, ainda que as

medidas de higiene clássicas devam ser aplicadas em paralelo (Gencay et al., 2004;

Amude et al., 2010; Temilade et al.,2015).

Ainda assim o controle do vírus se torna difícil devido a cobertura vacinal ser

insuficiente em diversas regiões menos desenvolvidas, fato esse que além de estar

relacionado com a ampla gama de hospedeiros susceptíveis, está relacionado também

com o tamanho da população canina, o grande número de cães não domiciliados e o

22

pequeno volume de doses vacinais vendidas anualmente nessas regiões (Arns et al.,

2012).

Embora seja difícil obter números precisos, mesmo nos países desenvolvidos

estima-se que apenas 30-50% da população de animais de estimação seja vacinada, e

este valor é significativamente menor nas nações em desenvolvimento. A vacinação

individual dos animais de estimação é importante, não só para proteger o indivíduo, mas

para reduzir o número de animais suscetíveis na população regional e, desse modo, a

prevalência da doença (Day et al.,2016)

No entanto, mesmo a vacinação sendo o meio mais seguro de diminuir o

núrmero de casos de cinomose, não se deve esquecer que a vacina não é 100% eficaz em

100% dos animais e que em indivíduos que apresentam sinais clínicos sugestivos de

infecção por VCC, a doença não pode ser excluída com base apenas em um histórico

adequado de vacinação (Leisewitz et al., 2001).

1.8.1. Imunidade e Vacinas contra o VCC

A proteção contra infecção natural durante as primeiras semanas de vida, quando

o sistema imune do animal ainda não está perfeitamente capacitado para suportar uma

infecção por um vírus altamente virulento e patogênico, é dada pela transferência

passiva de imunoglobulinas (Hass et al., 2008).

Apenas 3% dos anticorpos maternos contra o vírus da cinomose são transferidos

através da placenta e 97% através do colostro, resultando em um titulo inicial no

recém-nascido normalmente igual a 77% do titulo da mãe. Há uma variação individual

no nível de proteção, dependendo da imunidade materna (título de anticorpos) e da

quantidade de colostro ingerido pelo filhote (Biazzono et al., 2001; Monti, 2004).

A duração da imunidade adquirida passivamente é de cerca de nove a doze

semanas, havendo baixa significância da sexta à sétima semana de vida, ou duração

maior, com níveis de anticorpos detectáveis até a 12ª ou 14ª semana de idade. Quando o

nível de anticorpos atinge o limiar mínimo, os cães se tornam susceptíveis à infecção

natural (Martela et al., 2008)

23

Nessa fase a proteção contra a enfermidade pode ser obtida mediante a utilização

de vacinas que possuam adequada capacidade imunogênica e gerem uma combinação de

respostas imunológica humoral e celular (Hass et al., 2008).

As vacinas contra o VCC, assim como aquelas que conferem proteção contra a

infecção pelo adenovírus canino (CAV) e o parvovírus canino (CPV), são condiseradas

pelo Grupo de Diretrizes de Vacinação (VGG) da Associação Veterinária Mundial de

pequenos animais (WSAVA) como vacinas essenciais, ou seja, aquelas que todos os

cães em todo o mundo devem receber rotineiramene, nos intervalos recomendados, para

fornecer proteção por toda a vida contra doenças infecciosas de significância global

(Day et al., 2016)

A partir da década de 1950, vacinas MLV foram desenvolvidas com as cepas

clássicas de VCC causando uma drástica redução no impacto da cinomose na população

canina (Martella et al., 2008).

As vacinas MLV estimulam tanto a resposta imune celular quanto a humoral e se

tornaram atenuadas após passagens seriadas em cultivos celulares (Leisewitz et al.,

2001; Valli et al., 2010).

Esses organismos atenuados possuem reduzida virulência, porém estão intactos e

viáveis e promovem imunidade induzindo uma baixa infecção ao se replicarem dentro

do animal, sem produzir patologia tecidual significativa ou sinais clínicos de doença

infecciosa (Day et al., 2016).

A maioria das vacinas contra cinomose comercializadas, tanto em clínicas

veterinárias quanto em lojas de produtos agropecuários, possuem as cepas clássicas

atenuadas Onderstepoort (mais utilizada), Snyder Hill e Lederle (Martella et al., 2008).

A cepa Rockborn ainda é encontrada em algumas formulações no mercado, apesar de

relatos de reter patogenicidade (Martella et al., 2011).

Embora as vacinas MLV sejam seguras e eficazes em cães, podem se tornar

perigosas para uma variedade de animais selvagens de vida livre ou de cativeiro, pois

mesmo atenuadas podem permanecer patogênicas para as espécies altamente suscetíveis

à infecção, com risco de causar doença induzida pela vacinação. Para a imunização de

animais de zoológico, vacinas inativadas foram utilizadas, no entanto demonstrando

baixa eficácia (Maclachlan & Dubovi, 2011).

24

Para atender a essa necessidade Vacinas recombinantes contra VCC (rVCC)

utilizando poxvírus aviário como vetor, os quais induzem a expressão das proteínas H e

F da cepa Onderstepoort foram desenvolvidas e estão disponíveis comercialmente

(Maclachlan & Dubovi, 2011).

Elas são consideradas seguras e eficazes, pois o vírus não replica eficientemente

em linfócitos e no SNC de mamíferos e não há risco de reversão à virulência (Welter et

al., 2000; Arns et al., 2012).

Desde 1950, são utilizadas as mesmas cepas vacinais nas formulações das

vacinas atualmente comercializadas e a incidência da doença em todo o mundo parece

ter aumentado nas últimas décadas, com muitos relatos de episódios de infecção em

animais vacinados sugerindo o surgimento de VCCs com diferentes propriedades

antigênicas das cepas vacinais (Parks et al., 1992; Curran et al., 1993; Yoshida et

al.,1998; Castilho et al, 2007; Calderon et al., 2007; Sarute et al., 2011; Fisher et al.,

2013)

Isso indica que esses cães que foram infectados, mesmo protegidos pelas vacinas

atenuadas, podem ter sido contaminados mediante a exposição de um tipo selvagem de

VCC, levantando a dúvida de se as vacinas atuais protegem efetivamente os cães contra

estirpes geneticamente divergentes das estirpes vacinais, ou não (Si et al., 2010; Sarute

et al., 2011).

Apesar dos diversos relatos publicados de doença em cães vacinados, ainda não

está esclarecido se as falhas vacinais são decorrentes de baixa reatividade cruzada entre

as cepas atenuadas e as cepas de campo circulantes, ou devido a falhas em protocolos

vacinais e/ou armazenamento dos produtos (Budaszewski et al., 2016).

Animais vacinados com vacina MLV desenvolvem forte resposta humoral e

celular de longa duração, semelhante à infecção natural, e estão protegidos contra o

desafio por pelo menos 3-4 anos, sendo que 100% dos animais sobrevivem ao desafio e

90% não desenvolvem sinais clínicos de cinomose (ABDELMAGID et al., 2004; GORE

et al., 2004) e segundo Day et al. (2016), quando administrada a um animal que não

possui anticorpos derivados da mãe (MDA), geralmente induz proteção com uma dose

única.

Resquícios da imunidade passiva interferem na vacinação dos animais, por ser o

antígeno vacinal neutralizado pelos anticorpos circulantes que bloqueiam a replicação

25

deste no organismo hospedeiro, condição considerada essencial para a adequada

resposta imune (Biazzono et al., 2001). Os filhotes com baixo MDA podem ficar

vulneráveis (e capazes de responder à vacinação) em uma idade mais precoce, enquanto

que outros possuem MDA em títulos tão altos que são incapazes de responder à

vacinação até ≥12 semanas de idade (Day et al., 2016).

Como na prática é impossível determinar quando isto ocorre, nenhuma política

de vacinação primária única cobrirá todas as situações possíveis e, portanto, o VGG

recomenda a vacinação inicial dos cães às 6-8 semanas de idade e então a cada 2-4

semanas até as 16 semanas de idade ou mais. De acordo com esta recomendação,

quando a vacinação é iniciada às 6 ou 7 semanas de idade, uma série de quatro vacinas

essenciais primárias seria administrada com um intervalo de 4 semanas, mas somente

três seriam necessárias com início às 8 ou 9 semanas de idade e intervalo similar de 4

semanas (Day et al., 2016).

Assim, assegura-se que o filhote receba pelo menos uma dose vacinal em uma

idade em que a imunidade materna é insuficiente para impedir a imunização ativa. A

primovacinação com qualquer agente infeccioso antes das 6 semanas de idade, mesmo

na ausência de imunidade passiva, não é recomendada devido à imaturidade

imunológica (Welborn et al., 2011).

A prática de revacinação anual foi estabelecida a mais de 30 anos atrás e não é

de hoje que esse protocolo vem sendo questionado. Para alguns pequisadores a

vacinação, apesar de fundamental, não é um procedimento inócuo, tem riscos inerentes

e pode provocar reações adversas no animal. O aumento da incidência de algumas

doenças imunomediadas levou a se suspeitar da existência de uma ligação entre a

vacinação frequente e a ocorrência de problemas imunitários tais como: alergias,

poliartrite, doenças da tiróide, reacções de hipersensibilidade, anemia hemolítica,

trombocitopénia, osteopatias, etc. (Monti, 2004; Almendra et al., 2005).

Dessa forma, atualmente o VGG recomenda que após a última da série primária

de vacinas dos filhotes seja dado um reforço com 26 ou 52 semanas e as revacinações

subsequentes sejam dadas em intervalos de três anos ou mais e não mais anualmente

como era de costume no passado, uma vez que a duração da imunidade (DI) é de vários

anos, podendo durar até o fim da vida do animal de estimação (Day et al., 2016).

26

Um cão adulto que tenha recebido uma série completa de vacinações essenciais

quando filhote, incluindo um reforço às 26 ou 52 semanas, mas que pode não ter sido

vacinado regularmente quando adulto, requer apenas uma única dose de vacina essencial

para reforçar a imunidade. Similarmente, um cão adulto (ou filhote com mais de 16

semanas de idade) adotado, com histórico de vacinação desconhecido, requer apenas

uma única dose de vacina essencial para gerar uma resposta imune protetora (Day et al.,

2016).

Existem várias razões, além da anulação da vacina por MDA e diferenças

genéticas entre cepas circulantes e cepas utilizadas em vacinas, para as falhas vacinais

ocorrerem, que incluem desde problemas na aplicação, refrigeração incorreta, ineficácia

da vacina e resposta imune antiviral inadequada, imunocomprometimento do cão por

parasitas internos e estresse (Welborn et al., 2011).

1.9. EPIDEMIOLOGIA DA CINOMOSE CANINA

A cinomose canina é uma doença infectocontagiosa de distribuição mundial

relevantemente importante, uma vez que resulta em alta mortalidade dos animais

infectados (30 a 70%), só perdendo em gravidade para a raiva (Swango, 1997; Lamb &

Parks, 2007; Alcade et al., 2013; Ke et al., 2015; Temilade et al., 2015).

Acomete principalmente cães domésticos e tornou-se relativamente rara em

muitos países desenvolvidos devido à vacinação, no entanto, apesar da extensa

vacinação em muitas regiões continua a ser uma das principais doenças em cães, com

relatos de infecção tanto em animais vacinados e não vacinados em países

desenvolvidos ou em desenvolvimento (Greene & Appel, 2006; Lan et al., 2006; Larson

& Schultz, 2006; Calderon et al., 2007; Elia et al., 2008; Simon-Martınez et al., 2008;

Amude et al., 2010; Martella et al., 2010; Woma et al., 2010; Zhao et al., 2010;

Maclachlan & Dubovi, 2011; Panzera et al., 2012; Panzera et al., 2014; Temilade et al.,

2015).

A constante urbanização com a consequente fragmentação de habitats promoveu

a aproximação de animais selvagens com os animais domésticos, que são potenciais

reservatórios de agentes patogênicos e, dessa forma, o vírus vem se disseminando em

27

um amplo espectro de hospedeiros no chamado efeito spill-over (Sherding, 2003;

Medina-Vogel, 2010; Headley et al., 2012; Megid et al., 2013).

O efeito de spill-over é caracterizado como a transmissão de agentes infecciosos

de animais de reservatório (espécies mais frequentemente domesticadas) para espécies

selvagens simpatizantes e freqüentemente resulta em doenças infecciosas emergentes

que podem ser fatais para novos hospedeiros e colocar em risco espécies ameaçadas de

extinção (Headley et al., 2012).

Com isso, o número de relatos da infecção por VCC em hospedeiros não

concencionais vêm aumentando em todo o mundo e além da infecção em cães

domésticos, o vírus tem sido isolado em outros membros da família Canidae, bem como

em membros das famílias Procyonidae, Pinnipedia, Mustelidae, Mephitidae, Hyaenidae,

Ailuridae, Ursidae, Viverridae, Tayassuidae, Phocidae, em alguns primatas

não-humanos (Cercopithecidae) e em felídeos selvagens (Felidae) (Greene & Appel,

2006; Elia et al., 2008; Megid et al ., 2009; Megid et al., 2010; Quiu et al., 2011; Megid

et al., 2013).

Embora a doença já tenha sido relatada em grandes felinos, o vírus ainda não foi

detectado em gatos domésticos. No entanto, esses animais já foram infectados

experimentalmente, resultando em soroconversão, mas não em doença clínica (Martella

et al., 2008; Carvalho et al., 2012).

No Brasil o VCC já foi encontrado infectando lobo-guará (Chrysocyon

brachyurus), furão (Galictis vittata), cachorro-do-mato (Cerdocyon thous)

graxaim-do-campo (Pseudalopex gymnocercus), raposa do campo (Lycalopex vetulus),

onça-pintada (Panthera onca) puma (Puma concolor) e jaguatirica (Leopardus pardalis)

(Rego et al., 1997; Nava et al., 2008; Megid et al., 2009; 2010; 2013; Hübner et al.,

2010)

Como reservatórios virais, os cães domésticos representam um risco

significativo para as espécies de animais selvagens livres ou de cativeiro por causa da

sua abundância e capacidade de percorrer longas distâncias (Fiorello et al., 2006).

Os cães sem raça definida (SRD) são frequentemente associados com a

disseminação viral, o que está diretamente relacionado a seu estilo de vida, pois são

mais propensos a vagarem pelas ruas em zonas urbanas e semi rurais, têm status vacinal

desconhecido, apresentando maiores chances de entrarem em contato com o patógeno

28

proveniente de outros cães já contaminados, além de que, os cães de raça pura são mais

rigorosamente vacinados contra o VCC do que os sem raça definida (Headley et al.,

2012; Freitas-Filho et al.,2014).

A capacidade do vírus de passar de hospedeiro para hospedeiro é considerada

como uma das causas para o sucesso da sua disseminação, sendo caracterizada como

uma doença enzootica em vários países e endêmica no Brasil (Fiorello et al., 2006).

No Brasil a epidemiologia da cinomose canina ainda é pouco estudada, porém,

casos da doença vem sendo frequentemente relatados em várias regiões do país, embora

o desenvolvimento de estudos epidemiológicos e filogenéticos se concentrem na sua

grande maioria nas regiões sul e sudeste (Headley & Graça, 2000; Borba et al., 2002;

Gebara et al., 2004; Amude et al., 2006; 2007; Castilho et al., 2007; Negrão et al.,

2013; Budaszewski et al., 2014).

A doença atinge animais de qualquer idade, raça e sexo, no entanto filhotes entre

três a quatro meses de idade são mais acometidos, devido ao declínio da taxa de

anticorpos maternos (Sherding, 2003; Baumann, 2004; Martella et al., 2008).

Apesar de ocorrer em qualquer época do ano, estudos anteriores já demonstraram

uma tendência sazonal da doença, com o maior número de casos ocorrendo no inverno

(Borba et al., 2002; Greene & Appel, 2006). Dados obtidos aqui na cidade de Belém/PA

demonstraram que o número de casos foi mais acentuado durante o período frio, úmido

e chuvoso (Guedes et al., 2009).

Embora a influência que as variações sazonais exercem na infecção por VCC

ainda não estejam totalmente claras, essa ocorrência maior durante os meses frios pode

estar relacionada a um ambiente mais propício para a manutenção e sobrevivência do

vírus, facilitando a infecção dos hospedeiros susceptíveis (Headley & Graça, 2000;

Borba et al., 2002; Greene & Appel, 2006; 2012).

1.10. DIVERSIDADE GENÉTICA DO VCC

A análise das sequências de diferentes genes tem sido realizada para caracterizar

as cepas de VCC circulantes em várias regiões do mundo, sendo notável na literatura

que a maioria das cepas atualmente caracterizadas são geneticamente divergentes

daquelas comumente utilizadas na produção de vacinas comercializadas mundialmente

(Pardo et al., 2005; Castilho et al., 2007; Demeter et al., 2010; Zhao et al., 2010;2014;

29

Martella et al., 2011; Radtanakatikanon et al., 2013; Sarute et al., 2013; Budaszewski et

al., 2016).

Algumas variações do gene N entre isolados de VCC já foram observadas, não

obstante ao fato de que essa proteína compõe a região conservada do genoma do VCC,

levando-se a acreditar que maiores polimorfismos podem ser encontrados em genes

mais variáveis, tais como os genes H e F (Blixenkrone-Moller et al., 1992; Sarute et al.,

2011).

O gene H é o mais amplamente utilizado porque tem a maior variabilidade

dentro do genoma do VCC, com aproximadamente 10% de variação nas sequências de

seus aminoácidos). Sua análise permitiu identificar linhagens (genótipos) geográficas

proporcionando avanços importantes para o conhecimento da evolução do VCC em todo

o mundo (Bolt et al., 1997; Martella et al., 2006; Kapil et al., 2008; Panzera et al.,

2014; Budaszewski et al., 2016).

O termo genótipo foi usado no agrupamento de VCCs, mas uma análise formal

ainda não foi publicada, sendo as estirpes que apresentam mais de 95% de homologia de

aminoácidos consideradas pertencentes ao mesmo genótipo (Mochizuki et al., 1999).

Análises filogenéticas das cepas VCC circulantes na América do Sul já foram

realizadas anteriormente, visando o estabelecimento dos padrões evolutivos do vírus na

região. Os primeiros estudos realizados no Brasil, Argentina e Uruguai revelaram que as

cepas de campo diferiram claramente em relação às cepas vacinais (Saito et al., 2006;

Calderón et al., 2007; Sarute et al., 2011).

Existe apenas um sorotipo de VCC e, até onde se tem conhecimento, as análises

filogenéticas baseadas no gene H permitiram a definição de pelo menos 15 genótipos

separados de acordo com a região geográfica de origem (Martella et al., 2006; Calderón

et al., 2007; Panzera et al., 2012; Woma et al., 2010). Desses, quatro estão circulantes

na América do Sul: EU1/SA1 (formado por cepas argentinas, uruguaias e brasileiras),

SA2 (distribuído exclusivamente na Argentina), SA3 e SA4, onde estão agrupadas cepas

equatorianas e colombianas, respectivamente (Panzera et al., 2014).

Segundo relatos anteriores, todas as cepas brasileiras de cães domésticos, que

foram caracterizadas filogeneticamente, pertencem à linhagem EU1/SA1. Embora esta

linhagem tenha sido anteriormente descrita na Europa, não é possível determinar a

direção do fluxo genético entre os dois continentes. No entanto, a alta homologia

30

genética entre a as estirpes europeias e sul-americanas é indicativo de um ancestral

comum (Budaszewski et al., 2014; Panzera et al., 2014).

Budaszewski et al. (2014), analisando o genótipo EU1/SA1 separadamente,

sugeriram a sua divisão em oito sub-genótipos distintos (A-H), definidos com base nas

propriedades filogenéticas da sequência neocleotídica do gene H. Classificação que,

segundo os autores, não havia sido sugerida previamente.

Resumindo, os genótipos circulantes atualmente em todo o mundo são:

America-I (cepas vacinais clássicas), America-II, America-III, America-IV, Asia-I,

Asia−II, Asia-III, Asia−IV, Europa-I/América do Sul-I (EU1/SA1), Ártico, Europa

Selvagem (EW), América do Sul-II (SA2), América do Sul-III (SA3), América do

Sul-IV (SA4), Africa-I e o Rockborn-like. MARTELLA et al., 2011; BUDASZEWSKI

et al., 2014;2016; KE et al., 2015).

2. OBJETIVOS

2.1. GERAL

- Analisar os aspectos biológicos e epidemiológicos da cinomose canina na

região metropolitana de Belém/PA

31

2.2. ESPECÍFICOS

- Avaliar a prevalência da cinomose canina na região metropolitana de

Belém/PA.

- Avaliar a relação entre o sexo, idade, raça, status vacinal dos animais,

sazonalidade do vírus e o risco de infecção pelo VCC nessa região.

- Identificar os sinais clínicos mais frequentes associados aos casos de infecções

pelo VCC em Belém/PA.

- Caracterizar as relações filogenéticas das cepas do VCC circulantes em

Belém/PA, em comparação com aquelas circulantes em outras regiões do país e do

mundo e com as cepas presentes em vacinas comercialmente utilizadas na prevenção da

doença.

3. MATERIAL E MÉTODOS

32

3.1. AMOSTRAGEM

Foram utilizados no presente estudo amostras de sangue total de cães

encaminhadas ao Laboratório de Tecnologia Biomolecular (LTB) da Universidade

Federal do Pará (UFPA), campus Belém, no âmbito do projeto de extensão coordenado

pelo prof. Dr. Evonnildo Costa Gonçalves. Este laboratório recebe amostras de diversas

clínicas da região metropolitana de Belém/PA para a investigação quanto à presença de

diferentes enfermidades infecciosas e parasitárias, sendo incluídas na presente pesquisa

todas as amostras encaminhadas ao referido serviço para pesquisa do vírus da cinomose

canina durante o período compreendido entre junho de 2014 a dezembro de 2017,

resultando em um total de 378 amostras sanguíneas.

As amostras recebidas possuíam volume compreendido entre 1 a 3 mL, coletadas

em tubos contendo o anticoagulante ácido etilenodiamino tetra-acético (EDTA). Após o

registro das amostras, alíquotas foram armazenadas a -80°C onde foram mantidas até o

momento da extração do RNA, realizada em até no máximo dois dias.

3.2. PROCESSAMENTO DO MATERIAL

Todas as manipulações das amostras biológicas foram realizadas em uma capela

de fluxo laminar, com sua superfície descontaminada com álcool 70% e dodecil sulfato

de sódio (SDS) 0,5%, seguida da descontaminação de pipetas, estantes, luvas e todos os

equipamentos utilizados durante os procedimentos. Além disso, somente eppendorfs e

ponteiras livres de RNases foram utilizadas, para evitar a degradação e perda de RNA

viral.

3.2.1. Extração de RNA

O RNA total foi extraído a partir de 200 µL de sangue total de cada amostra

previamente congelada a -80°C, seguindo o protocolo do Blood Total RNA Miniprep

Kit, da Axygen Biosciences®.

Para o controle da extração, amostras positivas (DNA de cão sabidamente

infectado) e negativas (Água bidestilada) e positivo foram extraídas juntamente com as

amostras a serem testadas, a fim de se identificar falhas durante esse procedimento.

33

Ao final dessa etapa, alíquotas do RNA extraído foram estocadas a -80°C até a

realização da técnica de transcrição reversa.

3.2.2. Transcrição Reversa

A transcrição reversa foi realizada utilizando-se o kit High Capacity cDNA

Reverse Transcription, da Applied Biosystems, num volume final de 20 µL, sendo 10 µL

dos reagentes, contendo oligonucleotídeos randômicos que compõem o kit, e 10 µL do

RNA extraído, seguindo as instruções do fabricante. O mix foi submetido às seguintes

condições de ciclagem: 25°C por 10 minutos, 37°C por 120 minutos, 85°C por 5

minutos em um único ciclo.

A partir dessa reação se obteve o DNA viral para a realização dos testes

moleculares de detecção e diferenciação das cepas de VCC.

3.2.3. nested-PCR para o gene N do VCC

Para a detecção do VCC nas amostras analisadas, uma nested-PCR foi realizada

a partir do DNA previamente obtido após a etapa de transcrição reversa. Esse protocolo

baseia-se na amplificação de fragmentos do gene da proteína do nucleocapsídeo (N)

utilizando-se os oligonucleotídeos externos CDV-1F e CDV-2F, que amplificam um

fragmento de 480pb, seguida da reação de nested-PCR com os oligonucleotídeos

internos CDV-3F e CDV-4R, que amplificam um fragmento de 287pb (Quadro 1).

A primeira reação ocorreu em um volume final de 25 µL, contendo 1 µL de

cDNA de cada amostra teste e de cada controle (positivo e negativo) nas seguintes

condições de ciclagem: 1 ciclo a 94°C por 2 minutos, 35 ciclos de desnaturação a 94°C

por 20 segundos, anelamento a 55°C por 40 segundos, extensão a 72°C por 1 minuto e

um ciclo de extensão final de 1 minuto a 72°C.

A partir de 1 µL da primeira reação realizou-se a nested-PCR, também em um

volume final de 25 µL, seguindo as seguintes condições: ciclo inicial a 94°C por 3

minutos, 35 ciclos de desnaturação a 94°C por 20 segundos, anelamento a 59°C por 40

segundos, extensão a 72°C por 1 minuto e ciclo de extensão final a 72°C por 5 minutos.

Quadro 1- Oligonucleotídeos sintetizados para o gene que codifica a proteína N do

34

VCC.

Primer Sequência (5`-3`) Posição nogenoma*

Referência

CDV-1F ACTGCTCCTGATACTGC 654-670

Castilho et al.,2007

CDV-2R TTCAACACCRACYCCC 1118-1133

CDV-3F ACAGRATTGCYGAGGACYTRT 769-789

Frisk et al., 1999CDV-4F CARRATAACCATGTAYGGTGC 1055-1035

*Posição numérica no genoma da cepa Onderstepoort (GenBank: NC001921)

3.2.4. Análise dos fragmentos amplificados.

Para a detecção dos fragmentos amplificados, 4 µl de cada uma das reações

foram misturados a 1 µl de GelRedTM Nucleic Acid stain (Biotium), e então submetidos

à eletroforese em gel de agarose a 1,5% em tampão TAE (Tris-Acetato-EDTA) e

visualização em fotodocumentador E-BOX VX2 (Vilber Lourmat®). O tamanho dos

fragmentos amplificados foi estimado comparando-se com os marcadores de peso

molecular 100 pb e/ou 1 Kb (DNA ladder Invitrogen®).

3.2.5. nested-PCR para o gene H do VCC

Para avaliar a diversidade das cepas circulantes em Belém/PA e definir os

genótipos em que essas cepas se agrupam, foi realizada amplificação do gene completo

da hemaglutinina (H) nas amostras que foram positivas pela técnica de nested-PCR para

o gene N, utilizando-se o DNA previamente obtido e estocado a -80°C, após transcrição

reversa.

Para a amplificação do gene H foram utilizados os oligonucleotídeos externos

RH3-F/RH4-R, que amplificam um fragmento de 871pb, seguindo-se com uma

nested-PCR utilizando-se os oligonucleotídeos internos H1F/H1R, H2F/H2RB,

CDVF10B/ CDVR10 e H3FB/H3R, que amplificam fragmentos de 788pb, 525pb,

870pb e 253pb, respectivamente (Quadro 2).

35

A primeira reação foi realizada para um volume final de 25 µL, contendo 2 µL

de cDNA de cada amostra teste e de cada controle (positivo e negativo) nas seguintes

condições de ciclagem: 1 ciclo a 94°C por 3 minutos, 35 ciclos de desnaturação a 94°C

por 30 segundos, anelamento a 50°C por 40 segundos, extensão a 72°C por 1 minuto e

um ciclo de extensão final de 10 minutos a 72°C.

A partir de 1 µL da primeira reação, em um volume final de 50 µL, realizou-se a

nested-PCR com os oligonucleotídeos internos, seguindo as mesmas condições de

ciclagem da primeira reação.

Os métodos de análise dos fragmentos amplificados para o gene H foram os

mesmos descritos para o gene N no item 3.2.4.

Quadro 2 - Oligonucleotídeos sintetizados para a amplificação completa do gene H doVCC

Primer Sequência (5`-3`) Posição nogenoma*

Referência

RH3-F AGGGCTCAGGTACTCCAGC 7059-7077Harder et al., 1996

RH4-R AATGCTAGAGATGGTTTAATT 8975-8995

H1F ATGCTCTCCTACCAAGACAA 7079-7098

An et al., 2008H1R CATGTCATTCAGCCACCGTT 7848-7867

H2F AATATGCTAACCGCTATCTC 7730-7749 An et al., 2008

H2RB TTTGGTTGCACATAGGGTAG 8236-8255 Budaszewski et al.,2014

H3FB CATATGATATATCCCGGGGC 8649-8668 Budaszewski et al.,2014

H3R TCARGGWTTTKAACGRYYAC 8883-8902 An et al., 2008

CDVF10B TAYCATGAYAGYARTGGTTC 7991-8010

Hashimoto et al.,2001

CDVR10 ARTYYTCRACACTGRTKGTG 8842-8861

*Posição numérica no genoma da cepa Onderstepoort (GenBank: NC001921)

3.2.6. Purificação, sequenciamento e caracterização molecular

36

Os amplicons dos genes N e H a serem sequenciados foram purificados com a

enzima Illustra ExoProStar 1-Step (GE Healthcare – UK), seguindo as recomendações

do fabricante. Os produtos purificados foram sequenciados automaticamente em um

3500 XL Genetic Analyzer (Applied Biosystems), seguindo orientações do fabricante.

As sequências obtidas foram alinhadas manualmente e editadas utilizando-se o

programa BioEdit (Hall, 1999). Comparações com sequências depositadas no GenBank

foram feitas usando a ferramenta Basic Local Alignment Search Tool – BLAST

(Altschul iet al., 1990).

A análise filogenética das amostras obtidas no presente estudo, em comparação

com sequências depositadas no GenBank foi realizada no programa MEGA 7.0, baseada

no método de distância Neighbor-Joining (Saitou & Neil, 1987) e Tamura-3-parâmetros

(Tamura, 1992). O teste de Bootstrap com 1000 pseudoréplicas foi realizado para

estimar a confidência do padrão de agrupamento da árvore Neighbor-Joining.

(Felsenstein, 1985).

3.3. ANÁLISES ESTATÍSTICAS

Os dados foram categorizados em forma dicotômica (positivo e negativo). Em

seguida, foram estabelecidas as frequências absolutas e relativas dos casos positivos de

cinomose canina. As variáveis foram submetidas ao teste qui-quadrado para comparar as

prevalências, seguido do teste odds ratio para determinar a probabilidade de ocorrência

de animais positivos entre as variáveis e foram determinados os intervalos de confiança

de 95%. Todas as análises foram realizadas pelo PROC FREQ do programa SAS

(Edição Universitária) com nível de significância de 0,05.

37

4. RESULTADOS

4.1 nested-PCR para o gene N do VCC

O vírus da cinomose canina foi detectado através da nested- PCR para o gene N

em 86 (22,7%) das 378 amostras de sangue de cães analisadas no presente estudo,

observando-se a amplificação de um fragmento de DNA de 280 pb correspondente em

eletroforese em gel de agarose em cada uma delas (Figura 4).

Figura 4 – Gel de eletroforese demonstrando a amplificação de um fragmento de 280pbdo gene N do VCC em seis (A1-A6) das 86 amostras positivas detectadas no presenteestudo. C- e C+ correspondem, respectivamente, aos controles negativo (Aguabidestilada) e positivo (DNA de cão sabidamente infectado) usados para confiabilidadeda reação.

38

De um total de 194 fêmeas e de 184 machos, 43 animais de cada sexo foram

positivos correspondendo a 22,1% e 23,3%, respectivamente (Quadro 3).

Quadro 3- Total de cães analisados discriminando-se o número de amostras por gênero

e infecção por VCC.

Gênero Positivos Negativos Total

Machos 43 141 184

Fêmeas 43 151 194

Total 86 292 378

Informações sobre a idade puderam ser obtidas apenas para 311 animais, os

quais, seguindo critérios adotados por Freitas-filho et al. (2014), foram agrupados entre

filhotes (animais até um ano de idade); adultos (animais de dois a 10 anos de idade) e

idosos (animais acima de 10 anos de idade). Dessa forma foram analisadas 83 amostras

de cães filhotes, resultando em 33,7% de positividade (28 positivos); 184 amostras de

cães adultos, resultando em 17,3% de positividade (32 positivos) e 44 amostras de cães

idosos, com 09% de positividade (quatro positivos) (Quadro 4).

Quadro 4- Total de cães analisados discriminando-se o número de amostras por idade e

infecção por VCC.

Idade Positivos Negativos Total

Filhotes 28 55 83

Adultos 32 152 184

Idosos 04 40 44

INI 22 45 67

Total 86 292 378

39

*INI= idade não informada

Quanto à raça dos animais incluídos no estudo, 251 cães puderam ser

distinguidos entre cães com raça definida (147) e cães sem raça definida (104). Dentre

os positivos, 20 tinham definição de raça enquanto que 21 eram cães sem raça definida,

correspondendo a 13,6% e 20,1% respectivamente (Quadro 5).

Quadro 5- Total de cães analisados discriminando-se o número de amostras por raça e

infecção por VCC.

Raça Positivos Negativos Total

RD 20 127 147

SRD 21 83 104

RNI 45 82 127

Total 86 292 378

*RD= raça definida; SRD=sem raça definida; RNI= raça não informada

Informações acerca do quadro clínico dos animais foram disponibilizadas

somente para 113 cães no momento da entrada das amostras no laboratório de análise,

mas sabe-se que, excetuando-se um animal em que a investigação do vírus foi solicitada

pelo clínico somente como um exame de rotina pré-vacinação, todos os demais animais

tinham indício da presença da doença, seja pela manifestação de um ou mais sinais

40

clínicos sugestivos. Em 10 deles a exposição ao vírus através de alguma forma de

contato com animais infectados foi também relatada.

Os sinais clínicos observados foram separados em neurológicos (67/59,2%),

gastrointestinais (48/42,4%), oftalmológicos (35/30,9%), respiratórios (15/13,2%), e

dermatológicos (09/7,9%) (Quadro 6).

Dentre os 113 cães que possuíam histórico clínico 36 foram positivos e o sinais

clínicos mais observados entre eles (por ordem decrescente de frequência de

observação) foram: neurológicos (22/61,1%), gastrointestinais (20/55,5%);

oftalmológicos (18/50%); respiratórios (09/25%) e dermatológicos (5/13,87%), com a

combinação de dois ou mais tipos de sinais clínicos em 27 dos animais.

Com relação aos negativos foi observada a mesma ordem de frequência de sinais

clínicos observada para os positivos, que foram, em ordem decrescente: neurológicos

(45/58,4%); gastrointestinais (28/36,3%); oftalmológicos (17/22,0%); respiratórios

(06/7,7%) e dermatológicos (04/5,1%).

Quadro 6- Número de casos positivos e negativos para VCC por sinais clínicos

observados em ordem decrescente de observação.

Sinais clínicos Positivos Negativos Total

Neurológicos 22 45 67

Gastrointestinais 20 28 48

Oftalmológicos 18 17 35

Respiratórios 09 06 15

Dermatológicos 05 04 09

Em sete dos 10 animais que tiveram exposição ao vírus através de algum tipo de

contato com cães com cinomose, foi detectada a infeção pelo VCC.

41

No que se refere ao histórico vacinal, somente 51 cães puderam ser separados

entre não vacinados (que não receberam nenhuma dose da vacina); com vacinação

inadequada (que não completaram as doses iniciais ou que estavam com revacinação

atrasada) e vacinados (com vacinação completa e atualizada), correspondendo a 50,9%

(26), 29,4% (15) e 19,6% (10), respectivamente. O maior número de animais positivos

pertenceu ao grupo dos não vacinados (18/69,2%), seguido pelo grupo dos que não

possuíam uma vacinação adequada (08/53,3%) e dos vacinados adequadamente

(03/30%) (Quadro 7).

Quadro 7- Total de cães analisados discriminando-se o número de amostras por status

vacinal e infecção por VCC.

Status vacinal Positivos Negativos Total

Não vacinados 18 08 26

Vacinação inadequada 08 07 15

Vacinados 03 07 10

SVNI 57 270 327

Total 86 292 378

*SVNI= status vacinal não informado

42

A sazonalidade do vírus foi avaliada quanto ao número de amostras positivas

detectadas nos dois períodos bem distintos na região, sendo um chuvoso (dezembro a

maio) e outro menos chuvoso (junho a novembro) (Silva Junior et al., 2013). No

primeiro período o número de amostras encaminhadas ao LTB para investigação quanto

à presença de VCC foi de 213 animais, resultando em 63 positivos (29,5%), enquanto

que no período menos chuvoso foram encaminhadas 165 amostras, detectando-se a

positividade em 23 animais (13,9%) (Quadro 8).

Quadro 8- Total de cães analisados discriminando-se o número de amostras por período

do ano em que foram recebidas e infecção por VCC.

Período do ano Positivos Negativos Total

Período chuvoso 63 150 213

Período menos chuvoso 23 142 165

Total 86 292 378

As variáveis faixa etária e sazonalidade apresentaram relação de proporções

significativas (p<0,05). Para a faixa etária, há associações de probabilidade de

ocorrência de animais positivos para cinomose na comparação de filhotes com adultos e

filhotes com idosos em 2,42 e 5,09, respectivamente. Para a variável sazonalidade, o

existe a probabilidade significativa de 2,59 animais positivos no período chuvoso em

relação ao não chuvoso (Tabela 1)

As variáveis sexo, raça e prevenção vacinal não apresentaram associações

significativas (p>0,05) que influenciassem em animais positivos para cinomose canina.

Não há maior prevalência de um sexo em relação a outro, nem influencia entre as raças

na soropositivade para cinomose. Quanto à prevenção vacinal, a comparação entre os

não vacinados e os vacinados obteve probabilidade de 0,078 (bem próximo do nível de

significância de 0,05), o que podemos tomar como atenção, uma vez que entre essas

43

váriaveis observou-se a possibilidade de ocorrência de 5,25 positivos não vacinados

para 1 vacinado (Tabela 1).

Tabela 1- Variáveis analisadas para determinar a prevalência (%) e a probabilidade deocorrência (odds ratio) de animais positivos para cinomose canina viral.

Variáveis +/N + (%) Odds ratio P IC95%

Sexo

MachoFêmea

43/18443/194

23,3722,16 1,07 0,880 0,66-1,73

Faixa etária

FilhoteAdulto

Filhote

28/8332/184

28/83

33,7317,39

33,73

2,42

5,09

0,005

0,005

1,34-4,38

1,65-15,67

44

Idoso

AdultoIdoso

4/44

32/1844/44

9,1

17,399,1

2,11 0,260 0,70-6,30

Raça

SRDRD

21/10420/147

20,1913,61 1,61 0,224 0,82-3,15

Prevenção vacinal

Não vacinadosVacinação inadequada

Não vacinadosVacinados

Vacinação inadequadaNão vacinados

18/268/15

18/263/10

8/153/10

69,2353,33

69,2330,00

53,3330,00

1,97

5,25

2,67

0,496

0,078

0,459

0,53-7,32

1,07-25,70

0,49-14,46

Sazonalidade

ChuvosoMenos chuvoso

63/21323/165

29,5813,94 2,59 0,0005 1,53-4,40

+= Casos positivos; N= Número de amostras analisadas; P= Probabilidade; IC95%=Intervalo de confiança de 95%.

4.1.1. Detecção do VCC em cão assintomático

Em um dos animais em que o vírus foi investigado somente como respaldo para

a vacinação e que não apresentava sinais clínicos, foi detectada positividade para o

VCC. Trata-se de um cão de rua, sem raça definida, fêmea, de dois meses de idade, que

havia sido resgatado a poucos dias da detecção da infecção. A amostra de sangue desse

animal foi encaminhada para o laboratório de análise no dia 22 de fevereiro de 2016

para descartar também infecções por hemoparasitos visando a sua primovacinação,

constatando-se a positividade somente para o vírus da cinomose canina.

Foi realizada uma monitoração desse animal com envio de amostras de sangue

total para o laboratório a cada 15 dias até a constatação de uma segunda amostra

negativa para o vírus. A primeira amostra negativa para o VCC foi enviada 45 dias após

a descoberta da infecção (3° amostras após a detecção) e a segunda amostra

confirmatória 15 dias após a primeira, onde confirmou-se a negatividade para o vírus e o

45

animal pôde então ser vacinado. Informações sobre o tratamento instituído para esse

caso não foram obtidas.

4.1.2. (Re) infecção com VCC associado a caso de Tumor Venéreo Transmissível

(T.V.T.)

Em dezembro de 2016 a amostra de sangue total de um cão com sinais

oftalmológicos, gastrointestinais e neurológicos, foi encaminhada ao LTB com suspeita

clínica de cinomose, onde confirmou-se a presença do vírus. Esse cão, SRD, fêmea,

aparentando mais ou menos três anos de idade, era um animal de rua que tinha sido

resgatado recentemente e, portanto, provavelmente nunca tinha sido vacinado.

Decorridos dois meses da detecção, uma nova amostra de sangue foi analisada

onde não se constatou mais a presença do vírus pelas técnicas de nested-PCR aqui

empregadas para este fim, sendo analisada um mês depois uma nova amostra para

confirmar essa negatividade. O animal apresentava-se clinicamente saudável, com

apenas algumas sequelas neurológicas (espasmos musculares), quando foi instituído

então o protocolo de vacinação, com duas doses da vacina múltipla com intervalo de 21

dias entre elas (Protocolo estabelecido pelo veterinário responsável).

Em junho de 2017 esse mesmo cão foi diagnosticado com tumor venéreo

transmissível (TVT) e iniciou o tratamento com o quimioterápico vincristina® a cada

sete dias durante quatro semanas, fase em que apresentou novamente os sinais clínicos

sugestivos de cinomose, a qual foi confirmada pela detecção do vírus na amostra de

sangue total encaminhada em julho de 2017 ao LTB. O animal foi novamente tratado

para a doença e em novembro de 2017 uma nova amostra de sangue foi analisada, não

sendo mais detectada a presença de VCC na mesma.

4.1.3. Coinfecções de VCC com outros microrganismos infecciosos

As coinfecções de VCC com outros microrganismos foram observadas em cinco

dos animais positivos para o vírus no presente estudo, sendo que em quatro deles

constatou-se a positividade para o VCC e para hemoparasitoses e em um animal foi

46

detectada a positividade para o VCC juntamente com a positividade para o vírus da

parvovirose canina (CPV).

Dentre os animais diagnosticados com hemoparasitoses, um apresentava-se

infectado com Babesia vogeli, um com Ehrlichia canis, outro infectado com os dois

parasitos citados e o último infectado com Ehrlichia canis e Anaplasma platys. As

amostras de sangue total desses animais foram encaminhadas ao LTB para a

investigação quanto a presença desses microorganismos, bem como quanto a presença

do vírus da cinomose canina, detectando-se as co-infecções nas amostras através da

utilização de protocolos de nested-PCR específicos para os referidos agentes

patogênicos.

Já no animal em que foi detectada coinfecção com CPV, o diagnóstico de

parvovirose canina foi obtido através do uso de um teste imunocromatográfico realizado

na própria clínica onde o animal foi consultado, sendo em seguida encaminhada a sua

amostra de sangue total para o LTB para investigação quanto à presença do VCC.

Todos os animais eram filhotes não vacinados e três apresentavam somente

sinais clínicos gastrointestinais, enquanto o animal com erliquiose e babesiose, assim

como o que apresentava só a associação com erliquiose, manifestaram além dos sinais

gastrointestinais sinais clínicos neurológicos.

4.2. nested-PCR para o gene H do VCC

Uma alíquota de cDNA (2 µL) de cada uma das 86 amostras positivas detectadas

através da nested-PCR para o gene N do VCC foi utilizada para a realização de uma

nested-PCR para o gene H do vírus, importante para a análise da diversidade das cepas

agrupando-as em genótipos. Das 86 amostras analisadas, somente em 10 foi possível se

obter a amplificação completa do gene H.

47

Figura 5 – Gel de eletroforese demonstrando a amplificação dos fragmentos do gene Hde VCC amplificados em uma das amostras positivas do estudo. C-: controle negativo(Agua bidestilada); HA: primers H1F/H1R, 788pb; HB: primers H3R/H3RB, 525pb;HC: primer H3FB/H3R, 253pb; HD: primers CDVF10B/CDVR10, 870pb.

4.3. Purificação, sequenciamento e caracterização molecular

Foram purificados e sequenciados 25 amplicons do gene N e os 10 amplicons

obtidos para o gene H, no entanto, não foi possível utilizar as sequências nucleotídicas

de oito amostras positivas para o gene N e de nenhuma obtida para o gene H, devido à

reduzida qualidade das sequências. Dessa forma para a análise filogenética do presente

estudo foram utilizadas as sequências nucleotídicas de apenas 18 amostras positivas

para o gene N do VCC.Após alinhamento e edições as sequências foram comparadas

com sequencias de outros locais do país e do mundo depositadas no Genbank, usando a

ferramenta BLAST (Quadro 9). A árvore filogenética do gene N (figura 6) foi montada e

48

a história evolutiva foi inferida usando o método de Neighbord-Joining (Saitou & Nei,

1987).

Quadro 9- Número de acesso no GenBank, localização e ano das cepas utilizadas comocomparação com as cepas isoladas na região metropolitana de Belém

Número de acesso da cepa Localização Ano

JQ790535.1 Brasil/RS 2015

JQ790552.1 Brasil/RS 2015

JQ790551.1 Brasil/RS 2015

JQ790554.1 Brasil/RS 2015

JQ790555.1 Brasil/RS 2015

JQ790553.1 Brasil/RS 2015

DQ005126.1 Brasil/SP 2005

DQ005127.1 Brasil/SP 2005

DQ005132.1 Brasil/SP 2005

DQ005129.1 Brasil/SP 2005

DQ005128.1 Brasil/SP 2005

DQ005133.1 Brasil/SP 2005

AY738653.1 Brasil/SP 2004

AY738624.1 Brasil/SP 2004

KM586388.1 Brasil/PR 2014

KJ933692.1 Brasil/PR 2010

EU072200.1 Hungria 2005

HQ850150.1 China 2011

EF042819.1 China 2008

KM386684.1 China 2013

49

EF445050.1 China 2007

AY738625.1 (Lerdele) Brasil/SP 2004

AF305419.1(Onderstepoort)

Irlanda do Norte 2000

DQ887333.1 México 2008

EF445056.1 China 2007

JN381190.1 Japão 2011

50

51

Figura 6 – Árvore filogenética para o gene N de VCC utilizando o métodoNeighbord-Joining (Saitou & Nei, 1987), modelo Tamura-3-parâmetros (Tamura, 1992)construída a partir do programa MEGA7 (Kumar et al., 2016). A posições 1 a 18correspondem as cepas isoladas no presente estudo.

As sequências parciais do gene N obtidas no presente estudo apresentaram de

98,4% a 100% de identidade entre si. Com as cepas brasileiras, utilizadas como

comparação no estudo, apresentaram de 94,2% a 99,4% de identidade e 94,7% a 98,4%

com as cepas isoladas nos outros lugares do mundo comparadas aqui.

Com relação às cepas vacinais, as amostras isoladas no presente estudo

apresentaram de 95,7% a 96,8% de identidade com elas.

Apenas uma das cepas isoladas no presente estudo (VCCM17) apresentou sua

sequência nucleotídica conservada, todas as demais cepas apresentaram substituição de

uma timina por uma citosina na posição 88 de suas sequências nucleotídicas, tal qual

observada nas cepas vacinais utilizadas como comparação, Onderpoort (AF305419.1) e

Lardele (AY738625.1), e que não foram observadas nas sequências brasileiras e nas dos

demais países utilizados no estudo.

Essas amostras formaram um grupo separado no qual duas delas, VCCM3 e

VCCM15, apresentaram história evolutiva mais recente (Figura 6), com substituições

únicas não observadas em nenhuma outra cepa utilizada como comparação no presente

trabalho. Elas apresentaram substituição de timina por citosina em dois outros sítios

além do já citado acima, a primeira no sítio 144 e a segunda no sítio 51. Além disso a

cepa VCC3 apresentou também uma inserção de base na posição 12, não observada em

nenhuma outra cepa isolada no presente estudo, bem como em nenhum isolado utilizado

como comparação, entando essa cepa posicionada no ramo mais recente da árvore.

A amostra VCCM17 agrupou separadamente dos demais isolados do presente

estudo, estando mais próxima evolutivamente e apresentando maior identidade com as

cepas brasileiras isoladas nas regiões do sul e sudeste do Brasil que com as cepas de

outros lugares do mundo, inclusive as vacinais.

52

Quadro 9- Diferenças nucleotídicas entre o gene N das cepas isoladas no presenteestudo, isoladas em outras regiões do Brasil e do mundo, e das cepas vacinais (negrito).Amostras de cepas selvagens representativas de cada divergência nucleotídica foramselecionadas. Todas as demais cepas não listadas no quadro, que foram isoladas nopresente estudo, apresentam a mesma sequência nucleotídica da cepa VCCM1(*)

0

5

1

2

1

6

1

9

2

1

5

1

5

9

6

3

7

2

7

8

8

8

9

9

1

1

4

1

2

9

1

4

7

1

5

0

1

5

3

1

8

9

VCCM17 C - A C T T T G A T T A G T T A G G

VCCM3 . C . . . . . . . . C . C . . . . .

VCCM15 . . . . . C . . . . C . . . . . . .

VCCM1* . . . . . . . . . . C . . . . . . .

JQ790552.1 . . . . . . . . . . . . . . . . . .

JQ790535.1 . . . . . . T . . . . . . . . . . .

DQ005126.1 . . . . . . . . . . . . . . . . . .

DQ005129.1 . . . . . . . . G . . . . . . . . .

DQ005128.1 . . . . C . . . . . . . . . . . . A

DQ005134.1 . . . . . . . . . . . . . . . . . A

DQ005130.1 . . . . . . . . . . . . . . C . . A

KM586388.1 . . . . . . . . . . . . . . . . . .

AY738653.1 . . . . . . . . . . . . . . . . . .

AY738624.1 . . . . . . . . . . . . . . . . . .

EU072200.1 . . . . . . . . . . . . . C . . A

HQ850150.1 . . . . . . . T . . . . . C C . . A

EF042819.1 . . . . . . . . . . . . . . C . . A

KM386684.1 . . . . . . . . . . . . . . C . A A

DQ887333.1 . . . . . . . . . . . . . . C G . A

EF445056.1 . . C . . . . T . . . . . . C T A A

53

JN381190.1 T . . A . . . . . G . . . . C T . A

AY738625.1 . . . . . . . . G . C G . . C . A A

AF305419.1 . . . . . . . . G . C G . . C . A A

5. DISCUSSÃO

A natureza contagiosa e as altas taxas de mortalidade da cinomose canina

evidenciam a necessidade do aceleramento do diagnóstico dessa enfermidade para a

adoção de procedimentos adequados que visem a diminuição da propagação do vírus.

Protocolos precisos de vacinação, bem como bons programas de vigilância são de

grande importância, além de métodos confiáveis de detecção (Wang et al., 2011).

Embora diferentes genes tenham sido utilizados para o diagnóstico e

caracterização das sequências de VCC obtidas, o gene N, altamente conservado, parece

ser o melhor alvo para as técnicas de biologia molecular, uma vez que, outros genes

menos conservados podem possuir alterações que impeçam a ligação dos primers

utilizados, gerando resultados falso negativos (Calderon et al., 2007; Castilho et al.,

2007; Gámiz et al., 2011; Wang et al., 2011; Di Francesco et al., 2012; Alcalde et al.,

2013; Yi et al., 2013; Fisher et al., 2013; Macedo et al.,2015).

Diversos métodos de RT-PCR baseados na detecção do gene N do VCC vêm

sido desenvolvidos, no entanto, a RT-PCR combinada com a nested-PCR mostrou-se

ser o método mais sensível para este fim. (Kim et al., 2001; Shin et al., 2004; Józwik &

Frymus, 2005; Castilho et al., 2007; Alcade et al., 2013; Fisher et al., 2013).

No presente estudo, através da nested-PCR para o gene N do VCC, foi

observada uma prevalência de 22,7% da cinomose canina na região metropolitana de

Belém, não sendo observadas diferenças significativas entre o sexo dos animais

estudados (P >0,05), assim como nos estudos realizados anteriormente nessa mesma

cidade por Guedes et al. (2009) através de testes imunocromatogáficos. Headley &

Graça (2000), Borba et al. (2002); Dezengrini et al., (2007), Hass et al. (2008); Sonne et

al. (2009); Freitas-Filho et al. (2014) e Lúcio et al. (2014) também não detectaram

relação entre a positividade e o gênero dos cães analisados em estudos realizados no

Brasil.

Por outro lado, Alex & Dhanapalan (1994) na Índia e Temilade et al. (2015) na

Nigéria, demonstraram que esse pode sim ser considerado um fator de risco para a

54

infecção por VCC, uma vez que foi relatada maior prevalência do vírus entre os machos

do que nas fêmeas no primeiro estudo e o inverso no segundo.

De acordo com Tipold et al. (1992), Sherding (2003), Baumann (2004) e

Martella et al. (2008), além de não possuir predisposição para o sexo, a cinomose

acomete cães de qualquer idade e raça, sendo mais acometido os animais entre 3 e 6

meses de idade, não vacinados, após terem perdido os anticorpos maternos.

Headley et al. (2012), ao realizarem um estudo epidemiológico da infecção pelo

VCC no Brasil, observaram que filhotes e cães jovens foram mais freqüentemente

infectados pelo vírus em comparação aos animais mais velhos, acreditando que isso

possa estar relacionado com o fato de que os filhotes não estão totalmente protegidos

pela imunização passiva, enquanto que os cães jovens podem não ter sido totalmente

vacinados e, portanto, serem infectados quando exposto ao vírus.

No presente estudo o maior número de positividade foi encontrado entre os cães

de até um ano de idade (33,7%) ainda que o maior número de animais investigados

pertencesse ao grupo dos adultos, demonstrando relação de proporções significativas

(p<0,05) entre a faixa etária dos animais estudados. Esses resultados estão de acordo

com o exposto na literatura e com os dados obtidos por Headley & Graça (2000), Bohm

et al. (2004), Sonne et al. (2009) e por Temilade et al. (2015), no entanto, divergem dos

resultados obtidos por Silva et al. (2007) e por Freitas-Filho et al. (2014), cujos estudos

não observaram diferenças significativas entre as idades dos cães investigados.

A vacinação continua a ser a maneira mais econômica de controlar a cinomose

canina e a partir do uso de vacinas vivas modificadas a incidência da doença em cães

reduziu consideravelmente (Temilade, 2015), no entanto, muitos animais não são

vacinados, dentre outros fatores, devido a negligências ou às condições financeiras de

seus tutores, o que explica o caráter endêmico dos vírus em algumas regiões

(Budaszewski, 2013).

Embora na presente pesquisa a variável prevenção vacinal não tenha apresentado

associações significativas (p>0,05) que influenciassem em animais positivos para

cinomose, a maior prevalência foi observada nos cães não vacinados (69,2%), assim

como nos resultados obtidos por Monti et al. (2007) e Amaral (2007).

55

Segundo Megide et al. (2013), sob condições experimentais a vacinação pode

produzir imunidade prolongada em elevada porcentagem dos animais, sendo capaz de

determinar pelo menos três anos de imunidade em cães saudáveis.

Embora em alguns lugares o protocolo de revacinação anual ainda seja praticado

e algumas vacinas ainda portem uma DI mínima de um ano em seus rótulos, essa prática

já vem sendo questionada há bastante tempo sendo sugerida a adoção de intervalos

maiores entre as doses (Monti, 2004; Almendra et al., 2005; Amaral, 2007) e, dessa

forma, atualmente o VGG recomenda a revacinação de cães em intervalos de três anos

ou mais. No entanto, os dados sobre a DI são conflitantes, uma vez que Monti (2004)

realizou um estudo no Brasil onde verificou grande porcentagem de títulos abaixo do

considerado protetor em cães que foram vacinados adequadamente.

No presente estudo, em três (30%) dos 10 animais que apresentavam vacinação

em dia (revacinação anual ou trienal) foi detectada presença do vírus nas amostras

analisadas, assim como nos estudos conduzidos por Amaral (2007), Budaszewski et al.

(2013) e Temilade et al. (2015), que também detectaram positividade em animais

vacinados adequadamente, demonstrando que as vacinas não fornecem uma proteção

absoluta contra a doença ou protegem todos os animais igualmente, como descrito por

Megid et al. (2013).

De acordo com Megid et al. (2013), o grau e duração da proteção vacinal variam

com o tipo de vacina e com o animal, assim como a dose infectante, virulência e

prevalência do patógeno, devendo-se avaliar os riscos e benefícios da vacinação e

determinar os protocolos vacinais mais apropriados baseando-se nas necessidades

individuais de cada animal.

As especulações para explicar os casos de falhas vacinais são variadas, mas

incluem imunossupressão do animal infectado; tempo insuficiente para este desenvolver

imunidade após a vacinação; acondicionamento inadequado das vacinas; presença de

anticorpos derivados da mãe; incapacidade genética para responder a certos antígenos

vacinais e lotes de vacinas ineficazes (Temilade et al., 2015).

Segundo Biazzono et al. (2001) a imunidade adquirida após a exposição ao vírus

da cinomose é de longa duração em contraposição à imunidade transferida pela mãe e os

cães apresentam altas concentrações de anticorpos para o VCC após a infecção natural

ou vacinação bem-sucedida.

56

No entanto, no presente estudo um animal que já havia apresentado infecção

pelo VCC em dezembro de 2016 e que havia sido vacinado três meses depois, quando

contatou-se que ele não apresentava mais positividade para o vírus em pesquisa

molecular, apresentou novamente positividade na sua amostra de sangue analisada em

menos de um ano após a primeira detecção.

Infelizmente as amostras desse animal obtidas nos dois momentos da detecção

do VCC não geraram sequências nucleotícas satisfatórias para podermos inferir se se

tratava da mesma cepa viral, que permaneceu em estado de latência nesse animal e por

algum motivo voltou a replicar sendo detectado novamente pela técnica de nested-PCR

empregada no presente estudo, ou se tratava de uma nova infecção por outra cepa viral.

Esse animal tinha sido diagnosticado com Tumor Venéreo Transmissível, um

tipo de neoplasia maligna, e foi tratado com quimioterápicos um mês antes de

aparecerem os sinais clínicos sugestivos de nova infecção para o VCC, o que pode ter

contribuído para a nova positividade, uma vez que a hipótese da ocorrência da

diminuição dos títulos de anticorpos para vírus comuns devido a imunossupressão

causada pelos efeitos sistêmicos do câncer e da administração de agentes

quimioterápicos em cães com neoplasias malignas, já foi levantada (Henry et al., 2001).

Em humanos essa associação já foi melhor estudada em pacientes oncológicos

adultos e pediátricos, constatando-se que a imunidade a alguns vírus, como o vírus do

sarampo (intimamente relacionado ao VCC), foi comprometida em pacientes

submetidos à terapia antineoplásica, com os títulos virais em resposta à quimioterapia

variando com os diferentes vírus examinados (Ridgway & Wolff, 1991;1993)

O significado clínico desses achados em pacientes veterinários com neoplasias

malignas ainda não foi totalmente elucidado. Embora estudos anteriores que avaliaram a

associação entre a quimioterapia contra o câncer e os títulos de anticorpos contra o

VCC, CPV e o vírus da raiva tenham demonstrado que esses títulos permaneceram em

níveis satisfatórios em animais com neoplasias malignas (Henry,2001), maiores estudos

necessitam ser realizados, entendendo as particularidades de cada indivíduo a fim de se

manter uma proteção adequada dos pacientes submetidos a quimioterapia.

No Brasil os cães sem raça definida são frequentemente associados com a

disseminação do vírus, sendo os mais infectados em estudos realizados em Santa

57

Maria/RS (54%) (Headley & Graça, 2000), Porto Alegre/RS (44%) (Sonne et al., 2009)

e aqui em Belém/PA (30%) (Guedes et al., 2009). No presente estudo a variável raça

não apresentou associações significativas (p>0,05) que influenciassem em animais

positivos para cinomose, no entanto, a maior positividade para o vírus foi detectada

entre os cães sem raça definida (20,1%) em relação aos que tinham definição de raça

(13,6%), resultados divergentes dos encontrados por Freitas-Filho et al. (2014), cuja

maior positividade se deu entre os animais de raças puras.

Segundo Headley et al. (2012) e Freitas-Filho et al. (2014) os índices elevados

de infecção por VCC em cães sem raça definida no Brasil estão diretamente

relacionados ao seu estilo de vida, pois são mais propensos a percorrerem espaços

semi-urbanos e rurais, apresentando maiores chances de entrarem em contato com o

patógeno proveniente de outros cães já contaminados, além de que, os cães de raça pura

são mais rigorosamente vacinados contra o VCC do que os sem raça definida.

Quanto aos sinais clínicos apresentados pelos animais da presente pesquisa, os

mais observados, tanto nos animais positivos quanto nos animais negativos foram os

sinais neurológicos, sendo relatado em 55,7% dos casos. Em 29 cães, foi o único sinal

observado, com apenas três deles apresentando positividade para o VCC, concordando

com Amude et al. (2010) que citam que a apresentação neurológica pode ser o único

sinal clínico de infecção pelo vírus.

O número de animais apresentando somente sintomatologia neurológica e que

não foram positivos para VCC (26 animais) enfatiza ainda os relatos dos autores citados

acima quanto a dificuldade de se obter um diagnóstico clínico de cinomose nervosa,

uma vez que, muitas outras disfunções do SNC podem levar a apresentações

semelhantes.

Esses autores citam ainda que, ocasionalmente, o diagnóstico de cinomose pode

ser um desafio para o veterinário e que, no entanto, em áreas onde o VCC é endêmico,

como no Brasil, a cinomose deve ser sempre considerada como um importante

diagnóstico diferencial em cães com doença neurológica progressiva e multifocal e que

mesmo na disfunção nervosa focal, a infecção por VCC deve ser investigada.

A combinação de mais de um tipo de sinal clínico foi relatada em 27 dos animais

positivos e segundo Amude et al. (2010) e Lempp et al. (2014), o curso e o desfecho da

doença, assim como o tipo de apresentação neuropatológica, estão diretamente

58

relacionados à cepa do vírus, bem como à idade e imunocompetência do animal afetado,

sendo esses últimos os principais determinantes da apresentação clínica e patológica da

enfermidade.

Os sinais não neurológicos mais observados entre os animais com histórico

clínico foram os gastrointestinais seguido dos oftalmológicos, no entanto, os

oftalmológicos foram mais confiáveis (18 positivos dos 35 casos relatados) em

comparação aos gastrointestinais (20 positivos dos 48 casos relatados) para um

diagnóstico clinico de cinomose nos animais.

Esses resultados foram similares aos encontrados por Amaral (2007), que em sua

pesquisa também observou maior predomínio de alterações oftalmológicas nos animais

positivos para VCC, diferindo do presente estudo apenas quanto aos sinais

gastrointestinais, que foi o terceiro mais relatado estando atrás apenas dos sinais

respiratórios.

Dos 378 cães analisados na presente pesquisa, somente um estava aparentemente

saudável não apresentando nenhuma sintomatologia clínica, no qual o exame foi

solicitado apenas como cautela para a realização de uma vacinação segura, sendo

detectado, no entanto, a positividade para VCC nesse animal. Esse resultado, bem como

os apresentados por Temilade et al (2015), que detectaram maior prevalência para a

infecção por VCC em cães saudáveis, estão de acordo com Greene & Appel (2006), que

afirmam que mais de metade das infecções por VCC em cães domésticos ocorrem de

forma subclínica.

Esse cão, de acordo com os resultados obtidos, possuía grande fator de risco para

a infecção, pois se tratava de um filhote não vacinado que era animal de rua e,

possivelmente, teve alguma forma de contato com outros animais infectados, sendo a

exposição um fator importante para a infecção observado no presente estudo, uma vez

que dos 10 animais em que uma possível exposição foi relatada, em sete foi detectada a

positividade para o vírus. Infelizmente o sequenciamento da amostra desse animal

também não gerou sequências nucleotídicas satisfatórias para que pudéssemos avaliar as

características filogenéticas dessa cepa e associa-las com curso dessa infecção.

59

O percentual de animais negativos obtidos na presente pesquisa, considerando

somente aqueles em que se obteve alguma informação sobre sinais clínicos

apresentados, foi de 79,6%, corroborando a literatura que cita que em muitas situações

os sinais clínicos sugestivos de cinomose são geralmente devidos a outros agentes virais

e/ou bacterianos (Demeter et al., 2007; Leisewitz et al., 2001).

Como os sinais clínicos iniciais após a infecção podem ser indicativos não

apenas de VCC, esses podem ser enganosos e o uso regular dos testes diagnósticos

específicos, como a PCR, são indicados para o diagnóstico confirmatório (Demeter et

al, 2009).

Além das infecções bacterianas secundárias comumente observadas em cães com

cinomose, outras coinfecções têm sido descritas na literatura (Silva et al., 2007; Headley

et al., 2009). No presente estudo cinco cães apresentaram algum outro tipo de infecção

associada ao VCC, sendo que em um deles o vírus foi detectado simultaneamente a um

caso de parvovirose canina, assim como os achados de Headley et al. (2003; 2013) E

Silva et al. (2014). Nos demais cães o VCC foi associado a casos de hemoparasitoses,

assim como o descrito por (Miranda et al., 2011).

Esses achados corroboram relatos anteriores que sugerem que os efeitos

imunossupressores do VCC podem facilitar a manutenção de outros agentes patogênicos

(Damián et al., 2006; Chvala et al., 2007; Headley et al., 2013).

Na presente pesquisa, todos os animais que estavam infectados com outros

patógenos concomitantemente à infeção por VCC eram filhotes não vacinados, o que

pode ter facilitado essas coinfecções, pois de acordo com Headley et al. (2013) os

efeitos imunossupressores do vírus somados a um sistema imunológico

subdesenvolvido de filhotes podem facilitar a ocorrência e manutenção simultânea de

agentes infecciosos.

Segundo Silva junior (2013), o clima na cidade de Belém/PA é tropical chuvoso

e as variações sazonais são classificadas com base na pluviometria. Dessa forma

existem dois períodos bastante distintos na região, sendo um chuvoso (dezembro a

maio) e outro menos chuvoso (junho a novembro).

60

No presente estudo a variável sazonalidade apresentou relação de proporções

significativas (p<0,05), existindo a probabilidade de ocorrerem 2,59 casos positivos no

período chuvoso, que corresponde a época mais fria nessa região, em relação ao não

chuvoso. Guedes et al. (2009) também constataram o maior número de casos ocorrendo

nesse período mais frio aqui nessa mesma cidade. No sul do Brasil Headley & Graça

(2000) e Borba et al. (2002), também encontraram maior prevalência de cinomose nos

meses mais frios demonstrando uma tendência sazonal da doença que corresponde a

épocas mais frias do ano

De acordo com a literatura, embora a influência exata das variações sazonais na

ocorrência de cinomose seja obscura, as estações mais frias do ano favorecem a

manutenção da estabilidade das partículas virais e têm sido relacionadas a

imunossupressões, principalmente em caninos recém-nascidos, recém-desmamados e

não adequadamente vacinados (Alex & Dhanapalan, 1994; Swango, 1997).

Quanto aos resultados de filogenia, no presente estudo 17 das 18 amostras

sequenciadas apresentaram um ou mais polimorfismos em suas sequências

nucleotídicas, as quais não foram observadas nas sequências obtidas de outras regiões

do Brasil e do mundo utilizados como comparação para esta pesquisa. Apesar do gene N

constituir a região mais conservada do genoma do VCC, variações dentro desse gene

entre os isolados do Brasil e do mundo já haviam sido descritas (Parks et al., 1992;

Curran et al., 1993; Yoshida et al.,1998; Castilho et al, 2007; Calderon et al., 2007;

Sarute et al., 2011; Fisher et al., 2013), tornando também este gene adequado para a

diferenciação entre as cepas de VCC circulantes e para sua epidemiologia molecular

baseada em filogenia (Castilho et al., 2007).

Vale ressaltar que as sequências obtidas nesta pesquisa pertencem à região

central desse gene, região mais conservada e que, portanto, exibe a maior semelhança

entre as cepas, fornecendo resolução suficiente para se chegar a conclusões confiáveis,

segundo Castilho et al., (2007).

As cepas selvagens isoladas no presente estudo apresentaram de 98,4% a 100%

de identidade entre si e foram segregadas em dois grupos distintos do grupo que incluem

as cepas vacinais Onderstepoort e Lederle (figura 6), com as quais apresentaram 95,7%

a 96,8% de identidade. Essa distância entre as cepas selvagens e vacinais, analisando-se

61

sequências parciais do gene N¸ já foi observada anteriormente, como nos estudos

conduzidos por Yoshida et al. (1998), Castilho et al. (2007) e Fisher et al. (2013),

apesar da grande maioria das pesquisas para identificação dessas diferenças serem

conduzidas através da análise filogenética do gene H (Rosa et al., 2012; Zhao et al.,

2014; Budaszewski et al., 2016).

Todas as sequências nucleotídicas obtidas no presente estudo foram oriundas de

cepas isoladas de cães não vacinados, impossibilitando a correlação entre o

distanciamento entre as cepas selvagens e as cepas utilizadas em formulação de vacinas

com a ocorrência de falhas vacinais.

Com exceção de uma cepa da presente pesquisa (VCCM17) que foi agrupada

juntamente com amostras identificadas no Sul e Sudeste do Brasil, apresentando 100%

de identidade com elas, todas as demais amostras formaram um clado único, separadas

das demais cepas brasileiras e do mundo que foram utilizadas como comparação através

da ferramenta BLAST do GenBank, sugerindo que possa haver duas linhagens de VCC

circulando na região metropolitana de Belém, uma das quais é similar as que circulam

nas regiões Sul e Sudeste (Castilho et al., 2007)

As cepas VCCM3 e VCCM15 foram as que apresentaram maiores

polimorfismos, com substituições únicas não observadas em nenhuma outra cepa

isolada ou utilizada como comparação no presente trabalho. A primeira apresentou a

substituição de timina por citosina na posição 144 e a segunda na posição 51. A

VCCM3 apresentou ainda uma inserção de base na posição 11, sendo essa cepa

posicionada no ramo mais recente da árvore.

Ambas foram isoladas de cães adultos que apresentavam combinação de sinais

clínicos, incluindo neurológicos, no entanto, apesar da cepa viral influenciar no

desfecho e nas manifestações clínicas da doença (Martella et al., 2008; Amude et al.,

2010; Lempp et al. 2014), não podemos afirmar que a gravidade dos sinais clínicos

apresentados por esses animais tenha sido devido as alterações apresentadas nas

sequências nucleotídicas dessas amostras, uma vez que a cepa VCCM17, a única que

apresentou sequência nucleotídica conservada, foi isolada de um cão apresentando as

mesmas características desses animais.

62

Além disso a sequência nucleotídica da cepa detectada no cão assintomático do

presente estudo não pôde ser obtida para podermos fazer melhores comparações entre o

desfecho clínico da doença e tipo de cepa selvagem infectante.

Como foram encontradas variações no gene mais conservado do VCC nas

amostras analisadas no presente estudo, tal qual já encontrado em pesquisas realizadas

anteriormente, é esperado que maiores polimorfismos em genes mais variáveis, como H

e F, possam ser encontrados (Castilho et al., 2007; Calderon et al., 2007; Sarute et al.,

2011; Fisher et al., 2013).

O gene H é o mais comumente utilizado para a tipagem molecular das cepas de

VCC uma vez que possui a maior variabilidade dentro do genoma viral permitindo a

separação das amostras identificadas em genótipos de acordo com sua localização

geográfica, sendo que as sequências que possuem acima de 95% de similaridade são

consideradas pertencentes a um mesmo genótipo (Budaszewski et al., 2013; Panzera et

al., 2014; Ke et al., 2015).

De acordo com a análise do gene H, segundo relatos anteriores, todas as cepas

brasileiras de VCC que foram caracterizadas filogeneticamente pertencem à linhagem

EU1/SA1 (Budaszewski et al., 2014; Panzera et al., 2014). Na presente pesquisa não foi

possível se obter sequências nucleotídicas de qualidade para o gene H nas amostras

analisadas e, portanto, não foi possível determinar o genótipo dessas cepas detectadas.

O número reduzido de sequências obtidas na presente pesquisa para o gene N e

mais acentuadamente para o gene H do VCC pode ser explicado pela intensa

instabilidade do vírus (Greene & Appel, 2006), uma vez que a maioria das amostras

positivas permaneceram estocadas a -70°C por mais de um ano até as análises finais da

pesquisa, o que pode ter gerado perda de material genético nas mesmas, embora a

literatura relate que o vírus seja capaz de sobreviver por vários anos em temperaturas

abaixo de -76°C (Zee, 2003; Quinn et al., 2005).

Diante dessas incertezas o mais prudente é que se realizem todas as etapas de

detecção, caracterização e filogenia do vírus no menor espaço de tempo possível, afim

de se evitar a degradação do RNA viral nas amostras analisadas e se obter o maior

número de dados possíveis para uma análise filogenética mais robusta e confiável.

63

O gene N tem sido mais amplamente utilizado para efeito de diagnóstico da

cinomose canina do que para análise da diversidade genética entres as cepas de VCC

circulantes no mundo, existindo poucos estudos focados na correlação entre as mutações

encontradas nesse gene e antigenicidade e patogenicidade do vírus (Gámiz-Mejía et al.,

2012).

Embora no presente estudo não tenha sido realizado nenhum teste

correlacionando a presença destes polimorfismos encontrados com possíveis ‘falhas’

vacinais nos cães, ficou evidente o distanciamento das cepas isoladas aqui com as

utilizadas nas formulações de vacinas, necessitando-se de estudos adicionais, baseados

principalmente nos genes mais variáveis do VCC, para se chegar a conclusões

confiáveis quanto a proteção que as vacinas conferem nos animais contra as cepas

circulantes aqui na região.

Vale ressaltar que não existe até o momento estudos acerca da variabilidade

genética do VCC na região Norte do Brasil e mesmo os estudos epidemiológicos

utilizando outras técnicas de diagnóstico, como os sorológicos, são escassos nessa

região. Portanto, os resultados obtidos pela presente pesquisa fornecem dados

importantes para as estragéias de controle do vírus na região e levanta a hipótese da

existência de diferentes linhagens de VCC circulando entre a gama de hospedeiros

suscetíveis que aqui habita.

6. CONCLUSÕES

Foram analisadas 378 amostras sanguíneas de cães da região metropolitana de

Belém/PA obtendo-se uma prevalência de 22,7% da cinomose canina nessa região.

As variáveis sexo, raça e prevenção vacinal não apresentaram associações

significativas (p>0,05) que influenciassem em animais positivos para a enfermidade

As variáveis faixa etária e sazonalidade apresentaram relação de proporções

significativas (p<0,05), ocorrendo maiores casos de cinomose entre os filhotes e no

período chuvoso.

Os sinais clínicos mais observados entre os animais positivos foram os sinais

neurológicos seguidos dos gastrointestinais e oftalmológicos.

64

Com exceção de uma cepa, todas as demais amostras sequenciadas apresentaram

um ou mais polimorfismos no gene N, os quais não foram observadas nas sequências

obtidas de outras regiões do Brasil e do mundo utilizados como comparação para a

pesquisa.

Uma das cepas isoladas em Belém/PA foi agrupada juntamente com amostras

identificadas no Sul e Sudeste do Brasil, apresentando 100% de identidade com elas,

todas as demais amostras formaram um clado único, separadas das demais cepas

brasileiras e do mundo, inclusive das cepas vacinais.

Estudos mais aprofundados serão necessários para conclusões confiáveis quanto

a proteção que as vacinas conferem nos animais contra as cepas circulantes aqui na

região de Belém/PA.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

ABDELMAGID, O. Y.; LARSON, L.; PAYNE, L.; TUBBS, A.; WASMOEN, T.;SCHULTZ, R. Evaluation of the efficacy and duration of immunity of a caninecombination vaccine against virulent parvovirus; infectious canine hepatitis virus;and distemper virus experimental challenges. Veterinary Therapeutics: Researchin Applied Veterinary Medicine 5 (3): 173–186, 2004.

65

ALCALDE, R.; KOGIKA, M.M.; FORTUNATO, V.A.B; COELHO, B.M.P.; LOPES,L.R.; PAIVA, P.B.; DURIGON, E.L. Canine distemper virus: detection of viralRNA by Nested RT-PCR in dogs with clinical diagnosis. Braz. J. Vet. Res. Anim.Sci. 50 (1): 74-76, 2013.

ALEX, P.C.; DHANAPALAN, P. Distemper encephalitis in dogs: incidence,symptomathology and electroencephalographic findings. Journal of Veterinaryand Animal Sciences 25: 127-31, 1994.

ALMENDRA, C.; PINTO, O.; CARMICHAEL, L.; TAVARES, L. Determinação dosníveis de imunidade humoral induzidos pela vacinação contra a Esgana e aParvovirose Caninas. Revista Portuguesa de Ciências Veterinárias 100(553-554): 75-84, 2005.

AMARAL, H.A. Detecção do Vírus da Cinomose pela Técnica de RT-PCR em Cãescom Sintomatologia Neurológica. Tese (Doutorado em Medicina Veterinária) – SãoPaulo, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, 2007. 72p.

AMUDE, A. M.; ALFIERI, A. A.; ALFIERI, A. F. Antemortem Diagnosis of CDVInfection by RT-PCR in Distemper Dogs with Neurological Deficits without theTypical Clinical Presentation. Veterinary Research Communications 30:679–687, 2006.

AMUDE, A. M.; ALFIERI, A. A.; ALFIERI, A. F. Clinicopathological findings in dogswith distemper encephalomyelitis presented without characteristic signs of thedisease. Research in Veterinary Science 82: 416–422, 2007.

AMUDE, A.M., ALFIERI, A.F.; ALFIERI, A.A. Clinical courses and neurologicalsigns of canine distemper virus infection in dogs. Formatex 723-728, 2010.

AN, D.J.; KIMB, T.Y.; SONGC, D.S.; KANGC, B.K.; PARK, B.K. Animmunochromatog-raphy assay for rapid antemortem diagnosis of dogs suspectedto have caninedistemper. Journal of Virological Methods 147: 244–249, 2008.

APPEL, M.J.G.; SUMMERS, B.A. Canine Distemper: Current Status. Recent Advancesin Canine Infectious Diseases. In: Recent Advances in Canine InfectiousDiseases. L.E. Carmichael (Ed.). Publisher: International Veterinary InformationService (www.ivis.org), 1999.

ARNS, C.W.; SPILKI, F.R.; ALMEIDA, R.S. Paramyxoviridae. In: VirologiaVeterinária: Virologia Geral e Doenças Víricas. Flores, E.F. Santa Maria,UFSM, 2012. P. 759-792.

BAUMANN, G. Ortomixovírus e Paramixovírus. In: Doenças Infecciosas em AnimaisDomésticos. BEER, J. São Paulo, Roca, 2004. P.120-166.

BEINEKE, A.; PUFF, C.; SEEHUSEN, F.; BAUMGARTNER, W. Pathogenesis andimmunopathology of systemic and nervous canine distemper. VeterinaryImmunology Immunopathology 127:1-18, 2009.

66

BIAZZONO, L.; HAGIWARA, K.M.; CORRÊA, A.R. Avaliação da resposta imunehumoral em cães jovens imunizados contra a cinomose com vacina de vírusatenuado. Braz. J. vet. Res. anim. Sci. 38 (5): 245-250, 2001.

BLANCOU, J. Dog distemper: imported into Europe from South America? HistoriaMedicinae Veterinariae 29 (2): 35-41, 2004.

BORBA, T.R.; MANNIGEL, R.C.; FRAPORTI, C.K.; HEADLEY, S.A.; SAITO, T.B. Cinomose: dados epidemiológicos Maringá-PR (1998-2001). Iniciação CientíficaCESUMAR 4 (1): 53-56, 2002.

BOHM, M.; THOMPSON, H.; WEIR, A.; HASTED, A.M.; MAXWELL, N.S.;HERRTAGE, M.E. Serum antibody titres to canine parvovirus, adenovirus anddistemper virus in dogs in the UK which had not been vaccinated for at least threeyears. Veterinary Records154:457–463, 2004

BROWN, D.D.; COLLINS, F.M.; DUPREX, W.P.; BARON, M.D.; BARRETT, T.;RIMA, B.K. “Rescue” of mini-genomic constructs and viruses combinations ofmorbiliviruses N, P and L proteins. Journal of General Virology 86: 1077-4081,2005.

BUDASZEWSKI, R.F.; PINTO, L.D.; WEBER, M.N.; CALDART, E.T.; ALVES,C.D.; MARTELLA, V.; IKUTA, N.; LUNGE, V.R; CANAL, C.W. Genotyping ofcanine distemper virus strains circulating in Brazil from 2008 to 2012. VirusResearch 180: 76-83, 2014.

BUDASZEWSKI, R.F.; VON MESSLING, V. Morbillivirus Experimental AnimalModels: Measles Virus Pathogenesis Insights from Canine Distemper Virus.Viruses 8 (274): 1-12, 2016.

BUDASZEWSKI, R.F.; STRECK, A.F.; WEBER, M.N.; SIQUEIRA, F.M.; GUEDES,R.L.M.; CANAL, C.W. Influence of vaccine strains on the evolution of caninedistemper virus. Infection, Genetics and Evolution 41: 262–269, 2016.

CALDERON, M.G.; REMORINI, P.; PERIOLO, O.; IGLESIAS, M.; MATTION, N.,TORRE, J.L. Detection by RT-PCR and genetic characterization of caninedistemper virus from vaccinated and non-vaccinated dogs in Argentina. VeterinaryMicrobiology 125: 341–349, 2007.

CARVALHO, O.V.; BOTELHO, C.V.; FERREIRA, C.C.T.; SCHERER, P.O.;SOARES-MARTINS, J.A.P.S.; ALMEIDA, M.R.; SILVA JÚNIOR, A.Immunopathogenic and NeurologicalMechanisms of Canine Distemper Virus.Advances in Virology 1-10, 2012.

CASTILHO J.G.; BRANDÃO P.E.; CARNIELI J.R.P.; OLIVEIRA R.N.; MACEDOC.I.; PEIXOTO, Z.M.P.; CARRIERI, M.L.; KOTAIT, I. Molecular analysis of theN gene of canine distemper virus in dogs in Brazil. Arq. Bras. Med. Vet. Zootec.59: 654-659, 2007.

67

CORRÊA, C.N.M. Cinomose. In: Enfermidades Infecciosas dos MamíferosDomésticos. Corrêa, W.M.; Corrêa, C.N.M. Rio de Janeiro, Medsi, 1992. P.655-670.

CURTI, M.C.; ARIAS, M.V.B.; ZANUTTO, M.S. Avaliação de um Kit de imunoensaiocromatográfico para detecção do antígeno do vírus da cinomose em cães com sinaissistêmicos ou neurológicos da doença. Semina: Ciências Agrárias 33 (6):2383-2390, 2012.

CHVALA, S.; BENETKA, V.; MÖSTL, K; ZEUGSWETTER, F.; SPERGSER J.;WEISSENBÖCK, H. Simultaneous canine distemper virus, canine adenovirus type2, and Mycoplasma cynos infection in a dog with pneumonia. VeterinaryPathology, Washington 44 (4): 508-512, 2007.

DAMIÁN, M.; MORALES, E.; SALAS, G.; TRIGO, F. J. Immunohistochemicaldetection of antigens of distemper, adenovirus, and parainfluenza viruses indomestic dogs with pneumonia. Journal of Comparative Pathology 133 (4):289-293, 2006.

DAY, M.J.; HORZINEK, M.C.; SCHULTZ, R.D.; SQUIRES, R.A. Guidelines for thevaccination of dogs and cats. Compiled by the Vaccination Guidelines Group(VGG) of the World Small Animal Veterinary Association (WSAVA). Journal ofSmall Animal Practice 57: 1-45, 2016.

DEMETER, Z.; PALADE, E.A.; RUSVAI, M. Canine Distemper: Still A MajorConcern In Central Europe. Lucrări stiinłifice medicină veterinară Xlii (1), 2009

DENZIN, N.; HERWIG, V.; VAN DER GRINTEN, E. Occurrence and geographicaldistribution of Canine Distemper Virus infection in red foxes (Vulpes vulpes) ofSaxony-Anhalt, Germany. Veterinary Microbiology 162: 214–218, 2013.

DI FRANCESCO, C.E.; DI FRANCESCO D; DI MARTINO, B.; SPERANZA, R.;SANTORI, D.; BOARI, A.; MARSILIO, F. Detection by hemi-nested reversetranscription polymerase chain reaction and genetic characterization of wild typestrains of Canine distemper virus in suspected infected dogs. J Vet Diagn Invest.24 (1):107-115, 2012.

EK-KOMMONEN, C.; SIHVONEN, L.; PEKKANEM, K.; RIKULA, U.; NUOTIO, L.Outbreak of canine distemper in vaccinated dogs in Finlândia. The VeterinaryRecord 141: 380-383, 1997.

ELIA, G.; DECARO, N.; MARTELLA, V.; CIRONE, F.; LUCENTE, M.S.;LORUSSO, E.; DI TRANI, L.; BUONAVOGLIA, C. Detection of canine distempervirus in dogs by real-time RT-PCR. Journal of Virological Methods136:171–176,2006

ELIA, G.; BELLOLI, C.; CIRONE, F.; LUCENTE, M.S.; CARUSO, M.; MARTELLA,V.; DECARO, N.; BUONAVOGLIA, C.; ORMAS, P. In vitro efficacy of ribavirinagainst canine distemper virus. Antiviral Research 77: 108-113, 2008.

68

FIORELLO, C.V.; NOSS, A.J.; DEEM, S.J. Demography, hunting ecology andpathogen exposure of domestic dogs in the Isoso of Bolivia. Conservation Biology20 762-771, 2006.

FISCHER, C.D.B.; IKUTAA, N.; CANAL, C.W.; MAKIEJCZUKA, A.;ALLGAYERA, M.C.; CARDOSOA, C.H.; LEHMANNA, F.K.; FONSECA,A.S.K.; LUNGEA, V.R. Detection and differentiation of field and vaccine strains ofcaninedistemper virus using reverse transcription followed by nested realtime PCR(RT-nqPCR) and RFLP analysis. Journal of Virological Methods 194: 39– 45,2013.

FREITAS-FILHO, E.G.; FERREIRA, M.R.A.; DIAS, M.; MOREIRA, C.N.prevalência, fatores de risco e associações laboratoriais para cinomose canina emJatai-GO. Enciclopédia Biosfera 10 (18), 2014.

FRISK, A.L.; KONIG, M.; MORITZ, A.; BAUMGARTNER W. Detection of caninedistemper vírus nucleoprotein RNA by reverse transcription-PCR using serum,whole blood, and cerebrospinal fluid from dogs with distemper. J. Clin. Microbiol.37: 3634-3643, 1999.

GÁMIZ, C.; MARTELLA, V.; ULLOA, R.; FAJARDO, R.; QUIJANO-HERNANDÉZ,I.; MARTÍNEZ, S. Identification of a new genotype of canine distemper viruscirculating in America. Vet Res Commun. 35(6):381-390, 2011.

GÁMIZ-MEJÍA, C.E.; SIMÓN-MARTÍNEZ, J.; FAJARDO-MUÑOZ, R.C.Identification of new genovariants of canine distemper virus in dogs from the Stateof Mexico by analyzing the nucleocapsid gene. Arch Med Vet 44: 53-58, 2012.

GEBARA, C.M.S.; WOSIACKI, S.R.; NEGRÃO, F.J.; OLIVEIRA, D.B.; BELONI,S.N.E.; ALFIERI, A.A.; ALFIERI, A.F. Detecção do gene da nucleoproteína dacinomose canina por RT – PCR em urina de cães com sinais clínicos de cinomose.Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia 56: 480-487, 2004.

GENCAY, A.; ONCEL, T.; KARAOGLU, T.; SANCAK, A.A.; DEMIR, A.B.;OZKUL, A. Antibody Prevalence to Canine Distemper Virus (CDV) in Stray Dogsin Turkey. Revue Méd. Vét. 155 (8-9): 432-434, 2004.

GORE, T. C.; LAKSHMANAN, N.; DUNCAN, K. L.; COYNE, M. J.; LUM, M. A.;STERNER, F. J. Three-year duration of immunity in dogs following vaccinationagainst canine adenovirus type-1, canine parvovirus, and canine distemper virus.Veterinary Therapeutics: Research in Applied Veterinary Medicine 6 (1):5–14, 2004.

GREENE, C.E; APPEL, M.J. Canine Distemper. In: Infectious Diseases of the Dogand the Cat. GREENE, C.E. (3 ed). Philadelphia, Saunders, 2006. P. 226-239.

GREENE, C.E. Infectious Diseases of the Dog and Cat. St. Louis, Elsevier/Saunders,2012. 1354 p.

69

GUEDES, I. B.; LIMA, A. S.; ESPINHEIRO, R. F.; BARTHA, M.M.; DIAS, H. L. T.Occurrence and geographical assessment of canine distemper in the city of Belém,Pará-Brazil. In: 34th World Small Animal Veterinay Association CongressWSAVA, 2009, São Paulo, 34th Annual World Small Animal VeterinayAssociation Congress, São Paulo: Guará, 2009, p. 100-101.

HARDER, T.C.; OSTERHAUS, A.D. Canine distemper virus--a morbillivirus in searchof new hosts? Trends in Microbiology 5 (3): 120-124, 1997.

HASS, R.; JOHANN, J.M.; CAETANO, C.F.; FISCHER, C.; VARGAS, G.D; VIDOR,T.; HÜBNER, S.O. Níveis de anticorpos contra o vírus da cinomose canina e oparvovírus canino em cães não vacinados e vacinados. Arq. Bras. Med. Vet.Zootec. 60 (1): 270-274, 2008.

HEADLEY, S. A.; GRAÇA, D. L. Canine distemper: epidemiological findings of 250cases. Brazilian Journal of Veterinary Research and Animal Science 37 (2):136-140, 2000.

HEADLEY, S.A.; SAITO, T.B. Simultaneous canine distemper encephalitis and canineparvovirus infection with distemper-associated cardiac necrosis in a pup. CiênciaRural, Santa Maria 33 (6):1149-1151, 2003.

HEADLEY, S.A.; SHIROTA, K.; BABA, T.; IKEDA, T.; SUKURA, A. DiagnosticExercise: Tyzzer’s Disease, Distemper, and Coccidiosis in a Pup. Vet Pathol46:151–154, 2009.

HEADLEY, S.A.; AMUDE, A.M.; ALFIERI, A.F.; BRACARENSE, A.P.F.R.L.;ALFIERI, A.A. Epidemiological features and the neuropathologicalmanifestationsof canine distemper virus-induced infections in Brazil: a review.Semina: Ciências Agrárias 33 (5): 1945-1978, 2012.

HEADLEY, S.A.; SHIROTA, K., BABA, B.; IKEDA, T.; SUKURA, A. Concomitantcanine distemper, infectious canine hepatitis, canine parvoviral enteritis, canineinfectious tracheobronchitis, and toxoplasmosis in a puppy. Journal of VeterinaryDiagnostic Investigation 25 (1): 129–135, 2013.

HÜBNER, S. A.; PAPPEN, F. G.; RUAS, J. L.; VARGAS, G. D.; FISCHER, G.;VIDOR, T. Exposure of pampas fox (Pseudalopex gymnocercus) and crab-eatingfox (Cerdocyon thous) from the Southern region of Brazil to Canine distemper virus(CDV), Canine parvovirus (CPV) and Canine coronavirus (CCoV). BrazilianArchives of Biology and Technology 53 (3): 593-597, 2010.

JONES, T.C.; HUNT, R.D.; KING, N.W. Moléstias causadas por agentes viraisIn:Patologia Veterinária. Jones, T.C.; Hunt, R.D. & King, N.W. São Paulo, Manole,2000. P. 320-323.

Ke, G.; Ho, C.; Chiang, M.; Sanno-Duanda, B.; Chung, C.; Lin, M.; Shi, Y.; Yang, M.;Tyan, Y.; Liao, P.; Chu, P. Phylodynamic analysis of the canine distemper virushemagglutinin gene. BMC Veterinary Research 11 (164): 1-15, 2015.

70

KERDILES, Y.M.; CHERIF, B.; MARIE, J.C.; TREMILLON, N.; BLANQUIER, B.;LIBEAU, G.; DIALLO, A.; WILD, T.F.; VILLIERS, M.B.; HORVAT, B.Immunomodulatory properties of mobbilivirus nucleoproteins. Viral Immunology19 (2): 324-334, 2006.

KOUTINAS, A.F.; POLIZOPOULOU, Z.; BAUMGÄERTNER, W.; LEKKAS, S.;KONTOS, V. Relation ofclinical signs to pathological changes in 19 cases ofcanine distemper encephalomyelitis. Journal of Comparative Pathology 126:47-56, 2002.

LAMB, R. A.; KOLAKOFSKY, D. Paramyxoviridae: the viruses and their replication.In: Fields virology. FIELDS, B.N.; KNIPE, D. M.; HOWLEY, P. M. (4 ed).Phialdephia: Lippincott-Williams & Wilkins, 2001. P. 1305-1443.

LAMB, R.A.; PATERSON, R.G.; JARDETZKY, T.S. Paramyxovirus membranefusion: lessons from the F and HN atomic structures. Virology 344: 30–37, 2006.

LAMB, R.A.; PARKS, G.D. Paramyxoviridae: the viruses and their replication. In:Fields Virology. Knipe, D.M. & Howley, P.M. Philadelphia, Lippincott Williams& Wilkins, 2007. P. 1449-1485.

LAN, N.T.; YAMAGUCHI, R.; INOMATA, A.; FURUYA, Y.; UCHIDA, K.;SUGANO, S.; TATEYAMA, S. Comparative analyses of canine distemper viralisolates from clinical cases of canine distemper in vaccinated dogs. Veterinary.Microbiology 115: 32–42, 2006.

LARSON, L.J.; SCHULTZ, R.D. Effect of vaccination with recombinant caninedistemper virus vaccine immediately before exposure under shelter-like conditions.Vet Ther 7: 113–118, 2006.

LEDNICKY, J.A.; DUBACH, J.; KINSEL, M.J.; MEEHAN, T.P.; BOCCHETTA, M.;HUNGERFORD, L.L.; SARICH, N.A.; WITECKI, K.E.; BRAID, M.D.; PEDRAK,C.; HOUDE, C.M. Genetically distant American Canine distemper virus lineageshave recently caused epizootics with somewhat different characteristics in raccoonsliving around a large suburban zoo in the USA. Virology Journal 1 (2): 1-14,2004.

LEISEWITZ, A.L.; CARTERB, A.; VAN VUURENC, M.; VAN BLERK, L. Caninedistemper infections, with special reference to South Africa, with a review of theliterature. Journal South African Veterinary Association 72 (3): 127-136, 2001.

LEMPP, C., SPITZBARTH, I.; PUFF, C.; CANA, A.; KEGLER, K.;TECHANGAMSUWAN, S.; BAUMGÄRTNER, W.; SEEHUSEN, F. NewAspects of the Pathogenesis of Canine Distemper Leukoencephalitis. Viruses 6:2571-2601, 2014.

LÚCIO, E.C.; PIMENTEL, J.L.; CLEMENTE, S.M.S.; MACHADO, A.C.; OLIVEIRA,J.M.B; BRANDESPIM, D.F.; SILVA JÚNIOR, J.L.S.; PINHEIRO JÚNIOR; J.W.Análise epidemiológica da infecção pelo vírus da cinomose, em cães do município

71

de Garanhuns, Pernambuco, Brasil. Semina: Ciências Agrárias, Londrina 35 (3):1323-1330, 2014.

MACLACHLAN, N. J.; DUBOVI, E. J. Paramyxoviridae. Fenner’s VeterinaryVirology. San Diego, Academic Press, 2011. P. 299-325.

MACEDO, C.I.; PEIXOTO, Z.M.P.; CASTILHO, J.G.; OLIVEIRA, R.N.;RODRIGUES, A.C.; ACHKAR, S.M. Canine distemper diagnosis by RT-PCR indog samples from São Paulo State submitted to rabies laboratory diagnosis. Revistade Educação Continuada em Medicina Veterinária e Zootecnia do CRMV-SP14 (1): 18-21, 2016.

MARTELLA, V., ELIA, G.; LUCENTE, M.; DECARO, M.; LORUSSO, E.;BELLACICCO, A.L.; BLIXENKRONE-MØLLER, M.; CARMICHAEL, L.E.;BUONAVOGLIA, C. Heterogeneity within the hemagglutinin genes of caninedistemper virus (CDV) strains detected in Italy. Veterinary Microbiology 116:301-309, 2006.

MARTELLA V.; ELIA G.; BUONAVOGLIA C. Canine distemper virus. Vet. Clin.North Am., Small Anim. Pract. 38:787-797, 2008.

MARTELLA V.; BLIXENKRONE-MOLLER M.; ELIA G.; LUCENTE M.S.;CIRONE F.; DECARO N.; NIELSEN, L.; BÁNYAI, K.; CARMICHAEL, L.E.;BUONAVOGLIA, C. Lights and shades on an historical vaccine canine distempervírus the Rockborn strain. Vaccine 29:1222–1227, 2011.

MARTINEZ, J. S.; ARVIZU, R. U.; SORIANO, V. E.; FAJARDO, R. Identification ofa genetic variant of the canine distemper virus from clinical cases involving twovaccinated dogs in Mexico. Veterinary Journal 175 (3): 423-426, 2008.

MCCARTHY, A.J.; SHAW, M.A.; GOODMAN, S.J. Pathogen evolution and diseaseemergence in carnivores. Proc. R. Soc. B. 274: 3165–3174, 2007.

MEDINA-VOGEL, G. Ecología de enfermedades infecciosas emergentes yconservación de especies silvestres. Arch. Med. Vet. 42:11-24, 2010.

MEGID, J.; SOUZA, V.A.F.; TEIXEIRA, C.R.; CORTEZ, A.; AMORIM, R.L.;HEINEMANN, M.B. Canine distemper virus in a crab-eating fox (Cerdocyonthous) in Brazil: Case report and phylogenetic analyses. J. Wildlife Dis. 45:527-530, 2009.

MEGID, J.; TEIXEIRA, C. R.; AMORIN, R. L.; CORTEZ, A.; HEINEMANN, M. B.;ANTUNES, J. M. A. P.; COSTA, L. F.; FORNAZARI, F.; CIPRIANO, J. R. B.;CREMASCO, A.; RICHTZENHAIN, L.J. First Identification of Canine DistemperVirus in Hoary Fox (Lycalopex vetulus): Pathologic Aspects and Virus Phylogeny.Journal of Wildlife Diseases 46 (1): 303–305, 2010.

MEGID, J.; TEIXEIRA, C. R.; AMORIN, R. L.; CORTEZ, A.; HEINEMANN, M. B.;ANTUNES, J. M. A. P.; FORNAZARI, F.; RASSY, F.B.; RICHTZENHAIN, L.J.

72

Canine distemper virus infection in a lesser grison (Galictiscuja): first report andvirus phylogeny. Pesq. Vet. Bras. 33(2): 247-250, 2013.

MESSLING, V.; ZIMMER, G.; HERRLER, G.; HAAS, L.; CATTANEO, R. Thehemagglutinin of canine distemper virus determines tropism and cytopathogenicity.Journal of Virology 75 (14): 6418-6427, 2001.

MIRANDA, F.J.B.; ALBERNAZ, A.P.; M.A.D., VIESTEL; MELO JR, O.A.;MACHADO, J.A.; R.B.M, A.; CARVALHO, C.B. Infecção simultânea porEhrlichia canis, Babesia canis e vírus da cinomose canina - Relato de Caso. JornalBrasileiro de Ciência Animal 3 (6): 238 – 246, 2011.

MOCHIZUKI, M.; HASHIMOTO, M.; HAGIWARA, S.; YOSHIDA, Y.; ISHIGURO,S. Genotypes of canine distemper virus determined by analysis of the hemagglutiningenes of recent isolates from dogs in Japan. Journal of Clinical Microbiology 37(9): 2936–2942, 1999.

MONTI, F.S. Anticorpos contra o virus da cinomose em cães vacinados em diferentesestabelecimentos da área urbana do município de Viçosa/MG. Tese (Programa depós-graduação em Medicina Veterinária) – Viçosa, Universidade Federal de Viçosa,2004. 67p.

MONTI, F.S.; VIANA, J.A.; BEVILACQUA, P.D. Anticorpos contra o vírus dacinomose de cães vacinados em diferentes estabelecimentos. Revista Ceres54:14-19, 2007.

MOSS, W.J.; GRIFFIN, D.E. Global measles elimination. Nature reviews.Microbiology 4 (12): 900-908, 2006.

MOUZIN, D.E.; LORENZEN, M.J.; HAWORTH, J.D.; KING, V.L. Duration ofserologic response to three viral antigens in cats. Journal of American VeterinaryMedical Association 224: 61–66, 2004.

MÜHLEBACH, M. D.; MATEO, M.; SINN, P. L.; PRÜFER, S.; UHLIG, K. M.;LEONARD, V. H. J.; NAVARATNARAJAH, C. K.; FRENZKE, M.; WONG, X.X.; SAWATSKY, B.; RAMACHANDRAN, S.; MCCRAY, P. B.; CICHUTEK, K.;VON MESSLING, V.; LOPEZ, M.; CATTANEO, R. Adherens junction proteinnectin-4 is the epithelial receptor for measles virus. Nature 480: 530–533, 2011.

MURPHY, F.A.; GIBBS, E.P.J.; HORZINEK, M.C.; STUDDERT, M.J. Laboratorydiagnosis of viral diseases. In: Veterinary Virology. Murphy, F.A.; Gibbs, E.P.;Studdert, M.J. & Horzinek, M.C. San Diego, Academic, 1999. P. 193-224.

NAVA, A.F.; CULLEN, L. Jr.; SANA, D.A.; NARDI, M.S.; FILHO, J.D.; LIMA, T.F.;ABREU, K.C.; FERREIRA, F. First evidence of canine distemper in Brazilianfree-ranging felids. Ecohealth 5 (4): 513-518, 2008.

NEGRÃO, F. J.; GARDINALI, N. R.; HEADLEY, S. A.; ALFIERI, A. A.;FERNANDEZ, M. A.; ALFIERI, A. F. Phylogenetic analyses of the hemagglutinin

73

gene of wild-type strains of canine distemper virus in southern Brazil. Geneticsand Molecular Research 12 (3): 2549-2555, 2013.

NOYCE, R. S.; BONDRE, D.G.; HA, M.N.; LIN, L.T.; SISSON, G.; TSÃO, M.S.;RICHARDSON, C.D. Tumor cell marker PVRL4 (nectin 4) is an epithelial cellreceptor for measles virus. PLoS Pathogens 7, 2011.

NOYCE, R.S.; DELPEUT, S.; RICHARDSON, C.D. Dog nectin-4 is an epithelial cellreceptor for canine distemper virus that facilitates virus entry and syncytiaformation. Virology 436: 210–220, 2013.

OSTERHAUS, A. D. M. E.; SWART, R. L.; VOS, H. W.; ROSS, P. S.; KENTER, M.J. H.; BARRETT, T. Morbillivirus infections of aquatic mammals: newly identifiedmembers of the genus. Veterinary Microbiology 44 (2-4): 219-227, 1995

PANZERA, Y.; CALDERÓN, M.G.; SARUTE, N.; GUASCO, S.; CARDEILLAC, A.;BONILLA, B.; HERNÁNDEZ, M.; FRANCIA, L.; BEDÓ, G.; LA TORRE, J.;PÉREZ, R. Evidence of two co-circulating genetic lineages of canine distempervirus in South America. Virus Research 163: 401–404, 2012.

PANZERA, Y.; SARUTE, N.; CARRAU, L.; ALDAZ, J.; PÉREZ, R. GeneticDiversity of Canine Distemper Virus in South America. British Journal ofVirology 1: 48-53, 2014.

PARDO, I.D.R.; JOHNSON, G.C.; KLEIBOEKER, S.B. Phylogenetic characterizationof canine distemper viruses detected in naturally infected dogs in North America. J.Clin. Microbiol. 43 (10): 5009-5017, 2005.

PLATTET, P.; RIVALS, J.P.; ZUBER, B.; BRUNNER, J.; ZURBRIGGEN, A.;WITTEK, R. The fusion protein of wild-type canine distemper virus is a majordeterminant of persistent infection. Virology 337: 312–326, 2005.

PLATTET P, CHERPILLOD P, WIENER D, ZIPPERLE, L.; VANDEVELDE, M.;WITTEK, R.; ZURBRIGGEN, A. Signal peptide and helical bundle domains ofvirulent canine distemper virus fusion protein restrict fusogenicity. Journal ofVirology 81: 11413–11425, 2007.

PRATAKPIRIYA, W.; SEKI, F.; OTSUKI, N.; SAKAI, K.; FUKUHARA, H.;KATAMOTO, H.; HIRAI, T.; MAENAKA, K.; TECHANGAMSUWAN, S.; THILAN, S.; TAKEDA, M.; YAMAGUCHIA, R. Nectin4 is na epitelial cell receptorfor canine distemper vírus and involved in neurovirulence. Journal of virology 86(18): 10207-10210, 2012.

QIU,W.; ZHENG, Y.; ZHANG,S.; FAN, Q.; LIU, H.; ZHANG, F.; WANG, W.; LIAO,G.; HU, R. Canine Distemper Outbreak in Rhesus Monkeys, China. EmergingInfectious Diseases 17 (8): 1541-1543, 2011.

QUINN, P. J.; MARKEY, B. K.; CARTER, M. E.; DONNELY, W. J. C.; LEONARD,F. C. Paramyxoviridae. In: Microbiologia Veterinária e Doenças Infecciosas. Quinn,

74

P. J.; Markey, B. K.; Carter, M. E.; Donnely, W. J. C. & Leonard, F. C. PortoAlegre, Artmed, 2005. P. 372-376.

RADTANAKATIKANON, A.; KEAWCHAROEN, J.; CHAROENVISAL, N.T.;POOVORAWAN, N.; PROMPETCHARA, E.; YAMAGUCHI, R.;TECHANGAMSUWAN, R. Genotypic lineages and restriction fragment lengthpolymorphism of canine distemper virus isolates in Thailand. VeterinaryMicrobiology 166:76 –83, 2013.

REGO, A. A. M. S.; MATUSHIMA, E. R.; PINTO, C.M.; BIASIA, I. Distemper inBrazilian wild canidae and mustelidae: case report. Brazilian Journal ofVeterinary Research and Animal Science, São Paulo 34 (3): 256-258, 1997.

RIDGWAY, D.; WOLFF, L.J. Active immunization of children with leukemia and othermalignancies. Leuk Lymphoma 9:177–192, 1993.

SAITO, T.B., A.A. ALFIERI, S.R. WOSIACKI, F.J. NEGRÃO, H.S. MORAIS,ALFIERI, A.F. Detection of canine distemper virus by reverse transcriptase-polymerase chain reaction in the urine of dogs with clinical signs of distemperencephalitis. Research in Veterinary Science 80:116-119, 2006.

SARUTE, N., R. PEREZ, L. FRANCIA, M. HERNÁNDEZ, G. BEDO; PANZERA, Y.Primer diagnóstico molecular y caracterización parcial del gen de la nucleoproteínadel Virus Distemper Canino em Uruguay. Veterinaria 47: 7–13, 2011.

SARUTE, N., M.G. CALDERÓN, R. PEREZ, J. LA TORRE, M. HERNANDEZ M, L.FRANCIA AND Y. PANZERA. The Fusion Protein Signal-Peptide-Coding Regionof Canine Distemper Virus: A Useful Tool for Phylogenetic Reconstruction andLineage Identification, PLoS ONE 8(5), 2013.

SAWATSKY, B.; VON MESSLING, V. Canine distemper viruses expressing ahemagglutinin without N-glycans lose virulence but retain immunosuppression. J.Virology 84 (6): 2753-2761, 2010.

SHERDING, R.G. Cinomose. In: Manual saunders: clinica de pequenos animais.Birchard, S. J. & Sherding, R. G. São Paulo, Rocca, 2003. P. 117-120.

SHIN, Y.J.; CHO, K.O.; CHO, H.S.; KANG, S.K.; KIM, H.J.; KIM, Y.H.; PARK, H.S.PARK, N.Y. Comparison of one-step RT-PCR andnested PCR for the detection ofcanine distemper virus in clinical samples. Australian Veterinary Journal 82:83-86, 2004.

SI, W.; ZHOU, S.; WANG, Z.; CUI, S. A multiplex reverse transcriptionnestedpolymerase chain reaction for detection and differentiation of wild-type and vaccinestrains of canine distemper virus. Virology Journal 7: 86–91, 2010.

SILVA, M.C.; FIGHERA, R.A.; BRUM, J.S. Aspectos clinicopatológicos de 620 casosneurológicos de cinomose em cães. Pesquisa Veterinária Brasileira 27(5):215-220, 2007.

75

SILVA JUNIOR, J.A; COSTA; A.C.L.; PEZZUTI, J.C.B.; COSTA, R.F.;RODRIGUES, H.J.B. Sazonalidade de elementos meteorológicos da área urbana eperiférica na cidade de Belém, PA. Brazilian Geographical Journal: Geosciencesand Humanities research medium 4 (2): 650-662, 2013.

SILVA, A.P.; BODNAR, S.; HEADLEY, S.A.; ALFIERI, A.F.; ALFIERI, A.C.Molecular detection of canine distemper virus (CDV), canine adenovirus A types 1and 2 (CAdV-1 and CAdV-2), and canine parvovirus type 2 (CPV-2) in the urine ofnaturally infected dogs. Semina: Ciências Agrárias 35 (6): 3231-3236, 2014

SIMON-MARTI´NEZ, J.; ULLOA-ARVIZU, R.; SORIANO, V.E.; FAJARDO, R.Iden-tification of a genetic variant of canine distemper virus from clinical cases intwo vaccinated dogs in Mexico. Veterinary Journal 175: 423–426, 2008

SWANGO, L.J. Molestias virais caninas. In: Tratado de Medicina InternaVeterinaria. Ettinger, S.J. & Feldman, E.C. São Paulo, Manole, 1997. P. 576-580.

TAMURA, K. Estimation of the number of nucleotide substitutions when there arestrong transition-transversion and G + C-content biases. Molecular Biology andEvolution 9: 678-687, 1992.

TEMILADE, B.E.; SOLOMON, O.O; OMOTAYO, O.E.; OMEZURUIKE, O.I.Seropositivity of Canine Distemper Virus (CDV) in Dogs Presenting at Abeokuta,Nigeria. Public Health Research 5(4): 109-119, 2015.

TWARK, L.M.; DODDS, W.J. Thoughts on vaccination protocols. Journal ofAmerican Veterinary Medical Association 27: 1458-1459, 2000.

TILLEY, L.P.; SMITH, F.W.K. Consulta veterinária em 5 minutos: Espécies Caninae Felina. Barueri, Manole, 2008. 1550 p.

TIPOLD, A.; VANDEVELDE, M.; JAGGY, A. Neurological manifestations of caninedistemper virus infection. Journal of Small Animal Practice 33 (10): 466–470,1992.

TOBER, C.; SEUFERT, M.; SCHNEIDER, H.; BILLETER, M.A.; JOHNSTON, I.C.;NIEWIESK, S.; TER MEULEN, V.; SCHNEIDER-SCHAULIES, S. Expression ofmeasles virus V protein is associated with pathogenicity and control of viral RNAsynthesis. Journal of Virology 72 (10): 8124-8132, 1998.

TOZATO, C.D.; ZADRA, V.F.; BASSO, C.R.; ARAÚJO JÚNIOR, J.P. Caninedistemper virus detection by differente methods of One-Step RT-qPCR. CiênciaRural 46 (9): 1601-1606, 2016.

TREBBIEN, R.; CHRIEL, M.; STRUVE, T.; HJULSAGER, C.K.; LARSEN, G.;LARSEN, L.E. Wildlife reservoirs of canine distemper virus resulted in a majoroutbreak in Danish farmed mink (Neovison vison). PLoS One 9 (1): 1-11, 2014.

76

VALLI, J.L.; WILLIAMSON, A.; SHARIF, S.; RICE, J.; SHEWEN, P.E. In vitrocytokine responses of peripheral blood mononuclear cells from healthy dogs todistemper virus, Malassezia and Toxocara. Veterinary Immunology andImmunopathology 134: 218-29, 2010.

VANDEVELDE, M.; ZURBRIGGEN, A. “Demyelination in canine distemper virusinfection: a review”, Acta Neuropathologica 109: 56–68, 2005.

YI, L.; XU, H.; WANG, J.; CHENG, Y.; ZHANG, H.; YAN, X.; CHENG, S. CompleteNucleotide Sequence of Canine Distemper Virus CDV-PS, Isolated from Dogs inChina. Genome Announc. 1(3), 2013.

YOSHIDA, E.; IWATSUKI, K.; MIYASHITA, N. et al. Molecular analysis of thenucleocapsid protein of recent isolates of canine distemper virus in Japan. Vet.Microbiol. 16: 237-244, 1998.

WANG, F.; YAN, X.; CHAI, X.; ZHANG, H.; ZHAO, J.; WEN, Y.; WU, W.Differentiation of canine distemper virus isolates in fur animals from variousvaccine strains by reverse transcription-polymerase chain reaction-restrictionfragment length polymorphism according to phylogenetic relations in china.Virology Journal 8 (85): 1-8, 2011.

WELBORN, L. V.; DEVRIES, J. G.; FORD, R.; FRANKLIN, R. T.; HURLEY, K. F.;MCCLURE, K. D.; PAUL, M.A.; SCHULTZ, R. D. 2011 AAHA CanineVaccination Guidelines. Journal of the American Animal Hospital Association47 (5): 1–42, 2011.

WELTER, J.; TAYLOR, J.; TARTAGLIA, J.; PAOLETTI, E.; STEPHENSEN, C.B.Vaccination against canine distemper virus infection in infant ferrets with andwithout maternal antibody protection, using recombinant attenuated poxvirusvaccines. Journal of Virology 74 (14): 6358-6367, 2000.

WOMA, T.Y.; VAN VUUREN, M.; BOSMAN, A.-M.; QUAN, M.; OOSTHUIZEN,M. Phylogenetic analysis of the haemagglutinin gene of current wild-type caninedistemper viruses from South Africa: lineage Africa. Veterinary Microbiology143: 126–132, 2010

ZHAO, J.J., YAN, X.J., CHAI, X.L., MARTELLA, V., LUO, G.L., ZHANG, H.L.,GAO, H., LIU, Y.X., BAI, X., ZHANG, L., CHEN, T.; XU, L.; ZHAO, C.;WANG, F.; SHAO, X.; WU, W.; CHENG, S. Phylogenetic analysis of thehaemagglutinin gene of canine distemper virus strains detected from breedingfoxes, raccoon dogs and minks in China. Veterinary Microbiology 140: 34–42,2010.

ZHAO, J.; ZHANG, H.; BAI, X.; MARTELLA, V.; HUA, B.; SUN; Y.; ZHU, C.;ZHANG, L.; LIU, H.; XU, S.; SHAO, X.; WUA, W.; YAN, X. Emergence ofcanine distemper virus strains with two amino acid substitutions in the

77

haemagglutinin protein, detected from vaccinated carnivores in North-EasternChina in 2012–2013. The Veterinary Journal 200: 191–194, 2014.

ZEE, Y.C. Paramyxoviridae. In: Microbiologia Veterinária. Mcvey, D. S.; Kennedy,M. & Chengappa, M.M. Rio de Janeiro, Guanabara Koogan, 2003. P. 374-378.