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MÉTODOS RÁPIDOS EN MICROBIOLOGÍA DE ALIMENTOS

Kendra Nightingale, Ph.D.Centro Internacional para la Excelencia de la Industria Alimentaria

Departamento Ciencias Animales y Alimentarias

Universidad de Texas Tech

DIAGNÓSTICO MOLECULAR DE PATÓGENOS TRANSMITIDOS POR ALIMENTOS: FUNDAMENTOS

PARA LA APLICACIÓN

SIMPOSIO DE SEGURIDAD ALIMENTARIA URUGUAY, ABRIL 2015

ANÁLISIS MICROBILÓGICOS CONVENCIONALES PARA DETECTAR PATÓGENOS TRANSMITIDOS POR

ALIMENTOS

Confirmar las colonias presuntas Confirmar las colonias presuntas

Examinar colonias de morfología típica en los platosExaminar colonias de morfología típica en los platos

Plaquear las muestras en medio selectivo/diferencialPlaquear las muestras en medio selectivo/diferencial

Detectar en la muestra enriquecida la presencia/ ausencia de patógenosDetectar en la muestra enriquecida la presencia/ ausencia de patógenos

Enriquecer la muestra (pre-enriquecimiento no-selectivo/ enriquecimiento selectivo)

Enriquecer la muestra (pre-enriquecimiento no-selectivo/ enriquecimiento selectivo)

Procesar la muestraProcesar la muestra

Colectar la muestraColectar la muestra

ANÁLISIS MICROBILÓGICOS PARA DETECTARPATÓGENOS TRANSMITIDOS POR ALIMENTOS• Departamento de Agricultura de los Estados Unidos

(USDA): Guía de Laboratorio para ServiciosMicrobiológicos de Inspección de InocuidadAlimentaria (MLG). Carne, pollo y productos a base de huevos.

• http://www.fsis.usda.gov/science/microbiological_lab_guidebook/

• Administración de Medicamentos y Alimentos de los Estados Unidos. Manual Analítico Bacteriológico; Todos los demás alimentos.

• http://www.fda.gov/Food/ScienceResearch/LaboratoryMethods/BacteriologicalAnalyticalManualBAM/default.htm

¿POR QUÉ MÉTODOS RÁPIDOS?

Toma entre 3 a 5 días obtener resultados definitivosde análisis microbiológicos de una muestra utilizandométodos tradicionales de detección de patógenostransmitidos por alimentos.

Varios métodos rápidos han sido desarrolados y son disponibles comercialmente para generar resultadossustancialmente más rápido:

• Evaluar la muestra después del enriquecimiento.

•Confirmar las muestras presuntas positivas.

USO DE MÉTODOS RÁPIDOS EN LA DETECCIÓN, AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN

Evaluación del enriquecimiento: • Decisión de aceptar o rechazar el producto.

• Si la prueba de detección es NEGATIVA el producto seráaceptado

• Si la prueba de detección es POSITIVA, la muestra es un “potencial positivo” y puede ser sujeta a confirmación, El producto puede ser aceptado o rechazado pendiente de confirmación o basada en el tipo de producto.

Confirmación:• Enriquecer el plato en medio selectivo/diferencial (coloniasde morfología típica; “presunto positivo”)

• Escojer varias colonias que presentan característicasmorfológicas típicas del patógeno meta y poner a prueba

• Pruebas de confirmación (bioquímicas, immunológicas, moleculares)

CRITERIOS DE EVALUACIÓN Y ENFOQUES PARA EL DIAGNÓSTICO

MOLECULAR

• Número de kits comercialmente disponibles/ métodos de detección de patógenos transmitidos por alimentos continuan aumentando a un rápido ritmo.

• Difícil de balancear las ventajas/desventajas de los diferentes métodos para elegir el mejor método.

• Conocimiento fundamental en métodos rápidos.

• Criterios generales para la industria de alimentos para evaluar métodos rápidos de detección.

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EL DOGMA CENTRAL

ADN

ARNm

Proteinas/Enzymas

Toxinas y otros metabolitos

Métodosmoleculares

MétodosFenotípicos

Replicación de ADN

Traducción

Transcripción

CÉLULA PROCARIOTA

MÉTODOS RÁPIDOS PARA DETECCIÓN Y CONFIRMACIÓN

Bioquimícos: nuevos enfoques de la cultura, sistemas bioquímicos comerciales de identificación.

Immunológicos: interacciones antígeno-anticuerpo; aglutinación de látex, immunoensayo enzimático/ ensayo porInmunoabsorción ligado a enzimas, tiras de prueba de flujo lateral inmunocromatográfico.

Métodos moleculares: hibridación AND-ADN, cadena de reacción de polimerasa (PCR), PRC en tiempo real, y no PCR basado en métodos.

EJEMPLOS DE MÉTODOS BIOQUÍMICOS RÁPIDOS

Nuevos enfoques culturales:

Cromatografía media (Ej., CHROMagar)

Sistemas comerciales de identificación:

VITEK (targeta bioquímica, BioMerieux)

API (líneas de prueba; BioMerieux)

BioLog (96-well plate)

EJEMPLOS DE MÉTODOS INMUNOLÓGICOS RÁPIDOS

Aglutinación de látex: RIM Escherichia coli O157:H7 Kit de Aglutinación de látex (Remel)

Inmunoensayo enzimático (EIA)/ ensayo por Inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA): Aseguramiento de la EIA para Listeria, EHEC, o Salmonella (Control biológico)

EJEMPLOS DE MÉTODOS INMUNOLÓGICOS RÁPIDOS

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Tiras de prueba de flujo lateral: RapidChek (SDIX), VIP (BioControl), Reveal 2.0 (Neogen)

EJEMPLOS DE MÉTODOS INMUNOLÓGICOS RÁPIDOS

EJEMPLOS DE MÉTODOS MOLECULARES RÁPIDOS

Hibridación de ADN: ACCUPROBE (Gen-Probe)

Cadena de Reacción de Polimerasa Estándar (PCR)

PCR en tiempo real: BAX (DuPont Qualicon), GeneDisc (Pall), MicroSeq (LifeTechnologies), Assurance GDS (BioControl), R.A.P.I.D. (BioFire Diagnostics), iQ (Bio-Rad)

No-PCR Métodos isotérmicos: Sistema de Detección Molecular (3M), ANSR (Neogen), ATLAS (Roka Biosciences)

NUEVOS DESARROLLOS

• Detección basada bacteriófagos (ligandos y fago completo)

• Detección basada en espectrometría de masas (detección o caracterización de los productos de la PCR)

• Detección integrada y subtipificación (Abbott PLEX-ID)

CRITERIOS CLAVES DE EVALUACIÓN

Criterio para patógenos específicos:

• Inclusividad

• Exclusividad

• Sensibilidad del diagnóstico (Falsos Negativos)

• Especifidad del diagnóstico (Falsos Positivos)

• Sensitividad analítica (Límite de detección)

• Reproducibilidad

• Repetitibilidad

• Validación (AFNOR or AOAC)

CRITERIOS CLAVES DE EVALUACIÓN

Criterios Genéricos:

• Diferenciar Viable/No Viable

• Robustez

• Controles Positivos

• Prevención de contaminación cruzada a través de barreras.

• Disponibilidad para diferentes patógenos.

• Compatibilidad con la matriz de alimentos

• Velocidad

• Rendimiento

• Tamaño del equipo

• Fácil de usar

• Flexibilidad

• Costo

• Soporte de producto

CONSIDERACIONES PRÁCTICAS• Molécula diana (ADN o moléculas de ARNr, o

ADNr)

• Multiplexing (multiples genes, multiples patógenos o líneas específicas)

• Control positivo interno

• Escoger un laboratorio de detección externo:

• Calidad

• Ubicación

• Tiempo/Costo

• Económicos

• Plataformas/Ensayos Ofrecidos

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CONSIDERACIONES PRÁCTICAS• Tipo de prueba conducida (fenotípica vs.

molecular).

• Objetivo de la prueba (ej. virulencia vs. serotipo).

• Desarrollo de un plan de muestreo.

• Manejo de resultados de pruebas positivas con impacto regulatorio.

• Detección de muestras positivas en multiplex PCR

GENÉTICA MICROBIANA 101

¿Qué es el ADN?¿Qué tipos de moléculas de ADN están presentes en una célula bacteriana?¿Cuál es el tamaño del material genético de una bacteria patógena típica?¿Cuántos genes tiene una bacteria patógena?¿Cuál es el tamaño promedio de un gen bacteriano?

¿De qué está formada esta molécula? NUCLEOTIDO = CARBONO 5' DEL AZÚCAR, BASE NITROGENADA &

GRUPO FOSFATO

EL ADN TIENE UNA ESTRUCTURA DE DOBLE HELICE Y ORIENTACIÓN

ANTIPARALELA

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REPLICACIÓN DE ADN

Leading strand; continuous replication

Lagging strand; discontinuous replication

ARN EN LA CÉLULAARN Ribosomal (ARNr), la mayoría de ARN en la célula

• 3 tipos (16s, 23s, y 5s)• 3,000 copias en una célula• Ribosomas; proteina ensamblada durante la traducción.

ARN Mensajero (ARNm), 5-10% de ARN en la célula• Casi tantos tipos como hay genes.• No estable en la célula; tienen pocos cientos de copias de genes altamente

transcritos; vida-media unos pocos minutos (de 1 a 7 min.)• Sintetizado a partir de AND durante la transcripción.• Mueve la información contenida en el AND a la maquinaria de traducción.

ARN de tranferencia (ARNt)• Alrededor de 50 tipos• Recoge y transporta de aminoácidos al ribosoma durante la traducción.

ARN pequeño (ARNp)• 50 - 200 nucleotidos• Funciones reguladoras(Ej., afectar la estabilidad y traducción del ARNm)

APLICACIÓN DE LA DETECCCIÓN MOLECULAR EN MICROBIOLOGÍA DE

ALIMENTOSLos métodos moleculares incluyen ensayos dirigidos a ácidos nucleicos (ej., ADN y ARN)Métodos de detección de ADN

• Detectar la presencia o ausencia de gen(es) o fragmento(s) de genes específicos en el organismo meta.

• Detección del gen universal o fragmento de gen (ej. 16S ARNr) seguido por secuenciación de ADN

• Detección de ADN no diferencia entre organismos viables y no viables.

Métodos de detección de ARNm• El ARNm se degrada rádidamente y su detección indica la presencia de organismos viables

PRINCIPIOS DE LA PCR• Conceptualizado por Kary Mullis en 1983.

• Amplificación de AND in vitrio utilizando los siguientes componentes:

• Dos oligonucleótidos de ADN sintéticos (cebadores) complementarios a cada extremo de la secuencia de ADN específica – cebadores “sentido” y “antisentido”.

• Bases de nucleótidos individuales como sustratos.• ADN Polimerasa: una enzima natural responsable de

la replicación y reparación in vivo de AND. • Síntesis de una cantidad suficiente de ADN para

permitir su detección.

APLICACIONES DE LA PCR

La detección de PCR es particularmente útilcuando:

• La detección clásica consume demasiado tiempo.• Es difícil la diferenciación de organismos no patógenos

estrechamente relacionados.

Ejemplo: Listeria monocytogenes• Es la única especie dentro del género Listeria que es patógena

para humanos.• El ensayo de PCR dirigido a detectar el gen hemolisina (hlyA)

puede diferenciar L. monocytogenes de otras esecies de Listeria.

Inocuidad Alimentaria:• Detección o confirmación molecular de microorganismos

específicos presentes en los alimentos.• La sensitividad y especifidad de la PCR permite la

amplificación de genes únicos para un organismo dado.

• Subtipificación molecular de aislamientos.Biología Molecular:

• Mutagénesis, clonación o secuenciación

Biología Evolutiva:• Recrear la historia evolutiva de un grupos taxonómicos a

través ide la secuenciación de ciertos segmentos de ADN.

APLICACIONES DE LA PCR

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• Etapa 1: Desnaturalizaciónde la doble cadena de moléculas de ADN monocatenario.

• Etapa 2: Hibridación de los primers con patrón de ADN monocatenario en suubicación complementariaespecífica.

• Etapa 3: Sintesis de unanueva cadena de ADN compementaria a la cadenapatrón de ADN mediante la adición de dNTPs en la dirección 5' a 3‘.

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REACIÓN DE LA PCR DETECCIÓN Y ANÁLISIS DE LOS PRODUCTOS DE LA PCR

Electroforesis en gel de agarosa es la técnica más común utilizada para detectar y analizar los productos de la PCR

• El AND esta cargado negativamente migra a través de la matriz de gel gracias a la aplicación de un campo eléctrico.

• Diferenciación de productos de la PCR basada en el tamaño del fragmento y en su fluidez para moverse a través de la matríz del gel.

-

+

1000bp

900bp

800bp

700bp

300bp250bp

DETECCIÓN Y ANÁLISIS DE LOS PRODUCTOS DE LA PCR PCR MULTIPLEX

• Utilizada para dirigir a multiples secuencias en una sola prueba.

• Ventajas:• Más información de una sola prueba.• Disminuye el uso de materiales y reactivos/ consumibles• Ahorra tiempo

• Desventajas:• Requiere tiempo para optimización.• El análisis de los resultados es menos sencillo.

• PCR que contiene multiples parejas únicas de cebadoressentido y antisentido :

• Temperatura de anillamiento para cada pareja de primers debe sersimilar para poder trabajar correctamente dentro de una sola prueba.

• Cada pareja de primers debe amplificar fragmentos de variostamaños específicos para cada objetivo.

PCR MULTIPLEX : UN EJEMPLO

• Detección de EHEC O157:H7

• Detección simultanea de varios marcadores moleculares presentes en cepas de EHEC O157:H7

Hemolisina E (772bp)

Antigeno flagelar H7 (625bp)

Shiga toxina Stx2 (484bp)

Intimina Eae (368bp)

Antígeno somático O157 (292bp)

Shiga toxina (210bp)

PCR EN TIEMPO REAL• Funciona igual que lo hace la PCR convencional, excepto:

• No es necesario ejecutar un gel para obtener resultados

• Involucra sondas marcadas con fluoróforo fluorescente.

• Capaz de detectar cuándo el PCR objetivo empieza a amplificar

• Permite la detección del objetivo en tiempo real durante la amplificación del ADN .

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TECNOLOGÍAS EN PCR EN TIEMPO REAL

• SYBR Green (Punto de ensayo final)

• Transferencia de energía de resonanciafluorescente (FRET) Sondas de dobleetiquetado.

• Hidrólisis basada en sondeos (ej., TaqMan)• Sondas de unión al surco menor• Sondas moleculares Beacons• Sondas Scorpión• Invasor

SYBR GREEN

Stimulated fluorophore

Non-stimulated fluorophore

Amplicon Primer

Targeted double stranded-DNA

Idaho Technoloogy Inc.

ANÁLISIS DE LA CURVA MELT• Determinación de la

temperatura de hibridación (Tm) de los productos a evaluar la especifidad de la amplificación llevada a cabo.

• Tm= temperatura a la cual se desnaturaliza la mitad de longitud de la amplificación doble cadena.

• Temperatura elevada a un punto donde las cadenas de ADN estan completamente separadas:

• Emisiones de fluoróforo.• Descenso de fluorescencia

SYBR GREEN

• Ventajas

• Barato, fácil de usar.• Mínimo esfuerzo para diseñar• Funciona bien con un solo objetivo definido

• Desventajas:

• Multiplexing limitado• Se une a cualquier doble cadena de ADN

• Dímeros de primer• Productos no específicos

• Se debe realizar una curva de disociación o una curva de fusión después de completar el protocolo de la PCR –MÁS TIEMPO

ENSAYOS DE SONDA DOBLEMENTEMARCADA

• Tecnología basada en FRET

• Transferencia de Energía de Resonancia Fluorescente

• Fluoróforo inhibidor y fluoróforo indicador:

• Cuando se irradia , el reportero transfiere fluoróforo de energía a un fluoróforo inhibidor en lugar de a un fluorescente.

• El fluoróforo inhibidor debe estar en estrecha proximidad al indicador.

Close Proximity Separation

Reporter/Donor Excitation

QuencherReporter

SONDAS DE HIDRÓLISIS

• También conocida como ensayonucleasa 5’ o ensayo TaqMan®.

• Aprovecha de la actividad en exonucleasa de la Taq Polimerasa: La sonda es destruida durante el proceso de amplificación.

• Fluorescencia media al final de cada ciclo

• Aumenta la señal de fluorescenciacon el número de amplificación de cada ciclo de la PCR

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TAQMAN PCR- TIEMPO REAL

• El valor Ct puedeser utilizado para cuantificar el ADN patrón

• Un valor Ct retardado se puedeexplicar por la presencia de mutación(es) en el primer y/o sondasitio de unión lo cualreduce la eficienciade la PCR.

TAQMAN RT-PCR: MULTIPLEXING• PCR en tiempo real: reacción de PCR de tiempo real que contiene

múltiple, parejas únicas de primer y sondas.

• Las sondas deben ser marcadas con diferentes fluoróforos fluorescentes a fin de ser detectados por el instrumento.

• Ventajas

• Más información de una sola prueba• Disminuye el uso de materiales y reactivos/ consumibles• Ahorra tiempo.

• Desventajas

• Más consideraciones para el diseño experimental.• Requiere tiempo para optimización.

• Ventajas:

• Aumento de la especifidad y sensibilidad

• Capáz de detectar multiples objetivos

• Permite la cuantificación

• Mas rápido que el PCR convencional y green SYBR

• Desventajas:

• Caro para sintetizar sondas.

• Los reactivos son más caros

• Los químicos son continuamente mejorados y optimizados.

SONDAS BASADAS EN PCR DE TIEMPO REAL

STECS Y MANIFESTACIONES CLÍNICAS DE LA ENFERMEDAD ASOCIADA CON LA

INFECCIÓN POR STEC

• El serotipo de E. coli lleva uno o ambos genes de la Shiga toxina (stx1 and stx2)

• Portador asintomático

• Diarrea acuosa

• Colitis hemorrágica (CH)

• Sindrome Urémico Hemolítico (SUH)

• Causa principal de la insuficiencia renal en niños menores de 5 años en EE.UU.

STEC SERO-PATOTIPOS

Seropatotipos Serotipos CH & SUH Frecuencia de los brotes

A O157:H7, O157:NM

Si Común

B O26:H11,O103:H2,O111:NM, O121:H19,O145:NM

Si Raro

C O91:H21,O104:H21,O113:H21,otros

Si Raro

D Multiple No Ninguna

Karmali et al., 2003

NON-O157 STEC : UNA EMERGENCIA EN LA SALUD PÚBLICA EN LOS EE.UU.

• La Shiga toxina producida por Escherichia coli(STEC) perteneciente al serogrupo O se ha convertido en un problema importante para la salud pública en los EE.UU.

• En el 2008, El Departamento de Agricultura de los Estados Unidos: Servicios de Inspección de Inocuidad Alimentaria (USDA:FSIS) publicó un artículo en el cual non-O157 STEC representa un problema para la salud pública equivalente a O157.

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LOS “SEIS GRANDES” SEROGRUPOS-O OBJETIVOS EN LOS EE.UU

• Se ha demostrado que más de 300 serogrupos – O llevan uno o ambos genes de la Shiga toxina .

• Algunos serogrupos – O específicos (ej., O26, O45, O103, O111, O121 and O145) comunmente conocidos como los “Seis grandes” han:

• Sido relacionados con la mayoría (75 a 80%) de las enfermedades transmitidas por alimentos atribuidos a non-O157 STECs en los EE.UU.

• Sido asociados a graves manifestaciones clínicas de enfermedades (ej., CH y SUH)

REGULACIÓN Y MONITOREO EN LOS EE.UU

• USDA:FSIS Anunció su plan para considerar estos “Seis Grandes” serogrupos - O como adulterantes en la carne de ganado vacuno no intacta y sus componentes en septiembre del 2011.

• USDA-FSIS implementó la metodología analítica (MLG 5B.02; ahora utilizando MLG 5B.05) para iniciar esta nueva regulación a través de las pruebas de rutina de los recortes de carne en junio de 2012

• BMT se produce en el lugar de cosecha del ganado e incluye productos de carne en cajas tradicionales destinadas al uso no intacto.

PRUEBAS PARA NON-O157 STEC EN LOS EE.UU.

• Gobierno (USDA:FSIS)

• Guía de Laboratorio Microbiológico

• MLB 5B.05 “Detection and isolation of non-O157 Shiga Toxin Producing Escherichia coli (STEC) from Meat Products

• Métodos de detección en enriquecimientos y confirmación por cultivo en placa.

• Industria

• Ensayos moleculares comerciales de detección de genes de virulencia de EHEC y serogrupos-O en enriquecimientos, por regulación de USDA:FSIS

• Confirmación de presuntas colonias positivas.

1 Modified Tryptone Soya or

Trypticase Soy Broth with 8mg/L novobiocin plus casaminoacids

2 Laboratory Electronic Application For Results Notification

3 Biological Information Transfer & E-mail System

4 modified Rainbow Agar 5 Sheep Blood Agar 6 Outbreak Section of the Eastern

Laboratory, USDA-FSIS

Day

2

Either stx (-) or eae (-) Report as NEGATI VE

TO LEARN2

O antigen gene cluster (+)

Prepare aliquot of mTSB+n for Immunomagnetic capture for 1 to 6 serogroups (O26, O45, O103, O111, O121, O145)

O antigen gene cluster (-) Report as NEGATIVE

TO LEARN2

Multiplex RT PCR (eae, stx)

Report as Potential (+)

TO BI TES3 AND LEARN2

DNA Extraction

eae (+) & stx (+)

Multiplex RT PCR

(O antigen gene cluster)

Perform acid treatment step and streak prepared mTSB+n to mRBA4 then incubate @35 C for 20-24 hrs.

Streak prepared mTSB+n to mRBA4 then incubate @35 C for 20-24 hrs.

Day

3

No growth or latex negative colonies Report as

Presumptive (+) TO BI TES3 AND LEARN2

Report as NEGATIVETO BI TES3 AND LEARN2

Select a well-isolated colony from each identified phenotype on mRBA4 and perform latex agglutination with antisera specific for the serogroup of interest.

Streak latex positive colonies onto SBA5 for isolation then incubate

@35 C for 18-24hrs.

Day

1 Per 325g sample, add 975ml of mTSB+n1, stomach for 2 min. Incubate @ 42 1 C for 15-22 hours.

NOTE: A single test portion is used for testing with MLG 5 Detection, Isolation and Identification of Escherichia coli O157:H7 from Meat Products and MLG 5B Detection and Isolation of non-O157 Shiga Toxin-Producing Escherichia

coli (STEC) from Meat Products. Sample receipt temperatur oC is required.

Day

4

Pick isolates to cryobeads for storage.

VI TEK (+) O antigen gene cluster (+)

Report as CONFIRM ED

POSITIVE TO BI TES3 AND LEARN2

Either stx (-) or eae (-) Report as NEGATI VE

TO BITES3 AND LEARN2

Multiplex RT PCR (eae, stx)

O antigen gene cluster (-) Report as NEGATIVE

TO BITES3 AND LEARN2

FSIS Laboratories: Pick isolates to nutrient agar deep for PFGE testing at OSEL6

VI TEK (-) O antigen gene cluster (+)

Further Testing Required. FSIS Laboratories send

isolate to OSEL6

DNA Extraction

Multiplex RT PCR

(O antigen gene cluster)

eae (+) & stx (+)

O antigen gene cluster (+)

Following SBA5 incubation, perform serological agglutination to verify positive colonies for the serotype of interest.

VI TEK2 Biochemical

Testing

CONFIRM ED POSI TI VE ISOLATES

Assay Name Company AssayChemistry

Target Time to Result*

Limit of Detection*

NeoSEEK Neogen PCR + Mass Spec

Top 6 + O157 1 day/Not reported

The Rapid Finder Life Technologies

RT-PCR Top 6 + O157

Same day (+), 10 hour (-)

1-5 cfu insample

Assurance GDS BioControl RT-PCR Top 6 + O157

Need a customer log in to access specific product information

E. coli O157 & STEC GeneDisc

Pall GDS RT-PCR E. coli 6‐18 hour enrichment + < 1 hour run

1 cfu/25g

GeneDisc plate for STEC and Salmonella spp.

Pall GDS RT-PCR STEC6‐18 hour enrichment + < 1 hour run

1 cfu/25g

BAX System Real-Time PCR STEC Suite

DuPontQualicon

RT-PCR Stx, eae, +Top 6

9-12 hour enrichment +55 min run

10^4 cfu/ml

*as reported by manufacturer

Ensayos moleculares de detección de Non-O157 STEC comercialmente disponibles

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RETO EN LA INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS DE PCR DE UN

ENRIQUECIMIENTO

IMPLICACIONES• La industria debe confiar en una detección por PCR

para aceptar o rechazar un producto fresco altamente perecedero.

• La evaluación de una gran cantidad de colonias es requerida para confirmar que una muestra contiene aislamientos viables cargados con factores de virulencia.

SUBTIPIFICACIÓN MOLECULAR DE PATÓGENOS TRANSMITIDOS POR ALIMENTOS: FUNDAMENTOS

PARA LA APLICACIÓN

SIMPOSIO DE SEGURIDAD ALIMENTARIA URUGUAY, ABRIL 2015

ENFOQUES MOLECULARES PARA MICROBIOLOGÍA ECOLÓGÍCA

Kendra Nightingale, Ph.D.Centro Internacional para la Excelencia de la Industria Alimentaria

Departamento Ciencias Animales y Alimentarias

Universidad de Texas Tech

SUBTIPIFICACIÓN

• Capacidad para diferenciar un aislamiento más allá del nivel de especie/subespecie.

• Fenotípica• Identificación Molecular de ADN

• Basado en Bandeo• Basada en secuencias de ADN.

FUSIÓN BINARIA EVOLUCIÓN MICROBIANA 101

Generación 1

Generación 2

Generación 3

Generación N

Genotipo Ancestro

Clones

Clones

Clones y genotipos divergentes

¿Mutación ?¿Tasa de mutación bacteriana?

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MECANISMOS DE CAMBIO GENÉTICO• Mutaciones

• Mutaciones puntuales• Mutaciones de cambio• Inversiones• Inserciones/deleciones (indels), incluye duplicaciones.

• Transferencia horizontal de genes

• Transferencia horizontal de genes homólogos de las secuencias de genes.

• Tranferencia horizontal de secuencia de genes no homólogos

• Perdida de plásmido (!!!) o adquisición

CONSIDERACIONES PARA LA INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS EN LA

SUBTIPIFICACIÓN MOLECULAR• ADN humano “huella genetica”: el objetivo es

identificar un solo individuo específico• Las huellas de ADN humano son únicas.• ADN de huellas bacterianas/ no son subtipos

• Subtipificación Bacteriana: el objetivo es determinar si los aislamientos comparten un antepasado común reciente

• Aplicaciones• Detección/identificación• Investigación de brotes• Patrones de contaminación y dinámicas de transmición a lo largo

de la cadena.• Identificar los sitios de refugio.• Vías de transmisión a los productos alimenticios terminados.

TIPIFICACIÓN DE CEPAS BASADAS EN BANDEODE ADN/MÉTODOS DE IDENTIFICACIÓN

(“IDENTIFICACIÓN DE ADN”)

• Métodos de la PCR

• Perfil del plásmido

• PCR Multiplex

• ADN Polimórfico amplificado al azar (RAPD)/ Primers Arbitrarios (AP-PCR)

• Elemento repetitivo PCR (rep-PCR)

• Métodos basados en enzimas de restricción

• PCR-fragmentos de restricción de longitud polimórfica (PCR-RFLP)

• Ribotipificación

• Electroforesis en Gel de campo pulsado (PFGE)

Incluye Ribotipificación y PFGE

Detecta cambios (mutaciones) en sitios de reconocimiento de enzimas de restricción (6 – 8 bases de longitud)

• Mutación puntual puede potencialmente crear un subtipo diferente.

• Solo una pequeña fracción del genoma es “probada” por variación (ej., secuencias reconocidas por la enzima de restricción)

RESTRICCIÓN A NIVEL DE GENOMA MÉTODOS BASADOS EN ENZIMAS

SUBTIPIFICACIÓN E INVESTIGACIONES DE BROTES

Patógenos en los alimentos

Infección humana

Aislamiento de fluido corporal estéril usando

placas de sangre no selectivas

Almacenamiento de alimentos

Aislamiento mediante enriquecimiento selectivo, medio selectivo y agar

diferencial

Subtipificación del Aislado

Subtipificación del Aislado

Imagen proporcionada por Peter Gerner-Smidt, Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades

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• Mediados de Septiembre del 2006

• CDC alertó sobre enfermedades con clusters de E. coli O157:H7 en el noroeste

• CDC PulseNet confimó casoscausados por el mismo tipo PFGE

• A finales de Septiembre del 2006

• 206 personas infectadas con cepasdel brote en 26 estados.

• 52% hospitalizados; 15% SUH; tresmuertes

• 95% de comidas con espinaca frescafueron reportadas dentro de 10 díasantes del inicio de la enfermendad.

• Investigación de rastreo• E. coli O157:H7 brote combinado con

aislamientos de tipo PFGE de ganadoen ranchos cercanos a campos de espinacas y cerdos salvajes

TIPIFICACIÓN DE CEPAS BASADA EN SECUENCIAS DE ADN/MÉTODOS DE

IDENTIFICCIÓN.

• Tipificación Alélica

• Tipificación multilocus de secuencias (MLST)

• Análisis multilocus de repeticiones en tándem de número variable (MLVA)

• Tipificación de Polimorfismo de un solo nucleótido (SNP)

• Tipificación de Repeticiones palindrómicas cortas agrupadas y regularmente espaciadas (CRISPR)

• Secuenciación completa del genoma.

• CDC, FDA y agencias regulatorias de otros países realizan rutinariamente la secuenciación del genoma de patógenos transmitido por alimentos, aislados de casos clínicos de pacientes con enfermedades transmitidas por alimentos.

HISTORIA DE LA SECUENCIACIÓN DEL GENOMA

• La secuenciación de las moléculas de ADN inició a finales de 1970

• La degradación 1uímica, seguido por el método de terminación de cadena de Sanger, conocido como el “Gold Standard" de la secuenciación de ADN.

• Secuenciación Shutgun, basada en el método de Sanger, la clonación de fragmentos en Escherichia coli para la amplificación

• Primera secuencia del genoma bacteriano completada (Haemophilus influenzae; 1,8 millones de pares de bases), terminada en 1995

• Estudios por genómica comparativa E. coli O157:H7/K-12; Primer genoma de Listeria monocytogenes publicado en el 2001

• Finalización de la primera secuencia de genoma humano (3 billones pb) completada en el 2003

• El proyecto tardó 13 años en completarse y costó $ 2.7 millones

EL GENOMA DE 1.000 DOLARES

• 2003

• La Fundación Científica J. Craig Venter prometió 500,000 dólares al primer grupo en producir una tecnología capaz de secuenciar un genoma humano por 1,000 USD

• La Fundación X Prize prometió otros $ 5-20 millones al ganador.

• 2004

• Los Institutos Nacionales de Salud (NIH) pusieron en marcha un programa de $ 70 millones para apoyar a los investigadores que trabajan para secuenciar genomas completos inicialmente por $ 100.000 y en última instancia por $ 1,000

TECNICAS DE SECUENCIACIÓN DE NUEVAGENERACION (NGS)

• Genera grandes cantidades de datos de secuencia rápida y relativamente económica

• Química única y plataformas de preparación, secuenciación y análisis de datos

• Eliminar la necesidad de “secuenciacion por shotgun” clonación y amplificación

• Preparación del Templado

• Templado clonalmente amplificado procedente de una sola molécula.

• Molécula unica de ADN molde.

• Secuenciación.

• Terminación reversible cíclica

• Única adición de nucleótidos.

• Secuenciación por ligación

• Secuenciación en tiempo real.

Metzker, 2010

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APLICACIÓN DE LA SECUENCIACIÓNDE NUEVA GENERACION

• Secuenciación ChIP

• Patrones de metilación

• Secuenciación completa del genoma

• Etiquetas de expresión.

• Metagenómica y diversidad microbiana

• Resecuenciación dirigida

• Análisis de pequenos ARN

• Secuenciación del transcriptoma

APLICACIONES DE NGS EN MICROBIOLOGÍA DE ALIMENTOS / INOCUIDAD DE LOS ALIMENTOS

• Facilita el desarrollo de ensayos de detección mejorados

• Identificación de genes/marcadores únicos para patógenos o cepas del brote

• Permite el desarrollo mejorado de métodos de tipificación molecular.

• Patógenos que son difíciles de diferenciar por PFGE (ej., ciertos serotipos de Salmonella)

• Proporciona nuevos conocimientos sobre la biología de los microorganismos asociados a los alimentos (patógenos, organismos de descomposición, microorganismos beneficiosos)

• Taxonomía (Cinco nuevas subespecies de Listeria., nuevos serotipos de Salmonella), perfil transcripcional y adaptación nicho.

• Permite estudios basados en la gran escala de alimentos asociados con microorganismos, microorganismo ambientales y microbios intestinales.

• Metagenómica para investigar toda la comunidad microbiana (es decir, cultivable y no cultivable) secuenciar el ADN microbiano total .

NGS PARA LA DETECCIÓNESPECÍFICA DE BROTES.

• Antecedentes:

• Brotes muy grandes asociados con cepas no- O157:H7

• Características clínicas inusuales

• Serotipo O104:H4

LA SECUENCIACIÓN DEL GENOMA

• Metas:

• Caracterizar la cepa para posiblemente ganar conocimiento en razón más allá de las características epidemiológicas y clínicas únicas del brote.

• Utilizar los datos de la secuencia del genoma para desarrollar ensayos de PCR para la detección.

• Realizado, utilizando el sistema de Ion Torrent en Europa (LifeTechnologies, Darmstadt Centro de Formación en colaboración con la Universidad de Münster) y en China (BGI Shenzhen)

• Resultados:

• La cepa carece de intimina y codifica para un número de genes que confieren resistencia a diferentes agentes antimicrobianos

• La cepa parece ser un "híbrido que tiene propiedades de EHEC y E. coli enteroagregativa"

Ion Torrent

• Instrumentos approx. $50,000

• Costo de reactivos por aislamiento alrededor de $100

• Secuenciación inicial de un aislado < 1 semana

ENSAYO DEL GENOMA

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NGS PARA MEJORAR LA SUBTIPIFICACIÓN

• Antecedentes

• Salmonella Montevideo es muy clonable.

• Un gran número de aislamientos no relacionados tienen el mismo tipo PFGE, por ejemplo, los aislamientos de "brote de pistacho" y "brote salami"

• Problemas similares con un número de otros serotipos de Salmonella (ej, Newport y Enteritidis)

Xbal  SpeI

Den Bakker et al. 2011. AEM.

NGS BIOLOGÍA DE LOS MICROBIOS ASOCIADOS CON ALIMENTOS

• Sanger method (Nelson et al., 2004)

• F6854 (food – 1988)

• 133 contigs (2.97 MB combined length) – Pseudomolecule

• 8X coverage

• Roche/454 Pyrosequencer (Orsi et al., 2008)

• F6900 (human - 1988)

• 35 contigs (2.96 Mb combined length)

• 26X coverage

• J0161 (human – 2000)

• 49 contigs (2.97 MB combined length)

• 2 contigs (82,678 bp combined length) extra-chromosomal plasmid

(not used for analyses purposes)

• 29X coverage

• J2818 (food – 2000)

• 38 contigs (2.97 Mb combined length)

• 24X coverage

RESULTADOS• Alineación totalmente refinada: 2,922,773 bp (98.4 %)

de la secuencia del cromosoma F6854 (2,971,285 bp)

• 3 sub-alineaciones

• Alineación backbone• Alineamiento de Profago 1 (insertado en comK)• Alineamiento de Profago 1 (insertado en tRNA-Thr-4)

• SNPs (backbone y profago 2):

• 44 SNPs• 42 hijos únicos (observados en un solo aislamiento)• 2 diferenciar 1988 aislamientos de 2000 aislamientos

• Posibles problemas :

• Ensamblado• Alineación• Secuencia de errores

DISTRIBUCIÓN DE SNPS•Re-secuenciación ( Método Sanger) confirmó 12 SNPs•8 SNPs específicos para J2818 (2000 – alimentos)

•3 en regiones intergénicas•1 sinónimo•4 no sinónimos•Fosfoenolpiruvato sintasa, putativo •similar a la etanolamina utilizando proteína EutE •Familia RDD (transporte?)•AddB

•2 SNPs unicas para J0161 (2000 – humanos)•2 en las regiones intergénicas

•1 no se encuentra en el J0161 aislada en la colección FSL•1 SNP única de F6900 (1988 – humanos)

•Región intergénica•1 SNP diferenciado 1988/2000 aislamientos

•1 no sinónimo•Proteína de la cola del fago putativo

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RECOMBINACIÓN• Varios eventos de recombinación que implican un linaje que

aislar, J1194, fueron identificados por GENECONV

• Todos los acontecimientos dentro de un pofagos, insertados en comK

F6854F6900J2818J0161FSL J1-

194

Lysogeny control Cell

lysis Tail and base structures Head structural components &

assembly

DNA packaging

DNA replication, recombination, modification and gene expression modulation

Lysogeny control

Prophage inserted in comK

R1

R2

R3

ER1

ER2

12 AÑOS DE EVOLUCIÓN

F6900 (humano)

F6854(alimentos)

Ancestor A

1

Ancestor B

comKprophage recombination

ARNt propaga la mutación o recombinación

J2818(alimento)

J0161(humano)

1

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NGS Y ESTUDIOS DE POBLACIÓN

• La secuenciación de todo el ADN encontrado después del enriquecimiento es factible y se está haciendo por la FDA.

• Reduce el sesgo que es inherente a la detección tradicional• Crea datos sobre todo el ADN encontrado; un enorme

potencial para la creación de datos "comprometedores" en ausencia de riesgos para la salud pública.

• Caracterización basada en NGS de la diversidad microbiana encontrado en una muestra dada

• Secuenciación de ARN masiva en paralelo• Potencial de rastreo de fuentes

RESUMEN GENERAL Y CONCLUSIONES

• La secuenciación de nueva generación del genoma esta contribuyendo a la inocuidad alimentaria

• Subtipificación mejorada de PFGE• Identificación de mejores genes diana para la detección.• Traducción de transcriptómica, metabolómica, etc. hallazgos para

mejorar la prevención y tratamiento está en las primeras etapas

• Sistemas bioinformáticos, están avanzando rápidamente haciendo viable su aplicación en laboratorios de salud pública.

• NGS también impactará en los enfoques de detección de patógenos