uso e validazione del wbc marker kit ® - celltech per la marcatura in vitro di leucociti autologhi...
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Uso e validazione del WBC Marker Kit ® - Celltech per la marcatura in vitro di
leucociti autologhi
A.F.Sedda 1,2, S. Boemi 2
1 )ENEA
2) Ospedale S.Eugenio Roma
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WBC Marker Kit ® - Celltech• Utilizza materiali monouso sterili, apirogeni, latex
free.
• Secondo le indicazioni “PICS (Pharmaceutical Inspection Convention)/GMP Guide for blood
establishment del 25-9-2007” e EU Guidelines toGMP-Annex 1 del 14-2-2008, può essere considerato
un “sistema chiuso”.
• Tutte le manovre di trasferimento fra le siringhe e di passaggio nelle varie fasi di preparazione avvengono
sempre in sistema chiuso e in isolamento.
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EU Guidelines toGood Manufacturing Practice
Medicinal Products for Human and Veterinary UseAnnex 1
Manufacture of Sterile Medicinal Products
• 34. Prior to the completion of stoppering, transfer of partially closed containers,…..,
should be done either in a grade A environment with grade B background, or in
sealed transfer trays in a grade B environment.
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WBC-Marker Kit monouso
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Reagenti del WBC Marker Kit
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L'isolamento dall'ambiente esterno è garantito dall'uso di valvole Luer activated certificate, che aprono e
chiudono il passaggio dei fluidi automaticamente per semplice connessione o disconnessione.
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Certificazione fornita dalla Cardinal Health sulla sicurezza alla contaminazione della valvola femmina
SmartSite.
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Certificazione fornita dalla Cardinal Health sulla sicurezza alla contaminazione della
valvola femmina SmartSite.
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Certificazione fornita dalla Cardinal Health sulla sicurezza alla contaminazione della valvola
maschio Texium.
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WBC Marker Kit ® - Celltech
• Il Kit è validato per resa di marcatura, vitalità delle cellule leucocitarie marcate,
sterilità del processo (dal prelievo di sangue,compreso, fino al momento della
re-iniezione dei leucociti marcati).
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WBC Marker Kit ® - Celltech
• Massima semplificazione nella manipolazione in tutte le fasi del processo, e garanzia di
isolamento del materiale biologico dall'ambiente esterno.
• Le valvole di transito sono certificate dal costruttore per un uso sicuro fino a 50
connessioni/disconnessioni, e per un tempo di permanenza su catetere venoso centrale
certificato fino a72 ore
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1) Preparazione e prelievo del sangue(Siringa A con valvola a chiusura automatica all’atto
della disconnessione)
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Sedimentazionein siringa A,
con valvolamaschio chiusa
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2) Separazione del plasma arricchito in leucociti(Sangue in siringa A con valvola maschio chiusa)
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3) Separazione del plasma arricchito in leucociti (Eritrociti in siringa A, plasma in siringa B, attraverso le due valvole a
chiusura automatica alla disconnessione)
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3) Separazione del plasma arricchito in leucociti (Plasma in siringa B, valvola femmina chiusa)
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La siringa Bcontenente il
plasma arricchito in
leucociti viene
resecata con un apposito
Syringe Cutter ®
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4) Separazione dei leucociti(Plasma in siringa B, resecata, con valvola
chiusa)
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4) Separazione dei leucociti(Plasma in siringa B, resecata, con valvola
chiusa, centrifugata)
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5) Separazione dei leucociti (Leucociti in siringa B, plasma depleto in siringa C)
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Vial contenente il radiofarmaco, con perforatore e valvola chiusa
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Prelievo del radiofarmaco
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6) Marcatura dei leucociti(Leucociti + 99mTc-HMPAO in siringa B
resecata)
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7) Purificazione dei leucociti marcati(Leucociti in siringa B con valvola chiusa,
centrifugata)
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8) Trasferimento dei leucociti marcati(Leucociti in siringa finale per iniezione al
paziente)
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Studio di ottimizzazione della sedimentazione
• Per studiare il processo di sedimentazione, è stato effettuato un prelievo di sangue e una marcatura su sei volontari sani.
• Al termine della marcatura, i leucociti marcati sono stati miscelati con il plasma depleto e con gli eritrociti, per studiare in dettaglio la cinetica della sedimentazione dei leucociti stessi.
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• Ogni 15 minuti la siringa di sedimentazione di ognuno dei soggetti è stata fotografata ogni 15 minuti, e contemporaneamente è stata
acquisita una scintigrafia gamma della stessa siringa.
• In tal modo è stato possibile confrontare il processo di formazione della interfaccia plasma-eritrociti con la cinetica reale di
separazione dei leucociti.
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Visualizzazione fotografica e scintigrafica del processo di sedimentazione
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Scintigrafiadurante la
sedimentazione(immagine ogni
15 min).
La linea nera su ogni scintigrafia
mostra la corrispondente
interfaccia plasma-eritrociti
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Da sinistra: 1) siringa dopo sedimentazione,
2) fase di separazione del
plasma dagli eritrociti, 3)
le due frazioni separate
Pellet di leucociti
centrifugato in siringa
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-10
0
10
20
30
40
50
60
70
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0 50 100 150
sedimentation time (min)
% L
RP
LRP height (%) LRP activity (%)
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La figura precedente mostra come la formazione dell’interfaccia plasma-eritrociti
sia praticamente completa dopo circa un’ora, mentre la separazione dei leucociti
marcati prosegue fino a due ore dall’inizio della sedimentazione.
Un appropriato tempo di attesa consente quindi di aumentare notevolmente la
resa finale della marcatura
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Durante il processo, la contaminazione da batteri (media fill test e piastra di coltura) è sempre (n=30)
risultata negativa
Durante il processo, la contaminazione da muffe (piastra di coltura) e lieviti ( piastra di coltura) è sempre
(n=30) risultata negativa
Durante il processo, la concentrazione di pirogeni determinata mediante Limulus Test è sempre (n=30) risultata inferiore al limite di rivelabilità del test (0.125
UI/ml) (circa 30 volte inferiore al limite massimo ammesso dalla FDA per radiofarmaci marcati con
99mTc)
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0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
0 20 40 60 80 100 120 140
sedimentation time (min)
% L
RP
he
igh
t
HES 130 kDa HES 200 kDa
Confronto tra il sedimentante contenuto nel WBC Marker Kit (200 kDa),con il sedimentante comunemente reperibile in commercio (130kDa).
E’ ben visibile come il sedimentante 200 kDa produca una separazione plasma/eritrociti notevolmente migliore.
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Misura di vitalità-Microscopio a fluorescenzaLe cellule verdi sono i leucociti vitali, quelle arancioni
Rappresentano i leucociti non vitali o apoptici
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Misura di vitalità al microscopio otticoI leucociti vitali sono indicati dai punti gialli
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Microscopio ottico - Misura di vitalità immediatamente dopo la marcatura. I punti blu sono leucociti non vitali, colorati con il tripan blu. Sono anche visibili gli eritrociti
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Microscopio ottico - Misura di vitalità tre ore dopo la marcatura.I punti blu sono leucociti non vitali, colorati con il tripan blu. Sono anche visibili gli eritrociti
![Page 39: Uso e validazione del WBC Marker Kit ® - Celltech per la marcatura in vitro di leucociti autologhi A.F.Sedda 1,2, S. Boemi 2 1 )ENEA 2) Ospedale S.Eugenio](https://reader030.vdocuments.net/reader030/viewer/2022013003/5542eb74497959361e8dc9e0/html5/thumbnails/39.jpg)
Variazione del numero dei leucociti vitali dopo tre ore a temperatura ambiente.
Il numero di eritrociti (usati come controllo) rimane costante
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Chemiotassi sotto agar dei leucociti marcati (i due pozzetti laterali), diretta verso LPS di E.Coli (pozzetto centrale). Rivelazione effettuata
mediante radioactivity phosphor image screen Cyclone PE.
Iniziale
Dopo 1 oraO O O
O O O
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Chemiotassi dei leucociti marcati in capillare, diretta verso LPS di E.Coli , dopo 1 ora. E’ visibile al microscopio il
“ventaglio” dei leucociti che migrano nel pozzetto con LPS
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RBC
/
WBC
PLT
/
WBC
Total
WBC
Labeling yield
(%)
Dead
cells
(%)
Sedimentation time
Reccomended values (1)
< 3 < 1 Typically
2 . 108
>40 < 4
-----
Obtained experimental values (n=24)
1.7
+ 0.5
0.77
+ 0.2
2 . 108
+ 0.3 . 108
79 + 5 1.1
+0.3
110 min
+ 15
Caratteristiche ottenute con il kit WBC Marker Kit su un gruppo di 24 pazienti
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I risultati riportati in tabella mostrano un rapporto RBC/WBC e piastrine/WBC migliore del valore
raccomandato dalle linee guida Europee.
La vitalità si è sempre mantenutaentro valori eccellenti
La resa di marcatura ha mostrato valoricostantemente dell’ordine dell’80%, ottenuti
con un prelievo di 32 ml di sangue, e con l’uso di una sola confezione di HMPAO
per 5-6 marcature (< 100 microgrammi/marcatura)
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Tipica curva di wash-out ottenuta, che indica una eccellente qualità e una bassa attivazione
dei leucociti nella marcatura.
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Rapporto attività milza/attività fegato, ottenuta su un gruppo di 42 pazienti.
2 ore 20 ore
2.79 + 0.4 2.32 + 0.2
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Tipica immagine clinica ottenuta con il WBC-Marker Kit