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REDVET Rev. Electrón. vet. http://www.veterinaria.org/revistas/redvet 2017 Volumen 18 Nº 9 - http://www.veterinaria.org/revistas/redvet/n090917.html

Utilización de inoculo comercial para la producción de ensilado de pescado. Estudio preliminar http://www.veterinaria.org/revistas/redvet/n090917/091740.pdf

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REDVET - Revista electrónica de Veterinaria - ISSN 1695-7504

Utilización de inoculo comercial para la producción de ensilado de pescado. Estudio preliminary - Use of commercial inoculant for the production of fish silage. Preliminary study

Fernández Herrero, A.1; Fernández Compás, A. 1; Salomone, A. 1 y Vittone, M. 1

1Programa: “Desarrollo de Productos, Procesos y Transferencia de Tecnología”. INIDEP. Instituto Nacional de Investigación y Desarrollo Pesquero. Paseo Victoria Ocampo N°1. Mar del Plata, Argentina.

Correo electrónico: [email protected] Resumen Se utilizaron dos inóculos al 5% para la fermentación láctica de residuos de corvina rubia (Micropogonias furnieri): bacterias del yogur (L. bulgaricus y S. thermophilus) para el ensilado A y el inoculante comercial SILOTRAP (L. plantarum) para el ensilado B; además 10% de sacarosa y 0,25% de ácido sórbico. Se mantuvieron durante 15 días a 29 ºC. El ensilado B se estabilizó en 4,4 a los 8 días mientras que, el ensilado A llegó a 4,55 a los 13 días. La composición nutricional de los ensilados A y B respectivamente (en base seca) fue: proteína (42,28–41,28%); extracto etéreo (15,39–15,05%) y cenizas (16,08–16,89%). En cuanto a la oxidación lipídica (TBARS), el valor llegó a 13,69 y 13,12 mgMDA/kg; los valores de Nitrógeno Básico Volátil Total (NBVT) fueron de 104,813 mg N/100g y 102,701 mg N/100g (A y B respectivamente). El contenido de Omega 3 fue: EPA (3,54–3,00%) y DHA (5,77–4,80%) para los ensilados A y B respectivamente. En ambos ensilados desaparecen prácticamente las proteínas >50 kDa y, el grado de hidrólisis (%GH) llegó, en A al 10,76% y, en B al 12,83%. Los ensilados obtenidos, presentan un comportamiento similar en cuanto a su calidad nutricional, grado de hidrólisis y tamaño de péptidos. Se observó que, la utilización del inoculante SILOTRAP, aumenta la acidez y la velocidad con que ésta se alcanza con el inoculante “yogur”. Estos resultados alientan el estudio del empleo de inóculos comerciales utilizados en agricultura, para la elaboración de ensilados biológicos a partir de residuos pesqueros.

Palabras clave: ensilado biológico; inóculo comercial; grado de hidrólisis; peso molecular.



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Abstract Two 5% inocula were used for lactic fermentation of corvina (Micropogonias furnieri) residues: yogurt (L. bulgaricus and S. thermophilus) bacteria for silage A and the commercial inoculant SILOTRAP (L. plantarum) for silage B; in addition 10% sucrose and 0.25% sorbic acid. They were kept for 15 days at 29 °C. Silage B stabilized at 4.4 at 8 days while silage A reached 4.55 at 13 days. The nutritional composition of silages A and B respectively (dry basis) was: protein (42.28 - 41.28%); ethereal extract (15.39 - 15.05%) and ashes (16.08 - 16.89%). As for lipid oxidation (TBARS), the value reached 13.69 and 13.12 mgMDA / kg; the values of Total Volatile Basic Nitrogen (NBVT) were 104.813 mg N / 100 g and 102.701 mg N / 100 g (A and B respectively). The content of Omega 3 was: EPA (3.54 - 3.00%) and DHA (5.77 - 4.80%) for silages A and B respectively. In both silages the proteins > 50 kDa disappeared practically, and the degree of hydrolysis (% GH) reached, in A to 10.76% and in B to 12.83%. The silages obtained have a similar behavior in terms of nutritional quality, degree of hydrolysis and size of peptides. It was observed that the use of the SILOTRAP inoculant increases the acidity and the speed with which it is reached with the "yogurt" inoculant. These results encourage the study of the use of commercial inocula used in agriculture, for the preparation of biological silage from fish waste. Keywords: biological silage; commercial inocula; degree of hydrolysis; molecular weight. INTRODUCCION Los residuos generados de la pesca y acuicultura son una fuente importante de proteínas, lípidos y otras biomoléculas; actualmente se realizan estudios para dar un uso adecuado a los mismos y, a la vez, evitar el impacto que puedan causar al medio ambiente. Los métodos biológicos como la hidrólisis enzimática o el ensilado biológico (por fermentación láctica) son los preferidos para recuperar biomoléculas a partir de residuos de la industria de pescado, en comparación con los métodos químicos (ácido / alcalino), porque estos últimos son más peligrosos y generan residuos que no son respetuosos con el medio ambiente (Rai et al., 2011).

Históricamente en el medio rural se realizan ensilados de forrajes para alimentación de ganado; este proceso sirve para almacenar alimento en tiempos de cosecha y suministrarlo en tiempo de escasez, conservando calidad nutritiva y palatabilidad. Si bien la fermentación láctica puede tener lugar por la actividad espontánea de la microflora salvaje y naturalmente presente en el forraje utilizado, también puede inducirse, controlarse y estandarizarse mediante el empleo de inoculantes para silos, constituidos principalmente por BAL (bacterias ácido lácticas), logrando beneficios nutricionales y económicos



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en relación a la fermentación espontánea. El empleo de inoculantes permite controlar y dirigir la fermentación microbiana al favorecer un descenso rápido de pH, lo que evita la proliferación de microflora indeseable, la producción de nitrógeno amoniacal, ácido butírico, acético y micotoxinas, lo que redunda en una mayor calidad del alimento, mayor estabilidad aeróbica una vez abierto el silo y una mayor receptibilidad por parte del ganado (Borgo, 2014).

Los inoculantes microbiales para ensilaje son BAL seleccionadas; se dividen en dos grupos dependiendo de cómo fermentan los azúcares: BAL homofermentativas y BAL heterofermentativas. Las bacterias homofermentativas como Lactobacillus plantarum, Lactobacillus casei, Pediococcus spp. y Enterococcus spp., producen principalmente ácido láctico. Las bacterias heterofermentativas como Lactobacillus buchneri, producen ácido láctico, ácido acético, etanol y dióxido de carbono. Las BAL homofermentativas son los inoculantes más comunes en el mercado (Contreras Govea y Muck, 2006; Contreras Govea et al., 2009). Para su multiplicación requieren de azúcares como glucosa y lactosa, además de aminoácidos, vitaminas y otros factores de crecimiento (Ramírez Ramírez et al., 2011). Recientemente Fernández Herrero et al., (2015a y 2016) utilizaron las BAL del yogur comercial (L. bulgaricus y S. thermophilus) para desarrollar ensilados biológicos con residuos de corvina rubia (Micropogonias furnieri) y, hallaron que es suficiente utilizar como inóculo un 5 % de yogur y un aporte de hidratos de carbono de un 10 % de sacarosa, presentando buenas características nutricionales para su uso como suplemento dietario en piensos para animales de cría. En el presente trabajo se evaluó comparativamente, la utilización de dos inóculos para la fermentación láctica de residuos de corvina rubia (Fig.1): a - bacterias del yogur comercial (L. bulgaricus y S. thermophilus) y, b - inóculo microbiano comercial SILOTRAP (L. plantarum), utilizado ampliamente en agricultura.

Figura 1. Corvina rubia (Micropogonias furnieri) (Fuente: Cousseau y Perrotta, 2013)



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MATERIALES Y MÉTODOS La materia prima utilizada para la elaboración de los ensilados fueron residuos (esqueleto; aletas; cabezas y vísceras) de 10 ejemplares (38,5 – 42,0 cm de largo total) de corvina rubia (M. furnieri). El residuo fue congelado y transportado al Laboratorio de Tecnología de los Productos Pesqueros del INIDEP, donde se trituró en una picadora de carne marca FREIRE (Figura 2.a) con una placa perforada (orificios de 4 mm), fue homogéneamente mezclado formando una pasta y se congeló (- 25 °C) hasta su uso posterior. Como agente fermentativo (inóculo) se utilizó: a - Yogur natural, Marca YOGS de la Empresa SANCOR (L. bulgaricus y S. thermophilus) y; b - SILOTRAP de la firma NITRAP® (L. plantarum). Para la fermentación se empleó como fuente de hidratos de carbono sacarosa de caña de azúcar y; como antimicótico ácido sórbico (Marca Britania). En la preparación del inóculo microbiano, se diluyó 0,2 g de SILOTRAP en 100 ml de solución fisiológica estéril y se mantuvo a temperatura ambiente durante 48 hs antes de ser utilizado. Se analizó la concentración de bacterias lácticas tanto en el yogur como en el inóculo SILOTRAP; y se halló 1 x 106 UFC/g y 2,0 x 105 UFC/ml respectivamente. Preparación del ensilado.

a

b

c

Figura 2. Preparación del ensilado de corvina rubia. (a. picado de residuos; b. frascos con los ensilados y c. equipo ANKOM). (Fuente: A. Fernández Herrero)

Se elaboraron dos ensilados (por duplicado), con 10% de sacarosa, 0,25% de ácido sórbico y 5 % de inóculo (ensilado A: con yogur y ensilado B: con SILOTRAP). Los residuos triturados (MP), la sacarosa y el ácido sórbico fueron dosificados respectivamente en recipientes plásticos de 1,5 litros aproximadamente. Seguidamente, a cada recipiente se le agregó la cantidad de inóculo que correspondía y se mezcló con espátula durante 10 minutos a temperatura ambiente (20 ºC ± 2 ºC) hasta lograr una masa homogénea; luego se trasvasó la mezcla a frascos de vidrio (Figura 2.b) de 2 litros de capacidad con tapa plástica a rosca, los cuales se mantuvieron a 29 ºC en un



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equipo incubador (Marca ANKOM Daisy) con sistema de rotación y controlador automático de temperatura (Figura 2.c). A fin de lograr una acidificación homogénea, periódicamente se rotaron los frascos. A partir del 5° día de la preparación de los ensilados se tomó pH con tiras indicadoras de pH Marca Merck. Caracterización de la materia prima (MP) y ensilados (A y B). Se realizaron análisis bioquímicos, en la MP y en los ensilados (A y B) al final del proceso (15 días de fermentación). Proteínas por el método Kjeldahl (se utilizó el factor de conversión 6,25); contenido de agua y cenizas según AOAC (1995) y el extracto etéreo por el método Randall (1974). Todas las determinaciones se hicieron por duplicado. Se determinó la oxidación lipídica por el método del ácido tiobarbitúrico (TBARS) usando un coeficiente de extinción molar de 1,56 x 105 mol-1 cm-1 (Tiróni, 2005) y las bases nitrogenadas volátiles totales (NBVT) se determinaron por destilación según el método de referencia señalado por la UE (CEE/95/149). Para el seguimiento de la hidrólisis de proteínas durante la fermentación láctica se evaluó el grado de hidrólisis (%GH) por el método de Pezoa y Mellado (1979), con ligeras modificaciones (Fernández Herrero et al., 2015 b). La proteína soluble se determinó por el método de Lowry et al., (1951), expresando la concentración de proteínas como mg de albumina, a través de lectura de la absorbancia a 500 nm en espectrofotómetro visible (Marca Shimadzu. Modelo UV-1800). Así, el grado de hidrólisis se expresa como la relación entre las proteínas solubilizadas y las proteínas totales presentes en el substrato inicial, en % de acuerdo con la siguiente ecuación: %GH = mg Proteína (en TCA 20%) x 100 mg Proteína total La distribución del perfil proteico de la MP y ensilados (A y B) se determinó por electroforesis en gel de poliacrilamida en condiciones desnaturalizantes (SDS-PAGE: sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis), al 12 % para el gel separador y al 4 % para el gel concentrador, utilizando Tris-Glicina 1X como buffer de corrida de la electroforesis (Laemmli, 1970) con modificaciones según Salomone (2016). Para determinar el peso molecular relativo de las proteínas se utilizó un marcador de peso molecular comercial Novex® Sharp Pre-Stained Protein Ladder de Invitrogen (las bandas corresponden a pesos moleculares entre 10 y 160 kDa). Los lípidos totales se determinaron por el método de Bligh y Dyer (1959); los ácidos grasos fueron metilados según Dowd (2012) con modificaciones, separados y cuantificados en un cromatógrafo de gases Shimadzu® GCMS-



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2010, equipado con un inyector split, con una columna capilar de sílica fundida Omegawax Supelco® 320 (30 m x 0,32 mm ID, 0,25 μm) y un detector de ionización a la llama (FID). Los parámetros de operación y la identificación de los ácidos grasos se realizaron de acuerdo a Fernández Compás (2015). RESULTADOS Y DISCUSION Las temperaturas óptimas de crecimiento para S. thermophilus y L. bulgaricus son de 37º - 42ºC y de 42º - 45ºC, respectivamente, además ambas se desarrollan en una verdadera simbiosis (Rivas y Garro, 2006). Mientras que L. plantarum se desarrolla entre 30 - 40 °C (Waldir et al., 2007). El ensilado “B” (L. plantarum) registró un descenso de pH más rápido respecto del “A” (S. thermophilus y L. bulgaricus); el pH llegó a 4,5 en el ensilado B a los 6 días y, se estabilizó en 4,4 a los 8 días; en el ensilado A el pH llegó a 4,55 a los 13 días y, se mantuvo hasta el día 15 del ensayo (Tabla 1); evidenciando que la temperatura de incubación es fundamental para lograr el desarrollo bacteriano y con ello la producción de ácido láctico, responsable de la disminución del pH.

Tabla 1. Registro de la variación de pH de los ensilados (A y B) de M. furnieri, durante la maduración (los valores son el promedio de los duplicados).

Tiempo (días) 1 6 8 10 13 15

A 6,50 5,20 4,70 4,70 4,55 4,55 B

pH 6,50 4,50 4,40 4,40 4,40 4,40

En cuanto a la evaluación sensorial, a partir del sexto día se observó un

aumento gradual del proceso de licuefacción, pasando de una mezcla homogénea de textura pastosa, con apenas exudado de líquido, a una forma cremosa-pastosa (ensilado A) y, semi-líquida con partículas (ensilado B). La licuefacción observada durante el almacenamiento del ensilado puede determinarse por la consistencia, que se reduce a medida que aumenta la hidrólisis y el contenido de nitrógeno soluble (Belli Contreras, 2009). Respecto al color, se pudo observar que no hubo diferencias entre los ensilados, hubo leves cambios durante los 15 días de almacenamiento; el color al comienzo es a carne picada beige-rojiza y, llega a los 15 días a ser beige claro. El olor, se mantuvo similar en ambos ensilados, comenzó siendo olor a pescado fresco y pasó a olor a queso suave.

El valor nutricional del ensilado es semejante a la materia prima

utilizada (Borguesi et al., 2007). En la Tabla 2 se presentan los valores de la composición proximal de la MP y los ensilados (en base seca). Los valores presentaron un comportamiento similar al hallado por Fernández Herrero et al. (2015a) para residuos de corvina (vísceras y cabeza); los altos valores de ceniza están relacionados directamente con la alta presencia de estructuras óseas (cabezas y esqueleto). El contenido de proteínas, extracto etéreo y



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cenizas, en los ensilados A y B es menor al registrado en la MP; debido a la incorporación del inóculo (yogur y SILOTRAP).

Tabla 2. Composición proximal de MP y ensilados (A y B) de M. furnieri. Cada valor es el promedio de los duplicados ± dispersión. Muestra % Proteína % Ext. Etéreo % Cenizas % Mat. Seca

MP 58,22 ± 0,70 19,50 ± 0,20 18,38 ± 0,33 29,49 ± 0,19 A 42,28 ± 0,88 15,39 ± 0,63 16,08 ± 0,63 33,32 ± 0,21 B 41,28 ± 0,27 15,05 ± 0,62 16,89 ± 0,54 33,40 ± 0,11

Para estimar como se degradan los lípidos durante el proceso fermentativo, se determinó el valor de TBAR (Tabla 3). En este estudio, el valor inicial hallado para la MP fue de 8,7 ± 0,82 mg MDA/kg lo cual indica una buena calidad, teniendo en cuenta que, el valor de TBAR que indica buena calidad del músculo de pescado es alrededor de 5 mg MDA/kg, y son aceptables para el consumo humano valores hasta de 8 mg MDA/kg (Osorio Contreras, 2014; Rodriguez y Rojas, 2014); en los ensilados (A y B respectivamente), llegó a 13,69 ± 0,44 y 13,12 ± 0,78 mgMDA/kg, los valores hallados son aceptables teniendo en cuenta que, para una harina de pescado, el valor de TBAR puede considerarse normal hasta 8 mgMDA/kg y altamente oxidado a partir de 15 mgMDA/kg (Cruz Suárez et al., 2000).

Tabla 3. Valores de TBAR y NBVT en MP y ensilados (A y B). Cada valor es el promedio de los duplicados ± dispersión.

MP A B NBVT (mg N/100g) 22,14 ± 1,16 104,81 ± 0,00 102,70 ± 1,16 TBARS (mg de MDA/kg) 8,70 ± 0,82 13,69 ± 0,44 13,12 ± 0,78

Las harinas de pescado para consumo humano deben tener entre 20–30 mg N/100 g; para consumo animal, se clasifican en: buenas 115-117 mg N/100 g, contaminada 450-500 mg N/100 g y muy contaminada 1100 mg N/100 g (Belli Contreras, 2009). En este estudio, la MP presentó un valor de NBVT de 22,14 mg N/100g; los ensilados, a los 15 días de almacenamiento, registraron valores de 104,813 mg N/100g y 102,701 mg N/100g (A y B respectivamente, Tabla 4); ambos ensilados presentaron un comportamiento similar al reportado para ensilado de corvina por Fernández Herrero et al. (2015a), alcanzando valores de nitrógeno amoniacal menores, lo que los sitúa dentro de la categoría de “buena calidad”, de acuerdo a los valores usados para harina de pescado. Con respecto al perfil de los pesos moleculares, en la MP se observa la presencia de proteínas de alto peso molecular de 260 kDa y 50 kDa, además se identificaron dos fracciones peptídicas de 10 kDa y 3,5 kDa; ambos ensilados al día 15, presentan el mismo comportamiento: desaparecen prácticamente las proteínas >50 kDa y se destacan: una fracción proteica de 40 kDa y dos fracciones peptídicas de 10 y 3,5 kDa (Figura 3).



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Figura 3. SDS-PAGE de proteínas de la materia prima (MP) y ensilados (A1; A2 y B1; B2) a los 15 días. Bandas proteicas del marcador de peso molecular (PM), con sus pesos en kDa.

El grado de hidrólisis proteica (%GH) llegó, en el ensilado A al 10,76% y, en el ensilado B al 12,83%. Tabla 4. Perfil de ácidos grasos (g/100g) de MP y los ensilados A y B de M. furnieri

MP A B C12:0 0,15 0,16 0,16 Ac. mirístico C14:0 2,63 2,81 2,81 C15:0 0,78 0,82 0,83 Ac. palmítico C16:0 27,00 27,94 28,58 C17:0 1,23 1,29 1,32 Ac. esteárico C18:0 8,24 8,72 9,22 C21:0 0,45 0,48 0,49 C22:0 1,17 0,99 0,86 C23:0 0,32 0,37 0,41 C24:0 0,16 0,14 0,16 AGS 42,13 43,73 44,85 C14:1 0,22 0,24 0,24 C15:1 0,25 0,27 0,27 Ac. palmitoleico C16:1 11,17 12,21 12,40 C17:1 0,59 0,68 0,67 Ac. oleico C18:1n9 t y c 12,47 13,51 14,00 C18:1n7 3,85 4,33 4,40 C18:1n11 0,20 0,21 0,22 C20:1 0,45 0,50 0,51 C22:1n9 0,93 0,98 1,01 C22:1n11 0,51 0,71 0,72 AGMI 30,63 33,64 34,45 Ac. linoleico C18:2n6 t y c 0,71 0,73 0,73 Ac. linolénico C18:3n6 0,28 0,24 0,22

MP PM A1 A2 B1 B2

260 110

80

50

40

15

10

3.5



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C18:4n3 0,26 0,24 0,20 C18:3n3 1,31 1,49 1,46 C20:2 y C20:3 0,16 0,17 0,18 C20:3n6 0,16 0,19 EPA C20:5n3 4,25 3,54 3,00 Àc. araquidónico C20:4n6 0,25 0,30 0,33 C22:5n3 2,66 2,07 1,76 DHA C22:6n3 7,82 5,77 4,80 AGPI 17,86 14,75 12,68 No identif. (%) 9,29 7,78 7,95

El contenido de ácidos grasos de las muestras analizadas, se presenta en la Tabla 4. La composición de ácidos grasos hallada para la MP es similar a la hallada por Fernández Herrero et al. (2015 a) para residuos de M. furnieri (cabezas y vísceras) a excepción los ác. esteárico; ác. linoleico; ác. linolénico; DHA y EPA que son algo mayores. Para los ensilados A y B, respectivamente, se identificaron entre 43,73 – 44,85 % de los ácidos grasos saturados (AGS), siendo los ácidos palmítico (C16:0), esteárico (C18:0) y mirístico (C14:0) los predominantes (27,94 – 28,58 %; 8,72 – 9,22 % y 2,81%, respectivamente). Los ácidos grasos monoinsaturados (AGMI) representaron el 33,64 – 34,45 %; los ácidos oleico (C18:1 n9 t y c) y palmitoleico (C16:1) fueron los más abundantes (13,51 – 14,00 % y 12,21 – 12,40 % respectivamente). Los ácidos grasos polinsaturados (AGPI) representan entre el 14,75 y 12,68 %, se identificaron y cuantificaron dos ácidos grasos de la familia omega-3: el ácido eicosapentaenoico (C20:5n3; EPA) (3,54 – 3,00%) y el ácido docosahexaenoico (C22:6n3; DHA) (5,77 – 4,80 %) para los ensilados A y B respectivamente.

CONCLUSIONES Los ensilados obtenidos, presentan un comportamiento similar en cuanto a su calidad nutricional, grado de hidrólisis (%GH) y tamaño de péptidos. Se observó que, la utilización del inoculante SILOTRAP, aumenta la acidez y la velocidad con que ésta se alcanza con el inoculante “yogur”. Estos resultados alientan el estudio del empleo de inóculos comerciales utilizados en agricultura, para la elaboración de ensilados biológicos a partir de residuos pesqueros. Agradecimientos: las autoras agradecen al SENASA por aportar el material de estudio (residuos de corvina rubia); a la empresa NITRAP SRL proveedora de SILOTRAP; al Téc. Pablo Casagrande del INIDEP, por el procesamiento de los residuos de corvina rubia; a la Téc. Analia García del Gabinete de Biología Molecular y Microbiología del INIDEP.



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REDVET: 2017, Vol. 18 Nº 9

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