vol.1, nr.1, 2010 ediţie în limba românã - bioclima.robioclima.ro/j1rom.pdf · • prof. dr....

Vol.1, Nr.1, 2010

Ediţie în Limba Românã

ISSN 2069-0037

ISSN-L 2069-0037

Balneo-Research Journal Vol.1, Nr.1, 2010

EDITOR: Dr.Biol. Constantin Munteanu, Institutul Naţional de Recuperare, Medicinã Fizicã şi Balneoclimatologie, Romania

EDITORIAL BOARD

• Prof. Dr. Müfit Zeki KARAGÜLLE, MD, PhD, President of International Society of Medical Hydrology and Climatology, Department of Medical Ecology and Hydroclimatology, Istambul Medical Faculty of Istambul University, Turkey;

• Prof. Dr. Constantin Cosma, Şef Catedra Fizica, Chimia şi Ingineria Mediului, Facultatea de Ştiinţa Mediului, Universitatea Babeş-Bolyai Cluj-Napoca, Romania;

• Ass. Prof. Dr. Delia Cintezã, PhD., University of Medicine and Pharmacy "Carol Davila" – Bucharest, Romania;

• Ass. Prof. Dr. Olga Surdu, PhD., Balneary Sanatorium Techirghiol, Constanta, Romania; • Ass. Prof. Dr. Liviu Enache, PhD., Universitatea de Ştiinţe Agronomice şi Medicina Veterinara

Bucureşti, România; • Ass. Prof. Dr. Gheorghe Stoian, PhD., Department of Biochemistry and Molecular Biology,

University of Bucharest, Faculty of Biology, Bucharest, Romania; • Ass. Prof. Dr. Claudiu Mãrgãritescu, Senior Pathologist at Emergency Clinical Hospital from

Craiova, University of Medicine and Pharmacy from Craiova, Romania; • CP II, Iuri Simionca, Dr.B., Ph.D., National Institute of Rehabilitation, Physical Medicine and

Balneoclimatology, Bucharest, Romania; • Gina Gãlbeazã, National Institute of Rehabilitation, Physical Medicine and Balneoclimatology,

Bucharest, Romania; • Mihai Hoteteu, Ph.D., National Institute of Rehabilitation, Physical Medicine and

Balneoclimatology, Bucharest, Romania; • Diana Munteanu, M.Sc., National Institute of Rehabilitation, Physical Medicine and

Balneoclimatology, Bucharest, Romania. • Liana Gheorghievici, M.Sc., National Institute of Rehabilitation, Physical Medicine and

Balneoclimatology, Bucharest, Romania.

Published by

Editura Balnearã - http://editura.pluto.ro/Journal.htm

Laborator Culturi Celulare - http://cell-culture.xhost.ro/

E-mail: [email protected]

B-dul Ion Mihalache, 11A, Sector 1, Bucharest, Romania

ISSN 2069-0037

ISSN-L 2069-0037

2


Cuprins

• Editorial – Constantin Munteanu

• Agenda celei de A VIII-a Conferinţe Naţionale de Balneologie organizate de Institutul Naţional de Recuperare, Medicina Fizica si Balneoclimatologie

ORIGINAL PAPERS

• Metodologia experimentala utilizatã de Laboratorul de Culturi Celulare din cadrul INRMFB în scopul evaluãrii efectului terapeutic al factorilor naturali - Constantin Munteanu, Diana Munteanu

• Date morfologice şi electroforetice privind culturile primare heterogene dermale obţinute de la şobolani Wistar normali sau sensibilizaţi cu Ovalbuminã şi trataţi prin speleoterapie în minele de sare de la Cacica şi Dej din România - Constantin Munteanu, Diana Munteanu, Iuri Simionca, Mihai Hoteteu

• Date morfologice şi electroforetice ale culturilor de fibroblaste pulmonare obţinute de la şobolani Wistar normali sau „Asmatici” sensibilizaţi cu Ovalbuminã şi trataţi prin speleoterapie în minele de sare de la Cacica şi Dej din România - Constantin Munteanu, Diana Munteanu, Iuri Simionca, Mihai Hoteteu

• Evaluarea terapeutica a microclimatului din salina Turda pe culturi de fibroblaste pulmonare - Constantin Munteanu, Diana Munteanu, Iuri Simionca, Mihai Hoteteu, Ovidiu Mera

• Evaluarea experimentala in vitro a capacitatii de vindecare a ranilor si arsurilor prin expunere la microclimatul salin din Dej şi Cacica - Constantin Munteanu, Diana Munteanu, Iuri Simionca, Mihai Hoteteu

JOURNAL CLUB Intentii, planuri, ganduri – Constantin Munteanu

3


Editorial Constantin Munteanu

Concepţiile şi orientãrile noi din medicina modernã, ce abordeazã sãnãtatea ca un drept fundamental al omului, introducerea între criteriile de evaluare a sãnãtãţii a noţiunilor de calitate a vieţii, stil de viaţã, bunãstare a determinat o reevaluare a asistenţei medicale din staţiunile balneo-climatice, a balneologiei în general, ca şi a turismului tradiţional. Interesul şi preocuparea pentru a limita efectele negative pe care ritmul cotidian le genereazã asupra sãnãtãţii umane existã în orice stat din lume. O cale eficientã de a lupta împotriva bolilor civilizaţiei moderne este oferitã de turismul balnear.

Trendul internaţional este acela al întoarcerii la naturã pentru tratament şi recreere, iar din acest punct de vedere staţiunile balneare sunt, în mod evident, o destinaţie potrivitã.

Datoritã acestui fapt şi a efectelor benefice pe plan economic şi social, ţãrile ce deţin factori naturali de curã şi au tradiţie în exploatarea acestora, printre care se aflã şi România, stabilesc pentru turismul balnear strategii de diversificare şi relansare, de dezvoltare şi modernizare.

Atenţia acordatã acestei forme de turism la nivel mondial este relevatã de declararea anului 2000 ca „An mondial al Balneologiei” şi de manifestãrile ştiinţifice organizate, dintre care amintim: Congresul Mondial de Balneologie de la Roma, din anul 2000, cu tema „Balneologia în mileniul trei”, unde specialişti din diferite ţãri au prezentat puncte de vedere şi soluţii valoroase pentru viitorul balneologiei europene; Congresul Societãţii Internaţionale de Tehnicã Balnearã de la Levico Terme din Italia, din anul 2002, cu tema „Turismul de sãnãtate şi tratament medical în staţiunile balneo-climatice”.

Noile criterii de evaluare aratã saltul uriaş înregistrat în terapia cu factori naturali de curã, de la perioadele de crizã când i se reproşa lipsa unei fundamentãri ştiinţifice solide, metodologia utilizatã fiind bazatã în cea mai mare parte pe empirism, la multiplele studii şi cercetãri ştiinţifice care au dovedit eficienţa

curelor terapeutice şi de recuperare în diferite grupe de afecţiuni, pe baza unei metodologii complexe.

Evaluarea modernã a sãnãtãţii, a bunãstãrii, a calitãţii vieţii, impune continuarea şi dezvoltarea activitãţii de cercetare ştiinţificã, pentru stabilirea mecanismelor de acţiune şi a efectelor curative ale factorilor terapeutici naturali.

Sunt considerate prioritare cercetãrile asupra metodologiei şi efectelor „curelor de sãnãtate”, care reprezintã cel mai important domeniu al profilaxiei primare a bolilor majore din patologia legatã de modul de viaţã în civilizaţia noului mileniu.

Contribuţia specialiştilor din România la fundamentarea ştiinţificã a terapiei cu factori naturali de curã este remarcabilã. Încã din 1949, când a fost înfiinţat Institutul de Balneologie şi Fizioterapie din Bucureşti, balneoclimatologia a fãcut eforturi deosebite pentru studiul complex al factorilor terapeutici naturali, atât fizico-chimic, microbiologic şi farmacologic experimental, cât şi clinico-terapeutic. Cadre medicale şi tehnice au efectuat cercetãri sistematice în clinici, laboratoare şi staţiuni balneare. Au fost organizate studii şi cercetãri complexe, au fost descoperite, studiate şi exploatate noi surse valoroase de factori naturali de curã.

Rezultatele acestor studii au fost publicate într-o colecţie de 11 volume de „Studii şi cercetãri de balneologie şi fizioterapie”, într-o monografie în 3 volume „Apele minerale şi nãmolurile din România” în perioada 1960-1972, precum şi în numeroase „Îndreptare metodologice” şi „Indicaţii pentru tratamente în staţiunile balneo-climatice”, apãrute în 1960, 1965, 1975, 1986.

Relansarea turismului balnear din ţara noastrã şi alinierea staţiunilor noastre balneare la standardul existent în celelalte ţãri din Uniunea Europeanã, depind însã de un complex de factori printre care cercetarea ştiinţifica reprezinta un reper important.

4


Agenda celei de a VIII-a Conferinţe Naţionale de Balneologie

http://cell-culture.xhost.ro/CONFERINTA.htm

5


Metodologia experimentalã utilizatã de Laboratorul de Culturi Celulare din cadrul INRMFB în scopul evaluãrii

efectului terapeutic al factorilor naturali

Constantin Munteanu 1, Diana Munteanu

Rezumat Design-ul experimental al studiului pe culturi celulare permite evaluarea

biologică directă, la nivel celular, a efectului terapeutic pe care un factor natural ĩl poate avea supra organismului.

Tehnica de obţinere a culturilor celulare presupune o activitate complexă şi laborioasă care pleacă de la prelevarea ţesutului viu, continuă cu izolarea celulelor şi pregătirea lor pentru ĩnsămânţare pe o placă de cultură.

Această pregătire presupune intervenţia mecanică şi enzimatică a cercetătorului asupra materialului biologic.

Culturile de celule obţinute sunt monitorizate morfologic cu ajutorul unui microscop biologic inversat, de înaltã performanţã, cu camerã video pentru preluarea imaginilor.

Celulele sunt la final raclate şi, prin tehnici biochimice şi moleculare este verificată experimental ipoteza eficienţei terapeutice a factorului natural cercetat.

Culturile pot fi crioconservate ĩn containere speciale cu azot lichid.

1 Corresponding author: Constantin Munteanu, tel./fax: +40213186458, e-mail: [email protected], Mailing address: B-dul Ion Mihalache, nr.11A, District 1, cod 79173, Bucharest, Romania, http://www.cell-culture.xhost.ro/

6


Laboratorul de Culturi Celulare Certificarea periodicã a calitãţii terapeutice

a factorilor naturali utilizaţi în staţiunile balneare reprezintã un atribut al Institutului Naţional de Recuperare, Medicinã Fizicã şi Balneoclimatologie. Argumentele ştiinţifice aduse de cercetãrile efectuate în institut, prin sectorul de cercetare aplicativã şi fundamentalã, stau la baza evaluãrii unei staţiuni balneare, dar pot reprezenta şi motivele promovãrii staţiunii respective.

Laboratorul de Culturi Celulare din Sectorul de Cercetare al INRMFB contribuie la identificarea mecanismului terapeutic celular al unui factor natural.

Factorii naturali terapeutici Factorii naturali de curã: apele minerale şi

termominerale, lacurile sãrate, nãmolurile şi gazele mofetariene, salinele, climatul, plantele medicinale, etc. reprezintã condiţia fundamentalã, punctul de pornire al conceperii şi concretizãrii oricărei oferte balneare.

Resursele balneare sunt reprezentate în primul rând de substanţe minerale terapeutice, cu proprietãţi fizico-chimice ce rãspund necesitãţilor profilactice şi medicale de menţinere, consolidare, refacere a stãrii de sãnãtate, a capacitãţii de muncã şi reconfortare fizicã şi psihicã a individului.

Metodologia experimentala Prin studii in vitro se pot urmãri:

morfologia celularã, sinteza proteicã, secreţia anumitor substanţe, metabolismul celular, interacţia celulelor prin receptori celulari cu diferiţi liganzi, captarea sau eliberarea electroliţilor ori a altor tipuri de substanţe care ajung în mediul celular.

În sistemul culturilor celulare definim urmãtoarele categorii: cultura tisularã, cultura de organ, culturi de celule aderente şi în suspensie, culturi organotipice sau histiotipice, culturi de masã şi clonale, culturi primare, culturi celulare finite, linii celulare continue.

Pentru urmărirea şi caracterizarea răspunsului celulelor cultivate in vitro şi supuse acţiunii directe a factorilor naturali terapeutici, se vor utiliza culturi de celule obtinute prin procedee specifice în cadrul Laboratorului de Culturi Celulare.

Fibroblastele obţinute în laboratorul nostru prin tripsinizarea unor fragmente embrionare umane, obţinute de la Maternitatea Filantropia, în urma unor avorturi, au fost menţinute în medii de cultivare prin care li s-a indus condiţia patologicã prin „ înfometare” – sub 5% SER FETAL BOVIN.

Protocoalele esenţiale pentru culturile de celule sunt reprezentate de : obţinerea de culturi primare, subcultivarea celulelor, tripsinizarea, pasarea culturilor celulare, numãrarea celulelor folosind hemocitometrul, evaluarea viabilitãţii celulare: metoda de excludere a albastrului tripan, colorarea cu roşu neutru; teste de citotoxicitate: studiul lactatdehidrogenazei, testul MTT, determinarea curbei de creştere a celulelor, evidenţierea histochimicã a celulelor senescente pe baza activitãţii βgalactozidazei, determinarea eficienţei de clonare, decongelarea şi crioconservarea celulelor.

Evaluarea modificărilor la nivel celular şi molecular se poate realiza prin studii de microscopie optică, în care este urmãritã morfologia celulara, studii de viabilitate celulara, studii imunocitochimie, studii proteomice realizate prin tehnici specifice, incluzând electroforeza şi Western Blottingul, determinarea parametrilor biochimici de baza la nivelul mediului de culturã, studii asupra fiziologiei celulare, studii privind senescenţa celularã, studii privind semnalizarea celularã.

Studii de microscopie optică. După fiecare variantă experimentală celulele sunt fixate cu 10% paraformaldehidă şi colorate cu hematoxilină-eozină (pentru histologie generală). Studiile de microscopie opticã permit evaluarea morfologiei celulare de-a lungul întregii perioade experimentale.

Studii de imunocitochimie. Aceste studii vor urmări evaluarea modificărilor unor markeri celulari, a proteinelor de stress (Hsp 70, Hsp 90), a proteinelor pro- şi antiapoptotice (p53, Bax, Bcl-2, caspaza 3 şi citocrom c) precum şi a principalilor constituenţi matriceali (fibronectină, laminină, colagen). Detectarea imunocitochimică este realizată printr-o metodă indirectă în care anticorpul secundar este cuplat cu peroxidaza.

7


8


Design-ul experimental pentru testarea efectelor biologice celulare a factorilor naturali terapeutici

9


Date morfologice şi electroforetice privind culturile primare heterogene dermale obţinute de la şobolani Wistar normali sau sensibilizaţi cu Ovalbuminã şi trataţi prin speleoterapie în minele de sare de la Cacica şi Dej din România

Constantin Munteanu, PhD, a1 Diana Munteanu, MBiol a, Iuri Simionca, PhD a,

Mihai Hoteteu, a

(a) Institutul Naţional de Recuperare, Medicinã Fizicã şi Balneoclimatologie, Bucureşti, România

Rezumat Obiective: Investigarea influenţei mediului salin din minele de sare Cacica şi Dej

asupra mofologiei şi expresiei electroforetice a culturilor heterogene de celule dermale obţinute de la şobolani Wistar din ţesut prelevat de pe abdomen, în condiţii normale şi de sensibilizare a animalelor cu Ovalbuminã.

Mateiale şi metode: Culturile heterogene de celule dermale au fost obţinute din ţesut hipodermic prelevat de pe abdomenul şobolanilor Wistar. Culturile rezultate experimental se dezvoltã sub forma unui monostrat de fibroblaste şi celule epiteliale aderate la suprafaţa disponibilã a vasului de culturã. Anterior iniţierii culturilor, şobolani din rasa experimentalã Wistar cu greutate de 75-100 g au fost separaţi în douã loturi: martor şi animale sensibilizate cu Ovalbuminã. Zece animale din fiecare lot au fost trimise în minele de sare de la Cacica şi Dej pentru o curã speleoterapeuticã de 14 zile şi menţinute într-un program standard pentru tratament în microclimatul salinelor menţionate.

Rezultate: Tratamentul speleoterapeutic aplicat şobolanilor Wistar a determinat diferenţe semnificative în morfologia şi expresia electroforeticã a culturilor primare de celule dermale. Datele experimentale aratã cã în comparaţie cu cazul animalelor sensibilizate cu Ovalbuminã, cele tratate prin speleoterapie argumenteazã ipoteza caracterului terapeutic al mediului salin din minele de sare analizate.

Concluzii: Rezultatele acestui studiu indicã faptul cã speleoterapia determinã schimbãri ale morfologiei şi expresiei proteice a celulelor dermale in vitro, iar aceste schimbãri argumenteazã efectele benefice ale speleoterapiei.

Cuvinte cheie: speleoterapie, culturi de celule dermale, mine de sare

1 Corresponding author: Constantin Munteanu, tel./fax: +40213186458, e-mail: [email protected], mailing address: B-dul Ion Mihalache, nr.11A, District 1, cod 79173, Bucharest, Romania, http://www.cell-culture.xhost.ro/

10


INTRODUCERE Culturi primare de celule pot fi cu

uşurinţã obţinute din piele prelevatã de la om sau animale, utilizând metoda explantului sau metoda tripsinizãrii.

Toatã grosimea pielii, de asemenea, numitã tegument, este un compozit de trei ţesuturi (epiderm, derm şi ţesut subcutanat), dintre care niciunul nu constituie o entitate omogenă.

Epiderma, în mod normal, este compusã din keratinocite, cea mai mare populaţie de celule, şi melanocite, celule Langerhans, şi ocazional, celule ale sistemului limfo-reticular.

Deşi cea mai mare parte a dermului este noncellular (colagen şi substanţa de bază), în cadrul acestui compartiment existã, de asemenea, o varietate de tipuri de celule, inclusiv fibroblaşti, histicite, mastocite, macrofage, limfocite şi celule Schwann, celule endoteliale ale vaselor de sange si cele limfatice, celule musculare striate ale muşchilor erectori piliari şi musculare netede ale vaselor de sange.

Ţesutul subcutanat include ca tipuri celulare fibroblastele dermice şi celule cu rezerve lipidice (Flaxman, 1974).

Studiul actual a fost conceput pentru a investiga influenţa mediului minelor de sare de la Cacica şi Dej asupra morfologiei celulare şi asupra exprimãrii electroforetice a celulelor dermale in vitro obţinute din tegument prelevat de la şobolani Wistar, în condiţii normale şi de sensibilizare cu Ovalbuminã.

Utilizarea culturilor celulare dermale pentru a verifica proprietăţile terapeutice ale mediului salin, descris ca speleoterapie, reprezintă un nou mod ştiinţific şi inovator pentru a stabili metodologia medicalã de prevenire, tratare şi recuperare a pacienţilor cu diverse probleme dermatologice.

MATERIALE ŞI METODE Materiale Tampon fosfat salin (TFS: NaCl

0,13M + KCl 2,6mM + Na2HPO4 x12 H2O 8mM + KH2PO4 1,4mM); mediu HAM-F12 (Sigma); penicilină 100 U/ml, streptomicină 100µg/ml (Antibiotice S. C. Iaşi); neomicină 50µg/ml (Sigma); ser fetal de viţel (Sigma).

Model animal –şobolani Wistar cu sensibilizare indusã prin Ovalbuminã: Şobolani Wistar de 75-100 g greutate au fost sensibilizaţi prin injecţii intravenoase cu o soluţie de ovalbuminã.

Cultura de fibroblaste dermale După anestezia realizatã cu cloroform

şi eliminarea pãrului cu ajutorul unei lame de ras sterile, a fost preluatã o suprafaţã de 1 cm2 de piele, care a fost plasatã în soluţie tampon fosfat salin (TFS) pe gheaţă. Prin tripsinizãri succesive cu tripsinã 0,125% şi centrifugare, peletul celular este preluat într-o cantitate corespunzãtoare de mediu. Celulele au fost crescute în mediu HAM-F12 cu 4500mg/l glucoză, 25 mM HEPES, 100 U/ml penicilină, 100 µg/ml streptomicină şi 50 µg/ml neomicină. Mediul a fost suplimentat cu 10% ser fetal de viţel.

După 24 ore s-a schimbat mediul de cultură, pentru a îndepărta celulele moarte şi resturile celulare. Ulterior schimbarea mediului s-a efectuat la fiecare 3 zile. Celulele au fost cultivate pe plăci Petri de sticlă, cu diametrul de 50 mm (Schott).

Microscopia în contrast de fază Microscopia în contrast de fază,

descrisã pentru prima data in 1934 de catre fizicianul olandez Frits Zernike, este o tehnica opticã de contrast ce poate fi utilizatã pentru a produce imagini cu contrast ridicat a probelor transparente, cum sunt celulele vii

11

Balneo-Research Journal Vol.1, Nr.1, 2010 Electroforeza SDS-PAGE Electroforeza proteinelor din lizatul

celular omogen total are ca scop stabilirea schimbărilor aparute la nivelul expresiei proteice a culturilor dermale obţinute de la şobolanii supuşi tratamentului speleoterapeutic.

Electroforeza proteinelor în gel de poliacrilamidă a fost făcut în condiţii denaturante în conformitate cu tehnicile descrise de Laemmli (1979).

Culturile au fost spălate cu TFS, raclate de la placa de cultură şi lizate în tampon care conţine 0,5 M Tris-HCl, pH 6,8 + 0,05% BPB + glicerol 10% + 10% SDS.

Analiza densitometricã pentru evaluarea cantitãţii relative de proteinã s-a efectuat cu ajutorul sistemului SCIE-PLAS VISION, utilizãnd soft-ul de analizã a gelurilor GeneTools de la SYNGENE, versiunea 4.00.

REZULTATE Cultura martor de celulele dermale

de 7 zile are un aspect heterogen cu un nivel ridicat de pre-confluenţã. Diviziunea celularã este la un nivel ridicat iar morfologia celularã arată un aspect microscopic tipic, aşa cum este descris în literatura de specialitate. Există în principal două tipuri de celule: celule epiteliale şi fibroblaste.

Celulele dermale din culturi de 7 zile obţinute de la şobolani sensibilizaţi cu Ovalbumina prezintă mai multe schimbări morfologice faţã de cultura martor de celule dermale, fiind observat un număr sensibil redus al fibroblastelor dermice în cultură în comparaţie cu densitate de celule epiteliale, precum şi o morfopatologie accentuatã a celulelor din cultură. După 7 zile de cultură, nivelul de pre-confluenţã este mult mai redus decât în cazul martor.

Cultura de celule dermale de 7 zile obţinutã de la animale sensibilizate timp de 14 zile cu ovalbuminã şi ulterior expuşi timp de 14 zile mediului din salina Cacica are o compoziţie celularã diferitã uşor de a culturii martor fiind formatã din mai puţine fibroblaste dermale şi mai multe celule epiteliale de tipul keratinocitelor. Raportul dintre cele douã tipuri de celule este însã unul intermediar între cultura martor şi lotul de animale sensibilizate. Dupã 7 zile de cultivare atinge un nivel de preconfluenţã mai redus decât în cazul martor. Diviziunea celularã are o frecvenţã ridicatã. Vacuolizarea celulelor epiteliale este mai accentuatã în acest caz decât în cazul martor, în timp ce fibroblastele capãtã numeroase caracterisitici morfopatologice.

Cultura de celule dermale de 7 zile obţinutã de la animale sensibilizate timp de 14 zile cu ovalbuminã şi ulterior supuse timp de 14 zile mediului din salina Dej are o compoziţie celularã diferitã uşor de a culturii martor fiind formatã din mai puţine fibroblaste dermale şi mai multe celule epiteliale de tipul keratinocitelor. Raportul dintre cele douã tipuri de celule este însã unul intermediar între cultura martor şi lotul de animale sensibilizate, foarte asemãnãtor cazului Cacica. Dupã 7 zile de cultivare atinge un nivel de preconfluenţã mai redus decât în cazul martor. Diviziunea celularã are o frecvenţã ridicatã. Vacuolizarea celulelor epiteliale este mai accentuatã în acest caz decât în cazul martor, în timp ce fibroblastele capãtã numeroase caracterisitici morfopatologice.

Dupã 8 zile de cultivare, celulele dermale au fost omogenizate în tampon Laemmli pH 6,8, iar omogenatul obţinut a fost supus electroforezei denaturante în gel de poliacrilamidă 10% (SDS-PAGE).

12

Balneo-Research Journal Vol.1, Nr.1, 2010 DISCUŢII Prezentul studiu a evaluat

fenotipurile morfologice legate de procesele de reparare şi remodelare a culturilor de fibroblaste şi celule epiteliale obţinute de la şobolani Wistar martor şi ovalbumin-sensibilizaţi.

Studiul actual s-a axat pe fibroblaste, fiind considerate a fi celule ce joacă un rol important în menţinerea şi remodelarea ţesutului conjunctiv interstiţial. În acest context, fibroblastele joaca un rol cheie în menţinerea şi modificarea structurii ţesutului. Capacitatea fibroblastelor de a migra şi de a prolifera ca răspuns la stimuli chemotactici sau ca răspuns la factori de creştere specifici este explicatã prin necesitatea de a controla acumularea lor la locurile unde are loc repararea ţesuturilor.

Capacitatea fibroblastelor de a produce şi de a remodela matricea extracelularã este consideratã a contribui la modificările structurale ale ţesuturilor. Remodelarea ţesuturilor implică probabil activitatea contractilă a fibroblastelor.

CONCLUZII • Analiza morfologicã a culturilor

realizatã microscopic, în contrast de fazã, relevã regenerarea celularã dupã expunerea animalelor la mediul din salinele Dej şi Cacica, faţã de culturile obţinute de la animale sensibilizate cu ovalbiminã.

• Observaţiile de morfologie celularã sunt confirmate de analiza electroforeticã, care demonstreazã prin modificarea profilului mai multor proteine şi prin determinarea cantitãţii totale de proteine cã expunerea la mediul din salinele Cacica şi Dej favorizeazã obţinerea celulelor dermale in vitro;

• Sensibilizarea cu ovalbiminã a animalelor de laborator scade considerabil numãrul celulelor dermale din culturile obţinute şi induce un nivel morfopatologic semnificativ. Mulţumiri Acest studiu va fi terminat în 2011 şi

este finanţat de către Autoritatea Naţională pentru Cercetare Ştiinţificã - CNMP, contract nr. 42120/2008, proiect: Studiu complex medico-biologic in vederea utilizarii inovative a factorilor potential terapeutici de mediu din saline si pestera in sanatate si turism balneoclimatic; soluţii de modelare a acestora, coordonat de Dr. Iuri Simionca.

Bibliografie 1. Flaxman A. – cell identification in primary cell cultures from skin, In vitro, vol.10, no 1&2, 1974 2. Foster Judith Ann, Celeste B.R., Miller M.F. – Pulmonary Fibroblasts: an in Vitro Model for Emphysema, The Journal of Biological Chemistry, Vol. 265, No. 26, 1990, p. 15544-15549; 3. Laemmli U.K. (1979) Cleavage and structural proteins duting the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227: 680-682. 4. Towbin H., Staehelin T., Gordon J. (1979) Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: Procedure and some applications. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 4350-4354.

13

5. Sugiura H., Liu X., Duan F., Kawasaki S., Togo S., Kamio K., Wang X.Q., Mao l., Ahn Y., Ertl R.F., Bargar T.W., Berro A., Casale T.B. – Cultured Lung Fibroblasts from Ovalbumin-Challenged “Asthmatic” Mice Differ Functionally from Normal, Am. J. Respir Cell Mol Biol, Vol 37, pp 424-430, 2007


14


15


16


17


18

Date morfologice şi electroforetice ale culturilor de fibroblaste pulmonare obţinute de la şobolani Wistar normali sau „Asmatici” sensibilizaţi cu Ovalbuminã şi trataţi prin speleoterapie în minele de sare de la Cacica şi Dej din România

Constantin Munteanu, PhD, a1 Diana Munteanu, MBiol a, Iuri Simionca, PhD a, Mihai

Hoteteu, a

(a) Institutul Naţional de Recuperare, Medicinã Fizicã şi Balneoclimatologie, Bucureşti, Romania

Rezumat

Obiective: Investigarea influenţei mediului salin din minele de sare Cacica şi Dej asupra mofologiei şi expresiei electroforetice a culturilor de fibroblaste pulmonare obţinute de la şobolani Wistar din ţesut pulmonar prelevat în condiţii normale şi de sensibilizare a animalelor cu Ovalbuminã.

Mateiale şi metode: Culturile de fibroblaste pulmonare au fost obţinute din plãmâni prelevaţi de la şobolani Wistar. Culturile rezultate experimental se dezvoltã sub forma unui monostrat de fibroblaste aderate la suprafaţa disponibilã a vasului de culturã. Anterior iniţierii culturilor, şobolani din rasa experimentalã Wistar cu greutate de 75-100 g au fost separaţi în douã loturi: martor şi animale sensibilizate cu Ovalbuminã. Zece animale din fiecare lot au fost trimise în minele de sare de la Cacica şi Dej pentru o curã speleoterapeuticã de 14 zile şi menţinute într-un program standard pentru tratament în microclimatul salinelor menţionate.

Rezultate: Tratamentul speleoterapeutic aplicat şobolanilor Wistar a determinat diferenţe semnificative în morfologia şi expresia electroforeticã a culturilor primare de fibroblaste pulmonare. Datele experimentale aratã cã în comparaţie cu cazul animalelor sensibilizate cu Ovalbuminã, cele tratate prin speleoterapie argumenteazã ipoteza caracterului terapeutic al mediului salin din minele de sare analizate.

Concluzii: Rezultatele acestui studiu indicã faptul cã speleoterapia determinã schimbãri ale morfologiei şi expresiei proteice a fibroblastelor pulmonare in vitro, iar aceste schimbãri argumenteazã efectele benefice ale speleoterapiei.

Cuvinte cheie: speleoterapie, culturi de fibroblaste pulmonare, mine de sare



INTRODUCERE Astmul este o boală caracterizată prin

inflamaţia cronică a căilor respiratorii ce devin astfel hiper-responsive şi prin schimbări în arhitectura acestora, proces denumit remodelare.

Celulele responsabile pentru menţinerea structurii pulmonare sunt celulele parenchimatoase ale plămânului: celule epiteliale, celule mezenchimale, şi celule endoteliale.

Studii recente au sugerat că funcţia celulelor epiteliale, a celulelor musculare netede şi a fibroblaştilor din culturi obţinute din plamanii persoanelor cu astm diferă de funcţia celulelor cultivate în mod similar de la persoane sãnãtoase, fără astm. Aceste diferenţe funcţionale, legate de reparare şi remodelare, ar putea contribui la modificarea structurală a căilor respiratorii (Sugiura et al., 2007).

Studiul actual a fost conceput pentru a investiga influenţa microclimatului Salinelor Cacica şi Dej asupra morfologiei celulare şi exprimarea electroforeticã a fibroblastelor pulmonare in vitro obţinute de la şobolani Wistar, în condiţii normale şi de sensibilizare cu Ovalbumina - "astmatici ".

Fibroblastele au fost cultivate din parenchimul pulmonar prelevat de la animale martor, sensibilizate cu ovalbumină netratate şi şobolani trataţi în saline după sensibilizare cu ovalbuminã.

Utilizarea culturilor de fibroblaste pulmonare pentru a verifica proprietăţile terapeutice ale microclimatului salin în cure de speleoterapie, reprezintă o abordare ştiinţificã pentru stabili metodologia medicalã de prevenire, tratare şi recuperare a pacienţilor cu diverse probleme pulmonare.



Model animal –şobolan Wistar cu astm indus alergenic Şobolani Wistar de 75-100 g greutate au fost sensibilizaţi prin injecţii intramusculare cu Ovalbumina. Cultura de fibroblaste pulmonare

După anestezia realizatã cu cloroform şi disecţia sternalã a animalelor, a fost preluat ţesut pulmonar care a fost plasat în soluţie tampon fosfat salin (TFS) pe gheaţă. Prin tripsinizãri succesive cu tripsinã 0,125% şi centrifugare, peletul celular este preluat într-o cantitate corespunzãtoare de mediu. Celulele au fost crescute în mediu HAM-F12 cu 4500mg/l glucoză, 25 mM HEPES, 100 U/ml penicilină, 100 µg/ml streptomicină şi 50 µg/ml neomicină. Mediul a fost suplimentat cu 10% ser fetal de viţel.

După 24 ore s-a schimbat mediul de cultură, pentru a îndepărta celulele moarte şi resturile celulare. Ulterior schimbarea mediului s-a efectuat zilnic. Celulele au fost cultivate pe plăci Petri de sticlă, cu diametrul de 50 mm (Schott).


descrisã pentru prima data in 1934 de catre fizicianul olandez Frits Zernike, este o tehnica opticã de contrast ce poate fi utilizatã pentru a produce imagini cu contrast ridicat a probelor transparente, cum sunt celulele vii.

Balneo-Research Journal Vol.1, Nr.1, 2010 Electroforeza SDS-PAGE Electroforeza proteinelor din lizatul

celular omogen total are ca scop stabilirea schimbărilor aparute la nivelul expresiei proteice a culturilor de fibroblaste obţinute de la şobolanii supuşi tratamentului speleoterapeutic în minele de sare Cacica şi Dej.

Electroforeza proteinelor în gel de poliacrilamidă a fost făcut în condiţii denaturante în conformitate cu tehnicile descrise de Laemmli (1979). Culturile au fost spălate cu TFS, raclate de la placa de cultură şi lizate în tampon care conţine 0,5 M Tris-HCl, pH 6,8 + 0,05% BPB + glicerol 10% + 10% SDS.

REZULTATE Cultura de fibroblaste pulmonare

martor de 9 zile are o compoziţie celularã mult mai omogenã faţã de cultura de celule dermale, fiind formatã numai din fibroblaste.

Dupã 9 zile de cultivare se ajunge la un nivel avansat de preconfluenţã celularã. Diviziunea celularã are o frecvenţã ridicatã. Morfologia celularã a celulelor martor corespunde datelor din literatura de specialitate.

Cultura de fibroblaste pulmonare de 9 zile obţinutã de la animale sensibilizate timp de 14 zile cu ovalbuminã suferã modificãri substanţiale faţã de cultura martor fiind observatã o reducere a numãrului de celule, diminuarea frecvenţei diviziunilor celulare şi accentuarea caracterelor morfopatologice ale fibroblastelor pulmonare din culturã.

Dupã 9 zile de cultivare se atinge un nivel de preconfluenţã mult mai redus decât în cazul martor.

Cultura de fibroblaste pulmonare de 9 zile obţinutã de la animale sensibilizate timp de 14 zile cu ovalbuminã şi ulterior expuse timp de 14 zile mediului din salina Cacica

prezintã o îmbunãtãţire a parametrilor morfologici ai celulelor faţã de cazul animalelor sensibilizate cu ovalbuminã. De asemenea se observã microscopic, în contrast de fazã, o creştere a numãrului de celule, dar fãrã a fi atinsã densitatea celularã din cazul martor.

Cultura de fibroblaste pulmonare de 9 zile obţinutã de la animale sensibilizate timp de 14 zile cu ovalbuminã şi ulterior expuse timp de 14 zile mediului din salina Dej este foarte asemãnãtoare cu cea obţinutã de la animalele expuse mediului din salina Cacica.

Şi de aceastã datã se observã creşterea densitãţii populaţiei de fibroblaste pulmonare şi îmbunãtãţirea parametrilor morfologici a celulelor din culturã.

Fibroblastele pulmonare au fost omogenizate în tampon Laemmli pH 6,8, iar omogenatul obţinut a fost supus electroforezei denaturante în gel de poliacrilamidă 10 % (SDS-PAGE).

Gelurile au fost ulterior colorate cu Coomassie Brilliant Blue şi apoi supuse analizei densitometrice.

Markerii de greutate moleculară au fost produşi de Sigma, având următoarele greutăţi moleculare: 205; 116; 97; 66; 55; 45; 36; 29; 24; 20,1; 14,2 şi 6,5 KDa.

Determinarea cantitativă a fost calibrată, cunoscând faptul că markerii sunt prezenţi la o concentraţie de 10 µg/µl.

DISCUŢII Prezentul studiu a evaluat

fenotipurile morfologice legate de procesele de reparare şi remodelare a culturilor de fibroblaste pulmonare obţinute de la şobolani Wistar martor şi ovalbumin-sensibilizaţi.


21

Studiul actual s-a axat pe fibroblaste, fiind considerate a fi celule ce joacă un rol important în menţinerea şi remodelarea ţesutului conjunctiv interstiţial.

În acest context, fibroblastele joaca un rol cheie în menţinerea şi modificarea structurii ţesutului. Capacitatea fibroblastelor de a migra şi de a prolifera ca răspuns la stimuli chemotactici sau ca răspuns la factori de creştere specifici este explicatã prin necesitatea de a controla acumularea lor la locurile unde are loc repararea ţesuturilor.

Capacitatea fibroblastelor de a produce şi de a remodela matricea extracelularã este consideratã a contribui la modificările structurale ale ţesuturilor. Remodelarea ţesuturilor implică probabil activitatea contractilă a fibroblastelor.

CONCLUZII • Analiza morfologicã a culturilor

realizatã microscopic, în contrast de fazã, relevã regenerarea celularã dupã expunerea animalelor la mediul din salinele Dej şi Cacica, faţã de culturile obţinute de la animale sensibilizate cu ovalbiminã.

• Observaţiile de morfologie celularã sunt confirmate de analiza electroforeticã, care demonstreazã, prin modificarea profilului mai multor proteine şi prin determinarea cantitãţii totale de proteine, cã expunerea la mediul din salinele Cacica şi Dej favorizeazã obţinerea fibroblastelor pulmonare in vitro;

• Sensibilizarea cu ovalbiminã a animalelor de laborator scade considerabil numãrul fibroblastelor pulmonare din culturile obţinute şi induce un nivel morfopatologic semnificativ.

Mulţumiri Acest studiu va fi terminat în 2011

şi este finanţat de către Autoritatea Naţională pentru Cercetare Ştiinţificã - CNMP, contract nr. 42120/2008, proiect: Studiu complex medico-biologic in vederea utilizarii inovative a factorilor potential terapeutici de mediu din saline si pestera in sanatate si turism balneoclimatic; soluţii de modelare a acestora, coordonat de Dr. Iuri Simionca.

Bibliografie 1. Foster Judith Ann, Celeste B.R.,

Miller M.F. – Pulmonary Fibroblasts: an in Vitro Model for Emphysema, The Journal of Biological Chemistry, Vol. 265, No. 26, 1990, p. 15544-15549;

2. Laemmli U.K. (1979) Cleavage and structural proteins duting the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227: 680-682.

3. Nunez J.S., Torday J.S. – The Developing Rat Lung Fibroblast and Alveolar Type II Cell Activity Recruit Surfactant Phospholipid Substrate, American Institute of Nutrition, 1995, 1639S-1643S.

4. Towbin H., Staehelin T., Gordon J. (1979) Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: Procedure and some applications. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 4350-4354.



22


23


24


25


Evaluarea terapeutica a microclimatului din Salina Turda pe culturi de fibroblaste pulmonare

- Constantin Munteanu 1, Diana Munteanu, Iuri Simionca, Mihai Hoteteu,

Ovidiu Mera

Rezumat Obiectiv: Investigarea influenţei microclimatului Salinei Turda asupra

morfologiei şi exprimãrii electroforetice a fibroblastelor pulmonare in vitro obţinute din ţesutul pulmonar al şobolanilor Wistar, în condiţii normale şi de sensibilizare cu Ovalbumina - "astmatici experimentali ".

Materiale şi metode: culturile de fibroblaste pulmonare au fost obţinute din plămâni prelevaţi de la şobolani Wistar. Culturile obţinute din ţesut pulmonar de şobolan se dezvolta în monostrat de fibroblaste ataşate la vasul de cultivare. Înainte de iniţierea culturilor, şobolanii Wistar cu greutate de 75-100 g au fost separaţi în două loturi: control şi sensibilizaţi cu ovalbumină. Cinci animale din fiecare lot au fost trimise la Salina Turda timp de 14 zile şi menţinute în mediul din mina de sare, ca şi în cura speleoterapeuticã.

Rezultate: Speleoterapia aplicatã şobolanilor Wistar a determinat diferenţe semnificative în morfologia celularã şi în exprimarea electroforeticã a fibroblastelor pulmonare din culturile primare realizate. Datele obţinute confirmã efectele terapeutice ale speleoterapiei prin comparaţie cu datele experimentale de la animalele sensibilizate cu ovalbumina – cu astm bronşic indus.

Concluzii: Rezultatele acestui studiu indicã faptul ca speleoterapiea induce schimbări în morfologia şi expresia proteicã a fibroblastelor pulmonare in vitro, iar aceste schimbări susţin proprietãţile terapeutice ale mediului Salinei Turda.

Cuvinte cheie: speleoterapie, fibroblaşti, salina.

1 Corresponding author: Constantin Munteanu, tel./fax: +40213186458, e-mail: [email protected], mailing address: B-dul Ion Mihalache, nr.11A, District 1, cod 79173, Bucharest, Romania, http://www.cell-culture.xhost.ro/

26


INTRODUCERE Astmul este o boală caracterizată prin

inflamaţia cronică a căilor respiratorii ce devin astfel hiper-responsive şi prin schimbări în arhitectura acestora, proces denumit remodelare. Celulele responsabile pentru menţinerea structurii pulmonare sunt celulele parenchimatoase ale plămânului, inclusiv celule epiteliale, celule mezenchimale, şi celule endoteliale. Studii recente au sugerat că funcţia celulelor epiteliale, a celulelor musculare netede şi a fibroblaştilor din culturi obţinute din plamanii persoanelor cu astm diferă de funcţia celulelor cultivate în mod similar de la persoane sãnãtoase, fără astm. Aceste diferenţe funcţionale, legate de reparare şi remodelare, ar putea contribui la modificarea structurală a căilor respiratorii (Sugiura et al., 2007).

Studiul actual a fost conceput pentru a investiga influenţa microclimatului Salinei Turda asupra morfologiei

celulare şi exprimarea electroforeticã a fibroblastelor pulmonare in vitro obţinute de la şobolani Wistar, în condiţii normale şi de sensibilizare cu Ovalbumina - " astmatici ".

Fibroblastele au fost cultivate din parenchimul pulmonar prelevat de la animale martor, sensibilizate cu ovalbumină netratate şi şobolani trataţi în salina după sensibilizare cu ovalbuminã - aflaţi în curã de speleoterapie. Forma fibroblastelor în cultură poate varia în funcţie de substratul pe care sunt crescute şi de spaţiul pe care îl au pentru mişcare.

Utilizarea culturilor de fibroblaste pulmonare pentru a verifica proprietăţile terapeutice ale microclimatului Salinei Turda în cure de speleoterapie, reprezintă o modalitate ştiinţificã de a stabili metodologia medicalã de prevenire, tratare şi recuperare a pacienţilor cu diverse probleme pulmonare.

27




Model animal –şobolan Wistar cu astm indus alergenic Şobolani Wistar de 75-100 g greutate au fost sensibilizaţi prin injecţii intramusculare cu Ovalbumina. Cultura de fibroblaste pulmonare

După anestezia realizatã cu cloroform şi disecţia sternalã a animalelor, a fost preluat ţesut pulmonar care a fost plasat în soluţie tampon fosfat salin (TFS) pe gheaţă. Prin tripsinizãri succesive cu tripsinã 0,125% şi centrifugare, peletul celular este

preluat într-o cantitate corespunzãtoare de mediu. Celulele au fost crescute în mediu HAM-F12 cu 4500mg/l glucoză, 25 mM HEPES, 100 U/ml penicilină, 100 µg/ml streptomicină şi 50 µg/ml neomicină. Mediul a fost suplimentat cu 10% ser fetal de viţel.

După 24 ore s-a schimbat mediul de cultură, pentru a îndepărta celulele moarte şi resturile celulare. Ulterior schimbarea mediului s-a efectuat zilnic. Celulele au fost cultivate pe plăci Petri de sticlă, cu diametrul de 50 mm (Schott).


descrisã pentru prima data in 1934 de catre fizicianul olandez Frits Zernike, este o tehnica opticã de contrast ce poate fi utilizatã pentru a produce imagini cu contrast ridicat a probelor transparente, cum sunt celulele vii.

28


Electroforeza SDS-PAGE Electroforeza proteinelor din lizatul

celular omogen total are ca scop stabilirea schimbărilor aparute la nivelul expresiei proteice a culturilor de fibroblaste obţinute de la şobolanii supuşi tratamentului speleoterapeutic în mina de sare Turda.

Electroforeza proteinelor în gel de poliacrilamidă a fost făcut în condiţii denaturante în conformitate cu tehnicile descrise de Laemmli (1979). Culturile au fost spălate cu TFS, raclate de la placa de cultură şi lizate în tampon care conţine 0,5 M Tris-HCl, pH 6,8 + 0,05% BPB + glicerol 10% + 10% SDS.

REZULTATE Cultura martor de fibroblaste

pulmonare de 7 zile are un aspect omogen cu un nivel ridicat de pre-confluenta. Diviziunea celularã este la un nivel ridicat iar morfologia celularã în microscopie opticã este tipicã, descrisã în literatura de specialitate.

Fibroblaste pulmonare din culturi de 7 zile obţinute de la şobolani sensibilizaţi cu ovalbumina prezintă mai multe schimbări morfologice faţã de cultura martor de fibroblaste pulmonare,

fiind observatã reducerea numărului de fibroblaste pulmonare în cultură, diminuarea ratei de diviziune celularã, precum şi o morfopatologie celularã accentuatã a fibroblastelor în cultură. După 7 zile de cultivare, nivelul de pre-confluenta este mult mai mic decât în cazul martor.

Culturile de 7 zile de fibroblaste pulmonare obţinute de la şobolani sensibilizaţi cu Ovalbumina şi trataţi prin speleoterapie în Salina Turda prezinta o imbunãtãţire a parametrilor


morfologici ai celulelor, comparativ cu culturile obţinute de la şobolani „astmatici” sensibilizaţi cu ovalbuminã şi netrataţi.

Fibroblastele pulmonare au fost omogenizate cu tampon Laemmli pH 6,8, iar proteinele din omogenatele obţinute au fost separate prin electroforeză pe gel de poliacrilamidă cu 10% SDS care menţine polipeptidele într-o stare denaturatã dupã ce acestea au fost tratate cu agenţi puternici de reducere pentru a elimina structura secundarã şi terţiarã.

Probele de 10µl au fost încărcate în godeurile din gel. Unul dintre godeuri a fost rezervat pentru amestecul de markeri moleculari Sigma de 205, 116; 97; 66; 55; 45, 36, 29, 24; 20; 14,2 şi 6,5 kDa

Dupã electroforeza, gelul a fost colorat cu Coomassie Brilliant Blue R -250, ceea ce a permis vizualizarea proteinelor separate. După colorare, diferitele proteine au apărut ca benzi distincte în gel (Towbin et al., 1979).

30


Analiza cu versiunea de software 4 GeneTools de la SynGene din fiecare track de electroforeză, ne-a permis să comparãm profilurile de expresie totalã a proteinelor.

Datele obţinute confirmã observaţiile noastre de microscopie opticã, fiind depistatã o scãdere a nivelului total de proteine la 130µg în cazul indus de astm faţã de 160 µg la martor. Cura speleoterapeutica în Salina Turda a readus acest parametru la o valoare apropiatã de martor, respectiv de 155 µg proteine totale.

CONCLUZII Analizele microscopice ale

fibroblastelor din culturile primare relevã o regenerare celulară după expunerea animalelor la microclimatul din Salina Turda, comparativ cu

morfologia celulelor din culturile provenite de la şobolani sensibilizaţi cu ovalbuminã.

Observaţiile morfologice sunt confirmate de analiza electroforetică, care demonstrează prin creşterea expresiei unor proteine şi a nivelului total de proteine din omogenatul celular dupã expunerea animalelor ovalbumin-sensibilizate la mediul din Salina Turda, fiind astfel inversate procesele morfopatologice ale fibroblastelor pulmonare din culturã;

DISCUŢII Prezentul studiu a evaluat fenotipurile

morfologice legate de procesele de reparare şi remodelare a culturilor de fibroblaste pulmonare obţinute de la şobolani Wistar martor şi şobolani ovalbumin-sensibilizaţi - un model pentru astmul bronşic care duce la hiper-rãspunsul căilor respiratorii şi

31


remodelarea cronicã a căilor respiratorii, aşa cum şi alţi autori au prezentat.

Comparativ cu fibroblastele din cultura martor, fibroblastele obţinute din parenchimul pulmonar de la şobolani "astmatici" şi şobolani ovalbumin-sensibilizaţi trataţi în Salina Turda am demonstrat rolul pozitiv al mediului salin pentru tratarea astmului.

Studiul actual s-a axat pe fibroblaste, fiind considerate a fi celule ce joacă un rol important în menţinerea şi remodelarea ţesutului conjunctiv interstiţial. În acest context, fibroblastele joaca un rol cheie în menţinerea şi modificarea structurii ţesutului. Capacitatea fibroblastelor de a migra şi de a prolifera ca răspuns la stimuli chemotactici sau ca răspuns la factori de creştere specifici este explicatã prin necesitatea de a controla acumularea lor la locurile unde are loc repararea ţesuturilor. Capacitatea fibroblastelor de a produce şi de a remodela matricea extracelularã este consideratã a contribui la modificările structurale ale ţesuturilor. Remodelarea ţesuturilor implică probabil activitatea contractilă a fibroblastelor.

Mulţumiri Acest studiu a fost finantat prin

contractul nr. 5366 bis /2010 de cãtre SC Turda Salina Durgãu SA, în calitate de beneficiar al rezultatelor.

Bibliografie 1. Foster Judith Ann, Celeste B.R.,

Miller M.F. – Pulmonary Fibroblasts: an in Vitro Model for Emphysema, The Journal of Biological Chemistry, Vol. 265, No. 26, 1990, p. 15544-15549;


3. Mera O., Ştefãnie T., Vişinescu V – Cetatea din Muntele de Sare, Turda, 2010, ISBN 978-973-0-07419-2

4. Nunez J.S., Torday J.S. – The Developing Rat Lung Fibroblast and Alveolar Type II Cell Activity Recruit Surfactant Phospholipid Substrate, American Institute of Nutrition, 1995, 1639S-1643S.


6. Simionca I., Grudnicki N., Buturuga A., Hoteteu M., Kiss J., Oprina A. – Speleoterapia bolnavilor cu astm bronşic non-sever prin intermediul factorilor terapeutici din salina Slãnic Prahova, Editura “George Tofan”, Suceava 2009, ISBN 978-973-1862-87-3


32


Evaluarea experimentala in vitro a capacitatii de vindecare a ranilor si arsurilor prin expunere la microclimatul salin din Dej şi

Cacica

- Constantin Munteanu 1, Diana Munteanu, Iuri Simionca, Mihai Hoteteu

Rezumat Obiectiv: Investigarea influenţei microclimatului salinelor Dej şi Cacica asupra

morfologiei şi exprimãrii electroforetice a fibroblastelor dermale in vitro obţinute din ţesutul hipodermic al şobolanilor Wistar, în condiţii normale şi dupã rãni şi arsuri experimentale.

Materiale şi metode: culturile de fibroblaste dermale au fost obţinute din ţesutul hipodermic prelevat de la şobolani Wistar. Culturile obţinute se dezvolta în monostrat de fibroblaste ataşate la vasul de cultivare. Înainte de iniţierea culturilor, şobolanii Wistar cu greutate de 75-100 g au fost separaţi în trei loturi: control, rãni şi arsuri. Cinci animale din fiecare lot au fost trimise la salinele Dej şi Cacica timp de 14 zile şi menţinute în mediul salin, ca şi în speleoterapie.

Rezultate: Speleoterapia aplicatã şobolanilor Wistar a determinat diferenţe semnificative în morfologia celularã şi în exprimarea electroforeticã a fibroblastelor dermale din culturile primare realizate. Datele obţinute confirmã efectele terapeutice ale speleoterapiei prin comparaţie cu datele experimentale de la animalele martor.

Concluzii: Rezultatele acestui studiu indicã faptul ca speleoterapiea induce schimbări în morfologia şi expresia proteicã a fibroblastelor dermale in vitro, iar aceste schimbări susţin efectele terapeutice ale speleoterapiei.

Cuvinte cheie: speleoterapie, fibroblaşti, salina.


33


INTRODUCERE Pielea reprezintă interfaţa primară

între organism şi mediul înconjurător. Spectrul agresiunilor la care pielea este susceptibilă include afecţiuni cauzate de către agenţi chimici şi microbieni, radiaţii termice şi electromagnetice şi traume mecanice. Consecinţa distrugerii pielii este invazia microorganismelor patogene, ceea ce poate afecta viaţa omului.

Vindecarea unei rǎni este un rǎspuns natural, restaurativ, la o leziune tisularǎ – care constǎ dintr-o cascadǎ de evenimente celulare a cǎror naturǎ depinde de caracteristicile rǎnii. Existǎ rǎni acute rezultate în urma intervenţiilor chirurgicale, penetrǎrii unor obiecte contondente, amputǎrii unor falange, rosǎturi, arsuri, muşcǎturi de animale, etc. şi rǎni cronice ca ulcerul arterial, ulcerul venos, limfedemul, ulcerul de presiune şi ulcerul neuropatic.

Medicina regenerativă este în general văzută ca una dintre revoluţiile

următoare în tratamentul medical. Aceasta se inspiră foarte mult din domeniile ştiinţei ţesuturilor, biologie, biochimie, fizica, chimie, stiinta materialelor, inginerie şi aplicate la alte domenii şi este o disciplină extrem de nouã şi interdisciplinarã. Scopul general al medicinei regenerative este să repare, să înlocuiască sau sã regenereze in vivo ţesuturi şi organe pierdute sau deteriorate, prin tehnici care le stimuleazã vindecarea proprie. De asemenea pot fi cultivate in vitro ţesuturi şi organe pentru implantare ulterioară în organism.

Utilizarea culturilor de celule dermale pentru a verifica proprietăţile terapeutice ale microclimatului din saline în cure de speleoterapie, reprezintă o modalitate ştiinţificã de a stabili metodologia medicalã de prevenire, tratare şi recuperare a pacienţilor cu diverse probleme dermatologice.

34




Model animal –şobolani Wistar cu rãni şi arsuri experimentale: Şobolani Wistar de 75-100 g greutate au fost supuşi la rãni şi arsuri de 1 cm patrat, pe suprafaţa dorsalã - spate.

Cultura de fibroblaste dermale După anestezia realizatã cu

cloroform şi eliminarea pãrului cu ajutorul unei lame de ras sterile, a fost preluatã o suprafaţã de 1 cm2 de piele, care a fost plasatã în soluţie tampon fosfat salin (TFS) pe gheaţă. Prin tripsinizãri succesive cu tripsinã 0,125% şi centrifugare, peletul celular este

preluat într-o cantitate corespunzãtoare de mediu. Celulele au fost crescute în mediu HAM-F12 cu 4500mg/l glucoză, 25 mM HEPES, 100 U/ml penicilină, 100 µg/ml streptomicină şi 50 µg/ml neomicină. Mediul a fost suplimentat cu 10% ser fetal de viţel.

După 24 ore s-a schimbat mediul de cultură, pentru a îndepărta celulele moarte şi resturile celulare. Ulterior schimbarea mediului s-a efectuat la fiecare 3 zile. Celulele au fost cultivate pe plăci Petri de sticlă, cu diametrul de 50 mm (Schott).

Electroforeza SDS-PAGE Electroforeza proteinelor din lizatul

celular omogen total are ca scop stabilirea schimbărilor aparute la nivelul expresiei proteice a culturilor de fibroblaste obţinute de la şobolanii supuşi tratamentului speleoterapeutic.

Electroforeza proteinelor în gel de poliacrilamidă a fost făcut în condiţii denaturante în conformitate cu tehnicile


descrise de Laemmli (1979). Culturile au fost spălate cu TFS, raclate de la placa de cultură şi lizate în tampon care conţine 0,5 M Tris-HCl, pH 6,8 + 0,05% BPB + glicerol 10% + 10% SDS. Analiza densitometricã pentru evaluarea

cantitãţii relative de proteine s-a efectuat cu ajutorul sistemului SCIE-PLAS VISION, utilizãnd soft-ul de analizã a gelurilor GeneTools de la SYNGENE, versiunea 4.00.

REZULTATE

Cultura de celule dermale martor de 7 zile are o compoziţie celularã heterogenã formatã din fibroblaste dermale şi celule epiteliale de tipul keratinocitelor. Dupã 7 zile de cultivare se ajunge la un nivel avansat de preconfluenţã celularã. Diviziunea celularã are o frecvenţã ridicatã. Morfologia celularã a celulelor martor corespunde datelor din literatura de specialitate.

Cultura de celule dermale de 7 zile obţinutã de la animale martor negativ, cu rãni şi arsuri, dar netrataţi prin speleoterapie prezintã mai multe modificãri morfologice faţã de cultura martor (0) de celule dermale, fiind observatã o reducere semnificativã a numãrului de fibroblaste din culturã, diminuarea frecvenţei diviziunilor celulare şi accentuarea morfopatologiilor celulelor din culturã. Dupã 7 zile de cultivare, nivelul de preconfluenţã este mult mai redus decât în cazul martor.


Cultura de celule dermale de la şobolani din loturile de control pozitiv, fãrã rãni şi arsuri şi trimişi la speleoterapie în salinele Cacica şi Dej prezintã un aspect intermediar între martorii negativi cu rãni şi arsuri şi martorul de control, ţinut la Biobazã.

Cultura de celule dermale de 7 zile obţinutã de la şobolani cu rãni şi arsuri, trataţi prin speleoterapie la Cacica şi dej prezintã o ameliorare evidentã microscopic a parametrilor morfologici,

în comparaţie cu martorii negativi. Creşte densitatea şi viabilitatea celularã

Observaţiile morfologice sunt confirmate de analiza electroforetică, ce demonstrează prin creşterea expresiei unor proteine şi a nivelului total de proteine din omogenatul celular dupã expunerea animalelor cu rãni şi arsuri la mediul din salinele Cacica şi Dej, fiind astfel inversate procesele morfopatologice ale celulelor dermale din culturã;

37


Mulţumiri Acest studiu va fi terminat în 2011

şi este finanţat de către Autoritatea Naţională pentru Cercetare Ştiinţificã - CNMP, contract nr. 42120/2008, proiect: Studiu complex medico-biologic in vederea utilizarii inovative a factorilor potential terapeutici de mediu din saline si pestera in sanatate si turism balneoclimatic; soluţii de modelare a acestora, coordonat de Dr. Iuri Simionca.

Bibliografie

1. Flaxman A. – cell identification in primary cell cultures from skin, In vitro, vol.10, no 1&2, 1974

2. Foster Judith Ann, Celeste B.R., Miller M.F. – Pulmonary Fibroblasts: an in Vitro Model for Emphysema, The Journal of Biological Chemistry, Vol. 265, No. 26, 1990, p. 15544-15549;


4. Neagos D. – Teza de doctorat: MODELE CELULARE DE STUDIU

IN VITRO A MECANISMELOR MOLECULARE CARE STAU LA BAZA REPARARII LEZIUNILOR PIELII, Universitatea din Bucuresti, 2007


6. Simionca I., Grudnicki N., Buturuga A., Hoteteu M., Kiss J., Oprina A. – Speleoterapia bolnavilor cu astm bronşic non-sever prin intermediul factorilor terapeutici din salina Slãnic Prahova, Editura “George Tofan”, Suceava 2009, ISBN 978-973-1862-87-3


38


Intenţii, planuri, gânduri Constantin Munteanu

EDITURA Balnearã raspunde unei necesitãţi de diseminare şi promovare a cercetarii

desfãşurate de Institutul Naţional de Recuperare, Medicinã Fizicã şi Balneoclimatologie cu scopul de a contribui la fundamentarea capacitãţii terapeutice a factorilor naturali din staţiunile balneare.

EDITURA Balnearã reprezintã o provocare pentru sistemul balnear românesc în încercarea de a arãta rolul cercetãrii ştiinţifice moderne în dezvoltarea acestui sector, fiind promovatã ideea de calitate terapeuticã certificatã a factorilor naturali

EDITURA Balnearã işi propune sã fie un pilon de susţinere pentru balneologia bazata pe dovezi ştiinţifice, fiind o platforma de diseminare a datelor experimentale acumulate in decursul timpului prin activitatea de cercetare ştiinţificã.

EDITURA Balnearã doreşte sa colaboreze cu actorii implicati in turismul balnear şi va întreprinde demersuri de promovare a rolului cercetãrii ştiinţifice in dezvoltarea sectorului.

EDITURA Balnearã va publica revista: Balneo-Research Journal prin intermediul careia vor fi publicate articole ştiinţifice.

EDITURA Balnearã va avea un editorial zilnic: Editorial Balneo unde vor fi exprimate opinii ce vizeazã diferite probleme aparute in domeniul balneologiei.

EDITURA Balnearã va concepe şi va publica in format pdf, Gazeta Balneara prin care va disemina informaţii de actualitate, ştiri, evenimente şi opinii legate de factorii naturali terapeutici, de staţiunile balneare, de domeniul balneologiei şi despre Institutul National de Recuperare, Medicina Fizica si Balneoclimatologie.

Reguli de editare (protocol peer-review) Manuscrisele articolelor vor fi trimise in format Word ataşate unui email la adresa:

[email protected]. Procesarea imaginilor, scanarea şi prelucrarea graficelor – daca este cazul - va fi responsabilitatea echipei editoriale. Limba de redactare a articolelor este limba engleza. Articolele pot fi publicate şi cu traducerea lor în limba românã.

După primirea manuscrisului, autorul corespondent va primi un scurt e-mail de confirmare a primirii articolului care va conţine numărul de înregistrare, data la care manuscrisul a fost primit şi faptul că manuscrisul a fost înaintat Consiliului Editorial. Editorul revistei alege 2 membrii ai consiliului editorial pentru peer-review şi le trimite prin e-mail manuscrisul.

Decizia recenzorilor (de aprobare, de aprobare cu modificãri minore sau majore, sau de respingere) va fi imediat comunicatã prin e-mail autorului corespondent de către editor.

În cazul în care manuscrisul primeşte aprobarea publicãrii cu modificări, autorul corespondent este rugat sã trimitã editorului manuscrisul îmbunătăţit în decurs de 4 săptămâni. Editorul revistei va transmite raspunsul autorului corespondent la recenzorii selectaţi. Dacă ei sunt mulţumiţi de modificãrile fãcute, vor trimite editorului decizia de aprobare pentru publicare a manuscrisului îmbunătăţit.

În cazul în care recenzorii consideră că autorii nu au respectat acceptabil cererea de revizuire, ei vor putea lua decizia de a nu aproba articolul pentru publicare şi vor comunica decizia respectivã editorului revistei.

Decizia de aprobare pentru publicare luatã de către recenzori va fi comunicată în şedinţa consiliului editorial.

39


40

http://cell-culture.xhost.ro/CONFERINTA.htm

vol.1, nr.1, 2010 ediţie în limba românã - bioclima.robioclima.ro/j1rom.pdf · • prof. dr....

Documents