VYTAUTO DIDŽIOJO UNIVERSITETAS

GAMTOS MOKSLŲ FAKULTETAS

BIOCHEMIJOS KATEDRA

Zbigniev Balion

AZOTO MONOKSIDO DONORO NOC-18 POVEIKIO ŠIRDIES MITOCHONDRIJOMS

IŠEMIJOS METU MECHANIZMO TYRIMAS

Magistro baigiamasis darbas

Biocheminės analizės studijų programa, valstybinis kodas 621C77001

Molekulinė biologija, biofizika ir biochemija studijų kryptis

Vadovas (- ė): Odeta Arandarčikaitė ____________ ___________

(Parašas) (Data)

Apginta:prof. Saulius Mickevičius ____________ ___________

(Fakulteto/studijų instituto dekanas/direktorius) (Parašas) (Data)

Kaunas, 2017

2

TURINYS

SANTRUMPOS ....................................................................................................................................... 3

SANTRAUKA ......................................................................................................................................... 4

ABSTRACT ............................................................................................................................................. 5

ĮVADAS ................................................................................................................................................... 6

1. LITERATŪROS APŽVALGA .......................................................................................................... 7

1.1 Širdies pažeidimai išemijos metu .................................................................................................... 7

1.2 Mitochondrijų nespecifinio pralaidumo pora .................................................................................. 8

1.3 Azoto monoksidas ir jo apsauginis poveikis išemijos metu ......................................................... 14

2. METODAI ......................................................................................................................................... 21

2.1 Širdies perfuzija ir išemija ............................................................................................................ 21

2.2 Mitochondrijų ir citozolinės frakcijos išskyrimas ......................................................................... 21

2.3 Baltymo kiekio nustatymas ........................................................................................................... 22

2.4 Elektroforezė ................................................................................................................................. 22

2.5 Baltymų pernešimas ant membranos ............................................................................................ 22

2.6 Blotingas ir baltymų detekcija ...................................................................................................... 23

2.7 Duomenų analizė ........................................................................................................................... 23

2.8 Naudotos medžiagos ..................................................................................................................... 24

3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS .............................................................................................. 26

3.1 Membranos .................................................................................................................................... 27

3.2 Mitochondrijų ir Citozolio frakcijų baltymų kiekybinė analizė .................................................... 31

IŠVADOS ............................................................................................................................................... 34

LITERATŪROS SĄRAŠAS ................................................................................................................ 35

3

SANTRUMPOS

ANT – adenino nukleotidų nešiklis

ATPazė – ATP sintazė

cGMP – ciklinis 3‘,5‘-guanozinmonofosfatas

CyP-D – ciklofilinas D

CoQ – kofermentas Q

CsA – ciklosporinas A

eNOS – endotelinė azoto monoksido sintazė

HK 2 – heksokinazė 2

iNOS – indukuojamoji azoto monoksido sintazė

MNPP – mitochondrijų nespecifinio pralaidumo pora

NADH – nikotino amido adenino dinukleotidas, redukuota forma

nNOS – neuroninė azoto monoksido sintazė

NO – azoto monoksidas

NOC-18 – azoto monoksido donoras

NOS – azoto monoksido sintazė

Pi – neorganinis fosfatas

PiC – neorganinio fosfato nešiklis

PKG – baltymų kinazė G

PKC – baltymų kinazė C

PKCε – baltymų kinzė C epsilon

PPIazė – peptidilprolilizomerazė

ROS – aktyviosios deguonies formos

UCP – atskiriantieji baltymai

VDAC – įtampos valdomas jonų kanalas

4

SANTRAUKA

Praktikos ataskaitos autorius: Zbigniev Balion

Praktikos ataskaitos pavadinimas: Azoto monoksido donoro NOC-18 poveikio širdies mitochondrijoms

išemijos metu mechanizmo tyrimas

Vadovas: Dr. O. Arandarčikaitė

Darbas pristatytas: Vytauto Didžiojo Universiteto Gamtos mokslų fakultete, Kaunas, 2017.

Puslapių skaičius: 41

Lentelių skaičius: 1

Paveikslų skaičius: 10

Priedų skaičius: 0

Išemija pažeidžia širdį, jos metu žūsta kardiomiocitai. Azoto monoksidas apsaugo ląsteles nuo

išemijos neleisdamas formuotis MNPP, per baltymų kinazes G ir C. PKC epsilon siejama su

apsauginiu poveikiu širdies mitochondrijose dėl MNPP formavimosi slopinimo išemijos metu. Darbo

metu buvo tirtas PKC epsilon baltymo kiekio pokytis širdies ląstelių citozolinėse ir mitochondrinėse

frakcijose. Atlikti eksperimentai su 4 grupėmis: kontroline, kontroline perfuzuojant su NO donoru

NOC-18, 30 min. išemijos ir 30 min. išrmijos prieš tai perfuzuojant su NO donoru. Mitochondrinė ir

citozolinė frakcijos buvo išskiriamos diferenciniu centrifugavimu, atlikta elektroforezė ir Westernblot

analizė. Buvo naudoti antikūnai: prieš PKC epsilon baltymus, vidinei kontrolei citozoliniams

baltymams prieš beta-aktiną, mitochondrijų baltymams – prieš VDAC. Ištirta, kad išemijos metu

citozolyje padaugėja PKC epsilon baltymo lyginant su kontrole. Mitochondrijose baltymo kiekis

nepadidėjo išemijos metu. NO donoras NOC-18 neturėjo įtakos baltymo kiekiui mitochondrijose ir

citozolyje.

5

ABSTRACT

Author : Zbigniev Balion

Title: Evaluation of protective mechanism fo nitric oxide donor NOC-18 to heart mitochondria against

ischemia induced damages.

Supervisor : Dr. O. Arandarčikaitė

Presented at : Vytautas Magnus University, Faculty of Natural Sciences, Kaunas, 2017.

Number of pages: 41

Number of tables: 1

Number of pictures: 10

Number of appendices: 0

During ischemia cardymiocytes die which dameges the heart. Nitric oxide protects the cells

from ischemic damage by activating protein kinases G and C. Activated PKC epsilon protects

mitochondria from ischemic damage by inhibiting MPTP. Here we tried to determine how PKC

epsilons concentration changes in cells cytosol and mitochondria after 30 min. ischemia and if NO

donor NOC-18 has any affect on it. Hearts were perfused, mitochondrial and cytosolic factions

extracted using diferencial centrifgation and after separating them using electrophoresis Westernblot

analysis was performed. Anti PKC epsilon antibodies were used for protein of interest, anti VDAC and

anti beta-Actin antibodies were used for housekeeping proteins for mitochondrial and cytosolic

proteins. The results show an increase of PKC epsilon in cytosol after ischemia. No increase was

detected in mitochondria after ischemia. NO donor NOC-18 had no effect on PKC epsilon

concentration neather in cytosol or mitochondria.

6

ĮVADAS

Širdies išemija yra daugiausiai gyvybių nusinešanti liga pasaulyje. Išemijos metu širdis

negauna deguonies ir kitų substratų dėl sumažėjusio kraujo patekimo į audinius. Dėl šios priežasties

ląstelėse pirmiausiai nukenčia mitochondrijos. Dėl deguonies trūkumo nebegaminamas ATP

oksidacinio fosforilinimo metu. Dėl ATP trūkumo padidėja kalcio jonų koncentracija ląstelėje, dėl

formuojasi mitochondrijų nespecifinio pralaidumo pora (MNPP). Susiformavus MNPP iš

mitochondrijų į citozoli patenka proapoptotiniai junginiai, tokie kaip citochromas c. Proapoptotiniai

junginiai sukelia ląstelės apoptozę ar nekrozę ir ląstelė žūna.

Žinoma, kad organizme natūraliai gaminamas azoto monoksidas (NO) apsaugo ląsteles nuo

išemijos neleisdamas susidaryti MNPP. Nustatyta, kad NO veikia per cGMP kuri aktyvuoja baltymų

kinazę G. Baltymų kinazė G veikia baltymų kinazę C. Baltymų kinazės C epsilon izoforma veikia

mitochondrijas ir slopina MNPP formavimasį. Tikslus apsauginio poveikio mechanizmai nėra žinomi.

Baltymų kinazės C izoformos pasižymi translokacija ląstelėse – jos gali būti perkeliamos tarp

mitochondrijų, membranų, citozolio ir kitų ląstelės vietų. Kaip tiksliai NO išemijos metu apsaugo

ląsteles nuo MNPP susidarymo nėra žinoma. Ištyrus NO apsauginio poveikio mechanizmą geriau

suprastumėme kaip galime apsaugoti širdį nuo išemijos pažaidų.

Šiame darbe tyrėme NO donoro NOC-18 aktyvintos baltymų kinazės C vietą širdies ląstelėse.

Aktyvintos baltymų kinazės C frakcijose nustatymas padėtų suprasti, kaip veikia NO apsauginiai

mechanizmai išemijos metu.

Darbo tikslas: Nustatyti NO donoro NOC-18 aktyvintos baltymų kinazės C vietą ląstelėje

Darbo uždaviniai:

1. Nustatyti NOC-18 aktyvintą baltymų kinazę C širdies mitochondrinėje frakcijoje.

2. Nustatyti NOC-18 aktyvintą baltymų kinazę C širdies citozolinėje frakcijoje.

7

1. LITERATŪROS APŽVALGA

1.1 Širdies pažeidimai išemijos metu

Išemijos metu širdis negauna deguonies ir kitų substratų dėl sumažėjusio kraujo patekimo į

audinius. Dėl šios priežasties ląstelės nustoja gaminti adenozino trifosfatą (ATP). Dėl deguonies

trūkumo ląstelėse prasideda anaerobinis kvėpavimas ir kaupiasi laktatas dėl kurio kinta ląstelės pH.

Ląstelėje besikaupiantys protonai aktyvuoja Na+/H+ jonų kanalą. Nepakankamas ATP kiekis ląstelėse

reiškia, kad natrio ir kalcio kanalai nebegali pašalinti šių jonų iš ląstelės. Į ląstelę nevaldomai

patenkantis kalcio ir natrio jonai sukelia ląstelės brinkimą, dėl ko gali plyšti jos plazminė membrana

(Borutaitė V ir kt. 2013). Plyšus ląstelės plazminei membranai pažeidžiamos kitos aplinkui esančios

ląstelės (Gustafsson ir Gotlieb, 2003). Kalcio jonų padidėjimas ląstelėse gali sukelti ląstelės žūtį

aktyvuojant proteazes, fosfolipazes, apoptozę, miocitų hypersusitraukinėjimą ar mitochondrijų

nespecifinio pralaidumo poros (MNPP) formavimasį. Reperfuzija gali sutabdyti ląstelių žūtį atstatant

ląstelėse deguonies ir kitų substratų kiekius. Tačiau į ląstelę patekus deguoniui gaminami reaktyvieji

deguonies junginiai, kurie sukelia pažaidas ląstelėje. (Borutaitė V ir kt. 2013). Išemijos metu ląstelėje

padidėjus kalcio konų koncentracijai susidato MNPP pro kuria iš mitochondrijų į citozolį gali patekti:

citochromas c, Smac/DIABLO, apoptozę indukuojantis faktorius (AIF), endonukleazė G ir

prokaspazės. Citochromo c patekimas į citozolį sukelia ląstelės apoptozę. Citozolyje citochromas c su

Apad-1, dATP ir kaspaze-9 formuojant makromolekulinį kompleksą vadinama apoptosoma ir taip

aktyvuojant kaspazę-3 ir apoptozę. Kaspazių aktyvumas dar labiau padidinamas širdies

mitochondrijose randamu baltymu Smac/DIABLO. AIF ir endonukleazė G yra perkeliamos iš

mitochondrijų į branduolį ir sukelia DNR fragmentaciją (Gustafsson ir Gotlieb, 2003). Atlikti tyrimai

rodo, kad jau po 10 min. išemijos matomi pirmi apoptozės požymiai, o po 30-60 min. išsemijos jie

pasiekia maksimalų pokytį (Chakrabarti S ir kt. 1997). Žiurkių širdyse kazspazių aktyvacija jau

matoma po 30 min. išemijos, o DNR fragmentacija po 60 min. išemijos. (Borutaitė V ir kt. 2003).

Mitochondrijos atlieka itin svarbia funkcija ląstelėje. Mitochondrijos tai pailgos organelės kurių

dydis ir skaičius ląstelėse priklauso nuo audinio tipo. Mitochondrijų skaičius ląstelėse svyruoja nuo

kelių dešimčių iki kelių šimtų, priklausomai nuo ląstelės paskirties ir tipo. Daugiausia mitochondrijų

aptinkama audiniuose, kuriuose vyksta intensyviausi fiziologiniai ir biocheminiai procesai –

smegenyse, kepenyse, raumenyse ir širdyje. Kiekviena mitochondrija turi dvi membranas : vidinę ir

8

išorinę. Šios dvi membranos atskiria mitochondrijų turinį nuo citozolio ir leidžia atlikti svarbias

funkcijas. Išorinė mitochondrijų membrana yra pusiau pralaidi ir praleidžia mažas molekules iki 10

kDa dyžio į tarpmembraninę erdvę. Ji suteikia mitochondrijoms budingą apvalią ir pailgą formą. (Frey

ir Mannella, 2000). Kitaip nei išorinė, vidinė mitochondrijų membrana yra išraizgyta kristomis –

mebranos įlinkimai, dėl ko ji yra žymiai didesnė už išorinę membraną. Ji nėra tokia pralaidį kaip

išorinė membrana ir apsupa vidinę mitochondrijų erdvę vadinama matriksu. Vidinėje mitochondrijų

membranoje yra išsidėste oksidacinio fosforilinimo kompleksai. (Frey ir Mannella, 2000).

Mitochodrijos yra kilusio iš eubakterijų, dėl ko jos turį savo genomą kuris su laiku pakito. Jis sudarytas

iš 16 569 bazių porų kuriame yra 37 genai kuoduojantis: dvi rRNR, 22 tRNR ir 13 polipeptidų.

Mitochondrijose sintetinami baltymai yra naudojami oksidacinio fosforilinomo sistemos

kompleksuose, tokie kaip NADH, citochromas c, ATP sintazė ir kt. Visgi dauguma baltymų yra

kuoduojami branduolyje ir sintetinami citozolyje. Iš citozolio jie pernešami į mitochondrijas.

(Taanman, 1999). Širdies ląstelėms reikia ypatingai daug energijos, kurią mitochondrijos gamina

adenozino trifosfato pavidalu. Tai pagrindinė mitochondrijų funkcija, kuri yra atliekama fosforilinant

adenozino difosfatą (ADP) mitochondrijų vidinėje membranoje oksidacinio fosforilinimo metu.

Oksidacinį fosforilinimą vidinėje mitochondrijų membranoje atlieka kvėpavimo grandinė sudaryta iš 4

kompleksų kurie yra isiterpe į membraną. Šie kompleksai oksdacijos-redukcijos būdu perduoda

elektronus nuo NADH ir FADH2 deguoniui taip jį redukuojant. Šie kvėpavimo grandinės substratai

gaunami oksiduojant junginius trikarboksi rūgščių cikle, gautus skaidant maisto medžiagas (Gautheron

1984). Išemijos metu yra pažeidžiama okscidacinio fosforilinimo sistema. Širdyje trumpi išemijos

periodai stabdo pirmą kvėpavimo grandinės kompleksą ir ATP sintazę. Šie poveikiai laiko grįžtamais,

nes gražinus kraujo tekėjima, kompleksų veikla atstatoma. Toliau įvyksta neatstatomas ketvirto

kvėpavimo grandinės komplekso slopinimas kartu su citochromo c patekimu į citozolį (Borutaitė V. ir

kt 2013). Pirmiausia buvo manyta, kad citochromas c patenka į citozolį per MNPP kurį atsiveria tik

reperfuzijos metu. Tačiau vėlesni tyrimai parodė, kad citochromas c širdyje patenka į citozolį po 30

min., be reperfuzijos (Pasdois P ir kt. 2011). MNPP formavimasis yra vienas iš pagridinių išemijos

padarinių, dėl kurio ląstelės žūsta. Norint apsaugoti ląsteles nuo išemijos poveikio reikia suprasti kaip

veikia MNPP, kaip ji susidaro ir kas ją reguliuoja.

1.2 Mitochondrijų nespecifinio pralaidumo pora

Pirma karta MNPP mitochondrijose buvo aptikta 1979 metais (Haworth RA, Hunter DR 1979).

MNPP formavimasis lemia ląstelės žūtį išemijos metu. MNPP yra nespecifinė 1.5 kDa dydžio pora

kuri susidaro tipiškai jonams nelaidžioje vidinėje mitochondrijų membranoje. Poros susidarymą lemia

9

išemijos metu padidėjusi kalcio jonų koncentracija ląstelėje (Goldenthal M. J. 2016). MNPP poros

jautrumas kalcio jonams gali būti stipriai padidintas kitais faktoriais: adenino nukleotidų sumažėjimas,

neorganinio fosfato (Pi) padidėjimas ir oksidacinis stresas (Savage MK, Reed DJ 1994).

Nustatyta, kad submikromoliniai kiekiai ciklosporino (CsA) gali inhibuoti MNPP formavimasį

(Griffiths EJ, Halestrap AP 1991). Toliau buvo atrasta, kad CsA inhibuoja MNPP jungdamasis su

mitochondrijų užpilde esančiu ciklofilinu D (CyP D) (peptidil – prolil- cis-trans izomeraze (PPIazė))

kurio fermentinį aktyvumą blokuoja CsA kiekias atitinkančiais kiekius kurie inhibuoja MNPP

formavimasį (Connern CP, Halestrap AP 1994). Pirmiausiai buvo pateikta hipotezė, kad MNPP sudaro

baltymai esantys išorinėje ir vidinėje mitochondrijų membranose, tarpląstelinio užpildo baltymai, bei

matrikso baltymai. Buvo manoma, kad MNPP susidaro vidinės ir išorinės membranų susilietimo

vietoje (Lemasters JJ ir kt 1998). Buvo manoma, kad MNPP sudaro: CyP D mitochondrijų užpilde,

adenino nukleotidų translokazė (ANT) vidinėje membranoje, mitochondrinė kreatino kinazė

tarpmembraniniame užpilde, įtampos valdomas jonų kanalas (VDAC) išorinėje membranoje,

hekzokinazė 2 (HK II) ir periferinis benzodiaspino receptorius ( TSPO dar vadinamas PBR) kartu su

Bcl-2 šeimos baltymais mitochondrijų paviršiuje. ANT reaguoja su CyP-D ir jo specifiniai inhibitoriai

atraktilozidas ir bongkrekinė rugštis atitinkamai skatina ir inhibuoja MNPP (Halestrap AP 1990).

Rekonstruotas į liposomas ANT sudarydavo kalcio jonais aktyvuojamą kanalą panašų į MNPP. VDAC

– išorinėje mitochondrijų membranoje paplites porinis baltymas perneša daugelį ištirpusių medžiagų iš

citozolio į tarpmembraninę erdvę ir sąveikauja su ANT. Citozolinės heksokinazės II surišimas

inhibuoja MNPP[]. Vėliau iš žiurkės smegenų išskirtas kompleksas sudarytas iš VDAC, ANT,

heksokinazės I ir kreatino kinazės pasižymėjo panašiais elektrochemiškais aktyvumais į MNPP

(Beutner G. Ir kt. 1998) . Tačiau atlikti tyrimai su transgeninėmis pelėmis parodė, kad ANT (Kokoszka

JE ir kt. 2004), VDAC( Baines CP ir kt. 2007) ir TSPO(Sileikyte J ir kt. 2014) negali būti MNPP

komponentai, nes pelėse su už jų ekspresiją atsakančių genų slopinimais MNPP susidarymas nebuvo

sustabdytas.

Atitinkamai mitochondrinio fosfato nešiklis (PiC) buvo siulomas kaip galimas komponentas.

Jis sąveikauja su CyP-D ir ANT ir perkeltas į liposomas sukuria pora, o neorganinio fosfato

koncentracija įtakoja MNPP susidarymą (Leung AW, Halestrap AP 2008). Tačiau susidarančios poros

elektrofiziologinės savybės neatitiko MNPP. Tyrimai su pašalintu PiC parodė, kad jo praradimas

neįtakoja MNPP (Gutie´rrez-Aguilar M ir kt. 2014). Bet genetinė analizė parodė, kad CyP-D yra

kritinis MNPP reguliatorius[]. Jo pašalinimas padidino reikiama kalcio jonų kocentraciją MNPP

10

susidarymui, bei sumažino išemijos padarytą žalą širdžiai(Basso E ir kt. 2005). CyP-D yra atliekamos

potransliacinės modifikacijos – fosforilinimo, nitrozilinimo, oksidacijos ir acetilinimo. Atlikta mažai

tyrimų su CyP D fosforilinimu. Glikogeno sintazės kinazė 3β (GSK-3β) buvo susieta su jos

translokacija iš citozolio į mitochondrijas per cGMP/PKG kelią. Mitochondrijose GSK-3β veikė su

CyP D ir pasižymėjo apsauginiu poveikiu širdims (Halestrap AP 1994 ). Tačiau neaišku ar apsauginis

poveikis atsiranda GSK-3β fosforilinant CyP D. Buvo parodyta , kad aktyviam rekombinantiniam GSK

tiesiogiai fosforilinant CyP D buvo sukelta mitochondrijų depoliarizacija ir MNPP formavimasis

vėžinėse ląstelėse. GSK-3 slopinimas apsaugojo ląsteles nuo MNPP formavimosi (Rasola A ir kt.

2010). Žinant baltymų kinazių kompleksiškumą translokuojantis į mitochondrijas ir ten foforilinant

baltymus reikia daugiau tyrimų, kad išsiaiškinti CyP D fosforilinimo mechanizmu. CyP D

nitrozilinimas turėti apsaugini poveikį neleisdamas CyP D saveikauti su kitais baltymais, tame tarpe ir

MNPP baltymais (Sun J ir kt. 2006). CyP D oksidacija keičia jo konformaciją ir fermentinį aktyvumą.

Oksiduotas CyP D stimuliuoja MNPP formavimasį ir ląstelės žūtį (Linard D ir kt. 2009). Baltymų

acetilinias/ deacetilinimas yra svarbus mechanizmas mitochondrijose. Mitochondrinių baltymų

deacetilinimas yra reguliuojamas sirtuinų izoforma – SIRT3 kuri naudoja NAD+. CyP D deacetilinimas

sumažina PPIazės aktyvumą ir sukelia jos disociacija nuo ANT (Shulga N ir kt. 2010). SIRT3

inhibicija atvirkščiai padidino CyP D acetilinimą ir aktyvumą bei saveika su ANT (Shulga N ir

Pastorino JG 2010). Sumažintas CyP D acetilinimas ir padidinta SIRT3 ekspresija pagerino širdies

funkcijas ir mitochondrijų kvėpavimą. Baltymo overekspresija net inhibavo MNPP formavimasi

(Bochaton T 2015). Šios modifikacijos pakeičia CyP-D struktūra ir poveikį MNPP. Šios modifikacijos

taip pat keičia CyP-D saveiką su kitais baltymais, tokiais kaip Bcl-2 ir F0F1 ATP sintaze (Goldenthal

M. J. 2016).

ATP F0F1 sintazė siūloma kaip potencialiai formuojanti MNPP. ATP sintazės dimerai perkelti

į fosfolipidų dvisluoksnį formuoja nuo kalcio jonų priklausomus elektrofiziologiškai panašius į MNPP

kanalus(Giorgio V ir kt. 2013). Atlikus tyrimus su ATP sintazės c subvienetais HeLa ląstelėse, buvo

parodyta, kad slopinant baltymo ekspresiją MNPP susidarymas buvo slopinamas, o padidinus

ekspresiją MNPP susidarymas irgi padidėjo. C subvienetas yra dalis memrbaninio ATP sintazės F0

subkomplekso pro kurį praeina protonai. C subvientai formuoja žiedinę struktūrą. Atlikus tyrimus su

išgrinintu c subvienetu jį perkeliant į liposomas buvo nustatyta, kad jis formuoja įtampai jautrų kanalą,

kurį atidarius membrana yra depoliarizuojama. Tačiau susiformaves kanalas nebuvo jautrus kalcio

jonams ir CsA (Bonora M ir kt. 2013). Išgrinintui c subvieneto kanalui trūksta komponentų, kurie

reguliuotu jo aktyvumą ląstelėse, bet jis galimai yra dalis MNPP struktūros. Kad pilnai išaiškinti FOF1

11

ATP sintazės reikšmę MNPP formavimuisi reikalingi tolimesni tyrimai. Nėra aišku kaip tiksliai

MNPP yra reguliuojama, kas už tai atsako ir kas sudaro pačią porą. Manoma, kad už MNPP

reguliavimą atsako anksčiau su MNPP struktūra sieti baltymai. Dėl to su ATP sintaze saveikaujantis

ANT ir PiC, VDAC yra siūlomi kaip MNPP reguliuojantis kompleksai (Halestrap AP 2014).

1.1.1 Pav. Siulomas MNPP komplekso modelis. Molekulinė MNPP sandara nėra žinoma. CyP D

mitochondrinis matrikso baltymas reguliuoja MNPP formavimasį sąveikaudamas su ANT, F0F1 – ATP

sintaze ir PiC vidinėje mitochondrijos membranoje. Heksokinazė 2 (HK2) periferalinis benzidiazapeno

receptorius (PBR) ir apoptotiniai baltymai (Bax ir Bcl) saveikaudami su VDAC išorinėje

mitochondrijų membranoje kartu su kreatino kinaze (CK) tarpmembraninėje erdvėje prisideda prie

MNPP formavimosi (Javadov S. ir kt. 2017).

12

Membranos potencialas ir mitochondrijų užpildo pH reguliuojantis MNPP tai pat reguliuoja

ATP sintazę (Bernardi P ir kt. 2006). Yra pateikta įrodymų, kad MNPP gali susidaryti vien tik vidinėje

mitochondrijų membranoje atlikus tyrimus su mitoplastais – mitochondrijomis be išorinės membranos

(Sileikyte J 2011). Tačiau yra siūloma, kad nežinomi išorinės membranos komponentai gali moduliuoti

MNPP (Ricchelli F ir kt. 2011). Bcl-2 šeimos baltymai taip pat padeda MNPP formavimuisi.

Proapoptotiniai Bcl-2 šeimos baltymai Bax ir Bak sąveikauja ir sukelia MNPP formavimasi (Narita M

ir kt. 1998). Naudojantis genetiniais Bax ir Bak nutildymais buvo nustatyta, kad sumažėja išemijos

pažaida širdžiai bei reikia didesnės kalcio jonų kiekio MNPP formavimuisi (Karch J ir kt. 2013). Bax ir

Bak pašalinimas nepakeitė vidinės mitochondrijų membranos kur ir toliau buvo matomi kristų pokyčiai

atitinkantis MNPP formavimasį. Tačiau Bax ir Bak trūkumas slopino išorinės mitochondrijų

membranos laidumą, dėl ko yra atstatomas ląstelių išgyvenamumas (Karch J ir kt. 2013).

Kadangi CyP D yra vienintelis žinomas MNPP reguliacinis komponentas, jis buvo

tiriamas kaip farmakologinis taikinys apsaugant pacientus nuo širdies išemijos. Atlikti tyrimai su

gyvunų modeliais inhibuojant CyP D rodo teigiamus efektus (Javadov S ir kt. 2009). Tačiau klinikiniai

tyrimai su CyP D inhibitoriumi CsA neparodė jokio apsauginio poveikio pacientuose su miokardo

infarktu (Cung TT 2015). CyP D yra vienintelis ciklofilinas kuris po sintezės citozolyje yra

nukreipiamas į mitochondrijas kur yra nukerpama jo lokalizacijos seka ir lieka 21 kDa dyžio baltymas

(Johnson N ir kt. 1999). Fiziologinės CyP D funkcijos nėra pilnai atskleistos. CyP D katalizuoja

peptidyl-prolil jungčių cis/trans izomerizaciją baltymuose (Galat A 1993). Ciklofilinai gali katalizuoti

baltymų lankstymą ir dalyvauti baltymų translokacijoje iš citoplazmos į mitochondrijas (Lodish HF ir

Kong N 1991). CyP D gali reguliuoti mitochondrijų kalcio jonų homeostazę atidarydamas mažo

laidumo MNPP. CsA slopina kalcio jonų perėjimą iš mitochondrijų į citozolį žiurkių kardiomiocituose

(Altschuld RA ir kt. 1992). MNPP mažo laidumo virpėjimai laidus daugiausiai jonams mažesniems nei

300 Da (Ichas F ir Mazat JP 1998). Tokie trumpi MNPP atvėrimai leidžia greitai pašalinti sukauptus

kalcio jonus iš mitochondrijų (Huser J ir Blatter LA 1999). CyP D gali reguliuoti ATP sintezę per

mitochondrijų kalcio jonų koncentraciją trumpais žemo laidumo MNNP atvėrimais. Kalcio jonai

skatina mitochondrijų dehidrogenazių aktyvumą taip padidindami NADH ir FADH2 kiekius, dėl ko

pagreitėja ATP sintezė (Tarasov AI ir kt 2012). Tokiu budu CyP D gali veikti ir kitas mitochondrijų

funkcijas, kadangi mitochondrijos yra jautrios mažiems pokyčiams matrikse (Halestrap AP 1994).

Nepaisant gausaus atliktų tyrimų kiekio vis dar nėra žinoma tiksliai kas sudaro MNPP.

Dauguma baltymų anksčiau manytu kaip poros komponentų iš tiesu dalyvauja MNPP inicijavimo

13

reguliavime (Javadov S. ir kt. 2017). Šiuo metu žinomas žinios apie MNPP struktūrą apibendrintos 1

lentelėje.

Baltymas Vieta Funkcija MNPP

Ciklofilinas D Matriksas Patvirtintas

reguliacinis

komponentas

ATP sintazė Vidinė mitochondrijų

membrana

Potencialus struktūrinis

baltymas

VDAC Išrorinė mitochondrijų

membrana

Potencialus

reguliacinis baltymas

ANT Vidinė mitochondrijų

membrana

Potencialus

reguliacinis baltymas

Heksokinazė 2 Citozolis Potencialus

reguliacinis baltymas

PiC Vidinė mitochondrijų

membrana

Potencialus

reguliacinis baltymas

Kreatino kinazė Tarpmembraninė erdvė Potencialus

reguliacinis baltymas

TSPO Citozolis Potencialus

reguliacinis baltymas

Bcl 2 šeimos baltymai

( Bax, Bak)

Citozolis Potencialus

reguliacinis baltymas

1. Lentelė. MNPP sruktūros komponentai ir funkcijos.

Nepaisant to, kad vis dar trūksta žinių apie MNPP struktūrą ar jos reguliacinius komponentus,

tiriami įvairių medžiagų poveikiai MNPP. Viena iš tokių medžiagų yra azoto monoksidas (NO). Atlikti

tyrimai rodo, kad azoto monoksidas apsaugo širdį nuo išemijos sukeliamos apoptozės ir mitochondrijų

pažeidimo blokuojant MNPP formavimasį (Borutaitė V. ir kt. 2009). Tiriant šiuos poveikius galima

būtu rasti naujus kelius, kuriais galima būtu apsaugoti pacientus nuo išemijos arba kaip tai buvo

14

bandyta su CyP D blokavimu, bei atskleisti MNPP formavimosi mechanizmus ar ją sudarančius

komponentus.

1.3 Azoto monoksidas ir jo apsauginis poveikis išemijos metu

Azoto monoksidas yra svarbi signalinė molekulė, aptinkama daugelyje audinių ir dalyvaujanti

daugybėje fiziologinių procesų: reguliuojant kraujagyslių spindį, signalo perdavime neuronuose,

imuninėse organizmo reakcijose, ląstelių apoptozėje, trombocitų aktyvinime ir agregacijoje (Knott ir

Bossy-Wetzel, 2009). Azoto monoksidas organizme yra sintetinamas iš L- arginino su trijų NO

sintazių pagalba. Dvi iš šių sintazių (eNOS ir nNOS) yra ekspresuojamos pastoviai ir reguliuojamos

kalciu/kalmodulinu ir fosforilinimu. NO sintazė (iNOS) indukuojama uždegimo metu ir gamina

didesniu NO kiekius ilgesni laika. NO taip pat gali būti gaminamas nefermentiškai iš nitritų prie

mažesnio pH nei 5, pavyzdžiui išemijos metu. NO difunduoja labai greitai tiek vandenyje, tiek per

membrananas, todėl gali pasklisti po audinį labai greitai. Savaime NO fiziologinėmis koncentracijomis

(1-100 nM) nepasižymi reaktyvumu. Didžioji jo fiziologinio veikimo dalis atliekama prisijungiant prie

hemo Fe2+ esančio tirpioje guanilato ciklazėje ją aktyvuojant ir gaminant cGMP. Tačiau NO gali būti

paverstas į grupę labiau reaktyviu dalelių žinomų kaip reaktyvus azoto junginiai (RNS). Esant

didelėms koncentracijoms NO reaguoja tiesiogiai su deguonimi ir susidaro NO2, kuris toliau reaguoja

su kitu NO gamindamas N2O3. NO2 gali oksiduoti arba nitrifikuoti (pridėti NO2+ grupę) kitas

molekules. N2O3 tuo tarpu gali pridėti NO+ grupę aminams ir tioliams. NO reaguoja su O2-

sudarydamas peroksinitritą (ONOO-) kuris gali oksiduoti ar nitrifikuoti kitas molekules arba skilti

gamindamas kitas kenksmingas molekules. Nitrifikuoti tioliai gali pakeisti baltymų funkcijas. Svarbu

suprasti, kad NO ir visi jo junginiai turi skirtingas savybes kurios taip pat priklauso nuo koncentracijos

(Brown GC ir Borutaitė V 2001). eNOS yra ekspresuojama kraujagyslių endotelyje, jos pagamintas

NO yra svarbus palaikant mikrocirkuliaciją, slopinant trombocitų agregaciją, leukocitų adheziją ir

migraciją (Broos ir kt., 2011). nNOS yra ekspresuojama neuronuose. iNOS ekspresuojamas

makrofaguose, glijos ląstelėse ir vėžinėse ląstelėse, kai yra indukuojamas citokinų ir endotoksinų ir

gali susintetinti didžiulius kiekius (100-1000 kartų daugiau) NO, lyginant su eNOS ir nNOS, nes jo

aktyvavimui nereikalingas Ca2+ (Pautz ir kt., 2010). Kai iNOS yra indukuojamas, jis nenutrūkstamai

gamina NO, kol fermentas degraduoja. Nors visos NOS dalyvauja NO sintezėje ir yra panašiai

reguliuojamos, tačiau jos vaidina skirtingą vaidmenį fiziologiniuose ir pataloginiuose procesuose

(Alderton ir kt., 2001).

15

Pelėse su pašalintu eNOS genu stebima didesnė infarkto zona, nei laukinio tipo pelėse. Taip

pat su eNOS veikimas yra susijęs su terapinės hipotermijos apsauginiais efektas po širdies sustojimo,

nes pelėsė su pašalintu eNOS genu, įkvepiamas NO turėjo tokį patį apsauginį efektą, kaip ir

hipotermija (Kida ir kt., 2014).

NO gali reguliuoti MNPP atsidarymą ir mitochondrijų citochromo c patekimą į citozolį, taip

asaugant ląsteles nuo žūties. Šis MNPP atsidarymo reguliavimas labai priklauso nuo NO koncentracijų.

Mažos NO koncentracijos, kurios gali būti in vivo pagaminamos eNOS (nM) slopino MNPP

formavimasį, kai didesnės nei fiziologinės koncentracijos pagreitino MNPP formavimasį, ir

citochromo c išmetimą į citozolį išemijos metu (Brookes ir kt., 2000). NO taip pat gali reaguoti su

superoksido anionu ir sudaryti peroksinitritą ir slopinti mitochondrijų superoksido dismutazę

(Macmillan-Crow ir Cruthirds, 2001). Dėl mitochondrijų superoksido dismutazės slopinimo ląstelėje

kaupiasi superoksidas ir dar labiau pagreitėja peroksinitrito formavimasis. Susidaręs peroksinitritas gali

oksiduoti įvairias biomolekules: lipidus, nukleorūgštis ir baltymus bei taip paskatinti apoptozę.

Tyrimais parodyta, kad NO ir peroksinitritas gali oksiduoti potencialų MNPP formavimosį reguliatorių

adenino nukleotidų nešiklį pagreitinant MNPP formavimasį(Vieira ir kt., 2001). Yra duomenų, kad

organizme esant padidėjusiai NO koncentracijai, jis gali slopinančiai veikti ribonukleotidų reduktazę ir

taip blokuoti deoksiribonukleotidų bei DNR sintezę. Be šių neigiamų efektų, dar yra duomenų, kad NO

gali inicijuoti kaspazes -8,-3 ir taip pagreitinti ląstelės apoptozę (Chae ir kt., 2004).

Žinoma, kad NO turi ir apsauginių efektų išemijos metu. Apsauginiai NO efektai dažnai

siejami su cGMP/PKG aktyvavimu ir MNPP formavimosi slopinimu (Costa ir kt., 2011). cGMP/PKG

aktyvacija slopinančiai veikia L-tipo Ca2+ kanalus ir taip gali apsaugot ląsteles nuo apoptozės (Gao ir

kt., 2001).Vienas iš veiksmingiausių NO apsauginių mechanizmų yra baltymų, kurie atsakingi už

apoptozę, modifikacija nitrozilinant merkapto grupę (S-nitrozilinimas). Tyrimai parodė, kad NO

donoras SNAP priklausomai nuo koncentracijos slopino rekombinantines žmogaus kaspazes -1,-2,-3,-

4,-5,-6,-7,-8 (Li ir kt., 1997). SNAP sukeltas kaspazių slopinimas buvo nutrauktas, panaudojus DTT,

kuris pašalina iš nitrozilintų baltymų su tioliu surištas NO grupes (Mohr ir kt., 1996). Daugiau

tiesioginių įrodymų pateikta, parodžius, kad NO nitrozilindamas kaspazę-3 ties 163 pozicijoje esančiu

cisteinu ją slopina (Rossig ir kt., 1999). NO tokiu pat būdu gali reguliuoti ir šiluminio šoko baltymą 70,

kuris tiesiogiai jungiasi prie Apaf-1 ir taip slopina deoksi-ATP/citochromo c paskatintą apoptosomos

formavimąsi (Beere ir kt., 2000). Su NO apsauginiais efektais siejamas ir ląstelių transglutaminazės

slopinimas. Transglutaminazė yra aktyvi ląstelės apoptozės kaskados metu ir formuoja apoptotinius.

16

NO modifikuoja transglutaminazės merkapto grupę ją nitrozilinant ir taip slopina jos aktyvumą

(Bernassola ir kt., 1999).

Hipoksija slopina NO sintezę vykdomą NOS izoformų, nes šių fermentų veikimui yra

reikalingas deguonis. Tokiomis sąlygomis NO donorų panaudojimas gali būti efektyvus. NO donoras

(DETA/NO) sumažino kardiomiocitų pažeidimus išemijos metu aktyvuodamas PKG ir taip

blokuodamas MNPP formavimąsi bei citochromo c patekimą į citozolį (Borutaitė ir kt., 2009). PKG

apsauginio poveikio mechanizmai nėra iki galo ištirti. Manoma, PKG veikia mitochondrijas

perduodant apsauginį signalą iš citozolio į mitochondrijas per PKCε (Costa ir kt., 20011).

Baltymų kinazė G (PKG) yra 75 kDa citozolio homodimeras pirmą kartą aptiktas ir

įdentifikuotas omaro uodegos raumenyje. Žinduolių ląstelėse yra atrasti du genai koduojantys dvi šio

fermento izoformas PKG-I (PKG-Iα; PKG-Iβ) ir PKG-II, kurios yra ekspresuojamos skirtinguose

audiniuose. PKG-Iα yra aptinkama kardiomiocituose, plaučiuose, inkstuose ir smegenyse, o PKGβ

vyrauja šlapimo sistemoje (Wall ir kt., 2003). PKG yra sudaryta iš trijų funkcinių domenų: N-galo

domeno, domeno turinčio aukšto giminingumo cGMP surišimo vietą A ir mažo giminingumo cGMP

surišimo vietą B, bei Mg2+/ATP aktyvaus centro, prie kurio jungiasi kiti baltymai ir įvyksta fosfato

pernešimas nuo ATP prie baltymo – taikinio serino/treonino liekanos (Feil ir kt., 2003).

Baltymų kinazė C (PKC) yra Ser/Thr kinazių šeima, kuri pirmą kartą buvo identifikuota galvijų

smegenėlėse. PKC izofermentai yra labai konservatyvus eukariotinėse ląstelėse ir varijuoja savo

skaičiumi tarp organizmų: mielėse aptinkama 1 PKC, o žinduoliuose iki 12 skirtingų PKC izoformų,

kurios sudaro ~2% visų žmogaus kinazių genomo (Mellor ir Parker, 1998). PKC pagal savo struktūrą ir

funkcijas yra klasifikuojamos į 3 grupes: klasikinius PKC izofermentus (cPKC), kurie yra aktyvuojami

Ca2+ ir diacilglicerolio (DAG) esant fosfatidilserinui (PS) ir šią grupę sudaro PKCα, PKCβ ir PKCγ.

Neįprastas PKC izofermentus (nPKC), apimančius PKCδ, PKCε, PKCη ir PKCθ. nPKC yra

aktyvuojamos DAG ir PS, tačiau jų aktyvacijai nereikia Ca2+(Mackay ir Mochly-Rosen, 2001); atipines

PKC izofermentus (aPKC), kurie apima PKCι, PKCλ ir PKCζ. Šios kinazės yra priklausomos nuo

lipidų, tačiau jų aktyvacijai nereikia DAG ar Ca2+ (Hool, 2005). Klonavus PKCν nustatytas ir ketvirtas

kinazių pošeimis, kuris su PKCµ sudaro naują kinazių grupę (Malhotra ir kt., 2001). Faktas, kad

klasikinių PKC aktyvavimui yra reikalingas Ca2+ gali rodyti šių fermentų svarbą ląstelėms išemijos

metu, kai įvyksta pasikeitimai citozolio Ca2+ koncentracijose. Be DAG, Ca2+ ir PS reikalingų PKC

aktyvavimui, įtakos šių fermentų aktyvumui turi ir fosforilinimas (Matta ir Mobasheri, 2014).

Nustatyta, kad PKC dalyvauja įvairių ląstelių procesų reguliavime: migracijos, sekrecijos,

17

diferenciacijos, genų tranksripcijos ir transliacijos, ląstelės žūties bei jonų kanalų ir receptorių

reguliacijoje (Mochly-Rosen ir kt., 2012). Imunoblotingas yra parodęs, kad žiurkės širdyje dvi

daugiausiai aptinkamos PKC izoformos yra PKCε ir PKCδ. Aktyvuojami PKC baltymai perkeliami iš

citozolio į mebranines ląstelės dalis. Koks būtent PKC izomeras ir kur ląstelėje jis yra perkeliamas

priklauso nuo audinio ir ląstelės tipo. Pastebėta, kad net skirtingi PKC izomerai toje pačioje ląstelėje

gali būti perkeliami į skirtingas ląstelės vietas. Pastebėta, kad išemijos metu PKCδ perkeliama į

mitochondrijas ir veikia kalcio signalus, reguliuoja H2O2 sukeliama membranos potencialo praradimą,

citochromo c išskyrimą, bei aktyvuoja kaspazę-3 (Duquesnes N. ir kt., 2011). Tuo tarpu PKCε yra

perkeliama į branduoliuo, bei kitas ląstelės vidaus membranas. Padidėjes PKCε kiekis mitochondrijose

fosforilina kelis taikinius, taip apsaugant ląstelę nuo išemijos. Tai yra: inhibuoja MNPP formavimasį,

atidaro nuo ATP priklausomą kalio jonų kanalą (mitoKATP) ir padidina ATP gamybą aktyvinant COIV

(citochromo c oksidazė IV). Kalio jonų kanalai esantys vidinėje mitochondrijų membranoje paprastai

yra uždaryti. Jie atsidaro esant metaboliniam stresui, kai ATP kiekiai būna sumažėje. Pastebėta, kad

kalio jonų kanalo atsivėrimas turi apsauginį poveikį. Manoma, kad šis poveikis atsiranda reguoliuojant

matrikso tūrį ar kalcio koncentraciją, kaip tiesioginis atsakas į padidėjusia kalio jonų koncentraciją

matrikse. Tyrimai rodo, kad PKCε saveikauja su mitoKATP ir kad kanalo atsivėrimą galima reguliuoti

reguliuojant PKCε aktyvumą (Costa ir kt. 2011). Taip pat išskiriama, kad mitochondrijose gali būti 2

tipai PKCε epsilon baltymų, kurie nėra aktyvuojami vienu metu PKCε1 ir PKCε2 (Garlid K.D. ir kt.

2009). 2010 metais Budas G.R. su kolegomis aprašė naują būdą PKC epsilon baltymams patekti į

mitochondrijas reguliuojama HSP90 baltymais. Jų atlikti tyrimai rodo, kad po 35 min. išemijos ir 15

min. reperfuzijos įvyko išemijos sukeltos PKCε ir PKCδ translokacijos. Buvo parodyta, kad PKC

epsilon baltymo pernaša į mitochondrijas yra reguliuojama HSP90 baltymais kurie yra būtini apsaugant

širdis nuo išemijos pažaidų. Taip buvo parodytas ψεHSP90 – peptidini PKCε aktyvatoriaus veikimas,

kuris skatina HSP90 ir PKCε saveiką (Budas ir kt. 2010).

NO aktyvuota guanilato ciklazė gamina cGMP, kuris gali aktyvinti PKG. Tai, kad aktyvinta

PKG yra svarbi apsaugant mitochondrijas nuo išeminių pažeidimų, patvirtino tyrimas su izoliuotomis

širdies mitochondrijomis (Borutaitė ir kt., 2009). Mitochondrijų inkubacija su aktyvuota PKG

apsaugojo mitochondrijas nuo MNPP formavimosi, padidino jų gebėjimą kaupti kalcį ir sumažino

citochromo c patekimą į citozolį (Borutaitė ir kt., 2009). Mechanizmas, kaip aktyvinta PKG gali veikti

vidinius mitochondrijų baltymus ir taip apsaugoti nuo MNPP formavimosi nėra pilnai išaiškintas. Šiuo

metu yra iškeltos kelios hipotezės: aktyvuota PKG aktyvuoja PKCε1 kuri toliau aktyvuoja mitoKATP

kuri aktyvuoja PKCε2 kuris slopina MNPP formavimasį. Tačiau atlikti tyrimai su žiurkių širdimis

18

slopinant mitoKATP NO slopinantis poveikis išemijos metu išskiriamo citochromo c kiekiui nebuvo

panaikintas. Ber gali būti, kad NO per PKG slopino mitoKATP slopiklio poveikį. Kitaip mitoKATP

nedalyvauja NO apsauginiame poveikyje nuo apoptozės. Kita hipotezė yra, kad PKG kažkokiu budu

tiesiogiai veikia mitochondrinius PKC baltymus kurie slopina MNPP formavimasį. (Borutaitė ir kt.,

2009), citozolyje esanti aktyvi PKG gali perduoti signalą mitochondrijose aptinkamai PKCε, kuri

fosforilina tam tikrus mitochondrijos baltymus ir taip slopina MNPP susiformavimą (Costa ir kt.,

2005).

1.3.1 Pav. Vienas iš galimų būdų kaip PKG ir PKCε apsaugo mitochondrijas. PKG

netiesiogiai perduoda signalą išorinėje mitochondrijų membranoje esančiam baltymui R1 kuris

nežinomu keliu signalą perduoda vidinėje membranoje esančiai PKCε1 kuri atidaro nuo ATP

priklausomą kalio jonų kanalą. PKCε1 aktyvumą gali malšinti Ser/Thr baltymų fosfatazės kaip PP2A.

Dėl atviro kalio jonų kanalo padidina kalio jonų sugėrimą, padidina matrikso pH ir padidina ROS

19

gamyba. ROSai aktyvuoja PKCɛ1 ir PKCɛ2. PKCɛ2 stabdo MNPP formavimasi, taip apsaugant

ląsteles. (Garlid K.D. ir kt. 2009)

PKG ir PKC svarbą dalyvaujant apsauginiuose NO inicijuotose mechanizmuose patvirtino

tyrimai su izoliuotomis žiurkių širdies mitochondrijomis. Po 30 min. išemijos NO donoras sumažino

išemijos sukeltus pažeidimus širdies mitochondrijose: sumažėjo į citozolį patenkančio citochormo c

kiekis, pagerino mitochondrijų kvėpavimą ir sumažino mitochondrijų jautrumą kalcio jonamas (

slopinant MNPP formavimasį). Panaudojus PKG slopiklį KT5823 arba PKC slopiklį Ro-32-0432,

apsauginis NOC-18 poveikis buvo panaikintas (Borutaitė V. ir kt. 2009). Vėliau pakartojus

eksperimentus su smegenų mitochondrijomis gauti panašus rezultatai. Po 90 minučių trukmės išemijos

NO donoras NOC-18 atstatė smegenų mitochondrijų gebėjimą kaupti kalcį iki kontrolinio lygio ir taip

slopino MNPP formavimąsi, tačiau PKG ir PKC slopikliai panaikino NO donoro sukeltą efektą. Tai

rodo, kad NOC-18 slopinamas MNPP formavimasis veikia per PKG ir PKC (Arandarčikaitė ir kt.,

2015)..

Apibendrinant NO turi teigiamų ir neigiamų efektų išemijos metu. Didelės NO koncentracijos

gali veikti žalingai susidarant peroksinitritams, slopindamos mitochondrijų funkcijas ar skatindamos

MNPP formavimąsi. Fiziologinės NO koncentracijos išemijos metu veikia apsaugančiai. Apsauginiai

mechanizmai skirstomi į dvi grupes: nuo cGMP priklausomus ir nepriklausomus mechanizmus. Bcl-2

baltymo ekspresijos reguliavimas ir L-tipo Ca2+ siejami su cGMP/PKG aktyvavimu, kai kaspazių,

transglutaminazės ir NMDA receptorių nitrozilinimas yra nuo cGMP nepriklausomi mechanizmai (Gao

ir kt., 2001). Taip pat NO gali apsaugoti ląsteles nuo apoptozės aktyvuodamas tokius baltymus kaip

oksigenazę-1 ir šiluminio šoko baltymus (Beere ir kt., 2000). NO donorų panaudojimas išemijos metu

gali būti efektyvus būdas norint apsaugoti ląsteles nuo išeminių pažaidų. Daug tyrimų dar reikalinga

atlikti, kad būtų galima nustatyti optimalią NO terapijos trukmę ir koncentraciją. Taip pat būtina geriau

suprasti ir pilnai išsiaiškinti NO veikimo mechanizmus ląstelėse, kad ši medžiaga ateityje galėtų būtų

panaudota žmonių gydymui ir apsaugai nuo insulto ar infarkto sukeliamų pasekmių.

Atlikti eksperimentai rodo, kad NO gali aktyvindamas baltymų kinazes G ir C sumažinti

audinių pažeidimus išemijos metu, tačiau tikslūs mechanizmai ir taikiniai ląstelėje nėra iki galo ištirti.

NO aktyvuoja PKG per cGMP. Žinoma, kad PKG toliau perduoda signalą PKCε. Tačiau kaip ir kur

ląstelėje tai atliekama nėra tiksliai žinoma. PKC baltymai pasižymi translokacijos savybę, dėl ko

ląstelėje gali keliauti tarp skirtingų ląstelės darinių. Šiuo metu žinoma, NO apsaugo mitochondrijas nuo

20

MNPP formavimosi per PKC epsilon baltymus. Tačiau tiksliai nežinoma kaip PKC epsilon baltymai

tai atlieka. PKC baltymų translokacinės savybės galimai leidžia baltymams pereiti į mitochondrijas

(Duquesnes N. ir kt., 2011) kur jo padidėjusi koncentracija veikia mitochondrijų baltymus ir stabdo

MNPP formavimasį. Šiame darbe tyrėme NO donoro NOC-18 aktyvintos PKCε vietą ląstelėje.

Palyginus PKC epsilon vietą ląstelėje paveikus širdį NO donoru matytume ar NO apsauginis poveikis

veikia per PKC epsilon translokavimą į mitochondrijas.

21

2. Metodai

Tyrimai atliekami su Wistar žiurkėmis, kurios suskirstytos į keturias grupes: kontrolinę grupę,

išeminę grupę, išeminę su NOC-18 ir kontrolinę grupę su NOC-18. Kad širdis paveikti su NOC-18, jos

buvo perfuzuojamos. Su kitomis dvejomis grupėmis taip pat atliekama perfuzija, kad turėti vienodas

salygas. Atliekama 30 min. išemija.

2.1 Širdies perfuzija ir išemija

Žiurkės (Wistar) buvo užmigdomos naudojant CO2 , joms nutraukiamas stuburas ties kaklu. Iš

žiurkės išimama širdis ir į aorta įstatoma plastikinė kaniulė ir širdis yra perfuzuojama Langendorfo tipo

sistema. Širdims perfuzuoti naudojamas Krebs-Henseleit tirpalas: 11 mM gliukozės, 118 mM NaCl, 25

mM NaHCO3, 4,8 mM KCl, 1,2 mM KH2PO4, 1,2 mM CaCl2, 1,6 mM MgSO4, 0,7 mM Na-piruvato,

pH 7,37-7,4 ties 37 °C . Prieš naudojant tirpalas yra pašildomas iki 37 °C ir prisotinamas 95% - O2 ir

5% CO2 dujomis. Atliekant perfuzija su NO donoru į tirpalą buvo pridėta 50 mikroM NOC-18, ir su

šiuo tirpalu perfuzuojama 4 min. Po perfuzijos buvo sukeliama išemija širdis laikant 30 min. drėgnoje

termuostatuojamoje kameroje 37 °C temperatūroje. Po to širdis patalpinamos į 0,9% KCl tirpalą

leduose ir pereinama prie mitochondrijų izoliavimo.

2.2 Mitochondrijų ir citozolinės frakcijų išskyrimas

Širdis sukarpomos žirklutėmis. Ant jų užpilama 4 ml homogenizavimo terpės (10 mM NaCl, 20

mM TrisHCl, 2 mM EGTA, pH 7,7 ties 2°C temperatūra) į kurioje ištirpinta idėta 10 mg/ml proteazių

inhibitorių ir homogenizuojama mechaniniu homogenizatoriumi. Centrifuguojama 1000xg 5 min.,

toliau supernatantas perpilamas ir centrifuguojamas 6800xg 10 min. ir iš supernatanto paimama 1 ml

citozolinės frakcijos, likusi supernatanto dalis nupilama. Nuosėdos – mitochondrinė frakcija

resuspenduojama 300 μl RIPA buferiu ( 50 mM Tris-HCl, 1% Triton X-100, 0,5% natrio

deoksicholato, 0,1 % SDS, 150 mM NaCl, pH 8). Citozolinė frakcija centrifuguojama 10 min. 10000xg

ir nusiurbiamas supernatantas, taip išvalant citozolį nuo ląstelės likučių. Į citozolinę frakciją pridedama

50 μl RIPA buferio. Inkubuojama leduose 1 valandą. Po 1 valandos inkubavimo leduose visi mėginiai

nucentrifuguojami 10000xg 10 min. ir surenkami supernatantai.

22

2.3 Baltymo kiekio nustatymas

Baltymo koncentracijai nustatyti pasirinktas Biureto metodas. Į mėgintuvėlį įpilama 50 μl

mitochondrijų arba 200 μl citozolinio mėginio ir užpilama vandens iki 1 ml. Toliau užpilama 4ml

Biureto reagento. Kontrolinis tirpalas buvo sudarytas iš 1 ml vadens ir 4 ml Biureto reagento. Toliau

tirpalai inkubuojami vandens vonelėje 30 min. 37 °C temperatūroje. Po inkubavimo tirpalo optinis

tankis nustatomas spektrofotometru ties 536 nm bangos ilgiu. Kaip lyginamis tirpalas naudojama

kontrolė. Baltymo kiekis pasakaičiuojamas pagal kalibracinę kreivę sudaryta naudojantis standartiniu

žmogaus serumo albumino tirpalų.

2.4 Elektroforezė

Elektroforezei gaminami 5-8% Bis – Tris poliakrilamidiniai geliai. Koncnetruojantysis 5%

gelis: 1,12 ml H2O, 340 μl Akrilamid/Bis-akrilamido 30%, 500 μl 0,5 M Tris-HCl, pH 6,8 , 20 μl SDS

10%, 2 μl TEMED ir 20 μl APS. Skirstomasis gelis : 2,085 ml H2O, 1,2 ml Akrilamid/Bis-akrilamido

30%, 1,125 ml 1,5 M Tris-HCl, pH 8,8 , 45 μl SDS 10%, 4,5 μl TEMED ir 45 μl APS. 25 μg frakcijų

mėginio baltymo buvo praskiedžiama iki 15 μl su vandeniu. Toliau pridedama 5 μl LDS sample

buferio su 10% merkapto etanoliu ir kaitinama 10 min 90 °C temperatūroje. Pavyzdžiai trumpai

nucentrifuguojami. Elektroforezei naudojama Bio-Rad elektroforezės sistema. Elektroforezės buferis:

25 mM Tris bazės, 192 mM Glicino ir 3,45 mM SDS. Elektroforezės salygos: 30 min. 50 V ir toliau 60

min. 150 V. Taip pat naudojamas dažytas molekulinės masės žymuo - ,,Novex® Sharp Pre-stained

Protein Standard“ .

2.5 Baltymų pernešimas ant membranos

Naudojama 45 μm porų dydžio PVDF membrana kuri aktyvuojama 1 min. metanolyje ir 5 min.

laikoma pernešimo buferyje (48 mM Tris bazės, 39,2 mM Glicino ir 0,87 mM SDS ir 10% metanolio).

Po elektroforezes gelis laikomas pernešimo beferyje 10 min. Pernešimui naudojama The Novex®

Semi-Dry Blotter sistema. Sudedamas sumuštinis: 2 pernešimo buferyje išmirkyti Vatmano popieriai,

membrana, gelis, 2 išmirkyti Vatmano popieriai. Pernešimo salygos: 60 min. 20 V.

23

2.6 Blotingas ir baltymų detekcija

Po baltymų pernešimo membrana praskalaujama su TBS 0,02 % Tween 20 ( 20 mM Tris

bazės, 150 mM NaCl ir 400 μl Tween 20 50%) ir blokuojama 5% BSA ištirpintame TBS 0,02 %

Tween 20 buferyje 1 valanda kambario temperatūroje ant purtyklės. Toliau membrana yra sukarpoma

atsižvelgiant į batymų padėtį joje pagal spalvotą baltymų kokteilį parodantį tam tikro dyžio baltymų

vietą membranoje. Ant atitinkamos membranos dalies užpilami atitinkami antikūniai: PKC-epsilon

Rabbit Monoclonal Antibody (1:1500 su TBS 0,02 % Tween 20 buferyje su 5% BSA), VDAC

Polyclonal Antibody (1:1000 su TBS 0,02 % Tween 20 buferyje su 5% BSA), beta Actin Polyclonal

Antibody (1:1000 su TBS 0,02 % Tween 20 buferyje su 5% BSA). Membranos su pirminiais

antikūniais laikomos per nakti 4 °C temperatūroje. Po pirminių antikūnių mebranos plaunamos 5 kartus

po 5 min. su TBS 0,02 % Tween 20 buferiu ir 1 valanadai užpilami antriniai antikūniai - Goat Anti-

Rabbit IgG (H+L), Horseradish Peroxidase Conjugate (1:1500 su TBS 0,02 % Tween 20 buferyje su

5% BSA). Po inkubavimo membranos plaunamos 3 kartus 10 min. su TBS 0,02 % Tween 20 buferiu.

Atplautos membranos praskalaujamos PBS buferyje ir užpilama 2 ml. Amplex Red dažų ( 20 μl

Amplex Red 10 mM, 100 μl H2O2 0,075% ir 1,88 ml PBS buferio). Inkubuojama 2 min. ir matuojama

chemiliuminesencija. Gaunamos membranos nuotraukos kuriose matomi tik baltymai kuriuos atpažino

naudoti antikūnai.

2.7 Duomenų analizė

Duomenų analizė atlikta su ImageJ programa. Buvo matuojamas baltymų chemiliuminescencijos

intensyvumas membranoje ir pagal tai gaunamas santykinis ieškomo baltymo kiekis membranoje.

Gauti skaičiai buvo perskaičiuoti naudojantis ląstelėje esančiais nekintančiais baltymais (angl.

housekeeping proteins) : citozolyje – beta aktino baltymai, mitochondrijose VDAC baltymai. Šių

baltymų kiekis ląstelėje nekinta, dėl to jie naudojami kaip standartai. Eksperimentų duomenis buvo

apdoroti naudojantis Sigma Plot programine įranga. Duomenų vidurkiai buvo įvertinti naudojantis

SPSS programa, naudojant vienfaktorinę dispersinę analizę ANOVA. Duomenys palyginti pagal LSD

kriterijų. Duomenys laikomi statistiškai patikimi kai p<0,05, n=3-6.

24

2.8 Naudotos medžiagos

2-merkapto etanolis Sigma

Amplex Red Sigma

APS Bio RAD

Beta Actin Polyclonal Antibody antikūnas Thermo scientific

Bisakrilamidas (37,5:1) Roth

BSA Sigma

CaCl2 Sigma

EGTA (etilenglikol-bis-β-aminoetil-tetraacto

rūgštis)

Sigma

H2O2 Greenice

Glicinas Bio RAD

Goat Anti-Rabbit IgG (H+L), Horseradish

Peroxidase Conjugate antikūnas

Thermo scientific

KCl Sigma

KH2PO4 ROTH

LDS Sample buffer (4x) Invitrogen

NOC-18 Alexis

Metanolis Sigma

MgSO4 Sigma

Molekulinės masės žymuo, dažytas Invitrogen

NaCl ROTH

NaHCO3 ROTH

PBS Sigma

Piruvatas ( Na druska) Sigma

PKC-epsilon Rabbit Monoclonal Antibody

antikūnas

Abcam

PVDF membrana Thermo scientific

SDS Bio RAD

TEMED Bio RAD

Tris-HCl Sigma

25

Trizma bazė Sigma

Triton x-100 Sigma

Tween 20 Sigma

VDAC Polyclonal Antibody antikūnas Thermo scientific

Whatman blotingo popierius ROTH

26

3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS

Buvo atlikta westernblot analizė su wistar žiurkių širdžių mitochondrinės ir citozolinės

frakcijos baltymais. Tyrimo metu naudotos sąlygos leidžiančios gauti optimalius rezultatus: SDS

PAGE elektroforezės gelio koncentracija 8 % leidžianti geriausiai išskirstyti gelyje mūsų ieškomų

baltymų diapazoną - nuo 100 kDa iki 20 kDa. Baltymų frakcijų inkubacijos laikas RIPA buferyje – 1

h., kad suardyti membranas ir išlaisvinti baltymus. Baltymo kiekis dedamas į šulinėlį leidžiantis mums

aptikti visus ieškomus baltymus, bet kartu ir nepersotinant gelio ir membranos baltymais – 25 μg. Taip

pat buvo atsirinktos baltymų pernešimo laikas – 60 min., kad visi baltymai esantys gelyje butu pernešti

ant membranos jų neprarandant. Tam po pernešimo buvo dažomi geliai ir membranos tikrinant ar visi

baltymai perėjo ir ilginant pernešimo laiką iki patenkinamo rezultato. Parinkta TWEEN 20 naudojamo

praplovimo blokavimo ir antikūnų tirpale 0,02% koncentracija ir 5% BSA koncentracija blokavime,

bei skiedžiant antikūnus tam, kad užtikrinti kuo mažesnį nespecifini antikūnų prisirišimą ir tuo pačiu

sumažinti foną atliekant chemiliuminescencinę analizę. Dėl tu pačių priežasčių buvo atsirinkta

kiekvieno antikūno koncentracija. Toliau buvo atsirinktos optimaliausi membranos vaizdinimo

parametrai, tokie kaip: inkubacijos laikas su chemiliuminescenciniais dažais prieš fotografuojant,

išlaikymas fotografuojant ir kt. prietaiso parametrai. Visos šios sąlygos keičiasi priklausomai nuo

ieškomų baltymų, dėl ko jos turi būti atsirinktos norint gauti kokybiškus rezultatus.

27

3.1 Membranos

Membrana po pernešimo buvo kerpama į keturias dalis kaip parodyta 3.1.1 pav. Skirtingos

membranos dalys buvo inkubuojamos su skirtingais antikūniais. Membranose matomas ryškus

skirtumas tarp mitochondrinių frakcijų (a,c dalys), bei citozolinių (b, d dalys). Citozolių mėginiuose

atsikartojančiai buvo randama daugiau baltymų, nors jų buvo dedamas vienodas kiekis į visus

šulinėlius - 25 μg. 3.1.2. pav. matoma membrana su nudažytais baltymais naudojant PonceuS dažus.

3.1.1. Pav. Pilna membrana, prieš inkubavimą su pirminiais antikūnais kerpama išilgai brukšniuotų

linijų. Gaunamos 4 membranos dalys: a, b, c ir d.

28

3.1.2. Pav. Membrana su naudažytais baltymais naudojant PonceuS dažus. Kairėje matomi

mitochondrijų frakcijų baltymai, dešinėje citozolinių frakcijų baltymai. Į visus šulinėlius dėta 25 μg

baltymų.

29

3.1.3 Pilnos membranos a dalis atitinkanti mitochondrijų PKC epsilon baltymus.

Membranos a dalyje yra mitochondrijų baltymai kurių dydis yra didesnis nei ~ 70 kDa. Ši

membrana buvo veikiama anti PKC epsilon antikūnais. Matomos dvi juostos baltymų, ties 84 ir 82 kDa

dydžiais. Jos atitinka PKC epsilon baltymus, pagal antikūno gamintojo aprašymą. Dėl ko baltymai

išsiskiria į 2 juostas nėra žinoma. Baltymų analizei buvo naudojamas abiejų juostu intensyvumas.

Mitochondrijoms buvo atliekami 2 pakartojimai, 1 su 50 μg baltymo ir 1 su 25 μg baltymo, kad

užtikrinti ryškų rezultatą. Žiurint nuo kairės membranos dalies link dešinės buvo dedami mėginiai: 50

μg kontrolės mitochondrijų baltymų, 50 μg išeminės širdies mitochondrijų baltymų, 50 μg išeminės

širdies paveiktos NOC-18 mitochondrijų baltymų ir sekantis 3 šulinėliai atitinkamai tik po 25 μg.

3.1.4 Pav. Membranos b dalis atitinkanti citozolio PKC epsilon baltymus.

Membranos b dalyje kaip ir a dalyje yra baltymai didesni už ~ 70 kDa. Čia buvo citozolio

baltymai. Membrana buvo veikiama anti PKC epsilon baltymais kaip a dalis. Žiurint iš kairės į dešinę

sudėta po 25 μg į šulinėlį : citozolinių baltymų iš kontrolinės, išeminės ir išeminės paveiktos NOC-18

širdžių.

30

3.1.5 Pav. Mebranos c dalis atitinkant mitochondrijų vidinės kontrolės baltymus – VDAC.

C dalyje yra baltymai mažesni už 70 kDa ir jį buvo naudota mitochondrijų baltymų vidinei

kontrolei. Membrana buvo veikta anti VDAC antikūnais. Kadangi mitochondrijose yra ypač daug

VDAC baltymų ir jų koncentracija nesikeičia kintant sąlygoms, dėl to pagal šiuos baltymus galima

perskaičiuoti inešto į šulinėlį baltymo kiekį. Ties 31 kDa matoma viena juosta baltymų kurie pagal

dydį atitinka VDAC baltymus. Žiurint nuo kairės į dešinę užnešti baltymai atitinka a membraną.

3.1.6 Pav. Membranos d dalis atitinkanti citozolio vidinės kontrolės baltymus – beta –aktiną.

Kadangi mitochondrijų baltymai skiriasi nuo citozolinių, citozolių baltymų vidinei kontrolei

turėjo būti pasirinktas baltymas kurio kiekis nekinta ląstelėje, kintant salygoms. Tam buvo pasirinktas

beta – aktinas. Membranos d dalis atitinka b membraną ir joje matomi baltymai yra mažesni nei ~ 70

31

kDa. Membrana buvo veikta anti beta – Actin antikūnais. Ties 42 kDa buvo aptikta viena juosta

baltymų kurie atitinka beta aktiną. Pagal šių baltymų intensyvumą buvo perskaičiuojamas citozolyje

aptiktos PKC epsilon intensyvumas.

3.2 Mitochondrijų ir Citozolio frakcijų baltymų kiekybinė analizė

Analizuojant duomenis gauti PKC epsilon baltymų intensyvumai buvo perskaičiuoti pagal

atitinkamus jiems vidinių kontrolių baltymų intensyvumus. Iš gautų rezultatų nubraižyti grafikai ir

atlikta statistinė analizė naudojant SPSS program.

32

1. Grafikas. ImageJ programa apdoroti rezultatai mitochondrinėse

frakcijose.Atlikta statistinė analizė neparodė statistiškai patikimo skirtumu tarp grupių

naudojant LSD kriteriju kai p<0,05, n=3-6.

1 Grafike esantys duomenys rodo, kad išemijos metu lyginant su kontrole mitochondrijose

statistiškai patikimai PKC epsilon kiekis nekito tarp grupių. Paveikus kontrolines širdis su NO donoru

PKC epsilon kiekis išliko toks pats. Statistiškai patikimo skirtumo tarp išemijos grupės ir išemijos prieš

tai paveiktos su NOC-18 nebuvo.

2. Grafikas. ImageJ programa apdoroti rezultatai citozolinėse frakcijose.*-statistiškai reikšmingas

skirtumas lyginant su kontroline grupe pagal LSD kriterijų kai p<0,05, n=3-6 išskyrus

2 Grafiko rezultatai parodo, kad po 30 min. išemijos statistiškai patikimai citozolyje PKC epsilon

baltymo kiekis padidėjo 2,34 karto lyginant su kontrole. NO donoro paveiktose širdyse po 30 min.

33

išemijos baltymo kiekis statistiškai patikimai padidėjo 2.16 karto lyginant su kontrole. Paveikus

kontrolinę širdį su NO PKC epsilon baltymo kiekis statistiškai patikimai nepakito.

Šie rezultatai parodo, kad apsauginis NOC-18 poveikis nepasireiškia PKC epsilon perkėlimu

iš citozolio į mitochondrijas. Tačiau išemijos metu citozolyje PKC epsilon baltymo kiekis kinta. Ir

padidėja daugiau nei 2 kartus. Papildomai PKC epsilon išemijos metu galėjo padaugėti baltymui

translokuojantis iš kitų ląstelės vietų. Tai paaiškintu po išemijos padidėjusius PKC epsilon kiekius.

Taip pat buvo atlikta širdies perfuzija su NO donoru, bet be išemijos. PKC epsilon kiekis visiškai

nepakito lyginant su paprasta kontrole. PKC epsilon statistiškai patikimai nebuvo perkeltas iš citozolio

į mitochondrijas, galbūt tam pritrūko laiko arba nebuvo pakankamai aktyvinamas HSP90 atsakingas už

PKC epsilon translokaciją į mitochondrijas (Budas GR ir kt 2010). NOC 18 poveikio PKC epsilon

translokacijai taip pat nebuvo pastebėta. Reikia daugiau tyrimų leisenčiu suprasti kas vyksta su PKC

epsilon baltymu NO sukelto apsauginio poveikio metu, kad jį suprasti.

34

IŠVADOS

1. NO donoras NOC-18 po 30 min. išemijos nesukelia PKC epsilon translokacijos

mitochondrijose ar citozolyje.

2. Išemijos metu citozolinėje frakcijoje esančios PKC epsilon statistiškai patikimai padidėja

daugiau nei 2 kartus lyginant su kontrole: išemijoje 2,34 kartus, išemijoje prieš tai širdį

paveikus NO donoru NOC-18 2.16 karto.

3. Išemijos metu mitochondrijų frakcijos PKC epsilon kiekis statistiškai patikimai nepakito.

35

LITERATŪROS SĄRAŠAS

1. Alderton WK, Cooper CE, Knowles RG. Nitric oxide synthases: structure, function and inhibition.

Biochem J. 2001; 357:593-615.

2. Altschuld RA, Hohl CM, Castillo LC, Garleb AA, Starling RC et al (1992) Cyclosporin inhibits

mitochondrial calcium efflux in isolated adult rat ventricular cardiomyocytes. Am J Physiol

262:H1699–H1709

3. Arandarcikaite O, Jokubka R, Borutaite V. Neuroprotective effects of nitric oxide donors NOC-18

against ischemia-induced mitochondrial damages: role of PKG and PKC. Neurosci Lett. 2015;

586:65-70.

4. Budas GR, Churchill EN, Disatnik M, Sun L, Mochly-Rosen D. 2010 Mitochondrial import of

PKC1 is mediated by HSP90: a role in cardioprotection from ischaemia and reperfusion injury

Cardiovascular Research 88, 83–92

5. Baines CP, Kaiser RA, Sheiko T, Craigen WJ, Molkentin JD (2007) Voltage-dependent anion

channels are dispensable for mitochondrial-dependent cell death. Nat Cell Biol 9:550–555

6. Basso E, Fante L, Fowlkes J, Petronilli V, Forte MA, Bernardi P (2005) Properties of the

permeability transition pore in mitochondria devoid of Cyclophilin D. J Biol Chem 280:18558–

18561

7. Beere HM, Wolf BB, Cain K, Mosser DD, Mahboubi A, Kuwana T, Tailor P, Morimoto RI,

Cohen GM, Green DR. Heat-shock protein 70 inhibits apoptosis by preventing recruitment of

procaspase-9 to the Apaf-1 apoptosome. Nature Cell Biol. 2000; 2:469-475.

8. Bernardi P, Krauskopf A, Basso E, Petronilli V, Blachly-Dyson E, Di Lisa F, Forte MA (2006)

The mitochondrial permeability transition from in vitro artifact to disease target. FEBS J

273:2077–2099

9. Bernassola F, Rossi A, Melino G. Regulation of transglutaminases by nitric oxide. Ann NY Acad

Sci. 1999; 887:83-91.

10. Beutner G, Ruck A, Riede B, Brdiczka D (1998) Complexes between porin, hexokinase,

mitochondrial creatine kinase and adenylate translocator display properties of the permeability

transition pore. Implication for regulation of permeability transition by the kinases. Biochim

Biophys Acta 1368:7–18

36

11. Bochaton T, Crola-Da-Silva C, Pillot B, Villedieu C, Ferreras L et al (2015) Inhibition of

myocardial reperfusion injury by ischemic postconditioning requires sirtuin 3-mediated

deacetylation of cyclophilin D. J Mol Cell Cardiol 84:61–69

12. Bonora M, Bononi A, DeMarchi E, Giorgi C, Lebiedzinska M, Marchi S, Patergnani S, Rimessi A,

Suski JM, Wojtala A, Wieckowski MR, Kroemer G, Galluzzi L, Pinton P (2013) Role of the c

subunit of the FO ATP synthase in mitochondrial permeability transition. Cell Cycle 12:674–683

13. Borutaite V, Jekabsone A, Morkuniene R, Brown GC. Inhibition of mitochondrial permeability

transition prevents mitochondrial dysfunction, cytochrome c release and apoptosis induced by

heart ischemia. J Mol Cell Cardiol. 2003; 35:357-366.

14. Borutaite V, Morkuniene R, Arandarcikaite O, Jekabsone A, Barauskaite J, Brown GC. Nitric

oxide protects the heart from ischemia-induced apoptosis and mitochondrial damage via protein

kinase G mediated blockage of permeability transition and cytochrome c release. J Biomed Sci.

2009; 16:70.

15. Borutaite V, Toleikis A, Brown GC. In the eye of the storm: mitochondrial damage during heart

and brain ischaemia: review article. The FEBS journal. 2013; 280(20):4999-5014.

16. Brookes PS, Salinas EP, Darley-Usmar K, Eiserich JP, Freeman BA, Darley-Usmar VM,

Anderson PG. Concentration-dependent effects of nitric oxide on mitochondrial permeability

transition and cytochrome c release. J Biol Chem. 2000; 275:20474-20479.

17. Broos K, Feys HB, De Meyer SF, Vanhoorelbeke K, Deckmyn H. Platelets at work in primary

hemostasis. Blood Rev. 2011; 25:155-167.

18. Brown GC, Borutaite V. Nitric oxide, cytochrome c and mitochondria. Biochem Soc Symp. 1999;

66:17-25.

19. Brown GC, Borutaite V. Nitric Oxide, Mitochondria, and Cell Death critical review 2001 IUBMB

Life, 52: 189–195

20. Chae IH, Park KW, Kim HS, Oh BH. Nitric oxide induced apoptosis is mediated by Bax/Bcl-2

gene expression, transition of cytochrome c, and activation of caspase-3 in rate vascular smooth

muscle cells. Clin Chim Acta. 2004; 341:83-91.

21. Chakrabarti S, Hoque AN, Karmazyn M. A rapid ischemia-induced apoptosis in isolated rat hearts

and its attenuation by the sodium-hydrogen exchange inhibitor HOE 642 (cariporide). J Mol Cell

Cardiol. 1997 Nov;29(11):3169-74.

37

22. Costa AD, Garlid KD, West IC, Lincoln TM, Downey JM, Cohen MV, Critz SD. Protein kinase G

transmits the cardioprotective signal from cytosol to mitochondria. Circ Res. 2005 Aug 19;

97(4):329-36.

23. Costa C, Tozzi A, Siliquini S, Galletti F, Cardaioli G, Tantucci M, Pisani F, Calabresi P. A critical

role of NO/cGMP/PKG dependent pathway in hippocampal post-ischemic LTP: modulation by

zonisamide. Neurobiol Dis. 2011; 44:185-191.

24. Connern CP, Halestrap AP (1994) Recruitment of mitochondrial cyclophilin to the mitochondrial

inner membrane under conditions of oxidative stress that enhance the opening of a

calciumsensitive non-specific channel. Biochem J 302:321–324

25. Crompton M. The mitochondrial permeability transition pore and its role in cell death. Biochem J.

1999; 341:233-249.

26. Cung TT, Morel O, Cayla G, Rioufol G, Garcia-Dorado D et al (2015) Cyclosporine before PCI in

patients with acute myocardial infarction. N Engl J Med 373:1021–1031

27. Duquesnes N., Lezoualc'h F., Crozatier B. PKC-delta and PKC-epsilon: Foes of the same family

or strangers? Journal of Molecular and Cellular Cardiology 51 (2011) 665–673

28. Feil R, Lohmann SM, de Jonge H, Waler U, Hofmann F. Cyclic GMP-dependent protein kinases

and the cardiovascular system: insights from genetically modified mice. Circ Res. 2003: 93:907-

916.

29. Frey TG, Mannella CA. The internal structure of mitochondria. Trends Biochem Sci. 2000;

25:319-324.

30. Galat A (1993) Peptidylproline cis-trans-isomerases: immunophilins. Eur J Biochem 216:689–707

31. Gao F, Gong B, Christopher TA, Lopez BL, Karasawa A, Ma XL. Anti-apoptotic effect of

benidipine, a long-lasting vasodilation calcium antagonist, in ischaemic/reperfused myocardial

cells. Br J Pharmacol. 2001; 132:869-878.

32. Gautheron D. C. Mitochondrial Oxidative Phosphorylation and Respiratory Chain: Review. 1984

33. Garlid K. D., Costa A.D.T., Quinlan C. L., Pierre S. V., Santos P. D. Cardioprotective signaling to

mitochondria review article Journal of Molecular and Cellular Cardiology 46 (2009) 858–866.

34. Giorgio V, von Stockum S, Antoniel M, Fabbro A, Fogolari F, Forte M, Glick GD, Petronilli V,

Zoratti M, Szabo´ I, Lippe G, Bernardi P (2013) Dimers of mitochondrial ATP synthase form the

permeability transition pore. Proc Natl Acad Sci USA 110:5887–5892

38

35. Griffiths EJ, Halestrap AP (1991) Further evidence that cyclosporin A protects mitochondria from

calcium overload by inhibiting a matrix peptidyl-prolyl cis–trans isomerase. Implications for the

immunosuppressive and toxic effects of cyclosporin. Biochem J 274:611–614

36. Goldenthal M. J. 2016 Mitochondrial involvement in myocyte death and heart failure 2016

37. Gustafsson AB, Gottlieb RA. Mechanisms of apoptosis in the heart. J Clin Immunol. 2003;

23:447-459.

38. Gutie´rrez-Aguilar M, Douglas DL, Gibson AK, Domeier TL, Molkentin JD, Baines CP (2014)

Genetic manipulation of the cardiac mitochondrial phosphate carrier does not affect permeability

transition. J Mol Cell Cardiol 72:316–325

39. Halestrap AP (1994) Regulation of mitochondrial metabolism through changes in matrix volume.

Biochem Soc Trans 22:522–529

40. Halestrap AP, Davidson AM Inhibition of Ca2+ induced large-amplitude swelling of liver and heart

mitochondria by cyclosporin is probably caused by the inhibitor binding to mitochondrial-matrix

peptidyl-prolyl cis–trans isomerase and preventing it interacting with the adenine nucleotide

translocase. 1990 Biochem J 268:153–160

41. Halestrap AP (2014) The C ring of the F1Fo ATP synthase forms the mitochondrial permeability

transition pore: a critical appraisal. Front Oncol 4:234

42. Haworth RA, Hunter DR (1979) The Ca2+ induced membrane transition in mitochondria. II.

Nature of the Ca 2þ trigger site. Arch Biochem Biophys 195:460–467

43. Hool LC. Protein kinase C isozyme selective peptides – a current view of what they tell us about

location and function of isozymes in the heart. Curr Pharm Des. 2005; 11(4):549-59.

44. Huser J, Blatter LA (1999) Fluctuations in mitochondrial membrane potential caused by repetitive

gating of the permeability transition pore. Biochem J 343(Pt 2):311–317

45. Javadov S, Karmazyn M, Escobales N (2009) Mitochondrial permeability transition pore opening

as a promising therapeutic target in cardiac diseases. J Pharmacol Exp Ther 330:670–678

46. Javadov S., Jang S., Parodi‑ Rullan R., Khuchua Z.,Kuznetsov A.V. Mitochondrial permeability

transition in cardiac ischemia–reperfusion: whether cyclophilin D is a viable target for

cardioprotection? Review 2017 Cell. Mol. Life Sci.

47. Johnson N, Khan A, Virji S, Ward JM, Crompton M (1999) Import and processing of heart

mitochondrial cyclophilin D. Eur J Biochem 263:353–359

39

48. Ichas F, Mazat JP (1998) From calcium signaling to cell death: two conformations for the

mitochondrial permeability transition pore. Switching from low- to high-conductance state.

Biochim Biophys Acta 1366:33–50

49. Kida K, Shirozu K, Yu B, Mandeville JB, Bloch KD, Ichinose F. Beneficial effects of nitric oxide

on outcomes after cardiac arrest and cardiopulmonary resuscitation in hypothermia-treated mice.

Anesthesiology. 2014; 120:880-889.

50. Knott AB, Bossy-Wetzel E. Nitric oxide in health and disease of the nervous system. Antioxid

Redox Signal. 2009; 11:541-554.

51. Kokoszka JE, Waymire KG, Levy SE, Sligh JE, Cai J, Jones DP, MacGregor GR, Wallace DC.

The ADP/ATP translocator is not eesential for the mitochondrial permeability transition pore.

Nature 2004;427: 461-465.

52. Lemasters JJ, Nieminen AL, Qian T, Trost LC, Elmore SP, Nishimura Y, Crowe RA, Cascio WE,

Bradham CA, Brenner DA, Herman B (1998) The mitochondrial permeability transition in cell

death: a common mechanism in necrosis, apoptosis and autophagy. Biochim Biophys Acta

1366:177–196

53. Leung AWC, Varanyuwatana P, Halestrap AP. The mitochondrial phosphate carrier interacts with

cyclophilin D and may play a key role in the permeability transition. J Biol Chem. 2008;

283:26312-26323.

54. Li J, Billiar TR, Talanian RV, Kim YM. Nitric oxide reversibly inhibits seven members of the

caspase family via S-nitrosylation. Biochem Biophys Res Commun. 1997; 240:419-424.

55. Linard D, Kandlbinder A, Degand H, Morsomme P, Dietz KJ et al (2009) Redox characterization

of human cyclophilin D: identification of a new mammalian mitochondrial redox sensor? Arch

Biochem Biophys 491:39–4

56. Lodish HF, Kong N (1991) Cyclosporin A inhibits an initial step in folding of transferrin within

the endoplasmic reticulum. J Biol Chem 266:14835–1483

57. Macmillan-Crow LA, Cruthirds DL. Manganese superoxide dismutase in disease. Free Radic Res.

2001; 34:325-336.

58. Mackay K, Mochly-Rosen D. Localization, anchoring, and functions of protein kinase C isozymes

in the heart. J Mol Cell Cardiol. 2001; 33(7):1301-7

59. Malhotra A, Kang BP, Opawumi D, Belizaire W, Meggs LG. Molecular biology of protein kinase

C signaling in cardiac myocytes. Mol Cell Biochem. 2001; 225(1):97-107.

40

60. Matta C, Mobasheri A. Regulation of chondrogenesis by protein kinase C: Emerging new roles in

calcium signaling. 2014; 26:979-1000.

61. Mellor H, Parker PJ. The extended protein kinase C superfamily. Biochem J. 1998; 332:281-292.

62. Mochly-Rosen D, Das K, Grimes KV. Protein kinase c, an elusive therapeutic target? Nat Rev

Drug Discov. 2012 Dec; 11(12):937-57.

63. Mohr S, Stamler JS, Brune B. Posttranslational modification of glyceralaldehyde-3-phosphate

dehydrogenase by S-nitrosylation and subsequent NADH attachment. J Biol Chem. 1996;

271:4209-4214.

64. Narita M, Shimizu S, Ito T, Chittenden T, Lutz RJ, Matsuda H, Tsujimoto Y (1998) Bax interacts

with the permeability transition pore to induce permeability transition and cytochrome c release in

isolated mitochondria. Proc Natl Acad Sci USA 95:14681–14686

65. Pasdois P, Parker JE, Griffiths EJ, & Halestrap AP (2011) The role of oxidized cytochrome c in

regulating mitochondrial reactive oxygen species production and its perturbation in ischaemia.

Biochem J, 436, 493-505.

66. Pautz A, Art J, Hahn S, Nowag S, Voss C, Kleinert H. Regulation of the expression of inducible

nitric oxide synthase. Nitric Oxide. 2010; 23:75-93.

67. Rasola A, Sciacovelli M, Chiara F, Pantic B, Brusilow WS et al (2010) Activation of

mitochondrial ERK protects cancer cells from death through inhibition of the permeability

transition. Proc Natl Acad Sci USA 107:726–731

68. Ricchelli F, S Šileikyte J, Bernardi P (2011) Shedding light on the mitochondrial permeability

transition. Biochim Biophys Acta1807:482–490

69. Rossig L, Fichtlscherer B, Breitschopf K, Haendeler J, Zeiher AM, Mulsch A, Dimmeler S. Nitric

oxide inhibits caspase-3 by S-nitrosation in vivo. J Biol Chem. 1999; 274:6823-6826.

70. Savage MK, Reed DJ (1994) Oxidation of pyridine nucleotides and depletion of ATP and ADP

during calcium- and inorganic phosphate-induced mitochondrial permeability transition. Biochem

Biophys Res Commun 200:1615–162041.

71. Shulga N, Wilson-Smith R, Pastorino JG (2010) Sirtuin-3 deacetylation of cyclophilin D induces

dissociation of hexokinase II from the mitochondria. J Cell Sci 123:894–90299

72. Shulga N, Pastorino JG (2010) Ethanol sensitizes mitochondria to the permeability transition by

inhibiting deacetylation of cyclophilin-D mediated by sirtuin-3. J Cell Sci 123:4117–4127

41

73. Sileikyte J, Blachly-Dyson E, Sewell R, Carpi A, Menabo R, Di Lisa F, Ricchelli F, Bernardi P,

Forte M (2014) Regulation of the mitochondrial permeability transition pore by the outer

membrane does not involve the peripheral benzodiazepine receptor (TSPO). J Biol Chem

289:13769–13781

74. Sileikyte J, Petronilli V, Zulian A, Dabbeni-Sala F, Tognon G, Nikolov P, Bernardi P, Ricchelli F

(2011) Regulation of the inner membrane mitochondrial permeability transition by the outer

membrane translocator protein (peripheral benzodiazepine receptor). J Biol Chem 286:1046–1053

75. Sun J, Steenbergen C, Murphy E (2006) S-nitrosylation: Norelated redox signaling to protect

against oxidative stress. Antioxid Redox Signal 8:1693–1705

76. Szabo I, De Pinto V, Zoratti M (1993) The mitochondrial permeability transition pore may

comprise VDAC molecules. II. The electrophysiological properties of VDAC are compatible with

those of the mitochondrial megachannel. FEBS Lett 330:206–210

77. Taanman JW. The mitochondrial genome: structure, transcription, translation and replication.

Biochim Biophys Acta. 1999 Feb 9; 1410(2):103-23.

78. Tarasov AI, Griffiths EJ, Rutter GA (2012) Regulation of ATP production by mitochondrial

Ca(2+). Cell Calcium 52:28–35

79. Vieira HL, Belzacq AS, Haouzi D, Bernassola F, Cohen I, Jacotot E, Ferri KF, El Hamel C, Bartle

LM, Melino G, Brenner C, Goldmacher V, Kroemer G. The adenine nucleotide translocator: a

target of nitric oxide, peroxynitrite, and 4-hydroxynonenal. Oncogene. 2001; 20:4305-4316.

80. Wall ME, Francis SH, Corbin JD, Grimes K, Richie-Jannetta R, Kotera J. Macdonald BA, Gibson

RR, Trewhella J. Mechanisms associated with cGMP binding and activation of cGMP-dependent

protein kinase. Proc Natl Acad Sci USA. 2003; 100:2380-2385.