y adulta - montpellier · la historia de la diabetes mellitus es tan vieja como la propia historia...

Dr. Gustavo D. Frechtel

Dr. Edgardo Poskus

DIABETES MELLITUS

AUTOINMUNE DE INICIO

EN EDAD INFANTO-JUVENIL

Y ADULTA

Bases racionales para

el diagnóstico diferencial

y el tratamiento

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PRÓLOGO

La historia de la diabetes mellitus es tan vieja como la propiahistoria del hombre. Sin embargo se tardó bastante, aún den-tro de la Era Contemporánea cuando la Medicina ya alcanzaun grado de considerable desarrollo, para comprender que ladiabetes constituye una patología más heterogénea que losospechado inicialmente. Las dos variantes mayores, reconoci-das formalmente desde la década de 1930, eran la diabetes in-sulinodependiente (denominada actualmente diabetes tipo 1),típica de los niños y jóvenes y la diabetes no insulinodepen-diente (denominada actualmente diabetes tipo 2), típica de losadultos. Desde entonces los nuevos nombres incorporados pa-ra las formas “atípicas”, y la anarquía en la nomenclatura pa-ra las formas intermedias, condujeron a una confusión clasifi-catoria que en buena medida perdura en la actualidad. Así,fueron surgiendo sucesivamente nombres alternativos para lasnuevas variantes genéticas: en los MODY se reconocieron 6 ti-pos; en las variantes de diabetes emergentes en los adultos,asociadas con autoinmunidad, las de tipo 1 se separaban pe-numbrosamente de las de “tipo 1.5”. De ahí que surgiera ini-cialmente el nombre de diabetes tipo 2-IR (insulinorrequirien-te), aunque después quedara comprendido en la definición ge-neral de “LADA”. Posteriormente esta nomenclatura parecióimprecisa y se propuso la subdivisión en LADA-tipo 1 y LADA-tipo 2. El problema central no reside en los formalismos de no-menclatura, sino en la incertidumbre diagnóstica, la cual a suvez se propaga en intervenciones terapéuticas erróneas o ins-taladas a destiempo. La administración indebida de antidiabé-ticos orales, principalmente del tipo sulfonilureas y la poster-gación del pase al tratamiento insulínico en los pacientes conagresión inmunológica en curso hacia los islotes, son los casosmás representativos de desaciertos terapéuticos. La única luztendiente a despejar ese panorama parece ser el estableci-miento firme de las bases etiopatogénicas que conducen a losdistintos fenotipos. Los intentos clasificatorios más recientes, y por ende el enfo-que terapéutico preciso de los distintos modelos de diabetes,ya no provienen de supuestos refinamientos en el estudio “clá-sico” de los fenotipos, sino en la incorporación de los elemen-tos de apoyo diagnóstico que provee la Genética y la Inmuno-logía. Dentro de ésta última se ha producido un notable avan-ce, principalmente en el área de la autoinmunidad. A partir deesa evolución del conocimiento hoy se sabe, por ejemplo, quela diabetes asociada a autoinmunidad, tradicionalmente asimi-

Diabetes mellitus autoinmune de inicio en edad infanto-juvenil y adulta

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INDICE

PRÓLOGO

SECCIONES

1. GENÉTICA GENERAL.

2. DIABETES TIPO MODY: MODELOS DE ENFERMEDADES

MONOGÉNICAS.

3. POLIMORFISMOS EN SALUD Y EN ENFERMEDAD. DIABETES ENTRE LAS ENFERMEDADES POLIGÉNICAS.

4. BASES DE INMUNOLOGÍA GENERAL Y AUTOINMUNIDAD.

5. INMUNOGENÉTICA Y DIABETES MELLITUS AUTOINMUNE.

6. LOS MÉTODOS ANALÍTICOS PARA EL APOYO DIAGNÓSTICO

DE DIABETES.

7. LA DIABETES AUTOINMUNE EMERGENTE EN EDAD

INFANTO-JUVENIL Y ADULTA.

8. CASOS MODELO.

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Finalmente, se incorporan algunos casos modelos, escogidosentre las fichas de la actividad multiprofesional que realizanconjuntamente los autores desde hace varios años, en los ám-bitos de los centros asistenciales y de investigación en los cua-les actúan: el Dr. G. D. Frechtel en la División Genética del Hos-pital de Clínicas, J. de San Martín, UBA y el Dr. E. Poskus, en laCátedra de Inmunología e Instituto de Estudios de la Inmuni-dad Humoral, Facultad de Farmacia y Bioquímica, UBA.

1. GENÉTICA GENERAL

EL ESTADO ACTUAL DEL DESARROLLO DE LA GENÉTICA MOLECULAR

Las herramientas con que cuenta la Biología Molecular para elestudio de las enfermedades hereditarias han ido avanzandodesde fines de la década del 70 hasta la actualidad. Desde latécnica de Southern Blot en 1975, con la utilización de enzimasde restricción, transferencia de ADN a soporte sólido, e hibridi-zación con sondas marcadas con 32P, se posibilitó el estudio degrandes tramos de secuencia de ADN. La técnica denominadaPCR, desarrollada a partir de 1990, permitió la amplificación enmillones de veces de una pequeña secuencia de ADN y tambiénfacilitó el estudio de mutaciones. Las técnicas de clonado y cul-tivo para permitir la multiplicación de fragmentos de ADN tam-bién han facilitado enormemente el trabajo en el laboratorio.La irrupción de estas diferentes metodologías acopladas a PCRpermitieron el estudio de mutaciones puntuales, pequeñas inser-ciones o deleciones, e incluso el screening masivo de grandes po-blaciones de enfermos con una determinada patología. El avan-ce en las técnicas de secuenciación, incluyendo la utilización ac-tual de la secuenciación automática de nucleótidos, también hafacilitado en muchos casos la búsqueda directa de mutaciones. El desarrollo del conocimiento en el genoma humano favore-ce la identificación de la secuencia de nuevos genes y la deter-minación de nuevos polimorfismos, con el objetivo final de co-nocer la secuencia completa de las 6.000 millones de pares debases (pb) que constituyen el genoma humano diploide.Las actuales técnicas de clonado en vectores de expresión yluego el estudio funcional de la proteína expresada, permitenclarificar con exactitud si una alteración genética tiene reper-cusión sobre la actividad funcional de la proteína. De esta ma-nera, con la actual contribución de la tecnología y las metodo-logías con que cuenta la Biología Molecular se están estudian-do los aspectos estructurales y funcionales de los genes. Enparticular, los trabajos de la última década aplicados al estudio


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lada a la diabetes tipo 1 infanto-juvenil, se encuentra mayori-tariamente expresada entre los pacientes diabéticos diagnosti-cados en edad adulta, aunque su prevalencia relativa sea me-nor que la registrada en pediatría. Inversamente, la diabetesno insulinodependiente, con un grado variable de insulinorre-sistencia periférica y defecto secretorio de las células beta, semanifiesta no sólo entre los adultos, sino en forma crecienteentre niños y jóvenes, asociada con sobrepeso y obesidad. Esarecíproca “invasión” de las fronteras de la clasificación originalen diabetes tipo 1 y tipo 2, no sólo torna cada vez más penum-brosa la intersección del diagrama epidemiológico, sino queexplica la existencia frecuente de incertidumbres diagnósticasen la práctica asistencial y los errores en los tratamientos.El esfuerzo que deben realizar los profesionales involucradosen la medicina asistencial de la diabetes para actualizarse enesta área es considerable. Ello resulta perentorio sobre todo sitales profesionales se sienten llamados a incorporar a la prác-tica cotidiana de la Medicina Diabetológica los avances con-sensuados de la Genética y de la Inmunología en esa subárea.La profusa bibliografía internacional en el tema torna dificul-tosa no sólo la lectura de actualización, sino su interpretaciónacabada, ya que la jerga técnica se torna cada vez más comple-ja. En la actualidad solicitar análisis como los de genotipifica-ción de ADN para alelos HLA del locus DQB, o seleccionar cri-teriosamente los análisis mínimos de marcadores de autoinmu-nidad, significa manejar fluidamente los algoritmos analíticosy poder interpretar los informes de laboratorio correctamente.En forma coincidente con esta percepción de la realidad vigen-te, el presente artículo intenta facilitar el acceso de los profe-sionales médicos a las fronteras del tema, haciendo una revi-sión crítica de la bibliografía más actualizada y transfiriéndolaen términos de divulgación. Además incorpora las experienciasrecogidas en un proyecto de investigación en curso, Programaprospectivo de Autoinmunidad en el Diabético Adulto (Pro-grama ADA), propuesto y administrado por la Sociedad Argen-tina de Diabetes a través de su Comité de Genética Inmunolo-gía y Prevención de la Diabetes*. Para ello este volumen incor-pora una breve revisión de los capítulos básicos de Genética eInmunología, con un glosario práctico mínimo, antes de abo-carse al desarrollo principal del tema y a los algoritmos reco-mendados.

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* Nota: El mencionado Comité ha recibido para el Programa ADA el valorable apoyofinanciero inicial de Química Montpellier y de Novo Nordisk. En la etapa siguiente losautores de esta Separata han conseguido el soporte económico de la Universidad de BuenosAires a través del subsidio UBACYT 2004-2007, Urgencia Social código B708.

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ticuerpos y los receptores de linfocitos T, la situación es un po-co más compleja y varios genes originales empaquetados enregiones contiguas se recombinan para constituir el gen fun-cional que finalmente se traduce en la proteína específica.La expresión de un gen sin embargo no se produce directa-mente, sino que existe un mecanismo intermedio por el cual seproduce el pasaje de la información genética a otra secuenciapolinucleotídica semejante a la del ADN, basada en el ácido ri-bonucleico o ARN. El tramo de la secuencia implicado en elmensaje que finalmente se traduce como proteína se denomi-na ARN mensajero (ARNm). El mensajero es entonces la por-ción copiada a partir del ADN en un idioma ligeramente distin-to, el de las bases y azúcares propios del ARN, pero que con-serva estrictamente la secuencia codificante. Este proceso detransferencia informativa entre los dos polinucleótidos se de-nomina transcripción. El ARNm es exportado del núcleo al ci-toplasma celular y a nivel del retículo rugoso, donde sa hallanlos ribosomas, sirve de molde para la síntesis de la proteína. Es-te proceso implica un cambio sustancial de idioma, ya que lasecuencia polinucleotídica original del gen se traduce en la se-cuencia polipeptídica de la proteína, por lo cual se lo denomi-na como traducción. Las proteínas están constituidas por cade-nas cuyas unidades son los aminoácidos, por lo cual cada genque se expresa en una proteína tiene información codificadapara la secuencia aminoacídica en términos de sus propias uni-dades de lenguaje. Estas unidades son grupos de tres bases, otripletes, comúnmente denominadas codones. Por lo tanto elproceso de la traducción consiste en el pasaje de un lenguajede palabras representados por codones agrupados secuencial-mente de a tres letras en el ADN, que se transforman a un len-guaje de nuevas palabras representadas por los aminoácidosen la proteínas. Hay 64 codones posibles (las 4 bases formandotripletes configuran combinatorias para esos 64 codones) delos cuales 61 codifican para los 20 aminoácidos y 3 son los de-nominados codones mudos o de terminación, los que señalancon precisión el final de la síntesis de las proteínas.El mecanismo de biosíntesis puede no terminar ahí, pues en losorganismos más evolucionados (eucariotas) muchas de las pro-teínas antes de dirigirse a los sitios celulares asignados sufrenun procesamiento post-traduccional. En esta etapa se adicio-nan componentes no peptídicos, como los denominados gru-pos prostéticos o los carbohidratos, los cuales les confieren laspropiedades estructurales y funcionales plenas.Los tres procesos descriptos, replicación, transcripción y traduc-ción constituyen el dogma central de la Biología Molecular. Pe-


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de la diabetes, tanto de tipo 1 como de tipo 2, han contribui-do a develar algunos de los mecanismos básicos implicados eneste grupo heterogéneo de enfermedades.Para una comprensión más acabada de todos los temas reseña-dos, abordaremos someramente los contenidos elementales dela Genética Molecular, para luego introducirnos en las enfer-medades poligénicas, entre las cuales se encuentran las distin-tas formas de diabetes mellitus.

LAS BASES DE LA GENÉTICA MOLECULAR

El ADN es una estructura de doble hélice, que se encuentra enel núcleo de la célula, constituido por unidades de nucleótidos(Base nitrogenada + Desoxirribosa + Fosfato), unidos entre sípor puentes fosfodiester. Las cuatro bases nitrogenadas son:Adenina (A), Guanina (G), representan las bases púricas, Cito-sina (C) y Timina (T), las bases pirimídicas. Las dos cadenas deADN entre si se encuentran unidas por puentes de hidrógeno,que unen una base púrica a una pirimídica. Dos puentes de hi-drogeno unen A a T y tres puentes de hidrógeno unen C a G.Cada célula posee una versión del genoma completo en suADN, lo cual significa la existencia de una copia completa detodos los genes y las correspondientes regiones intergénicas.Luego cada gen ejerce su acción a través de su expresión regu-lada a través de la maquinaria de biosíntesis celular, la cualproduce la traducción de la secuencia nucleotídica en términosde la secuencia aminoacídica de la proteína correspondiente.De ese modo la expresión de los genes se logra de manera “te-jido específica”: el gen codificante para la albúmina se expre-sa en el hígado, el gen codificante para la insulina se expresaen las células beta de los islotes pancreáticos, etc.El genoma humano es diploide, por lo que existen dos copiasde ADN, uno heredado del padre y otro de la madre. El ADNse copia en otra versión duplicada, proceso denominado repli-cación, lo cual significa que cada cadena molde da origen auna nueva cadena durante la división celular. Este ADN, cons-tituido por las 6.000 millones de pb según hemos menciona-do, está ordenado y dividido en 46 cromosomas: 22 autosómi-cos, heredados del padre, otros 22 heredados de la madre, y 2 cromosomas sexuales. Pero sólo el 10% del genoma huma-no así organizado codifica para la síntesis de proteínas. Estoes, tan sólo el 10% del archivo de ADN está constituido porgenes que se traducen en un producto proteico con funcionescelulares determinadas. Un gen se define entonces como launidad funcional del genoma que expresa una proteína. Enotros casos, como en el de los genes que codifican para los an-

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Los pacientes con diabetes tipo MODY son delgados, diferen-ciándose de los pacientes con diabetes tipo 2 de comienzo enla niñez o en la adolescencia que tienen sobrepeso u obesidady en los cuales predomina como alteración fisiopatológica laresistencia periférica a la acción de la insulina. Entonces en lapráctica asistencial un problema a resolver puede ser precisa-mente el de la categorización de los niños, o de los adolescen-tes con diabetes, como tipo 1 o como tipo MODY. La diabetes tipo 1 en general no presenta antecedentes fami-liares, es una enfermedad poligénica determinada por genesdel sistema HLA (usualmente con genotipo DR3 - DR4, DQB0201 - DQB 0302) y por genes conocidos como VNTR, ubicadoscerca del extremo 5´ del gen de la insulina. En cambio el tipoMODY presenta otras bases genéticas diferentes. Últimamentese ha caracterizado en gran parte la etiología genética de estesubtipo de diabetes, determinándose claramente que se tratade una forma monogénica. Esta característica determinante degen único y con alta penetrancia ha hecho que la diabetes tipoMODY sea denominada el paradigma de la diabetes tipo 2 yque se constituya en un excelente modelo de estudio. En efec-to, los enormes avances logrados en esta forma de diabetespermite mejorar el conocimiento de la genética de la diabetestipo 2, de presentación tardía. La prevalencia de la diabetes tipo MODY no está claramentedeterminada, en tal sentido se presentan algunas dificultades,ya que muchas veces la enfermedad no es diagnosticada hastala edad adulta y otras veces no se establece fácilmente el ca-rácter autosómico dominante por carecerse del dato familiar opor muerte prematura de los progenitores. De las prevalenciasconocidas, se puede afirmar que en India llega al 18% de to-dos los casos de diabetes diagnosticada antes de los 35 años;en negros americanos alcanza al 10% de todas las formas dediabetes y en Francia al 13% de las familias seleccionadas paraestudios genéticos. La diabetes MODY 1 fue determinada en una familia denomi-nada RW, estudiada en sus diferentes generaciones por Fajans,que fue el primero en describir este tipo diabetes. En esta fa-milia se halló un ligamiento a un microsatélite ubicado en elcromosoma 20. Posteriormente se secuenció el gen causante deeste subtipo de diabetes MODY y se llegó a describir un factorde transcripción denominado factor nuclear hepático 4 (HNF 4),el que actúa sobre el gen de la insulina activando su expresión.Se han descripto varias mutaciones en el gen del HNF 4 , lascuales constituyen una causa poco común de diabetes tipoMODY. Posteriormente Fajans determina en la familia RW que


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ro con esta descripción general del tema apenas nos hemosaproximado al verdadero y complejo panorama de los procesosinvolucrados en el archivo y ejecución de los mensajes genéticos.Un gen frecuentemente está constituido por dos tipos de se-cuencias claramente distinguibles: los exones y los intrones. Losexones comprenden las regiones codificantes, por lo cual repre-sentan los tramos de secuencias que dan origen al ARNm y con-ducen a la síntesis proteica. El nombre de exón proviene de sunaturaleza de “gen exportable” del núcleo al citoplasma. Los in-trones son secuencias de ADN que se encuentran intercaladasentre los exones, separándolos físicamente y cumpliendo funcio-nes distintas a las de codificación para proteínas. Como son se-cuencias que quedan dentro del núcleo, sin una expresión tra-ducible en la biosíntesis proteica, se les ha dado ese nombre.En realidad el proceso de transcripción implica primero latransferencia en bloque de toda la secuencia del gen, constitu-yendo el ARN premensajero o transcripto primario y luego seproduce la formación del ARNm maduro o definitivo a partirdel transcripto primario, por el proceso denominado splicing.En esa etapa se separan los intrones y se empalman los exonespara conformar el ARNm maduro, el cual es exportado del nú-cleo con la secuencia que codifica para la proteína.Cada gen tiene dos extremos, uno 5’ (denominado así por lapresencia de un grupo fosfato terminal en una cadena polinu-cleotídica) y un extremo 3’ (caracterizado por la presencia de ungrupo OH en el otro extremo de la cadena polinucleotídica). Enel extremo 5’ de cada gen se encuentra una secuencia de ADNrelacionada con la regulación de la expresión del gen, denomi-nada región promotora. Sobre esta región actúan diferentesfactores proteicos, denominados factores de transcripción, queregulan la expresión del gen, activándola o inhibiéndola, e in-cluso regulando su expresión tejido-específica. Por lo tanto, unanálisis del ARNm como producto directo de un gen nos per-mite estudiar la expresión de ese gen y la identificación delARNm en un tejido nos asegura que ese gen efectivamente seestá expresando en ese tejido.

2. DIABETES TIPO MODY: MODELOS DE ENFERMEDADES MONOGÉNICAS

La diabetes tipo MODY (Maturity Onset Diabetes in Youngs) esun subtipo de diabetes tipo 2 que habitualmente se presentaen individuos menores de 25 años y tiene un modo de heren-cia autosómico dominante. Estos son pacientes que en generalson tratados con hipoglucemiantes orales.

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na truncada. Queda abierta la posibilidad de hallar nuevas mu-taciones a medida que sean estudiadas nuevas poblaciones yotros grupos étnicos. La enzima glucoquinasa fosforila la glucosa a glucosa 6 fosfa-to y, de esta manera, asegura el ingreso de la glucosa a la cé-lula. La conversión de glucosa a glucosa 6 fosfato se producecuando los niveles de glucemia son altos, como por ejemplo enel estado postprandial. La forma de herencia autosómica do-minante implica que tanto la célula ß como el hepatocito ex-presan la forma normal y la forma mutada de la enzima. De es-ta manera las mutaciones en el gen de la glucoquinasa produ-cen una disminución de la entrada y metabolización de la glu-cosa a la célula ß del páncreas y así una menor activación de lasíntesis y secreción de la insulina. Por otro lado se produce unmenor ingreso y metabolización de la glucosa en el hígado conel consecuente aumento de la producción hepática de glucosa.En general los pacientes no son totalmente deficientes en glu-coquinasa ya que heredan la mutación en forma autosómicadominante y así son heterocigotas para esa mutación. Por lotanto tienen niveles de glucoquinasa que se hallan alrededordel 50% de lo normal y este nivel de actividad enzimática noes suficiente para asegurar una función metabólica normal enla célula ß y en el hígado. Esto determina la presentación deuna forma de diabetes moderada que puede ser controladacon dieta o con hipoglucemiantes orales, sin llegar a necesitarinsulinoterapia. En resumen, las mutaciones en el gen de laglucoquinasa causan hiperglucemia, la cual se presenta funda-mentalmente en el período postprandial, debido a la falta deestímulo de la glucosa en la síntesis y secreción de insulina. Las mutaciones en el gen de glucoquinasa inciden de manera di-ferente en la mecánica funcional de la enzima, ya que puedenalterar directamente su actividad catalítica, distorsionar la es-tructura de la enzima (causando indirectamente menor activi-dad enzimática), o alterar su estructura conformacional, afec-tando su unión a la glucosa o a la proteína reguladora de la glu-coquinasa. Esta proteína alterada inhibe a la glucoquinasa intac-ta al actuar en forma competitiva a través de la glucosa. Es de destacar que cuando la secreción de insulina se estimulapor otros medios, como por ejemplo el estímulo con argininapor vía endovenosa, la repuesta pancreática al estímulo nopresenta diferencias entre pacientes con diabetes MODY 2 y elgrupo control sin diabetes.La mayoría de las mutaciones en el gen de la glucoquinasa sehallan en los exones comunes que se expresan en el hígado yen la célula ß del páncreas, por lo tanto es de esperar que la ac-


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la alteración fisiopatológica de la diabetes tipo MODY se debea trastornos en la secreción de la insulina y no en la sensibili-dad periférica a la misma. Los individuos de esta familia conmutaciones en el gen HNF 4α, pasaron de una etapa de tole-rancia normal a la glucosa a una hiperglucemia postprandial(intolerancia a la prueba oral a la glucosa) y por último evolu-cionaron a una etapa final de hiperglucemia en ayunas. Los pa-cientes con mutaciones en el gen HNF 4 a presentan alteraciónen la secreción de insulina cuando el estímulo se produce tan-to con glucosa como con secretagogos diferentes, como porejemplo la arginina. Con lo cual se estaría demostrando la ac-ción del HNF4 a en la vía final común de ambos estímulos, va-le decir directamente sobre la expresión del gen de la insulina. La identificación de polimorfismos en el gen de la glucoquinasa,facilitó los estudios genéticos en cuanto al rol de este gen en eldesarrollo de diabetes tipo MODY y aclaró el rol de la enzimaglucoquinasa en relación a la fisiología de la secreción de la in-sulina y su participación en la etiopatogenia de la diabetes tipoMODY. Así, la diabetes MODY 2 se ha constituido en el paradig-ma de la detección de alteraciones genéticas en la diabetes,siendo éste el primer subtipo de diabetes en el cual se determi-na fehacientemente una alteración genética, aunque de tipomonogénico, pudiéndose establecer una relación lineal entre elgenotipo y el fenotipo de la enfermedad. Froguel, en su estudiode pacientes tipo MODY en la población francesa determinaque la diabetes MODY 2 corresponde al 64% de los pacientescon este tipo de diabetes. Por otro lado, en el estudio realizadoen Alemania la frecuencia de diabetes MODY 2 fue del 8% y enel trabajo realizado en España la frecuencia fue del 25%. El gen de la enzima glucoquinasa está constituido por 12 exones,tiene 50.000 pb y mapea en el brazo corto del cromosoma 7.Este gen se expresa en dos tipos celulares, la célula ß del pán-creas y el hepatocito; además se sabe que la expresión del genes regulada por 2 promotores tejido específicos que regulan laexpresión en cada uno de ellos. Los exones 2-10 son comunesa ambos tejidos, el exón 1a es expresado específicamente en lacélula β y los exones 1b y 1c se expresan en el hígado. Se cono-cen actualmente más de 150 mutaciones en este gen, el 80%de las mismas se encuentran en 6 exones (1a, 4, 5, 6, 7 y 8). Lamayoría de las mutaciones corresponden a cambios de un ami-noácido debido a mutaciones puntuales en el gen, y el restorepresentan mutaciones en la región intrón / exón que alteranel proceso de splicing, dando lugar a la formación de ARNm al-terados. Ocho mutaciones determinan la aparición de codonesde stop tempranos, de manera tal que se sintetiza una proteí-

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ción de insulina. Así, como fue mencionado, los pacientes condiabetes MODY 3 con mutaciones en el gen HNF 1α tienen hi-posecreción de insulina que se presenta en forma más severa,comparada con los pacientes MODY 2.Frayling y col. demostraron que las mutaciones en el gen HNF 1αson una causa frecuente de MODY en pacientes de origen britá-nico, ya que se encontraron mutaciones en el 73% de los pacien-tes con diabetes tipo MODY estudiados. Esta mayor prevalenciatambién fue hallada en la mayoría de las poblaciones estudiadas.Los pacientes con diabetes MODY 3 tienen una alteración en lasecreción de insulina más severa que los MODY 2, por lo cual enla mayoría de los casos los pacientes deben ser tratados con in-sulina a lo largo de la evolución de la enfermedad.La diabetes MODY 4 se debe a la presencia de mutaciones enel gen del factor promotor de la insulina 1 (IPF 1). Los ratonesknock-out para este gen tienen agenesia pancreática, situaciónque podría ser reproducida en humanos con mutaciones enforma homocigota en el gen IPF 1. Cuando las mutaciones sepresentan en forma heterocigota causan diabetes tipo MODY 4.Ha sido publicado un caso de un paciente con diabetes y age-nesia pancreática con mutaciones en forma homocigota en es-te gen. De esta manera se demuestra que el IPF 1 está implica-do como factor de transcripción no sólo en el gen de la insuli-na, sino en la regulación de la expresión de otros genes rela-cionados con el desarrollo de la célula ß del páncreas. La for-ma de diabetes MODY 4 ha presentado una baja frecuencia enlas diferentes poblaciones de diabéticos MODY estudiadas.En el reconocimiento de la participación de 3 factores de trans-cripción en la génesis de la diabetes tipo MODY, un grupo de in-vestigadores japoneses estudió las mutaciones en otro factor detranscripción que activa la expresión del gen de la insulina, eldenominado factor nuclear hepático 1 ß (HNF 1 ß). Hallaron mu-taciones en este gen en dos familias de origen japonés que te-nían hiposecreción de insulina, por lo cual a esta alteración se ladenominó como diabetes MODY 5. Los pacientes con mutacio-nes en el gen HNF 1 ß desarrollan, además de diabetes, nefro-patía e hipertensión arterial. La forma de diabetes MODY 5 re-sultó ser muy poco frecuente en otras familias de origen caucá-sico con diabetes tipo 2 de origen indeterminado. El MODY subtipo 6 se produce por la presencia de mutacionesen otro factor de transcripción denominado Neuro D1. Es unsubtipo de diabetes recientemente descripto, por lo que nohay mucha experiencia clínica sobre el mismo. Neuro D1 es unfactor de transcripción que regula el desarrollo pancreático yla expresión del gen de insulina. Se han diagnosticado pacien-


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tividad enzimática de la glucoquinasa hepática también se ha-lle alterada. Por ello, se ha investigado el efecto de las mutacio-nes sobre la enzima en el hígado y su efecto en la patogénesisde la diabetes. Así, se demostró que los pacientes diabéticosMODY 2 tienen un menor contenido de glucógeno hepáticoque los individuos controles y además tienen una mayor pro-ducción hepática de glucosa a través de la gluconeogénesis. Lospacientes con diabetes subtipo MODY 2 desarrollan diabetesantes de la pubertad y presentan un descontrol metabólico le-ve. Además, estos pacientes en general no desarrollan compli-caciones crónicas tanto microvasculares como macrovasculares.A principios de la década de 1990 en pacientes con diabetes ti-po MODY que no habían sido clasificados dentro de los subti-pos 1 o 2, se llevó a cabo un estudio de ligamiento en diferen-tes cromosomas del genoma, hallándose un ligamiento positi-vo de estos enfermos con un microsatélite ubicado en el brazocorto del cromosoma 12. Así quedó establecido el tercer locusgenético relacionado a diabetes tipo MODY, por lo cual los pa-cientes con esta alteración se encuadran bajo la denominaciónde subtipo 3. En esta región genómica fueron secuenciados 14genes diferentes, entre ellos el gen del factor nuclear hepáti-co 1a (HNF 1 a), un factor de transcripción que activa la expre-sión del gen de la insulina. En este gen se han reconocido másde 45 mutaciones que, consecuentemente, producen disminu-ción en la secreción de insulina, con un cuadro clínico similar alde la diabetes MODY 1. La clínica de esta forma de diabetes esmás severa, ya que la hiposecreción de insulina, y por lo tantola hiperglucemia, tanto de ayunas como post-prandial, es ma-yor en los MODY 3 que en los MODY 2. Además, los primerostienen tendencia a las complicaciones microvasculares y es ne-cesario el tratamiento con insulina para obtener un adecuadocontrol metabólico, lo que no ocurre habitualmente con lospacientes MODY 2.Otra diferencia clara entre MODY 2 y MODY 3 parece ser laedad de presentación de la enfermedad. Los pacientes con dia-betes MODY 3 inician la diabetes después de la pubertad,mientras que los pacientes con diabetes subtipo MODY 2 lo ha-cen, como fue dicho, antes de la pubertad.El HNF 1 α tiene una función de activación sobre la expresiónde genes que codifican enzimas claves de la glucólisis. Por lotanto, al presentar la proteína HNF 1 α una secuencia aminoa-cídica alterada, debido a la presencia de mutaciones presentesen el gen, se ve disminuida la expresión de estas enzimas cla-ves de la glucólisis y en consecuencia se ve alterada la vía oxi-dativa de la glucosa, que es clave en la activación de la secre-

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y diabetes mellitus autoinmune, ese polimorfismo vecino algen de la insulina guarda relación con la susceptibilidad parala diabetes tipo 1.Otra forma de polimorfismo, con aplicaciones en el estudio delas enfermedades genéticas, es el cambio de una base por otraen una determinada región del genoma denominado SNP (delinglés, Single Nucleotide Polymorphism). Dentro de esta catego-ría se incluyen las variantes polimórficas del HLA, en las cualespueden ocurrir más de un SNP en cada alelo. Si ese polimorfis-mo ocurre en un sitio específico para determinar el corte conuna enzima de restricción en particular, tal cambio determina lapérdida de ese sitio. Eso no sólo tiene repercusión en que la en-zima en cuestión no pueda cortar el ADN en ese preciso sitio, si-no que un polimorfismo dado también puede crear un nuevo si-tio de restricción para otra enzima diferente (existe una gran co-lección de estas enzimas aisladas de la naturaleza y disponiblespara el manipuleo analítico de la Biotecnología). De esta mane-ra se permite un corte en un sitio del ADN donde anteriormen-te no existía la posibilidad de fragmentar la cadena con esa se-gunda enzima. Como se aprecia a partir de ese ejemplo, ambostipos de polimorfismos generan fragmentos nucleotídicos de ta-maño diferente, por lo cual en ambos casos las variantes poli-mórficas pueden ser identificadas cortando el ADN con la enzi-ma de restricción adecuada y utilizando la técnica denominadaSouthern Blot o la de PCR (ver tales técnicas en la sección 6. Losmétodos analíticos para el apoyo diagnóstico de diabetes). Es-tos polimorfismos son característicos de individuos o de grupostales como, familias, poblaciones cerradas, etnias o razas, y mu-chas veces se encuentran ligados o asociados a alteraciones enlos genes, las que determinan la presencia de una enfermedadhereditaria o genética. La asociación entre el polimorfismo y laenfermedad se realiza a través de análisis estadísticos que per-miten precisar objetivamente esta asociación o ligamiento. Ac-tualmente se está avanzando aceleradamente en el esclareci-miento de ligamientos de polimorfismos con enfermedadescomplejas como la diabetes, lo que permite identificar los genesinvolucrados en la etiología de la enfermedad. El avance en el conocimiento del genoma humano permite lautilización de más polimorfismos con la finalidad de establecersu ligamiento a diabetes tipo 2. Las alteraciones en los genesubicados en cromosomas autosómicos que producen enferme-dades hereditarias son clasificadas clásicamente en dominan-tes y recesivas. Eso implica la presencia de una forma normal yotra alterada de las dos versiones (alelos) del par de genes enlas células diploides del organismo. Por ello el genotipo corres-


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tes entre los 17 y los 60 años. Algunos de estos pacientes tie-nen obesidad, resistencia a la insulina e hiperinsulinemia, ca-racterísticas de la diabetes tipo 2 tardía. De acuerdo al tipo demutación hallada se decidirá el tratamiento más adecuado coninsulina o antidiabéticos orales.En conclusión, la diabetes tipo MODY es un síndrome hetero-géneo, desde un punto vista genético, metabólico y clínico,constituyendo una forma monogénica dentro de una enfer-medad poligénica como es la diabetes. El denominador comúnes que todos los pacientes con diabetes tipo MODY tienen hi-posecreción de insulina como factor desencadenante primario.Estos hallazgos abren un nuevo camino en el entendimientode la diabetes MODY y posiblemente de algunas formas dediabetes tipo 2 de aparición tardía.

3. POLIMORFISMOS EN SALUD Y EN ENFERMEDAD. DIABETES ENTRE LAS ENFERMEDADES POLIGÉNICAS

POLIMORFISMOS GENÉTICOS EN SALUD Y EN ENFERMEDAD

Ya hemos mencionado que sólo el 10% del genoma tiene se-cuencias correspondientes a las unidades funcionales del mis-mo, o sea los genes que codifican para proteínas. ¿En queconsiste entonces el resto mayoritario del archivo genético?Se sabe que esa porción de ADN contiene secuencias intergé-nicas, entre las cuales hay un importante número de las deno-minadas secuencias polimórficas. El polimorfismo significauna secuencia de ADN que varía de individuo a individuo yque es transmitida de padres a hijos. Estas secuencias polimór-ficas son las permiten la identificación de individuos y la de-terminación o exclusión de paternidad, constituyendo las hue-llas digitales genéticas de un individuo. Estos polimorfismosconstituyen, en su mayoría, secuencias repetitivas que se ubi-can tanto en regiones intergénicas como en los genes, ya seaen sus intrones o en sus exones. Tales secuencias repetitivas es-tán conformadas por unidades, las cuales se repiten en tan-dem un número determinado de veces. De acuerdo al tamañode la unidad repetitiva se los clasifica como microsatélite:cuando la unidad repetitiva está constituida por 2 o 3 nucleó-tidos y en minisatélite: cuando la unidad repetitiva está cons-tituida por más de 4 o 5 nucleótidos. Cada unidad se repite unnúmero variable de veces para cada polimorfismo en particu-lar, constituyendo el tramo de secuencia completa para esepolimorfismo. Dentro de los minisatélites se encuentran losVNTR (la sigla inglesa significa número variable de repeticio-nes en tandem). Según se verá en la sección 5. Inmunogenética

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En general, este tipo de patologías tiene una considerable agre-gación familiar. El riesgo de contraer una enfermedad poligéni-ca en los familiares de primer grado es del orden del 5 al 15%,dependiendo este porcentaje de la enfermedad en cuestión. En-tre las enfermedades poligénicas se pueden mencionar las si-guientes: diabetes, esquizofrenia, enfermedad tiroidea, hiper-tensión, dislipemia, cardiopatía coronaria, obesidad, etc. Además, el riesgo de contraer una enfermedad multifactorialvaría de una familia a otra, dependiendo este riesgo de la gra-vedad de la alteración genética, del número de individuosafectados en esa familia y de la contribución de los factoresambientales.Las enfermedades complejas no siguen un modo de herenciamendeliano simple, como ocurre en las enfermedades heredita-rias monogénicas. Sin embargo en ciertas formas clínicas de lasenfermedades multifactoriales con patrones fenotípicos especí-ficos se ha hallado la alteración de un solo gen, las que consti-tuyen formas monogénicas dentro de las enfermedades poligé-nicas, como por ejemplo en la diabetes de tipo MODY, en la hi-percolesterolemia familiar, el defecto familiar de Apo B 100, etc. El tipo de herencia de las enfermedades poligénicas no estácompletamente establecido. En particular se desconoce si la cau-sa genética de las mismas está determinada por un sitio princi-pal en el ADN (locus mayor) que, en conjunción con loci meno-res, ocasiona la mayoría de los casos o si, por el contrario, son va-rios loci menores determinantes de un porcentaje pequeño decasos, los que determinarían una importante dispersión entrelas diferentes alteraciones genéticas. Debemos tener presenteque la complejidad deriva del importante número de moléculaspotencialmente implicadas, como enzimas, receptores, trans-portadores, reguladores de la actividad enzimática, reguladoresde la expresión de genes que intervienen en el metabolismo pa-ra mantener normales las concentraciones de glucosa, coleste-rol, triglicéridos, o los valores de presión arterial. Los desequili-brios en estos parámetros representan la manifestación fenotí-pica compleja de las enfermedades poligénicas más comunes.Uno de los caminos estratégicos que se ha seguido para deter-minar las causas genéticas de las enfermedades complejas, esel análisis de ligamiento de polimorfismos con la enfermedad,es decir establecer la relación de la enfermedad con un marca-dor genético polimórfico, cercano al cual se encontrará el genafectado. Es probable que la frecuencia de los polimorfismos haya au-mentado debido a una selección positiva que actúa sobre lasvariables que confieren una ventaja evolutiva. Las variantes po-


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pondiente a esos individuos se define como heterocigota y escausante de las enfermedades autosómicas dominantes.Las enfermedades autosómicas recesivas están determinadaspor la presencia de una forma patológica en ambos alelos, si lamutación es exactamente la misma en ambos alelos, el genoti-po es homocigota. Si la mutación es diferente en un alelo res-pecto del otro, el genotipo se denomina doble heterocigota.La repercusión funcional será la misma en el caso de un homo-cigota que en el de un doble heterocigota. En las enfermeda-des autosómicas recesivas el genotipo heterocigota convierteal individuo en portador.Las alteraciones que modifican la estructura normal de ADN yconstituyen la base de una patología, pueden ser clasificadas enmacrolesiones y microlesiones. En la diabetes tipo 2 se han des-cripto microlesiones como factores determinantes de la etiologíagenética de la enfermedad (generalmente SNPS). Estas alteracio-nes genéticas pueden ser de origen hereditario o producirse enun individuo a lo largo de la vida por la acción de agentes quími-cos o físicos (radiaciones, radicales libres), o por errores fortuitosen el proceso de la replicación.Si la alteración genética se produce en un determinado órga-no o tejido, la patología sólo se expresará en éstos, de acuer-do a la proteína afectada, y la enfermedad no será transmiti-da a la descendencia (mutaciones somáticas).La técnica denominada Reacción en Cadena de la Polimerasa(PCR) es un procedimiento rápido y eficiente para amplifica-ción in vitro de porciones predeterminadas de ADN (véase ladescripción más detallada de esta técnica en la sección 6. Losmétodos analíticos para el apoyo diagnóstico de diabetes), locual permite diagnosticar directamente a nivel molecular lapresencia de microlesiones en el ADN. Según el diseño de losoligonucleótidos “cebadores” (primers) que flanquean amboslados de la región escogida, se posibilita la amplificación selec-tiva desde pequeñas secuencias de ADN (200 a 1000 pb) hastatramos de 20.000 pb.

DIABETES ENTRE LAS ENFERMEDADES POLIGÉNICAS

Las enfermedades poligénicas, mejor denominadas como com-plejas o multifactoriales, están determinadas por alteracionesen una cierta cantidad de genes que predisponen al desarrollode estas patologías, siendo los factores ambientales los desen-cadenantes de las mismas. Está claro que es necesaria la inte-racción entre el factor genético (llamado factor de susceptibi-lidad) y el ambiental (factor gatillo o desencadenante) paraque la enfermedad se desarrolle.

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constituyen el sustrato de estudio de las enfermedades mono-génicas, es muy probable que, en las enfermedades poligéni-cas, sea necesario el efecto acumulativo de alteraciones gené-ticas (polimorfismos) en diversos loci para que la enfermedadmultifactorial se desarrolle, como por ejemplo en el caso de ladiabetes tipo 2, en la que es necesario la conjunción de poli-morfismos en genes relacionados con la secreción de insulina ycon la acción periférica de la misma. Como ya se dijo, los polimorfismos en si mismos no constituyenel resultado de errores o cambios filogénicos fallidos, sino queresultaron del fenómeno evolutivo determinante de la diversi-dad genética. Esta a su vez determinó la capacidad adaptativadel hombre y de los seres vivos en general, para hacer frente alos desafíos del medio ambiente. Cuando las necesidades adap-tativas, durante la evolución de las especies, han ejercido mayo-res presiones y una alta velocidad en los cambios, los mecanis-mos genéticos implicados en la herencia y en la defensa acom-pañaron el cambio con el desarrollo de otras formas de genera-ción de diversidad. Tal es el caso de la recombinación de genesy los ejemplos prototípicos de ello son las recombinaciones degenes del Sistema Inmune Adaptativo, denominados V, D y J. Es-tos genes (unos pocos centenares) se “barajan” (shuffling) y serecombinan para dar millones de variantes potenciales deARNm, lo cual conduce a su vez al exhuberante repertorio de re-ceptores de los linfocitos B y T y de los anticuerpos (véase estetema en la sección 5. Inmunogenética y diabetes mellitus au-toinmune). La enfermedad poligénica diabetes tipo 1 está con-dicionada por el concurso de varios genes de susceptibilidad, en-tre los cuales predominan los del sistema polimórfico HLA, perotambién participan en alguna medida los genes recombinadosdel Sistema Inmune que finalmente condicionan la intensidadde la respuesta autoagresiva hacia los islotes pancreáticos. Como puede apreciarse, a diferencia de las enfermedades mo-nogénicas, donde los errores a nivel genético condicionan uní-vocamente la expresión clínica de la patología, las enfermeda-des poligénicas están condicionadas por una combinatoriacompleja de genes normales emergentes de multialelismo o derecombinación que confieren una matriz de susceptibilidad.

4. BASES DE INMUNOLOGÍA GENERAL Y AUTOINMUNIDAD

EL SISTEMA INMUNE

Durante la evolución de los organismos multicelulares primiti-vos probablemente se seleccionaron una serie de mecanismosconstitutivos de la denominada inmunidad natural o innata,


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limórficas que confieren susceptibilidad a las enfermedades he-reditarias poligénicas tienen, indudablemente, una alta preva-lencia en la población. Es muy probable que esos polimorfismoshayan contribuido a mantener las concentraciones normales deglucosa, colesterol, presión arterial, etc., en nuestros antepasa-dos cazadores-recolectores y que esos mismos polimorfismosrespondan adversamente al sedentarismo y a la sobrealimenta-ción (factores ambientales), propios de las sociedades contem-poráneas, con una creciente predisposición a las enfermedadesmultifactoriales que afectan al hombre moderno. Como fue ex-presado, en general los polimorfismos no representan altera-ciones funcionales en los genes, pero pueden estar estrecha-mente ligados a una variación genética que determine un cam-bio en el fenotipo. Esta asociación está determinada por el de-sequilibrio de ligamiento entre el polimorfismo y la mutación.Por ello se dice que existe desequilibrio de ligamiento cuandodos polimorfismos se encuentran asociados en una poblacióncon una frecuencia mayor a la que se esperaría sólo por azar.Esto significa que ambos polimorfismos están estrechamente li-gados y cercanos en el mismo cromosoma y co-segregan en losestudios familiares. El hallazgo de una asociación entre una en-fermedad y un polimorfismo implica que la selección natural haaumentado la frecuencia del alelo portador del polimorfismomarcador y el polimorfismo causal, en una determinada familiao población. Para que esto ocurra, se debió producir una co-sanguineidad significativa en la población en la que se inició ypropagó el polimorfismo causal. Además, durante un períodode tiempo considerable debió producirse una “estabilidad po-blacional”, tras la aparición conjunta de la mutación genética yel polimorfismo marcador. Se han hallado polimorfismos mar-cadores asociados a mutaciones en genes que codifican proteí-nas importantes en la determinación de la concentración de li-poproteínas, la glucemia y la presión arterial. Estas alteracionesgenéticas producen diferentes fenotipos dentro de patologíascomo las dislipemias, la diabetes y la hipertensión arterial. El otro camino estratégico para el estudio de enfermedadesgenéticas es la búsqueda de polimorfismos en genes candida-tos. Se utiliza el término candidato cuando, por razones fun-cionales, un gen, al expresar una mutación en la proteína quecodifica, tiene amplias probabilidades de causar una determi-nada patología. Sobre todo se aplica en aquellas en las cualesexisten proteínas involucradas en una vía metabólica, seanproteínas transportadoras, receptores, reguladores de vías me-tabólicas, o incluso proteínas relacionadas con la regulación dela expresión de genes. Las mutaciones en genes candidatos

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tación se hace por medio de moléculas MHC Clase II, a los Th.Luego de esa interacción, de la que resulta la liberación de in-terleuquinas regulatorias por parte del Th, surge una diferen-ciación y estimulación de la línea de linfocitos B implicada, conlo cual se transforman en células plasmáticas (PC), productorasde importantes cantidades de BCR libres del anclaje celular. Ta-les moléculas circulantes son los anticuerpos específicos paracada antígeno, constituyendo una expresión de la respuestahumoral. Esta es la vía por la cual se sintetizan los anticuerposhacia los antígenos “naturales” que nos desafían en el trans-curso de nuestra vida, hacia los antígenos de las inmunizacio-nes vacunales e incluso hacia los autoantígenos involucradosen las enfermedades autoinmunes, como la diabetes tipo 1 yotras variantes relacionadas. Estos últimos autoanticuerpos,como veremos, son los marcadores séricos que se utilizan parael apoyo diagnóstico y la detección precoz de la diabetes au-toinmune.

LA AUTOINMUNIDAD

El daño a estructuras propias es un recurso defensivo naturalde los organismos inmunocompetentes y ocurre frecuente-mente de manera regulada para eliminar células infectadas odefectuosas y productos inútiles. Para cumplir con esa funciónprioritaria el Sistema Inmune evolucionó hasta disponer de unmecanismo complejo de autorreconocimiento y, como deriva-ción de ello, desarrolló una capacidad defensiva dependientede la discriminación de las estructuras extrañas que potencial-mente podrían agredirlo. En esos procesos participan diferen-tes mecanismos celulares y humorales de eliminación: las célu-las fagocitan estructuras moleculares propias y las provenien-tes de microorganismos, fragmentándolas, oxidándolas y fi-nalmente degradándolas totalmente. Los anticuerpos unencon alta especificidad y avidez a los antígenos en solución oparticulados, generando complejos eliminables por los distin-tos sistemas de depuración, basados en mecanismos de opso-nización, intermediados por el sistema complemento o porotros tipos celulares dependientes de anticuerpos. Si alguno de los diversos mecanismos implicados en el funcio-namiento defensivo del Sistema Inmune falla por alguna causa,se instala una inmunodeficiencia parcial o total, comprome-tiendo la integridad de los tejidos blanco y hasta la sobreviven-cia del individuo afectado. Por ello, si se altera alguno de losdelicados mecanismos del reconocimiento discriminativo entrelo propio y lo extraño y/o la regulación supresora, resultante enautoagresión descontrolada, extensa e irreversible, estamos an-


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por medio de la cual se reconocían sustancias nocivas y mi-croorganismos potencialmente agresores. Posteriormente laevolución condujo a una forma de inmunidad adquirida, adap-tativa, o también llamada específica. Tal vez la función principal de este sistema “moderno” con unamplísimo espectro de reconocimiento molecular topográficoy profundo se consolidó como una herramienta poderosa parala vigilancia de la identidad propia. Como una derivación deello, se podrían reconocer las estructuras foráneas y de algunamanera conducir a su eliminación. Sin embargo, la alta com-plejidad del nuevo sistema no quedó libre de posibles erroresy al identificar los agentes infecciosos también se posibilitaríael reconocimiento de macromoléculas muy similares dentrodel propio organismo. El Sistema Inmune de los mamíferos actuales consta de un con-junto armónico de células y macromoléculas solubles que ac-túan como mensajeros intercelulares, las citoquinas, o como an-ticuerpos, uniéndose a los antígenos y promoviendo su elimina-ción. Esa división simplificada facilita la presentación de las dosprincipales ramas (celular y humoral) del Sistema Inmune, invo-lucradas en el reconocimiento de los antígenos propios y exter-nos. En el mecanismo de presentación juegan un papel funda-mental las moléculas del complejo Mayor de Histocompatibilidad(MHC) como presentadoras de los antígenos fragmentados. Re-cordamos que la descripción histórica de ese sistema proveníadel papel que jugaba en los trasplantes experimentales, de ahíque a sus componentes se los designara con el nombre de antí-genos de histocompatibilidad. Normalmente los antígenos propios, asociados a MHC Clase I,son presentados a los linfocitos T citotóxicos (Tc). Este mecanis-mo de presentación normal del Sistema Inmune se lleva a ca-bo por células del tipo macrófagos-monocitos. Los antígenos externos a los macrófagos son internalizados porlos mismos, procesados, y unidos a moléculas MHC Clase II. Se-guidamente aparecen en la superficie celular, donde son presen-tados a otros linfocitos T, denominados linfocitos auxiliares (Th). Los antígenos alternativamente pueden ser reconocidos enforma directa e intacta por parte de otras células presentado-ras, como son los linfocitos B, a través de sus receptores espe-cíficos (BCR). Millones de linfocitos B (cada una de sus líneas esespecífica para un antígeno diferente) constituyen el reperto-rio defensivo contra otros tantos antígenos potencialmenteagresivos. Los linfocitos B, tras la unión de los antígenos a susBCR, pueden internalizarlos, procesarlos y presentar sus frag-mentos de modo similar a los macrófagos. También la presen-

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En gemelos univitelinos la tasa de concordancia del 50%, indi-có inicialmente la asociación de factores genéticos predispo-nentes con factores ambientales desencadenantes, aunque es-tos últimos no estaban completamente esclarecidos. Luego sedeterminó que las infecciones virales son tal vez el factor de-sencadenante más importante. Finalmente, el conocimientosobre la recombinación de los genes que codifican para los re-ceptores T y para los anticuerpos perfeccionó la explicación so-bre la discordancia en los gemelos univitelinos.Si bien los genes del HLA son los factores genéticos más impor-tantes que determinan susceptibilidad a diabetes tipo 1, estábien establecido que esta predisposición es necesaria pero nosuficiente. Se han analizado varios polimorfismos distribuidosen el genoma, en familias con varios individuos afectados dediabetes tipo 1, relacionándose algunas de estas regiones poli-mórficas con la enfermedad. Entre estas regiones polimórficasse ha asociado a la región VNTR (recordamos, según los adelan-tado en la sección 3. Polimorfismos en salud y enfermedad, quela sigla significa número variable de repeticiones en tandem).Esta región se halla vecina al extremo 5’ del gen de la insulina,la cual constituye otro de los loci polimórficos que con mayorfrecuencia produce susceptibilidad para la diabetes tipo 1. Tam-bién se ha establecido cierto grado de participación en el ori-gen de la enfermedad de determinados polimorfismos del gencodificante para la proteína denominada CTLA4. Cada uno deestos tres genes (HLA, VNTR y CTLA4) y sus alelos implicados enla diabetes tipo 1 merecen una consideración especial.

EL SISTEMA HLALos genes del sistema HLA se encuentran en el brazo corto delcromosoma 6 y son clasificados en tres familias: Clase I, II y III. Es-pecíficamente los genes de Clase II son los que presentan másfuerte asociación con la enfermedad y son altamente polimórfi-cos. La mayoría de los residuos polimórficos se encuentran en eldominio amino-terminal. Hay tres loci que expresan los antíge-nos de Clase II: DP, DQ, DR; los productos de la expresión de ge-nes de Clase II son glicoproteínas heterodiméricas constituidaspor cadenas α y cadenas β , presentes en la superficie celular demacrófagos y linfocitos B, codificadas respectivamente por losgenes DRA y DRB, y por DQA y DQB. El gen DRA es monomórfi-co, el DRB es polimórfico y es el responsable por lo tanto del po-limorfismo presente en las moléculas DR. Por el contrario, tantoel gen DQA como el DQB son polimórficos y de esta manera, am-bos determinan el polimorfismo existente en las moléculas DQ.Se ha comprobado que tanto los alelos polimórficos de genes de


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te una patología autoinmune. Como estos trastornos son mul-tifactoriales, en las diferentes enfermedades autoinmunes pue-den estar comprometidos distintos mecanismos etiológicos.Entre las diversas hipótesis propuestas, varias se destacan porun sustancial soporte experimental, aclarándose que en mu-chos casos pueden ser mutuamente no excluyentes. Las hipótesis principales de la autoinmunidad apuntan a de-fectos en la inducción central o periférica de la tolerancia o,por otra parte, a la respuesta convencional disregulada haciamoléculas propias, que en circunstancias normales no necesi-tan el desarrollo de un proceso de tolerancia. Además, variosde los mecanismos propuestos que se muestran en la Tabla 4.1son variantes de un mismo modelo, adaptados a enfermeda-des órgano-específicas, o a la autoinmunidad sistémica. Final-mente, como las bases de la autoinmunidad tienen una claraconexión con la predisposición genética, los estudios familiaresy poblacionales incluyen la exploración de los factores de sus-ceptibilidad a nivel de los genes que codifican para las macro-moléculas que contactan con los antígenos (MHC, TCR y anti-cuerpos) y de otras implicadas en la regulación (citoquinas,componentes del mecanismo de apoptosis, etc.).Debido a la importancia crucial de la constitución genética enla predisposición para la diabetes autoinmune, este tema se de-sarrollará a continuación con mayor amplitud. Como además larespuesta inmune celular, responsable de la autoagresión quelesiona a las células beta de los islotes, y la respuesta humoral,generadora de los marcadores, son mecanismos controladospor genes del sistema inmune, las bases etiopatogénicas de ladiabetes autoinmune y el origen de los marcadores se trataránconsecutivamente en la siguiente sección de Inmunogenética.

5. INMUNOGENÉTICA Y DIABETES MELLITUS AUTOINMUNE

GENÉTICA DE LA DIABETES MELLITUS TIPO 1Como se ha adelantado en las secciones anteriores, la diabetestipo 1 es una enfermedad heterogénea causada por la interac-ción de factores genéticos y ambientales, en la cual se ha de-mostrado una forma de herencia de tipo poligénica. De todasmaneras, las bases etiopatogénicas de la enfermedad incluyenclaramente el componente autoinmune y desde el punto devista hereditario existe una reconocida asociación con genesdel MHC (HLA en los humanos). En este sistema se halla enton-ces el factor genético más importante para la susceptibilidadhacia la diabetes autoinmune, la que comprende a su vez a ladiabetes tipo 1 como el modelo mejor estudiado.

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MECANISMOS ETIOLÓGICOSDE LA AUTOINMUNIDAD

Predisposición genéticaLiberación de antígenos recluidosExposición de epitopes crípticosIgnorancia de lo propio por inadecuada presentación antigénica o de señales coestimulatoriasMimetismo molecularModificación de lo propioDefectos en la tolerancia central o periféricaActivadores policlonalesDisturbios inmunnorregulatorios

Tabla 4.1

Mecanismos etiológicos de la autoinmunidad, destacando la contribución fundamental de la predisposición genética. Para accedera una versión más desarrollada de estospuntos, puede consultarse el temaAutoinmunidad en la Separata 2001.Diabetes e Inmunidad, E. Poskus.


la región DR como de la región DQ predisponen o protegen pa-ra el desarrollo de la diabetes tipo 1. Desde hace varios años sehabía comprobado, por tipificación serológica, la relación de losantígenos DR3-DR4 con la enfermedad. El 95% de los pacientescon diabetes tipo 1 poseían DR3-DR4, comparado con el 50% dela población no diabética. En las diferentes poblaciones estudia-das los tipos serológicos HLA DR3 y DR4 determinaban suscepti-bilidad para padecer la enfermedad, mientras que el DR2 confe-ría resistencia. Las variantes polimórficas halladas en pacientesfueron también encontradas en controles sanos.El avance de la Biología Molecular ha permitido focalizar entrelos tres loci de la región D (DP, DQ, DR) a la región DQ como lamás fuertemente asociada con la diabetes tipo 1 (Figura 5.1).Por ello hoy se sabe que los alelos de genes DR, codificantespara los serotipos DR3-DR4, están asociados a la enfermedadpor su participación directa y por el desequilibrio de ligamien-to con alelos DQB. De la misma forma, el DR2 se halla en dese-quilibrio de ligamiento con las variantes alélicas de DQB queconfieren resistencia.

Con el advenimiento de la técnicas de Biología Molecular, comoel análisis de RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism)y la amplificación de ADN a través de la reacción en cadena dela polimerasa, se han podido determinar los alelos que confie-ren susceptibilidad o resistencia para padecer diabetes tipo 1.La hipótesis de una contribución mayoritaria del locus DQ al de-sarrollo de la diabetes tipo 1 surge en base a los trabajos deJohn Todd, a partir de los cuales se establece claramente que laregión genómica alrededor del codón 57 del gen B de la regiónDQ del Complejo Mayor de Histocompatibilidad, está induda-blemente involucrada en la asociación con esa patología au-toinmune. Se ha establecido que las secuencias aminoacídicasde las cadenas ß, codificadas por el gen DQB, son comúnmentehalladas en asociación con la diabetes tipo 1, confiriendo sus-ceptibilidad a la enfermedad cuando los residuos de aminoáci-do en la posición 57 son alanina, valina o serina (cualquiera deesas alternativas se denominan como “aspártico negativo”, oAsp-). En contraste, las cadenas aminoacídicas halladas más fre-cuentemente en la población no diabética, y que confieren pro-tección para el desarrollo de la enfermedad, tienen el aminoá-cido aspártico en esa posición (denominadas “aspártico positi-vo”, o Asp+). Se ha demostrado ampliamente en diferentes po-blaciones estudiadas que el haplotipo DQB Asp- homocigota(Asp- / Asp- ) es el que tiene una correlación específica con dia-betes tipo 1. Las diferentes variantes alélicas del gen polimórfi-co DQB se encuentran circunscriptas al segundo exón del gen yson las que codifican la región amino-terminal de la moléculapresentadora de antígenos. Actualmente se reconocen decenasde alelos diferentes en el gen DQB, que se diferencian por suestructura a nivel del codón 57 y también por fuera de él. Lanueva nomenclatura individualiza cada uno de estos alelos concuatro dígitos: por ejemplo, entre los alelos de susceptibilidad,el DQB 0302 y el DQB 0201 se encuentran entre los más comu-nes entre los diabéticos tipo 1. Además, la forma actual de ex-presar la constitución genética a nivel del sistema HLA que con-fiere la mayor predisposición para padecer la diabetes tipo 1 nose refiere a un locus solamente. Por ello la nomenclatura com-pleta para expresar el patrón de mayor susceptibilidad genéti-ca hacia la enfermedad es la siguiente: serotipo DR3, haplotipoDRB 03 - DQB 0201 - DQA 0501; serotipo DR4, haplotipo DRB 04- DQB 0302 - DQA 0301). Alrededor del 80% de los individuoscaucásicos con diabetes tipo 1 son portadores de alguno de es-tos dos haplotipos, aunque de todas maneras presentan unaimportante variación cuando se estudian diferentes grupos ét-nicos. Cuando se estudió estadísticamente la forma homocigo-


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Organización genómica del sistema HLAy distribución de las moléculas Clase I y Clase II en la superficie de células periféricas “comunes” y de células “profesionales” (macrófagos). Se destacan las cadenas DQβ y DQα,asociadas con la diabetes autoinmune,según la estructuras de sus formas polimórficas a nivel de los aminoácidosAsp 57 y Arg 52, respectivamente.

FIGURA 5.1


mientras que en la diabetes tipo 1 los polimorfismos de genesHLA son los que contribuyen fundamentalmente a la predispo-sición genética, constituyéndose en el locus mayor para este ti-po de diabetes autoinmune. El conocimiento de la frecuencia y el tipo de alelos presentesen nuestra población permite genotipificar a futuros pacientesy sobre todo a los familiares de primer grado de los pacientesdiabéticos tipo 1. Por otra parte, en el mismo estudio, la distri-bución alélica en el grupo control fue homogénea, siendo elalelo protector DQB 0301 el más frecuentemente hallado en lamisma población: su frecuencia llega al 44,2% con respecto al3,8% presente en los pacientes con diabetes tipo 1.El gen DQA también ha sido relacionado a la predisposicióngenética para la diabetes tipo 1. En este gen la región del co-dón 52 cuando codifica para arginina determina susceptibili-dad y la ausencia de este aminoácido reemplazado por otro,otorga protección para el desarrollo de la enfermedad. En laFigura 5.2 se muestra esquemáticamente cómo la estructuraespacial de las cadenas a y b de la molécula DQ permiten el ac-ceso de un fragmento peptídico del antígeno GAD si corres-ponden a variantes alélícas con Asp 57- y Arg 52+, respectiva-mente. Ese modelo proviene de una doble demostración expe-rimental: 1) la interacción efectiva, en solución, de ese péptidoautoantigénico con la molécula HLA presentadora y 2) la ima-gen tridimensional real del complejo cristalino, obtenido porCorper y col. mediante la técnica de difracción de rayos X (5.2).A partir de este estado del conocimiento a nivel molecular, hasido posible reducir a una imagen gráfica relativamente sim-


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ta Asp-/Asp- en nuestra población, se identificó un alto gradode asociación a diabetes tipo 1, llegando al 78,6% en los pa-cientes diabéticos tipo 1 y al 46,8% en los pacientes LADA, com-parados con un 20,5% en los individuos controles (Tabla 5.1).Con estos porcentajes se confirmó, para el grupo étnico repre-sentativo de nuestro país, que esta región del sistema HLA, enefecto, es la que predispone a la diabetes autoinmune, tantoLADA como diabetes tipo 1, y otorga un mayor riesgo de con-traerla. La población genéticamente más predispuesta es la delos familiares de primer grado de pacientes con diabetes tipo 1(grupo de riesgo). Además, se observó una fuerte asociaciónentre diabetes tipo 1 y los diferentes genotipos del locus DQBen distintos grupos étnicos. A pesar de establecerse áreas conalta incidencia de diabetes tipo 1, como en Francia y en Finlan-dia y otras de baja incidencia, como en Japón y en Taiwan, entodas estas poblaciones permanece la relación lineal entre ale-los de susceptibilidad relacionados al codón 57 de la regiónDQB y la diabetes tipo 1. Teniendo en cuenta que los alelos polimórficos del gen DQBse encuentran en desequilibrio de ligamiento con variantespolimórficas de los genes DQA y DRB, se admite que sólo conla determinación de alelos del gen DQB se establece una ade-cuada ponderación de la susceptibilidad o resistencia a la en-fermedad.Considerando los genotipos del estudio realizado en la pobla-ción argentina (5.1), se destaca la alta proporción de dos alelosde susceptibilidad para la diabetes tipo 1: los alelos 0201 y 0302alcanzan el 80% entre los pacientes con diabetes tipo 1, el 51%en los LADA y el 16% entre los controles. Cuando se analizó lafrecuencia genotípica que confiere mayor predisposición a dia-betes autoinmune (la combinación alélica 0302/0201) se encon-tró un 38% en diabetes tipo 1, 17% en LADA y sólo 2% en loscontroles. Estos porcentajes son similares a otras poblaciones,con la diferencia que en nuestra población el alelo mas fre-cuente es el 0201 (similar a Italia y España), a diferencia de laspoblaciones de EEUU o centro y norte de Europa, en las que elalelo de mayor frecuencia es el 0302. (Tabla 5.2).Como se puede comprender a partir de los porcentajes presen-tados, los alelos de susceptibilidad del gen HLA DQB 1 se en-cuentran asociados fundamentalmente a diabetes tipo 1, pre-sentando en el LADA un comportamiento intermedio entrediabetes tipo 1 y controles. Como se verá en la sección 7. Ladiabetes emergente en edad infanto-juvenil y adulta, el LADApresenta un mayor peso en la predisposición genética a partirde polimorfismos en otros genes (VNTR de insulina y CTLA 4),

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Tabla 5.2

Figura 5.2

Frecuencia de los genotipos DQB1 en la población argentina normal y en los pacientes diabéticos, según sus alelos.

Estructura tridimensional del complejo MHC (HLA) Clase II /Péptido de la GAD, obtenida pordifracción de rayos X (izquierda) y su esquema simplificado mostrandola factibilidad de la unión y presentación del péptido cuandolas variantes polimórficas corresponden a cadenas β conAsp57- y a cadenas α con Arg52+

(derecha).

Tabla 5.1

Frecuencia de los genotipos DQB1 en la población argentina normal y en los pacientes diabéticos, según el codón 57 codificante para ASP- o ASP+.


constituido por 1430 pb y tiene 3 exones separados por 2 intro-nes de 179 y 786 pb. El gen tiene la secuencia completa para lacodificación de las cadenas A y B de la insulina, el péptido C yel prepéptido o péptido señal. Además, en la región genómicavecina del extremo 5’, se ha determinado la presencia de un po-limorfismo denominado VNTR, que ya hemos mencionado, elcual ha sido estudiado en múltiples grupos poblacionales y endiversas familias con árboles genealógicos constituidos por unimportante número de paciente diabéticos. Los polimorfismosgenéticos de ese tipo han sido extensamente usados como mar-cadores genéticos de las enfermedades hereditarias.La región VNTR vecina al gen de la insulina está constituidapor segmentos de 30 a 170 repeticiones en tandem de unida-des nucleotídicas formadas por 14 pb. Este VNTR genera tiposde alelos diferentes (Figura 5.3): Clase I: 600 pb, Clase II: hasta1400 pb y Clase III: más de 2400 pb. El alelo de Clase I ha sidocorrelacionado con diabetes tipo 1 (esta asociación se denomi-nó IDdiabetes 2), correspondiendo al 10% de la carga genéti-ca en los pacientes diabéticos tipo 1. De esta manera se distin-guen del modelo antes descripto que se correlaciona con el sis-tema HLA (denominados IDdiabetes 1) y que constituía el 50%de la carga genética. La detección de varios polimorfismos relacionados a diabetestipo 1 en diferentes regiones del genoma confirma la caracte-rística heterogénea de la enfermedad.Recientemente en el Hospital de Clínicas J. de San Martín, Uni-versidad de Buenos Aires, se realizó un trabajo para la tipifica-ción de los alelos polimórficos del VNTR vecino al gen de la in-sulina, con el propósito de establecer la asociación entre estelocus y la susceptibilidad para padecer diabetes tipo 1 en la po-


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ple, tanto las causas de la alta capacidad autorreactiva de cier-tos individuos (según su HLA) como el papel que juegan cier-tas moléculas propias implicadas en la ruptura de la tolerancia(la proteína GAD de las células beta).Independientemente del nivel académico alcanzado para des-cifrar la relación entre la genética y la autoinmunidad, se debetener cierta cautela respecto de la interpretación práctica de losanálisis de genotipificación del sistema HLA y, obviamente, res-pecto de la información que se brinda a la población de riesgoeventualmente estudiada. En efecto, la presencia de alelos DQBde predisposición, aún en la forma homocigota, no asegura lapredicción del desarrollo futuro de la enfermedad. En todo ca-so la información analítica indica que existe un determinadoriesgo relativo para padecerla. Justamente, debido a que la dia-betes tipo 1 es una enfermedad multifactorial y poligénica, losotros genes implicados fuera del sistema HLA, también jueganun papel definitorio. Además, se debe tener presente que losfactores ambientales interactúan con los factores genéticos depredisposición para desencadenar finalmente la expresión clíni-ca de la enfermedad. Por ello la visión actual es que la diabetestipo 1 es una enfermedad que se halla comprendida dentro delgrupo de enfermedades autoinmunes, que a su vez tambiénpresentan asociación con alelos específicos Clase II del sistemaHLA. Al respecto se han descripto familias que, además de pre-sentar miembros con diabetes tipo 1, son afectadas por otrasenfermedades autoinmunes órgano-específicas y, en menormedida, por las sistémicas. Ejemplos de ellas son la enfermedadtiroidea autoinmune (enfermedad de Graves y el síndrome deHashimoto), la enfermedad celíaca, la artritis reumatoidea, ellupus eritematoso sistémico, etc.

VNTREn general muchas de las enfermedades autoinmunes tienenun órgano blanco específico contra el cual se dirige la agresióninmunológica. El conocimiento de las bases que determinanuna respuesta autorreactiva específica hacia un órgano blanco(por ejemplo, los islotes pancreáticos y en particular las célulasß) es lo que determinará la comprensión de la etiopatogenia,orientará las posibles intervenciones terapéuticas para la pre-vención y, por último, mejorará las chances de curación de estaenfermedad. Es muy probable que ciertos genes que se encuen-tran fuera del sistema HLA jueguen un papel crítico para deter-minar la expresión de la autoinmunidad órgano-específica. Unbuen ejemplo de esto se tiene con el gen de la insulina, el cualse encuentra ubicado en el brazo corto del cromosoma 11. Está

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Figura 5.3

Organización genómica de los alelosClase I, II y III en la región VNTR, up stream (“corriente arriba” del extremo 5´) del gen de la insulina.Se señala la asociación de la varianteClase I small (corta) con la diabetes autoinmune.


te polimorfismo con la región reguladora del gen de la insuli-na sugiere que podría estar involucrado en la regulación de laexpresión de ese gen. En trabajos recientes se propone que laexpresión del gen está correlacionada con la longitud del VNTR,flanqueante en la región 5’ del gen de la insulina. Kennedy ycol. (véase la bibliografía recomendada) encontraron una re-ducida expresión del gen en células productoras de insulina,transfectadas con construcciones de promotores de insulinaque contenían el alelo de Clase I, con respecto a aquellas quecontenían el alelo de Clase III. En los individuos con la varian-te S la pobre expresión de la insulina a nivel del timo ha sidoimplicada en la pérdida de tolerancia central (5.4). La participación de la región VNTR vecina al gen de la insulinasería, según la visión actual, la de un gen específico de órganoque “dirige” la reacción autoinmune contra ese en particular.De todas maneras, el conocimiento de otros genes, como losque codifican para factores de transcripción o de replicaciónespecíficos de la célula ß, permitirá en el futuro profundizar elconocimiento de la patogénesis de la diabetes tipo 1. Así sepodrá determinar la interacción biológica entre los genes delsistema HLA que regulan la respuesta autoinmune y los genesórgano-específicos.Luego de haber demostrado la fuerte asociación entre alelos po-limórficos del sistema HLA y el VNTR del gen de la insulina con laenfermedad, se debe demostrar la relación de éstos con la varia-ción molecular de su expresión o con su función. Indudablemen-te al considerar una enfermedad poligénica y de etiopatogeniaheterogénea, como la diabetes tipo 1, no se puede establecer unpatrón único vinculado a la causa genética, ni se puede anticiparel éxito de una sola terapéutica, o una simple medida de inter-vención con la finalidad de prevenir la enfermedad.

CTLA4La molécula proteica CTLA4 es conocida desde hace un tiempoen Inmunología celular por ser un marcador que se expresa encélulas reactivas del tipo linfocito T. Esas células están involu-cradas en la activación inicial, tras la interacción con las célulaspresentadoras de antígenos (APC), como los macrófagos y mo-nocitos, regulando la inmunidad celular. Se sabe que el gen co-dificante para CTLA4 es un candidato en la participación deenfermedades autoinmunes, debido a sus funciones de regula-dor negativo del mecanismo coestimulatorio durante la inte-racción de linfocito B y T. El gen CTLA4 integra el grupo de ge-nes de susceptibilidad para la diabetes tipo 1, clasificándoselocomo IDDM12. Actualmente se sabe que en la posición 49 del


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blación argentina. A partir de este tipo de estudios se halló quela presencia de los alelos polimórficos varía en los diferentesgrupos raciales. Así se estableció que los alelos de Clase II sonpoco frecuentes entre los caucásicos y en cambio entre la razanegra se observó su frecuencia más alta, llegando a un 22%.Por otra parte, se determinó una frecuencia superior de la for-ma homocigota para los alelos de Clase I en el grupo de pacien-tes diabéticos, comparados con los controles no diabéticos, locual concuerda con estudios previos realizados en caucásicos. El 81,3% de los pacientes con diabetes tipo 1 en el estudio rea-lizado en la Argentina (5.3) presentó el alelo de susceptibilidadde Clase I, en relación con el 69,9% del grupo control y el 80,6% del grupo con LADA. El alelo de Clase III, considerado un alelo protector para la dia-betes tipo 1, también mostró una diferencia significativa:27,9% en el grupo control y 15,3% en los pacientes diabéticostipo 1 (Tabla 5.3).Se ha establecido que los alelos de Clase I son los que más va-rían en tamaño. McGinnis y Spielman fueron los que subclasi-ficaron los alelos de Clase I en alelos de Clase S (Small) y alelosL (Large) de acuerdo a la longitud determinada por el númerode pares de bases que constituía cada tipo de alelo. Estos au-tores hallaron que los alelos S estaban más fuertemente aso-ciados a diabetes tipo 1 en un estudio llevado a cabo con fami-liares de primer grado de diabéticos tipo 1. La mayor frecuen-cia de alelos S estuvo presente entre los pacientes con LADA,63,4%, con respecto a diabetes tipo 1, 53,4%, y a los controlesnormales, 37%, en el estudio llevado a cabo en Argentina (Ta-bla 5.4). Estos datos son coincidentes con los publicados porotros autores (véase en la bibliografía recomendada los traba-jos de Owerbach y col) los que compararon diabetes tipo 1 ycontroles. A partir de estos datos, comparando alelos S y L en-tre diabéticos con autoinmunidad y controles, surge claramen-te que los alelos S se encuentran fuertemente asociados a dia-betes autoinmune y dentro de ésta a los pacientes con LADA. La presencia de los alelos susceptibilidad del gen DQB 0201 /0302, junto a la forma homocigota del alelo de Clase I delVNTR del gen de la insulina (en particular el alelo S), constitu-ye un haplotipo que presenta una amplia diferencia estadísti-ca entre el grupo control y los pacientes con diabetes autoin-mune. Este haplotipo se constituye de esta manera en un im-portante marcador de predisposición para la diabetes autoin-mune y, fundamentalmente, el LADA. El rol del locus polimórfico en el extremo 5’ del gen de la insu-lina no está completamente claro, aunque la proximidad de es-

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Tabla 5.3

Frecuencia de alelos Clase 1, 2 y 3 delVNTR del gen de la insulina en lapoblación argentina normal y en lospacientes diabéticos.

Tabla 5.4

Frecuencia de alelos Clase I (en particular IS), 2 y 3 del VNTR delgen de la insulina en la poblaciónargentina normal y en los pacientesdiabéticos.


exón 1 del CTLA4 existe un polimorfismo de transición deno-minado por las bases participantes, A-G (Figura 5.4). En un trabajo efectuado sobre individuos japoneses se demos-tró que los pacientes diabéticos adultos de evolución progresi-va y lenta a las forma tipo 1, con el marcador humoral GADApositivo, estaban asociados con el alelo A, mientras que los pa-cientes que manifestaban la evolución abrupta se asociabanpreferentemente con el alelo G.Se ha demostrado que la presencia de la variante G disminuyela síntesis de CTLA4 y altera su procesamiento postranscripcional(glicosilación de la proteína), por lo tanto los portadores del ale-lo G tienen una alteración en el CTLA4 que determina una me-nor capacidad para frenar la respuesta autoinmune, derivandoen una forma más abrupta en el desarrollo de la enfermedad. En el trabajo que se realizó en la Argentina sobre tipicación deese polimorfismo en el gen CTLA4, se encontró una diferenciaestadísticamente significativa en la presentación de la formaheterocigota AG cuando se compararon pacientes diabéticostipo 1 y LADA: 39,8% vs. 55,3% respectivamente (Tabla 5.5).Luego otro grupo demostró que los heterocigotas expresanpreferencialmente el alelo A. De ahí que el LADA está más pro-tegido que los diabéticos tipo 1 (5.5).Si bien estos estudios sirven de orientación preliminar, existeuna fuerte presunción que en otros grupos étnicos, como loscaucasoides, los cambios polimórficos en el gen CTLA4 en los

pacientes con marcadores humorales de autoinmunidad, tam-bién pueden modular el desarrollo del proceso autoinmune anivel del modo de aparición. Debido a que las distintas formas en que se puede presentarla diabetes autoinmune es tratada especialmente en la sec-ción 7. La diabetes autoinmune emergente en edad infanto-juvenil y adulta, en la presente sección sólo se proporcionanlos elementos conceptuales elementales, de modo de adelan-tar cuáles son las bases genéticas condicionantes para la ex-presión diferencial de las variantes prototípicas de la diabetestipo 1 “clásica”, infanto-juvenil, y de las subvariantes de apa-rición en edad adulta.

En resumen, respecto de lo expuesto sobre la predisposición ge-nética a diabetes autoinmune, los polimorfismos en genes HLA(fundamentalmente DQA y DQB) son los que condicionan princi-palmente para la diabetes tipo 1 y tienen menos peso en la sus-ceptibilidad para LADA, donde cobran mayor protagonismo lospolimorfismos en genes como el VNTR de la insulina y el CTLA4.La Figura 5.5 muestra un esquema integrado del patrón gené-tico predisponente para la diabetes autoinmune, incluyendo elsistema HLA, la recombinación de genes codificantes para losreceptores T, los genes CTLA4 y la región VNTR.


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Esquema de la presentación antigénicade una célula tipo APC a un linfocito Tcon regulación positiva (coestimulación)y negativa (inhibición), en este últimocaso mediada por CTLA4. Se indicanlas variantes polimórficas A y G que probablemente se asocian con la distinta velocidad de evolución a la diabetes tipo 1.

Figura 5.4 Tabla 5.5

Frecuencia genotípica de alelos del gen CTLA4 en la población argentina normal y en los pacientesdiabéticos.

Figura 5.5

Esquema integrado del patrón genéticopredisponente para la diabetes autoinmune, incluyendo el sistemaHLA, la recombinación de genes codificantes para los receptores T, los genes CTLA4 y la región VNTR del gen de la insulina.


tización y expresión semicuantitativa en unidades arbitrarias(UJDF). Si bien este marcador ha tenido un papel relevante en elcurso histórico reciente del tema, en la actualidad está siendoreemplazado con ventajas por parte de las técnicas prospectivasde marcadores individuales que utilizan antígenos recombinan-tes clonados y sistemas analíticos cuantitativos (tests radiométri-cos e inmunoenzimáticos). Inclusive inicialmente estos métodosespecíficos para marcadores individuales se utilizaron comple-mentariamente con los de inmunofluorescencia para determi-nar ICA. De ese modo existen muchos estudios en los que se hancomputado datos mixtos de ICA en conjunción con uno o másde los otros marcadores. Esto desde la visión actual puede obje-tarse, pues se sabe que los autoantígenos involucrados en la de-tección por IFI incluye GAD e IA-2. Por lo tanto la complementa-ción de los ICA con otros métodos diferentes que superponenlos mismos analitos, con diferente sensibilidad, es de dudoso sig-nificado. Por ello últimamente la prospección de marcadores selimita a la aplicación de tests individuales, con exclusión de losICA. La sensibilidad combinada de tests para GADA, IA-2A e IAA/PAA supera ampliamente a la del test clásico de ICA y disminu-ye las incertidumbres sobre eventuales falsos positivos.

Autoanticuerpos anti-insulina (IAA) y anti-proinsulina (PAA):Desde 1983 se sabe que una fracción considerable de los pa-cientes debutantes con diabetes tipo 1 tienen anticuerpos es-pecíficos hacia la insulina (5.7). Para ello se utilizó un ensayode unión de radioligando, o RBA (de Radioligand Binding As-say). Cuando la aparición de estos anticuerpos en la circula-ción es anterior al tratamiento con insulina exógena existecerteza de su origen autoinmune, de ahí que se los identifi-que como IAA (de insulin autoantibodies). La tolerancia nor-mal hacia la hormona se quiebra probablemente como conse-cuencia de la liberación de insulina en concentraciones localesanormalmente altas desde los gránulos donde se almacena,tras la lisis de las células beta. Además, la agregación molecu-lar de la insulina en los gránulos y la existencia de los precur-sores hormonales, como la pre-proinsulina y la proinsulina,factibilizan su reconocimiento como neoantígenos, no some-tidos a la tolerancia.Por otro lado, a los pocos días de la administración terapéuti-ca de insulina (aún las de mejor calidad y pureza), pueden apa-recer anticuerpos específicos, los cuales se denominan operati-vamente como IA (de Insulin Antibodies). La inducción de losIA, indistinguibles analíticamente de los IAA, genera una inter-ferencia que impide determinar este último marcador una veziniciada la insulinoterapia.


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LOS MARCADORES INMUNOLÓGICOS DE LA DIABETES AUTOINMUNE

La Figura 5.6 muestra un esquema simplificado sobre la agre-sión celular hacia las células beta de los islotes y el surgimien-to del la respuesta humoral específica, esto es, la síntesis de losautoanticuerpos o marcadores de la diabetes tipo 1. Los mar-cadores aparecen en la circulación mucho antes de la expre-sión clínica de la enfermedad. Por ello son importantes ele-mentos predictivos, denunciando el período prodrómico encurso de la patología autoinmune y además representan valio-sos parámetros de apoyo diagnóstico. A continuación haremosuna breve reseña de los marcadores más importantes.

Anticuerpos anti-células del islote (ICA): Desde hace más de uncuarto de siglo los ICA han sido los marcadores más usados pa-ra el apoyo diagnóstico y la prospección de la diabetes tipo 1(5.6). Preceden en años a la aparición de los síntomas clínicos y,luego de instalada la enfermedad, desaparecen paulatinamen-te. La detección de los ICA se lleva a cabo mediante una técnicade microscopía basada en la inmunofluorescencia indirecta (IFI).Se utilizan cortes de páncreas humano fresco de grupo sanguí-neo cero, para evitar las posibles interferencias de las aglutini-nas de los grupos sanguíneos. Aunque la determinación de ICApor IFI fue importante para la predicción de la diabetes tipo 1,las limitaciones prácticas que se presentaron durante su imple-mentación impulsaron el desarrollo de mejoras para su sistema-

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Figura 5.6

Esquema representativo de la agresióninmune celular a la célula β (izquierda)y respuesta inmune humoral hacia los componentes celulares, con la generación de los autoanticuerpos marcadores de la diabetes tipo 1(derecha).


de los síntomas clínicos de la enfermedad. Además, este mar-cador no varía con la edad de los debutantes, ni decae dema-siado con el tiempo. En la predicción de la diabetes tipo 1 sedestacan por su alta especificidad: Un 0-1% de los individuossanos exhiben datos aparentemente positivos para GADA,mientras que entre los parientes en primer grado de un pa-ciente con diabetes tipo 1 la prevalencia supera el 10%. Entrelos que contraen la diabetes este valor asciende al 90%.Como los GADA pueden aparecer en otros desórdenes autoin-munes endócrinos, no siempre debe tomárselos como marca-dores de la diabetes tipo 1 y por ello es conveniente asociarloscon otras determinaciones complementarias.

Anticuerpos anti-tirosina fosfatasa IA-2 (IA-2A, o ICA512A): Estemarcador fue descripto en 1995, resultando parcialmente coin-cidente con otro definido en 1990 como 37/40K (5.10). En 1996se identificó que en realidad el componente de 37K correspon-de a otra tirosina fosfatasa homóloga, denominada IA-2β(5.11). El componente 40K es entonces el que corresponde a lafosfatasa IA-2 localizada en los gránulos de secreción y en lamembrana citoplasmática. A diferencia del domino extracelu-lar, sometido a tolerancia, esta porción normalmente no estáaccesible al sistema inmune, integrando las estructuras intrace-lulares crípticas que se exponen tras la lisis de la membrana.Además, se ha especulado respecto a que la tolerancia hacia laporción de IA-2 intracelular yuxtapuesta a la membrana plas-mática se puede perder por procesamiento alternativo a niveldel ARNm. Esto se basa en que se han detectado productos deexpresión que carecen de ese sector y tal vez las células del sis-tema inmune sean las que en ciertas circunstancias “ignoran”esa porción del dominio intracelular de IA-2 como una estruc-tura propia. Aunque los IA-2A se detectan en el 7% de los familiares en pri-mer grado de los pacientes con diabetes tipo 1, ese valor se ele-va a 64% si se toman en consideración sólo los que se tornandiabéticos en los años siguientes.

VALOR PREDICTIVO POSITIVO DE LOS MARCADORES APLICABLES

A GRUPOS DE RIESGO

El valor predictivo positivo (VPP) es una estimación estadísticaaplicada a cada test para marcadores, que guarda relación con elriesgo para padecer diabetes durante el seguimiento longitudi-nal durante intervalos determinados. En la Figura 5.7 se muestrala ecuación usualmente aplicada para calcular el VPP a partir dela información epidemiológica y de los datos analíticos prove-nientes del screening de los marcadores de diabetes tipo 1.


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Mediante RBA se detectaron IAA aproximadamente en el 50%de los sueros provenientes de pacientes debutantes con diabe-tes tipo 1, observándose que el marcador se correlaciona inver-samente con la edad. Esto es, los IAA muestran mayor preva-lencia entre los pacientes que debutan con diabetes tipo 1 aedades más tempranas, sin embargo, en algunos pacientesadultos diabéticos los IAA parecen tener un origen y una pre-valencia diferentes. La deteminación del marcador relacionado a los precursoresde la insulina, fundamentalmente la proinsulina (PAA), mere-ce una consideración aparte. Además de la esperable inmuno-rreactividad cruzada entre la insulina y la proinsulina frente alos anticuerpos inducidos por cualquiera de ellas, existe la po-sibilidad que existan anticuerpos exclusivos hacia la proinsuli-na entre la mezcla policlonal de los sueros positivos para elmarcador “IAA/PAA”. En esos casos el marcador sería estricta-mente PAA y sus implicancias serían claras respecto del verda-dero autoantígeno inductor durante los eventos que condu-cen al reconocimiento de las estructuras moleculares propias(en este caso la familia de la insulina, sus precursores y sus in-termediarios inmaduros en los gránulos de secreción).

Autoanticuerpos anti-GAD (GADA): En 1982 se había descriptoun autoantígeno de las células beta reconocible por radioin-munoprecipitación y se lo denominó 64K. En 1990 se lo identi-ficó como GAD (5.8), la enzima conocida en Neurobiología porsu capacidad de sintetizar el neurotransmisor inhibitorio GA-BA a partir de ácido glutámico. Ese hallazgo se produjo comoconsecuencia de la alta incidencia de la diabetes tipo 1 en pa-cientes con el síndrome Stiff-man (hombre rígido), una enfer-medad neurológica rara asociada a la presencia de GADA. Sesabe que existen dos formas de la enzima, identificables porsus pesos moleculares de 65 kDa y 67 kDa (GAD65 y GAD67,respectivamente). En el hombre la GAD65 se localiza principal-mente en el sistema nervioso y en las células beta pancreáticas,mientras que la GAD67 está sólo en el primero, por lo cual elantígeno reconocido por los GADA en la diabetes tipo 1 esfundamentalmente la GAD65. Por distintos talleres intenacio-nales y programas de estudios epidemiológicos se sabe que laprevalencia del marcador GADA en los pacientes debutantescon diabetes tipo 1 es del 70-80%. Si se determinan GADA jun-tamente con otros marcadores, la sensibilidad combinada su-pera el 90% (5.9). Los GADA constituyen el marcador más precoz de la diabetestipo 1, ya que se detectan hasta 8-10 años antes de la aparición

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minación de marcadores en los grupos de riesgo, así como eleventual apoyo que brindan los tests de genotipificación HLA. Los grupos de riesgo para diabetes tipo 1 están integrados no só-lo por los familiares en primer grado de los pacientes diabéticos,sino por los individuos con otras patologías autoinmunes restrin-gidas por los mismos HLA: enfermedad tiroidea autoinmune(Graves- Basedow, Hashimoto), enfermedad celíaca, artritis reu-matoidea, etc. En un estudio local realizado en el Hospital de Clí-nicas J. de San Martín, UBA, División Endocrinología, (Dr. H. Nie-pomniszcze y Dr. O. D. Bruno), junto al Instituto de Estudios de laInmunidad Humoral (IDEHU, CONICET-UBA), se determinó que el6.5% de los 425 pacientes con tiroideopatías mostraban al me-nos un marcador positivo de autoinmunidad hacia las células be-ta, frente al 0% de los 100 controles normales. Además, uno delos pacientes exhibía el perfil de positividad para GADA e IA-2Ay, por ende, alto índice de riesgo para desarrollar diabetes autoinmume (trabajo aún inédito, divulgado en su versión preli-minar: “Diabetic immune markers in thyroid diseases. Prelimi-nary studies on autoantibodies to glutamic acid decarboxilase(GADA)”. 45èmes Journees Internationales d´Endocrinologie Cli-nique. Edit. En Memoria. Paris, Francia. 23-24 de mayo de 2002). También integran grupos de riesgo las pacientes con diabetesgestacional, 5% de las cuales poseen serología positiva paramarcadores y evolucionan a diabetes tipo 1. En un trabajo rea-lizado en 1994 por los grupos dirigidos por el Dr. J. Alvariñas(Hospital Durand) y el Dr. E. Poskus (IDEHU, CONICET-UBA) sedemostró que en nuestra población el 5% de las pacientes dia-béticas gestacionales eran GADA+.Los pacientes diabéticos con debut en edad adulta han mostra-do una prevalencia considerable de marcadores de autoinmu-nidad (5.12), por lo cual también integran grupos de riesgo pa-ra la insulinodependencia. En este caso el riesgo se expresaríacomo una “insulinorrequiriencia” asociada a autoinmunidad,con evolución frecuentemente más lenta que la de los pacien-tes con diabetes tipo 1 o latente (LADA). En un estudio recien-temente publicado, el grupo del IDEHU (CONICET-UBA) de-mostró que el 90% de los pacientes adultos (tipo LADA y tipo2 con evolución lenta al déficit funcional), positivos para untest combinado GADA/PAA, pasaron al requerimiento insulíni-co, sugiriendo que ese tipo de análisis es útil para la pondera-ción del proceso autoinmune asociado al deterioro progresivode la secreción de insulina (5.13). Para todos estos casos, los valores predictivos positivos deberíangenerarse de estudios ad hoc, ya que los VPP derivados de tra-bajos como el de Verge y col. provienen de familiares en primer


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Uno de los estudios más representativos sobre predicción de dia-betes tipo 1 en familiares en primer grado de pacientes diabéti-cos, expresando los riesgos en términos de VPP, es el de Verge ycol. (5.9). En ese trabajo se determinaron los marcadores GADA,IA-2A e IAA en 882 familiares sanos de diabéticos tipo 1, 50 delos cuales se tornaron diabéticos tras el seguimiento de controldurante más de 10 años. Entre ellos, 98% presentaron positivi-dad en los estudios de RBA para uno o más de los marcadores y80% eran positivos para dos o más de los mismos marcadores,comparados con tests negativos para casi todos los controles. Losvalores de VPP a 3 y 5 años y para algunas combinaciones de doso más marcadores, se muestran en la Tabla 5.6. Esos perfiles ex-plican por qué se han desarrollado variantes analíticas combina-das para dos marcadores en un solo test, como GADA/IA-2A.Además en el mismo trabajo de Verge y col. se pudo demostrarpara algunos de los marcadores una asociación significativa conHLA-DR4-DQ8 (nótese que la nomenclatura citada, DQ8, corres-ponde a la emergente de la detección serológica del antígeno,hoy tipificado desde el ADN en términos del alelo DQB1 0302).Esos datos y otros provenientes de varios estudios independien-tes, ilustran suficientemente sobre el valor potencial de la deter-

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El valor predictivo positivo (VPP) se calcula por la fórmula recuadrada. Losvalores de sensibilidad y especificidadpara cada marcador se obtienen luegode analizar un número suficientementegrande de individuos enfermos y controles sanos, respectivamente.

Figura 5.7

Tabla 5.6

Valores representativos de VPP paramarcadores de la diabetes tipo 1 individuales y en algunas combinatoriassimples o con tests funcionales, comola determinación del primer pico de secreción de insulina. Los estudios seefectuaron sobre un grupo de riesgo,como son los familiares en primergrado de pacientes con diabetes tipo 1.Datos tomados del trabajo de Verge y col. (5.9).


de otra forma de expresión, en términos de unidades de preci-sión: “scores de desvíos estándar”, o sDS. Esta forma de expre-sión relativiza las señales respecto del nivel del valor inespecífi-co, computando la dispersión de los datos de los controles. Porejemplo, un informe analítico para un marcador puede incluirlos siguientes valores: B% = 10.0; inespecífico B% = 3.0; sDS = 10.0.Ese valor es más convincente como indicador de positividad res-pecto de otro tipo de análisis que eventualmente exhibieraproporciones comparables entre las señales brutas de la mues-tra del paciente y la de los controles, pero su bajo sDS disminu-yera sensiblemente la significación de la positividad. Esto sueleocurrir sitemáticamente con los métodos analíticos de marca-dores basados en enzimoinmunoanálisis (ELISA).Para el caso del marcador GADA, el método de referencia(5.15) también conduce en principio a señales de B%, pero lue-go éstas se procesan en términos de unidades GAD Index. Ta-les unidades se obtienen por la comparación de la respuesta enel mismo test de un suero patrón internacional, provenientede un paciente con Síndrome de Stiff Man, GADA positivo. Lasunidades de estos análisis normalizados varían para el univer-so de resultados posibles entre el valor negativo del inespecífi-co (controles normales) y un máximo de 2.5 GAD Index. Ade-más estos análisis también pueden acompañarse de la expre-sión sDS, mejorando la consistencia y, por ende, la confiabili-dad de los resultados.Algunos autores han llegado a proponer la subclasificación delos pacientes con diabetes autoinmune en base al nivel de losmarcadores. Lohman y col. (5.16) propusieron suclasificar a lospacientes inicialmente definibles como LADA en los tipos LA-DA 1 (menor función de las células beta, rápida evolución a lainsulinodependencia, complicaciones microangiopáticas y al-tos títulos de GADA) y LADA 2 (similares a los diabéticos tipo2, con presencia de insulinorresistencia, evolución más lenta ala insulinorrequiriencia y bajos títulos de GADA). Para más de-talles, ver sección 7. La diabetes autoinmune emergente enedad infanto-juvenil y adulta.

6. LOS MÉTODOS ANALÍTICOS PARA EL APOYO DIAGNÓSTICO DE DIABETES

Además de los métodos bioquímicos “convencionales” para elcontrol y seguimiento de la diabetes (determinación de gluce-mia, hemoglobina glicosilada, pruebas funcionales de reservapancreática, insulinemia, péptido C, relación insulina/proinsuli-


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grado, sanos, de pacientes con diabetes tipo 1 y no de individuoscon patologías endócrinas autoinmunes, diabetes gestacional,o con diabetes presuntivamente clasificada como de tipo 2. Ade-más, los grupos étnicos involucrados en todos esos casos no soniguales. Por todo lo comentado, la utilización de datos de VPPde estudios de referencia sólo debería aplicarse a otros modelosdiferentes de investigación clínica de manera tentativa.

IMPORTANCIA DE LA PONDERACIÓN CUANTITATIVA DE LOS MARCADORES

Los primeros intentos por cuantificar el nivel de los marcado-res en el suero provienen de la determinación de los ICA. A tra-vés de la labor de talleres internacionales especializados, se lo-gró disminuir la variabilidad de los resultados y asignarles elcarácter de “cuantitativos”, mediante la normalización de pro-cedimientos de titulación (5.14). Estos últimos consisten en lautilización de diluciones seriadas de los sueros sometidos aanálisis, frente a sueros patrones de referencia y de un proce-samiento especial de cálculo. Las unidades arbitrarias con quese expresan estos análisis de ICA se designan como “UJDF” (deUnidades de la Juvenile Diabetes Foundation). Así, por ejem-plo, 5 ó 10 UJDF, según el laboratorio, puede significar el valorlímite de negatividad y 20, 40 u 80 UJDF, representarían res-puestas progresivamente más intensas para ese marcador.Para los marcadores determinados en la actualidad por los mé-todos radiométricos de referencia (RBA), las señales constituyende por sí expresiones cuantitativas relativas (porcentaje de bin-ding del antígeno trazador radiactivo, B%). Como estas señalesdependen críticamente del diseño metodológico, es importan-te su normalización para los fines comparativos de los resulta-dos interlaboratorios. Tales son los casos de los marcadores IAAe IA-2A, para los cuales los estudios epidemiológicos suelencomputar simplemente los resultados como positivos o negati-vos. Sin embargo, en los informes de análisis individuales el va-lor de B% debe interpretarse como el nivel de la respuesta au-toinmune humoral, lo cual a su vez es sólo un reflejo indirectode la respuesta autoagresiva celular. La cuestión sobre si el ni-vel del marcador en el suero realmente denuncia el grado deavance del estadío prodrómico de la enfermedad es dudosa,pues la constitución genética de cada individuo (el HLA entreotras) condiciona su categoría de “bajo” o “alto respondedor”para los autoanticuerpos, con cierta independencia de la inten-sidad del daño T-dependiente a las células beta. A pesar de ello,es razonable suponer que las respuestas muy francas implicanmayor riesgo, al menos desde el punto de vista estadístico. Porello las unidades B% de los RBA también pueden acompañarse

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leccionan según el caso, según se necesite tipificar las variantespolimórficas de un individuo entre el repertorio de alelos natu-rales en la población general (genotipificación PCR-ASO), o setrate de la detección de una secuencia alterada por pequeñasmutaciones o lesiones mayores en los genes (PCR-RFLP). Paramayores detalles sobre estos remas, véase más adelante el sub-título Genotipificación HLA.

SOUTHERN BLOT

La técnica de Southern blot permite identificar secciones deter-minadas de ADN, por lo cual es de suma utilidad para la detec-ción de polimorfismos genéticos. Esta técnica consiste en lafragmentación del ADN con enzimas de restricción, las que cor-tan en sitios específicos. Luego se separan electroforéticamen-te los fragmentos generados, seguidamente se transfieren a unsoporte sólido apropiado (membrana de Nylon) en forma des-naturalizada (con sus cadenas separadas) y por último se las hi-bridiza (lo cual significa que se permite su unión) a sondas es-pecíficas. Estas sondas son fragmentos de ADN complementarioa la región que se quiere identificar y que fueron radiomarca-das con 32P. Una vez producida la hibridización entre el ADN yla sonda, se coloca una placa radiográfica en contacto con lamembrana de Nylon. Así se detecta por fotorreacción el frag-mento oligo o polinucleotídico de interés, el cual exhibe dife-rente movilidad electoforética y, por ende, un posicionamientodeterminado en la matriz del soporte. Los mapas de bandas ob-tenidos muestran los diferentes fragmentos generados por cor-te con las distintas enzimas de restricción.

GENOTIPIFICACIÓN HLALa genotipificación de los diferentes alelos polimórficos de losgenes del HLA se basa en la detección de la variación de la se-cuencia nucleotídica presente en el segundo exón de los genesde Clase II, como por ejemplo el gen DQB1. A tal fin se cuentacon las siguientes técnicas de Biología Molecular:PCR-ASO (allele specific oligonucleotide): luego de la amplifi-cación por PCR del gen B de la región DQ se obtiene un pro-ducto de 260 pb, el cual se transfiere a una membrana de Ny-lon por medio de Dot Blot. El producto en la membrana se hi-bridiza contra probes, o segmentos oligonucleotídicos, que in-cluyen las distintas variaciones en las bases según los diferen-tes alelos conocidos del gen DQB.PCR-RFLP (restriction fragment length polymorphism): en estatécnica el producto de amplificación de PCR es cortado por en-zimas de restricción que reconocen diferentes secuencias. Co-


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na, etc.), actualmente existe un panel de pruebas genéticas einmunológicas que sirven para el apoyo diagnóstico preciso dela diabetes con componente autoinmune. En las secciones an-teriores se describieron las bases genéticas e inmunológicas dela diabetes autoinmune, independientemente que se trate dela diabetes tipo 1 típica o se asocie a otras formas. Entre ellas sedescribieron los casos en los que la diabetes autoinmune se aso-cia a otras formas definidas o, contrariamente, a formas inde-terminadas, en los individuos diagnosticados en edad adulta.En esta sección describiremos con mayor detalle cuáles son esasdeterminaciones y sus fundamentos, ya que su comprensión re-sulta conceptualmente importante. La indicación de aplicaciónde esos tests, así como la correcta interpretación de los resulta-dos producidos en los laboratorios de genética e inmunosero-logía, es de gran importancia para la interlocución médico-bio-química, así como para el ejercicio racionalizado de los algorit-mos diagnósticos y la instalación de las terapias correctas.

PCRPara poder amplificar fragmentos de ADN por PCR se debe con-tar con dos oligonucleótidos de alrededor de 20 pb, o primers,complementarios a los extremos 5’ y 3’ de la región a amplificar.Estos se diseñan a partir de la secuencia conocida del ADN enesa región y se los denomina sense y antisense, respectivamen-te. La amplificación del ADN entre los extremos definidos porlos primers se logra por la acción de la enzima Taq Polimerasaque tiene la capacidad de copiar repetitivamente y en progre-sión geométrica la secuencia del molde (templado) a partir delos nucleótidos agregados en el medio de reacción. De este mo-do se genera primero una cadena hija por cada hebra del tem-plado. La progresión de la amplificación se hace exponencial,pues si se parte de las 2 hebras originales de ADN en el paso si-guiente se obtienen 4, luego 8, 16, etc. Si esta serie se repite enforma cíclica 30-40 veces, se obtiene una amplificación que su-pera el millón de cadenas sintetizadas a partir de las 2 origina-les. Estos pasos repetitivos de síntesis requieren cambios cíclicosde temperatura (con un equipo denominado ciclador térmico)para favorecer sucesivamente la separación de las dobles cade-nas complementarias del ADN (94-96 ºC), la unión de los primers(annealing, a 50-55 ºC), la elongación de cada cadena durante lacopia bidireccional con la polimerasa (72 ºC) y el rearmado de lascadenas por establecimiento de los puentes de hidrógeno entrelas bases complementarias de las respectivas cadenas. Una vezamplificado el fragmento de interés, se utilizan técnicas comple-mentarias que permiten la tipificación del producto. Éstas se se-

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zadores isotópicos agregando un aminoácido radiactivo a elec-ción dentro del cóctel de los aminoácidos normales (6.2). Resu-midamente, en esta técnica se aisla el gen codificante de laGAD65 humana y se lo expresa en un sistema eucariota (lisa-dos de reticulocitos), con la polimerasa y los otros ingredientesnecesarios para la biosíntesis de proteínas. Entre ellos están to-dos los aminoácidos naturales, menos el que se sustituye poruna variante radiactiva (en general, la 35S-Metionina). Así esposible obtener GAD65 radiactiva prácticamente intacta paraefectuar un RBA parecido al descripto para los IAA. Los GADAson determinados en este caso tras una inmunoprecipitaciónmás refinada, con proteína A-Sepharose, tras lo cual la emisiónbeta del radionucleido se mide en un contador de centelleo lí-quido. Los resultados se suelen comparar con un suero patróninternacional de referencia y las unidades de expresión se in-forman como un índice numérico relativo (GAD index).Para la determinación de IA-2A, o ICA512A, también se efec-túan análisis de inmunoprecipitación específica del tipo RBA,tal como se describió para los GADA, utilizando de manera in-distinta construcciones genéticas que codifican para la proteí-na tirosina fosfatasa IA-2 completa, o para el dominio intrace-lular, como el fragmento ICA512bdc (6.3). Un aspecto importante a tener en cuenta en la analítica de losmarcadores es el control de calidad inter-laboratorios que ase-gure la adecuada sensibilidad, exactitud y reproducibilidad delos resultados. Los procedimientos de RBA para determinarIAA han sido controlados frecuentemente por los programasInternational Proficiency Tests, Immunology Diabetes Workshop,University of Florida, USA y los análisis para GADA e IA-2A oICA512A por los respectivos Proficiency Tests, Research Institutefor Children, Harahan, Los Angeles, USA. La relativa complejidad de estos análisis exige que se los ejecutebajo normas estrictas, las cuales se alcanzan en pocos centros es-pecializados, causando que sus costos sean relativamente eleva-dos. Eso a su vez causa una baja demanda y una accesibilidad res-tringida dentro de la rutina asistencial. La combinación de dosensayos radiométricos en un mismo test (método combinado),donde se colocan simultáneamente los trazadores de GAD65 yde IA-2, ha sido propuesta como una estrategia ventajosa y a lavez como una solución parcial para reducir los insumos, ya que lacostosa etapa separativa con proteína A-Sepharose se ejecuta encomún para ambos marcadores (6.4). Sin embargo, el grupo delIDEHU de la Facultad de farmacia y Bioquímica (CONICET-UBA),demostró que la aplicación de ese método combinado sólo es re-comendable para el estudio de la diabetes de tipo 1, ya que en


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mo se dijo anteriormente, en el caso de las genotipificacionesHLA de Clase II aplicadas a diabetes autoinmune, se estudia elsegundo exón del gen DQB, por lo cual se requiere la utiliza-ción de alrededor de 6 o 7 enzimas diferentes. Luego se efec-túa la corrida electroforética en geles de agarosa, que permi-te reconocer los diferentes alelos a través del mapa de bandasobtenidas.DOT BLOT reverso: los productos de amplificación de PCR sonutilizados como sondas o probes, las que son hibridizadas bajocondiciones muy estrictas, en una membrana de Nylon quecontiene los probes representativos de los diferentes alelos. Elanálisis de los diferentes puntos positivos de hibridización per-mite establecer los alelos de cada individuo.Secuenciación: la secuenciación directa del producto de ampli-ficación por PCR permite establecer el tipo de alelo en base alconocimiento directo de la secuencia nucleotídica.

DETERMINACIÓN DE MARCADORES

Los IAA fueron los primeros marcadores medidos por RBA co-mo inmunocomplejos mediante un método físico de alta sen-sibilidad, basado en la determinación de la radiación gammaque emite el radioisótopo 125I introducido en la molécula de in-sulina (trazador) (6.1). La insulina radiomarcada se prepara enel laboratorio a partir de Na125I y de la insulina recombinantehumana, disponible fácilmente a partir de las preparacionesfarmacéuticas, o se obtiene directamente de fuentes comercia-les. Los resultados se expresan en términos porcentuales de laradiactividad unida (B%) por los anticuerpos específicos, luegode la separación de la marca no unida mediante polietilengli-col, o por otros procedimientos (proteína A o G-Sepharose). Lacorrección de la unión inespecífica se establece por un test pa-ralelo donde se desplaza la marca con antígeno frío en concen-tración virtualmente infinita. El valor de corte se establece ha-bitualmente a partir del valor de B% de la media más 3 desvíosestándar para un número abundante de controles normales. Para el caso de los GADA, conocida la naturaleza de la proteí-na 64K como GAD, fue factible la obtención de trazadores ra-diactivos, tal como se había hecho para la insulina. La fuentede GAD al comienzo era la enzima natural extraída del cerebrode animales, como el cerdo, y la marcación se efectuaba tam-bién con 125I. Luego, con el desarrollo de los métodos de Biolo-gía Molecular, se pudo obtener por la vía recombinante, con laventaja adicional que los sistemas de transcripción y traduc-ción in vitro posibilitaron la preparción a voluntad de los tra-

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sarrollándose otra construcción modificada por ingeniería gené-tica (la mutación M161T) que mejora la calidad del producto deexpresión evitando la síntesis simultánea de una proteína conta-minante truncada, iniciada en la metionina 161, sin alterar laspropiedades inmunoquímicas de la GAD65 completa (6.12-6.13). Todos estos desarrollos se han encarado en el intento de reem-plazar las complejas y onerosas técnicas radiométricas, hallán-dose algunos de ellos en la fase de control de calidad compa-rativo respecto de los métodos RBA de referencia.

7. LA DIABETES AUTOINMUNE EMERGENTE EN EDAD INFANTO-JUVENIL Y ADULTA

DEFINICIÓN Y PATOGÉNESIS DE DIABETES

La reciente clasificación de diabetes es un nuevo intento porencontrar una forma adecuada de incluir las diferentes varian-tes patogénicas incluidas bajo el término diabetes (7.1). La an-terior clasificación de los años 70 se basaba en la edad comocriterio fundamental para agrupar las diferentes formas dediabetes, pero esto debió ser dejado de lado, ya que estas pue-den presentarse a diferentes edades a lo largo de la vida, aun-que algunas son características de la edad infanto-juvenil yotras de la edad adulta.La insulinodependencia fue un criterio utilizado posteriormen-te para caracterizar aquellas formas con patogénesis autoinmu-ne, pero este término no era conveniente en un determinadonúmero de casos. Debido a esto se llega a la última clasifica-ción, que fija un criterio eminentemente etiológico, denomi-nando diabetes tipo 1 a la diabetes producida por un mecanis-mo autoinmune. En la diabetes tipo 1 la agresión T-dependien-te contra las células ß del páncreas lleva a la destrucción de losislotes de Langherans con escasa o nula producción de insulinay, como se ha referido, la enfermedad está determinada princi-palmente por alelos de susceptibilidad del sistema HLA.La diabetes tipo 1 se presenta frecuentemente en niños o ado-lescentes, aunque lo puede hacer a cualquier edad y requieretratamiento con insulina. La diabetes tipo 2, es producida poruna alteración en la secreción de insulina con o sin insulinorre-sistencia, habitualmente está presente en la edad adulta, perotambién se puede presentar en la edad infanto-juvenil. De es-ta manera se pueden analizar las diferentes formas de diabe-tes de acuerdo a la edad de aparición.Queda entonces bien establecido que la diabetes tipo 1 es laforma de presentación característica en la edad infanto-juvenil,


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los individuos diagnosticados en edades adultas los perfiles dife-renciales de los distintos marcadores pueden ser distintos, exi-giendo su ponderación individualizada (6.5). Recientemente elmismo grupo logró la biosíntesis in vitro de un trazador 35S-Proin-sulina, apto para la determinación de PAA (6.6) y la eventualcombinación GADA/PAA (6.7- 6.8), apta para el screening rápidode autoinmunidad en los pacientes diabéticos detectados enedad adulta y con evolución al requerimiento insulínico.Por otra parte, los análisis de ICA mediante IFI convencional nohan evolucionado mucho después de su estandarización. Suuso sistemático se ha desalentado por la dificultad en la provi-sión de páncreas frescos con inmunorreactividad reproducibley por la inevitable subjetividad en la apreciación de los títulosbajos. Sin embargo, debido a que la ejecución de las IFI nece-sita baja complejidad de equipamiento y prescinde de las exi-gencias de las radiometrías, el grupo del IDEHU (CONICET-UBA) ha desarrollado una alternativa original para determinarlos GADA, preservando las ventajas de la inmunofluorescenciay sorteando las limitaciones de los cortes histológicos pancreá-ticos frescos, al reemplazarlos por un sistema artificial de célu-las CHO de hamster transfectadas con el gen de la GAD65 hu-mana (CHO-GAD) (6.9). A pesar que este sistema presenta so-lamente el autoantígeno GAD65 hiperexpresado, su sensibili-dad en el test de IFI es aceptable, abriendo la posibilidad futu-ra de crear sistemas co-transfectados, o combinados, conICA512. Además, la GAD65 humana expresada en las célulasCHO-GAD se halla en un contexto celular, exhibiendo el plega-miento nativo y la asociación normal a estructuras membrano-sas sináptico-símiles. Ese diseño alternativo explica algunos re-sultados GADA+ obtenidos por IFI para algunos sueros de dia-béticos tipo 1 que son GADA- por RBA, donde el antígeno sehalla puro y en solución. Otro intento para transformar a los tests para marcadores enpruebas de bajo costo y accesibles a laboratorios comunes fueencarado por el grupo del IDEHU (CONICET-UBA) en base a in-munobiológicos recombinantes producidos en sistemas procario-tas y a tests enzimáticos (Depletion ELISA, o DELISA). Para ello laobtención de GAD en E. coli, como proteína soluble y con altorendimiento, fue resuelta por primera vez en base a la creaciónde una construcción genética que expresa la GAD65 humana fu-sionada a la proteína bacteriana tiorredoxina (Trx). La quimeraTrx-GAD presenta propiedades enzimáticas e inmunoquímicas in-tactas (6.10), permitiendo su aplicación exitosa en un test tipoDELISA para GADA (6.11). Recientemente ese emprendimientobiotecnológico fue perfeccionado por el mismo laboratorio, de-

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tienen características clínicas propias del Síndrome Metabólico,con sobrepeso u obesidad, en los cuales generalmente no sepresentan los síntomas clásicos de la enfermedad, ya que losniveles de hiperglucemia suelen ser moderados.Se considera que entre el 70% y el 80% de los individuos quedesarrollan diabetes tipo 2 en la edad adulta lo hacen con lascaracterísticas clínicas arriba señaladas. Alrededor del 40% delos mismos desconoce su enfermedad y, en muchas oportuni-dades, el diagnóstico surge tras un análisis de rutina o por ladetección de complicaciones crónicas.Entre el 20% y el 30% de los casos de diabetes tipo 2 que sepresentan en la edad adulta, corresponden a una forma en lacual predomina la alteración en la secreción de insulina sobrela resistencia periférica a la misma. Estos pacientes general-mente tienen peso normal o un sobrepeso leve, además la re-percusión sintomatológica es mayor, acompañada por mayoresniveles de hiperglucemia con respecto al diabético tipo 2 obe-so. Es en esta forma de presentación donde se debe pensar enla posibilidad de una diabetes de origen autoinmune y dondela determinación de autoanticuerpos contra la célula ß, y even-tualmente la genotipificación del HLA DQB, cobra importanciacomo apoyo diagnóstico para una correcta interpretación fi-siopatológica de la enfermedad.Debemos considerar desde el punto de vista clínico la impor-tancia de identificar a los pacientes adultos con diabetes au-toinmune (LADA) para poder establecer un tratamiento ade-cuado desde el comienzo de la enfermedad, incluyendo la uti-lización de insulinoterapia precoz, cuando el control metabó-


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además tiene como característica fisiopatológica la autoinmu-nidad contra las células ß del páncreas, la asociación con alelosde susceptibilidad del sistema HLA y finalmente el fenotipo ca-racterístico de los pacientes es el peso normal o disminuido. Es importante la repercusión clínica de los síntomas clásicos de laenfermedad: poliuria, polidipsia, pérdida de peso, altos nivelesde glucemia con marcada tendencia a la cetoacidosis diabética yuna rápida progresión a la dependencia de insulina. La complica-ción crónica más frecuente es la microangiopatía diabética.Otro tipo de pacientes también desarrolla diabetes tipo 1, perono presentan niveles tan altos de glucemia como el grupo an-terior, los síntomas no son tan marcados y muchas veces se ha-ce necesario diferenciarlos de los pacientes MODY, sobre todocon los MODY 3. Los pacientes MODY tienen peso normal co-mo los diabéticos tipo 1, pero tienen antecedentes familiaresde diabetes, lo que no ocurre con diabetes tipo 1. Nunca desa-rrollan cetoacidosis diabética, aunque pueden requerir insuli-noterapia con la progresión de la enfermedad, incluso desde elcomienzo de la misma, dependiendo del gen afectado y del ti-po de mutación presente. Es en esta situación, en que se plan-tea un diagnóstico diferencial entre diabetes tipo 1 y MODY,cuando la determinación de anticuerpos contra la célula ß to-ma real importancia. Luego si los anticuerpos resultan negati-vos, un estudio de genética molecular para determinar el sub-tipo MODY es de suma utilidad para establecer el tratamientoadecuado y el pronóstico de la evolución. Tanto en la diabetestipo 1 como en el MODY el mecanismo fisiopatológico presen-te es la alteración en la secreción de insulina sin resistencia pe-riférica a la acción de la hormona. Una cuarta posibilidad de diagnóstico de diabetes en la edadinfanto-juvenil es la presencia de diabetes tipo 2. Son pacientescon sobrepeso u obesidad en los que predomina la resistenciaa la insulina por sobre la alteración en su secreción. Estos pa-cientes no tienen asociación con genes de HLA, no exhiben unaforma de presentación autoinmune y los niveles de hipergluce-mia suelen ser moderados con repecto a la diabetes tipo 1.Como se desprende de lo anterior, es de fundamental impor-tancia un diagnóstico correcto de la forma de diabetes que sepresenta en la edad infanto-juvenil, con el objetivo de llevar acabo estrategias terapeúticas adecuadas en cada paciente. Amodo de integración, en la Figura 7.1 se presenta un algorit-mo de diagnóstico de diabetes en la edad infanto-juvenil. En la edad adulta la forma mas frecuente de presentación esla diabetes tipo 2, con resistencia a la insulina predominantesobre la alteración en la secreción de insulina. Estos pacientes

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Algoritmo sugerido para el diagnósticode diabetes en edad infanto-juvenil.

Figura 7.1


progresivo proceso autoinmune que lleva a la destrucción de lascélulas ß del páncreas, lo cual conduce finalmente a una escasao nula producción de la hormona y la necesidad finalmente deinstalar insulinoterapia sustitutiva (7.4).En base a lo anterior, es indudable que tanto la diabetes tipo 1como el LADA tienen en común la autoinmunidad, pero se tra-ta de dos procesos patogénicos con características propias. Así,el LADA tiene una menos marcada predisposición asociada alos genes del sistema HLA que los individuos jóvenes que desa-rrollan diabetes tipo 1, lo cual está fehacientemente documen-tado. Además es muy probable que exista una mayor partici-pación de polimorfismos de otros genes (VNTR del gen de in-sulina y CTLA4), los cuales tienen una participación menor enla diabetes tipo 1 (7.5). Aunque en el LADA pueden estar involucrados otros mecanis-mos inmunogenéticos, como una mayor tolerancia inmune,una mayor capacidad de regeneración de la masa de células ß,o una menor o diferente exposición a factores ambientalesdesencadenates, la hiperglucemia que se presenta tanto en elLADA como en la diabetes tipo 1, es la consecuencia y la eta-pa final de un mecanismo autoinmune de destrucción de losislotes (7.6). Indudablemente en muchos casos el LADA cuen-ta con una mayor conservación de la masa critica de células ß,lo que permite preservar una adecuada secreción de insulinapara mantener un buen control metabólico, sin necesidad ini-cial de insulinoterapia. A pesar de estas diferencias, por otro lado también hay fran-cas características comunes entre diabetes tipo 1 y LADA, comopor ejemplo la insulitis con infiltración de células T. Esto ha si-do demostrado al menos en algunos pacientes diabéticos adul-tos, GADA positivos, a través de la biopsia de páncreas. Estasevidencias lo que indudablemente sugieren es la existencia deun mecanismo fisiopatológico común, aunque con mayor tole-rancia inmune en el caso del LADA, lo que a su vez es determi-nante para que no haya una destrucción completa y rápida dela masa de células ß (7.7).Además, los pacientes LADA, al igual que los diabéticos tipo 1,pueden presentar asociación con otras endocrinopatías au-toinmunes, lo cual refleja otro mecanismo etiopatogénico co-mún entre ambas formas de la enfermedad.En resumen, el deterioro en la secreción que lleva a la necesi-dad de utilizar insulinoterapia en individuos genéticamentesusceptibles, depende de la destrucción de la masa de célulasß por un mecanismo autoinmune. Dicho deterioro en la secre-ción de insulina es sumamente rápido en la infancia, más len-


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lico o las circunstancias clínicas así lo determinen. Este puntoserá desarrollado especialmente en el apartado Tratamientodel LADA.En los pacientes LADA no sólo la determinación de autoanti-cuerpos puede resultar de utilidad clínica, sino que el dosajede péptido C en ayunas, o post estímulo con glucagon, nospermite establecer el grado de compromiso de la secreción deinsulina. De todas maneras, la decisión de iniciar la terapia coninsulina cuenta con componentes clínicos de indudable valor.Estos se presentan cuando hay un severo deterioro en la masade células ß producido por la autoinmunidad, como son el des-censo de peso y el descontrol metabólico que no se justificapor otras causas. Hoy se está tratando de evitar ese deterioroen la masa de células ß, tanto en la edad infanto juvenil comoen la edad adulta, interviniendo precozmente con insulina,desde que la autoinmunidad es detectada.Se debe tener presente que aproximadamente la mitad de losindividuos adultos con características clínicas similares al LADA(peso normal, disminución en la secreción de insulina, etc.)presentan autoinmunidad negativa, por lo tanto en ellos la al-teración que produce la falla en la secreción tal vez no es deorigen inmunológico, ni está asociado con genes del HLA.Por último, hay un escaso número de diabéticos adultos que de-butan con cetoacidosis en forma similar a los pacientes diabéti-cos tipo 1 de edad infanto-juvenil. Como se ve, en muchas opor-tunidades se hace dificultoso para el clínico distinguir entre dia-betes tipo 1 o diabetes tipo 2, tanto en la edad infanto-juvenilcomo en la adulta. Por ello, principalmente para los pacientesdiabéticos adultos, se ha producido cierta anarquía en la no-menclatura (LADA, diabetes tipo 1.5, diabetes autoinmune deladulto, o tipo 1 en el adulto, etc.). En estos casos la determina-ción de las bases etiológicas, a las cuales contribuye la detecciónde anticuerpos contra la célula ß del páncreas, es de fundamen-tal importancia para establecer el diagnóstico y el tratamientoadecuado (7.2). Precisamente, el término LADA o diabetes laten-te autoinmune del adulto fue introducido para distinguir aaquellos individuos adultos que desarrollan la enfermedad, aligual que la diabetes tipo 1, por la producción de marcadores sé-ricos contra la célula ß del páncreas, entre los cuales los anticuer-pos contra la enzima glutamato decarboxilasa (GADA) son losmás característicos (7.3). Estos individuos adultos generalmenteno requieren insulina al comienzo de la enfermedad para man-tener un adecuado control metabólico, pero con el transcursode los años, muchos llegan al requerimiento insulínico. Este tar-dío requerimiento de insulina está determinado por un lento y

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IA-2A, IAA/PAA), lo cual es producto de una mayor autoagresióndel sistema inmune celular sobre las célula ß, en términos depérdida de la autotolerancia. Este fenómeno es el denomina-do spreading, o ampliación de la respuesta inmune, haciaotros epitopes (determinantes antigénicos) de las mismas mo-léculas inicialmente implicadas (spreading intramolecular) ohacia otras moléculas diferentes de la misma célula β (spread-ing intermolecular).En los LADA el autoanticuerpo predominante es el GADA, loque está determinando una menor agresividad del sistema in-mune por la presencia de ese solo marcador y en títulos gene-ralmente bajos. Eso coincide con una necesidad de insulinote-rapia más demorada respecto de la diabetes tipo 1. Por otraparte, la presencia de IA-2A parece asociarse con un fenotipode comienzo agudo e insulino-requiriencia temprana (7.12).Otra característica es que, a diferencia del paciente con diabe-tes tipo 1 que no tiene resistencia a la insulina, el paciente LA-DA puede o no tener insulinorresistencia. Eso ocurre en formasimilar a los casos de diabtes tipo 2, pero en el LADA en gene-ral existe una mayor alteración en la secreción de insulina.En un estudio en particular se ha separado a los LADA en dossubtipos: se denominaron LADA tipo 1 o LADA 1 a aquellos pa-cientes que presentaban características metabólicas y clínicassimilares a la diabetes tipo 1, vale decir con insulinopenia sinresistencia periférica a la insulina, con necesidad de insulinote-rapia precoz y con complicaciones microvasculares. Por otro la-do se denominaron LADA tipo 2 o LADA 2 a aquellos pacientesque presentaban similitud con los pacientes diabéticos tipo 2(7.13). Además los pacientes LADA 2 tenían insulinopenia conresistencia periférica a la insulina y por lo tanto característicasdel Síndrome Metabólico, hipertrigliceridemia con descensodel colesterol HDL, hipertensión arterial, complicaciones ma-crovasculares y requerimiento de insulinoterapia a más largoplazo.En los diferentes trabajos realizados la prevalencia de LADAvaría entre el 10% al 20% de los pacientes diabéticos tipo 2, deacuerdo a las características clínicas de los individuos recluta-dos, a las restricciones impuestas sobre los pacientes estudia-dos y a los métodos analíticos aplicados. Los criterios de inclu-sión se basan en especificaciones variadas, como el índice demasa corporal (IMC), la edad, el tiempo de evolución de la dia-betes, la reserva insulínica medida por péptido C, la presenciao no de resistencia a la insulina, el grupo étnico analizado y lasensibilidad y especificidad de los métodos para la determina-ción de los marcadores (7.14-7.15).


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to en la adolescencia, latente y de progresión variable en adul-tos jóvenes y más lento aún en la edad adulta (7.8) (Figura 7.2).

CARACTERIZACIÓN DE LADAComo ya se definió, el tipo LADA tiene características similaresa la diabetes tipo 1, como autoagresión del sistema inmune ce-lular contra las células ß del páncreas (insulitis), autoanticuer-pos positivos (GADA, IA-2A, IAA/PAA), asociación a ciertas for-mas polimorficas de genes del sistema HLA de Clase II (DQB10201-0302) y necesidad de tratamiento con insulina, aunquecon marcadas diferencias en cuanto al tiempo de evolución dela enfermedad (7.9-7.10).Por otro lado los pacientes diabéticos adultos tipo 2 que pre-sentan marcadores requieren insulinoterapia en forma mástemprana que aquellos que no presentan autoanticuerpos. Elmarcador GADA se encuentra presente en el 75% de los pacien-tes diabéticos tipo 2 que son insulinodefecientes, de acuerdo aldosaje de péptido C post estímulo con glucagon, y sólo en el10% de aquellos que no presentan insulinodeficiencia (7.11).Los pacientes con diabetes tipo 1 presentan un mayor número, y un mayor título, de autoanticuerpos (principalmente GADA,

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Figura 7.2

Destrucción de la masa de células β de acuerdo a la edad y al mecanismo patogénico.


estrategias de intervención temprana y determinar el real im-pacto de la enfermedad en la salud pública.

SCREENING DE LADALa determinación de GADA en pacientes diabéticos tipo 2 de re-ciente comienzo es, en términos prácticos, el primer recurso ana-lítico recomendado para la detección de LADA. Uno de los ante-cedentes que brindan soporte formal a esta recomendación esel estudio realizado en el Reino Unido (UKPDS), en el cual se de-terminó que los pacientes GADA positivos en el rango de edadde 35 a 45 años eran los que rápidamente progresaban a la in-sulinorrequiriencia debido a descontrol metabólico (7.20).Por otro lado, existe consenso respecto de la tipificación dealelos de susceptibilidad del sistema HLA, con lo cual se contri-buye a sostener el diagnóstico de LADA. Además, la mediciónde péptido C, tanto en ayunas como post estímulo con gluca-gon, permite determinar la reserva de insulina en la célula ßdel páncreas, por lo cual estos tests bioquímicos o funcionalesorientan respecto de la oportunidad de iniciar la insulinotera-pia. Incluso en estos casos resulta recomendable realizar el se-guimiento de los niveles de péptido C.El IMC característico de LADA es aquel que se encuentra pordebajo de 25, aunque algunos pacientes con sobrepeso han si-do clasificados como diabéticos con autoinmunidad del adulto(7.22). De todas maneras la caída del IMC, independientemen-te de su valor original y cuando no se halla justificado porotras causas clínicas, está marcando la progresión a la insulino-dependencia.Por otro lado, los pacientes LADA pueden presentar diferentesgrados de resistencia a la insulina, por lo que la determinaciónde péptido C puede ser de poca utilidad en estos casos. Sin em-bargo, debemos aceptar que actualmente no existen recomen-daciones adecuadas para brindar al médico clínico y segura-mente se requieren estudios futuros para llegar a establecertales recomendaciones. A pesar de esas restricciones, se ha su-gerido un algoritmo para el diagnóstico de LADA (7.23), el cualhemos adaptado y actualizado en el esquema de la Figura 7.3.

TRATAMIENTO DEL LADAEl principal objetivo del tratamiento de la diabetes autoinmu-ne en pacientes detectados típicamente en edad adulta, debeser el de mantener un adecuado control metabólico y prevenirla instalación de complicaciones crónicas de la enfermedad.Para ello tiene especial importancia el control glucémico, demodo similar a lo que sucede con la diabetes tipo 1. Pero por


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En un estudio realizado en Italia sobre 2076 individuos, se losclasificó como diabéticos tipo 2, intolerantes a la glucosa y nor-males. La prevalencia de GADA fue de 2.8% en aquellos pacien-tes diagnosticados como diabéticos tipo 2. Esta menor preva-lencia de LADA en Italia con respecto a otros estudios europeosfue interpretado por los autores como debido a la menor sus-ceptibilidad genética a la diabetes tipo 1 que presenta la pobla-ción italiana que vive en la región continental (7.16). Por el con-trario, el 16% de los pacientes diabéticos tipo 2 de origen chi-no presentaron GADA positividad, independientemente de laantigüedad de la enfermedad (7.17). En otro estudio hecho enJapón, sobre 289 individuos clasificados como diabéticos tipo 2,la GADA positividad estaba presente en el 47% de los pacien-tes insulinorrequierentes y en el 10% de los pacientes que norequirieron insulina. En estos últimos la duración de la diabe-tes tipo 2 era de menos de 5 años (7.18). Gottsäter et al, halla-ron en población sueca que el 24% de los pacientes diabéticostipo 2 de reciente comienzo presentaban GADA positividad(7.19). En el estudio UKPDS se analizaron más de 3600 indivi-duos con diabetes tipo 2 no requiriente de insulina. El 16% deesta población presentó GADA o ICA positividad, siendo predic-tores ambos de insulinorrequiriencia (7.20). En el estudio local llevado a cabo por el Comité de Genética,Inmunología y Prevención de la Diabetes, de la Sociedad Ar-gentina de Diabetes (Programa ADA), se halló una prevalenciadel 24% de marcadores, principalmente GADA, en pacientesdiabéticos tipo 2 de reciente diagnóstico y con IMC igual o in-ferior a 30 (7.21). En resumen, resulta claro que en el momento del diagnóstico,tanto el marcador clásico ICA, como el GADA, han demostradoser predictores de insulinodepedencia para los pacientes LADA. Actualmente se acepta que el marcador GADA es el queexhibe mayor sensibilidad. De todos los estudios efectuados ha surgido como experienciaque se deben tomar estrictas medidas de estandarización me-todológica para la determinación de los marcadores. Ademáses esencial definir el tamaño de la muestra a analizar y las ca-racterísticas clínicas de los individuos para establecer la realprevalencia de LADA en los diferentes países, como se hizooportunamente con la diabetes tipo 1 en menores de 15 años.Es indudable que la prevalencia de LADA representa una con-siderable proporción de pacientes diabéticos, por lo menos tanimportante como la diabetes tipo 1. La determinación precisade esta prevalencia, además de contribuir a una correcta clasi-ficación etiopatogénica de la diabetes, permitará llevar a cabo

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tímulo secretagogo. 2) Está demostrado en modelos animalesque la liberación del contenido de los gránulos de secreciónpor parte de la célula ß exacerba la pérdida de la tolerancia in-munológica, con lo cual se está contribuyendo al empeora-miento y a la amplificación de la respuesta autoinmune (7.25). Por lo mencionado, es razonable sospechar que el tratamientocon sulfonilureas esté contribuyendo realmente al deteriorode la masa de células ß en los pacientes LADA y que por lo tan-to no sería el tratamiento más adecuado para esta forma dediabetes. Además del planteo especulativo en modelos anima-les, esa hipótesis en alguna medida está en relación con evi-dencias emanadas de diferentes estudios sobre pacientes dia-béticos adultos. En el estudio local de Zavala y col. (7.26) se de-mostró que los pacientes diabéticos tipo 2 con fracaso secun-dario a los antidiabéticos orales del tipo sulfonilureas, presen-taban con cierta frecuencia evidencias de agresión celular in-mune hacia las células ß e incluso positividad para el marcadorIAA. Sin embargo no quedó establecido que la causa del fraca-so secundario fuese causado por las sulfonilureas.Cabrera-Rode y col. estudiaron 14 pacientes diabéticos tipo 2con autoanticuerpos positivos, GADA e ICA, a los que dividie-ron en dos grupos, uno había sido tratado con glibenclamidae insulina y el otro había recibido insulina como monoterapia.El seguimiento se llevó a cabo durante un año y al final delmismo los autores encontraron que los pacientes tratados sólocon insulina habían mejorado el control metabólico. En coinci-dencia habían negativizado el ICA, aunque persistía el GADA yno se detectaban diferencias significativas en la reserva pan-creática medida por péptido C en ayunas (7.27).

METFORMINA

La metformina, una droga ampliamente utilizada en el trata-miento de los pacientes diabéticos tipo 2 (fundamentalmentecuando presentan sobrepeso), actúa favoreciendo el ingreso deglucosa en los tejidos periféricos e inhibiendo la gluconeogénesis. También se ha probado el tratamiento con metmorfina en mo-delos animales con diabetes autoinmune y se ha concluido queesta droga no interfiere en el curso de la enfermedad respec-to al desarrollo de la autoinmunidad (7.28).La carencia de efectos nocivos de la metformina sobre el cursoevolutivo de la autoinmunidad en el LADA, la torna una dro-ga de utilidad tanto para esos pacientes como para los adultosque presentan diabetes tipo 2 con resistencia a la insulina, conautoinmunidad, y que además presentan signos del síndromemetabólico.


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otro lado en el caso de estar presente el síndrome metabólico,de manera similar a lo que a lo que sucede con la diabetes ti-po 2, deben tenerse en cuenta los otros factores de riesgo pa-ra la enfermedad cardiovascular, como son la hipertensión ar-terial, la dislipemia, etc. (7.24).Como segundo objetivo, es de indudable interés para los pa-cientes LADA preservar la masa funcional de células ß, para locual tiene fundamental importancia el tipo de tratamiento uti-lizado. Con ese fin se presenta a continuación una revisión delos recursos terapéuticos disponibles, pero enfocando la pro-blemática del paciente diagnosticado en edad adulta y concomponente de autoinmunidad.

SULFONILUREAS

Las sulfonilureas, frecuentemente utilizadas en el tratamientode diabéticos tipo 2, favorecen la liberación de insulina de lascélulas ß del páncreas promoviendo el cierre de canales de po-tasio por una vía ATP dependiente. Desde ese punto de vista ysosteniendo que la hiposecreción de insulina es el evento pa-togénico principal en pacientes LADA, podría sostenerse quela utilización de sulfonilureas sería útil en el manejo de este ti-po de pacientes. Pero por otra parte debemos tener en cuentauna serie de consideraciones: 1) Estos fármacos pueden causarun temprano agotamiento de las célula ß por su continuo es-

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Algoritmo sugerido para el diagnóstico de diabetes autoinmune en el adulto.

Figura 7.3


secreción de insulina, medida por péptido C en ayunas, ade-más negativizó el test de ICA en 4 de los 5 pacientes y mejoróel control metabólico (7.33). A partir de ese estudio preliminarpuede suponerse con cierto asidero que la administración deinsulina subcutánea en bajas dosis (menores de 10 U/día) cons-tituye una estrategia terapéutica eficiente (tal vez más inmu-nomoduladora que sustitutiva), a diferencia del tratamientoconvencional con sulfonilureas. Ese estudio fue señero paratratar de prevenir la falla lenta y progresiva de las células ß enpacientes con diabetes clínicamente clasificables como tipo 2,pero con autoinmunidad específica demostrada a través de losmarcadores convencionales. De todas maneras, para confirmarapropiadamente esas presunciones se aguardan nuevos estu-dios, con un mayor número de pacientes, con seguimiento másextendido y con diseños más completos, incluyendo la utiliza-ción precoz de insulina y la determinación precisa de la reser-va pancreática. También será necesario demostrar la posibledisminución de las complicaciones crónicas de la diabetes enlos pacientes sometidos al tratamiento insulínico precoz parapoder validar la utilidad de este tipo de intervención. Mientrastanto, el tratamiento en primera instancia con insulina, paralos pacientes diabéticos tipo 2 con autoinmunidad demostra-ble y el seguimiento de control de la reserva pancreática de lahormona, parecería ser el enfoque más racional. Por otro lado, independientemente de la veracidad de la posi-ble acción inmunomoduladora de la insulina, en pacientes condiabetes tipo 1 se ha demostrado que es más fácil alcanzar unadecuado control metabólico y menores complicaciones micro-vasculares, administrando pequeñas dosis de insulina y tratan-do de presevar la masa remanente de células ß (7.34). En otroestudio, la pérdida completa de la secreción de insulina fueasociada con un comienzo más temprano de retinopatía pre-proliferativa (7.35).El estudio en dos fases denominado Diabetes Prevention Trial-Type 1 Diabetes (DPT-1) relevó la presencia de marcadores enmás de 84.000 y 103.000 familiares sanos de primer y segundogrado, respectivamente, y una fracción minoritaria de ellos in-gresó en el protocolo de tratamiento con insulina. Los resulta-dos tanto del primer trial, donde se administró insulina paren-teral (7.36), como los del segundo trial, donde se administró in-sulina oral (7.37), no demostraron freno parcial ni prevenciónen la evolución hacia la diabetes tipo 1, comparando los resul-tados entre los individuos tratados y los controles con placebo.Sin embargo, en ambos casos las edades de los individuos (11.2y 10.25 años) y los parámetros cuantitativos de riesgo, eran di-


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GLITAZONAS

Las glitazonas, recientemente introducidas para el manejo dela diabetes tipo 2, mejoran la acción periférica de la insulina,disminuyen los niveles circulantes de insulina y favorecen el in-greso de glucosa a los tejidos periféricos. Pero además, estasdrogas tienen interesantes propiedades, por lo cual sus aplica-ciones se extienden a los LADA. Hay evidencias para afirmarque las glitazonas favorecen la síntesis de insulina en la célulaß, aumentan el contenido de insulina en los gránulos de secre-ción y mejoran la propia secreción de la hormona (7.29). Ade-más de su efecto antihiperglucemiante, las glitazonas han de-mostrado poseer efectos antinflamatorios, con disminución delas citoquinas involucradas en la agresión autoinmune a los is-lotes, como el factor de necrosis tumoral alfa y el interferóngamma (7.30). En modelos animales de diabetes autoinmunela troglitazona ha demostrado impedir el desarrollo de la en-fermedad, muy posiblemente debido a sus efectos antiinfla-matorios (7.31).A pesar de lo mencionado, todavía no hay suficientes trabajosde investigación clínica que soporten fehacientemente la pre-servación de la masa de células ß y, por ende, una recomenda-ción de consenso para aplicar las glitazonas en el tratamientode los LADA.

INSULINOTERAPIA

Al referirnos a la insulinoterapia en pacientes LADA, se da porentendido que la misma no genera dudas respecto a su aplica-ción en aquellos pacientes cuyo descontrol metabólico así lorequire. Pero además la utilización de insulinoterapia en pa-cientes con diagnóstico de LADA puede ser beneficiosa inde-pendientemente del control metabólico, ya que este tipo deintervención ha demostrado preservar la masa de células ß dela acción deletérea de la autoinmunidad en modelos animales.También se ha demostrado que el tratamiento insulínico pro-duce una disminución de los marcadores séricos, de lo cual seinfiere que tal vez se atenúe la agresión inmune celular, mejo-rando la secreción de insulina medida por péptido C y final-mente reflejándose en un mejor control metabólico de los pa-cientes (7.32).Un estudio piloto, por el bajo número de individuos incluidos,separó a 10 pacientes con diagnóstico de LADA, seropositivospara ICA y GADA, en 2 grupos de 5 sujetos cada uno. A un gru-po se lo trató con glibenclamida y al otro con pequeñas dosisde insulina, efectuándose un seguimiento de control durante30 meses. El grupo tratado con insulina presentó mejoría en la


cial y de Inmunoanalítica especializada que se mencionan en elPrólogo, permitió acumular una vasta colección de casos ins-criptos en la clasificación general de “pacientes diabéticosdiagnosticados en edad adulta, con autoinmunidad demostra-ble”. Salvo ese patrón general, obviamente todos ellos, en unoo más aspectos, resultaron diferentes. Por ello sería impractica-ble y poco útil la exposición de toda la variedad posible de fe-notipos y genotipos, además asociada a un amplísimo espectrode parámetros bioquímicos e inmunológicos. Sin embargo, seestima que la presentación de un par de casos representativospuede ilustrar someramente sobre cómo se pueden presentarlos casos clínicos, qué tipos de análisis inmunológicos y genéti-cos complementan los análisis convencionales en Diabetología,cómo se los interpreta y, finalmente cómo se llega a una con-clusión fundamentada sobre el diagnóstico y el tratamiento aseguir. En las Figuras 8.1 y 8.2 se presentan las fichas resumidasde dos casos LADA.


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ferentes a los de individuos adultos que estamos considerando,cuya evolución a la diabetes autoinmune y a la dependencia (orequiriencia) insulínica es en general más lenta y se supone queexhiben otra constitución genética que los lleva a debutar enedad superior a los 25 o 35 años, según los distintos autores. Por último no sólo la insulinoterapia podría ser útil en preser-var la masa de células ß en el LADA, ya que otras estrategiasabren una esperanza a futuro, no sólo para evitar el deteriorode la masa de células ß, sino para prevenir la enfermedad au-toinmune. Entre ellas se encuentran la insulina inhalante y losantígenos administrados a modo de “vacunas”, ya sean com-pletos, como la GAD recombinante, o los péptidos representa-tivos de los epitopes T, como algunos fragmentos de la proin-sulina. El paciente LADA constituye un excelente modelo paraeste tipo de intervenciones precoces y luego para poder exten-der los modelos terapéuticos a la diabetes tipo 1 de comienzoen edades tempranas de la vida.En resumen, una vez establecido el diagnóstico de LADA, eltratamiento debe ser instituido de acuerdo al control metabó-lico y a la reserva insulínica, con el objetivo de preservar la ma-sa de células ß y por lo tanto la secreción de la propia hormo-na. A tal fin no parece ser adecuado el tratamiento convencio-nal con sulfonilureas, en cambio la terapia insulínica y las glita-zonas parecen constituir los recursos terapeúticos más conve-nientes. En cambio, en los pacientes con diagnóstico de LADA ysignos de resistencia a la insulina, o síndrome metabólico, lautilización de metformina puede ser lo más conveniente.Es indudable que se requieren más trabajos de investigaciónclínica con mayor número de pacientes y con mayor tiempo deseguimiento para establecer el tratamiento más adecuado. Enese sentido se ha establecido el Programa ADA de la SociedadArgentina de Diabetes, el cual desde la primera fase en cursoencara la prospección de marcadores y la genotipificación HLApara detectar los casos de diabetes en adultos asociados conautoinmunidad. Se aguarda que las conclusiones de ese estu-dio multicéntrico lleven a recomendaciones de consenso y acriterios terapéuticos de guía. Hasta entonces, la clínica y el cri-terio médico individual, con el soporte de los análisis inmuno-genéticos disponibles, determinarán las medidas terapéuticasa seguir en cada caso.

8. CASOS MODELO

La experiencia recogida por los autores de este artículo a lolargo de muchos años desde los servicios de Medicina asisten-

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Ficha médica con datos bioquímicos einmunogenéticos del caso clínicoModelo 1.

Caso clínico: modelo 1

Sexo: FemeninoEdad: 26 añosPeso: 55 Kg; Talla: 1.62m; BMI: 20Antecedentes: Sin antecedentes personales o familiares de diabetes.Historia clínica: A los 25 años, primer embarazo. A la 8a semana:glucemia 99 mg%; en 7º mes, fetomuerto y retenido. Post-cesárea: glucemia 331 mg%. Peso 54 Kg pasa a51.5 Kg. Tratamiento: Metformina (6 meses).Servicio de Diabetes: Primera consulta; glucemia 161 mg%; HbA1c6.9% (VN 6.4%)Se solicita: - Péptido C: 0.29 nM (VN 0.6 nM)

ICA: 20 UJDF (VN 5-10 UJDF) - Marcadores: GADA: 5.4 U/ml

(Positivo); IAA: Negativo- HLA: DQB1 0201/0302

(susceptibilidad)Diagnóstico: Diabetes tipo 1 (LADA)Durante el embarazo se debió haberrealizado curva de sobrecarga con 75 gde glucosa (superó el nivel de 95m g%)Tratamiento: Insulina NPH humana, 12U/dia, en 2 dosis.Control: Buen control glucemia (automonitoreo y laboratorio) y de HbA1c; peso: 55 Kg.

Caso clínico: modelo 2

Sexo: MasculinoEdad: 35 añosAntecedentes: Sin antecedentes personales o familiares de diabetes.Historia clínica: Poliuria, polidipsia ypérdida de peso; glucemia 354 mg%;cuerpos cetónicos 4+; glucosuria 4+;triglicéridos 250 mg% (VN 180 mg%);colesterol 250 mg% (VN < 200 mg%);LDLc 170 mg% (VN 100 mg%); HDLc35 mg% (VN > 40 mg%). Tratamiento: Insulina NPH, 36 U/día, en 2 dosis; buen control metabólico ypeso; Luego descenso glucémico e hipoglucemia.Discontinúa la terapia, con normoglucemia y HbA1c normal (6 meses).Consulta otro profesional: Tratamientocon glibenclamida 10 mg/día.Servicio de Diabetes: Primera consulta: Se solicita: ICA: Negativo- Marcadores: GADA: 7 U/ml (Positivo)

IAA/IA: Negativo- HLA: DQB1 0501/0502 (susceptibilidad)

Diagnóstico: Diabetes tipo 1(LADA)Tratamiento: Reinicio de la insulinote-rapia.

Ficha médica con datos bioquímicos e inmunogenéticos del caso clínicoModelo 2.

Figura 8.1

Figura 8.1


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1

Figura 7.1

Algoritmo sugerido para el diagnósticode diabetes en edad infanto-juvenil.

Fe de erratas

Estimado doctor/doctora:

En la separata “Diabetes mellitus autoinmune de inicio en edad infanto-juvenil y adulta”. Basesracionales para el diagnóstico diferencial y el tratamiento, deseamos aclarar lo siguiente:

En la página 49, al pie, la figura 7.1 debe ser reemplazada por la que mostramos a continuación.

Por otra parte en la página 56, encabezando, la figura 7.3 debe ser reemplazada por la que mos-tramos a continuación.

Figura 7.3

Algoritmo sugerido para el diagnósticode diabetes autoinmune en el adulto.

FE DE ERRATAS Diabetes 7/19/05 3:10 PM Page 1

y adulta - montpellier · la historia de la diabetes mellitus es tan vieja como la propia historia...

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