Yeni Genetik Testler

Dr. Fatih Ezgü

Gazi Üniversitesi Tıp Fakültesi

Çocuk Metabolizma ve Çocuk Genetik Hastalıkları

Bilim Dalları

Ankara

Nadir Genetik Hastalıklar

Genetik Biliminin Gelişmesi

Gregor Mendel Archibald Garrod Watson-Crick

İnsan Genom ProjesiTanıda YeniliklerTedavide Yenilikler

CRISPR/Cas9

Hangi Durumlarda Genetik Hastalık

Düşünmeli?

A Aile öyküsü

G Gruplar şeklinde konjenital anomaliler

E Sık gözlenen hastalıklarda ekstrem klinik

N Nörogelişimsel retardasyon ya da regresyon

E Ekstrem patolojik bulgular

S Şaşırtıcı laboratuvar bulguları

A G T C A

A

GEN 1 GEN 2 GEN 3

Küçük değişiklik

• Gen

• Tek nükleotid değişikliği

• Küçük insersiyon / delesyon

Büyük değişiklik

• Gen

• Bölgesel del / dup

• Tüm gen del / dup

Büyük değişiklik

• Kromozomal

• Sayısal (Anöploidi, Poliploidi vb.)

• Yapısal (Del / dup vb.)

Protein

Epigenetik değişiklikler

Genetik Hastalık Oluşturan Mekanizmalar

(Mutasyonlar)

Genetik Analiz Yöntemleri

Sitogenetik Analizler

◼ Hücresel düzeyde genetik materyalin incelenmesidir.

Moleküler Genetik Analizler

◼ Moleküler düzeyde genlerin yapı ve fonksiyonlarının

incelenmesidir.

Epigenetik Analizler

◼ Epigenetik değişikliklerin rol oynadığı genom bölümlerinde

yapılan incelemelerdir.

Sayısal ve Yapısal Kromozom

Anomalileri

Terminal

delesyon

Intertsiyel

delesyon Esit olmayan

crossing over

Ring Izokromozom

Robertsonian translokasyon Insersiyon

SAYISAL YAPISAL

Kromozom (Karyotip) Analizi

Periferik kan/diğer dokular

Kültür

370C – 3 gün

Metafazdadurdurulur

Hipotonik sıvı

Fikseedilir

Lam üzerine Yayılır

Gimsa ile boyanır

Metafaz yayılımı incelenirKaryotip

Kromozom Analizi

Kullanım alanları ve olumlu yönleri

◼ Sayısal ve yapısal kromozomal anomali tanısı için

kullanılır.

◼ Tüm genom incelenebilir.

Olumsuz yönleri

◼ Duyarlılığı 5 Mb (5.000.000 baz) civarındadır.

◼ Aktif hücre kültürü gerektirir.

Kromozom Analizi Örnekleri

Turner Sendromu

Ring Kr 15 46,XY,t(4;11)(q21;q23)

Flöresan In Situ Hibridizasyon (FISH)

Flöresan In Situ Hibridizasyon (FISH)

Kullanım alanları ve olumlu yönleri

◼ Duyarlılığı 100kb-1Mb’dır.

◼ Mikrodelesyon ve duplikasyonlarda, translokasyonlarda

anöploidilerde kullanılır.

◼ Anöploidilerde hızlı sonuç verir.

◼ Mozaisizmlerde daha güvenilirdir.

◼ Hücre siklusunun her safhasında analiz yapılabilir.

◼ Karyotipe göre hızlıdır, hücre bazında analiz yapılabilir.

Olumsuz yönleri

◼ Ancak hedeflenmiş belirli bölgeleri analiz eder.

◼ Özgüllüğü azdır. Genomik imbalans yanında epigenetik

faktörlerin rol oynadığı PWS ve AS gibi hastalıklarda ilk tercih

değildir.

FISH Örnekleri

del 22q11.2

Velokardiyofasiyal Sendrom

dup 1p36.1

Trizomi 21

Karyotip / FISH Endikasyonları

Erken başlangıçlı büyüme ve gelişme anormallikleri

İzole anomaliler (Yarık damak-dudak, konjenital kalp hastalığı vb.)

Kuşkulu genitalya

Gecikmiş puberte / uygun olmayan ikincil seks karakterleri

Kızlarda boy kısalığı ve/veya amenore

İnfertilite

İleri gebelik yaşı

Kanserler

Aile öyküsünde etkilenmiş birey

Karyotip / FISH

◼ Hafif-orta MR, hipotoni

◼ Büyüme geriliği

◼ Strabismus, epikantalkatlantılar

◼ Simian çizgisi

◼ Makroglossi, hipodonti

◼ Eklem hiperfleksibilitesi

◼ Hipogonadizm

◼ Konjenital kalp defekti

(AV kanal defekti)

◼ Duodenal atrezi, Hirschprung

◼ Hipotirioidizm

◼ Karakteristik yüz

◼ Supravalvuler aort stenozu

◼ Kalın ses, herni, rektalprolapsus

◼ Aşırı sıcak davranış

◼ Hiperkalsemi

◼ Büyüme geriliği

◼ Mikrosefali, MR

◼ Hipotoni

◼ Strabismus

Array Bazlı Genomik Analizler

Hasta DNAsı Kontrol DNA

AmplifikasyonSindirim

İşaretleme

OligonükleotidArray

Hibridizasyon

Normal

Delesyon

Duplikasyon

Normal

Delesyon

Duplikasyon

Hasta DNAsıAmplifikasyon

Sindirimİşaretleme

Alel A

Alel B

Hibridizasyon

Ale

lB

A

lel

A

Dup Del

Array Bazlı Genomik Analizler

Kullanım alanları ve olumlu yönleri

◼ Delesyon/duplikasyon analizlerinde kullanılır.

◼ Tüm genom incelenir.

◼ Duyarlılığı 1 Mb – 10 Kb arası değişir.

Olumsuz yönleri

◼ Pahalıdır.

◼ Bioinformatik analiz güçlüğü bulunur.

Olgu-1

10 aylık erkek hasta;

Oturamama, emekleyememe, anormal yüz görünümü yakınmaları ile başka merkeze başvurmuş

Mukolipidoz ön tanısı ile bölümümüze sevk edildi.

Mukolipidoz için enzim analizi NORMAL

Karyotip NORMAL

Olgu-1

Dup

Del

1pdel 1pdup

Olgu-2

6 yaşında kız hasta

Konuşamama nedeniyle başvurdu

Önce yapılan karyotip analizi, temporal CT ve

BSND, CDC14A, CDH23 gen analizleri ve

karyotip NORMAL

Fizik incelemede hafif MR ve minör dismorfik

bulgular saptandı.

Olgu-2

15q11’e yakın bölgede dup

Mental Retardasyon Tanısında

Sitogenetik İncelemeler

METOD TANISAL ORAN

Karyotip / FISH % 5-10

CGH Array Karyotip / FISH (-) EK % 16.7 olgu

SNP Array Karyotip / FISH (-) EK % 22.7 olgu

Array CGH ve SNP Array Endikasyonları

Açıklanamayan öğrenme güçlüğü

Kognitif bozukluklar

Gelişme geriliği

Otizim benzeri davranış problemleri

Kromozomal anomali telkin eden dismorfik bulgular/çoklu konjenital

anomaliler

Düşük / ölü doğum (SNP Array)

USG ile saptanmış prenatal anomalisi olan bebekler

Multiplex Ligand-Dependent Probe Assay

(MLPA)

Denatürasyon ve 2. Hibridizasyon

PCR primeri X

PCR primeri Y

İşaretleyici dizi

Hedef A Hedef B

Hibridizasyondizisi

Ligasyon

Hedef A

Hedef B

Elektroforez ile ayrıştırma ve Okuma

5’Y

Y

X

3’

X

Multiplex Ligand-Dependent Probe Assay

(MLPA)

Kullanım alanları ve olumlu yönleri

◼ Gen içi büyük yeniden yapılanmalar, delesyon ya da

duplikasyonları saptamak için geliştirilmiştir.

◼ 50 değişik genomik DNA ya da RNA bölgesinde 50-75 bazlık

bölgeler hedeflenir.

◼ Multipleks analiz yapılabilir.

◼ aCGH’e göre daha ucuzdur.

Dezavantajları

◼ Önceden hedeflenmiş bölgeler analiz edilir.

◼ Epigenetik faktörler için farklı analiz gerekir.

Olgu-3

6 aylık erkek hasta;

Emmede bozulma ve gevşeklik nedeniyle başvurdu.

Ekokardiyografi’de sol ventrikül hipertrofisi saptandı

Alfa-glukosidaz düzeyi çok düşük

Pompe Hastalığı tanısı ile ERT başlandı

Olgu-3

G.Ü.T.F. Metabolizma, Ege Üniv. Genetik, Hollanda Erasmus Üniv. Genetik Laboratuvarlarında

GAA geni dizi analizi NORMAL

Karşılıklı alellerde iki gen delesyonu?

Erasmus Üniv: İncelemeye gerek yok

İspanya’da özel laboratuvarda MLPA :

Karşılıklı alellerde iki gen içi delesyonmevcut

Gen İçi Mutasyonlar

Amino asit

Amino asit

Amino asit

Amino asit

Yer

değiştirme

Küçük

insersiyon

Küçük

delesyon

Nokta

Değişiklikler

Büyük

delesyon

Büyük

insersiyon

Hedefli Mutasyon Analizi

Mutasyon analizi

Hedefli Mutasyon Analizleri

Sorumlu genin sadece belirli bölümlerinde belirli mutasyonların

varlığı araştırılır.

Kullanıldığı Alanlar

◼ Sık tekrarlayan mutasyon (olguların büyük bölümünde az sayıda ve benzer

mutasyon) gözlenen metabolik hastalıklarda tercih edilebilir.

◼ Aynı mutasyonun pek çok bireyde gözlendiği topluluklarda uygundur.

Kullanılan teknikler

◼ ASO, ARMS, AFLP

Olumlu Yanları

◼ Daha ucuz ve hızlıdır.

Olumsuz yanları

◼ Yeni mutasyonların, büyük delesyonların saptanması mümkün değildir.

DNA Dizi Analizi

Dizi (sekans) analizi

Kapiller Elektroforez ile Dizi Analizi

Kapiller elektroforez ile DNA dizi analizi yöntemi ile gen boyunca bulunan yeni

ya da daha önce tanımlanmış tüm

◼ tek baz değişiklikleri,

◼ küçük delesyonlar

◼ insersiyonlar

büyük bir doğruluk oranı ile belirlenebilir.

Olumlu yanları

◼ Moleküler genetik tetkikler arasında “altın standart” olarak kabul edilir.

◼ Bu yöntem ile kalıtsal metabolik hastalıkların tümüne tanı konulabilir.

◼ Tüm gen dizi analizine tabi tutulduğunda tanı koyma yeteneği çok yüksektir (%90)

Olumsuz yanları

◼ Büyük yapısal değişiklikler (delesyon ya da duplikasyonlar) bu yöntem ile

saptanamaz.

◼ Belirli gen bölgelerine (Örn. Belirli ekzonlar) uygulandığında diğer bölgelerdeki

mutasyonları atlar.

◼ Maliyeti yüksektir ve daha uzun zaman alır.

DNA dizi Analizi-1

Homozigot Mutasyon

Heterozigot Mutasyon

Boyama

Tampon

DNA fragmanlarının göçü

Lazer

Flöresan

dedektör

Örnek/Tampon

Kapiller

- +

PCR

Yeni Jenerasyon DNA Dizi Analizi

• Günümüzde DNA dizi analizinin altın standardı olarak kabul edilen kapiller

elektroforez ile DNA dizileme teknolojisine göre

daha fazla (onlar, yüzler, binlerce) genin hatta tüm genomun,

daha hızlı ve daha ucuza

dizi analizine tabi tutulmasını sağlar.

• Elde edilen büyük veriler ise özel olarak geliştirilmiş yazılımlar ile kısa

zaman içerisinde analiz edilebilmektedir.

Yeni Jenerasyon DNA Dizi Analizi

Yöntemler

◼ “Massively parallel sequencing” (Illumina)

◼ “Pyrosequencing” (Roche)

◼ “Semiconductor sequencing” (Ion Torrent)

Olumlu yönleri

◼ Aynı anda çok sayıda gen (Metabolizma doktoru için kolaylık) ve hasta

(Laboratuvar için kolaylık) dizi analizine alınabilir.

◼ Aynı belirti ve bulgu ile kendini gösteren tüm hastalıklar panel yapılabilir.

◼ Bulguları hiçbir tanımlanmış hastalık ile açıklanamayan olgularda “Egzom” dizi

analizi ile insandaki tüm genler taranabilir, yeni hastalık tanımlanabilir

Olumsuz yönleri

◼ Analiz edilen hasta sayısı azaldıkça ya da hastalık arttıkça maliyet artar.

◼ Klinik tanı güvenirliği tam netleşmemiştir.

◼ Çok yüklü miktarda verinin biyoinformatik analizi gerekir.

YJDA’de Akış

Gen panellerinin oluşturulması

Çipe yükleme ve Dizileme

Biyoinformatik analiz

Örneklerinhazırlanması

Örneklerindizilenmesi

Verilerin okunması(Biyoinformatik Analiz)

Yeni Jenerasyon DNA Dizi Analizi İle Panel

Şeklinde Gen Dizilemesi

Organ/sistem bazlı paneller

◼ Örn. Kc hastalıkları paneli, göz hastalıkları paneli vb.

Semptom bazlı paneller

◼ Örn. Epilepsi paneli, sağırlık paneli vb.

Ekzom analizi

◼ 20.000 genin kodlayan bölgeleri (ekzonları) (WES)

Genom analizi

◼ 20.000 genin tüm tüm bölgeleri (ekzon+intron) (WGS)

G.Ü.T.F Çocuk Metabolizma YJDA Panelleri

5 Hastalık

◼ Kistik fibrozis+Ailevi hiperkolesterolemi + Gaucher + Pompe + Hiperokzalüri Tip 1

Kalısal metabolik hastalıklar

◼ 450 hastalık

Lizozomal hastalıklar+Marfan+Ehler Danlos

60 hastalık

Nefroloji+İmmünoloji paneli

60 hastalık

Egzom sekansı

22.000 gen

◼ YAKINDA

İmmünoloji paneli (200 hastalık)

Organik asidemi+Kobalamin bozuklukları (60 hastalık)

Pulmoner hipertansiyon (10 hastalık)

Dismorfik hastalıklar (700 hastalık)

G.Ü.T.F. Çocuk Metabolizma

Metabolik Hastalıklar Paneli

450 Kalıtsal Metabolik Hastalık (450 GEN)

Yeni Jenerasyon DNA Dizileme

Teknolojisi

KALITSAL METABOLİK HASTALIK ŞÜPHESİ BULUNAN OLGULARDA TANIMLANMIŞ

TÜM METABOLİK HASTALIKLARIN (450 HASTALIK) AYNI ANDA YENİ JENERASYON

DNA DİZİLEME TEKNOLOJİSİ İLE ARAŞTIRILMASI

Olgu-4

3 yaşında kız

Üçlü antiepileptik kullanmasına karşın kontrol altına alınamayan konvülsiyonları bulunuyor

Konvülsiyonların erken yaşta başlaması ve dirençli olması ⇒ Kalıtsal Metabolik Hastalık?

Kalıtsal Metabolik Hastalıklara Bağlı

Konvülsiyonlar

• Mitokondriyal hastalıklar

• Kreatin metabolizma bozuklukları

• GLUT1 eksikliği

• Amino asit metabolizma bozuklukları

• Üre siklus bozuklukları

• Organik asidemiler

• Pürin ve pirimidin bozuklukları

• Nörotransmitter bozuklukları

• Non-ketotik hipoglisemi

• Biyotinidaz eksikliği

• Molibden kofaktör / sülfit oksidazeksikliği

• CDG

• Serin biyosentez bozuklukları

100’ün üzerinde hastalık

KMH’a YJDA ile Panel Yaklaşımı Araştırması

(Konvansiyonel vs YJDA)

FİZİK İNCELEME

RUTİN LABORATUVAR

(CBC, BİYOKİMYA..)

EEG

1. BASAMAK METABOLİK TESTLER

(AMİNOASİTLER, AÇİLKARNİTİNLER, İDRARDA ORG. ASİT…)

GÖRÜNTÜLEME (MRI, MRS)

BOS İNCELEMESİ

TEK GEN DİZİ ANALİZİ

TANI YA DA YENİ GEN

FİZİK İNCELEME

YJDA

TANI?

GLDC c.2203-2A>G (HOMOZİGOT) NON-KETOTİK HİPERGLİSİNEMİ

Yeni Jenerasyonda Veri Analizi

Olgu-5

Yenidoğan erkek olgu

Sorunsuz gebeliği takiben hastanemizde doğdu

Ailenin daha önce erken dönemde kaybedilen bebek öyküsü bulunuyor ⇒ Gözlem

Olgu-5

İlerleyen günlerde;

- Metabolik (Laktik) asidoz

- KCFT bozukluğu

- Renal tübülopati

- Konvülsiyon ve nistagmus

Kalıtsal Metabolik Hastalık

(Mitokondriyal hastalık ?)

450 gen içeren KMH paneli ile YJDA

DGUOK geni p.S52C mutasyonu (Homozigot)

Mitokondriyal Hastalık

Ekzom Dizileme

Tüm genom

Egzom %1

Mendelyen kalıtım gösteren hastalıkların % 85’inden sorumludur.

Egzom /Genom Analizi

Endikasyonları

Fizik inceleme ve laboratuvar analizleri sonucu

tanıya ulaşılamamış KMH düşünülen olgular.

Fizik inceleme ve laboratuvar bulguları, daha

önce tanımlanmış bir klinik duruma uyan ancak

geni bilinmeyen olgular.

Olgu-6

3 yaş erkek olgu

Sık tekrarlayan ketoasidoz atakları mevcut

Dünyada bilinen tüm hastalıklar araştırıldı ⇒NORMAL

TÜM EGZOM DİZİLEME

Monokarboksilat Transporter 1 (MCT1 geni)

MUTASYON

Sonuç (Genetik Analiz Seçimi)

Kromozomal Anomali

Ön tanı var

Karytotip FISH

Ön tanı yok

Karyotip

Karyotip Sonucu NORMAL ise

Array

(CGH, SNP)

Tüm sonuçlar NORMAL ise

Tüm EKZOM / GENOM Analizi

Sonuç (Genetik Analiz Seçimi)

Sık gözlenen değişiklik

Hayır Evet

Hedefli mutasyon analizi

Mutasyon

var

Mutasyon

yok

Kapiller elektroforez ile

DNA dizi analizi

Mutasyon

var

Mutasyon

yok

Küçük delesyon / duplikasyon

analizi (MLPA)

Mutasyon

var

Mutasyon

yok

Yeni jenerasyon DNA dizi analizi ve yüksek

rezonanslı kromozom analizi (CGH)TANI

Tek gen hastalığı