Физическая химия биополимеровФизическая химия биополимеров

Лаврик О.И.Лаврик О.И.

N

C H 3

O

НГУ-2012НГУ-2012

9. Аффинная модификация биополимеров. 9. Аффинная модификация биополимеров.

Фотоаффинная модификация как метод изучения Фотоаффинная модификация как метод изучения сложных ферментативных системсложных ферментативных систем

Аффинный реагентАффинный реагент

Часть, обеспечивающая специфичное Часть, обеспечивающая специфичное нековалентное связывание реагента нековалентное связывание реагента

с биополимеромс биополимером

Реакционноспособная группа, Реакционноспособная группа, за счет которой происходит за счет которой происходит ковалентное присоединение ковалентное присоединение

реагента к акцептору в биополимеререагента к акцептору в биополимере

Белок-мишень содержит лиганд–связывающий центр

Образование комплекса между меченым реагентом и белком-мишенью

Образование ковалентной связи между реакционноспособной

группой реагента и белком-мишенью

Идентификация модифицированной части белка

Светлые овалы обозначают аффинную часть реагента; темные кружочки – реакционно-cпособную группу реагента, а звездочки – метку, например, радиоактивную.

Схема классической модификацииСхема классической модификации

где EX – комплекс E с X; EZ – продукт модификации; k – константа скорости превращения E в Z.

Обычно концентрация EX считается квазиравновесной, т.е. принимается, что по ходу всего процесса концентрации E, X и EX связаны соотношением:

= Kx

[E] + [EX] + [EZ] = E0

[X] + [EX] + [EZ] = X0

= k[EX]

E + X EX

EX EZ

[EX]

[E][X]

dt

d[EZ]

Кинетические закономерности Кинетические закономерности аффинной модификацииаффинной модификации

Если реагент находится в большом избытке по отношению к биополимеру, т.е. Х0>>Е0, то [X]≈Х0 на протяжении всего процесса.

[EX] = и = = kкаж(E0-[EZ])

Это уравнение скорости псевдопервого порядка с кажущейся константой скорости kкаж. Начальная скорость реакции

v0=

где Vmax=kЕ0 – максимальная скорость аффинной модификации, достигаемая при насыщающих концентрациях реагента. Величины kкаж и v0 – гиперболические функции Х0. Измерив начальную скорость или kкаж при разных концентрациях реагента, с помощью линейной анаморфозы можно определить k и Kx

dt

d[EZ] [EZ])-(E

X

K1

k0

0

x

0

x

max

X

K1

V

0

x

каж kX

K

k

1

k

1

0

x

0

X

K1

[EZ]-E

Основные критерии аффинной модификацииОсновные критерии аффинной модификации

1) Модификация проходит по определенным группам в каждой молекуле биополимера или в каждой субъединице в самом активном центре или вблизи него и может сопровождаться потерей биополимером (ферментом) свойственной им активности;

2) Начальная скорость модификации v0 изменяется в зависимости от начальной концентрации реагента X0 по гиперболическому закону, достигая предельного значения при достаточно высоких концентрациях реагента;

3) Сродство реагента к биополимеру (ферменту), характеризуемое константой диссоциации комплекса биополимер-реагент Кx , может быть определено из зависимости v0 от X0. Оно должно быть таким же, как и сродство реагента, проявляемое им в случае, когда он выступает как конкурент по отношению к природному лиганду при исследовании обратимого связывания последнего;

4) Природный лиганд защищает биополимер от аффинной модификации, т.е. тормозит процесс аффинной модификации. Из зависимости v0 от концентрации реагента и природного лиганда можно определить величину константу диссоциации комплекса биополимер-природный лиганд (KY). Если речь идет об аффинной модификации односубстратного фермента, то можно определить величину константы Михаэлиса для субстрата KM. Эта величина может быть больше KY или равна ей.

Условие материального баланса для фермента следует заменить на

[E] + [EX] + [EY] + [EZ] = E0

Для взаимодействия этого лиганда с полимером условие материального баланса и квазиравновесия:

[EY] + [Y] = Y0

= Ky

где Ky – константа диссоциации комплекса нереакционноспособного конкурента.

Если наряду с реагентом X в реакционной смеси Если наряду с реагентом X в реакционной смеси присутствует нереакционноспособный конкурент Y присутствует нереакционноспособный конкурент Y

(природный лиганд)(природный лиганд)

[EY]

[E][Y]

Если конкурент взят в количестве, намного превышающем количество биополимера, то [Y]≈Y0 . В этом случае кинетическое уравнение остается уравнением псевдопервого порядка с кажущейся константой скорости

kкаж = и v0 =

Линейная зависимость Лайнуивера–Берка для 1/kкаж как функции 1/X0.

В серии экспериментов с постоянным значением Y0 и изменяющимся значением X0 точки ложатся на прямую, пересекающую ось ординат при значении 1/kкаж = 1/k. Значение Kx определяется из экспериментов в отсутствие нереакционноспособного конкурента Y.

y

0

0

x

K

Y1

X

K1

k

y

0

0

x

каж K

Y1

kX

K

k

1

k

1

y

0

0

x

0

K

Y1

X

K1

keE

где Q – продукт (продукты) превращения Y. Для описания ферментативного превращения Y обычно используют квазиравновесное приближение:

= k’1[E][Y] – (k’-1+ k’2)[EY] = 0

и, следовательно, (KM)Y

где (KM)M – константа Михаэлиса для субстрата Y. В этом случае в выражение:

v0 =

вместо KY следует подставить (KM)Y. Эта величина может существенно превышать KY=k’-1/k’1, если k’-1 того же порядка или меньше, чем k’2.

Природный субстрат YПриродный субстрат Y превращается в продукт реакциипревращается в продукт реакции

dt

d[Y]

,1

,2

,1-

k

kk

[EY]

[E][Y]

y

0

0

x

0

K

Y1

X

K1

keE

Особые случаиОсобые случаи

Аффинная модификация одноцентрового фермента может проходить по нескольким группам, локализованным в самом активном центре или вблизи него.

В случае более сложных ферментов и механизмов превращения реагента зависимость начальной скорости модификации от концентрации реагента может иметь насыщающий характер, но не быть гиперболической. Эта зависимость может проходить через максимум или иметь точки перегиба.

Возможны ситуации, когда не наблюдается защитного эффекта природного лиганда от модификации или он резко занижен.

Для многосубстратных ферментов могут появиться новые критерии, сформулированные на основе кинетического анализа более сложных схем аффинной модификации. Например, в случае функциональных димеров можно наблюдать взаимодействие аффинного реагента с двумя активными центрами.

Ковалентное присоединение белков к ДНК, содержащим АР-сайт

NaBH4АР-сайт АР-сайт

АР-сайт

2) Электрофорез

СорбентСорбент c c иммобилизованным иммобилизованным

стрептавидиномстрептавидином

1) Элюция с сорбента

1) Адсорбция

2) Отмывка

Модифицированный белок

Окр

ас

ка б

ел

ков

кум

ас

си

R-2

50

Ра

ди

оа

вт

огр

аф

гел

я

ДНК-дуплекс, содержащий

AP-сайт, биотин и радиоактивную

метку

+

экстракт

NaBH4PARP1 NaBH4Ku 80

стабильный комплексДНК–БЕЛОК

трипсин

Идентификация Ku80 из клеток хронической миелоидной лейкемии человека как белка, ковалентно присоединенного к ДНК-дуплексу,

содержащему апуриновый/апиримидиновый (АР-) сайт

Ku 80

Идентификация белка

Масс-cпектрометрия(MALDI-TOF-MS)

(Mascot/Profound)

белокбелок

белок

Функции Функции KuKu--антигенаантигена::

• Репарация двойных разрывов ДНК

• V(D)J-рекомбинация

• Репликация ДНК

• Регуляция транскрипции

• Сохранение теломерных концов

• Апоптоз

• Адгезия клеток

Роль Ku-антигена

Ku-антиген как онкобелок или как белок-супрессор развития рака

Репарация двойных разрывов ДНК

связываниеконцов ДНК

сближениеконцов ДНК

сшиваниеконцов ДНК

Angew. Chem. Int. Ed., 2003, 42, 2946 – 2974

Структура Ku70/80, связанного с ДНК

Angew. Chem. Int. Ed., 2003, 42, 2946 – 2974

1. Метод аффинной модификации, основанный на использовании реакционноспособных структур ДНК, имитирующих промежуточные интермедиаты процессов репарации, позволяет изучать функционирование ансамблей белков репарации.

2. Аффинная модификация в сочетании с MALDI-MS при использовании на уровне экстрактов клеток и ядер позволяет открывать новые белковые факторы, участвующие в этих процессах.

3. Разработанные методы идентификации белков репарации в экстрактах клеток позволяют оценивать статус систем репарации.

Преимущества фотоаффинной модификации при Преимущества фотоаффинной модификации при исследовании многокомпонентных комплексов, исследовании многокомпонентных комплексов,

например, репликативногонапример, репликативного комплексакомплекса

Возможность изучения быстро протекающих изменений в Возможность изучения быстро протекающих изменений в области контакта участников процесса: ферментов, ДНК-области контакта участников процесса: ферментов, ДНК-матрицы и матрицы и dNTPdNTP при помощи быстрого фотохимического при помощи быстрого фотохимического мечения фермента фотоактивируемыми аналогами мечения фермента фотоактивируемыми аналогами dNTPdNTP или праймера, которое можно осуществить за или праймера, которое можно осуществить за миллисекунды, используя импульсное облучение. миллисекунды, используя импульсное облучение.

Фотоактивируемые группы позволяют определить Фотоактивируемые группы позволяют определить взаимное расположение отдельных субъединиц всех взаимное расположение отдельных субъединиц всех участников репликации относительно ДНК и друг друга и участников репликации относительно ДНК и друг друга и исследовать динамику функционирования таких систем. исследовать динамику функционирования таких систем.

В случае фотореагентов, содержащих арилазидогруппы, В случае фотореагентов, содержащих арилазидогруппы, существует возможность вариации длины линкера и типа существует возможность вариации длины линкера и типа арилазидогруппы, что способствует повышению арилазидогруппы, что способствует повышению эффективности и селективности модификации эффективности и селективности модификации биополимера. биополимера.

N

HN

OP

O

O-

OP

O

O-

OP

O

O-

-OO

O

NH

O

HHO

HH

HH

NH

N

N3

O

ClF

R

O

N3F

O

N3

O2N

O

N3

O2N

O

F N3O

N

O

R:

FAP-8-dUTPFAB-4-dUTP

NAB-4-dUTP NAB-12-dUTP

FABC-dUTP

4Li+

FAB-dCTP

FABO-dCTP

FABG-dCTP

R1

N3

O2N

O

NH

HN

O

F N3

OO

NN3

F

HN

O HN

N

N3

FO

NH

CO

ON

N3F

FABC-dCTP

NAB-dCTP

R1

R1

R1

R1

FAP-dCTP

HN

N

N3

R1

Cl

F

F

N

N

OP

O

O-

OP

O

O-

OP

O

O-

OO

HN

O

HOH

R1=

Фотореакционноспособные аналоги Фотореакционноспособные аналоги dNTPdNTP

Схема фотоаффинной модификацииСхема фотоаффинной модификации

белокДНК

комплекс белок-ДНК

белок,ковалентно присоединенный к ДНК

+

УФ-свет

Механизм фотолиза Механизм фотолиза тетрафторазидобензоил(тетрафторазидобензоил(FAB)-FAB)-замещенных замещенных

аналогов аналогов dNTPdNTP

Репликативный белок А человека (Репликативный белок А человека (RPARPA))

RPARPA – основной эукариотический – основной эукариотический SSBSSB-белок, как и -белок, как и прокариотические прокариотические SSBSSB, играет ключевую роль в процессах , играет ключевую роль в процессах репликации, репарации и рекомбинации ДНК. репликации, репарации и рекомбинации ДНК.

Структура: стабильный гетеротример, состоящий из трех Структура: стабильный гетеротример, состоящий из трех субъединиц с молекулярными массами 70, 32 и 14 кДа. субъединиц с молекулярными массами 70, 32 и 14 кДа.

Основная функция – стабилизация одноцепочечных Основная функция – стабилизация одноцепочечных участков ДНК. Кроме того, участков ДНК. Кроме того, RPA RPA обладает способностью к обладает способностью к расплетению двуспиральной структуры ДНК. Эта функция расплетению двуспиральной структуры ДНК. Эта функция естественно связана с его способностью удерживать естественно связана с его способностью удерживать однонитчатые участки ДНК в расплетенном состоянии. однонитчатые участки ДНК в расплетенном состоянии.

Домены Домены RPARPA, связывающие одноцепочечные участки ДНК, связывающие одноцепочечные участки ДНК

Bochkareva E. et al. (2002) EMBO J., 21, 1855-1863

Структура тримера Структура тримера RPA RPA человекачеловека

Lavrik O.I. et al. (1999) Nucleic Acids Res., 27, 4235-4240

Фотоаффинная модификация димера Фотоаффинная модификация димера RPA70/RPA32RPA70/RPA32 Фотореакционноспособными ДНК-структурами с Фотореакционноспособными ДНК-структурами с

различной длиной одноцепочечного участкаразличной длиной одноцепочечного участка

Длина матрицы (нт)

кДа

УФ-индуцированная«сшивка»

Разделение в ПААГ

Субъединичный контакт с 3Субъединичный контакт с 3’’-концом праймера ДНК-структур -концом праймера ДНК-структур с различной длиной одноцепочечного участкас различной длиной одноцепочечного участка

Конформация глобулыпри связывании с участком 8нт

Конформация глобулыпри связывании с участком 13нт

Вытянутая конформацияпри связывании с участком 30нт

Kolpashchikov D.M.,Khodyreva S.N., Khlimankov D.Yu., Wold M.S., Favre A., Lavrik O.I. (2001) Nucleic Acids Res., 29, 373-379

Полярность связывания Полярность связывания RPA RPA с ДНКс ДНК

Конформация глобулыпри связывании с

участком 8нт

Вытянутая конформацияпри связывании с

участком 30нт

Фотоактивируемый 5’-конец запирающего

праймера

ДлинаБреши 9нт 30нт

ДлинаБреши 9нт 30нт

Фотоактивируемый 3’-конец запирающего

праймера

Фотоактивируемые аналоги Фотоактивируемые аналоги dNTPdNTP являются являются эффективными субстратами ДНК-полимераз и могут эффективными субстратами ДНК-полимераз и могут быть использованы для ферментативного синтеза быть использованы для ферментативного синтеза фотореакционноспособных ДНКфотореакционноспособных ДНК--субстратовсубстратов, , либо либо интермедиатов процессов метаболизма ДНК, в интермедиатов процессов метаболизма ДНК, в частности репликации и репарации ДНК, с частности репликации и репарации ДНК, с последующей фотоаффинной модификацией последующей фотоаффинной модификацией ферментов-участников этих процессов метаболизма ферментов-участников этих процессов метаболизма ДНК.ДНК.

Фотоаффинная модификация белков клеточных экстрактовФотоаффинная модификация белков клеточных экстрактов

фотоактивируемый аналог dNTP ДНК-полимераза

фотоактивируемая ДНК

Ферментативный синтезФерментативный синтезфотоактивируемой ДНКфотоактивируемой ДНК

Репарация оснований ДНКРепарация оснований ДНК

ХДНК-гликозилаза

Активные формы кислородаметилирование, дезаминирование

Спонтанный гидролизгликозидной связи

(АР-сайт)

Рентгеновское излучение(одноцепочечный разрыв)

APE1PNK

PARP1

XRCC1

XRCC1 Pol

+dGTP +4dNTP

PCNAPol /ε

FEN1

ДНК-лигаза III

ДНК-лигаза I

+ATP +ATP

Взаимодействие Взаимодействие APE1, PolAPE1, Pol и PA и PARPRP11с ДНК-интермедиатом репарации основанийс ДНК-интермедиатом репарации оснований

PARP1

Pol β

Апуриновая/апиримидиновая эндонуклеаза 1 (Апуриновая/апиримидиновая эндонуклеаза 1 (APE1APE1) ) стимулирует синтез ДНК, катализируемый ДНК-стимулирует синтез ДНК, катализируемый ДНК-полимеразой полимеразой (Pol (Pol ) и повышает его точность. ) и повышает его точность.

PolPol и и APE1 APE1 осуществляют эффективный и точный осуществляют эффективный и точный синтез ДНК при репарации длинных брешей.синтез ДНК при репарации длинных брешей.

Поли(ADP-рибозо)полимераза -1 (PARP1) координирует Поли(ADP-рибозо)полимераза -1 (PARP1) координирует пути репарации.пути репарации.

Sukhanova M.V. et al., Nucleic Acids Res., 2005, 33, 1222-1229 DNA Repair, 2004,3, 581-591

Sukhanova M.V. et al., DNA Repair, 2007, 6, 615-625

Lavrik O.I. et al., J. Biol. Chem., 2001, 276, 25541-25548

32Р XG

Ферментыклеточного экстракта

удаляют повреждение в ДНК ивстраивают фотоактивируемый

нуклеотид

УФ-облучениеиндуцирует ковалентное

присоединение специфическихбелков из экстракта

Идентификация белков,ковалентно присоединенных

к ДНК

32Р CG

P5’

*

32Р CG

P5’

Белок,ковалентно

присоединенныйк ДНК

Повреждение в ДНК

Фотоактивируемый

нуклеотид

+dCTP*

Из тысяч Из тысяч клеточных белков клеточных белков

только шестьтолько шестьформировали формировали

аддукты с таким аддукты с таким ДНК-ДНК-

интермедиатом интермедиатом репарации репарации оснований.оснований.

Наряду с Наряду с известными известными

компонентамикомпонентамисистемы системы

репарации репарации выявлены новыевыявлены новыеучастники этого участники этого

процесса:процесса:PARP1PARP1 и и HMGB1 HMGB1..

Идентификация белков репарацииИдентификация белков репарацииоснований в клеточном экстрактеоснований в клеточном экстракте

hν

Идентификация белков репарации оснований в экстракте Идентификация белков репарации оснований в экстракте из клеток эмбриональных фибробластов мышииз клеток эмбриональных фибробластов мыши

Lavrik O.I. et al., J. Biol. Chem., 2001, 276, 25541-25548

HighHigh--mobility groupmobility group box 1 protein (HMGB1)box 1 protein (HMGB1) был идентифицирован был идентифицирован масс-спектрометрией какмасс-спектрометрией как кофактор репарации оснований ДНКкофактор репарации оснований ДНК

Mol. Cell., 2007, 27, 829-41

Методы высокоселективной Методы высокоселективной модификации ферментовмодификации ферментов

Использование реагентов, соответствующих Использование реагентов, соответствующих аналогам субстрата, имитирующим аналогам субстрата, имитирующим переходное состояние, через которое переходное состояние, через которое происходит превращение субстрата в происходит превращение субстрата в продукт. продукт.

Каталитически компетентное мечение (ККМ). Каталитически компетентное мечение (ККМ). Модификация с использованием бинарной Модификация с использованием бинарной

системы фотоаффинных реагентов (БСФР).системы фотоаффинных реагентов (БСФР).

Бинарная система фотоаффинных реагентовБинарная система фотоаффинных реагентов

А) Белок-мишень содержит центр связывания для А) Белок-мишень содержит центр связывания для двух субстратов. двух субстратов.

Б) Образование комплекса белка-мишени с Б) Образование комплекса белка-мишени с радиоактивно меченым фотореагентом и радиоактивно меченым фотореагентом и сенсибилизатором. сенсибилизатором.

В) Во время облучения энергия изначально В) Во время облучения энергия изначально поглощается сенсибилизатором, а затем поглощается сенсибилизатором, а затем переносится на фотоактивируемую группу переносится на фотоактивируемую группу реагента. Реагенты, связанные вне активного реагента. Реагенты, связанные вне активного центра и находящиеся в растворе, не центра и находящиеся в растворе, не возбуждаются. возбуждаются.

Г) Реагент ковалентно присоединяется в Г) Реагент ковалентно присоединяется в связывающем центре белка-мишени. связывающем центре белка-мишени.