Физическая химия биополимеровФизическая химия биополимеров

Лаврик ОИЛаврик ОИ

N

C H 3

O

НГУ-2012НГУ-2012

11 Механизмы специфического отбора 11 Механизмы специфического отбора

субстратов субстратов

Коррекция ошибок в реакциях катализируемых Коррекция ошибок в реакциях катализируемых аминоацил-тРНК-синтетазами и аминоацил-тРНК-синтетазами и

ДНК-полимеразамиДНК-полимеразами

Что происходит в ходе Что происходит в ходе ферментативной реакцииферментативной реакции

Связывание субстрата с активным центром происходит за счет достаточно слабых взаимодействий (электростатических контактов гидрофобного связывания водородных связей) Если взаимодействие многоточечное то расположение активных группировок в молекуле субстрата должно точно соответствовать расположению активных групп в молекуле фермента Если эти группировки расположены так что необходимые контакты не формируются то это влияет на величину Kd=k-1k1 Возможно влияние на величину KM

Каталитические группы активного центра должны также быть ориентированы необходимым для катализа образом В противном случае смещение электронов будет неэффективным что приводит к понижению величины kcat

Специфичность ферментов в отношении превращаемых Специфичность ферментов в отношении превращаемых субстратов ndash важнейшая особенность ферментативных реакцийсубстратов ndash важнейшая особенность ферментативных реакций

Некоторые из ферментов обладают Некоторые из ферментов обладают очень широкой очень широкой специфичностьюспецифичностью (например щелочная фосфатаза) (например щелочная фосфатаза)

Другой крайний случай ndash Другой крайний случай ndash строгая стереоспецифичностьстрогая стереоспецифичность ndash Дрожжи содержат два определенных фермента ndash Дрожжи содержат два определенных фермента LL-лактат -лактат и и DD-лактатдегидрогеназу -лактатдегидрогеназу ndash ndash Аминоацил-тРНК-синтетазы проявляют высокую Аминоацил-тРНК-синтетазы проявляют высокую стереоспецифичность стереоспецифичность DD-аминокислоты не являются -аминокислоты не являются субстратами за исключением субстратами за исключением DD-тирозина Возможно -тирозина Возможно образование образование DD-тирозил-тРНК и по этой причине для -тирозил-тРНК и по этой причине для гидролиза нежелательного продукта существует фермент гидролиза нежелательного продукта существует фермент DD-тирозил-гидроксилаза-тирозил-гидроксилаза

Ферменты снижают энергию активации Ферменты снижают энергию активации катализируемой реакциикатализируемой реакции

ДжБС Холдейн 1930 гlaquoЭнергия связывания субстрата Энергия связывания субстрата используется для деформации используется для деформации субстрата до структуры продуктасубстрата до структуры продуктаraquoВ теории переходного состояния не учитываются процессы столкновения реагентов Теория рассматривает сами реагенты (основное состояние) и наиболее нестабильные соединения которые образуются в ходе реакции (переходное состояние) Переходному состоянию соответствует максимум на кривой изменения энергии реагентов вдоль координаты реакцииДжон Бердон СандерсонДжон Бердон Сандерсон

ХолдейнХолдейн1892 1892 Оксфорд Англия ndash 19Оксфорд Англия ndash 196464 Индия Индия

Английский биолог и философАнглийский биолог и философ

График изменения энергии Гиббса График изменения энергии Гиббса в ходе реакциив ходе реакции

Состояние 1 ndash переходное состояние (ESne) Состояние 2 ndash промежуточное состояние

В переходном состоянии химические связи непрерывно образуются и разрываются Соединениям со стабильными химическими связями соответствуют минимумы на графике Допущение о существовании термодинамического равновесия между основным и переходным состоянием используется для расчета скорости реакции В этом случае концентрацию переходного состояния можно рассчитать из разности энергии этих состояний Общую скорость реакции получают умножением концентрации переходного комплекса и константы скорости его распада

Для мономолекулярной реакцииРазность энергий Гиббса для переходного (Хne) и основного (Х) состояний равна ∆Gne Воспользуемся известным соотношением равновесной термодинамики∆Gne = -RT lnK [Хne]=[X]exp(-∆GneRT)

Частота распада переходного комплекса = частота колебаний разрываемой связиЧастота распада переходного комплекса = частота колебаний разрываемой связи

Частота получена из равенства энергий возбужденного осциллятора рассчитанных на основе квантовой теории (E=hω) и классической физики (Е=kT) где h ndash постоянная Планка ω ndash частота колебаний k ndash постоянная Больцмана ωω==kTkThh Скорость распада молекул Х определяется уравнением

exp(-∆GneRT)

Константа скорости первого порядка для распада молекул Х равна

k1= exp(-∆GneRT)

Энергия активации Гиббса ∆Gne может быть подразделена на энтальпийную и энтропийную составляющие ∆Gne =∆Нne -Т∆Sne

k1= exp(-∆HneRT) exp(∆SneR)

h

kT]X[]X[

dt

d[X]

h

kT

h

kT

Применение теории переходного состояния для Применение теории переходного состояния для анализа механизмов ферментативного катализаанализа механизмов ферментативного катализа

В случае простого механизма Михаэлиса-Ментен (КВ случае простого механизма Михаэлиса-Ментен (КSS=К=КMM) ) энергия связывания уменьшает энергию активации перехода энергия связывания уменьшает энергию активации перехода определяемого кажущейся константой скорости второго определяемого кажущейся константой скорости второго порядка порядка kkcatcatKKMMСмысл параметра kcatKM где kcat - число оборотов реакции поскольку эта величина определяет максимальное число молекул субстрата превращаемых в продукт одним активным центром в единицу времениndash KM в простейшем варианте можно рассматривать как кажущуюся константу диссоциации v=kcat[E](1+KM[S]) ndash При малых концентрациях субстрата v=kcatKM[E][S] то есть kcatKM представляет собой кажущуюся константу скорости второго порядка Ценность параметра kcatKM в том что он связывает скорость реакций с концентрацией свободного фермента а не с его общей концентрацией Это справедливо для низкой концентрации субстрата тк при [Е]asymp[Е0]

KM=KD= [ES]

]S][E[

RTln(kcatKM)=RTln(kTH) - ∆Gne-∆GS

Константа скорости для взаимодействия свободного фермента со свободным субстратом с образованием продуктов равна kcatKM В терминах теории переходного состояния константа равновесия для второй реакции пропорциональна энергии активации ∆GТ

ne

k1= exp(-∆GneRT)h

kT

∆GТne=∆Gne+∆GS

∆Gne ndash положительная величина отражающая энергию активации химических стадий в ходе которых происходит образование и разрыв связей ∆GS - отрицательная величина отражающая использование энергии связывания

Изменение энергии Гиббса для реакцииИзменение энергии Гиббса для реакции

E + S ES продукты

∆Gne ndash положительная величина отражающая образование и разрыв связей ∆GS - отрицательная величина отражающая использование энергии связывания

Фермент и субстрат Фермент и субстрат комплементарныкомплементарны когда каждая взаимодействующая группа когда каждая взаимодействующая группа

субстрата контактирует с субстрата контактирует с соответствующим центром связывания соответствующим центром связывания

фермента и энергия связывания фермента и энергия связывания принимает максимальное значениепринимает максимальное значение

Комплементарность фермента исходному Комплементарность фермента исходному субстратусубстрату

Допустим максимальная внутренняя свободная энергия связывания равна ∆Gb В рассмотренном случае она реализуется в исходном фермент-субстратном комплексе обеспечивая прочное связывание КM - константа диссоциации фермент-субстратного комплекса ndash будет мала Образование переходного состояния будет сопровождаться изменением геометрии субстрата и ухудшением его соответствия что приведет к уменьшению энергии связывания ∆GR ndash увеличение свободной энергии вызванное ухудшением структурного соответствия между ферментом и субстратом ∆G0 ndash свободная энергия активации для образования и разрыва химических связей на стадии определяемой константой kcatНаблюдаемая свободная энергия активации для стадии химического превращения субстрата с константой скорости kcat равна∆Gne=∆G0

ne+∆GR и∆GS=∆Gb

Энергия активации Гиббса для процесса

∆GТne=∆G0

ne+∆GR+∆Gb

Пунктирная линия ndash фермент структурно комплементарен субстрату сплошная ndash переходному состоянию (∆GS = ∆Gb - отрицательная величина ∆G0 и ∆GR ndash положительны)

График изменения энергии ГиббсаГрафик изменения энергии Гиббса

E + S ES продукты

Полная энергия связывания ∆Gb реализуется в переходном состоянии Исходному фермент-субстратному комплексу соответствует положительный член ∆GR который отражает возрастание энергии за счет структурного несоответствия исходного состояния переходному Этот член увеличивает КМ а прирост энергии связывания по мере приближения к переходному состоянию увеличивает kcat∆Gne = ∆G0

ne - ∆GR

∆GS = ∆Gb + ∆GR

Энергия активации Гиббса для перехода характеризующегося константой kcatKM

∆GТne=∆G ne + ∆GS = ∆G0

ne + ∆Gb

∆GR из конечного уравнения исключается

Когда фермент комплементарен переходному состоянию субстрата а не самому субстрату kcatKM возрастает в exp(∆GRRT) раз kcatKM не зависит от взаимодействий в исходном фермент-субстратном комплексе поскольку член ∆GR не входит в уравнение

Комплементарность фермента переходному Комплементарность фермента переходному состоянию субстратасостоянию субстрата

Наличие сильного связывания фермента с субстратом или Наличие сильного связывания фермента с субстратом или низкое значение Книзкое значение КМ М не является необходимым условием не является необходимым условием

протекания ферментативной реакции Для катализа важны протекания ферментативной реакции Для катализа важны высокие значения Квысокие значения КММ

Процесс эволюции ферментов направленный на увеличение Процесс эволюции ферментов направленный на увеличение скорости катализируемых ими реакций можно разделить на два скорости катализируемых ими реакций можно разделить на два этапаэтапа

11 Увеличение Увеличение kkcatcatKKMM за счет повышения комплементарности фермента за счет повышения комплементарности фермента переходному состоянию субстратапереходному состоянию субстрата

22 Увеличение концентрации фермента за счет повышения КУвеличение концентрации фермента за счет повышения КММ направленное на то чтобы в свободном состоянии находилось направленное на то чтобы в свободном состоянии находилось максимально возможное количество ферментамаксимально возможное количество фермента

Исключение ndash ферменты которые выполняют регуляторные функцииИх активность регулируется путем изменения КМ субстратов через

аллостерическое воздействие

Модель laquoключ-замокraquoМодель laquoключ-замокraquo

Теория комплементарности при фермент-субстратном взаимодействии принадлежит Э Фишеру воплотившему ее в модели laquoключ-замокraquo В 1890 г Э Фишер предложил модель согласно которой специфичность ферментов определяется точным соответствием формы фермента и субстрата Однако хотя эта модель объясняла высокую специфичность ферментов она не объясняла явления стабилизации переходного состояния которое наблюдается на практике

Герман Эмиль ФишерГерман Эмиль Фишер1852 Ойскирхен ndash 1919 Берлин1852 Ойскирхен ndash 1919 Берлин

Немецкий химик-органик и Немецкий химик-органик и биохимикбиохимик

Нобелевская премияпо химии 1902 г

Концепция деформацииКонцепция деформации(ДжБС Холдейн и Л Полинг)(ДжБС Холдейн и Л Полинг)

Активный центр фермента структурно комплементарен не самому субстрату а переходному состоянию При связывании с ферментом переходное состояние субстрата взаимодействует с ферментом более эффективно чем сам субстрат и поэтому полная энергия связывания не реализуется до тех пор пока не сформируется переходное состояние

Лайнус Карл ПолингЛайнус Карл Полинг1901 Портленд ndash 1994 Биг-Сюр1901 Портленд ndash 1994 Биг-Сюр

американский химикамериканский химикНобелевская премия

по химии 1954 г и мира 1962 г

Теория индуцированного Теория индуцированного соответствиясоответствия

Объясняет отсутствие ферментативной активности с небольшими субстратами такими как вода в которых нет групп способных обеспечить связывание и энергию для приведения фермента в активное состояние Является модификацией модели laquoключ-замокraquo - модель laquoрука-перчаткаraquo Предполагается что в отсутствии субстрата фермент структурно некомплементарен переходному состоянию Однако поскольку молекула фермента довольно гибкая а субстрат имеет жесткую структуру при образовании фермент-субстратного комплекса каталитические группы на ферменте ориентируются оптимальным для катализа образом фермент становится комплементарным переходному состоянию только после связывания субстрата Перестройка области активного центра при связывании с субстратом названа процессом конформационной адаптации

Дэниэл Эдвард КошландДэниэл Эдвард Кошланд1920 Нью-Йорк ndash 1919 Калифорния1920 Нью-Йорк ndash 1919 Калифорния

американский биохимикамериканский биохимик

Гипотеза непродуктивного связыванияГипотеза непродуктивного связывания

Было предложено что помимо продуктивного связывания в активном центре возможны другие способы связывания когда небольшие субстраты связываются но не подвергаются каталитическому превращению

Например в молекуле лизоцима активный центр имеет протяженную структуру состоящую из шести центров связывания ndash A B C D E F Для осуществления реакции необходимо чтобы молекула субстрата заняла центры D и Е Небольшие субстраты способны присоединяться с любой сторону вдоль вытянутого активного центра лизоцима не связываясь с подцентром где происходит расщепление

ДеформацияДеформация вносит положительный вклад в катализ вносит положительный вклад в катализ при условии комплементарности фермента при условии комплементарности фермента переходному состоянию субстрата увеличивая переходному состоянию субстрата увеличивая kkcatcat и и KKMM что приводит к увеличению скорости реакции что приводит к увеличению скорости реакции

ИндуцированноеИндуцированное соответствиесоответствие уменьшает уменьшает эффективность катализа увеличивая эффективность катализа увеличивая KKMM без без соответствующего увеличения соответствующего увеличения kkcatcat по сравнению с по сравнению с ферментом находящимся в кативной форме в ферментом находящимся в кативной форме в отсутствие субстрата отсутствие субстрата

Механизм непродуктивного связыванияМеханизм непродуктивного связывания не не затрагивает каталитического превращения затрагивает каталитического превращения специфических субстратов однако он приводит к специфических субстратов однако он приводит к появлению дополнительных связывающих центров для появлению дополнительных связывающих центров для конкурирующих между собой неспецифических конкурирующих между собой неспецифических субстратовсубстратов

Специфичность ферментаСпецифичность фермента

Способность фермента узнавать Способность фермента узнавать определенный субстрат из нескольких определенный субстрат из нескольких

конкурирующих за активный центрконкурирующих за активный центр

Функция слагающаяся из прочности связывания Функция слагающаяся из прочности связывания

каждого из субстратов и кинетической каждого из субстратов и кинетической

(каталитической) специфичности (каталитической) специфичности

характеризующейся скоростью катализахарактеризующейся скоростью катализа

laquoСуммарнаяraquo специфичность характеризуется laquoСуммарнаяraquo специфичность характеризуется

отношением отношением kkcatcatKKMM

Специфичность и относительная Специфичность и относительная реакционная способностьреакционная способность

Центральная проблема специфичности Центральная проблема специфичности каким образом фермент отличает специфический каким образом фермент отличает специфический субстрат от другого меньшего или равного ему по субстрат от другого меньшего или равного ему по размерам (изостерического) субстратаразмерам (изостерического) субстрата

Такую задачу постоянно решают аминоацил-тРНК-синтетазы Если синтетаза (ЕХ) ошибочно активирует чужую аминокислоту (Y) и далее катализирует ее перенос на laquoсвоюraquo тРНКХ

или если она ошибочно этерифицирует истинной субстратной аминокислотой Х чужую тРНК

то каждое из этих событий приведет к ошибке в последовательности синтезируемой полипептидной цепи

Дискриминация аминокислот меньших или изостеричных (равных по размеру) специфическому субстрату способных разместиться в активном центре фермента определяется предпочтительным связыванием истинного субстрата за счет незначительных различий в структуре

Валил-тРНК-синтетаза

Наличие разницы в энергии связывания не до конца обеспечивает Наличие разницы в энергии связывания не до конца обеспечивает в этих случаях точность работы системы аминоацилированияв этих случаях точность работы системы аминоацилирования

валин

Изолейцил-тРНК-синтетаза

изолейцин валин треонин

Треонин связывается с валил-тРНК синтетазой в 100-200 раз слабее валина несмотря на то что он изостеричен валину поскольку в гидрофобный карман погружается гидроксильная группа вместо метиленовой Энергия активации реакции представляет собой сумму двух составляющих одна из них ndash энергия активации для стадии химического превращения а вторая ndash энергия связывания фермента с субстратом

Валил-тРНК-синтетаза

валин треонин

Различие в энергии связывания специфичного субстрата (Различие в энергии связывания специфичного субстрата (RSRS) и ) и меньшего по размерам конкурирующего соединения меньшего по размерам конкурирующего соединения HSHS равно равно дополнительной энергии связывания группы дополнительной энергии связывания группы RR имеющейся у имеющейся у специфичного субстрата и отсутствующей у меньшего специфичного субстрата и отсутствующей у меньшего субстрата по отношению к водороду субстрата по отношению к водороду

Поскольку энергия взаимодействия группы R не только входит в энергию связывания но и понижает энергию активации стадии химического превращения вклад заместителя R следует оценивать из сравнения параметров kcatKM для двух субстратов RS и HS Например если величину kcat для валина для активации валил-тРНК-синтетазой принять за 1 то для других аминокислот эта величина будет для аланина 003 для изолейцина 00019 для серина 005

Дополнительную энергию связывания группы Дополнительную энергию связывания группы RR по отношению к по отношению к водороду можно определить по формулеводороду можно определить по формуле

∆Gb=RTln(kcatKM)RS ln(kcatKM)HS

Для пары изолейцил-тРНК-синтетаза-валин неспецифический субстрат по критерию kcatKM хуже в 140-200 раз В клетках EColi [Ile][Val] = 018 Уровень ошибок изолейцил-тРНК-синтетазы на стадии активации 003-004 Экспериментально обнаружено уровень ошибок при замене Ile на Val в биосинтезе овальбумина цыпленка и гемоглобина кролика равен 310-4

Изолейцил-тРНК-синтетаза

изолейцин валин

Чему соответствует этот уровень ошибокЧему соответствует этот уровень ошибок

Ошибочное включение одной аминокислоты на Ошибочное включение одной аминокислоты на каждые 10000 остатковкаждые 10000 остатков

Одна из 20 белковых молекул длиной в 500 остатков Одна из 20 белковых молекул длиной в 500 остатков будет содержать единственную ошибочную будет содержать единственную ошибочную

аминокислотуаминокислоту

Предположив что только около 10 всех ошибок Предположив что только около 10 всех ошибок серьезно сказываются на биологической функции серьезно сказываются на биологической функции

белка можно сделать заключение что одна белка можно сделать заключение что одна молекула белка из 200 синтезированных окажется молекула белка из 200 синтезированных окажется

бесполезной (или даже вредной) в клеточном бесполезной (или даже вредной) в клеточном метаболизмеметаболизме

Коррекция ошибок в реакциях катализируемых

аминоацил-тРНК- синтетазами

Существование механизмов Существование механизмов коррекции для аминоацил-коррекции для аминоацил-

тРНК-синтетазтРНК-синтетаз

Поль Наим БергПоль Наим Берг19219266 Бруклин СШАБруклин США

Американский биохимикАмериканский биохимикНобелевская премия

по химии 1980 г

Изолейцил-тРНК-синтетаза ошибочно активирует валин Добавление тРНК к комплексу с изолейциладенилатом приводит к образованию изолейцил-тРНК а у валиладенилат-ферментного комплекса не наблюдается образование валил-тРНК поскольку при добавлении тРНК происходит гидролиз ошибочного аминоациладенилата

Существование механизмов коррекции для Существование механизмов коррекции для аминоацил-тРНК-синтетазаминоацил-тРНК-синтетаз

В присутствии тРНКВ присутствии тРНКIleIle изолейцил-тРНК-синтетаза изолейцил-тРНК-синтетаза непроизводительно гидролизует АТР АМР + непроизводительно гидролизует АТР АМР + ppppii

ИзбыточныйИзбыточный гидролиз АТРгидролиз АТР по отношению к по отношению к синтезированному продукту за счет АТР-синтезированному продукту за счет АТР-пирофосфогидролазной активности синтетазы пирофосфогидролазной активности синтетазы является является критерием существования корректирующего механизмакритерием существования корректирующего механизма включающего дополнительную стадию разрушения ошибочного включающего дополнительную стадию разрушения ошибочного продукта реакции продукта реакции

У цистеинил- и тирозил-тРНК-синтетаз специфичность высокая У цистеинил- и тирозил-тРНК-синтетаз специфичность высокая и гидролиза АТР не наблюдается и гидролиза АТР не наблюдается

В некоторых случаях когда дискриминация аминокислот на В некоторых случаях когда дискриминация аминокислот на стадии активации была недостаточной наблюдался быстрый стадии активации была недостаточной наблюдался быстрый гидролиз ошибочного аминоациладенилата вместо переноса гидролиз ошибочного аминоациладенилата вместо переноса laquoнеправильнойraquo аминокислоты на субстратную тРНКlaquoнеправильнойraquo аминокислоты на субстратную тРНК

Роль тРНК в коррекцииРоль тРНК в коррекции

Индуцирует ли тРНК гидролиз аминоациладенилата или же служит акцептором ошибочно активированной аминокислоты а затем подвергается ферментативному деацилированию

Возможные последовательности реакций катализируемых синтетазами можно записать в виде следующей схемы (АК-аминокислота)

Роль тРНК в коррекцииРоль тРНК в коррекции

Предложенные механизмы коррекции можно разделить на две группы в зависимости от того какое соединение в них гидролизуется Механизм отбраковки ошибочной аминокислоты (Механизм отбраковки ошибочной аминокислоты (стадии 1

2 5 ndash гидролиз аминоацил-тРНК) Механизм коррекции за счет гидролиза промежуточного Механизм коррекции за счет гидролиза промежуточного

аминоациладенилата (аминоациладенилата (стадии 1 и 4 ndash гидролиз аминоациладенилата)

В каждом из возможных маршрутов коррекции исправление ошибки достигается благодаря введению в реакционный путь laquoнеобратимогоraquo ответвления (реакции 4 или 5) обеспечивающего гидролиз нежелательных соединений

Механизм отбраковки ошибочной аминокислотыМеханизм отбраковки ошибочной аминокислоты

Доказательство существования механизма гидролиза аминоацил-тРНК аминоацил-тРНК-синтетазами было получено при изучении аминоацилирования тРНКVal треонином катализируемого валил-тРНК-синтетазой из BStearothermophilus

Валил-тРНК-синтетаза образует с треонином стабильный комплекс Валил-тРНК-синтетаза образует с треонином стабильный комплекс который быстро гидролизуется при добавлении тРНКкоторый быстро гидролизуется при добавлении тРНКValVal

Предшествует ли гидролизу перенос аминоацильного остатка на тРНКПредшествует ли гидролизу перенос аминоацильного остатка на тРНКValVal

Импульсный метод laquoзамороженнойraquo струиКомплекс [14С]-треонил-АМРЕVal + тРНК [14С]-треонил-тРНК

Константа гидролиза треонил-тРНК в присутствии валил-тРНК-синтетазы 40 сКонстанта гидролиза треонил-тРНК в присутствии валил-тРНК-синтетазы 40 с -1-1а для специфичной валил-тРНК 0015 са для специфичной валил-тРНК 0015 с-1-1 то есть более чем в 2000 раз ниже то есть более чем в 2000 раз ниже

Механизм коррекции за счет гидролиза Механизм коррекции за счет гидролиза промежуточного аминоациладенилатапромежуточного аминоациладенилата

Ошибочное промежуточное соединение образующееся в ходе реакции диссоциирует с фермента и гиролизуется быстрее чем правильное Для правильного аминоациладенилата скорость переноса на тРНК выше чем диссоциация те коррекция определяется соотношением кинетических констант определенных стадий

Джон Джозеф ХопфилдДжон Джозеф Хопфилд1933 Чикаго США1933 Чикаго США

биофизик и биофизик и молекулярный биологмолекулярный биолог

Механизм кинетического корректированияМеханизм кинетического корректирования

Механизм коррекции за счет гидролиза Механизм коррекции за счет гидролиза промежуточного аминоациладенилатапромежуточного аминоациладенилата

Экспериментальное доказательствоЭкспериментальное доказательствоДля валил-тРНК-синтетазы из желтого люпина в отсутствие тРНК наблюдался гидролиз

АТР АМР + ppi зависящий от присутствия несубстратных аминокислот (Cys Thr Ser и α-аминомасляной кислоты)

Константа скорости гидролиза для этих кислот 07-13 мин-1 Специфический валиладенилат-ферментный комплекс гидролизуется с константой скорости 0018 мин-1 те например в 720 раз медленнее чем комплекс валил-тРНК-синтетазы с цистеинил-аденилатом

Коррекция ошибок в реакциях Коррекция ошибок в реакциях катализируемыхкатализируемых

ДНК-полимеразамиДНК-полимеразами

Механизм коррекции при репликации ДНКМеханизм коррекции при репликации ДНК

При синтезе ДНК ошибка исправляется после полимеризации Молекула ДНК синтезируется в направлении 5rsquo-3rsquo нуклеотиды присоединяются к 3rsquo-гидроксильной группе растущей цепи ДНК

Репликативные ДНК-полимеразы обладают Репликативные ДНК-полимеразы обладают корректирующей 3rsquo-5rsquo-экзонуклеазной активностью корректирующей 3rsquo-5rsquo-экзонуклеазной активностью

выщепляющей из цепи ошибочно встроенный нуклеотидвыщепляющей из цепи ошибочно встроенный нуклеотид

Частота мутации фага Т4 коррелирует с экзонуклеазной активностью проявляемой ДНК-полимеразой Частота мутации для ЕСoli составляет 10-6-10-8 и следовательно точность репликации ДНК либо равна этим величинам либо еще выше

Механизм коррекции при репликации ДНКМеханизм коррекции при репликации ДНК

С помощью экзонуклеазной активности исправляются ошибки которые накапливаются в процессе биосинтеза Однако нарушения структуры ДНК могут возникать не только по причине неточной работы в ходе синтеза но и в результате внешних воздействий таких как ионизирующее и ультрафиолетовое облучение окислительный стресс

Возможна различная пострепликационная коррекция структуры ДНКВозможна различная пострепликационная коррекция структуры ДНК(репарация)(репарация)

Система репарации ошибочно-встроенных нуклеотидов (Система репарации ошибочно-встроенных нуклеотидов (mismatch mismatch repairrepair) специально предназначена для удаления ошибок возникших в ) специально предназначена для удаления ошибок возникших в ДНК в ходе репликацииДНК в ходе репликации

Система эксцизионной репарации оснований исправляет повреждения в Система эксцизионной репарации оснований исправляет повреждения в ДНК возникающие в результате окислительного стресса то есть ДНК возникающие в результате окислительного стресса то есть модифицированные (окисленные) основания и разрывы в одной из цепей модифицированные (окисленные) основания и разрывы в одной из цепей ДНКДНК

Система эксцизионной репарации нуклеотидов удаляет из ДНК объемные Система эксцизионной репарации нуклеотидов удаляет из ДНК объемные повреждения фотодимеры возникающие под действием повреждения фотодимеры возникающие под действием ультрафиолетового облучения объемные аддукты метаболитов ультрафиолетового облучения объемные аддукты метаболитов попадающих из окружающей среды таких как продукты сгорания курения попадающих из окружающей среды таких как продукты сгорания курения например антрацены и бензапиренынапример антрацены и бензапирены

Синтез ДНК через повреждениеСинтез ДНК через повреждение((Translesion synthesisTranslesion synthesis ndash TLS)ndash TLS)

В случае синтеза с использованием поврежденной ДНК-матрицы транслезионными (translesion) ДНК-полимеразами (например η ι κ θ μ ζ) также возникают искажения в структуре ДНК

TLS ДНК-полимеразы ведущие синтез через повреждение матрицы не обладают корректирующей активностью поскольку их задачей является ввести во чтобы то ни стало нуклеотидное звено дабы избежать остановки репликативной вилки на повреждении матрицы Затем поврежденный участок ДНК восстанавливается системами репарации

Мутации вводимые репликативными Мутации вводимые репликативными ДНК-полимеразами в ходе репликативного синтеза ДНК-полимеразами в ходе репликативного синтеза

играют не только вредную рольиграют не только вредную роль Мутации в ДНК являются движущей Мутации в ДНК являются движущей

силой эволюциисилой эволюции

• Slide 1
• Slide 2
• Slide 3
• Slide 4
• Slide 5
• Slide 6
• Slide 7
• Slide 8
• Slide 9
• Slide 10
• Slide 11
• Slide 12
• Slide 13
• Slide 14
• Slide 15
• Slide 16
• Slide 17
• Slide 18
• Slide 19
• Slide 20
• Slide 21
• Slide 22
• Slide 23
• Slide 24
• Slide 25
• Slide 26
• Slide 27
• Slide 28
• Slide 29
• Slide 30
• Slide 31
• Slide 32
• Slide 33
• Slide 34
• Slide 35
• Slide 36
• Slide 37
• Slide 38
• Slide 39
• Slide 40
• Slide 41

11 Механизмы специфического отбора 11 Механизмы специфического отбора

субстратов субстратов

Коррекция ошибок в реакциях катализируемых Коррекция ошибок в реакциях катализируемых аминоацил-тРНК-синтетазами и аминоацил-тРНК-синтетазами и

ДНК-полимеразамиДНК-полимеразами

Что происходит в ходе Что происходит в ходе ферментативной реакцииферментативной реакции

Связывание субстрата с активным центром происходит за счет достаточно слабых взаимодействий (электростатических контактов гидрофобного связывания водородных связей) Если взаимодействие многоточечное то расположение активных группировок в молекуле субстрата должно точно соответствовать расположению активных групп в молекуле фермента Если эти группировки расположены так что необходимые контакты не формируются то это влияет на величину Kd=k-1k1 Возможно влияние на величину KM

Каталитические группы активного центра должны также быть ориентированы необходимым для катализа образом В противном случае смещение электронов будет неэффективным что приводит к понижению величины kcat

Специфичность ферментов в отношении превращаемых Специфичность ферментов в отношении превращаемых субстратов ndash важнейшая особенность ферментативных реакцийсубстратов ndash важнейшая особенность ферментативных реакций

Некоторые из ферментов обладают Некоторые из ферментов обладают очень широкой очень широкой специфичностьюспецифичностью (например щелочная фосфатаза) (например щелочная фосфатаза)

Другой крайний случай ndash Другой крайний случай ndash строгая стереоспецифичностьстрогая стереоспецифичность ndash Дрожжи содержат два определенных фермента ndash Дрожжи содержат два определенных фермента LL-лактат -лактат и и DD-лактатдегидрогеназу -лактатдегидрогеназу ndash ndash Аминоацил-тРНК-синтетазы проявляют высокую Аминоацил-тРНК-синтетазы проявляют высокую стереоспецифичность стереоспецифичность DD-аминокислоты не являются -аминокислоты не являются субстратами за исключением субстратами за исключением DD-тирозина Возможно -тирозина Возможно образование образование DD-тирозил-тРНК и по этой причине для -тирозил-тРНК и по этой причине для гидролиза нежелательного продукта существует фермент гидролиза нежелательного продукта существует фермент DD-тирозил-гидроксилаза-тирозил-гидроксилаза

Ферменты снижают энергию активации Ферменты снижают энергию активации катализируемой реакциикатализируемой реакции

ДжБС Холдейн 1930 гlaquoЭнергия связывания субстрата Энергия связывания субстрата используется для деформации используется для деформации субстрата до структуры продуктасубстрата до структуры продуктаraquoВ теории переходного состояния не учитываются процессы столкновения реагентов Теория рассматривает сами реагенты (основное состояние) и наиболее нестабильные соединения которые образуются в ходе реакции (переходное состояние) Переходному состоянию соответствует максимум на кривой изменения энергии реагентов вдоль координаты реакцииДжон Бердон СандерсонДжон Бердон Сандерсон

ХолдейнХолдейн1892 1892 Оксфорд Англия ndash 19Оксфорд Англия ndash 196464 Индия Индия

Английский биолог и философАнглийский биолог и философ

График изменения энергии Гиббса График изменения энергии Гиббса в ходе реакциив ходе реакции

Состояние 1 ndash переходное состояние (ESne) Состояние 2 ndash промежуточное состояние

В переходном состоянии химические связи непрерывно образуются и разрываются Соединениям со стабильными химическими связями соответствуют минимумы на графике Допущение о существовании термодинамического равновесия между основным и переходным состоянием используется для расчета скорости реакции В этом случае концентрацию переходного состояния можно рассчитать из разности энергии этих состояний Общую скорость реакции получают умножением концентрации переходного комплекса и константы скорости его распада

Для мономолекулярной реакцииРазность энергий Гиббса для переходного (Хne) и основного (Х) состояний равна ∆Gne Воспользуемся известным соотношением равновесной термодинамики∆Gne = -RT lnK [Хne]=[X]exp(-∆GneRT)

Частота распада переходного комплекса = частота колебаний разрываемой связиЧастота распада переходного комплекса = частота колебаний разрываемой связи

Частота получена из равенства энергий возбужденного осциллятора рассчитанных на основе квантовой теории (E=hω) и классической физики (Е=kT) где h ndash постоянная Планка ω ndash частота колебаний k ndash постоянная Больцмана ωω==kTkThh Скорость распада молекул Х определяется уравнением

exp(-∆GneRT)

Константа скорости первого порядка для распада молекул Х равна

k1= exp(-∆GneRT)

Энергия активации Гиббса ∆Gne может быть подразделена на энтальпийную и энтропийную составляющие ∆Gne =∆Нne -Т∆Sne

k1= exp(-∆HneRT) exp(∆SneR)

h

kT]X[]X[

dt

d[X]

h

kT

h

kT

Применение теории переходного состояния для Применение теории переходного состояния для анализа механизмов ферментативного катализаанализа механизмов ферментативного катализа

В случае простого механизма Михаэлиса-Ментен (КВ случае простого механизма Михаэлиса-Ментен (КSS=К=КMM) ) энергия связывания уменьшает энергию активации перехода энергия связывания уменьшает энергию активации перехода определяемого кажущейся константой скорости второго определяемого кажущейся константой скорости второго порядка порядка kkcatcatKKMMСмысл параметра kcatKM где kcat - число оборотов реакции поскольку эта величина определяет максимальное число молекул субстрата превращаемых в продукт одним активным центром в единицу времениndash KM в простейшем варианте можно рассматривать как кажущуюся константу диссоциации v=kcat[E](1+KM[S]) ndash При малых концентрациях субстрата v=kcatKM[E][S] то есть kcatKM представляет собой кажущуюся константу скорости второго порядка Ценность параметра kcatKM в том что он связывает скорость реакций с концентрацией свободного фермента а не с его общей концентрацией Это справедливо для низкой концентрации субстрата тк при [Е]asymp[Е0]

KM=KD= [ES]

]S][E[

RTln(kcatKM)=RTln(kTH) - ∆Gne-∆GS

Константа скорости для взаимодействия свободного фермента со свободным субстратом с образованием продуктов равна kcatKM В терминах теории переходного состояния константа равновесия для второй реакции пропорциональна энергии активации ∆GТ

ne

k1= exp(-∆GneRT)h

kT

∆GТne=∆Gne+∆GS

∆Gne ndash положительная величина отражающая энергию активации химических стадий в ходе которых происходит образование и разрыв связей ∆GS - отрицательная величина отражающая использование энергии связывания

Изменение энергии Гиббса для реакцииИзменение энергии Гиббса для реакции

E + S ES продукты

∆Gne ndash положительная величина отражающая образование и разрыв связей ∆GS - отрицательная величина отражающая использование энергии связывания

Фермент и субстрат Фермент и субстрат комплементарныкомплементарны когда каждая взаимодействующая группа когда каждая взаимодействующая группа

субстрата контактирует с субстрата контактирует с соответствующим центром связывания соответствующим центром связывания

фермента и энергия связывания фермента и энергия связывания принимает максимальное значениепринимает максимальное значение

Комплементарность фермента исходному Комплементарность фермента исходному субстратусубстрату

Допустим максимальная внутренняя свободная энергия связывания равна ∆Gb В рассмотренном случае она реализуется в исходном фермент-субстратном комплексе обеспечивая прочное связывание КM - константа диссоциации фермент-субстратного комплекса ndash будет мала Образование переходного состояния будет сопровождаться изменением геометрии субстрата и ухудшением его соответствия что приведет к уменьшению энергии связывания ∆GR ndash увеличение свободной энергии вызванное ухудшением структурного соответствия между ферментом и субстратом ∆G0 ndash свободная энергия активации для образования и разрыва химических связей на стадии определяемой константой kcatНаблюдаемая свободная энергия активации для стадии химического превращения субстрата с константой скорости kcat равна∆Gne=∆G0

ne+∆GR и∆GS=∆Gb

Энергия активации Гиббса для процесса

∆GТne=∆G0

ne+∆GR+∆Gb

Пунктирная линия ndash фермент структурно комплементарен субстрату сплошная ndash переходному состоянию (∆GS = ∆Gb - отрицательная величина ∆G0 и ∆GR ndash положительны)

График изменения энергии ГиббсаГрафик изменения энергии Гиббса

E + S ES продукты

Полная энергия связывания ∆Gb реализуется в переходном состоянии Исходному фермент-субстратному комплексу соответствует положительный член ∆GR который отражает возрастание энергии за счет структурного несоответствия исходного состояния переходному Этот член увеличивает КМ а прирост энергии связывания по мере приближения к переходному состоянию увеличивает kcat∆Gne = ∆G0

ne - ∆GR

∆GS = ∆Gb + ∆GR

Энергия активации Гиббса для перехода характеризующегося константой kcatKM

∆GТne=∆G ne + ∆GS = ∆G0

ne + ∆Gb

∆GR из конечного уравнения исключается

Когда фермент комплементарен переходному состоянию субстрата а не самому субстрату kcatKM возрастает в exp(∆GRRT) раз kcatKM не зависит от взаимодействий в исходном фермент-субстратном комплексе поскольку член ∆GR не входит в уравнение

Комплементарность фермента переходному Комплементарность фермента переходному состоянию субстратасостоянию субстрата

Наличие сильного связывания фермента с субстратом или Наличие сильного связывания фермента с субстратом или низкое значение Книзкое значение КМ М не является необходимым условием не является необходимым условием

протекания ферментативной реакции Для катализа важны протекания ферментативной реакции Для катализа важны высокие значения Квысокие значения КММ

Процесс эволюции ферментов направленный на увеличение Процесс эволюции ферментов направленный на увеличение скорости катализируемых ими реакций можно разделить на два скорости катализируемых ими реакций можно разделить на два этапаэтапа

11 Увеличение Увеличение kkcatcatKKMM за счет повышения комплементарности фермента за счет повышения комплементарности фермента переходному состоянию субстратапереходному состоянию субстрата

22 Увеличение концентрации фермента за счет повышения КУвеличение концентрации фермента за счет повышения КММ направленное на то чтобы в свободном состоянии находилось направленное на то чтобы в свободном состоянии находилось максимально возможное количество ферментамаксимально возможное количество фермента

Исключение ndash ферменты которые выполняют регуляторные функцииИх активность регулируется путем изменения КМ субстратов через

аллостерическое воздействие

Модель laquoключ-замокraquoМодель laquoключ-замокraquo

Теория комплементарности при фермент-субстратном взаимодействии принадлежит Э Фишеру воплотившему ее в модели laquoключ-замокraquo В 1890 г Э Фишер предложил модель согласно которой специфичность ферментов определяется точным соответствием формы фермента и субстрата Однако хотя эта модель объясняла высокую специфичность ферментов она не объясняла явления стабилизации переходного состояния которое наблюдается на практике

Герман Эмиль ФишерГерман Эмиль Фишер1852 Ойскирхен ndash 1919 Берлин1852 Ойскирхен ndash 1919 Берлин

Немецкий химик-органик и Немецкий химик-органик и биохимикбиохимик

Нобелевская премияпо химии 1902 г

Концепция деформацииКонцепция деформации(ДжБС Холдейн и Л Полинг)(ДжБС Холдейн и Л Полинг)

Активный центр фермента структурно комплементарен не самому субстрату а переходному состоянию При связывании с ферментом переходное состояние субстрата взаимодействует с ферментом более эффективно чем сам субстрат и поэтому полная энергия связывания не реализуется до тех пор пока не сформируется переходное состояние

Лайнус Карл ПолингЛайнус Карл Полинг1901 Портленд ndash 1994 Биг-Сюр1901 Портленд ndash 1994 Биг-Сюр

американский химикамериканский химикНобелевская премия

по химии 1954 г и мира 1962 г

Теория индуцированного Теория индуцированного соответствиясоответствия

Объясняет отсутствие ферментативной активности с небольшими субстратами такими как вода в которых нет групп способных обеспечить связывание и энергию для приведения фермента в активное состояние Является модификацией модели laquoключ-замокraquo - модель laquoрука-перчаткаraquo Предполагается что в отсутствии субстрата фермент структурно некомплементарен переходному состоянию Однако поскольку молекула фермента довольно гибкая а субстрат имеет жесткую структуру при образовании фермент-субстратного комплекса каталитические группы на ферменте ориентируются оптимальным для катализа образом фермент становится комплементарным переходному состоянию только после связывания субстрата Перестройка области активного центра при связывании с субстратом названа процессом конформационной адаптации

Дэниэл Эдвард КошландДэниэл Эдвард Кошланд1920 Нью-Йорк ndash 1919 Калифорния1920 Нью-Йорк ndash 1919 Калифорния

американский биохимикамериканский биохимик

Гипотеза непродуктивного связыванияГипотеза непродуктивного связывания

Было предложено что помимо продуктивного связывания в активном центре возможны другие способы связывания когда небольшие субстраты связываются но не подвергаются каталитическому превращению

Например в молекуле лизоцима активный центр имеет протяженную структуру состоящую из шести центров связывания ndash A B C D E F Для осуществления реакции необходимо чтобы молекула субстрата заняла центры D и Е Небольшие субстраты способны присоединяться с любой сторону вдоль вытянутого активного центра лизоцима не связываясь с подцентром где происходит расщепление

ДеформацияДеформация вносит положительный вклад в катализ вносит положительный вклад в катализ при условии комплементарности фермента при условии комплементарности фермента переходному состоянию субстрата увеличивая переходному состоянию субстрата увеличивая kkcatcat и и KKMM что приводит к увеличению скорости реакции что приводит к увеличению скорости реакции

ИндуцированноеИндуцированное соответствиесоответствие уменьшает уменьшает эффективность катализа увеличивая эффективность катализа увеличивая KKMM без без соответствующего увеличения соответствующего увеличения kkcatcat по сравнению с по сравнению с ферментом находящимся в кативной форме в ферментом находящимся в кативной форме в отсутствие субстрата отсутствие субстрата

Механизм непродуктивного связыванияМеханизм непродуктивного связывания не не затрагивает каталитического превращения затрагивает каталитического превращения специфических субстратов однако он приводит к специфических субстратов однако он приводит к появлению дополнительных связывающих центров для появлению дополнительных связывающих центров для конкурирующих между собой неспецифических конкурирующих между собой неспецифических субстратовсубстратов

Специфичность ферментаСпецифичность фермента

Способность фермента узнавать Способность фермента узнавать определенный субстрат из нескольких определенный субстрат из нескольких

конкурирующих за активный центрконкурирующих за активный центр

Функция слагающаяся из прочности связывания Функция слагающаяся из прочности связывания

каждого из субстратов и кинетической каждого из субстратов и кинетической

(каталитической) специфичности (каталитической) специфичности

характеризующейся скоростью катализахарактеризующейся скоростью катализа

laquoСуммарнаяraquo специфичность характеризуется laquoСуммарнаяraquo специфичность характеризуется

отношением отношением kkcatcatKKMM

Специфичность и относительная Специфичность и относительная реакционная способностьреакционная способность

Центральная проблема специфичности Центральная проблема специфичности каким образом фермент отличает специфический каким образом фермент отличает специфический субстрат от другого меньшего или равного ему по субстрат от другого меньшего или равного ему по размерам (изостерического) субстратаразмерам (изостерического) субстрата

Такую задачу постоянно решают аминоацил-тРНК-синтетазы Если синтетаза (ЕХ) ошибочно активирует чужую аминокислоту (Y) и далее катализирует ее перенос на laquoсвоюraquo тРНКХ

или если она ошибочно этерифицирует истинной субстратной аминокислотой Х чужую тРНК

то каждое из этих событий приведет к ошибке в последовательности синтезируемой полипептидной цепи

Дискриминация аминокислот меньших или изостеричных (равных по размеру) специфическому субстрату способных разместиться в активном центре фермента определяется предпочтительным связыванием истинного субстрата за счет незначительных различий в структуре

Валил-тРНК-синтетаза

Наличие разницы в энергии связывания не до конца обеспечивает Наличие разницы в энергии связывания не до конца обеспечивает в этих случаях точность работы системы аминоацилированияв этих случаях точность работы системы аминоацилирования

валин

Изолейцил-тРНК-синтетаза

изолейцин валин треонин

Треонин связывается с валил-тРНК синтетазой в 100-200 раз слабее валина несмотря на то что он изостеричен валину поскольку в гидрофобный карман погружается гидроксильная группа вместо метиленовой Энергия активации реакции представляет собой сумму двух составляющих одна из них ndash энергия активации для стадии химического превращения а вторая ndash энергия связывания фермента с субстратом

Валил-тРНК-синтетаза

валин треонин

Различие в энергии связывания специфичного субстрата (Различие в энергии связывания специфичного субстрата (RSRS) и ) и меньшего по размерам конкурирующего соединения меньшего по размерам конкурирующего соединения HSHS равно равно дополнительной энергии связывания группы дополнительной энергии связывания группы RR имеющейся у имеющейся у специфичного субстрата и отсутствующей у меньшего специфичного субстрата и отсутствующей у меньшего субстрата по отношению к водороду субстрата по отношению к водороду

Поскольку энергия взаимодействия группы R не только входит в энергию связывания но и понижает энергию активации стадии химического превращения вклад заместителя R следует оценивать из сравнения параметров kcatKM для двух субстратов RS и HS Например если величину kcat для валина для активации валил-тРНК-синтетазой принять за 1 то для других аминокислот эта величина будет для аланина 003 для изолейцина 00019 для серина 005

Дополнительную энергию связывания группы Дополнительную энергию связывания группы RR по отношению к по отношению к водороду можно определить по формулеводороду можно определить по формуле

∆Gb=RTln(kcatKM)RS ln(kcatKM)HS

Для пары изолейцил-тРНК-синтетаза-валин неспецифический субстрат по критерию kcatKM хуже в 140-200 раз В клетках EColi [Ile][Val] = 018 Уровень ошибок изолейцил-тРНК-синтетазы на стадии активации 003-004 Экспериментально обнаружено уровень ошибок при замене Ile на Val в биосинтезе овальбумина цыпленка и гемоглобина кролика равен 310-4

Изолейцил-тРНК-синтетаза

изолейцин валин

Чему соответствует этот уровень ошибокЧему соответствует этот уровень ошибок

Ошибочное включение одной аминокислоты на Ошибочное включение одной аминокислоты на каждые 10000 остатковкаждые 10000 остатков

Одна из 20 белковых молекул длиной в 500 остатков Одна из 20 белковых молекул длиной в 500 остатков будет содержать единственную ошибочную будет содержать единственную ошибочную

аминокислотуаминокислоту

Предположив что только около 10 всех ошибок Предположив что только около 10 всех ошибок серьезно сказываются на биологической функции серьезно сказываются на биологической функции

белка можно сделать заключение что одна белка можно сделать заключение что одна молекула белка из 200 синтезированных окажется молекула белка из 200 синтезированных окажется

бесполезной (или даже вредной) в клеточном бесполезной (или даже вредной) в клеточном метаболизмеметаболизме

Коррекция ошибок в реакциях катализируемых

аминоацил-тРНК- синтетазами

Существование механизмов Существование механизмов коррекции для аминоацил-коррекции для аминоацил-

тРНК-синтетазтРНК-синтетаз

Поль Наим БергПоль Наим Берг19219266 Бруклин СШАБруклин США

Американский биохимикАмериканский биохимикНобелевская премия

по химии 1980 г

Изолейцил-тРНК-синтетаза ошибочно активирует валин Добавление тРНК к комплексу с изолейциладенилатом приводит к образованию изолейцил-тРНК а у валиладенилат-ферментного комплекса не наблюдается образование валил-тРНК поскольку при добавлении тРНК происходит гидролиз ошибочного аминоациладенилата

Существование механизмов коррекции для Существование механизмов коррекции для аминоацил-тРНК-синтетазаминоацил-тРНК-синтетаз

В присутствии тРНКВ присутствии тРНКIleIle изолейцил-тРНК-синтетаза изолейцил-тРНК-синтетаза непроизводительно гидролизует АТР АМР + непроизводительно гидролизует АТР АМР + ppppii

ИзбыточныйИзбыточный гидролиз АТРгидролиз АТР по отношению к по отношению к синтезированному продукту за счет АТР-синтезированному продукту за счет АТР-пирофосфогидролазной активности синтетазы пирофосфогидролазной активности синтетазы является является критерием существования корректирующего механизмакритерием существования корректирующего механизма включающего дополнительную стадию разрушения ошибочного включающего дополнительную стадию разрушения ошибочного продукта реакции продукта реакции

У цистеинил- и тирозил-тРНК-синтетаз специфичность высокая У цистеинил- и тирозил-тРНК-синтетаз специфичность высокая и гидролиза АТР не наблюдается и гидролиза АТР не наблюдается

В некоторых случаях когда дискриминация аминокислот на В некоторых случаях когда дискриминация аминокислот на стадии активации была недостаточной наблюдался быстрый стадии активации была недостаточной наблюдался быстрый гидролиз ошибочного аминоациладенилата вместо переноса гидролиз ошибочного аминоациладенилата вместо переноса laquoнеправильнойraquo аминокислоты на субстратную тРНКlaquoнеправильнойraquo аминокислоты на субстратную тРНК

Роль тРНК в коррекцииРоль тРНК в коррекции

Индуцирует ли тРНК гидролиз аминоациладенилата или же служит акцептором ошибочно активированной аминокислоты а затем подвергается ферментативному деацилированию

Возможные последовательности реакций катализируемых синтетазами можно записать в виде следующей схемы (АК-аминокислота)

Роль тРНК в коррекцииРоль тРНК в коррекции

Предложенные механизмы коррекции можно разделить на две группы в зависимости от того какое соединение в них гидролизуется Механизм отбраковки ошибочной аминокислоты (Механизм отбраковки ошибочной аминокислоты (стадии 1

2 5 ndash гидролиз аминоацил-тРНК) Механизм коррекции за счет гидролиза промежуточного Механизм коррекции за счет гидролиза промежуточного

аминоациладенилата (аминоациладенилата (стадии 1 и 4 ndash гидролиз аминоациладенилата)

В каждом из возможных маршрутов коррекции исправление ошибки достигается благодаря введению в реакционный путь laquoнеобратимогоraquo ответвления (реакции 4 или 5) обеспечивающего гидролиз нежелательных соединений

Механизм отбраковки ошибочной аминокислотыМеханизм отбраковки ошибочной аминокислоты

Доказательство существования механизма гидролиза аминоацил-тРНК аминоацил-тРНК-синтетазами было получено при изучении аминоацилирования тРНКVal треонином катализируемого валил-тРНК-синтетазой из BStearothermophilus

Валил-тРНК-синтетаза образует с треонином стабильный комплекс Валил-тРНК-синтетаза образует с треонином стабильный комплекс который быстро гидролизуется при добавлении тРНКкоторый быстро гидролизуется при добавлении тРНКValVal

Предшествует ли гидролизу перенос аминоацильного остатка на тРНКПредшествует ли гидролизу перенос аминоацильного остатка на тРНКValVal

Импульсный метод laquoзамороженнойraquo струиКомплекс [14С]-треонил-АМРЕVal + тРНК [14С]-треонил-тРНК

Константа гидролиза треонил-тРНК в присутствии валил-тРНК-синтетазы 40 сКонстанта гидролиза треонил-тРНК в присутствии валил-тРНК-синтетазы 40 с -1-1а для специфичной валил-тРНК 0015 са для специфичной валил-тРНК 0015 с-1-1 то есть более чем в 2000 раз ниже то есть более чем в 2000 раз ниже

Механизм коррекции за счет гидролиза Механизм коррекции за счет гидролиза промежуточного аминоациладенилатапромежуточного аминоациладенилата

Ошибочное промежуточное соединение образующееся в ходе реакции диссоциирует с фермента и гиролизуется быстрее чем правильное Для правильного аминоациладенилата скорость переноса на тРНК выше чем диссоциация те коррекция определяется соотношением кинетических констант определенных стадий

Джон Джозеф ХопфилдДжон Джозеф Хопфилд1933 Чикаго США1933 Чикаго США

биофизик и биофизик и молекулярный биологмолекулярный биолог

Механизм кинетического корректированияМеханизм кинетического корректирования

Механизм коррекции за счет гидролиза Механизм коррекции за счет гидролиза промежуточного аминоациладенилатапромежуточного аминоациладенилата

Экспериментальное доказательствоЭкспериментальное доказательствоДля валил-тРНК-синтетазы из желтого люпина в отсутствие тРНК наблюдался гидролиз

АТР АМР + ppi зависящий от присутствия несубстратных аминокислот (Cys Thr Ser и α-аминомасляной кислоты)

Константа скорости гидролиза для этих кислот 07-13 мин-1 Специфический валиладенилат-ферментный комплекс гидролизуется с константой скорости 0018 мин-1 те например в 720 раз медленнее чем комплекс валил-тРНК-синтетазы с цистеинил-аденилатом

Коррекция ошибок в реакциях Коррекция ошибок в реакциях катализируемыхкатализируемых

ДНК-полимеразамиДНК-полимеразами

Механизм коррекции при репликации ДНКМеханизм коррекции при репликации ДНК

При синтезе ДНК ошибка исправляется после полимеризации Молекула ДНК синтезируется в направлении 5rsquo-3rsquo нуклеотиды присоединяются к 3rsquo-гидроксильной группе растущей цепи ДНК

Репликативные ДНК-полимеразы обладают Репликативные ДНК-полимеразы обладают корректирующей 3rsquo-5rsquo-экзонуклеазной активностью корректирующей 3rsquo-5rsquo-экзонуклеазной активностью

выщепляющей из цепи ошибочно встроенный нуклеотидвыщепляющей из цепи ошибочно встроенный нуклеотид

Частота мутации фага Т4 коррелирует с экзонуклеазной активностью проявляемой ДНК-полимеразой Частота мутации для ЕСoli составляет 10-6-10-8 и следовательно точность репликации ДНК либо равна этим величинам либо еще выше

Механизм коррекции при репликации ДНКМеханизм коррекции при репликации ДНК

С помощью экзонуклеазной активности исправляются ошибки которые накапливаются в процессе биосинтеза Однако нарушения структуры ДНК могут возникать не только по причине неточной работы в ходе синтеза но и в результате внешних воздействий таких как ионизирующее и ультрафиолетовое облучение окислительный стресс

Возможна различная пострепликационная коррекция структуры ДНКВозможна различная пострепликационная коррекция структуры ДНК(репарация)(репарация)

Система репарации ошибочно-встроенных нуклеотидов (Система репарации ошибочно-встроенных нуклеотидов (mismatch mismatch repairrepair) специально предназначена для удаления ошибок возникших в ) специально предназначена для удаления ошибок возникших в ДНК в ходе репликацииДНК в ходе репликации

Система эксцизионной репарации оснований исправляет повреждения в Система эксцизионной репарации оснований исправляет повреждения в ДНК возникающие в результате окислительного стресса то есть ДНК возникающие в результате окислительного стресса то есть модифицированные (окисленные) основания и разрывы в одной из цепей модифицированные (окисленные) основания и разрывы в одной из цепей ДНКДНК

Система эксцизионной репарации нуклеотидов удаляет из ДНК объемные Система эксцизионной репарации нуклеотидов удаляет из ДНК объемные повреждения фотодимеры возникающие под действием повреждения фотодимеры возникающие под действием ультрафиолетового облучения объемные аддукты метаболитов ультрафиолетового облучения объемные аддукты метаболитов попадающих из окружающей среды таких как продукты сгорания курения попадающих из окружающей среды таких как продукты сгорания курения например антрацены и бензапиренынапример антрацены и бензапирены

Синтез ДНК через повреждениеСинтез ДНК через повреждение((Translesion synthesisTranslesion synthesis ndash TLS)ndash TLS)

В случае синтеза с использованием поврежденной ДНК-матрицы транслезионными (translesion) ДНК-полимеразами (например η ι κ θ μ ζ) также возникают искажения в структуре ДНК

TLS ДНК-полимеразы ведущие синтез через повреждение матрицы не обладают корректирующей активностью поскольку их задачей является ввести во чтобы то ни стало нуклеотидное звено дабы избежать остановки репликативной вилки на повреждении матрицы Затем поврежденный участок ДНК восстанавливается системами репарации

Мутации вводимые репликативными Мутации вводимые репликативными ДНК-полимеразами в ходе репликативного синтеза ДНК-полимеразами в ходе репликативного синтеза

играют не только вредную рольиграют не только вредную роль Мутации в ДНК являются движущей Мутации в ДНК являются движущей

силой эволюциисилой эволюции

• Slide 1
• Slide 2
• Slide 3
• Slide 4
• Slide 5
• Slide 6
• Slide 7
• Slide 8
• Slide 9
• Slide 10
• Slide 11
• Slide 12
• Slide 13
• Slide 14
• Slide 15
• Slide 16
• Slide 17
• Slide 18
• Slide 19
• Slide 20
• Slide 21
• Slide 22
• Slide 23
• Slide 24
• Slide 25
• Slide 26
• Slide 27
• Slide 28
• Slide 29
• Slide 30
• Slide 31
• Slide 32
• Slide 33
• Slide 34
• Slide 35
• Slide 36
• Slide 37
• Slide 38
• Slide 39
• Slide 40
• Slide 41

Что происходит в ходе Что происходит в ходе ферментативной реакцииферментативной реакции

Связывание субстрата с активным центром происходит за счет достаточно слабых взаимодействий (электростатических контактов гидрофобного связывания водородных связей) Если взаимодействие многоточечное то расположение активных группировок в молекуле субстрата должно точно соответствовать расположению активных групп в молекуле фермента Если эти группировки расположены так что необходимые контакты не формируются то это влияет на величину Kd=k-1k1 Возможно влияние на величину KM

Каталитические группы активного центра должны также быть ориентированы необходимым для катализа образом В противном случае смещение электронов будет неэффективным что приводит к понижению величины kcat

Специфичность ферментов в отношении превращаемых Специфичность ферментов в отношении превращаемых субстратов ndash важнейшая особенность ферментативных реакцийсубстратов ndash важнейшая особенность ферментативных реакций

Некоторые из ферментов обладают Некоторые из ферментов обладают очень широкой очень широкой специфичностьюспецифичностью (например щелочная фосфатаза) (например щелочная фосфатаза)

Другой крайний случай ndash Другой крайний случай ndash строгая стереоспецифичностьстрогая стереоспецифичность ndash Дрожжи содержат два определенных фермента ndash Дрожжи содержат два определенных фермента LL-лактат -лактат и и DD-лактатдегидрогеназу -лактатдегидрогеназу ndash ndash Аминоацил-тРНК-синтетазы проявляют высокую Аминоацил-тРНК-синтетазы проявляют высокую стереоспецифичность стереоспецифичность DD-аминокислоты не являются -аминокислоты не являются субстратами за исключением субстратами за исключением DD-тирозина Возможно -тирозина Возможно образование образование DD-тирозил-тРНК и по этой причине для -тирозил-тРНК и по этой причине для гидролиза нежелательного продукта существует фермент гидролиза нежелательного продукта существует фермент DD-тирозил-гидроксилаза-тирозил-гидроксилаза

Ферменты снижают энергию активации Ферменты снижают энергию активации катализируемой реакциикатализируемой реакции

ДжБС Холдейн 1930 гlaquoЭнергия связывания субстрата Энергия связывания субстрата используется для деформации используется для деформации субстрата до структуры продуктасубстрата до структуры продуктаraquoВ теории переходного состояния не учитываются процессы столкновения реагентов Теория рассматривает сами реагенты (основное состояние) и наиболее нестабильные соединения которые образуются в ходе реакции (переходное состояние) Переходному состоянию соответствует максимум на кривой изменения энергии реагентов вдоль координаты реакцииДжон Бердон СандерсонДжон Бердон Сандерсон

ХолдейнХолдейн1892 1892 Оксфорд Англия ndash 19Оксфорд Англия ndash 196464 Индия Индия

Английский биолог и философАнглийский биолог и философ

График изменения энергии Гиббса График изменения энергии Гиббса в ходе реакциив ходе реакции

Состояние 1 ndash переходное состояние (ESne) Состояние 2 ndash промежуточное состояние

В переходном состоянии химические связи непрерывно образуются и разрываются Соединениям со стабильными химическими связями соответствуют минимумы на графике Допущение о существовании термодинамического равновесия между основным и переходным состоянием используется для расчета скорости реакции В этом случае концентрацию переходного состояния можно рассчитать из разности энергии этих состояний Общую скорость реакции получают умножением концентрации переходного комплекса и константы скорости его распада

Для мономолекулярной реакцииРазность энергий Гиббса для переходного (Хne) и основного (Х) состояний равна ∆Gne Воспользуемся известным соотношением равновесной термодинамики∆Gne = -RT lnK [Хne]=[X]exp(-∆GneRT)

Частота распада переходного комплекса = частота колебаний разрываемой связиЧастота распада переходного комплекса = частота колебаний разрываемой связи

Частота получена из равенства энергий возбужденного осциллятора рассчитанных на основе квантовой теории (E=hω) и классической физики (Е=kT) где h ndash постоянная Планка ω ndash частота колебаний k ndash постоянная Больцмана ωω==kTkThh Скорость распада молекул Х определяется уравнением

exp(-∆GneRT)

Константа скорости первого порядка для распада молекул Х равна

k1= exp(-∆GneRT)

Энергия активации Гиббса ∆Gne может быть подразделена на энтальпийную и энтропийную составляющие ∆Gne =∆Нne -Т∆Sne

k1= exp(-∆HneRT) exp(∆SneR)

h

kT]X[]X[

dt

d[X]

h

kT

h

kT

Применение теории переходного состояния для Применение теории переходного состояния для анализа механизмов ферментативного катализаанализа механизмов ферментативного катализа

В случае простого механизма Михаэлиса-Ментен (КВ случае простого механизма Михаэлиса-Ментен (КSS=К=КMM) ) энергия связывания уменьшает энергию активации перехода энергия связывания уменьшает энергию активации перехода определяемого кажущейся константой скорости второго определяемого кажущейся константой скорости второго порядка порядка kkcatcatKKMMСмысл параметра kcatKM где kcat - число оборотов реакции поскольку эта величина определяет максимальное число молекул субстрата превращаемых в продукт одним активным центром в единицу времениndash KM в простейшем варианте можно рассматривать как кажущуюся константу диссоциации v=kcat[E](1+KM[S]) ndash При малых концентрациях субстрата v=kcatKM[E][S] то есть kcatKM представляет собой кажущуюся константу скорости второго порядка Ценность параметра kcatKM в том что он связывает скорость реакций с концентрацией свободного фермента а не с его общей концентрацией Это справедливо для низкой концентрации субстрата тк при [Е]asymp[Е0]

KM=KD= [ES]

]S][E[

RTln(kcatKM)=RTln(kTH) - ∆Gne-∆GS

Константа скорости для взаимодействия свободного фермента со свободным субстратом с образованием продуктов равна kcatKM В терминах теории переходного состояния константа равновесия для второй реакции пропорциональна энергии активации ∆GТ

ne

k1= exp(-∆GneRT)h

kT

∆GТne=∆Gne+∆GS

∆Gne ndash положительная величина отражающая энергию активации химических стадий в ходе которых происходит образование и разрыв связей ∆GS - отрицательная величина отражающая использование энергии связывания

Изменение энергии Гиббса для реакцииИзменение энергии Гиббса для реакции

E + S ES продукты

∆Gne ndash положительная величина отражающая образование и разрыв связей ∆GS - отрицательная величина отражающая использование энергии связывания

Фермент и субстрат Фермент и субстрат комплементарныкомплементарны когда каждая взаимодействующая группа когда каждая взаимодействующая группа

субстрата контактирует с субстрата контактирует с соответствующим центром связывания соответствующим центром связывания

фермента и энергия связывания фермента и энергия связывания принимает максимальное значениепринимает максимальное значение

Комплементарность фермента исходному Комплементарность фермента исходному субстратусубстрату

Допустим максимальная внутренняя свободная энергия связывания равна ∆Gb В рассмотренном случае она реализуется в исходном фермент-субстратном комплексе обеспечивая прочное связывание КM - константа диссоциации фермент-субстратного комплекса ndash будет мала Образование переходного состояния будет сопровождаться изменением геометрии субстрата и ухудшением его соответствия что приведет к уменьшению энергии связывания ∆GR ndash увеличение свободной энергии вызванное ухудшением структурного соответствия между ферментом и субстратом ∆G0 ndash свободная энергия активации для образования и разрыва химических связей на стадии определяемой константой kcatНаблюдаемая свободная энергия активации для стадии химического превращения субстрата с константой скорости kcat равна∆Gne=∆G0

ne+∆GR и∆GS=∆Gb

Энергия активации Гиббса для процесса

∆GТne=∆G0

ne+∆GR+∆Gb

Пунктирная линия ndash фермент структурно комплементарен субстрату сплошная ndash переходному состоянию (∆GS = ∆Gb - отрицательная величина ∆G0 и ∆GR ndash положительны)

График изменения энергии ГиббсаГрафик изменения энергии Гиббса

E + S ES продукты

Полная энергия связывания ∆Gb реализуется в переходном состоянии Исходному фермент-субстратному комплексу соответствует положительный член ∆GR который отражает возрастание энергии за счет структурного несоответствия исходного состояния переходному Этот член увеличивает КМ а прирост энергии связывания по мере приближения к переходному состоянию увеличивает kcat∆Gne = ∆G0

ne - ∆GR

∆GS = ∆Gb + ∆GR

Энергия активации Гиббса для перехода характеризующегося константой kcatKM

∆GТne=∆G ne + ∆GS = ∆G0

ne + ∆Gb

∆GR из конечного уравнения исключается

Когда фермент комплементарен переходному состоянию субстрата а не самому субстрату kcatKM возрастает в exp(∆GRRT) раз kcatKM не зависит от взаимодействий в исходном фермент-субстратном комплексе поскольку член ∆GR не входит в уравнение

Комплементарность фермента переходному Комплементарность фермента переходному состоянию субстратасостоянию субстрата

Наличие сильного связывания фермента с субстратом или Наличие сильного связывания фермента с субстратом или низкое значение Книзкое значение КМ М не является необходимым условием не является необходимым условием

протекания ферментативной реакции Для катализа важны протекания ферментативной реакции Для катализа важны высокие значения Квысокие значения КММ

Процесс эволюции ферментов направленный на увеличение Процесс эволюции ферментов направленный на увеличение скорости катализируемых ими реакций можно разделить на два скорости катализируемых ими реакций можно разделить на два этапаэтапа

11 Увеличение Увеличение kkcatcatKKMM за счет повышения комплементарности фермента за счет повышения комплементарности фермента переходному состоянию субстратапереходному состоянию субстрата

22 Увеличение концентрации фермента за счет повышения КУвеличение концентрации фермента за счет повышения КММ направленное на то чтобы в свободном состоянии находилось направленное на то чтобы в свободном состоянии находилось максимально возможное количество ферментамаксимально возможное количество фермента

Исключение ndash ферменты которые выполняют регуляторные функцииИх активность регулируется путем изменения КМ субстратов через

аллостерическое воздействие

Модель laquoключ-замокraquoМодель laquoключ-замокraquo

Теория комплементарности при фермент-субстратном взаимодействии принадлежит Э Фишеру воплотившему ее в модели laquoключ-замокraquo В 1890 г Э Фишер предложил модель согласно которой специфичность ферментов определяется точным соответствием формы фермента и субстрата Однако хотя эта модель объясняла высокую специфичность ферментов она не объясняла явления стабилизации переходного состояния которое наблюдается на практике

Герман Эмиль ФишерГерман Эмиль Фишер1852 Ойскирхен ndash 1919 Берлин1852 Ойскирхен ndash 1919 Берлин

Немецкий химик-органик и Немецкий химик-органик и биохимикбиохимик

Нобелевская премияпо химии 1902 г

Концепция деформацииКонцепция деформации(ДжБС Холдейн и Л Полинг)(ДжБС Холдейн и Л Полинг)

Активный центр фермента структурно комплементарен не самому субстрату а переходному состоянию При связывании с ферментом переходное состояние субстрата взаимодействует с ферментом более эффективно чем сам субстрат и поэтому полная энергия связывания не реализуется до тех пор пока не сформируется переходное состояние

Лайнус Карл ПолингЛайнус Карл Полинг1901 Портленд ndash 1994 Биг-Сюр1901 Портленд ndash 1994 Биг-Сюр

американский химикамериканский химикНобелевская премия

по химии 1954 г и мира 1962 г

Теория индуцированного Теория индуцированного соответствиясоответствия

Объясняет отсутствие ферментативной активности с небольшими субстратами такими как вода в которых нет групп способных обеспечить связывание и энергию для приведения фермента в активное состояние Является модификацией модели laquoключ-замокraquo - модель laquoрука-перчаткаraquo Предполагается что в отсутствии субстрата фермент структурно некомплементарен переходному состоянию Однако поскольку молекула фермента довольно гибкая а субстрат имеет жесткую структуру при образовании фермент-субстратного комплекса каталитические группы на ферменте ориентируются оптимальным для катализа образом фермент становится комплементарным переходному состоянию только после связывания субстрата Перестройка области активного центра при связывании с субстратом названа процессом конформационной адаптации

Дэниэл Эдвард КошландДэниэл Эдвард Кошланд1920 Нью-Йорк ndash 1919 Калифорния1920 Нью-Йорк ndash 1919 Калифорния

американский биохимикамериканский биохимик

Гипотеза непродуктивного связыванияГипотеза непродуктивного связывания

Было предложено что помимо продуктивного связывания в активном центре возможны другие способы связывания когда небольшие субстраты связываются но не подвергаются каталитическому превращению

Например в молекуле лизоцима активный центр имеет протяженную структуру состоящую из шести центров связывания ndash A B C D E F Для осуществления реакции необходимо чтобы молекула субстрата заняла центры D и Е Небольшие субстраты способны присоединяться с любой сторону вдоль вытянутого активного центра лизоцима не связываясь с подцентром где происходит расщепление

ДеформацияДеформация вносит положительный вклад в катализ вносит положительный вклад в катализ при условии комплементарности фермента при условии комплементарности фермента переходному состоянию субстрата увеличивая переходному состоянию субстрата увеличивая kkcatcat и и KKMM что приводит к увеличению скорости реакции что приводит к увеличению скорости реакции

ИндуцированноеИндуцированное соответствиесоответствие уменьшает уменьшает эффективность катализа увеличивая эффективность катализа увеличивая KKMM без без соответствующего увеличения соответствующего увеличения kkcatcat по сравнению с по сравнению с ферментом находящимся в кативной форме в ферментом находящимся в кативной форме в отсутствие субстрата отсутствие субстрата

Механизм непродуктивного связыванияМеханизм непродуктивного связывания не не затрагивает каталитического превращения затрагивает каталитического превращения специфических субстратов однако он приводит к специфических субстратов однако он приводит к появлению дополнительных связывающих центров для появлению дополнительных связывающих центров для конкурирующих между собой неспецифических конкурирующих между собой неспецифических субстратовсубстратов

Специфичность ферментаСпецифичность фермента

Способность фермента узнавать Способность фермента узнавать определенный субстрат из нескольких определенный субстрат из нескольких

конкурирующих за активный центрконкурирующих за активный центр

Функция слагающаяся из прочности связывания Функция слагающаяся из прочности связывания

каждого из субстратов и кинетической каждого из субстратов и кинетической

(каталитической) специфичности (каталитической) специфичности

характеризующейся скоростью катализахарактеризующейся скоростью катализа

laquoСуммарнаяraquo специфичность характеризуется laquoСуммарнаяraquo специфичность характеризуется

отношением отношением kkcatcatKKMM

Специфичность и относительная Специфичность и относительная реакционная способностьреакционная способность

Центральная проблема специфичности Центральная проблема специфичности каким образом фермент отличает специфический каким образом фермент отличает специфический субстрат от другого меньшего или равного ему по субстрат от другого меньшего или равного ему по размерам (изостерического) субстратаразмерам (изостерического) субстрата

Такую задачу постоянно решают аминоацил-тРНК-синтетазы Если синтетаза (ЕХ) ошибочно активирует чужую аминокислоту (Y) и далее катализирует ее перенос на laquoсвоюraquo тРНКХ

или если она ошибочно этерифицирует истинной субстратной аминокислотой Х чужую тРНК

то каждое из этих событий приведет к ошибке в последовательности синтезируемой полипептидной цепи

Дискриминация аминокислот меньших или изостеричных (равных по размеру) специфическому субстрату способных разместиться в активном центре фермента определяется предпочтительным связыванием истинного субстрата за счет незначительных различий в структуре

Валил-тРНК-синтетаза

Наличие разницы в энергии связывания не до конца обеспечивает Наличие разницы в энергии связывания не до конца обеспечивает в этих случаях точность работы системы аминоацилированияв этих случаях точность работы системы аминоацилирования

валин

Изолейцил-тРНК-синтетаза

изолейцин валин треонин

Треонин связывается с валил-тРНК синтетазой в 100-200 раз слабее валина несмотря на то что он изостеричен валину поскольку в гидрофобный карман погружается гидроксильная группа вместо метиленовой Энергия активации реакции представляет собой сумму двух составляющих одна из них ndash энергия активации для стадии химического превращения а вторая ndash энергия связывания фермента с субстратом

Валил-тРНК-синтетаза

валин треонин

Различие в энергии связывания специфичного субстрата (Различие в энергии связывания специфичного субстрата (RSRS) и ) и меньшего по размерам конкурирующего соединения меньшего по размерам конкурирующего соединения HSHS равно равно дополнительной энергии связывания группы дополнительной энергии связывания группы RR имеющейся у имеющейся у специфичного субстрата и отсутствующей у меньшего специфичного субстрата и отсутствующей у меньшего субстрата по отношению к водороду субстрата по отношению к водороду

Поскольку энергия взаимодействия группы R не только входит в энергию связывания но и понижает энергию активации стадии химического превращения вклад заместителя R следует оценивать из сравнения параметров kcatKM для двух субстратов RS и HS Например если величину kcat для валина для активации валил-тРНК-синтетазой принять за 1 то для других аминокислот эта величина будет для аланина 003 для изолейцина 00019 для серина 005

Дополнительную энергию связывания группы Дополнительную энергию связывания группы RR по отношению к по отношению к водороду можно определить по формулеводороду можно определить по формуле

∆Gb=RTln(kcatKM)RS ln(kcatKM)HS

Для пары изолейцил-тРНК-синтетаза-валин неспецифический субстрат по критерию kcatKM хуже в 140-200 раз В клетках EColi [Ile][Val] = 018 Уровень ошибок изолейцил-тРНК-синтетазы на стадии активации 003-004 Экспериментально обнаружено уровень ошибок при замене Ile на Val в биосинтезе овальбумина цыпленка и гемоглобина кролика равен 310-4

Изолейцил-тРНК-синтетаза

изолейцин валин

Чему соответствует этот уровень ошибокЧему соответствует этот уровень ошибок

Ошибочное включение одной аминокислоты на Ошибочное включение одной аминокислоты на каждые 10000 остатковкаждые 10000 остатков

Одна из 20 белковых молекул длиной в 500 остатков Одна из 20 белковых молекул длиной в 500 остатков будет содержать единственную ошибочную будет содержать единственную ошибочную

аминокислотуаминокислоту

Предположив что только около 10 всех ошибок Предположив что только около 10 всех ошибок серьезно сказываются на биологической функции серьезно сказываются на биологической функции

белка можно сделать заключение что одна белка можно сделать заключение что одна молекула белка из 200 синтезированных окажется молекула белка из 200 синтезированных окажется

бесполезной (или даже вредной) в клеточном бесполезной (или даже вредной) в клеточном метаболизмеметаболизме

Коррекция ошибок в реакциях катализируемых

аминоацил-тРНК- синтетазами

Существование механизмов Существование механизмов коррекции для аминоацил-коррекции для аминоацил-

тРНК-синтетазтРНК-синтетаз

Поль Наим БергПоль Наим Берг19219266 Бруклин СШАБруклин США

Американский биохимикАмериканский биохимикНобелевская премия

по химии 1980 г

Изолейцил-тРНК-синтетаза ошибочно активирует валин Добавление тРНК к комплексу с изолейциладенилатом приводит к образованию изолейцил-тРНК а у валиладенилат-ферментного комплекса не наблюдается образование валил-тРНК поскольку при добавлении тРНК происходит гидролиз ошибочного аминоациладенилата

Существование механизмов коррекции для Существование механизмов коррекции для аминоацил-тРНК-синтетазаминоацил-тРНК-синтетаз

В присутствии тРНКВ присутствии тРНКIleIle изолейцил-тРНК-синтетаза изолейцил-тРНК-синтетаза непроизводительно гидролизует АТР АМР + непроизводительно гидролизует АТР АМР + ppppii

ИзбыточныйИзбыточный гидролиз АТРгидролиз АТР по отношению к по отношению к синтезированному продукту за счет АТР-синтезированному продукту за счет АТР-пирофосфогидролазной активности синтетазы пирофосфогидролазной активности синтетазы является является критерием существования корректирующего механизмакритерием существования корректирующего механизма включающего дополнительную стадию разрушения ошибочного включающего дополнительную стадию разрушения ошибочного продукта реакции продукта реакции

У цистеинил- и тирозил-тРНК-синтетаз специфичность высокая У цистеинил- и тирозил-тРНК-синтетаз специфичность высокая и гидролиза АТР не наблюдается и гидролиза АТР не наблюдается

В некоторых случаях когда дискриминация аминокислот на В некоторых случаях когда дискриминация аминокислот на стадии активации была недостаточной наблюдался быстрый стадии активации была недостаточной наблюдался быстрый гидролиз ошибочного аминоациладенилата вместо переноса гидролиз ошибочного аминоациладенилата вместо переноса laquoнеправильнойraquo аминокислоты на субстратную тРНКlaquoнеправильнойraquo аминокислоты на субстратную тРНК

Роль тРНК в коррекцииРоль тРНК в коррекции

Индуцирует ли тРНК гидролиз аминоациладенилата или же служит акцептором ошибочно активированной аминокислоты а затем подвергается ферментативному деацилированию

Возможные последовательности реакций катализируемых синтетазами можно записать в виде следующей схемы (АК-аминокислота)

Роль тРНК в коррекцииРоль тРНК в коррекции

Предложенные механизмы коррекции можно разделить на две группы в зависимости от того какое соединение в них гидролизуется Механизм отбраковки ошибочной аминокислоты (Механизм отбраковки ошибочной аминокислоты (стадии 1

2 5 ndash гидролиз аминоацил-тРНК) Механизм коррекции за счет гидролиза промежуточного Механизм коррекции за счет гидролиза промежуточного

аминоациладенилата (аминоациладенилата (стадии 1 и 4 ndash гидролиз аминоациладенилата)

В каждом из возможных маршрутов коррекции исправление ошибки достигается благодаря введению в реакционный путь laquoнеобратимогоraquo ответвления (реакции 4 или 5) обеспечивающего гидролиз нежелательных соединений

Механизм отбраковки ошибочной аминокислотыМеханизм отбраковки ошибочной аминокислоты

Доказательство существования механизма гидролиза аминоацил-тРНК аминоацил-тРНК-синтетазами было получено при изучении аминоацилирования тРНКVal треонином катализируемого валил-тРНК-синтетазой из BStearothermophilus

Валил-тРНК-синтетаза образует с треонином стабильный комплекс Валил-тРНК-синтетаза образует с треонином стабильный комплекс который быстро гидролизуется при добавлении тРНКкоторый быстро гидролизуется при добавлении тРНКValVal

Предшествует ли гидролизу перенос аминоацильного остатка на тРНКПредшествует ли гидролизу перенос аминоацильного остатка на тРНКValVal

Импульсный метод laquoзамороженнойraquo струиКомплекс [14С]-треонил-АМРЕVal + тРНК [14С]-треонил-тРНК

Константа гидролиза треонил-тРНК в присутствии валил-тРНК-синтетазы 40 сКонстанта гидролиза треонил-тРНК в присутствии валил-тРНК-синтетазы 40 с -1-1а для специфичной валил-тРНК 0015 са для специфичной валил-тРНК 0015 с-1-1 то есть более чем в 2000 раз ниже то есть более чем в 2000 раз ниже

Механизм коррекции за счет гидролиза Механизм коррекции за счет гидролиза промежуточного аминоациладенилатапромежуточного аминоациладенилата

Ошибочное промежуточное соединение образующееся в ходе реакции диссоциирует с фермента и гиролизуется быстрее чем правильное Для правильного аминоациладенилата скорость переноса на тРНК выше чем диссоциация те коррекция определяется соотношением кинетических констант определенных стадий

Джон Джозеф ХопфилдДжон Джозеф Хопфилд1933 Чикаго США1933 Чикаго США

биофизик и биофизик и молекулярный биологмолекулярный биолог

Механизм кинетического корректированияМеханизм кинетического корректирования

Механизм коррекции за счет гидролиза Механизм коррекции за счет гидролиза промежуточного аминоациладенилатапромежуточного аминоациладенилата

Экспериментальное доказательствоЭкспериментальное доказательствоДля валил-тРНК-синтетазы из желтого люпина в отсутствие тРНК наблюдался гидролиз

АТР АМР + ppi зависящий от присутствия несубстратных аминокислот (Cys Thr Ser и α-аминомасляной кислоты)

Константа скорости гидролиза для этих кислот 07-13 мин-1 Специфический валиладенилат-ферментный комплекс гидролизуется с константой скорости 0018 мин-1 те например в 720 раз медленнее чем комплекс валил-тРНК-синтетазы с цистеинил-аденилатом

Коррекция ошибок в реакциях Коррекция ошибок в реакциях катализируемыхкатализируемых

ДНК-полимеразамиДНК-полимеразами

Механизм коррекции при репликации ДНКМеханизм коррекции при репликации ДНК

При синтезе ДНК ошибка исправляется после полимеризации Молекула ДНК синтезируется в направлении 5rsquo-3rsquo нуклеотиды присоединяются к 3rsquo-гидроксильной группе растущей цепи ДНК

Репликативные ДНК-полимеразы обладают Репликативные ДНК-полимеразы обладают корректирующей 3rsquo-5rsquo-экзонуклеазной активностью корректирующей 3rsquo-5rsquo-экзонуклеазной активностью

выщепляющей из цепи ошибочно встроенный нуклеотидвыщепляющей из цепи ошибочно встроенный нуклеотид

Частота мутации фага Т4 коррелирует с экзонуклеазной активностью проявляемой ДНК-полимеразой Частота мутации для ЕСoli составляет 10-6-10-8 и следовательно точность репликации ДНК либо равна этим величинам либо еще выше

Механизм коррекции при репликации ДНКМеханизм коррекции при репликации ДНК

С помощью экзонуклеазной активности исправляются ошибки которые накапливаются в процессе биосинтеза Однако нарушения структуры ДНК могут возникать не только по причине неточной работы в ходе синтеза но и в результате внешних воздействий таких как ионизирующее и ультрафиолетовое облучение окислительный стресс

Возможна различная пострепликационная коррекция структуры ДНКВозможна различная пострепликационная коррекция структуры ДНК(репарация)(репарация)

Система репарации ошибочно-встроенных нуклеотидов (Система репарации ошибочно-встроенных нуклеотидов (mismatch mismatch repairrepair) специально предназначена для удаления ошибок возникших в ) специально предназначена для удаления ошибок возникших в ДНК в ходе репликацииДНК в ходе репликации

Система эксцизионной репарации оснований исправляет повреждения в Система эксцизионной репарации оснований исправляет повреждения в ДНК возникающие в результате окислительного стресса то есть ДНК возникающие в результате окислительного стресса то есть модифицированные (окисленные) основания и разрывы в одной из цепей модифицированные (окисленные) основания и разрывы в одной из цепей ДНКДНК

Система эксцизионной репарации нуклеотидов удаляет из ДНК объемные Система эксцизионной репарации нуклеотидов удаляет из ДНК объемные повреждения фотодимеры возникающие под действием повреждения фотодимеры возникающие под действием ультрафиолетового облучения объемные аддукты метаболитов ультрафиолетового облучения объемные аддукты метаболитов попадающих из окружающей среды таких как продукты сгорания курения попадающих из окружающей среды таких как продукты сгорания курения например антрацены и бензапиренынапример антрацены и бензапирены

Синтез ДНК через повреждениеСинтез ДНК через повреждение((Translesion synthesisTranslesion synthesis ndash TLS)ndash TLS)

В случае синтеза с использованием поврежденной ДНК-матрицы транслезионными (translesion) ДНК-полимеразами (например η ι κ θ μ ζ) также возникают искажения в структуре ДНК

TLS ДНК-полимеразы ведущие синтез через повреждение матрицы не обладают корректирующей активностью поскольку их задачей является ввести во чтобы то ни стало нуклеотидное звено дабы избежать остановки репликативной вилки на повреждении матрицы Затем поврежденный участок ДНК восстанавливается системами репарации

Мутации вводимые репликативными Мутации вводимые репликативными ДНК-полимеразами в ходе репликативного синтеза ДНК-полимеразами в ходе репликативного синтеза

играют не только вредную рольиграют не только вредную роль Мутации в ДНК являются движущей Мутации в ДНК являются движущей

силой эволюциисилой эволюции

• Slide 1
• Slide 2
• Slide 3
• Slide 4
• Slide 5
• Slide 6
• Slide 7
• Slide 8
• Slide 9
• Slide 10
• Slide 11
• Slide 12
• Slide 13
• Slide 14
• Slide 15
• Slide 16
• Slide 17
• Slide 18
• Slide 19
• Slide 20
• Slide 21
• Slide 22
• Slide 23
• Slide 24
• Slide 25
• Slide 26
• Slide 27
• Slide 28
• Slide 29
• Slide 30
• Slide 31
• Slide 32
• Slide 33
• Slide 34
• Slide 35
• Slide 36
• Slide 37
• Slide 38
• Slide 39
• Slide 40
• Slide 41

Специфичность ферментов в отношении превращаемых Специфичность ферментов в отношении превращаемых субстратов ndash важнейшая особенность ферментативных реакцийсубстратов ndash важнейшая особенность ферментативных реакций

Некоторые из ферментов обладают Некоторые из ферментов обладают очень широкой очень широкой специфичностьюспецифичностью (например щелочная фосфатаза) (например щелочная фосфатаза)

Другой крайний случай ndash Другой крайний случай ndash строгая стереоспецифичностьстрогая стереоспецифичность ndash Дрожжи содержат два определенных фермента ndash Дрожжи содержат два определенных фермента LL-лактат -лактат и и DD-лактатдегидрогеназу -лактатдегидрогеназу ndash ndash Аминоацил-тРНК-синтетазы проявляют высокую Аминоацил-тРНК-синтетазы проявляют высокую стереоспецифичность стереоспецифичность DD-аминокислоты не являются -аминокислоты не являются субстратами за исключением субстратами за исключением DD-тирозина Возможно -тирозина Возможно образование образование DD-тирозил-тРНК и по этой причине для -тирозил-тРНК и по этой причине для гидролиза нежелательного продукта существует фермент гидролиза нежелательного продукта существует фермент DD-тирозил-гидроксилаза-тирозил-гидроксилаза

Ферменты снижают энергию активации Ферменты снижают энергию активации катализируемой реакциикатализируемой реакции

ДжБС Холдейн 1930 гlaquoЭнергия связывания субстрата Энергия связывания субстрата используется для деформации используется для деформации субстрата до структуры продуктасубстрата до структуры продуктаraquoВ теории переходного состояния не учитываются процессы столкновения реагентов Теория рассматривает сами реагенты (основное состояние) и наиболее нестабильные соединения которые образуются в ходе реакции (переходное состояние) Переходному состоянию соответствует максимум на кривой изменения энергии реагентов вдоль координаты реакцииДжон Бердон СандерсонДжон Бердон Сандерсон

ХолдейнХолдейн1892 1892 Оксфорд Англия ndash 19Оксфорд Англия ndash 196464 Индия Индия

Английский биолог и философАнглийский биолог и философ

График изменения энергии Гиббса График изменения энергии Гиббса в ходе реакциив ходе реакции

Состояние 1 ndash переходное состояние (ESne) Состояние 2 ndash промежуточное состояние

В переходном состоянии химические связи непрерывно образуются и разрываются Соединениям со стабильными химическими связями соответствуют минимумы на графике Допущение о существовании термодинамического равновесия между основным и переходным состоянием используется для расчета скорости реакции В этом случае концентрацию переходного состояния можно рассчитать из разности энергии этих состояний Общую скорость реакции получают умножением концентрации переходного комплекса и константы скорости его распада

Для мономолекулярной реакцииРазность энергий Гиббса для переходного (Хne) и основного (Х) состояний равна ∆Gne Воспользуемся известным соотношением равновесной термодинамики∆Gne = -RT lnK [Хne]=[X]exp(-∆GneRT)

Частота распада переходного комплекса = частота колебаний разрываемой связиЧастота распада переходного комплекса = частота колебаний разрываемой связи

Частота получена из равенства энергий возбужденного осциллятора рассчитанных на основе квантовой теории (E=hω) и классической физики (Е=kT) где h ndash постоянная Планка ω ndash частота колебаний k ndash постоянная Больцмана ωω==kTkThh Скорость распада молекул Х определяется уравнением

exp(-∆GneRT)

Константа скорости первого порядка для распада молекул Х равна

k1= exp(-∆GneRT)

Энергия активации Гиббса ∆Gne может быть подразделена на энтальпийную и энтропийную составляющие ∆Gne =∆Нne -Т∆Sne

k1= exp(-∆HneRT) exp(∆SneR)

h

kT]X[]X[

dt

d[X]

h

kT

h

kT

Применение теории переходного состояния для Применение теории переходного состояния для анализа механизмов ферментативного катализаанализа механизмов ферментативного катализа

В случае простого механизма Михаэлиса-Ментен (КВ случае простого механизма Михаэлиса-Ментен (КSS=К=КMM) ) энергия связывания уменьшает энергию активации перехода энергия связывания уменьшает энергию активации перехода определяемого кажущейся константой скорости второго определяемого кажущейся константой скорости второго порядка порядка kkcatcatKKMMСмысл параметра kcatKM где kcat - число оборотов реакции поскольку эта величина определяет максимальное число молекул субстрата превращаемых в продукт одним активным центром в единицу времениndash KM в простейшем варианте можно рассматривать как кажущуюся константу диссоциации v=kcat[E](1+KM[S]) ndash При малых концентрациях субстрата v=kcatKM[E][S] то есть kcatKM представляет собой кажущуюся константу скорости второго порядка Ценность параметра kcatKM в том что он связывает скорость реакций с концентрацией свободного фермента а не с его общей концентрацией Это справедливо для низкой концентрации субстрата тк при [Е]asymp[Е0]

KM=KD= [ES]

]S][E[

RTln(kcatKM)=RTln(kTH) - ∆Gne-∆GS

Константа скорости для взаимодействия свободного фермента со свободным субстратом с образованием продуктов равна kcatKM В терминах теории переходного состояния константа равновесия для второй реакции пропорциональна энергии активации ∆GТ

ne

k1= exp(-∆GneRT)h

kT

∆GТne=∆Gne+∆GS

∆Gne ndash положительная величина отражающая энергию активации химических стадий в ходе которых происходит образование и разрыв связей ∆GS - отрицательная величина отражающая использование энергии связывания

Изменение энергии Гиббса для реакцииИзменение энергии Гиббса для реакции

E + S ES продукты

∆Gne ndash положительная величина отражающая образование и разрыв связей ∆GS - отрицательная величина отражающая использование энергии связывания

Фермент и субстрат Фермент и субстрат комплементарныкомплементарны когда каждая взаимодействующая группа когда каждая взаимодействующая группа

субстрата контактирует с субстрата контактирует с соответствующим центром связывания соответствующим центром связывания

фермента и энергия связывания фермента и энергия связывания принимает максимальное значениепринимает максимальное значение

Комплементарность фермента исходному Комплементарность фермента исходному субстратусубстрату

Допустим максимальная внутренняя свободная энергия связывания равна ∆Gb В рассмотренном случае она реализуется в исходном фермент-субстратном комплексе обеспечивая прочное связывание КM - константа диссоциации фермент-субстратного комплекса ndash будет мала Образование переходного состояния будет сопровождаться изменением геометрии субстрата и ухудшением его соответствия что приведет к уменьшению энергии связывания ∆GR ndash увеличение свободной энергии вызванное ухудшением структурного соответствия между ферментом и субстратом ∆G0 ndash свободная энергия активации для образования и разрыва химических связей на стадии определяемой константой kcatНаблюдаемая свободная энергия активации для стадии химического превращения субстрата с константой скорости kcat равна∆Gne=∆G0

ne+∆GR и∆GS=∆Gb

Энергия активации Гиббса для процесса

∆GТne=∆G0

ne+∆GR+∆Gb

Пунктирная линия ndash фермент структурно комплементарен субстрату сплошная ndash переходному состоянию (∆GS = ∆Gb - отрицательная величина ∆G0 и ∆GR ndash положительны)

График изменения энергии ГиббсаГрафик изменения энергии Гиббса

E + S ES продукты

Полная энергия связывания ∆Gb реализуется в переходном состоянии Исходному фермент-субстратному комплексу соответствует положительный член ∆GR который отражает возрастание энергии за счет структурного несоответствия исходного состояния переходному Этот член увеличивает КМ а прирост энергии связывания по мере приближения к переходному состоянию увеличивает kcat∆Gne = ∆G0

ne - ∆GR

∆GS = ∆Gb + ∆GR

Энергия активации Гиббса для перехода характеризующегося константой kcatKM

∆GТne=∆G ne + ∆GS = ∆G0

ne + ∆Gb

∆GR из конечного уравнения исключается

Когда фермент комплементарен переходному состоянию субстрата а не самому субстрату kcatKM возрастает в exp(∆GRRT) раз kcatKM не зависит от взаимодействий в исходном фермент-субстратном комплексе поскольку член ∆GR не входит в уравнение

Комплементарность фермента переходному Комплементарность фермента переходному состоянию субстратасостоянию субстрата

Наличие сильного связывания фермента с субстратом или Наличие сильного связывания фермента с субстратом или низкое значение Книзкое значение КМ М не является необходимым условием не является необходимым условием

протекания ферментативной реакции Для катализа важны протекания ферментативной реакции Для катализа важны высокие значения Квысокие значения КММ

Процесс эволюции ферментов направленный на увеличение Процесс эволюции ферментов направленный на увеличение скорости катализируемых ими реакций можно разделить на два скорости катализируемых ими реакций можно разделить на два этапаэтапа

11 Увеличение Увеличение kkcatcatKKMM за счет повышения комплементарности фермента за счет повышения комплементарности фермента переходному состоянию субстратапереходному состоянию субстрата

22 Увеличение концентрации фермента за счет повышения КУвеличение концентрации фермента за счет повышения КММ направленное на то чтобы в свободном состоянии находилось направленное на то чтобы в свободном состоянии находилось максимально возможное количество ферментамаксимально возможное количество фермента

Исключение ndash ферменты которые выполняют регуляторные функцииИх активность регулируется путем изменения КМ субстратов через

аллостерическое воздействие

Модель laquoключ-замокraquoМодель laquoключ-замокraquo

Теория комплементарности при фермент-субстратном взаимодействии принадлежит Э Фишеру воплотившему ее в модели laquoключ-замокraquo В 1890 г Э Фишер предложил модель согласно которой специфичность ферментов определяется точным соответствием формы фермента и субстрата Однако хотя эта модель объясняла высокую специфичность ферментов она не объясняла явления стабилизации переходного состояния которое наблюдается на практике

Герман Эмиль ФишерГерман Эмиль Фишер1852 Ойскирхен ndash 1919 Берлин1852 Ойскирхен ndash 1919 Берлин

Немецкий химик-органик и Немецкий химик-органик и биохимикбиохимик

Нобелевская премияпо химии 1902 г

Концепция деформацииКонцепция деформации(ДжБС Холдейн и Л Полинг)(ДжБС Холдейн и Л Полинг)

Активный центр фермента структурно комплементарен не самому субстрату а переходному состоянию При связывании с ферментом переходное состояние субстрата взаимодействует с ферментом более эффективно чем сам субстрат и поэтому полная энергия связывания не реализуется до тех пор пока не сформируется переходное состояние

Лайнус Карл ПолингЛайнус Карл Полинг1901 Портленд ndash 1994 Биг-Сюр1901 Портленд ndash 1994 Биг-Сюр

американский химикамериканский химикНобелевская премия

по химии 1954 г и мира 1962 г

Теория индуцированного Теория индуцированного соответствиясоответствия

Объясняет отсутствие ферментативной активности с небольшими субстратами такими как вода в которых нет групп способных обеспечить связывание и энергию для приведения фермента в активное состояние Является модификацией модели laquoключ-замокraquo - модель laquoрука-перчаткаraquo Предполагается что в отсутствии субстрата фермент структурно некомплементарен переходному состоянию Однако поскольку молекула фермента довольно гибкая а субстрат имеет жесткую структуру при образовании фермент-субстратного комплекса каталитические группы на ферменте ориентируются оптимальным для катализа образом фермент становится комплементарным переходному состоянию только после связывания субстрата Перестройка области активного центра при связывании с субстратом названа процессом конформационной адаптации

Дэниэл Эдвард КошландДэниэл Эдвард Кошланд1920 Нью-Йорк ndash 1919 Калифорния1920 Нью-Йорк ndash 1919 Калифорния

американский биохимикамериканский биохимик

Гипотеза непродуктивного связыванияГипотеза непродуктивного связывания

Было предложено что помимо продуктивного связывания в активном центре возможны другие способы связывания когда небольшие субстраты связываются но не подвергаются каталитическому превращению

Например в молекуле лизоцима активный центр имеет протяженную структуру состоящую из шести центров связывания ndash A B C D E F Для осуществления реакции необходимо чтобы молекула субстрата заняла центры D и Е Небольшие субстраты способны присоединяться с любой сторону вдоль вытянутого активного центра лизоцима не связываясь с подцентром где происходит расщепление

ДеформацияДеформация вносит положительный вклад в катализ вносит положительный вклад в катализ при условии комплементарности фермента при условии комплементарности фермента переходному состоянию субстрата увеличивая переходному состоянию субстрата увеличивая kkcatcat и и KKMM что приводит к увеличению скорости реакции что приводит к увеличению скорости реакции

ИндуцированноеИндуцированное соответствиесоответствие уменьшает уменьшает эффективность катализа увеличивая эффективность катализа увеличивая KKMM без без соответствующего увеличения соответствующего увеличения kkcatcat по сравнению с по сравнению с ферментом находящимся в кативной форме в ферментом находящимся в кативной форме в отсутствие субстрата отсутствие субстрата

Механизм непродуктивного связыванияМеханизм непродуктивного связывания не не затрагивает каталитического превращения затрагивает каталитического превращения специфических субстратов однако он приводит к специфических субстратов однако он приводит к появлению дополнительных связывающих центров для появлению дополнительных связывающих центров для конкурирующих между собой неспецифических конкурирующих между собой неспецифических субстратовсубстратов

Специфичность ферментаСпецифичность фермента

Способность фермента узнавать Способность фермента узнавать определенный субстрат из нескольких определенный субстрат из нескольких

конкурирующих за активный центрконкурирующих за активный центр

Функция слагающаяся из прочности связывания Функция слагающаяся из прочности связывания

каждого из субстратов и кинетической каждого из субстратов и кинетической

(каталитической) специфичности (каталитической) специфичности

характеризующейся скоростью катализахарактеризующейся скоростью катализа

laquoСуммарнаяraquo специфичность характеризуется laquoСуммарнаяraquo специфичность характеризуется

отношением отношением kkcatcatKKMM

Специфичность и относительная Специфичность и относительная реакционная способностьреакционная способность

Центральная проблема специфичности Центральная проблема специфичности каким образом фермент отличает специфический каким образом фермент отличает специфический субстрат от другого меньшего или равного ему по субстрат от другого меньшего или равного ему по размерам (изостерического) субстратаразмерам (изостерического) субстрата

Такую задачу постоянно решают аминоацил-тРНК-синтетазы Если синтетаза (ЕХ) ошибочно активирует чужую аминокислоту (Y) и далее катализирует ее перенос на laquoсвоюraquo тРНКХ

или если она ошибочно этерифицирует истинной субстратной аминокислотой Х чужую тРНК

то каждое из этих событий приведет к ошибке в последовательности синтезируемой полипептидной цепи

Дискриминация аминокислот меньших или изостеричных (равных по размеру) специфическому субстрату способных разместиться в активном центре фермента определяется предпочтительным связыванием истинного субстрата за счет незначительных различий в структуре

Валил-тРНК-синтетаза

Наличие разницы в энергии связывания не до конца обеспечивает Наличие разницы в энергии связывания не до конца обеспечивает в этих случаях точность работы системы аминоацилированияв этих случаях точность работы системы аминоацилирования

валин

Изолейцил-тРНК-синтетаза

изолейцин валин треонин

Треонин связывается с валил-тРНК синтетазой в 100-200 раз слабее валина несмотря на то что он изостеричен валину поскольку в гидрофобный карман погружается гидроксильная группа вместо метиленовой Энергия активации реакции представляет собой сумму двух составляющих одна из них ndash энергия активации для стадии химического превращения а вторая ndash энергия связывания фермента с субстратом

Валил-тРНК-синтетаза

валин треонин

Различие в энергии связывания специфичного субстрата (Различие в энергии связывания специфичного субстрата (RSRS) и ) и меньшего по размерам конкурирующего соединения меньшего по размерам конкурирующего соединения HSHS равно равно дополнительной энергии связывания группы дополнительной энергии связывания группы RR имеющейся у имеющейся у специфичного субстрата и отсутствующей у меньшего специфичного субстрата и отсутствующей у меньшего субстрата по отношению к водороду субстрата по отношению к водороду

Поскольку энергия взаимодействия группы R не только входит в энергию связывания но и понижает энергию активации стадии химического превращения вклад заместителя R следует оценивать из сравнения параметров kcatKM для двух субстратов RS и HS Например если величину kcat для валина для активации валил-тРНК-синтетазой принять за 1 то для других аминокислот эта величина будет для аланина 003 для изолейцина 00019 для серина 005

Дополнительную энергию связывания группы Дополнительную энергию связывания группы RR по отношению к по отношению к водороду можно определить по формулеводороду можно определить по формуле

∆Gb=RTln(kcatKM)RS ln(kcatKM)HS

Для пары изолейцил-тРНК-синтетаза-валин неспецифический субстрат по критерию kcatKM хуже в 140-200 раз В клетках EColi [Ile][Val] = 018 Уровень ошибок изолейцил-тРНК-синтетазы на стадии активации 003-004 Экспериментально обнаружено уровень ошибок при замене Ile на Val в биосинтезе овальбумина цыпленка и гемоглобина кролика равен 310-4

Изолейцил-тРНК-синтетаза

изолейцин валин

Чему соответствует этот уровень ошибокЧему соответствует этот уровень ошибок

Ошибочное включение одной аминокислоты на Ошибочное включение одной аминокислоты на каждые 10000 остатковкаждые 10000 остатков

Одна из 20 белковых молекул длиной в 500 остатков Одна из 20 белковых молекул длиной в 500 остатков будет содержать единственную ошибочную будет содержать единственную ошибочную

аминокислотуаминокислоту

Предположив что только около 10 всех ошибок Предположив что только около 10 всех ошибок серьезно сказываются на биологической функции серьезно сказываются на биологической функции

белка можно сделать заключение что одна белка можно сделать заключение что одна молекула белка из 200 синтезированных окажется молекула белка из 200 синтезированных окажется

бесполезной (или даже вредной) в клеточном бесполезной (или даже вредной) в клеточном метаболизмеметаболизме

Коррекция ошибок в реакциях катализируемых

аминоацил-тРНК- синтетазами

Существование механизмов Существование механизмов коррекции для аминоацил-коррекции для аминоацил-

тРНК-синтетазтРНК-синтетаз

Поль Наим БергПоль Наим Берг19219266 Бруклин СШАБруклин США

Американский биохимикАмериканский биохимикНобелевская премия

по химии 1980 г

Изолейцил-тРНК-синтетаза ошибочно активирует валин Добавление тРНК к комплексу с изолейциладенилатом приводит к образованию изолейцил-тРНК а у валиладенилат-ферментного комплекса не наблюдается образование валил-тРНК поскольку при добавлении тРНК происходит гидролиз ошибочного аминоациладенилата

Существование механизмов коррекции для Существование механизмов коррекции для аминоацил-тРНК-синтетазаминоацил-тРНК-синтетаз

В присутствии тРНКВ присутствии тРНКIleIle изолейцил-тРНК-синтетаза изолейцил-тРНК-синтетаза непроизводительно гидролизует АТР АМР + непроизводительно гидролизует АТР АМР + ppppii

ИзбыточныйИзбыточный гидролиз АТРгидролиз АТР по отношению к по отношению к синтезированному продукту за счет АТР-синтезированному продукту за счет АТР-пирофосфогидролазной активности синтетазы пирофосфогидролазной активности синтетазы является является критерием существования корректирующего механизмакритерием существования корректирующего механизма включающего дополнительную стадию разрушения ошибочного включающего дополнительную стадию разрушения ошибочного продукта реакции продукта реакции

У цистеинил- и тирозил-тРНК-синтетаз специфичность высокая У цистеинил- и тирозил-тРНК-синтетаз специфичность высокая и гидролиза АТР не наблюдается и гидролиза АТР не наблюдается

В некоторых случаях когда дискриминация аминокислот на В некоторых случаях когда дискриминация аминокислот на стадии активации была недостаточной наблюдался быстрый стадии активации была недостаточной наблюдался быстрый гидролиз ошибочного аминоациладенилата вместо переноса гидролиз ошибочного аминоациладенилата вместо переноса laquoнеправильнойraquo аминокислоты на субстратную тРНКlaquoнеправильнойraquo аминокислоты на субстратную тРНК

Роль тРНК в коррекцииРоль тРНК в коррекции

Индуцирует ли тРНК гидролиз аминоациладенилата или же служит акцептором ошибочно активированной аминокислоты а затем подвергается ферментативному деацилированию

Возможные последовательности реакций катализируемых синтетазами можно записать в виде следующей схемы (АК-аминокислота)

Роль тРНК в коррекцииРоль тРНК в коррекции

Предложенные механизмы коррекции можно разделить на две группы в зависимости от того какое соединение в них гидролизуется Механизм отбраковки ошибочной аминокислоты (Механизм отбраковки ошибочной аминокислоты (стадии 1

2 5 ndash гидролиз аминоацил-тРНК) Механизм коррекции за счет гидролиза промежуточного Механизм коррекции за счет гидролиза промежуточного

аминоациладенилата (аминоациладенилата (стадии 1 и 4 ndash гидролиз аминоациладенилата)

В каждом из возможных маршрутов коррекции исправление ошибки достигается благодаря введению в реакционный путь laquoнеобратимогоraquo ответвления (реакции 4 или 5) обеспечивающего гидролиз нежелательных соединений

Механизм отбраковки ошибочной аминокислотыМеханизм отбраковки ошибочной аминокислоты

Доказательство существования механизма гидролиза аминоацил-тРНК аминоацил-тРНК-синтетазами было получено при изучении аминоацилирования тРНКVal треонином катализируемого валил-тРНК-синтетазой из BStearothermophilus

Валил-тРНК-синтетаза образует с треонином стабильный комплекс Валил-тРНК-синтетаза образует с треонином стабильный комплекс который быстро гидролизуется при добавлении тРНКкоторый быстро гидролизуется при добавлении тРНКValVal

Предшествует ли гидролизу перенос аминоацильного остатка на тРНКПредшествует ли гидролизу перенос аминоацильного остатка на тРНКValVal

Импульсный метод laquoзамороженнойraquo струиКомплекс [14С]-треонил-АМРЕVal + тРНК [14С]-треонил-тРНК

Константа гидролиза треонил-тРНК в присутствии валил-тРНК-синтетазы 40 сКонстанта гидролиза треонил-тРНК в присутствии валил-тРНК-синтетазы 40 с -1-1а для специфичной валил-тРНК 0015 са для специфичной валил-тРНК 0015 с-1-1 то есть более чем в 2000 раз ниже то есть более чем в 2000 раз ниже

Механизм коррекции за счет гидролиза Механизм коррекции за счет гидролиза промежуточного аминоациладенилатапромежуточного аминоациладенилата

Ошибочное промежуточное соединение образующееся в ходе реакции диссоциирует с фермента и гиролизуется быстрее чем правильное Для правильного аминоациладенилата скорость переноса на тРНК выше чем диссоциация те коррекция определяется соотношением кинетических констант определенных стадий

Джон Джозеф ХопфилдДжон Джозеф Хопфилд1933 Чикаго США1933 Чикаго США

биофизик и биофизик и молекулярный биологмолекулярный биолог

Механизм кинетического корректированияМеханизм кинетического корректирования

Механизм коррекции за счет гидролиза Механизм коррекции за счет гидролиза промежуточного аминоациладенилатапромежуточного аминоациладенилата

Экспериментальное доказательствоЭкспериментальное доказательствоДля валил-тРНК-синтетазы из желтого люпина в отсутствие тРНК наблюдался гидролиз

АТР АМР + ppi зависящий от присутствия несубстратных аминокислот (Cys Thr Ser и α-аминомасляной кислоты)

Константа скорости гидролиза для этих кислот 07-13 мин-1 Специфический валиладенилат-ферментный комплекс гидролизуется с константой скорости 0018 мин-1 те например в 720 раз медленнее чем комплекс валил-тРНК-синтетазы с цистеинил-аденилатом

Коррекция ошибок в реакциях Коррекция ошибок в реакциях катализируемыхкатализируемых

ДНК-полимеразамиДНК-полимеразами

Механизм коррекции при репликации ДНКМеханизм коррекции при репликации ДНК

При синтезе ДНК ошибка исправляется после полимеризации Молекула ДНК синтезируется в направлении 5rsquo-3rsquo нуклеотиды присоединяются к 3rsquo-гидроксильной группе растущей цепи ДНК

Репликативные ДНК-полимеразы обладают Репликативные ДНК-полимеразы обладают корректирующей 3rsquo-5rsquo-экзонуклеазной активностью корректирующей 3rsquo-5rsquo-экзонуклеазной активностью

выщепляющей из цепи ошибочно встроенный нуклеотидвыщепляющей из цепи ошибочно встроенный нуклеотид

Частота мутации фага Т4 коррелирует с экзонуклеазной активностью проявляемой ДНК-полимеразой Частота мутации для ЕСoli составляет 10-6-10-8 и следовательно точность репликации ДНК либо равна этим величинам либо еще выше

Механизм коррекции при репликации ДНКМеханизм коррекции при репликации ДНК

С помощью экзонуклеазной активности исправляются ошибки которые накапливаются в процессе биосинтеза Однако нарушения структуры ДНК могут возникать не только по причине неточной работы в ходе синтеза но и в результате внешних воздействий таких как ионизирующее и ультрафиолетовое облучение окислительный стресс

Возможна различная пострепликационная коррекция структуры ДНКВозможна различная пострепликационная коррекция структуры ДНК(репарация)(репарация)

Система репарации ошибочно-встроенных нуклеотидов (Система репарации ошибочно-встроенных нуклеотидов (mismatch mismatch repairrepair) специально предназначена для удаления ошибок возникших в ) специально предназначена для удаления ошибок возникших в ДНК в ходе репликацииДНК в ходе репликации

Система эксцизионной репарации оснований исправляет повреждения в Система эксцизионной репарации оснований исправляет повреждения в ДНК возникающие в результате окислительного стресса то есть ДНК возникающие в результате окислительного стресса то есть модифицированные (окисленные) основания и разрывы в одной из цепей модифицированные (окисленные) основания и разрывы в одной из цепей ДНКДНК

Система эксцизионной репарации нуклеотидов удаляет из ДНК объемные Система эксцизионной репарации нуклеотидов удаляет из ДНК объемные повреждения фотодимеры возникающие под действием повреждения фотодимеры возникающие под действием ультрафиолетового облучения объемные аддукты метаболитов ультрафиолетового облучения объемные аддукты метаболитов попадающих из окружающей среды таких как продукты сгорания курения попадающих из окружающей среды таких как продукты сгорания курения например антрацены и бензапиренынапример антрацены и бензапирены

Синтез ДНК через повреждениеСинтез ДНК через повреждение((Translesion synthesisTranslesion synthesis ndash TLS)ndash TLS)

В случае синтеза с использованием поврежденной ДНК-матрицы транслезионными (translesion) ДНК-полимеразами (например η ι κ θ μ ζ) также возникают искажения в структуре ДНК

TLS ДНК-полимеразы ведущие синтез через повреждение матрицы не обладают корректирующей активностью поскольку их задачей является ввести во чтобы то ни стало нуклеотидное звено дабы избежать остановки репликативной вилки на повреждении матрицы Затем поврежденный участок ДНК восстанавливается системами репарации

Мутации вводимые репликативными Мутации вводимые репликативными ДНК-полимеразами в ходе репликативного синтеза ДНК-полимеразами в ходе репликативного синтеза

играют не только вредную рольиграют не только вредную роль Мутации в ДНК являются движущей Мутации в ДНК являются движущей

силой эволюциисилой эволюции

• Slide 1
• Slide 2
• Slide 3
• Slide 4
• Slide 5
• Slide 6
• Slide 7
• Slide 8
• Slide 9
• Slide 10
• Slide 11
• Slide 12
• Slide 13
• Slide 14
• Slide 15
• Slide 16
• Slide 17
• Slide 18
• Slide 19
• Slide 20
• Slide 21
• Slide 22
• Slide 23
• Slide 24
• Slide 25
• Slide 26
• Slide 27
• Slide 28
• Slide 29
• Slide 30
• Slide 31
• Slide 32
• Slide 33
• Slide 34
• Slide 35
• Slide 36
• Slide 37
• Slide 38
• Slide 39
• Slide 40
• Slide 41

Ферменты снижают энергию активации Ферменты снижают энергию активации катализируемой реакциикатализируемой реакции

ДжБС Холдейн 1930 гlaquoЭнергия связывания субстрата Энергия связывания субстрата используется для деформации используется для деформации субстрата до структуры продуктасубстрата до структуры продуктаraquoВ теории переходного состояния не учитываются процессы столкновения реагентов Теория рассматривает сами реагенты (основное состояние) и наиболее нестабильные соединения которые образуются в ходе реакции (переходное состояние) Переходному состоянию соответствует максимум на кривой изменения энергии реагентов вдоль координаты реакцииДжон Бердон СандерсонДжон Бердон Сандерсон

ХолдейнХолдейн1892 1892 Оксфорд Англия ndash 19Оксфорд Англия ndash 196464 Индия Индия

Английский биолог и философАнглийский биолог и философ

График изменения энергии Гиббса График изменения энергии Гиббса в ходе реакциив ходе реакции

Состояние 1 ndash переходное состояние (ESne) Состояние 2 ndash промежуточное состояние

В переходном состоянии химические связи непрерывно образуются и разрываются Соединениям со стабильными химическими связями соответствуют минимумы на графике Допущение о существовании термодинамического равновесия между основным и переходным состоянием используется для расчета скорости реакции В этом случае концентрацию переходного состояния можно рассчитать из разности энергии этих состояний Общую скорость реакции получают умножением концентрации переходного комплекса и константы скорости его распада

Для мономолекулярной реакцииРазность энергий Гиббса для переходного (Хne) и основного (Х) состояний равна ∆Gne Воспользуемся известным соотношением равновесной термодинамики∆Gne = -RT lnK [Хne]=[X]exp(-∆GneRT)

Частота распада переходного комплекса = частота колебаний разрываемой связиЧастота распада переходного комплекса = частота колебаний разрываемой связи

Частота получена из равенства энергий возбужденного осциллятора рассчитанных на основе квантовой теории (E=hω) и классической физики (Е=kT) где h ndash постоянная Планка ω ndash частота колебаний k ndash постоянная Больцмана ωω==kTkThh Скорость распада молекул Х определяется уравнением

exp(-∆GneRT)

Константа скорости первого порядка для распада молекул Х равна

k1= exp(-∆GneRT)

Энергия активации Гиббса ∆Gne может быть подразделена на энтальпийную и энтропийную составляющие ∆Gne =∆Нne -Т∆Sne

k1= exp(-∆HneRT) exp(∆SneR)

h

kT]X[]X[

dt

d[X]

h

kT

h

kT

Применение теории переходного состояния для Применение теории переходного состояния для анализа механизмов ферментативного катализаанализа механизмов ферментативного катализа

В случае простого механизма Михаэлиса-Ментен (КВ случае простого механизма Михаэлиса-Ментен (КSS=К=КMM) ) энергия связывания уменьшает энергию активации перехода энергия связывания уменьшает энергию активации перехода определяемого кажущейся константой скорости второго определяемого кажущейся константой скорости второго порядка порядка kkcatcatKKMMСмысл параметра kcatKM где kcat - число оборотов реакции поскольку эта величина определяет максимальное число молекул субстрата превращаемых в продукт одним активным центром в единицу времениndash KM в простейшем варианте можно рассматривать как кажущуюся константу диссоциации v=kcat[E](1+KM[S]) ndash При малых концентрациях субстрата v=kcatKM[E][S] то есть kcatKM представляет собой кажущуюся константу скорости второго порядка Ценность параметра kcatKM в том что он связывает скорость реакций с концентрацией свободного фермента а не с его общей концентрацией Это справедливо для низкой концентрации субстрата тк при [Е]asymp[Е0]

KM=KD= [ES]

]S][E[

RTln(kcatKM)=RTln(kTH) - ∆Gne-∆GS

Константа скорости для взаимодействия свободного фермента со свободным субстратом с образованием продуктов равна kcatKM В терминах теории переходного состояния константа равновесия для второй реакции пропорциональна энергии активации ∆GТ

ne

k1= exp(-∆GneRT)h

kT

∆GТne=∆Gne+∆GS

∆Gne ndash положительная величина отражающая энергию активации химических стадий в ходе которых происходит образование и разрыв связей ∆GS - отрицательная величина отражающая использование энергии связывания

Изменение энергии Гиббса для реакцииИзменение энергии Гиббса для реакции

E + S ES продукты

∆Gne ndash положительная величина отражающая образование и разрыв связей ∆GS - отрицательная величина отражающая использование энергии связывания

Фермент и субстрат Фермент и субстрат комплементарныкомплементарны когда каждая взаимодействующая группа когда каждая взаимодействующая группа

субстрата контактирует с субстрата контактирует с соответствующим центром связывания соответствующим центром связывания

фермента и энергия связывания фермента и энергия связывания принимает максимальное значениепринимает максимальное значение

Комплементарность фермента исходному Комплементарность фермента исходному субстратусубстрату

Допустим максимальная внутренняя свободная энергия связывания равна ∆Gb В рассмотренном случае она реализуется в исходном фермент-субстратном комплексе обеспечивая прочное связывание КM - константа диссоциации фермент-субстратного комплекса ndash будет мала Образование переходного состояния будет сопровождаться изменением геометрии субстрата и ухудшением его соответствия что приведет к уменьшению энергии связывания ∆GR ndash увеличение свободной энергии вызванное ухудшением структурного соответствия между ферментом и субстратом ∆G0 ndash свободная энергия активации для образования и разрыва химических связей на стадии определяемой константой kcatНаблюдаемая свободная энергия активации для стадии химического превращения субстрата с константой скорости kcat равна∆Gne=∆G0

ne+∆GR и∆GS=∆Gb

Энергия активации Гиббса для процесса

∆GТne=∆G0

ne+∆GR+∆Gb

Пунктирная линия ndash фермент структурно комплементарен субстрату сплошная ndash переходному состоянию (∆GS = ∆Gb - отрицательная величина ∆G0 и ∆GR ndash положительны)

График изменения энергии ГиббсаГрафик изменения энергии Гиббса

E + S ES продукты

Полная энергия связывания ∆Gb реализуется в переходном состоянии Исходному фермент-субстратному комплексу соответствует положительный член ∆GR который отражает возрастание энергии за счет структурного несоответствия исходного состояния переходному Этот член увеличивает КМ а прирост энергии связывания по мере приближения к переходному состоянию увеличивает kcat∆Gne = ∆G0

ne - ∆GR

∆GS = ∆Gb + ∆GR

Энергия активации Гиббса для перехода характеризующегося константой kcatKM

∆GТne=∆G ne + ∆GS = ∆G0

ne + ∆Gb

∆GR из конечного уравнения исключается

Когда фермент комплементарен переходному состоянию субстрата а не самому субстрату kcatKM возрастает в exp(∆GRRT) раз kcatKM не зависит от взаимодействий в исходном фермент-субстратном комплексе поскольку член ∆GR не входит в уравнение

Комплементарность фермента переходному Комплементарность фермента переходному состоянию субстратасостоянию субстрата

Наличие сильного связывания фермента с субстратом или Наличие сильного связывания фермента с субстратом или низкое значение Книзкое значение КМ М не является необходимым условием не является необходимым условием

протекания ферментативной реакции Для катализа важны протекания ферментативной реакции Для катализа важны высокие значения Квысокие значения КММ

Процесс эволюции ферментов направленный на увеличение Процесс эволюции ферментов направленный на увеличение скорости катализируемых ими реакций можно разделить на два скорости катализируемых ими реакций можно разделить на два этапаэтапа

11 Увеличение Увеличение kkcatcatKKMM за счет повышения комплементарности фермента за счет повышения комплементарности фермента переходному состоянию субстратапереходному состоянию субстрата

22 Увеличение концентрации фермента за счет повышения КУвеличение концентрации фермента за счет повышения КММ направленное на то чтобы в свободном состоянии находилось направленное на то чтобы в свободном состоянии находилось максимально возможное количество ферментамаксимально возможное количество фермента

Исключение ndash ферменты которые выполняют регуляторные функцииИх активность регулируется путем изменения КМ субстратов через

аллостерическое воздействие

Модель laquoключ-замокraquoМодель laquoключ-замокraquo

Теория комплементарности при фермент-субстратном взаимодействии принадлежит Э Фишеру воплотившему ее в модели laquoключ-замокraquo В 1890 г Э Фишер предложил модель согласно которой специфичность ферментов определяется точным соответствием формы фермента и субстрата Однако хотя эта модель объясняла высокую специфичность ферментов она не объясняла явления стабилизации переходного состояния которое наблюдается на практике

Герман Эмиль ФишерГерман Эмиль Фишер1852 Ойскирхен ndash 1919 Берлин1852 Ойскирхен ndash 1919 Берлин

Немецкий химик-органик и Немецкий химик-органик и биохимикбиохимик

Нобелевская премияпо химии 1902 г

Концепция деформацииКонцепция деформации(ДжБС Холдейн и Л Полинг)(ДжБС Холдейн и Л Полинг)

Активный центр фермента структурно комплементарен не самому субстрату а переходному состоянию При связывании с ферментом переходное состояние субстрата взаимодействует с ферментом более эффективно чем сам субстрат и поэтому полная энергия связывания не реализуется до тех пор пока не сформируется переходное состояние

Лайнус Карл ПолингЛайнус Карл Полинг1901 Портленд ndash 1994 Биг-Сюр1901 Портленд ndash 1994 Биг-Сюр

американский химикамериканский химикНобелевская премия

по химии 1954 г и мира 1962 г

Теория индуцированного Теория индуцированного соответствиясоответствия

Объясняет отсутствие ферментативной активности с небольшими субстратами такими как вода в которых нет групп способных обеспечить связывание и энергию для приведения фермента в активное состояние Является модификацией модели laquoключ-замокraquo - модель laquoрука-перчаткаraquo Предполагается что в отсутствии субстрата фермент структурно некомплементарен переходному состоянию Однако поскольку молекула фермента довольно гибкая а субстрат имеет жесткую структуру при образовании фермент-субстратного комплекса каталитические группы на ферменте ориентируются оптимальным для катализа образом фермент становится комплементарным переходному состоянию только после связывания субстрата Перестройка области активного центра при связывании с субстратом названа процессом конформационной адаптации

Дэниэл Эдвард КошландДэниэл Эдвард Кошланд1920 Нью-Йорк ndash 1919 Калифорния1920 Нью-Йорк ndash 1919 Калифорния

американский биохимикамериканский биохимик

Гипотеза непродуктивного связыванияГипотеза непродуктивного связывания

Было предложено что помимо продуктивного связывания в активном центре возможны другие способы связывания когда небольшие субстраты связываются но не подвергаются каталитическому превращению

Например в молекуле лизоцима активный центр имеет протяженную структуру состоящую из шести центров связывания ndash A B C D E F Для осуществления реакции необходимо чтобы молекула субстрата заняла центры D и Е Небольшие субстраты способны присоединяться с любой сторону вдоль вытянутого активного центра лизоцима не связываясь с подцентром где происходит расщепление

ДеформацияДеформация вносит положительный вклад в катализ вносит положительный вклад в катализ при условии комплементарности фермента при условии комплементарности фермента переходному состоянию субстрата увеличивая переходному состоянию субстрата увеличивая kkcatcat и и KKMM что приводит к увеличению скорости реакции что приводит к увеличению скорости реакции

ИндуцированноеИндуцированное соответствиесоответствие уменьшает уменьшает эффективность катализа увеличивая эффективность катализа увеличивая KKMM без без соответствующего увеличения соответствующего увеличения kkcatcat по сравнению с по сравнению с ферментом находящимся в кативной форме в ферментом находящимся в кативной форме в отсутствие субстрата отсутствие субстрата

Механизм непродуктивного связыванияМеханизм непродуктивного связывания не не затрагивает каталитического превращения затрагивает каталитического превращения специфических субстратов однако он приводит к специфических субстратов однако он приводит к появлению дополнительных связывающих центров для появлению дополнительных связывающих центров для конкурирующих между собой неспецифических конкурирующих между собой неспецифических субстратовсубстратов

Специфичность ферментаСпецифичность фермента

Способность фермента узнавать Способность фермента узнавать определенный субстрат из нескольких определенный субстрат из нескольких

конкурирующих за активный центрконкурирующих за активный центр

Функция слагающаяся из прочности связывания Функция слагающаяся из прочности связывания

каждого из субстратов и кинетической каждого из субстратов и кинетической

(каталитической) специфичности (каталитической) специфичности

характеризующейся скоростью катализахарактеризующейся скоростью катализа

laquoСуммарнаяraquo специфичность характеризуется laquoСуммарнаяraquo специфичность характеризуется

отношением отношением kkcatcatKKMM

Специфичность и относительная Специфичность и относительная реакционная способностьреакционная способность

Центральная проблема специфичности Центральная проблема специфичности каким образом фермент отличает специфический каким образом фермент отличает специфический субстрат от другого меньшего или равного ему по субстрат от другого меньшего или равного ему по размерам (изостерического) субстратаразмерам (изостерического) субстрата

Такую задачу постоянно решают аминоацил-тРНК-синтетазы Если синтетаза (ЕХ) ошибочно активирует чужую аминокислоту (Y) и далее катализирует ее перенос на laquoсвоюraquo тРНКХ

или если она ошибочно этерифицирует истинной субстратной аминокислотой Х чужую тРНК

то каждое из этих событий приведет к ошибке в последовательности синтезируемой полипептидной цепи

Дискриминация аминокислот меньших или изостеричных (равных по размеру) специфическому субстрату способных разместиться в активном центре фермента определяется предпочтительным связыванием истинного субстрата за счет незначительных различий в структуре

Валил-тРНК-синтетаза

Наличие разницы в энергии связывания не до конца обеспечивает Наличие разницы в энергии связывания не до конца обеспечивает в этих случаях точность работы системы аминоацилированияв этих случаях точность работы системы аминоацилирования

валин

Изолейцил-тРНК-синтетаза

изолейцин валин треонин

Треонин связывается с валил-тРНК синтетазой в 100-200 раз слабее валина несмотря на то что он изостеричен валину поскольку в гидрофобный карман погружается гидроксильная группа вместо метиленовой Энергия активации реакции представляет собой сумму двух составляющих одна из них ndash энергия активации для стадии химического превращения а вторая ndash энергия связывания фермента с субстратом

Валил-тРНК-синтетаза

валин треонин

Различие в энергии связывания специфичного субстрата (Различие в энергии связывания специфичного субстрата (RSRS) и ) и меньшего по размерам конкурирующего соединения меньшего по размерам конкурирующего соединения HSHS равно равно дополнительной энергии связывания группы дополнительной энергии связывания группы RR имеющейся у имеющейся у специфичного субстрата и отсутствующей у меньшего специфичного субстрата и отсутствующей у меньшего субстрата по отношению к водороду субстрата по отношению к водороду

Поскольку энергия взаимодействия группы R не только входит в энергию связывания но и понижает энергию активации стадии химического превращения вклад заместителя R следует оценивать из сравнения параметров kcatKM для двух субстратов RS и HS Например если величину kcat для валина для активации валил-тРНК-синтетазой принять за 1 то для других аминокислот эта величина будет для аланина 003 для изолейцина 00019 для серина 005

Дополнительную энергию связывания группы Дополнительную энергию связывания группы RR по отношению к по отношению к водороду можно определить по формулеводороду можно определить по формуле

∆Gb=RTln(kcatKM)RS ln(kcatKM)HS

Для пары изолейцил-тРНК-синтетаза-валин неспецифический субстрат по критерию kcatKM хуже в 140-200 раз В клетках EColi [Ile][Val] = 018 Уровень ошибок изолейцил-тРНК-синтетазы на стадии активации 003-004 Экспериментально обнаружено уровень ошибок при замене Ile на Val в биосинтезе овальбумина цыпленка и гемоглобина кролика равен 310-4

Изолейцил-тРНК-синтетаза

изолейцин валин

Чему соответствует этот уровень ошибокЧему соответствует этот уровень ошибок

Ошибочное включение одной аминокислоты на Ошибочное включение одной аминокислоты на каждые 10000 остатковкаждые 10000 остатков

Одна из 20 белковых молекул длиной в 500 остатков Одна из 20 белковых молекул длиной в 500 остатков будет содержать единственную ошибочную будет содержать единственную ошибочную

аминокислотуаминокислоту

Предположив что только около 10 всех ошибок Предположив что только около 10 всех ошибок серьезно сказываются на биологической функции серьезно сказываются на биологической функции

белка можно сделать заключение что одна белка можно сделать заключение что одна молекула белка из 200 синтезированных окажется молекула белка из 200 синтезированных окажется

бесполезной (или даже вредной) в клеточном бесполезной (или даже вредной) в клеточном метаболизмеметаболизме

Коррекция ошибок в реакциях катализируемых

аминоацил-тРНК- синтетазами

Существование механизмов Существование механизмов коррекции для аминоацил-коррекции для аминоацил-

тРНК-синтетазтРНК-синтетаз

Поль Наим БергПоль Наим Берг19219266 Бруклин СШАБруклин США

Американский биохимикАмериканский биохимикНобелевская премия

по химии 1980 г

Изолейцил-тРНК-синтетаза ошибочно активирует валин Добавление тРНК к комплексу с изолейциладенилатом приводит к образованию изолейцил-тРНК а у валиладенилат-ферментного комплекса не наблюдается образование валил-тРНК поскольку при добавлении тРНК происходит гидролиз ошибочного аминоациладенилата

Существование механизмов коррекции для Существование механизмов коррекции для аминоацил-тРНК-синтетазаминоацил-тРНК-синтетаз

В присутствии тРНКВ присутствии тРНКIleIle изолейцил-тРНК-синтетаза изолейцил-тРНК-синтетаза непроизводительно гидролизует АТР АМР + непроизводительно гидролизует АТР АМР + ppppii

ИзбыточныйИзбыточный гидролиз АТРгидролиз АТР по отношению к по отношению к синтезированному продукту за счет АТР-синтезированному продукту за счет АТР-пирофосфогидролазной активности синтетазы пирофосфогидролазной активности синтетазы является является критерием существования корректирующего механизмакритерием существования корректирующего механизма включающего дополнительную стадию разрушения ошибочного включающего дополнительную стадию разрушения ошибочного продукта реакции продукта реакции

У цистеинил- и тирозил-тРНК-синтетаз специфичность высокая У цистеинил- и тирозил-тРНК-синтетаз специфичность высокая и гидролиза АТР не наблюдается и гидролиза АТР не наблюдается

В некоторых случаях когда дискриминация аминокислот на В некоторых случаях когда дискриминация аминокислот на стадии активации была недостаточной наблюдался быстрый стадии активации была недостаточной наблюдался быстрый гидролиз ошибочного аминоациладенилата вместо переноса гидролиз ошибочного аминоациладенилата вместо переноса laquoнеправильнойraquo аминокислоты на субстратную тРНКlaquoнеправильнойraquo аминокислоты на субстратную тРНК

Роль тРНК в коррекцииРоль тРНК в коррекции

Индуцирует ли тРНК гидролиз аминоациладенилата или же служит акцептором ошибочно активированной аминокислоты а затем подвергается ферментативному деацилированию

Возможные последовательности реакций катализируемых синтетазами можно записать в виде следующей схемы (АК-аминокислота)

Роль тРНК в коррекцииРоль тРНК в коррекции

Предложенные механизмы коррекции можно разделить на две группы в зависимости от того какое соединение в них гидролизуется Механизм отбраковки ошибочной аминокислоты (Механизм отбраковки ошибочной аминокислоты (стадии 1

2 5 ndash гидролиз аминоацил-тРНК) Механизм коррекции за счет гидролиза промежуточного Механизм коррекции за счет гидролиза промежуточного

аминоациладенилата (аминоациладенилата (стадии 1 и 4 ndash гидролиз аминоациладенилата)

В каждом из возможных маршрутов коррекции исправление ошибки достигается благодаря введению в реакционный путь laquoнеобратимогоraquo ответвления (реакции 4 или 5) обеспечивающего гидролиз нежелательных соединений

Механизм отбраковки ошибочной аминокислотыМеханизм отбраковки ошибочной аминокислоты

Доказательство существования механизма гидролиза аминоацил-тРНК аминоацил-тРНК-синтетазами было получено при изучении аминоацилирования тРНКVal треонином катализируемого валил-тРНК-синтетазой из BStearothermophilus

Валил-тРНК-синтетаза образует с треонином стабильный комплекс Валил-тРНК-синтетаза образует с треонином стабильный комплекс который быстро гидролизуется при добавлении тРНКкоторый быстро гидролизуется при добавлении тРНКValVal

Предшествует ли гидролизу перенос аминоацильного остатка на тРНКПредшествует ли гидролизу перенос аминоацильного остатка на тРНКValVal

Импульсный метод laquoзамороженнойraquo струиКомплекс [14С]-треонил-АМРЕVal + тРНК [14С]-треонил-тРНК

Константа гидролиза треонил-тРНК в присутствии валил-тРНК-синтетазы 40 сКонстанта гидролиза треонил-тРНК в присутствии валил-тРНК-синтетазы 40 с -1-1а для специфичной валил-тРНК 0015 са для специфичной валил-тРНК 0015 с-1-1 то есть более чем в 2000 раз ниже то есть более чем в 2000 раз ниже

Механизм коррекции за счет гидролиза Механизм коррекции за счет гидролиза промежуточного аминоациладенилатапромежуточного аминоациладенилата

Ошибочное промежуточное соединение образующееся в ходе реакции диссоциирует с фермента и гиролизуется быстрее чем правильное Для правильного аминоациладенилата скорость переноса на тРНК выше чем диссоциация те коррекция определяется соотношением кинетических констант определенных стадий

Джон Джозеф ХопфилдДжон Джозеф Хопфилд1933 Чикаго США1933 Чикаго США

биофизик и биофизик и молекулярный биологмолекулярный биолог

Механизм кинетического корректированияМеханизм кинетического корректирования

Механизм коррекции за счет гидролиза Механизм коррекции за счет гидролиза промежуточного аминоациладенилатапромежуточного аминоациладенилата

Экспериментальное доказательствоЭкспериментальное доказательствоДля валил-тРНК-синтетазы из желтого люпина в отсутствие тРНК наблюдался гидролиз

АТР АМР + ppi зависящий от присутствия несубстратных аминокислот (Cys Thr Ser и α-аминомасляной кислоты)

Константа скорости гидролиза для этих кислот 07-13 мин-1 Специфический валиладенилат-ферментный комплекс гидролизуется с константой скорости 0018 мин-1 те например в 720 раз медленнее чем комплекс валил-тРНК-синтетазы с цистеинил-аденилатом

Коррекция ошибок в реакциях Коррекция ошибок в реакциях катализируемыхкатализируемых

ДНК-полимеразамиДНК-полимеразами

Механизм коррекции при репликации ДНКМеханизм коррекции при репликации ДНК

При синтезе ДНК ошибка исправляется после полимеризации Молекула ДНК синтезируется в направлении 5rsquo-3rsquo нуклеотиды присоединяются к 3rsquo-гидроксильной группе растущей цепи ДНК

Репликативные ДНК-полимеразы обладают Репликативные ДНК-полимеразы обладают корректирующей 3rsquo-5rsquo-экзонуклеазной активностью корректирующей 3rsquo-5rsquo-экзонуклеазной активностью

выщепляющей из цепи ошибочно встроенный нуклеотидвыщепляющей из цепи ошибочно встроенный нуклеотид

Частота мутации фага Т4 коррелирует с экзонуклеазной активностью проявляемой ДНК-полимеразой Частота мутации для ЕСoli составляет 10-6-10-8 и следовательно точность репликации ДНК либо равна этим величинам либо еще выше

Механизм коррекции при репликации ДНКМеханизм коррекции при репликации ДНК

С помощью экзонуклеазной активности исправляются ошибки которые накапливаются в процессе биосинтеза Однако нарушения структуры ДНК могут возникать не только по причине неточной работы в ходе синтеза но и в результате внешних воздействий таких как ионизирующее и ультрафиолетовое облучение окислительный стресс

Возможна различная пострепликационная коррекция структуры ДНКВозможна различная пострепликационная коррекция структуры ДНК(репарация)(репарация)

Система репарации ошибочно-встроенных нуклеотидов (Система репарации ошибочно-встроенных нуклеотидов (mismatch mismatch repairrepair) специально предназначена для удаления ошибок возникших в ) специально предназначена для удаления ошибок возникших в ДНК в ходе репликацииДНК в ходе репликации

Система эксцизионной репарации оснований исправляет повреждения в Система эксцизионной репарации оснований исправляет повреждения в ДНК возникающие в результате окислительного стресса то есть ДНК возникающие в результате окислительного стресса то есть модифицированные (окисленные) основания и разрывы в одной из цепей модифицированные (окисленные) основания и разрывы в одной из цепей ДНКДНК

Система эксцизионной репарации нуклеотидов удаляет из ДНК объемные Система эксцизионной репарации нуклеотидов удаляет из ДНК объемные повреждения фотодимеры возникающие под действием повреждения фотодимеры возникающие под действием ультрафиолетового облучения объемные аддукты метаболитов ультрафиолетового облучения объемные аддукты метаболитов попадающих из окружающей среды таких как продукты сгорания курения попадающих из окружающей среды таких как продукты сгорания курения например антрацены и бензапиренынапример антрацены и бензапирены

Синтез ДНК через повреждениеСинтез ДНК через повреждение((Translesion synthesisTranslesion synthesis ndash TLS)ndash TLS)

В случае синтеза с использованием поврежденной ДНК-матрицы транслезионными (translesion) ДНК-полимеразами (например η ι κ θ μ ζ) также возникают искажения в структуре ДНК

TLS ДНК-полимеразы ведущие синтез через повреждение матрицы не обладают корректирующей активностью поскольку их задачей является ввести во чтобы то ни стало нуклеотидное звено дабы избежать остановки репликативной вилки на повреждении матрицы Затем поврежденный участок ДНК восстанавливается системами репарации

Мутации вводимые репликативными Мутации вводимые репликативными ДНК-полимеразами в ходе репликативного синтеза ДНК-полимеразами в ходе репликативного синтеза

играют не только вредную рольиграют не только вредную роль Мутации в ДНК являются движущей Мутации в ДНК являются движущей

силой эволюциисилой эволюции

• Slide 1
• Slide 2
• Slide 3
• Slide 4
• Slide 5
• Slide 6
• Slide 7
• Slide 8
• Slide 9
• Slide 10
• Slide 11
• Slide 12
• Slide 13
• Slide 14
• Slide 15
• Slide 16
• Slide 17
• Slide 18
• Slide 19
• Slide 20
• Slide 21
• Slide 22
• Slide 23
• Slide 24
• Slide 25
• Slide 26
• Slide 27
• Slide 28
• Slide 29
• Slide 30
• Slide 31
• Slide 32
• Slide 33
• Slide 34
• Slide 35
• Slide 36
• Slide 37
• Slide 38
• Slide 39
• Slide 40
• Slide 41

График изменения энергии Гиббса График изменения энергии Гиббса в ходе реакциив ходе реакции

Состояние 1 ndash переходное состояние (ESne) Состояние 2 ndash промежуточное состояние

В переходном состоянии химические связи непрерывно образуются и разрываются Соединениям со стабильными химическими связями соответствуют минимумы на графике Допущение о существовании термодинамического равновесия между основным и переходным состоянием используется для расчета скорости реакции В этом случае концентрацию переходного состояния можно рассчитать из разности энергии этих состояний Общую скорость реакции получают умножением концентрации переходного комплекса и константы скорости его распада

Для мономолекулярной реакцииРазность энергий Гиббса для переходного (Хne) и основного (Х) состояний равна ∆Gne Воспользуемся известным соотношением равновесной термодинамики∆Gne = -RT lnK [Хne]=[X]exp(-∆GneRT)

Частота распада переходного комплекса = частота колебаний разрываемой связиЧастота распада переходного комплекса = частота колебаний разрываемой связи

Частота получена из равенства энергий возбужденного осциллятора рассчитанных на основе квантовой теории (E=hω) и классической физики (Е=kT) где h ndash постоянная Планка ω ndash частота колебаний k ndash постоянная Больцмана ωω==kTkThh Скорость распада молекул Х определяется уравнением

exp(-∆GneRT)

Константа скорости первого порядка для распада молекул Х равна

k1= exp(-∆GneRT)

Энергия активации Гиббса ∆Gne может быть подразделена на энтальпийную и энтропийную составляющие ∆Gne =∆Нne -Т∆Sne

k1= exp(-∆HneRT) exp(∆SneR)

h

kT]X[]X[

dt

d[X]

h

kT

h

kT

Применение теории переходного состояния для Применение теории переходного состояния для анализа механизмов ферментативного катализаанализа механизмов ферментативного катализа

В случае простого механизма Михаэлиса-Ментен (КВ случае простого механизма Михаэлиса-Ментен (КSS=К=КMM) ) энергия связывания уменьшает энергию активации перехода энергия связывания уменьшает энергию активации перехода определяемого кажущейся константой скорости второго определяемого кажущейся константой скорости второго порядка порядка kkcatcatKKMMСмысл параметра kcatKM где kcat - число оборотов реакции поскольку эта величина определяет максимальное число молекул субстрата превращаемых в продукт одним активным центром в единицу времениndash KM в простейшем варианте можно рассматривать как кажущуюся константу диссоциации v=kcat[E](1+KM[S]) ndash При малых концентрациях субстрата v=kcatKM[E][S] то есть kcatKM представляет собой кажущуюся константу скорости второго порядка Ценность параметра kcatKM в том что он связывает скорость реакций с концентрацией свободного фермента а не с его общей концентрацией Это справедливо для низкой концентрации субстрата тк при [Е]asymp[Е0]

KM=KD= [ES]

]S][E[

RTln(kcatKM)=RTln(kTH) - ∆Gne-∆GS

Константа скорости для взаимодействия свободного фермента со свободным субстратом с образованием продуктов равна kcatKM В терминах теории переходного состояния константа равновесия для второй реакции пропорциональна энергии активации ∆GТ

ne

k1= exp(-∆GneRT)h

kT

∆GТne=∆Gne+∆GS

∆Gne ndash положительная величина отражающая энергию активации химических стадий в ходе которых происходит образование и разрыв связей ∆GS - отрицательная величина отражающая использование энергии связывания

Изменение энергии Гиббса для реакцииИзменение энергии Гиббса для реакции

E + S ES продукты

∆Gne ndash положительная величина отражающая образование и разрыв связей ∆GS - отрицательная величина отражающая использование энергии связывания

Фермент и субстрат Фермент и субстрат комплементарныкомплементарны когда каждая взаимодействующая группа когда каждая взаимодействующая группа

субстрата контактирует с субстрата контактирует с соответствующим центром связывания соответствующим центром связывания

фермента и энергия связывания фермента и энергия связывания принимает максимальное значениепринимает максимальное значение

Комплементарность фермента исходному Комплементарность фермента исходному субстратусубстрату

Допустим максимальная внутренняя свободная энергия связывания равна ∆Gb В рассмотренном случае она реализуется в исходном фермент-субстратном комплексе обеспечивая прочное связывание КM - константа диссоциации фермент-субстратного комплекса ndash будет мала Образование переходного состояния будет сопровождаться изменением геометрии субстрата и ухудшением его соответствия что приведет к уменьшению энергии связывания ∆GR ndash увеличение свободной энергии вызванное ухудшением структурного соответствия между ферментом и субстратом ∆G0 ndash свободная энергия активации для образования и разрыва химических связей на стадии определяемой константой kcatНаблюдаемая свободная энергия активации для стадии химического превращения субстрата с константой скорости kcat равна∆Gne=∆G0

ne+∆GR и∆GS=∆Gb

Энергия активации Гиббса для процесса

∆GТne=∆G0

ne+∆GR+∆Gb

Пунктирная линия ndash фермент структурно комплементарен субстрату сплошная ndash переходному состоянию (∆GS = ∆Gb - отрицательная величина ∆G0 и ∆GR ndash положительны)

График изменения энергии ГиббсаГрафик изменения энергии Гиббса

E + S ES продукты

Полная энергия связывания ∆Gb реализуется в переходном состоянии Исходному фермент-субстратному комплексу соответствует положительный член ∆GR который отражает возрастание энергии за счет структурного несоответствия исходного состояния переходному Этот член увеличивает КМ а прирост энергии связывания по мере приближения к переходному состоянию увеличивает kcat∆Gne = ∆G0

ne - ∆GR

∆GS = ∆Gb + ∆GR

Энергия активации Гиббса для перехода характеризующегося константой kcatKM

∆GТne=∆G ne + ∆GS = ∆G0

ne + ∆Gb

∆GR из конечного уравнения исключается

Когда фермент комплементарен переходному состоянию субстрата а не самому субстрату kcatKM возрастает в exp(∆GRRT) раз kcatKM не зависит от взаимодействий в исходном фермент-субстратном комплексе поскольку член ∆GR не входит в уравнение

Комплементарность фермента переходному Комплементарность фермента переходному состоянию субстратасостоянию субстрата

Наличие сильного связывания фермента с субстратом или Наличие сильного связывания фермента с субстратом или низкое значение Книзкое значение КМ М не является необходимым условием не является необходимым условием

протекания ферментативной реакции Для катализа важны протекания ферментативной реакции Для катализа важны высокие значения Квысокие значения КММ

Процесс эволюции ферментов направленный на увеличение Процесс эволюции ферментов направленный на увеличение скорости катализируемых ими реакций можно разделить на два скорости катализируемых ими реакций можно разделить на два этапаэтапа

11 Увеличение Увеличение kkcatcatKKMM за счет повышения комплементарности фермента за счет повышения комплементарности фермента переходному состоянию субстратапереходному состоянию субстрата

22 Увеличение концентрации фермента за счет повышения КУвеличение концентрации фермента за счет повышения КММ направленное на то чтобы в свободном состоянии находилось направленное на то чтобы в свободном состоянии находилось максимально возможное количество ферментамаксимально возможное количество фермента

Исключение ndash ферменты которые выполняют регуляторные функцииИх активность регулируется путем изменения КМ субстратов через

аллостерическое воздействие

Модель laquoключ-замокraquoМодель laquoключ-замокraquo

Теория комплементарности при фермент-субстратном взаимодействии принадлежит Э Фишеру воплотившему ее в модели laquoключ-замокraquo В 1890 г Э Фишер предложил модель согласно которой специфичность ферментов определяется точным соответствием формы фермента и субстрата Однако хотя эта модель объясняла высокую специфичность ферментов она не объясняла явления стабилизации переходного состояния которое наблюдается на практике

Герман Эмиль ФишерГерман Эмиль Фишер1852 Ойскирхен ndash 1919 Берлин1852 Ойскирхен ndash 1919 Берлин

Немецкий химик-органик и Немецкий химик-органик и биохимикбиохимик

Нобелевская премияпо химии 1902 г

Концепция деформацииКонцепция деформации(ДжБС Холдейн и Л Полинг)(ДжБС Холдейн и Л Полинг)

Активный центр фермента структурно комплементарен не самому субстрату а переходному состоянию При связывании с ферментом переходное состояние субстрата взаимодействует с ферментом более эффективно чем сам субстрат и поэтому полная энергия связывания не реализуется до тех пор пока не сформируется переходное состояние

Лайнус Карл ПолингЛайнус Карл Полинг1901 Портленд ndash 1994 Биг-Сюр1901 Портленд ndash 1994 Биг-Сюр

американский химикамериканский химикНобелевская премия

по химии 1954 г и мира 1962 г

Теория индуцированного Теория индуцированного соответствиясоответствия

Объясняет отсутствие ферментативной активности с небольшими субстратами такими как вода в которых нет групп способных обеспечить связывание и энергию для приведения фермента в активное состояние Является модификацией модели laquoключ-замокraquo - модель laquoрука-перчаткаraquo Предполагается что в отсутствии субстрата фермент структурно некомплементарен переходному состоянию Однако поскольку молекула фермента довольно гибкая а субстрат имеет жесткую структуру при образовании фермент-субстратного комплекса каталитические группы на ферменте ориентируются оптимальным для катализа образом фермент становится комплементарным переходному состоянию только после связывания субстрата Перестройка области активного центра при связывании с субстратом названа процессом конформационной адаптации

Дэниэл Эдвард КошландДэниэл Эдвард Кошланд1920 Нью-Йорк ndash 1919 Калифорния1920 Нью-Йорк ndash 1919 Калифорния

американский биохимикамериканский биохимик

Гипотеза непродуктивного связыванияГипотеза непродуктивного связывания

Было предложено что помимо продуктивного связывания в активном центре возможны другие способы связывания когда небольшие субстраты связываются но не подвергаются каталитическому превращению

Например в молекуле лизоцима активный центр имеет протяженную структуру состоящую из шести центров связывания ndash A B C D E F Для осуществления реакции необходимо чтобы молекула субстрата заняла центры D и Е Небольшие субстраты способны присоединяться с любой сторону вдоль вытянутого активного центра лизоцима не связываясь с подцентром где происходит расщепление

ДеформацияДеформация вносит положительный вклад в катализ вносит положительный вклад в катализ при условии комплементарности фермента при условии комплементарности фермента переходному состоянию субстрата увеличивая переходному состоянию субстрата увеличивая kkcatcat и и KKMM что приводит к увеличению скорости реакции что приводит к увеличению скорости реакции

ИндуцированноеИндуцированное соответствиесоответствие уменьшает уменьшает эффективность катализа увеличивая эффективность катализа увеличивая KKMM без без соответствующего увеличения соответствующего увеличения kkcatcat по сравнению с по сравнению с ферментом находящимся в кативной форме в ферментом находящимся в кативной форме в отсутствие субстрата отсутствие субстрата

Механизм непродуктивного связыванияМеханизм непродуктивного связывания не не затрагивает каталитического превращения затрагивает каталитического превращения специфических субстратов однако он приводит к специфических субстратов однако он приводит к появлению дополнительных связывающих центров для появлению дополнительных связывающих центров для конкурирующих между собой неспецифических конкурирующих между собой неспецифических субстратовсубстратов

Специфичность ферментаСпецифичность фермента

Способность фермента узнавать Способность фермента узнавать определенный субстрат из нескольких определенный субстрат из нескольких

конкурирующих за активный центрконкурирующих за активный центр

Функция слагающаяся из прочности связывания Функция слагающаяся из прочности связывания

каждого из субстратов и кинетической каждого из субстратов и кинетической

(каталитической) специфичности (каталитической) специфичности

характеризующейся скоростью катализахарактеризующейся скоростью катализа

laquoСуммарнаяraquo специфичность характеризуется laquoСуммарнаяraquo специфичность характеризуется

отношением отношением kkcatcatKKMM

Специфичность и относительная Специфичность и относительная реакционная способностьреакционная способность

Центральная проблема специфичности Центральная проблема специфичности каким образом фермент отличает специфический каким образом фермент отличает специфический субстрат от другого меньшего или равного ему по субстрат от другого меньшего или равного ему по размерам (изостерического) субстратаразмерам (изостерического) субстрата

Такую задачу постоянно решают аминоацил-тРНК-синтетазы Если синтетаза (ЕХ) ошибочно активирует чужую аминокислоту (Y) и далее катализирует ее перенос на laquoсвоюraquo тРНКХ

или если она ошибочно этерифицирует истинной субстратной аминокислотой Х чужую тРНК

то каждое из этих событий приведет к ошибке в последовательности синтезируемой полипептидной цепи

Дискриминация аминокислот меньших или изостеричных (равных по размеру) специфическому субстрату способных разместиться в активном центре фермента определяется предпочтительным связыванием истинного субстрата за счет незначительных различий в структуре

Валил-тРНК-синтетаза

Наличие разницы в энергии связывания не до конца обеспечивает Наличие разницы в энергии связывания не до конца обеспечивает в этих случаях точность работы системы аминоацилированияв этих случаях точность работы системы аминоацилирования

валин

Изолейцил-тРНК-синтетаза

изолейцин валин треонин

Треонин связывается с валил-тРНК синтетазой в 100-200 раз слабее валина несмотря на то что он изостеричен валину поскольку в гидрофобный карман погружается гидроксильная группа вместо метиленовой Энергия активации реакции представляет собой сумму двух составляющих одна из них ndash энергия активации для стадии химического превращения а вторая ndash энергия связывания фермента с субстратом

Валил-тРНК-синтетаза

валин треонин

Различие в энергии связывания специфичного субстрата (Различие в энергии связывания специфичного субстрата (RSRS) и ) и меньшего по размерам конкурирующего соединения меньшего по размерам конкурирующего соединения HSHS равно равно дополнительной энергии связывания группы дополнительной энергии связывания группы RR имеющейся у имеющейся у специфичного субстрата и отсутствующей у меньшего специфичного субстрата и отсутствующей у меньшего субстрата по отношению к водороду субстрата по отношению к водороду

Поскольку энергия взаимодействия группы R не только входит в энергию связывания но и понижает энергию активации стадии химического превращения вклад заместителя R следует оценивать из сравнения параметров kcatKM для двух субстратов RS и HS Например если величину kcat для валина для активации валил-тРНК-синтетазой принять за 1 то для других аминокислот эта величина будет для аланина 003 для изолейцина 00019 для серина 005

Дополнительную энергию связывания группы Дополнительную энергию связывания группы RR по отношению к по отношению к водороду можно определить по формулеводороду можно определить по формуле

∆Gb=RTln(kcatKM)RS ln(kcatKM)HS

Для пары изолейцил-тРНК-синтетаза-валин неспецифический субстрат по критерию kcatKM хуже в 140-200 раз В клетках EColi [Ile][Val] = 018 Уровень ошибок изолейцил-тРНК-синтетазы на стадии активации 003-004 Экспериментально обнаружено уровень ошибок при замене Ile на Val в биосинтезе овальбумина цыпленка и гемоглобина кролика равен 310-4

Изолейцил-тРНК-синтетаза

изолейцин валин

Чему соответствует этот уровень ошибокЧему соответствует этот уровень ошибок

Ошибочное включение одной аминокислоты на Ошибочное включение одной аминокислоты на каждые 10000 остатковкаждые 10000 остатков

Одна из 20 белковых молекул длиной в 500 остатков Одна из 20 белковых молекул длиной в 500 остатков будет содержать единственную ошибочную будет содержать единственную ошибочную

аминокислотуаминокислоту

Предположив что только около 10 всех ошибок Предположив что только около 10 всех ошибок серьезно сказываются на биологической функции серьезно сказываются на биологической функции

белка можно сделать заключение что одна белка можно сделать заключение что одна молекула белка из 200 синтезированных окажется молекула белка из 200 синтезированных окажется

бесполезной (или даже вредной) в клеточном бесполезной (или даже вредной) в клеточном метаболизмеметаболизме

Коррекция ошибок в реакциях катализируемых

аминоацил-тРНК- синтетазами

Существование механизмов Существование механизмов коррекции для аминоацил-коррекции для аминоацил-

тРНК-синтетазтРНК-синтетаз

Поль Наим БергПоль Наим Берг19219266 Бруклин СШАБруклин США

Американский биохимикАмериканский биохимикНобелевская премия

по химии 1980 г

Изолейцил-тРНК-синтетаза ошибочно активирует валин Добавление тРНК к комплексу с изолейциладенилатом приводит к образованию изолейцил-тРНК а у валиладенилат-ферментного комплекса не наблюдается образование валил-тРНК поскольку при добавлении тРНК происходит гидролиз ошибочного аминоациладенилата

Существование механизмов коррекции для Существование механизмов коррекции для аминоацил-тРНК-синтетазаминоацил-тРНК-синтетаз

В присутствии тРНКВ присутствии тРНКIleIle изолейцил-тРНК-синтетаза изолейцил-тРНК-синтетаза непроизводительно гидролизует АТР АМР + непроизводительно гидролизует АТР АМР + ppppii

ИзбыточныйИзбыточный гидролиз АТРгидролиз АТР по отношению к по отношению к синтезированному продукту за счет АТР-синтезированному продукту за счет АТР-пирофосфогидролазной активности синтетазы пирофосфогидролазной активности синтетазы является является критерием существования корректирующего механизмакритерием существования корректирующего механизма включающего дополнительную стадию разрушения ошибочного включающего дополнительную стадию разрушения ошибочного продукта реакции продукта реакции

У цистеинил- и тирозил-тРНК-синтетаз специфичность высокая У цистеинил- и тирозил-тРНК-синтетаз специфичность высокая и гидролиза АТР не наблюдается и гидролиза АТР не наблюдается

В некоторых случаях когда дискриминация аминокислот на В некоторых случаях когда дискриминация аминокислот на стадии активации была недостаточной наблюдался быстрый стадии активации была недостаточной наблюдался быстрый гидролиз ошибочного аминоациладенилата вместо переноса гидролиз ошибочного аминоациладенилата вместо переноса laquoнеправильнойraquo аминокислоты на субстратную тРНКlaquoнеправильнойraquo аминокислоты на субстратную тРНК

Роль тРНК в коррекцииРоль тРНК в коррекции

Индуцирует ли тРНК гидролиз аминоациладенилата или же служит акцептором ошибочно активированной аминокислоты а затем подвергается ферментативному деацилированию

Возможные последовательности реакций катализируемых синтетазами можно записать в виде следующей схемы (АК-аминокислота)

Роль тРНК в коррекцииРоль тРНК в коррекции

Предложенные механизмы коррекции можно разделить на две группы в зависимости от того какое соединение в них гидролизуется Механизм отбраковки ошибочной аминокислоты (Механизм отбраковки ошибочной аминокислоты (стадии 1

2 5 ndash гидролиз аминоацил-тРНК) Механизм коррекции за счет гидролиза промежуточного Механизм коррекции за счет гидролиза промежуточного

аминоациладенилата (аминоациладенилата (стадии 1 и 4 ndash гидролиз аминоациладенилата)

В каждом из возможных маршрутов коррекции исправление ошибки достигается благодаря введению в реакционный путь laquoнеобратимогоraquo ответвления (реакции 4 или 5) обеспечивающего гидролиз нежелательных соединений

Механизм отбраковки ошибочной аминокислотыМеханизм отбраковки ошибочной аминокислоты

Доказательство существования механизма гидролиза аминоацил-тРНК аминоацил-тРНК-синтетазами было получено при изучении аминоацилирования тРНКVal треонином катализируемого валил-тРНК-синтетазой из BStearothermophilus

Валил-тРНК-синтетаза образует с треонином стабильный комплекс Валил-тРНК-синтетаза образует с треонином стабильный комплекс который быстро гидролизуется при добавлении тРНКкоторый быстро гидролизуется при добавлении тРНКValVal

Предшествует ли гидролизу перенос аминоацильного остатка на тРНКПредшествует ли гидролизу перенос аминоацильного остатка на тРНКValVal

Импульсный метод laquoзамороженнойraquo струиКомплекс [14С]-треонил-АМРЕVal + тРНК [14С]-треонил-тРНК

Константа гидролиза треонил-тРНК в присутствии валил-тРНК-синтетазы 40 сКонстанта гидролиза треонил-тРНК в присутствии валил-тРНК-синтетазы 40 с -1-1а для специфичной валил-тРНК 0015 са для специфичной валил-тРНК 0015 с-1-1 то есть более чем в 2000 раз ниже то есть более чем в 2000 раз ниже

Механизм коррекции за счет гидролиза Механизм коррекции за счет гидролиза промежуточного аминоациладенилатапромежуточного аминоациладенилата

Ошибочное промежуточное соединение образующееся в ходе реакции диссоциирует с фермента и гиролизуется быстрее чем правильное Для правильного аминоациладенилата скорость переноса на тРНК выше чем диссоциация те коррекция определяется соотношением кинетических констант определенных стадий

Джон Джозеф ХопфилдДжон Джозеф Хопфилд1933 Чикаго США1933 Чикаго США

биофизик и биофизик и молекулярный биологмолекулярный биолог

Механизм кинетического корректированияМеханизм кинетического корректирования

Механизм коррекции за счет гидролиза Механизм коррекции за счет гидролиза промежуточного аминоациладенилатапромежуточного аминоациладенилата

Экспериментальное доказательствоЭкспериментальное доказательствоДля валил-тРНК-синтетазы из желтого люпина в отсутствие тРНК наблюдался гидролиз

АТР АМР + ppi зависящий от присутствия несубстратных аминокислот (Cys Thr Ser и α-аминомасляной кислоты)

Константа скорости гидролиза для этих кислот 07-13 мин-1 Специфический валиладенилат-ферментный комплекс гидролизуется с константой скорости 0018 мин-1 те например в 720 раз медленнее чем комплекс валил-тРНК-синтетазы с цистеинил-аденилатом

Коррекция ошибок в реакциях Коррекция ошибок в реакциях катализируемыхкатализируемых

ДНК-полимеразамиДНК-полимеразами

Механизм коррекции при репликации ДНКМеханизм коррекции при репликации ДНК

При синтезе ДНК ошибка исправляется после полимеризации Молекула ДНК синтезируется в направлении 5rsquo-3rsquo нуклеотиды присоединяются к 3rsquo-гидроксильной группе растущей цепи ДНК

Репликативные ДНК-полимеразы обладают Репликативные ДНК-полимеразы обладают корректирующей 3rsquo-5rsquo-экзонуклеазной активностью корректирующей 3rsquo-5rsquo-экзонуклеазной активностью

выщепляющей из цепи ошибочно встроенный нуклеотидвыщепляющей из цепи ошибочно встроенный нуклеотид

Частота мутации фага Т4 коррелирует с экзонуклеазной активностью проявляемой ДНК-полимеразой Частота мутации для ЕСoli составляет 10-6-10-8 и следовательно точность репликации ДНК либо равна этим величинам либо еще выше

Механизм коррекции при репликации ДНКМеханизм коррекции при репликации ДНК

С помощью экзонуклеазной активности исправляются ошибки которые накапливаются в процессе биосинтеза Однако нарушения структуры ДНК могут возникать не только по причине неточной работы в ходе синтеза но и в результате внешних воздействий таких как ионизирующее и ультрафиолетовое облучение окислительный стресс

Возможна различная пострепликационная коррекция структуры ДНКВозможна различная пострепликационная коррекция структуры ДНК(репарация)(репарация)

Система репарации ошибочно-встроенных нуклеотидов (Система репарации ошибочно-встроенных нуклеотидов (mismatch mismatch repairrepair) специально предназначена для удаления ошибок возникших в ) специально предназначена для удаления ошибок возникших в ДНК в ходе репликацииДНК в ходе репликации

Система эксцизионной репарации оснований исправляет повреждения в Система эксцизионной репарации оснований исправляет повреждения в ДНК возникающие в результате окислительного стресса то есть ДНК возникающие в результате окислительного стресса то есть модифицированные (окисленные) основания и разрывы в одной из цепей модифицированные (окисленные) основания и разрывы в одной из цепей ДНКДНК

Система эксцизионной репарации нуклеотидов удаляет из ДНК объемные Система эксцизионной репарации нуклеотидов удаляет из ДНК объемные повреждения фотодимеры возникающие под действием повреждения фотодимеры возникающие под действием ультрафиолетового облучения объемные аддукты метаболитов ультрафиолетового облучения объемные аддукты метаболитов попадающих из окружающей среды таких как продукты сгорания курения попадающих из окружающей среды таких как продукты сгорания курения например антрацены и бензапиренынапример антрацены и бензапирены

Синтез ДНК через повреждениеСинтез ДНК через повреждение((Translesion synthesisTranslesion synthesis ndash TLS)ndash TLS)

В случае синтеза с использованием поврежденной ДНК-матрицы транслезионными (translesion) ДНК-полимеразами (например η ι κ θ μ ζ) также возникают искажения в структуре ДНК

TLS ДНК-полимеразы ведущие синтез через повреждение матрицы не обладают корректирующей активностью поскольку их задачей является ввести во чтобы то ни стало нуклеотидное звено дабы избежать остановки репликативной вилки на повреждении матрицы Затем поврежденный участок ДНК восстанавливается системами репарации

Мутации вводимые репликативными Мутации вводимые репликативными ДНК-полимеразами в ходе репликативного синтеза ДНК-полимеразами в ходе репликативного синтеза

играют не только вредную рольиграют не только вредную роль Мутации в ДНК являются движущей Мутации в ДНК являются движущей

силой эволюциисилой эволюции

• Slide 1
• Slide 2
• Slide 3
• Slide 4
• Slide 5
• Slide 6
• Slide 7
• Slide 8
• Slide 9
• Slide 10
• Slide 11
• Slide 12
• Slide 13
• Slide 14
• Slide 15
• Slide 16
• Slide 17
• Slide 18
• Slide 19
• Slide 20
• Slide 21
• Slide 22
• Slide 23
• Slide 24
• Slide 25
• Slide 26
• Slide 27
• Slide 28
• Slide 29
• Slide 30
• Slide 31
• Slide 32
• Slide 33
• Slide 34
• Slide 35
• Slide 36
• Slide 37
• Slide 38
• Slide 39
• Slide 40
• Slide 41

Для мономолекулярной реакцииРазность энергий Гиббса для переходного (Хne) и основного (Х) состояний равна ∆Gne Воспользуемся известным соотношением равновесной термодинамики∆Gne = -RT lnK [Хne]=[X]exp(-∆GneRT)

Частота распада переходного комплекса = частота колебаний разрываемой связиЧастота распада переходного комплекса = частота колебаний разрываемой связи

Частота получена из равенства энергий возбужденного осциллятора рассчитанных на основе квантовой теории (E=hω) и классической физики (Е=kT) где h ndash постоянная Планка ω ndash частота колебаний k ndash постоянная Больцмана ωω==kTkThh Скорость распада молекул Х определяется уравнением

exp(-∆GneRT)

Константа скорости первого порядка для распада молекул Х равна

k1= exp(-∆GneRT)

Энергия активации Гиббса ∆Gne может быть подразделена на энтальпийную и энтропийную составляющие ∆Gne =∆Нne -Т∆Sne

k1= exp(-∆HneRT) exp(∆SneR)

h

kT]X[]X[

dt

d[X]

h

kT

h

kT

Применение теории переходного состояния для Применение теории переходного состояния для анализа механизмов ферментативного катализаанализа механизмов ферментативного катализа

В случае простого механизма Михаэлиса-Ментен (КВ случае простого механизма Михаэлиса-Ментен (КSS=К=КMM) ) энергия связывания уменьшает энергию активации перехода энергия связывания уменьшает энергию активации перехода определяемого кажущейся константой скорости второго определяемого кажущейся константой скорости второго порядка порядка kkcatcatKKMMСмысл параметра kcatKM где kcat - число оборотов реакции поскольку эта величина определяет максимальное число молекул субстрата превращаемых в продукт одним активным центром в единицу времениndash KM в простейшем варианте можно рассматривать как кажущуюся константу диссоциации v=kcat[E](1+KM[S]) ndash При малых концентрациях субстрата v=kcatKM[E][S] то есть kcatKM представляет собой кажущуюся константу скорости второго порядка Ценность параметра kcatKM в том что он связывает скорость реакций с концентрацией свободного фермента а не с его общей концентрацией Это справедливо для низкой концентрации субстрата тк при [Е]asymp[Е0]

KM=KD= [ES]

]S][E[

RTln(kcatKM)=RTln(kTH) - ∆Gne-∆GS

Константа скорости для взаимодействия свободного фермента со свободным субстратом с образованием продуктов равна kcatKM В терминах теории переходного состояния константа равновесия для второй реакции пропорциональна энергии активации ∆GТ

ne

k1= exp(-∆GneRT)h

kT

∆GТne=∆Gne+∆GS

∆Gne ndash положительная величина отражающая энергию активации химических стадий в ходе которых происходит образование и разрыв связей ∆GS - отрицательная величина отражающая использование энергии связывания

Изменение энергии Гиббса для реакцииИзменение энергии Гиббса для реакции

E + S ES продукты

∆Gne ndash положительная величина отражающая образование и разрыв связей ∆GS - отрицательная величина отражающая использование энергии связывания

Фермент и субстрат Фермент и субстрат комплементарныкомплементарны когда каждая взаимодействующая группа когда каждая взаимодействующая группа

субстрата контактирует с субстрата контактирует с соответствующим центром связывания соответствующим центром связывания

фермента и энергия связывания фермента и энергия связывания принимает максимальное значениепринимает максимальное значение

Комплементарность фермента исходному Комплементарность фермента исходному субстратусубстрату

Допустим максимальная внутренняя свободная энергия связывания равна ∆Gb В рассмотренном случае она реализуется в исходном фермент-субстратном комплексе обеспечивая прочное связывание КM - константа диссоциации фермент-субстратного комплекса ndash будет мала Образование переходного состояния будет сопровождаться изменением геометрии субстрата и ухудшением его соответствия что приведет к уменьшению энергии связывания ∆GR ndash увеличение свободной энергии вызванное ухудшением структурного соответствия между ферментом и субстратом ∆G0 ndash свободная энергия активации для образования и разрыва химических связей на стадии определяемой константой kcatНаблюдаемая свободная энергия активации для стадии химического превращения субстрата с константой скорости kcat равна∆Gne=∆G0

ne+∆GR и∆GS=∆Gb

Энергия активации Гиббса для процесса

∆GТne=∆G0

ne+∆GR+∆Gb

Пунктирная линия ndash фермент структурно комплементарен субстрату сплошная ndash переходному состоянию (∆GS = ∆Gb - отрицательная величина ∆G0 и ∆GR ndash положительны)

График изменения энергии ГиббсаГрафик изменения энергии Гиббса

E + S ES продукты

Полная энергия связывания ∆Gb реализуется в переходном состоянии Исходному фермент-субстратному комплексу соответствует положительный член ∆GR который отражает возрастание энергии за счет структурного несоответствия исходного состояния переходному Этот член увеличивает КМ а прирост энергии связывания по мере приближения к переходному состоянию увеличивает kcat∆Gne = ∆G0

ne - ∆GR

∆GS = ∆Gb + ∆GR

Энергия активации Гиббса для перехода характеризующегося константой kcatKM

∆GТne=∆G ne + ∆GS = ∆G0

ne + ∆Gb

∆GR из конечного уравнения исключается

Когда фермент комплементарен переходному состоянию субстрата а не самому субстрату kcatKM возрастает в exp(∆GRRT) раз kcatKM не зависит от взаимодействий в исходном фермент-субстратном комплексе поскольку член ∆GR не входит в уравнение

Комплементарность фермента переходному Комплементарность фермента переходному состоянию субстратасостоянию субстрата

Наличие сильного связывания фермента с субстратом или Наличие сильного связывания фермента с субстратом или низкое значение Книзкое значение КМ М не является необходимым условием не является необходимым условием

протекания ферментативной реакции Для катализа важны протекания ферментативной реакции Для катализа важны высокие значения Квысокие значения КММ

Процесс эволюции ферментов направленный на увеличение Процесс эволюции ферментов направленный на увеличение скорости катализируемых ими реакций можно разделить на два скорости катализируемых ими реакций можно разделить на два этапаэтапа

11 Увеличение Увеличение kkcatcatKKMM за счет повышения комплементарности фермента за счет повышения комплементарности фермента переходному состоянию субстратапереходному состоянию субстрата

22 Увеличение концентрации фермента за счет повышения КУвеличение концентрации фермента за счет повышения КММ направленное на то чтобы в свободном состоянии находилось направленное на то чтобы в свободном состоянии находилось максимально возможное количество ферментамаксимально возможное количество фермента

Исключение ndash ферменты которые выполняют регуляторные функцииИх активность регулируется путем изменения КМ субстратов через

аллостерическое воздействие

Модель laquoключ-замокraquoМодель laquoключ-замокraquo

Теория комплементарности при фермент-субстратном взаимодействии принадлежит Э Фишеру воплотившему ее в модели laquoключ-замокraquo В 1890 г Э Фишер предложил модель согласно которой специфичность ферментов определяется точным соответствием формы фермента и субстрата Однако хотя эта модель объясняла высокую специфичность ферментов она не объясняла явления стабилизации переходного состояния которое наблюдается на практике

Герман Эмиль ФишерГерман Эмиль Фишер1852 Ойскирхен ndash 1919 Берлин1852 Ойскирхен ndash 1919 Берлин

Немецкий химик-органик и Немецкий химик-органик и биохимикбиохимик

Нобелевская премияпо химии 1902 г

Концепция деформацииКонцепция деформации(ДжБС Холдейн и Л Полинг)(ДжБС Холдейн и Л Полинг)

Активный центр фермента структурно комплементарен не самому субстрату а переходному состоянию При связывании с ферментом переходное состояние субстрата взаимодействует с ферментом более эффективно чем сам субстрат и поэтому полная энергия связывания не реализуется до тех пор пока не сформируется переходное состояние

Лайнус Карл ПолингЛайнус Карл Полинг1901 Портленд ndash 1994 Биг-Сюр1901 Портленд ndash 1994 Биг-Сюр

американский химикамериканский химикНобелевская премия

по химии 1954 г и мира 1962 г

Теория индуцированного Теория индуцированного соответствиясоответствия

Объясняет отсутствие ферментативной активности с небольшими субстратами такими как вода в которых нет групп способных обеспечить связывание и энергию для приведения фермента в активное состояние Является модификацией модели laquoключ-замокraquo - модель laquoрука-перчаткаraquo Предполагается что в отсутствии субстрата фермент структурно некомплементарен переходному состоянию Однако поскольку молекула фермента довольно гибкая а субстрат имеет жесткую структуру при образовании фермент-субстратного комплекса каталитические группы на ферменте ориентируются оптимальным для катализа образом фермент становится комплементарным переходному состоянию только после связывания субстрата Перестройка области активного центра при связывании с субстратом названа процессом конформационной адаптации

Дэниэл Эдвард КошландДэниэл Эдвард Кошланд1920 Нью-Йорк ndash 1919 Калифорния1920 Нью-Йорк ndash 1919 Калифорния

американский биохимикамериканский биохимик

Гипотеза непродуктивного связыванияГипотеза непродуктивного связывания

Было предложено что помимо продуктивного связывания в активном центре возможны другие способы связывания когда небольшие субстраты связываются но не подвергаются каталитическому превращению

Например в молекуле лизоцима активный центр имеет протяженную структуру состоящую из шести центров связывания ndash A B C D E F Для осуществления реакции необходимо чтобы молекула субстрата заняла центры D и Е Небольшие субстраты способны присоединяться с любой сторону вдоль вытянутого активного центра лизоцима не связываясь с подцентром где происходит расщепление

ДеформацияДеформация вносит положительный вклад в катализ вносит положительный вклад в катализ при условии комплементарности фермента при условии комплементарности фермента переходному состоянию субстрата увеличивая переходному состоянию субстрата увеличивая kkcatcat и и KKMM что приводит к увеличению скорости реакции что приводит к увеличению скорости реакции

ИндуцированноеИндуцированное соответствиесоответствие уменьшает уменьшает эффективность катализа увеличивая эффективность катализа увеличивая KKMM без без соответствующего увеличения соответствующего увеличения kkcatcat по сравнению с по сравнению с ферментом находящимся в кативной форме в ферментом находящимся в кативной форме в отсутствие субстрата отсутствие субстрата

Механизм непродуктивного связыванияМеханизм непродуктивного связывания не не затрагивает каталитического превращения затрагивает каталитического превращения специфических субстратов однако он приводит к специфических субстратов однако он приводит к появлению дополнительных связывающих центров для появлению дополнительных связывающих центров для конкурирующих между собой неспецифических конкурирующих между собой неспецифических субстратовсубстратов

Специфичность ферментаСпецифичность фермента

Способность фермента узнавать Способность фермента узнавать определенный субстрат из нескольких определенный субстрат из нескольких

конкурирующих за активный центрконкурирующих за активный центр

Функция слагающаяся из прочности связывания Функция слагающаяся из прочности связывания

каждого из субстратов и кинетической каждого из субстратов и кинетической

(каталитической) специфичности (каталитической) специфичности

характеризующейся скоростью катализахарактеризующейся скоростью катализа

laquoСуммарнаяraquo специфичность характеризуется laquoСуммарнаяraquo специфичность характеризуется

отношением отношением kkcatcatKKMM

Специфичность и относительная Специфичность и относительная реакционная способностьреакционная способность

Центральная проблема специфичности Центральная проблема специфичности каким образом фермент отличает специфический каким образом фермент отличает специфический субстрат от другого меньшего или равного ему по субстрат от другого меньшего или равного ему по размерам (изостерического) субстратаразмерам (изостерического) субстрата

Такую задачу постоянно решают аминоацил-тРНК-синтетазы Если синтетаза (ЕХ) ошибочно активирует чужую аминокислоту (Y) и далее катализирует ее перенос на laquoсвоюraquo тРНКХ

или если она ошибочно этерифицирует истинной субстратной аминокислотой Х чужую тРНК

то каждое из этих событий приведет к ошибке в последовательности синтезируемой полипептидной цепи

Дискриминация аминокислот меньших или изостеричных (равных по размеру) специфическому субстрату способных разместиться в активном центре фермента определяется предпочтительным связыванием истинного субстрата за счет незначительных различий в структуре

Валил-тРНК-синтетаза

Наличие разницы в энергии связывания не до конца обеспечивает Наличие разницы в энергии связывания не до конца обеспечивает в этих случаях точность работы системы аминоацилированияв этих случаях точность работы системы аминоацилирования

валин

Изолейцил-тРНК-синтетаза

изолейцин валин треонин

Треонин связывается с валил-тРНК синтетазой в 100-200 раз слабее валина несмотря на то что он изостеричен валину поскольку в гидрофобный карман погружается гидроксильная группа вместо метиленовой Энергия активации реакции представляет собой сумму двух составляющих одна из них ndash энергия активации для стадии химического превращения а вторая ndash энергия связывания фермента с субстратом

Валил-тРНК-синтетаза

валин треонин

Различие в энергии связывания специфичного субстрата (Различие в энергии связывания специфичного субстрата (RSRS) и ) и меньшего по размерам конкурирующего соединения меньшего по размерам конкурирующего соединения HSHS равно равно дополнительной энергии связывания группы дополнительной энергии связывания группы RR имеющейся у имеющейся у специфичного субстрата и отсутствующей у меньшего специфичного субстрата и отсутствующей у меньшего субстрата по отношению к водороду субстрата по отношению к водороду

Поскольку энергия взаимодействия группы R не только входит в энергию связывания но и понижает энергию активации стадии химического превращения вклад заместителя R следует оценивать из сравнения параметров kcatKM для двух субстратов RS и HS Например если величину kcat для валина для активации валил-тРНК-синтетазой принять за 1 то для других аминокислот эта величина будет для аланина 003 для изолейцина 00019 для серина 005

Дополнительную энергию связывания группы Дополнительную энергию связывания группы RR по отношению к по отношению к водороду можно определить по формулеводороду можно определить по формуле

∆Gb=RTln(kcatKM)RS ln(kcatKM)HS

Для пары изолейцил-тРНК-синтетаза-валин неспецифический субстрат по критерию kcatKM хуже в 140-200 раз В клетках EColi [Ile][Val] = 018 Уровень ошибок изолейцил-тРНК-синтетазы на стадии активации 003-004 Экспериментально обнаружено уровень ошибок при замене Ile на Val в биосинтезе овальбумина цыпленка и гемоглобина кролика равен 310-4

Изолейцил-тРНК-синтетаза

изолейцин валин

Чему соответствует этот уровень ошибокЧему соответствует этот уровень ошибок

Ошибочное включение одной аминокислоты на Ошибочное включение одной аминокислоты на каждые 10000 остатковкаждые 10000 остатков

Одна из 20 белковых молекул длиной в 500 остатков Одна из 20 белковых молекул длиной в 500 остатков будет содержать единственную ошибочную будет содержать единственную ошибочную

аминокислотуаминокислоту

Предположив что только около 10 всех ошибок Предположив что только около 10 всех ошибок серьезно сказываются на биологической функции серьезно сказываются на биологической функции

белка можно сделать заключение что одна белка можно сделать заключение что одна молекула белка из 200 синтезированных окажется молекула белка из 200 синтезированных окажется

бесполезной (или даже вредной) в клеточном бесполезной (или даже вредной) в клеточном метаболизмеметаболизме

Коррекция ошибок в реакциях катализируемых

аминоацил-тРНК- синтетазами

Существование механизмов Существование механизмов коррекции для аминоацил-коррекции для аминоацил-

тРНК-синтетазтРНК-синтетаз

Поль Наим БергПоль Наим Берг19219266 Бруклин СШАБруклин США

Американский биохимикАмериканский биохимикНобелевская премия

по химии 1980 г

Изолейцил-тРНК-синтетаза ошибочно активирует валин Добавление тРНК к комплексу с изолейциладенилатом приводит к образованию изолейцил-тРНК а у валиладенилат-ферментного комплекса не наблюдается образование валил-тРНК поскольку при добавлении тРНК происходит гидролиз ошибочного аминоациладенилата

Существование механизмов коррекции для Существование механизмов коррекции для аминоацил-тРНК-синтетазаминоацил-тРНК-синтетаз

В присутствии тРНКВ присутствии тРНКIleIle изолейцил-тРНК-синтетаза изолейцил-тРНК-синтетаза непроизводительно гидролизует АТР АМР + непроизводительно гидролизует АТР АМР + ppppii

ИзбыточныйИзбыточный гидролиз АТРгидролиз АТР по отношению к по отношению к синтезированному продукту за счет АТР-синтезированному продукту за счет АТР-пирофосфогидролазной активности синтетазы пирофосфогидролазной активности синтетазы является является критерием существования корректирующего механизмакритерием существования корректирующего механизма включающего дополнительную стадию разрушения ошибочного включающего дополнительную стадию разрушения ошибочного продукта реакции продукта реакции

У цистеинил- и тирозил-тРНК-синтетаз специфичность высокая У цистеинил- и тирозил-тРНК-синтетаз специфичность высокая и гидролиза АТР не наблюдается и гидролиза АТР не наблюдается

В некоторых случаях когда дискриминация аминокислот на В некоторых случаях когда дискриминация аминокислот на стадии активации была недостаточной наблюдался быстрый стадии активации была недостаточной наблюдался быстрый гидролиз ошибочного аминоациладенилата вместо переноса гидролиз ошибочного аминоациладенилата вместо переноса laquoнеправильнойraquo аминокислоты на субстратную тРНКlaquoнеправильнойraquo аминокислоты на субстратную тРНК

Роль тРНК в коррекцииРоль тРНК в коррекции

Индуцирует ли тРНК гидролиз аминоациладенилата или же служит акцептором ошибочно активированной аминокислоты а затем подвергается ферментативному деацилированию

Возможные последовательности реакций катализируемых синтетазами можно записать в виде следующей схемы (АК-аминокислота)

Роль тРНК в коррекцииРоль тРНК в коррекции

Предложенные механизмы коррекции можно разделить на две группы в зависимости от того какое соединение в них гидролизуется Механизм отбраковки ошибочной аминокислоты (Механизм отбраковки ошибочной аминокислоты (стадии 1

2 5 ndash гидролиз аминоацил-тРНК) Механизм коррекции за счет гидролиза промежуточного Механизм коррекции за счет гидролиза промежуточного

аминоациладенилата (аминоациладенилата (стадии 1 и 4 ndash гидролиз аминоациладенилата)

В каждом из возможных маршрутов коррекции исправление ошибки достигается благодаря введению в реакционный путь laquoнеобратимогоraquo ответвления (реакции 4 или 5) обеспечивающего гидролиз нежелательных соединений

Механизм отбраковки ошибочной аминокислотыМеханизм отбраковки ошибочной аминокислоты

Доказательство существования механизма гидролиза аминоацил-тРНК аминоацил-тРНК-синтетазами было получено при изучении аминоацилирования тРНКVal треонином катализируемого валил-тРНК-синтетазой из BStearothermophilus

Валил-тРНК-синтетаза образует с треонином стабильный комплекс Валил-тРНК-синтетаза образует с треонином стабильный комплекс который быстро гидролизуется при добавлении тРНКкоторый быстро гидролизуется при добавлении тРНКValVal

Предшествует ли гидролизу перенос аминоацильного остатка на тРНКПредшествует ли гидролизу перенос аминоацильного остатка на тРНКValVal

Импульсный метод laquoзамороженнойraquo струиКомплекс [14С]-треонил-АМРЕVal + тРНК [14С]-треонил-тРНК

Константа гидролиза треонил-тРНК в присутствии валил-тРНК-синтетазы 40 сКонстанта гидролиза треонил-тРНК в присутствии валил-тРНК-синтетазы 40 с -1-1а для специфичной валил-тРНК 0015 са для специфичной валил-тРНК 0015 с-1-1 то есть более чем в 2000 раз ниже то есть более чем в 2000 раз ниже

Механизм коррекции за счет гидролиза Механизм коррекции за счет гидролиза промежуточного аминоациладенилатапромежуточного аминоациладенилата

Ошибочное промежуточное соединение образующееся в ходе реакции диссоциирует с фермента и гиролизуется быстрее чем правильное Для правильного аминоациладенилата скорость переноса на тРНК выше чем диссоциация те коррекция определяется соотношением кинетических констант определенных стадий

Джон Джозеф ХопфилдДжон Джозеф Хопфилд1933 Чикаго США1933 Чикаго США

биофизик и биофизик и молекулярный биологмолекулярный биолог

Механизм кинетического корректированияМеханизм кинетического корректирования

Механизм коррекции за счет гидролиза Механизм коррекции за счет гидролиза промежуточного аминоациладенилатапромежуточного аминоациладенилата

Экспериментальное доказательствоЭкспериментальное доказательствоДля валил-тРНК-синтетазы из желтого люпина в отсутствие тРНК наблюдался гидролиз

АТР АМР + ppi зависящий от присутствия несубстратных аминокислот (Cys Thr Ser и α-аминомасляной кислоты)

Константа скорости гидролиза для этих кислот 07-13 мин-1 Специфический валиладенилат-ферментный комплекс гидролизуется с константой скорости 0018 мин-1 те например в 720 раз медленнее чем комплекс валил-тРНК-синтетазы с цистеинил-аденилатом

Коррекция ошибок в реакциях Коррекция ошибок в реакциях катализируемыхкатализируемых

ДНК-полимеразамиДНК-полимеразами

Механизм коррекции при репликации ДНКМеханизм коррекции при репликации ДНК

При синтезе ДНК ошибка исправляется после полимеризации Молекула ДНК синтезируется в направлении 5rsquo-3rsquo нуклеотиды присоединяются к 3rsquo-гидроксильной группе растущей цепи ДНК

Репликативные ДНК-полимеразы обладают Репликативные ДНК-полимеразы обладают корректирующей 3rsquo-5rsquo-экзонуклеазной активностью корректирующей 3rsquo-5rsquo-экзонуклеазной активностью

выщепляющей из цепи ошибочно встроенный нуклеотидвыщепляющей из цепи ошибочно встроенный нуклеотид

Частота мутации фага Т4 коррелирует с экзонуклеазной активностью проявляемой ДНК-полимеразой Частота мутации для ЕСoli составляет 10-6-10-8 и следовательно точность репликации ДНК либо равна этим величинам либо еще выше

Механизм коррекции при репликации ДНКМеханизм коррекции при репликации ДНК

С помощью экзонуклеазной активности исправляются ошибки которые накапливаются в процессе биосинтеза Однако нарушения структуры ДНК могут возникать не только по причине неточной работы в ходе синтеза но и в результате внешних воздействий таких как ионизирующее и ультрафиолетовое облучение окислительный стресс

Возможна различная пострепликационная коррекция структуры ДНКВозможна различная пострепликационная коррекция структуры ДНК(репарация)(репарация)

Система репарации ошибочно-встроенных нуклеотидов (Система репарации ошибочно-встроенных нуклеотидов (mismatch mismatch repairrepair) специально предназначена для удаления ошибок возникших в ) специально предназначена для удаления ошибок возникших в ДНК в ходе репликацииДНК в ходе репликации

Система эксцизионной репарации оснований исправляет повреждения в Система эксцизионной репарации оснований исправляет повреждения в ДНК возникающие в результате окислительного стресса то есть ДНК возникающие в результате окислительного стресса то есть модифицированные (окисленные) основания и разрывы в одной из цепей модифицированные (окисленные) основания и разрывы в одной из цепей ДНКДНК

Система эксцизионной репарации нуклеотидов удаляет из ДНК объемные Система эксцизионной репарации нуклеотидов удаляет из ДНК объемные повреждения фотодимеры возникающие под действием повреждения фотодимеры возникающие под действием ультрафиолетового облучения объемные аддукты метаболитов ультрафиолетового облучения объемные аддукты метаболитов попадающих из окружающей среды таких как продукты сгорания курения попадающих из окружающей среды таких как продукты сгорания курения например антрацены и бензапиренынапример антрацены и бензапирены

Синтез ДНК через повреждениеСинтез ДНК через повреждение((Translesion synthesisTranslesion synthesis ndash TLS)ndash TLS)

В случае синтеза с использованием поврежденной ДНК-матрицы транслезионными (translesion) ДНК-полимеразами (например η ι κ θ μ ζ) также возникают искажения в структуре ДНК

TLS ДНК-полимеразы ведущие синтез через повреждение матрицы не обладают корректирующей активностью поскольку их задачей является ввести во чтобы то ни стало нуклеотидное звено дабы избежать остановки репликативной вилки на повреждении матрицы Затем поврежденный участок ДНК восстанавливается системами репарации

Мутации вводимые репликативными Мутации вводимые репликативными ДНК-полимеразами в ходе репликативного синтеза ДНК-полимеразами в ходе репликативного синтеза

играют не только вредную рольиграют не только вредную роль Мутации в ДНК являются движущей Мутации в ДНК являются движущей

силой эволюциисилой эволюции

• Slide 1
• Slide 2
• Slide 3
• Slide 4
• Slide 5
• Slide 6
• Slide 7
• Slide 8
• Slide 9
• Slide 10
• Slide 11
• Slide 12
• Slide 13
• Slide 14
• Slide 15
• Slide 16
• Slide 17
• Slide 18
• Slide 19
• Slide 20
• Slide 21
• Slide 22
• Slide 23
• Slide 24
• Slide 25
• Slide 26
• Slide 27
• Slide 28
• Slide 29
• Slide 30
• Slide 31
• Slide 32
• Slide 33
• Slide 34
• Slide 35
• Slide 36
• Slide 37
• Slide 38
• Slide 39
• Slide 40
• Slide 41

Применение теории переходного состояния для Применение теории переходного состояния для анализа механизмов ферментативного катализаанализа механизмов ферментативного катализа

В случае простого механизма Михаэлиса-Ментен (КВ случае простого механизма Михаэлиса-Ментен (КSS=К=КMM) ) энергия связывания уменьшает энергию активации перехода энергия связывания уменьшает энергию активации перехода определяемого кажущейся константой скорости второго определяемого кажущейся константой скорости второго порядка порядка kkcatcatKKMMСмысл параметра kcatKM где kcat - число оборотов реакции поскольку эта величина определяет максимальное число молекул субстрата превращаемых в продукт одним активным центром в единицу времениndash KM в простейшем варианте можно рассматривать как кажущуюся константу диссоциации v=kcat[E](1+KM[S]) ndash При малых концентрациях субстрата v=kcatKM[E][S] то есть kcatKM представляет собой кажущуюся константу скорости второго порядка Ценность параметра kcatKM в том что он связывает скорость реакций с концентрацией свободного фермента а не с его общей концентрацией Это справедливо для низкой концентрации субстрата тк при [Е]asymp[Е0]

KM=KD= [ES]

]S][E[

RTln(kcatKM)=RTln(kTH) - ∆Gne-∆GS

Константа скорости для взаимодействия свободного фермента со свободным субстратом с образованием продуктов равна kcatKM В терминах теории переходного состояния константа равновесия для второй реакции пропорциональна энергии активации ∆GТ

ne

k1= exp(-∆GneRT)h

kT

∆GТne=∆Gne+∆GS

∆Gne ndash положительная величина отражающая энергию активации химических стадий в ходе которых происходит образование и разрыв связей ∆GS - отрицательная величина отражающая использование энергии связывания

Изменение энергии Гиббса для реакцииИзменение энергии Гиббса для реакции

E + S ES продукты

∆Gne ndash положительная величина отражающая образование и разрыв связей ∆GS - отрицательная величина отражающая использование энергии связывания

Фермент и субстрат Фермент и субстрат комплементарныкомплементарны когда каждая взаимодействующая группа когда каждая взаимодействующая группа

субстрата контактирует с субстрата контактирует с соответствующим центром связывания соответствующим центром связывания

фермента и энергия связывания фермента и энергия связывания принимает максимальное значениепринимает максимальное значение

Комплементарность фермента исходному Комплементарность фермента исходному субстратусубстрату

Допустим максимальная внутренняя свободная энергия связывания равна ∆Gb В рассмотренном случае она реализуется в исходном фермент-субстратном комплексе обеспечивая прочное связывание КM - константа диссоциации фермент-субстратного комплекса ndash будет мала Образование переходного состояния будет сопровождаться изменением геометрии субстрата и ухудшением его соответствия что приведет к уменьшению энергии связывания ∆GR ndash увеличение свободной энергии вызванное ухудшением структурного соответствия между ферментом и субстратом ∆G0 ndash свободная энергия активации для образования и разрыва химических связей на стадии определяемой константой kcatНаблюдаемая свободная энергия активации для стадии химического превращения субстрата с константой скорости kcat равна∆Gne=∆G0

ne+∆GR и∆GS=∆Gb

Энергия активации Гиббса для процесса

∆GТne=∆G0

ne+∆GR+∆Gb

Пунктирная линия ndash фермент структурно комплементарен субстрату сплошная ndash переходному состоянию (∆GS = ∆Gb - отрицательная величина ∆G0 и ∆GR ndash положительны)

График изменения энергии ГиббсаГрафик изменения энергии Гиббса

E + S ES продукты

Полная энергия связывания ∆Gb реализуется в переходном состоянии Исходному фермент-субстратному комплексу соответствует положительный член ∆GR который отражает возрастание энергии за счет структурного несоответствия исходного состояния переходному Этот член увеличивает КМ а прирост энергии связывания по мере приближения к переходному состоянию увеличивает kcat∆Gne = ∆G0

ne - ∆GR

∆GS = ∆Gb + ∆GR

Энергия активации Гиббса для перехода характеризующегося константой kcatKM

∆GТne=∆G ne + ∆GS = ∆G0

ne + ∆Gb

∆GR из конечного уравнения исключается

Когда фермент комплементарен переходному состоянию субстрата а не самому субстрату kcatKM возрастает в exp(∆GRRT) раз kcatKM не зависит от взаимодействий в исходном фермент-субстратном комплексе поскольку член ∆GR не входит в уравнение

Комплементарность фермента переходному Комплементарность фермента переходному состоянию субстратасостоянию субстрата

Наличие сильного связывания фермента с субстратом или Наличие сильного связывания фермента с субстратом или низкое значение Книзкое значение КМ М не является необходимым условием не является необходимым условием

протекания ферментативной реакции Для катализа важны протекания ферментативной реакции Для катализа важны высокие значения Квысокие значения КММ

Процесс эволюции ферментов направленный на увеличение Процесс эволюции ферментов направленный на увеличение скорости катализируемых ими реакций можно разделить на два скорости катализируемых ими реакций можно разделить на два этапаэтапа

11 Увеличение Увеличение kkcatcatKKMM за счет повышения комплементарности фермента за счет повышения комплементарности фермента переходному состоянию субстратапереходному состоянию субстрата

22 Увеличение концентрации фермента за счет повышения КУвеличение концентрации фермента за счет повышения КММ направленное на то чтобы в свободном состоянии находилось направленное на то чтобы в свободном состоянии находилось максимально возможное количество ферментамаксимально возможное количество фермента

Исключение ndash ферменты которые выполняют регуляторные функцииИх активность регулируется путем изменения КМ субстратов через

аллостерическое воздействие

Модель laquoключ-замокraquoМодель laquoключ-замокraquo

Теория комплементарности при фермент-субстратном взаимодействии принадлежит Э Фишеру воплотившему ее в модели laquoключ-замокraquo В 1890 г Э Фишер предложил модель согласно которой специфичность ферментов определяется точным соответствием формы фермента и субстрата Однако хотя эта модель объясняла высокую специфичность ферментов она не объясняла явления стабилизации переходного состояния которое наблюдается на практике

Герман Эмиль ФишерГерман Эмиль Фишер1852 Ойскирхен ndash 1919 Берлин1852 Ойскирхен ndash 1919 Берлин

Немецкий химик-органик и Немецкий химик-органик и биохимикбиохимик

Нобелевская премияпо химии 1902 г

Концепция деформацииКонцепция деформации(ДжБС Холдейн и Л Полинг)(ДжБС Холдейн и Л Полинг)

Активный центр фермента структурно комплементарен не самому субстрату а переходному состоянию При связывании с ферментом переходное состояние субстрата взаимодействует с ферментом более эффективно чем сам субстрат и поэтому полная энергия связывания не реализуется до тех пор пока не сформируется переходное состояние

Лайнус Карл ПолингЛайнус Карл Полинг1901 Портленд ndash 1994 Биг-Сюр1901 Портленд ndash 1994 Биг-Сюр

американский химикамериканский химикНобелевская премия

по химии 1954 г и мира 1962 г

Теория индуцированного Теория индуцированного соответствиясоответствия

Объясняет отсутствие ферментативной активности с небольшими субстратами такими как вода в которых нет групп способных обеспечить связывание и энергию для приведения фермента в активное состояние Является модификацией модели laquoключ-замокraquo - модель laquoрука-перчаткаraquo Предполагается что в отсутствии субстрата фермент структурно некомплементарен переходному состоянию Однако поскольку молекула фермента довольно гибкая а субстрат имеет жесткую структуру при образовании фермент-субстратного комплекса каталитические группы на ферменте ориентируются оптимальным для катализа образом фермент становится комплементарным переходному состоянию только после связывания субстрата Перестройка области активного центра при связывании с субстратом названа процессом конформационной адаптации

Дэниэл Эдвард КошландДэниэл Эдвард Кошланд1920 Нью-Йорк ndash 1919 Калифорния1920 Нью-Йорк ndash 1919 Калифорния

американский биохимикамериканский биохимик

Гипотеза непродуктивного связыванияГипотеза непродуктивного связывания

Было предложено что помимо продуктивного связывания в активном центре возможны другие способы связывания когда небольшие субстраты связываются но не подвергаются каталитическому превращению

Например в молекуле лизоцима активный центр имеет протяженную структуру состоящую из шести центров связывания ndash A B C D E F Для осуществления реакции необходимо чтобы молекула субстрата заняла центры D и Е Небольшие субстраты способны присоединяться с любой сторону вдоль вытянутого активного центра лизоцима не связываясь с подцентром где происходит расщепление

ДеформацияДеформация вносит положительный вклад в катализ вносит положительный вклад в катализ при условии комплементарности фермента при условии комплементарности фермента переходному состоянию субстрата увеличивая переходному состоянию субстрата увеличивая kkcatcat и и KKMM что приводит к увеличению скорости реакции что приводит к увеличению скорости реакции

ИндуцированноеИндуцированное соответствиесоответствие уменьшает уменьшает эффективность катализа увеличивая эффективность катализа увеличивая KKMM без без соответствующего увеличения соответствующего увеличения kkcatcat по сравнению с по сравнению с ферментом находящимся в кативной форме в ферментом находящимся в кативной форме в отсутствие субстрата отсутствие субстрата

Механизм непродуктивного связыванияМеханизм непродуктивного связывания не не затрагивает каталитического превращения затрагивает каталитического превращения специфических субстратов однако он приводит к специфических субстратов однако он приводит к появлению дополнительных связывающих центров для появлению дополнительных связывающих центров для конкурирующих между собой неспецифических конкурирующих между собой неспецифических субстратовсубстратов

Специфичность ферментаСпецифичность фермента

Способность фермента узнавать Способность фермента узнавать определенный субстрат из нескольких определенный субстрат из нескольких

конкурирующих за активный центрконкурирующих за активный центр

Функция слагающаяся из прочности связывания Функция слагающаяся из прочности связывания

каждого из субстратов и кинетической каждого из субстратов и кинетической

(каталитической) специфичности (каталитической) специфичности

характеризующейся скоростью катализахарактеризующейся скоростью катализа

laquoСуммарнаяraquo специфичность характеризуется laquoСуммарнаяraquo специфичность характеризуется

отношением отношением kkcatcatKKMM

Специфичность и относительная Специфичность и относительная реакционная способностьреакционная способность

Центральная проблема специфичности Центральная проблема специфичности каким образом фермент отличает специфический каким образом фермент отличает специфический субстрат от другого меньшего или равного ему по субстрат от другого меньшего или равного ему по размерам (изостерического) субстратаразмерам (изостерического) субстрата

Такую задачу постоянно решают аминоацил-тРНК-синтетазы Если синтетаза (ЕХ) ошибочно активирует чужую аминокислоту (Y) и далее катализирует ее перенос на laquoсвоюraquo тРНКХ

или если она ошибочно этерифицирует истинной субстратной аминокислотой Х чужую тРНК

то каждое из этих событий приведет к ошибке в последовательности синтезируемой полипептидной цепи

Дискриминация аминокислот меньших или изостеричных (равных по размеру) специфическому субстрату способных разместиться в активном центре фермента определяется предпочтительным связыванием истинного субстрата за счет незначительных различий в структуре

Валил-тРНК-синтетаза

Наличие разницы в энергии связывания не до конца обеспечивает Наличие разницы в энергии связывания не до конца обеспечивает в этих случаях точность работы системы аминоацилированияв этих случаях точность работы системы аминоацилирования

валин

Изолейцил-тРНК-синтетаза

изолейцин валин треонин

Треонин связывается с валил-тРНК синтетазой в 100-200 раз слабее валина несмотря на то что он изостеричен валину поскольку в гидрофобный карман погружается гидроксильная группа вместо метиленовой Энергия активации реакции представляет собой сумму двух составляющих одна из них ndash энергия активации для стадии химического превращения а вторая ndash энергия связывания фермента с субстратом

Валил-тРНК-синтетаза

валин треонин

Различие в энергии связывания специфичного субстрата (Различие в энергии связывания специфичного субстрата (RSRS) и ) и меньшего по размерам конкурирующего соединения меньшего по размерам конкурирующего соединения HSHS равно равно дополнительной энергии связывания группы дополнительной энергии связывания группы RR имеющейся у имеющейся у специфичного субстрата и отсутствующей у меньшего специфичного субстрата и отсутствующей у меньшего субстрата по отношению к водороду субстрата по отношению к водороду

Поскольку энергия взаимодействия группы R не только входит в энергию связывания но и понижает энергию активации стадии химического превращения вклад заместителя R следует оценивать из сравнения параметров kcatKM для двух субстратов RS и HS Например если величину kcat для валина для активации валил-тРНК-синтетазой принять за 1 то для других аминокислот эта величина будет для аланина 003 для изолейцина 00019 для серина 005

Дополнительную энергию связывания группы Дополнительную энергию связывания группы RR по отношению к по отношению к водороду можно определить по формулеводороду можно определить по формуле

∆Gb=RTln(kcatKM)RS ln(kcatKM)HS

Для пары изолейцил-тРНК-синтетаза-валин неспецифический субстрат по критерию kcatKM хуже в 140-200 раз В клетках EColi [Ile][Val] = 018 Уровень ошибок изолейцил-тРНК-синтетазы на стадии активации 003-004 Экспериментально обнаружено уровень ошибок при замене Ile на Val в биосинтезе овальбумина цыпленка и гемоглобина кролика равен 310-4

Изолейцил-тРНК-синтетаза

изолейцин валин

Чему соответствует этот уровень ошибокЧему соответствует этот уровень ошибок

Ошибочное включение одной аминокислоты на Ошибочное включение одной аминокислоты на каждые 10000 остатковкаждые 10000 остатков

Одна из 20 белковых молекул длиной в 500 остатков Одна из 20 белковых молекул длиной в 500 остатков будет содержать единственную ошибочную будет содержать единственную ошибочную

аминокислотуаминокислоту

Предположив что только около 10 всех ошибок Предположив что только около 10 всех ошибок серьезно сказываются на биологической функции серьезно сказываются на биологической функции

белка можно сделать заключение что одна белка можно сделать заключение что одна молекула белка из 200 синтезированных окажется молекула белка из 200 синтезированных окажется

бесполезной (или даже вредной) в клеточном бесполезной (или даже вредной) в клеточном метаболизмеметаболизме

Коррекция ошибок в реакциях катализируемых

аминоацил-тРНК- синтетазами

Существование механизмов Существование механизмов коррекции для аминоацил-коррекции для аминоацил-

тРНК-синтетазтРНК-синтетаз

Поль Наим БергПоль Наим Берг19219266 Бруклин СШАБруклин США

Американский биохимикАмериканский биохимикНобелевская премия

по химии 1980 г

Изолейцил-тРНК-синтетаза ошибочно активирует валин Добавление тРНК к комплексу с изолейциладенилатом приводит к образованию изолейцил-тРНК а у валиладенилат-ферментного комплекса не наблюдается образование валил-тРНК поскольку при добавлении тРНК происходит гидролиз ошибочного аминоациладенилата

Существование механизмов коррекции для Существование механизмов коррекции для аминоацил-тРНК-синтетазаминоацил-тРНК-синтетаз

В присутствии тРНКВ присутствии тРНКIleIle изолейцил-тРНК-синтетаза изолейцил-тРНК-синтетаза непроизводительно гидролизует АТР АМР + непроизводительно гидролизует АТР АМР + ppppii

ИзбыточныйИзбыточный гидролиз АТРгидролиз АТР по отношению к по отношению к синтезированному продукту за счет АТР-синтезированному продукту за счет АТР-пирофосфогидролазной активности синтетазы пирофосфогидролазной активности синтетазы является является критерием существования корректирующего механизмакритерием существования корректирующего механизма включающего дополнительную стадию разрушения ошибочного включающего дополнительную стадию разрушения ошибочного продукта реакции продукта реакции

У цистеинил- и тирозил-тРНК-синтетаз специфичность высокая У цистеинил- и тирозил-тРНК-синтетаз специфичность высокая и гидролиза АТР не наблюдается и гидролиза АТР не наблюдается

В некоторых случаях когда дискриминация аминокислот на В некоторых случаях когда дискриминация аминокислот на стадии активации была недостаточной наблюдался быстрый стадии активации была недостаточной наблюдался быстрый гидролиз ошибочного аминоациладенилата вместо переноса гидролиз ошибочного аминоациладенилата вместо переноса laquoнеправильнойraquo аминокислоты на субстратную тРНКlaquoнеправильнойraquo аминокислоты на субстратную тРНК

Роль тРНК в коррекцииРоль тРНК в коррекции

Индуцирует ли тРНК гидролиз аминоациладенилата или же служит акцептором ошибочно активированной аминокислоты а затем подвергается ферментативному деацилированию

Возможные последовательности реакций катализируемых синтетазами можно записать в виде следующей схемы (АК-аминокислота)

Роль тРНК в коррекцииРоль тРНК в коррекции

Предложенные механизмы коррекции можно разделить на две группы в зависимости от того какое соединение в них гидролизуется Механизм отбраковки ошибочной аминокислоты (Механизм отбраковки ошибочной аминокислоты (стадии 1

2 5 ndash гидролиз аминоацил-тРНК) Механизм коррекции за счет гидролиза промежуточного Механизм коррекции за счет гидролиза промежуточного

аминоациладенилата (аминоациладенилата (стадии 1 и 4 ndash гидролиз аминоациладенилата)

В каждом из возможных маршрутов коррекции исправление ошибки достигается благодаря введению в реакционный путь laquoнеобратимогоraquo ответвления (реакции 4 или 5) обеспечивающего гидролиз нежелательных соединений

Механизм отбраковки ошибочной аминокислотыМеханизм отбраковки ошибочной аминокислоты

Доказательство существования механизма гидролиза аминоацил-тРНК аминоацил-тРНК-синтетазами было получено при изучении аминоацилирования тРНКVal треонином катализируемого валил-тРНК-синтетазой из BStearothermophilus

Валил-тРНК-синтетаза образует с треонином стабильный комплекс Валил-тРНК-синтетаза образует с треонином стабильный комплекс который быстро гидролизуется при добавлении тРНКкоторый быстро гидролизуется при добавлении тРНКValVal

Предшествует ли гидролизу перенос аминоацильного остатка на тРНКПредшествует ли гидролизу перенос аминоацильного остатка на тРНКValVal

Импульсный метод laquoзамороженнойraquo струиКомплекс [14С]-треонил-АМРЕVal + тРНК [14С]-треонил-тРНК

Константа гидролиза треонил-тРНК в присутствии валил-тРНК-синтетазы 40 сКонстанта гидролиза треонил-тРНК в присутствии валил-тРНК-синтетазы 40 с -1-1а для специфичной валил-тРНК 0015 са для специфичной валил-тРНК 0015 с-1-1 то есть более чем в 2000 раз ниже то есть более чем в 2000 раз ниже

Механизм коррекции за счет гидролиза Механизм коррекции за счет гидролиза промежуточного аминоациладенилатапромежуточного аминоациладенилата

Ошибочное промежуточное соединение образующееся в ходе реакции диссоциирует с фермента и гиролизуется быстрее чем правильное Для правильного аминоациладенилата скорость переноса на тРНК выше чем диссоциация те коррекция определяется соотношением кинетических констант определенных стадий

Джон Джозеф ХопфилдДжон Джозеф Хопфилд1933 Чикаго США1933 Чикаго США

биофизик и биофизик и молекулярный биологмолекулярный биолог

Механизм кинетического корректированияМеханизм кинетического корректирования

Механизм коррекции за счет гидролиза Механизм коррекции за счет гидролиза промежуточного аминоациладенилатапромежуточного аминоациладенилата

Экспериментальное доказательствоЭкспериментальное доказательствоДля валил-тРНК-синтетазы из желтого люпина в отсутствие тРНК наблюдался гидролиз

АТР АМР + ppi зависящий от присутствия несубстратных аминокислот (Cys Thr Ser и α-аминомасляной кислоты)

Константа скорости гидролиза для этих кислот 07-13 мин-1 Специфический валиладенилат-ферментный комплекс гидролизуется с константой скорости 0018 мин-1 те например в 720 раз медленнее чем комплекс валил-тРНК-синтетазы с цистеинил-аденилатом

Коррекция ошибок в реакциях Коррекция ошибок в реакциях катализируемыхкатализируемых

ДНК-полимеразамиДНК-полимеразами

Механизм коррекции при репликации ДНКМеханизм коррекции при репликации ДНК

При синтезе ДНК ошибка исправляется после полимеризации Молекула ДНК синтезируется в направлении 5rsquo-3rsquo нуклеотиды присоединяются к 3rsquo-гидроксильной группе растущей цепи ДНК

Репликативные ДНК-полимеразы обладают Репликативные ДНК-полимеразы обладают корректирующей 3rsquo-5rsquo-экзонуклеазной активностью корректирующей 3rsquo-5rsquo-экзонуклеазной активностью

выщепляющей из цепи ошибочно встроенный нуклеотидвыщепляющей из цепи ошибочно встроенный нуклеотид

Частота мутации фага Т4 коррелирует с экзонуклеазной активностью проявляемой ДНК-полимеразой Частота мутации для ЕСoli составляет 10-6-10-8 и следовательно точность репликации ДНК либо равна этим величинам либо еще выше

Механизм коррекции при репликации ДНКМеханизм коррекции при репликации ДНК

С помощью экзонуклеазной активности исправляются ошибки которые накапливаются в процессе биосинтеза Однако нарушения структуры ДНК могут возникать не только по причине неточной работы в ходе синтеза но и в результате внешних воздействий таких как ионизирующее и ультрафиолетовое облучение окислительный стресс

Возможна различная пострепликационная коррекция структуры ДНКВозможна различная пострепликационная коррекция структуры ДНК(репарация)(репарация)

Система репарации ошибочно-встроенных нуклеотидов (Система репарации ошибочно-встроенных нуклеотидов (mismatch mismatch repairrepair) специально предназначена для удаления ошибок возникших в ) специально предназначена для удаления ошибок возникших в ДНК в ходе репликацииДНК в ходе репликации

Система эксцизионной репарации оснований исправляет повреждения в Система эксцизионной репарации оснований исправляет повреждения в ДНК возникающие в результате окислительного стресса то есть ДНК возникающие в результате окислительного стресса то есть модифицированные (окисленные) основания и разрывы в одной из цепей модифицированные (окисленные) основания и разрывы в одной из цепей ДНКДНК

Система эксцизионной репарации нуклеотидов удаляет из ДНК объемные Система эксцизионной репарации нуклеотидов удаляет из ДНК объемные повреждения фотодимеры возникающие под действием повреждения фотодимеры возникающие под действием ультрафиолетового облучения объемные аддукты метаболитов ультрафиолетового облучения объемные аддукты метаболитов попадающих из окружающей среды таких как продукты сгорания курения попадающих из окружающей среды таких как продукты сгорания курения например антрацены и бензапиренынапример антрацены и бензапирены

Синтез ДНК через повреждениеСинтез ДНК через повреждение((Translesion synthesisTranslesion synthesis ndash TLS)ndash TLS)

В случае синтеза с использованием поврежденной ДНК-матрицы транслезионными (translesion) ДНК-полимеразами (например η ι κ θ μ ζ) также возникают искажения в структуре ДНК

TLS ДНК-полимеразы ведущие синтез через повреждение матрицы не обладают корректирующей активностью поскольку их задачей является ввести во чтобы то ни стало нуклеотидное звено дабы избежать остановки репликативной вилки на повреждении матрицы Затем поврежденный участок ДНК восстанавливается системами репарации

Мутации вводимые репликативными Мутации вводимые репликативными ДНК-полимеразами в ходе репликативного синтеза ДНК-полимеразами в ходе репликативного синтеза

играют не только вредную рольиграют не только вредную роль Мутации в ДНК являются движущей Мутации в ДНК являются движущей

силой эволюциисилой эволюции

• Slide 1
• Slide 2
• Slide 3
• Slide 4
• Slide 5
• Slide 6
• Slide 7
• Slide 8
• Slide 9
• Slide 10
• Slide 11
• Slide 12
• Slide 13
• Slide 14
• Slide 15
• Slide 16
• Slide 17
• Slide 18
• Slide 19
• Slide 20
• Slide 21
• Slide 22
• Slide 23
• Slide 24
• Slide 25
• Slide 26
• Slide 27
• Slide 28
• Slide 29
• Slide 30
• Slide 31
• Slide 32
• Slide 33
• Slide 34
• Slide 35
• Slide 36
• Slide 37
• Slide 38
• Slide 39
• Slide 40
• Slide 41

RTln(kcatKM)=RTln(kTH) - ∆Gne-∆GS

Константа скорости для взаимодействия свободного фермента со свободным субстратом с образованием продуктов равна kcatKM В терминах теории переходного состояния константа равновесия для второй реакции пропорциональна энергии активации ∆GТ

ne

k1= exp(-∆GneRT)h

kT

∆GТne=∆Gne+∆GS

∆Gne ndash положительная величина отражающая энергию активации химических стадий в ходе которых происходит образование и разрыв связей ∆GS - отрицательная величина отражающая использование энергии связывания

Изменение энергии Гиббса для реакцииИзменение энергии Гиббса для реакции

E + S ES продукты

∆Gne ndash положительная величина отражающая образование и разрыв связей ∆GS - отрицательная величина отражающая использование энергии связывания

Фермент и субстрат Фермент и субстрат комплементарныкомплементарны когда каждая взаимодействующая группа когда каждая взаимодействующая группа

субстрата контактирует с субстрата контактирует с соответствующим центром связывания соответствующим центром связывания

фермента и энергия связывания фермента и энергия связывания принимает максимальное значениепринимает максимальное значение

Комплементарность фермента исходному Комплементарность фермента исходному субстратусубстрату

Допустим максимальная внутренняя свободная энергия связывания равна ∆Gb В рассмотренном случае она реализуется в исходном фермент-субстратном комплексе обеспечивая прочное связывание КM - константа диссоциации фермент-субстратного комплекса ndash будет мала Образование переходного состояния будет сопровождаться изменением геометрии субстрата и ухудшением его соответствия что приведет к уменьшению энергии связывания ∆GR ndash увеличение свободной энергии вызванное ухудшением структурного соответствия между ферментом и субстратом ∆G0 ndash свободная энергия активации для образования и разрыва химических связей на стадии определяемой константой kcatНаблюдаемая свободная энергия активации для стадии химического превращения субстрата с константой скорости kcat равна∆Gne=∆G0

ne+∆GR и∆GS=∆Gb

Энергия активации Гиббса для процесса

∆GТne=∆G0

ne+∆GR+∆Gb

Пунктирная линия ndash фермент структурно комплементарен субстрату сплошная ndash переходному состоянию (∆GS = ∆Gb - отрицательная величина ∆G0 и ∆GR ndash положительны)

График изменения энергии ГиббсаГрафик изменения энергии Гиббса

E + S ES продукты

Полная энергия связывания ∆Gb реализуется в переходном состоянии Исходному фермент-субстратному комплексу соответствует положительный член ∆GR который отражает возрастание энергии за счет структурного несоответствия исходного состояния переходному Этот член увеличивает КМ а прирост энергии связывания по мере приближения к переходному состоянию увеличивает kcat∆Gne = ∆G0

ne - ∆GR

∆GS = ∆Gb + ∆GR

Энергия активации Гиббса для перехода характеризующегося константой kcatKM

∆GТne=∆G ne + ∆GS = ∆G0

ne + ∆Gb

∆GR из конечного уравнения исключается

Когда фермент комплементарен переходному состоянию субстрата а не самому субстрату kcatKM возрастает в exp(∆GRRT) раз kcatKM не зависит от взаимодействий в исходном фермент-субстратном комплексе поскольку член ∆GR не входит в уравнение

Комплементарность фермента переходному Комплементарность фермента переходному состоянию субстратасостоянию субстрата

Наличие сильного связывания фермента с субстратом или Наличие сильного связывания фермента с субстратом или низкое значение Книзкое значение КМ М не является необходимым условием не является необходимым условием

протекания ферментативной реакции Для катализа важны протекания ферментативной реакции Для катализа важны высокие значения Квысокие значения КММ

Процесс эволюции ферментов направленный на увеличение Процесс эволюции ферментов направленный на увеличение скорости катализируемых ими реакций можно разделить на два скорости катализируемых ими реакций можно разделить на два этапаэтапа

11 Увеличение Увеличение kkcatcatKKMM за счет повышения комплементарности фермента за счет повышения комплементарности фермента переходному состоянию субстратапереходному состоянию субстрата

22 Увеличение концентрации фермента за счет повышения КУвеличение концентрации фермента за счет повышения КММ направленное на то чтобы в свободном состоянии находилось направленное на то чтобы в свободном состоянии находилось максимально возможное количество ферментамаксимально возможное количество фермента

Исключение ndash ферменты которые выполняют регуляторные функцииИх активность регулируется путем изменения КМ субстратов через

аллостерическое воздействие

Модель laquoключ-замокraquoМодель laquoключ-замокraquo

Теория комплементарности при фермент-субстратном взаимодействии принадлежит Э Фишеру воплотившему ее в модели laquoключ-замокraquo В 1890 г Э Фишер предложил модель согласно которой специфичность ферментов определяется точным соответствием формы фермента и субстрата Однако хотя эта модель объясняла высокую специфичность ферментов она не объясняла явления стабилизации переходного состояния которое наблюдается на практике

Герман Эмиль ФишерГерман Эмиль Фишер1852 Ойскирхен ndash 1919 Берлин1852 Ойскирхен ndash 1919 Берлин

Немецкий химик-органик и Немецкий химик-органик и биохимикбиохимик

Нобелевская премияпо химии 1902 г

Концепция деформацииКонцепция деформации(ДжБС Холдейн и Л Полинг)(ДжБС Холдейн и Л Полинг)

Активный центр фермента структурно комплементарен не самому субстрату а переходному состоянию При связывании с ферментом переходное состояние субстрата взаимодействует с ферментом более эффективно чем сам субстрат и поэтому полная энергия связывания не реализуется до тех пор пока не сформируется переходное состояние

Лайнус Карл ПолингЛайнус Карл Полинг1901 Портленд ndash 1994 Биг-Сюр1901 Портленд ndash 1994 Биг-Сюр

американский химикамериканский химикНобелевская премия

по химии 1954 г и мира 1962 г

Теория индуцированного Теория индуцированного соответствиясоответствия

Объясняет отсутствие ферментативной активности с небольшими субстратами такими как вода в которых нет групп способных обеспечить связывание и энергию для приведения фермента в активное состояние Является модификацией модели laquoключ-замокraquo - модель laquoрука-перчаткаraquo Предполагается что в отсутствии субстрата фермент структурно некомплементарен переходному состоянию Однако поскольку молекула фермента довольно гибкая а субстрат имеет жесткую структуру при образовании фермент-субстратного комплекса каталитические группы на ферменте ориентируются оптимальным для катализа образом фермент становится комплементарным переходному состоянию только после связывания субстрата Перестройка области активного центра при связывании с субстратом названа процессом конформационной адаптации

Дэниэл Эдвард КошландДэниэл Эдвард Кошланд1920 Нью-Йорк ndash 1919 Калифорния1920 Нью-Йорк ndash 1919 Калифорния

американский биохимикамериканский биохимик

Гипотеза непродуктивного связыванияГипотеза непродуктивного связывания

Было предложено что помимо продуктивного связывания в активном центре возможны другие способы связывания когда небольшие субстраты связываются но не подвергаются каталитическому превращению

Например в молекуле лизоцима активный центр имеет протяженную структуру состоящую из шести центров связывания ndash A B C D E F Для осуществления реакции необходимо чтобы молекула субстрата заняла центры D и Е Небольшие субстраты способны присоединяться с любой сторону вдоль вытянутого активного центра лизоцима не связываясь с подцентром где происходит расщепление

ДеформацияДеформация вносит положительный вклад в катализ вносит положительный вклад в катализ при условии комплементарности фермента при условии комплементарности фермента переходному состоянию субстрата увеличивая переходному состоянию субстрата увеличивая kkcatcat и и KKMM что приводит к увеличению скорости реакции что приводит к увеличению скорости реакции

ИндуцированноеИндуцированное соответствиесоответствие уменьшает уменьшает эффективность катализа увеличивая эффективность катализа увеличивая KKMM без без соответствующего увеличения соответствующего увеличения kkcatcat по сравнению с по сравнению с ферментом находящимся в кативной форме в ферментом находящимся в кативной форме в отсутствие субстрата отсутствие субстрата

Механизм непродуктивного связыванияМеханизм непродуктивного связывания не не затрагивает каталитического превращения затрагивает каталитического превращения специфических субстратов однако он приводит к специфических субстратов однако он приводит к появлению дополнительных связывающих центров для появлению дополнительных связывающих центров для конкурирующих между собой неспецифических конкурирующих между собой неспецифических субстратовсубстратов

Специфичность ферментаСпецифичность фермента

Способность фермента узнавать Способность фермента узнавать определенный субстрат из нескольких определенный субстрат из нескольких

конкурирующих за активный центрконкурирующих за активный центр

Функция слагающаяся из прочности связывания Функция слагающаяся из прочности связывания

каждого из субстратов и кинетической каждого из субстратов и кинетической

(каталитической) специфичности (каталитической) специфичности

характеризующейся скоростью катализахарактеризующейся скоростью катализа

laquoСуммарнаяraquo специфичность характеризуется laquoСуммарнаяraquo специфичность характеризуется

отношением отношением kkcatcatKKMM

Специфичность и относительная Специфичность и относительная реакционная способностьреакционная способность

Центральная проблема специфичности Центральная проблема специфичности каким образом фермент отличает специфический каким образом фермент отличает специфический субстрат от другого меньшего или равного ему по субстрат от другого меньшего или равного ему по размерам (изостерического) субстратаразмерам (изостерического) субстрата

Такую задачу постоянно решают аминоацил-тРНК-синтетазы Если синтетаза (ЕХ) ошибочно активирует чужую аминокислоту (Y) и далее катализирует ее перенос на laquoсвоюraquo тРНКХ

или если она ошибочно этерифицирует истинной субстратной аминокислотой Х чужую тРНК

то каждое из этих событий приведет к ошибке в последовательности синтезируемой полипептидной цепи

Дискриминация аминокислот меньших или изостеричных (равных по размеру) специфическому субстрату способных разместиться в активном центре фермента определяется предпочтительным связыванием истинного субстрата за счет незначительных различий в структуре

Валил-тРНК-синтетаза

Наличие разницы в энергии связывания не до конца обеспечивает Наличие разницы в энергии связывания не до конца обеспечивает в этих случаях точность работы системы аминоацилированияв этих случаях точность работы системы аминоацилирования

валин

Изолейцил-тРНК-синтетаза

изолейцин валин треонин

Треонин связывается с валил-тРНК синтетазой в 100-200 раз слабее валина несмотря на то что он изостеричен валину поскольку в гидрофобный карман погружается гидроксильная группа вместо метиленовой Энергия активации реакции представляет собой сумму двух составляющих одна из них ndash энергия активации для стадии химического превращения а вторая ndash энергия связывания фермента с субстратом

Валил-тРНК-синтетаза

валин треонин

Различие в энергии связывания специфичного субстрата (Различие в энергии связывания специфичного субстрата (RSRS) и ) и меньшего по размерам конкурирующего соединения меньшего по размерам конкурирующего соединения HSHS равно равно дополнительной энергии связывания группы дополнительной энергии связывания группы RR имеющейся у имеющейся у специфичного субстрата и отсутствующей у меньшего специфичного субстрата и отсутствующей у меньшего субстрата по отношению к водороду субстрата по отношению к водороду

Поскольку энергия взаимодействия группы R не только входит в энергию связывания но и понижает энергию активации стадии химического превращения вклад заместителя R следует оценивать из сравнения параметров kcatKM для двух субстратов RS и HS Например если величину kcat для валина для активации валил-тРНК-синтетазой принять за 1 то для других аминокислот эта величина будет для аланина 003 для изолейцина 00019 для серина 005

Дополнительную энергию связывания группы Дополнительную энергию связывания группы RR по отношению к по отношению к водороду можно определить по формулеводороду можно определить по формуле

∆Gb=RTln(kcatKM)RS ln(kcatKM)HS

Для пары изолейцил-тРНК-синтетаза-валин неспецифический субстрат по критерию kcatKM хуже в 140-200 раз В клетках EColi [Ile][Val] = 018 Уровень ошибок изолейцил-тРНК-синтетазы на стадии активации 003-004 Экспериментально обнаружено уровень ошибок при замене Ile на Val в биосинтезе овальбумина цыпленка и гемоглобина кролика равен 310-4

Изолейцил-тРНК-синтетаза

изолейцин валин

Чему соответствует этот уровень ошибокЧему соответствует этот уровень ошибок

Ошибочное включение одной аминокислоты на Ошибочное включение одной аминокислоты на каждые 10000 остатковкаждые 10000 остатков

Одна из 20 белковых молекул длиной в 500 остатков Одна из 20 белковых молекул длиной в 500 остатков будет содержать единственную ошибочную будет содержать единственную ошибочную

аминокислотуаминокислоту

Предположив что только около 10 всех ошибок Предположив что только около 10 всех ошибок серьезно сказываются на биологической функции серьезно сказываются на биологической функции

белка можно сделать заключение что одна белка можно сделать заключение что одна молекула белка из 200 синтезированных окажется молекула белка из 200 синтезированных окажется

бесполезной (или даже вредной) в клеточном бесполезной (или даже вредной) в клеточном метаболизмеметаболизме

Коррекция ошибок в реакциях катализируемых

аминоацил-тРНК- синтетазами

Существование механизмов Существование механизмов коррекции для аминоацил-коррекции для аминоацил-

тРНК-синтетазтРНК-синтетаз

Поль Наим БергПоль Наим Берг19219266 Бруклин СШАБруклин США

Американский биохимикАмериканский биохимикНобелевская премия

по химии 1980 г

Изолейцил-тРНК-синтетаза ошибочно активирует валин Добавление тРНК к комплексу с изолейциладенилатом приводит к образованию изолейцил-тРНК а у валиладенилат-ферментного комплекса не наблюдается образование валил-тРНК поскольку при добавлении тРНК происходит гидролиз ошибочного аминоациладенилата

Существование механизмов коррекции для Существование механизмов коррекции для аминоацил-тРНК-синтетазаминоацил-тРНК-синтетаз

В присутствии тРНКВ присутствии тРНКIleIle изолейцил-тРНК-синтетаза изолейцил-тРНК-синтетаза непроизводительно гидролизует АТР АМР + непроизводительно гидролизует АТР АМР + ppppii

ИзбыточныйИзбыточный гидролиз АТРгидролиз АТР по отношению к по отношению к синтезированному продукту за счет АТР-синтезированному продукту за счет АТР-пирофосфогидролазной активности синтетазы пирофосфогидролазной активности синтетазы является является критерием существования корректирующего механизмакритерием существования корректирующего механизма включающего дополнительную стадию разрушения ошибочного включающего дополнительную стадию разрушения ошибочного продукта реакции продукта реакции

У цистеинил- и тирозил-тРНК-синтетаз специфичность высокая У цистеинил- и тирозил-тРНК-синтетаз специфичность высокая и гидролиза АТР не наблюдается и гидролиза АТР не наблюдается

В некоторых случаях когда дискриминация аминокислот на В некоторых случаях когда дискриминация аминокислот на стадии активации была недостаточной наблюдался быстрый стадии активации была недостаточной наблюдался быстрый гидролиз ошибочного аминоациладенилата вместо переноса гидролиз ошибочного аминоациладенилата вместо переноса laquoнеправильнойraquo аминокислоты на субстратную тРНКlaquoнеправильнойraquo аминокислоты на субстратную тРНК

Роль тРНК в коррекцииРоль тРНК в коррекции

Индуцирует ли тРНК гидролиз аминоациладенилата или же служит акцептором ошибочно активированной аминокислоты а затем подвергается ферментативному деацилированию

Возможные последовательности реакций катализируемых синтетазами можно записать в виде следующей схемы (АК-аминокислота)

Роль тРНК в коррекцииРоль тРНК в коррекции

Предложенные механизмы коррекции можно разделить на две группы в зависимости от того какое соединение в них гидролизуется Механизм отбраковки ошибочной аминокислоты (Механизм отбраковки ошибочной аминокислоты (стадии 1

2 5 ndash гидролиз аминоацил-тРНК) Механизм коррекции за счет гидролиза промежуточного Механизм коррекции за счет гидролиза промежуточного

аминоациладенилата (аминоациладенилата (стадии 1 и 4 ndash гидролиз аминоациладенилата)

В каждом из возможных маршрутов коррекции исправление ошибки достигается благодаря введению в реакционный путь laquoнеобратимогоraquo ответвления (реакции 4 или 5) обеспечивающего гидролиз нежелательных соединений

Механизм отбраковки ошибочной аминокислотыМеханизм отбраковки ошибочной аминокислоты

Доказательство существования механизма гидролиза аминоацил-тРНК аминоацил-тРНК-синтетазами было получено при изучении аминоацилирования тРНКVal треонином катализируемого валил-тРНК-синтетазой из BStearothermophilus

Валил-тРНК-синтетаза образует с треонином стабильный комплекс Валил-тРНК-синтетаза образует с треонином стабильный комплекс который быстро гидролизуется при добавлении тРНКкоторый быстро гидролизуется при добавлении тРНКValVal

Предшествует ли гидролизу перенос аминоацильного остатка на тРНКПредшествует ли гидролизу перенос аминоацильного остатка на тРНКValVal

Импульсный метод laquoзамороженнойraquo струиКомплекс [14С]-треонил-АМРЕVal + тРНК [14С]-треонил-тРНК

Константа гидролиза треонил-тРНК в присутствии валил-тРНК-синтетазы 40 сКонстанта гидролиза треонил-тРНК в присутствии валил-тРНК-синтетазы 40 с -1-1а для специфичной валил-тРНК 0015 са для специфичной валил-тРНК 0015 с-1-1 то есть более чем в 2000 раз ниже то есть более чем в 2000 раз ниже

Механизм коррекции за счет гидролиза Механизм коррекции за счет гидролиза промежуточного аминоациладенилатапромежуточного аминоациладенилата

Ошибочное промежуточное соединение образующееся в ходе реакции диссоциирует с фермента и гиролизуется быстрее чем правильное Для правильного аминоациладенилата скорость переноса на тРНК выше чем диссоциация те коррекция определяется соотношением кинетических констант определенных стадий

Джон Джозеф ХопфилдДжон Джозеф Хопфилд1933 Чикаго США1933 Чикаго США

биофизик и биофизик и молекулярный биологмолекулярный биолог

Механизм кинетического корректированияМеханизм кинетического корректирования

Механизм коррекции за счет гидролиза Механизм коррекции за счет гидролиза промежуточного аминоациладенилатапромежуточного аминоациладенилата

Экспериментальное доказательствоЭкспериментальное доказательствоДля валил-тРНК-синтетазы из желтого люпина в отсутствие тРНК наблюдался гидролиз

АТР АМР + ppi зависящий от присутствия несубстратных аминокислот (Cys Thr Ser и α-аминомасляной кислоты)

Константа скорости гидролиза для этих кислот 07-13 мин-1 Специфический валиладенилат-ферментный комплекс гидролизуется с константой скорости 0018 мин-1 те например в 720 раз медленнее чем комплекс валил-тРНК-синтетазы с цистеинил-аденилатом

Коррекция ошибок в реакциях Коррекция ошибок в реакциях катализируемыхкатализируемых

ДНК-полимеразамиДНК-полимеразами

Механизм коррекции при репликации ДНКМеханизм коррекции при репликации ДНК

При синтезе ДНК ошибка исправляется после полимеризации Молекула ДНК синтезируется в направлении 5rsquo-3rsquo нуклеотиды присоединяются к 3rsquo-гидроксильной группе растущей цепи ДНК

Репликативные ДНК-полимеразы обладают Репликативные ДНК-полимеразы обладают корректирующей 3rsquo-5rsquo-экзонуклеазной активностью корректирующей 3rsquo-5rsquo-экзонуклеазной активностью

выщепляющей из цепи ошибочно встроенный нуклеотидвыщепляющей из цепи ошибочно встроенный нуклеотид

Частота мутации фага Т4 коррелирует с экзонуклеазной активностью проявляемой ДНК-полимеразой Частота мутации для ЕСoli составляет 10-6-10-8 и следовательно точность репликации ДНК либо равна этим величинам либо еще выше

Механизм коррекции при репликации ДНКМеханизм коррекции при репликации ДНК

С помощью экзонуклеазной активности исправляются ошибки которые накапливаются в процессе биосинтеза Однако нарушения структуры ДНК могут возникать не только по причине неточной работы в ходе синтеза но и в результате внешних воздействий таких как ионизирующее и ультрафиолетовое облучение окислительный стресс

Возможна различная пострепликационная коррекция структуры ДНКВозможна различная пострепликационная коррекция структуры ДНК(репарация)(репарация)

Система репарации ошибочно-встроенных нуклеотидов (Система репарации ошибочно-встроенных нуклеотидов (mismatch mismatch repairrepair) специально предназначена для удаления ошибок возникших в ) специально предназначена для удаления ошибок возникших в ДНК в ходе репликацииДНК в ходе репликации

Система эксцизионной репарации оснований исправляет повреждения в Система эксцизионной репарации оснований исправляет повреждения в ДНК возникающие в результате окислительного стресса то есть ДНК возникающие в результате окислительного стресса то есть модифицированные (окисленные) основания и разрывы в одной из цепей модифицированные (окисленные) основания и разрывы в одной из цепей ДНКДНК

Система эксцизионной репарации нуклеотидов удаляет из ДНК объемные Система эксцизионной репарации нуклеотидов удаляет из ДНК объемные повреждения фотодимеры возникающие под действием повреждения фотодимеры возникающие под действием ультрафиолетового облучения объемные аддукты метаболитов ультрафиолетового облучения объемные аддукты метаболитов попадающих из окружающей среды таких как продукты сгорания курения попадающих из окружающей среды таких как продукты сгорания курения например антрацены и бензапиренынапример антрацены и бензапирены

Синтез ДНК через повреждениеСинтез ДНК через повреждение((Translesion synthesisTranslesion synthesis ndash TLS)ndash TLS)

В случае синтеза с использованием поврежденной ДНК-матрицы транслезионными (translesion) ДНК-полимеразами (например η ι κ θ μ ζ) также возникают искажения в структуре ДНК

TLS ДНК-полимеразы ведущие синтез через повреждение матрицы не обладают корректирующей активностью поскольку их задачей является ввести во чтобы то ни стало нуклеотидное звено дабы избежать остановки репликативной вилки на повреждении матрицы Затем поврежденный участок ДНК восстанавливается системами репарации

Мутации вводимые репликативными Мутации вводимые репликативными ДНК-полимеразами в ходе репликативного синтеза ДНК-полимеразами в ходе репликативного синтеза

играют не только вредную рольиграют не только вредную роль Мутации в ДНК являются движущей Мутации в ДНК являются движущей

силой эволюциисилой эволюции

• Slide 1
• Slide 2
• Slide 3
• Slide 4
• Slide 5
• Slide 6
• Slide 7
• Slide 8
• Slide 9
• Slide 10
• Slide 11
• Slide 12
• Slide 13
• Slide 14
• Slide 15
• Slide 16
• Slide 17
• Slide 18
• Slide 19
• Slide 20
• Slide 21
• Slide 22
• Slide 23
• Slide 24
• Slide 25
• Slide 26
• Slide 27
• Slide 28
• Slide 29
• Slide 30
• Slide 31
• Slide 32
• Slide 33
• Slide 34
• Slide 35
• Slide 36
• Slide 37
• Slide 38
• Slide 39
• Slide 40
• Slide 41

Изменение энергии Гиббса для реакцииИзменение энергии Гиббса для реакции

E + S ES продукты

∆Gne ndash положительная величина отражающая образование и разрыв связей ∆GS - отрицательная величина отражающая использование энергии связывания

Фермент и субстрат Фермент и субстрат комплементарныкомплементарны когда каждая взаимодействующая группа когда каждая взаимодействующая группа

субстрата контактирует с субстрата контактирует с соответствующим центром связывания соответствующим центром связывания

фермента и энергия связывания фермента и энергия связывания принимает максимальное значениепринимает максимальное значение

Комплементарность фермента исходному Комплементарность фермента исходному субстратусубстрату

Допустим максимальная внутренняя свободная энергия связывания равна ∆Gb В рассмотренном случае она реализуется в исходном фермент-субстратном комплексе обеспечивая прочное связывание КM - константа диссоциации фермент-субстратного комплекса ndash будет мала Образование переходного состояния будет сопровождаться изменением геометрии субстрата и ухудшением его соответствия что приведет к уменьшению энергии связывания ∆GR ndash увеличение свободной энергии вызванное ухудшением структурного соответствия между ферментом и субстратом ∆G0 ndash свободная энергия активации для образования и разрыва химических связей на стадии определяемой константой kcatНаблюдаемая свободная энергия активации для стадии химического превращения субстрата с константой скорости kcat равна∆Gne=∆G0

ne+∆GR и∆GS=∆Gb

Энергия активации Гиббса для процесса

∆GТne=∆G0

ne+∆GR+∆Gb

Пунктирная линия ndash фермент структурно комплементарен субстрату сплошная ndash переходному состоянию (∆GS = ∆Gb - отрицательная величина ∆G0 и ∆GR ndash положительны)

График изменения энергии ГиббсаГрафик изменения энергии Гиббса

E + S ES продукты

Полная энергия связывания ∆Gb реализуется в переходном состоянии Исходному фермент-субстратному комплексу соответствует положительный член ∆GR который отражает возрастание энергии за счет структурного несоответствия исходного состояния переходному Этот член увеличивает КМ а прирост энергии связывания по мере приближения к переходному состоянию увеличивает kcat∆Gne = ∆G0

ne - ∆GR

∆GS = ∆Gb + ∆GR

Энергия активации Гиббса для перехода характеризующегося константой kcatKM

∆GТne=∆G ne + ∆GS = ∆G0

ne + ∆Gb

∆GR из конечного уравнения исключается

Когда фермент комплементарен переходному состоянию субстрата а не самому субстрату kcatKM возрастает в exp(∆GRRT) раз kcatKM не зависит от взаимодействий в исходном фермент-субстратном комплексе поскольку член ∆GR не входит в уравнение

Комплементарность фермента переходному Комплементарность фермента переходному состоянию субстратасостоянию субстрата

Наличие сильного связывания фермента с субстратом или Наличие сильного связывания фермента с субстратом или низкое значение Книзкое значение КМ М не является необходимым условием не является необходимым условием

протекания ферментативной реакции Для катализа важны протекания ферментативной реакции Для катализа важны высокие значения Квысокие значения КММ

Процесс эволюции ферментов направленный на увеличение Процесс эволюции ферментов направленный на увеличение скорости катализируемых ими реакций можно разделить на два скорости катализируемых ими реакций можно разделить на два этапаэтапа

11 Увеличение Увеличение kkcatcatKKMM за счет повышения комплементарности фермента за счет повышения комплементарности фермента переходному состоянию субстратапереходному состоянию субстрата

22 Увеличение концентрации фермента за счет повышения КУвеличение концентрации фермента за счет повышения КММ направленное на то чтобы в свободном состоянии находилось направленное на то чтобы в свободном состоянии находилось максимально возможное количество ферментамаксимально возможное количество фермента

Исключение ndash ферменты которые выполняют регуляторные функцииИх активность регулируется путем изменения КМ субстратов через

аллостерическое воздействие

Модель laquoключ-замокraquoМодель laquoключ-замокraquo

Теория комплементарности при фермент-субстратном взаимодействии принадлежит Э Фишеру воплотившему ее в модели laquoключ-замокraquo В 1890 г Э Фишер предложил модель согласно которой специфичность ферментов определяется точным соответствием формы фермента и субстрата Однако хотя эта модель объясняла высокую специфичность ферментов она не объясняла явления стабилизации переходного состояния которое наблюдается на практике

Герман Эмиль ФишерГерман Эмиль Фишер1852 Ойскирхен ndash 1919 Берлин1852 Ойскирхен ndash 1919 Берлин

Немецкий химик-органик и Немецкий химик-органик и биохимикбиохимик

Нобелевская премияпо химии 1902 г

Концепция деформацииКонцепция деформации(ДжБС Холдейн и Л Полинг)(ДжБС Холдейн и Л Полинг)

Активный центр фермента структурно комплементарен не самому субстрату а переходному состоянию При связывании с ферментом переходное состояние субстрата взаимодействует с ферментом более эффективно чем сам субстрат и поэтому полная энергия связывания не реализуется до тех пор пока не сформируется переходное состояние

Лайнус Карл ПолингЛайнус Карл Полинг1901 Портленд ndash 1994 Биг-Сюр1901 Портленд ndash 1994 Биг-Сюр

американский химикамериканский химикНобелевская премия

по химии 1954 г и мира 1962 г

Теория индуцированного Теория индуцированного соответствиясоответствия

Объясняет отсутствие ферментативной активности с небольшими субстратами такими как вода в которых нет групп способных обеспечить связывание и энергию для приведения фермента в активное состояние Является модификацией модели laquoключ-замокraquo - модель laquoрука-перчаткаraquo Предполагается что в отсутствии субстрата фермент структурно некомплементарен переходному состоянию Однако поскольку молекула фермента довольно гибкая а субстрат имеет жесткую структуру при образовании фермент-субстратного комплекса каталитические группы на ферменте ориентируются оптимальным для катализа образом фермент становится комплементарным переходному состоянию только после связывания субстрата Перестройка области активного центра при связывании с субстратом названа процессом конформационной адаптации

Дэниэл Эдвард КошландДэниэл Эдвард Кошланд1920 Нью-Йорк ndash 1919 Калифорния1920 Нью-Йорк ndash 1919 Калифорния

американский биохимикамериканский биохимик

Гипотеза непродуктивного связыванияГипотеза непродуктивного связывания

Было предложено что помимо продуктивного связывания в активном центре возможны другие способы связывания когда небольшие субстраты связываются но не подвергаются каталитическому превращению

Например в молекуле лизоцима активный центр имеет протяженную структуру состоящую из шести центров связывания ndash A B C D E F Для осуществления реакции необходимо чтобы молекула субстрата заняла центры D и Е Небольшие субстраты способны присоединяться с любой сторону вдоль вытянутого активного центра лизоцима не связываясь с подцентром где происходит расщепление

ДеформацияДеформация вносит положительный вклад в катализ вносит положительный вклад в катализ при условии комплементарности фермента при условии комплементарности фермента переходному состоянию субстрата увеличивая переходному состоянию субстрата увеличивая kkcatcat и и KKMM что приводит к увеличению скорости реакции что приводит к увеличению скорости реакции

ИндуцированноеИндуцированное соответствиесоответствие уменьшает уменьшает эффективность катализа увеличивая эффективность катализа увеличивая KKMM без без соответствующего увеличения соответствующего увеличения kkcatcat по сравнению с по сравнению с ферментом находящимся в кативной форме в ферментом находящимся в кативной форме в отсутствие субстрата отсутствие субстрата

Механизм непродуктивного связыванияМеханизм непродуктивного связывания не не затрагивает каталитического превращения затрагивает каталитического превращения специфических субстратов однако он приводит к специфических субстратов однако он приводит к появлению дополнительных связывающих центров для появлению дополнительных связывающих центров для конкурирующих между собой неспецифических конкурирующих между собой неспецифических субстратовсубстратов

Специфичность ферментаСпецифичность фермента

Способность фермента узнавать Способность фермента узнавать определенный субстрат из нескольких определенный субстрат из нескольких

конкурирующих за активный центрконкурирующих за активный центр

Функция слагающаяся из прочности связывания Функция слагающаяся из прочности связывания

каждого из субстратов и кинетической каждого из субстратов и кинетической

(каталитической) специфичности (каталитической) специфичности

характеризующейся скоростью катализахарактеризующейся скоростью катализа

laquoСуммарнаяraquo специфичность характеризуется laquoСуммарнаяraquo специфичность характеризуется

отношением отношением kkcatcatKKMM

Специфичность и относительная Специфичность и относительная реакционная способностьреакционная способность

Центральная проблема специфичности Центральная проблема специфичности каким образом фермент отличает специфический каким образом фермент отличает специфический субстрат от другого меньшего или равного ему по субстрат от другого меньшего или равного ему по размерам (изостерического) субстратаразмерам (изостерического) субстрата

Такую задачу постоянно решают аминоацил-тРНК-синтетазы Если синтетаза (ЕХ) ошибочно активирует чужую аминокислоту (Y) и далее катализирует ее перенос на laquoсвоюraquo тРНКХ

или если она ошибочно этерифицирует истинной субстратной аминокислотой Х чужую тРНК

то каждое из этих событий приведет к ошибке в последовательности синтезируемой полипептидной цепи

Дискриминация аминокислот меньших или изостеричных (равных по размеру) специфическому субстрату способных разместиться в активном центре фермента определяется предпочтительным связыванием истинного субстрата за счет незначительных различий в структуре

Валил-тРНК-синтетаза

Наличие разницы в энергии связывания не до конца обеспечивает Наличие разницы в энергии связывания не до конца обеспечивает в этих случаях точность работы системы аминоацилированияв этих случаях точность работы системы аминоацилирования

валин

Изолейцил-тРНК-синтетаза

изолейцин валин треонин

Треонин связывается с валил-тРНК синтетазой в 100-200 раз слабее валина несмотря на то что он изостеричен валину поскольку в гидрофобный карман погружается гидроксильная группа вместо метиленовой Энергия активации реакции представляет собой сумму двух составляющих одна из них ndash энергия активации для стадии химического превращения а вторая ndash энергия связывания фермента с субстратом

Валил-тРНК-синтетаза

валин треонин

Различие в энергии связывания специфичного субстрата (Различие в энергии связывания специфичного субстрата (RSRS) и ) и меньшего по размерам конкурирующего соединения меньшего по размерам конкурирующего соединения HSHS равно равно дополнительной энергии связывания группы дополнительной энергии связывания группы RR имеющейся у имеющейся у специфичного субстрата и отсутствующей у меньшего специфичного субстрата и отсутствующей у меньшего субстрата по отношению к водороду субстрата по отношению к водороду

Поскольку энергия взаимодействия группы R не только входит в энергию связывания но и понижает энергию активации стадии химического превращения вклад заместителя R следует оценивать из сравнения параметров kcatKM для двух субстратов RS и HS Например если величину kcat для валина для активации валил-тРНК-синтетазой принять за 1 то для других аминокислот эта величина будет для аланина 003 для изолейцина 00019 для серина 005

Дополнительную энергию связывания группы Дополнительную энергию связывания группы RR по отношению к по отношению к водороду можно определить по формулеводороду можно определить по формуле

∆Gb=RTln(kcatKM)RS ln(kcatKM)HS

Для пары изолейцил-тРНК-синтетаза-валин неспецифический субстрат по критерию kcatKM хуже в 140-200 раз В клетках EColi [Ile][Val] = 018 Уровень ошибок изолейцил-тРНК-синтетазы на стадии активации 003-004 Экспериментально обнаружено уровень ошибок при замене Ile на Val в биосинтезе овальбумина цыпленка и гемоглобина кролика равен 310-4

Изолейцил-тРНК-синтетаза

изолейцин валин

Чему соответствует этот уровень ошибокЧему соответствует этот уровень ошибок

Ошибочное включение одной аминокислоты на Ошибочное включение одной аминокислоты на каждые 10000 остатковкаждые 10000 остатков

Одна из 20 белковых молекул длиной в 500 остатков Одна из 20 белковых молекул длиной в 500 остатков будет содержать единственную ошибочную будет содержать единственную ошибочную

аминокислотуаминокислоту

Предположив что только около 10 всех ошибок Предположив что только около 10 всех ошибок серьезно сказываются на биологической функции серьезно сказываются на биологической функции

белка можно сделать заключение что одна белка можно сделать заключение что одна молекула белка из 200 синтезированных окажется молекула белка из 200 синтезированных окажется

бесполезной (или даже вредной) в клеточном бесполезной (или даже вредной) в клеточном метаболизмеметаболизме

Коррекция ошибок в реакциях катализируемых

аминоацил-тРНК- синтетазами

Существование механизмов Существование механизмов коррекции для аминоацил-коррекции для аминоацил-

тРНК-синтетазтРНК-синтетаз

Поль Наим БергПоль Наим Берг19219266 Бруклин СШАБруклин США

Американский биохимикАмериканский биохимикНобелевская премия

по химии 1980 г

Изолейцил-тРНК-синтетаза ошибочно активирует валин Добавление тРНК к комплексу с изолейциладенилатом приводит к образованию изолейцил-тРНК а у валиладенилат-ферментного комплекса не наблюдается образование валил-тРНК поскольку при добавлении тРНК происходит гидролиз ошибочного аминоациладенилата

Существование механизмов коррекции для Существование механизмов коррекции для аминоацил-тРНК-синтетазаминоацил-тРНК-синтетаз

В присутствии тРНКВ присутствии тРНКIleIle изолейцил-тРНК-синтетаза изолейцил-тРНК-синтетаза непроизводительно гидролизует АТР АМР + непроизводительно гидролизует АТР АМР + ppppii

ИзбыточныйИзбыточный гидролиз АТРгидролиз АТР по отношению к по отношению к синтезированному продукту за счет АТР-синтезированному продукту за счет АТР-пирофосфогидролазной активности синтетазы пирофосфогидролазной активности синтетазы является является критерием существования корректирующего механизмакритерием существования корректирующего механизма включающего дополнительную стадию разрушения ошибочного включающего дополнительную стадию разрушения ошибочного продукта реакции продукта реакции

У цистеинил- и тирозил-тРНК-синтетаз специфичность высокая У цистеинил- и тирозил-тРНК-синтетаз специфичность высокая и гидролиза АТР не наблюдается и гидролиза АТР не наблюдается

В некоторых случаях когда дискриминация аминокислот на В некоторых случаях когда дискриминация аминокислот на стадии активации была недостаточной наблюдался быстрый стадии активации была недостаточной наблюдался быстрый гидролиз ошибочного аминоациладенилата вместо переноса гидролиз ошибочного аминоациладенилата вместо переноса laquoнеправильнойraquo аминокислоты на субстратную тРНКlaquoнеправильнойraquo аминокислоты на субстратную тРНК

Роль тРНК в коррекцииРоль тРНК в коррекции

Индуцирует ли тРНК гидролиз аминоациладенилата или же служит акцептором ошибочно активированной аминокислоты а затем подвергается ферментативному деацилированию

Возможные последовательности реакций катализируемых синтетазами можно записать в виде следующей схемы (АК-аминокислота)

Роль тРНК в коррекцииРоль тРНК в коррекции

Предложенные механизмы коррекции можно разделить на две группы в зависимости от того какое соединение в них гидролизуется Механизм отбраковки ошибочной аминокислоты (Механизм отбраковки ошибочной аминокислоты (стадии 1

2 5 ndash гидролиз аминоацил-тРНК) Механизм коррекции за счет гидролиза промежуточного Механизм коррекции за счет гидролиза промежуточного

аминоациладенилата (аминоациладенилата (стадии 1 и 4 ndash гидролиз аминоациладенилата)

В каждом из возможных маршрутов коррекции исправление ошибки достигается благодаря введению в реакционный путь laquoнеобратимогоraquo ответвления (реакции 4 или 5) обеспечивающего гидролиз нежелательных соединений

Механизм отбраковки ошибочной аминокислотыМеханизм отбраковки ошибочной аминокислоты

Доказательство существования механизма гидролиза аминоацил-тРНК аминоацил-тРНК-синтетазами было получено при изучении аминоацилирования тРНКVal треонином катализируемого валил-тРНК-синтетазой из BStearothermophilus

Валил-тРНК-синтетаза образует с треонином стабильный комплекс Валил-тРНК-синтетаза образует с треонином стабильный комплекс который быстро гидролизуется при добавлении тРНКкоторый быстро гидролизуется при добавлении тРНКValVal

Предшествует ли гидролизу перенос аминоацильного остатка на тРНКПредшествует ли гидролизу перенос аминоацильного остатка на тРНКValVal

Импульсный метод laquoзамороженнойraquo струиКомплекс [14С]-треонил-АМРЕVal + тРНК [14С]-треонил-тРНК

Константа гидролиза треонил-тРНК в присутствии валил-тРНК-синтетазы 40 сКонстанта гидролиза треонил-тРНК в присутствии валил-тРНК-синтетазы 40 с -1-1а для специфичной валил-тРНК 0015 са для специфичной валил-тРНК 0015 с-1-1 то есть более чем в 2000 раз ниже то есть более чем в 2000 раз ниже

Механизм коррекции за счет гидролиза Механизм коррекции за счет гидролиза промежуточного аминоациладенилатапромежуточного аминоациладенилата

Ошибочное промежуточное соединение образующееся в ходе реакции диссоциирует с фермента и гиролизуется быстрее чем правильное Для правильного аминоациладенилата скорость переноса на тРНК выше чем диссоциация те коррекция определяется соотношением кинетических констант определенных стадий

Джон Джозеф ХопфилдДжон Джозеф Хопфилд1933 Чикаго США1933 Чикаго США

биофизик и биофизик и молекулярный биологмолекулярный биолог

Механизм кинетического корректированияМеханизм кинетического корректирования

Механизм коррекции за счет гидролиза Механизм коррекции за счет гидролиза промежуточного аминоациладенилатапромежуточного аминоациладенилата

Экспериментальное доказательствоЭкспериментальное доказательствоДля валил-тРНК-синтетазы из желтого люпина в отсутствие тРНК наблюдался гидролиз

АТР АМР + ppi зависящий от присутствия несубстратных аминокислот (Cys Thr Ser и α-аминомасляной кислоты)

Константа скорости гидролиза для этих кислот 07-13 мин-1 Специфический валиладенилат-ферментный комплекс гидролизуется с константой скорости 0018 мин-1 те например в 720 раз медленнее чем комплекс валил-тРНК-синтетазы с цистеинил-аденилатом

Коррекция ошибок в реакциях Коррекция ошибок в реакциях катализируемыхкатализируемых

ДНК-полимеразамиДНК-полимеразами

Механизм коррекции при репликации ДНКМеханизм коррекции при репликации ДНК

При синтезе ДНК ошибка исправляется после полимеризации Молекула ДНК синтезируется в направлении 5rsquo-3rsquo нуклеотиды присоединяются к 3rsquo-гидроксильной группе растущей цепи ДНК

Репликативные ДНК-полимеразы обладают Репликативные ДНК-полимеразы обладают корректирующей 3rsquo-5rsquo-экзонуклеазной активностью корректирующей 3rsquo-5rsquo-экзонуклеазной активностью

выщепляющей из цепи ошибочно встроенный нуклеотидвыщепляющей из цепи ошибочно встроенный нуклеотид

Частота мутации фага Т4 коррелирует с экзонуклеазной активностью проявляемой ДНК-полимеразой Частота мутации для ЕСoli составляет 10-6-10-8 и следовательно точность репликации ДНК либо равна этим величинам либо еще выше

Механизм коррекции при репликации ДНКМеханизм коррекции при репликации ДНК

С помощью экзонуклеазной активности исправляются ошибки которые накапливаются в процессе биосинтеза Однако нарушения структуры ДНК могут возникать не только по причине неточной работы в ходе синтеза но и в результате внешних воздействий таких как ионизирующее и ультрафиолетовое облучение окислительный стресс

Возможна различная пострепликационная коррекция структуры ДНКВозможна различная пострепликационная коррекция структуры ДНК(репарация)(репарация)

Система репарации ошибочно-встроенных нуклеотидов (Система репарации ошибочно-встроенных нуклеотидов (mismatch mismatch repairrepair) специально предназначена для удаления ошибок возникших в ) специально предназначена для удаления ошибок возникших в ДНК в ходе репликацииДНК в ходе репликации

Система эксцизионной репарации оснований исправляет повреждения в Система эксцизионной репарации оснований исправляет повреждения в ДНК возникающие в результате окислительного стресса то есть ДНК возникающие в результате окислительного стресса то есть модифицированные (окисленные) основания и разрывы в одной из цепей модифицированные (окисленные) основания и разрывы в одной из цепей ДНКДНК

Система эксцизионной репарации нуклеотидов удаляет из ДНК объемные Система эксцизионной репарации нуклеотидов удаляет из ДНК объемные повреждения фотодимеры возникающие под действием повреждения фотодимеры возникающие под действием ультрафиолетового облучения объемные аддукты метаболитов ультрафиолетового облучения объемные аддукты метаболитов попадающих из окружающей среды таких как продукты сгорания курения попадающих из окружающей среды таких как продукты сгорания курения например антрацены и бензапиренынапример антрацены и бензапирены

Синтез ДНК через повреждениеСинтез ДНК через повреждение((Translesion synthesisTranslesion synthesis ndash TLS)ndash TLS)

В случае синтеза с использованием поврежденной ДНК-матрицы транслезионными (translesion) ДНК-полимеразами (например η ι κ θ μ ζ) также возникают искажения в структуре ДНК

TLS ДНК-полимеразы ведущие синтез через повреждение матрицы не обладают корректирующей активностью поскольку их задачей является ввести во чтобы то ни стало нуклеотидное звено дабы избежать остановки репликативной вилки на повреждении матрицы Затем поврежденный участок ДНК восстанавливается системами репарации

Мутации вводимые репликативными Мутации вводимые репликативными ДНК-полимеразами в ходе репликативного синтеза ДНК-полимеразами в ходе репликативного синтеза

играют не только вредную рольиграют не только вредную роль Мутации в ДНК являются движущей Мутации в ДНК являются движущей

силой эволюциисилой эволюции

• Slide 1
• Slide 2
• Slide 3
• Slide 4
• Slide 5
• Slide 6
• Slide 7
• Slide 8
• Slide 9
• Slide 10
• Slide 11
• Slide 12
• Slide 13
• Slide 14
• Slide 15
• Slide 16
• Slide 17
• Slide 18
• Slide 19
• Slide 20
• Slide 21
• Slide 22
• Slide 23
• Slide 24
• Slide 25
• Slide 26
• Slide 27
• Slide 28
• Slide 29
• Slide 30
• Slide 31
• Slide 32
• Slide 33
• Slide 34
• Slide 35
• Slide 36
• Slide 37
• Slide 38
• Slide 39
• Slide 40
• Slide 41

Фермент и субстрат Фермент и субстрат комплементарныкомплементарны когда каждая взаимодействующая группа когда каждая взаимодействующая группа

субстрата контактирует с субстрата контактирует с соответствующим центром связывания соответствующим центром связывания

фермента и энергия связывания фермента и энергия связывания принимает максимальное значениепринимает максимальное значение

Комплементарность фермента исходному Комплементарность фермента исходному субстратусубстрату

Допустим максимальная внутренняя свободная энергия связывания равна ∆Gb В рассмотренном случае она реализуется в исходном фермент-субстратном комплексе обеспечивая прочное связывание КM - константа диссоциации фермент-субстратного комплекса ndash будет мала Образование переходного состояния будет сопровождаться изменением геометрии субстрата и ухудшением его соответствия что приведет к уменьшению энергии связывания ∆GR ndash увеличение свободной энергии вызванное ухудшением структурного соответствия между ферментом и субстратом ∆G0 ndash свободная энергия активации для образования и разрыва химических связей на стадии определяемой константой kcatНаблюдаемая свободная энергия активации для стадии химического превращения субстрата с константой скорости kcat равна∆Gne=∆G0

ne+∆GR и∆GS=∆Gb

Энергия активации Гиббса для процесса

∆GТne=∆G0

ne+∆GR+∆Gb

Пунктирная линия ndash фермент структурно комплементарен субстрату сплошная ndash переходному состоянию (∆GS = ∆Gb - отрицательная величина ∆G0 и ∆GR ndash положительны)

График изменения энергии ГиббсаГрафик изменения энергии Гиббса

E + S ES продукты

Полная энергия связывания ∆Gb реализуется в переходном состоянии Исходному фермент-субстратному комплексу соответствует положительный член ∆GR который отражает возрастание энергии за счет структурного несоответствия исходного состояния переходному Этот член увеличивает КМ а прирост энергии связывания по мере приближения к переходному состоянию увеличивает kcat∆Gne = ∆G0

ne - ∆GR

∆GS = ∆Gb + ∆GR

Энергия активации Гиббса для перехода характеризующегося константой kcatKM

∆GТne=∆G ne + ∆GS = ∆G0

ne + ∆Gb

∆GR из конечного уравнения исключается

Когда фермент комплементарен переходному состоянию субстрата а не самому субстрату kcatKM возрастает в exp(∆GRRT) раз kcatKM не зависит от взаимодействий в исходном фермент-субстратном комплексе поскольку член ∆GR не входит в уравнение

Комплементарность фермента переходному Комплементарность фермента переходному состоянию субстратасостоянию субстрата

Наличие сильного связывания фермента с субстратом или Наличие сильного связывания фермента с субстратом или низкое значение Книзкое значение КМ М не является необходимым условием не является необходимым условием

протекания ферментативной реакции Для катализа важны протекания ферментативной реакции Для катализа важны высокие значения Квысокие значения КММ

Процесс эволюции ферментов направленный на увеличение Процесс эволюции ферментов направленный на увеличение скорости катализируемых ими реакций можно разделить на два скорости катализируемых ими реакций можно разделить на два этапаэтапа

11 Увеличение Увеличение kkcatcatKKMM за счет повышения комплементарности фермента за счет повышения комплементарности фермента переходному состоянию субстратапереходному состоянию субстрата

22 Увеличение концентрации фермента за счет повышения КУвеличение концентрации фермента за счет повышения КММ направленное на то чтобы в свободном состоянии находилось направленное на то чтобы в свободном состоянии находилось максимально возможное количество ферментамаксимально возможное количество фермента

Исключение ndash ферменты которые выполняют регуляторные функцииИх активность регулируется путем изменения КМ субстратов через

аллостерическое воздействие

Модель laquoключ-замокraquoМодель laquoключ-замокraquo

Теория комплементарности при фермент-субстратном взаимодействии принадлежит Э Фишеру воплотившему ее в модели laquoключ-замокraquo В 1890 г Э Фишер предложил модель согласно которой специфичность ферментов определяется точным соответствием формы фермента и субстрата Однако хотя эта модель объясняла высокую специфичность ферментов она не объясняла явления стабилизации переходного состояния которое наблюдается на практике

Герман Эмиль ФишерГерман Эмиль Фишер1852 Ойскирхен ndash 1919 Берлин1852 Ойскирхен ndash 1919 Берлин

Немецкий химик-органик и Немецкий химик-органик и биохимикбиохимик

Нобелевская премияпо химии 1902 г

Концепция деформацииКонцепция деформации(ДжБС Холдейн и Л Полинг)(ДжБС Холдейн и Л Полинг)

Активный центр фермента структурно комплементарен не самому субстрату а переходному состоянию При связывании с ферментом переходное состояние субстрата взаимодействует с ферментом более эффективно чем сам субстрат и поэтому полная энергия связывания не реализуется до тех пор пока не сформируется переходное состояние

Лайнус Карл ПолингЛайнус Карл Полинг1901 Портленд ndash 1994 Биг-Сюр1901 Портленд ndash 1994 Биг-Сюр

американский химикамериканский химикНобелевская премия

по химии 1954 г и мира 1962 г

Теория индуцированного Теория индуцированного соответствиясоответствия

Объясняет отсутствие ферментативной активности с небольшими субстратами такими как вода в которых нет групп способных обеспечить связывание и энергию для приведения фермента в активное состояние Является модификацией модели laquoключ-замокraquo - модель laquoрука-перчаткаraquo Предполагается что в отсутствии субстрата фермент структурно некомплементарен переходному состоянию Однако поскольку молекула фермента довольно гибкая а субстрат имеет жесткую структуру при образовании фермент-субстратного комплекса каталитические группы на ферменте ориентируются оптимальным для катализа образом фермент становится комплементарным переходному состоянию только после связывания субстрата Перестройка области активного центра при связывании с субстратом названа процессом конформационной адаптации

Дэниэл Эдвард КошландДэниэл Эдвард Кошланд1920 Нью-Йорк ndash 1919 Калифорния1920 Нью-Йорк ndash 1919 Калифорния

американский биохимикамериканский биохимик

Гипотеза непродуктивного связыванияГипотеза непродуктивного связывания

Было предложено что помимо продуктивного связывания в активном центре возможны другие способы связывания когда небольшие субстраты связываются но не подвергаются каталитическому превращению

Например в молекуле лизоцима активный центр имеет протяженную структуру состоящую из шести центров связывания ndash A B C D E F Для осуществления реакции необходимо чтобы молекула субстрата заняла центры D и Е Небольшие субстраты способны присоединяться с любой сторону вдоль вытянутого активного центра лизоцима не связываясь с подцентром где происходит расщепление

ДеформацияДеформация вносит положительный вклад в катализ вносит положительный вклад в катализ при условии комплементарности фермента при условии комплементарности фермента переходному состоянию субстрата увеличивая переходному состоянию субстрата увеличивая kkcatcat и и KKMM что приводит к увеличению скорости реакции что приводит к увеличению скорости реакции

ИндуцированноеИндуцированное соответствиесоответствие уменьшает уменьшает эффективность катализа увеличивая эффективность катализа увеличивая KKMM без без соответствующего увеличения соответствующего увеличения kkcatcat по сравнению с по сравнению с ферментом находящимся в кативной форме в ферментом находящимся в кативной форме в отсутствие субстрата отсутствие субстрата

Механизм непродуктивного связыванияМеханизм непродуктивного связывания не не затрагивает каталитического превращения затрагивает каталитического превращения специфических субстратов однако он приводит к специфических субстратов однако он приводит к появлению дополнительных связывающих центров для появлению дополнительных связывающих центров для конкурирующих между собой неспецифических конкурирующих между собой неспецифических субстратовсубстратов

Специфичность ферментаСпецифичность фермента

Способность фермента узнавать Способность фермента узнавать определенный субстрат из нескольких определенный субстрат из нескольких

конкурирующих за активный центрконкурирующих за активный центр

Функция слагающаяся из прочности связывания Функция слагающаяся из прочности связывания

каждого из субстратов и кинетической каждого из субстратов и кинетической

(каталитической) специфичности (каталитической) специфичности

характеризующейся скоростью катализахарактеризующейся скоростью катализа

laquoСуммарнаяraquo специфичность характеризуется laquoСуммарнаяraquo специфичность характеризуется

отношением отношением kkcatcatKKMM

Специфичность и относительная Специфичность и относительная реакционная способностьреакционная способность

Центральная проблема специфичности Центральная проблема специфичности каким образом фермент отличает специфический каким образом фермент отличает специфический субстрат от другого меньшего или равного ему по субстрат от другого меньшего или равного ему по размерам (изостерического) субстратаразмерам (изостерического) субстрата

Такую задачу постоянно решают аминоацил-тРНК-синтетазы Если синтетаза (ЕХ) ошибочно активирует чужую аминокислоту (Y) и далее катализирует ее перенос на laquoсвоюraquo тРНКХ

или если она ошибочно этерифицирует истинной субстратной аминокислотой Х чужую тРНК

то каждое из этих событий приведет к ошибке в последовательности синтезируемой полипептидной цепи

Дискриминация аминокислот меньших или изостеричных (равных по размеру) специфическому субстрату способных разместиться в активном центре фермента определяется предпочтительным связыванием истинного субстрата за счет незначительных различий в структуре

Валил-тРНК-синтетаза

Наличие разницы в энергии связывания не до конца обеспечивает Наличие разницы в энергии связывания не до конца обеспечивает в этих случаях точность работы системы аминоацилированияв этих случаях точность работы системы аминоацилирования

валин

Изолейцил-тРНК-синтетаза

изолейцин валин треонин

Треонин связывается с валил-тРНК синтетазой в 100-200 раз слабее валина несмотря на то что он изостеричен валину поскольку в гидрофобный карман погружается гидроксильная группа вместо метиленовой Энергия активации реакции представляет собой сумму двух составляющих одна из них ndash энергия активации для стадии химического превращения а вторая ndash энергия связывания фермента с субстратом

Валил-тРНК-синтетаза

валин треонин

Различие в энергии связывания специфичного субстрата (Различие в энергии связывания специфичного субстрата (RSRS) и ) и меньшего по размерам конкурирующего соединения меньшего по размерам конкурирующего соединения HSHS равно равно дополнительной энергии связывания группы дополнительной энергии связывания группы RR имеющейся у имеющейся у специфичного субстрата и отсутствующей у меньшего специфичного субстрата и отсутствующей у меньшего субстрата по отношению к водороду субстрата по отношению к водороду

Поскольку энергия взаимодействия группы R не только входит в энергию связывания но и понижает энергию активации стадии химического превращения вклад заместителя R следует оценивать из сравнения параметров kcatKM для двух субстратов RS и HS Например если величину kcat для валина для активации валил-тРНК-синтетазой принять за 1 то для других аминокислот эта величина будет для аланина 003 для изолейцина 00019 для серина 005

Дополнительную энергию связывания группы Дополнительную энергию связывания группы RR по отношению к по отношению к водороду можно определить по формулеводороду можно определить по формуле

∆Gb=RTln(kcatKM)RS ln(kcatKM)HS

Для пары изолейцил-тРНК-синтетаза-валин неспецифический субстрат по критерию kcatKM хуже в 140-200 раз В клетках EColi [Ile][Val] = 018 Уровень ошибок изолейцил-тРНК-синтетазы на стадии активации 003-004 Экспериментально обнаружено уровень ошибок при замене Ile на Val в биосинтезе овальбумина цыпленка и гемоглобина кролика равен 310-4

Изолейцил-тРНК-синтетаза

изолейцин валин

Чему соответствует этот уровень ошибокЧему соответствует этот уровень ошибок

Ошибочное включение одной аминокислоты на Ошибочное включение одной аминокислоты на каждые 10000 остатковкаждые 10000 остатков

Одна из 20 белковых молекул длиной в 500 остатков Одна из 20 белковых молекул длиной в 500 остатков будет содержать единственную ошибочную будет содержать единственную ошибочную

аминокислотуаминокислоту

Предположив что только около 10 всех ошибок Предположив что только около 10 всех ошибок серьезно сказываются на биологической функции серьезно сказываются на биологической функции

белка можно сделать заключение что одна белка можно сделать заключение что одна молекула белка из 200 синтезированных окажется молекула белка из 200 синтезированных окажется

бесполезной (или даже вредной) в клеточном бесполезной (или даже вредной) в клеточном метаболизмеметаболизме

Коррекция ошибок в реакциях катализируемых

аминоацил-тРНК- синтетазами

Существование механизмов Существование механизмов коррекции для аминоацил-коррекции для аминоацил-

тРНК-синтетазтРНК-синтетаз

Поль Наим БергПоль Наим Берг19219266 Бруклин СШАБруклин США

Американский биохимикАмериканский биохимикНобелевская премия

по химии 1980 г

Изолейцил-тРНК-синтетаза ошибочно активирует валин Добавление тРНК к комплексу с изолейциладенилатом приводит к образованию изолейцил-тРНК а у валиладенилат-ферментного комплекса не наблюдается образование валил-тРНК поскольку при добавлении тРНК происходит гидролиз ошибочного аминоациладенилата

Существование механизмов коррекции для Существование механизмов коррекции для аминоацил-тРНК-синтетазаминоацил-тРНК-синтетаз

В присутствии тРНКВ присутствии тРНКIleIle изолейцил-тРНК-синтетаза изолейцил-тРНК-синтетаза непроизводительно гидролизует АТР АМР + непроизводительно гидролизует АТР АМР + ppppii

ИзбыточныйИзбыточный гидролиз АТРгидролиз АТР по отношению к по отношению к синтезированному продукту за счет АТР-синтезированному продукту за счет АТР-пирофосфогидролазной активности синтетазы пирофосфогидролазной активности синтетазы является является критерием существования корректирующего механизмакритерием существования корректирующего механизма включающего дополнительную стадию разрушения ошибочного включающего дополнительную стадию разрушения ошибочного продукта реакции продукта реакции

У цистеинил- и тирозил-тРНК-синтетаз специфичность высокая У цистеинил- и тирозил-тРНК-синтетаз специфичность высокая и гидролиза АТР не наблюдается и гидролиза АТР не наблюдается

В некоторых случаях когда дискриминация аминокислот на В некоторых случаях когда дискриминация аминокислот на стадии активации была недостаточной наблюдался быстрый стадии активации была недостаточной наблюдался быстрый гидролиз ошибочного аминоациладенилата вместо переноса гидролиз ошибочного аминоациладенилата вместо переноса laquoнеправильнойraquo аминокислоты на субстратную тРНКlaquoнеправильнойraquo аминокислоты на субстратную тРНК

Роль тРНК в коррекцииРоль тРНК в коррекции

Индуцирует ли тРНК гидролиз аминоациладенилата или же служит акцептором ошибочно активированной аминокислоты а затем подвергается ферментативному деацилированию

Возможные последовательности реакций катализируемых синтетазами можно записать в виде следующей схемы (АК-аминокислота)

Роль тРНК в коррекцииРоль тРНК в коррекции

Предложенные механизмы коррекции можно разделить на две группы в зависимости от того какое соединение в них гидролизуется Механизм отбраковки ошибочной аминокислоты (Механизм отбраковки ошибочной аминокислоты (стадии 1

2 5 ndash гидролиз аминоацил-тРНК) Механизм коррекции за счет гидролиза промежуточного Механизм коррекции за счет гидролиза промежуточного

аминоациладенилата (аминоациладенилата (стадии 1 и 4 ndash гидролиз аминоациладенилата)

В каждом из возможных маршрутов коррекции исправление ошибки достигается благодаря введению в реакционный путь laquoнеобратимогоraquo ответвления (реакции 4 или 5) обеспечивающего гидролиз нежелательных соединений

Механизм отбраковки ошибочной аминокислотыМеханизм отбраковки ошибочной аминокислоты

Доказательство существования механизма гидролиза аминоацил-тРНК аминоацил-тРНК-синтетазами было получено при изучении аминоацилирования тРНКVal треонином катализируемого валил-тРНК-синтетазой из BStearothermophilus

Валил-тРНК-синтетаза образует с треонином стабильный комплекс Валил-тРНК-синтетаза образует с треонином стабильный комплекс который быстро гидролизуется при добавлении тРНКкоторый быстро гидролизуется при добавлении тРНКValVal

Предшествует ли гидролизу перенос аминоацильного остатка на тРНКПредшествует ли гидролизу перенос аминоацильного остатка на тРНКValVal

Импульсный метод laquoзамороженнойraquo струиКомплекс [14С]-треонил-АМРЕVal + тРНК [14С]-треонил-тРНК

Константа гидролиза треонил-тРНК в присутствии валил-тРНК-синтетазы 40 сКонстанта гидролиза треонил-тРНК в присутствии валил-тРНК-синтетазы 40 с -1-1а для специфичной валил-тРНК 0015 са для специфичной валил-тРНК 0015 с-1-1 то есть более чем в 2000 раз ниже то есть более чем в 2000 раз ниже

Механизм коррекции за счет гидролиза Механизм коррекции за счет гидролиза промежуточного аминоациладенилатапромежуточного аминоациладенилата

Ошибочное промежуточное соединение образующееся в ходе реакции диссоциирует с фермента и гиролизуется быстрее чем правильное Для правильного аминоациладенилата скорость переноса на тРНК выше чем диссоциация те коррекция определяется соотношением кинетических констант определенных стадий

Джон Джозеф ХопфилдДжон Джозеф Хопфилд1933 Чикаго США1933 Чикаго США

биофизик и биофизик и молекулярный биологмолекулярный биолог

Механизм кинетического корректированияМеханизм кинетического корректирования

Механизм коррекции за счет гидролиза Механизм коррекции за счет гидролиза промежуточного аминоациладенилатапромежуточного аминоациладенилата

Экспериментальное доказательствоЭкспериментальное доказательствоДля валил-тРНК-синтетазы из желтого люпина в отсутствие тРНК наблюдался гидролиз

АТР АМР + ppi зависящий от присутствия несубстратных аминокислот (Cys Thr Ser и α-аминомасляной кислоты)

Константа скорости гидролиза для этих кислот 07-13 мин-1 Специфический валиладенилат-ферментный комплекс гидролизуется с константой скорости 0018 мин-1 те например в 720 раз медленнее чем комплекс валил-тРНК-синтетазы с цистеинил-аденилатом

Коррекция ошибок в реакциях Коррекция ошибок в реакциях катализируемыхкатализируемых

ДНК-полимеразамиДНК-полимеразами

Механизм коррекции при репликации ДНКМеханизм коррекции при репликации ДНК

При синтезе ДНК ошибка исправляется после полимеризации Молекула ДНК синтезируется в направлении 5rsquo-3rsquo нуклеотиды присоединяются к 3rsquo-гидроксильной группе растущей цепи ДНК

Репликативные ДНК-полимеразы обладают Репликативные ДНК-полимеразы обладают корректирующей 3rsquo-5rsquo-экзонуклеазной активностью корректирующей 3rsquo-5rsquo-экзонуклеазной активностью

выщепляющей из цепи ошибочно встроенный нуклеотидвыщепляющей из цепи ошибочно встроенный нуклеотид

Частота мутации фага Т4 коррелирует с экзонуклеазной активностью проявляемой ДНК-полимеразой Частота мутации для ЕСoli составляет 10-6-10-8 и следовательно точность репликации ДНК либо равна этим величинам либо еще выше

Механизм коррекции при репликации ДНКМеханизм коррекции при репликации ДНК

С помощью экзонуклеазной активности исправляются ошибки которые накапливаются в процессе биосинтеза Однако нарушения структуры ДНК могут возникать не только по причине неточной работы в ходе синтеза но и в результате внешних воздействий таких как ионизирующее и ультрафиолетовое облучение окислительный стресс

Возможна различная пострепликационная коррекция структуры ДНКВозможна различная пострепликационная коррекция структуры ДНК(репарация)(репарация)

Система репарации ошибочно-встроенных нуклеотидов (Система репарации ошибочно-встроенных нуклеотидов (mismatch mismatch repairrepair) специально предназначена для удаления ошибок возникших в ) специально предназначена для удаления ошибок возникших в ДНК в ходе репликацииДНК в ходе репликации

Система эксцизионной репарации оснований исправляет повреждения в Система эксцизионной репарации оснований исправляет повреждения в ДНК возникающие в результате окислительного стресса то есть ДНК возникающие в результате окислительного стресса то есть модифицированные (окисленные) основания и разрывы в одной из цепей модифицированные (окисленные) основания и разрывы в одной из цепей ДНКДНК

Система эксцизионной репарации нуклеотидов удаляет из ДНК объемные Система эксцизионной репарации нуклеотидов удаляет из ДНК объемные повреждения фотодимеры возникающие под действием повреждения фотодимеры возникающие под действием ультрафиолетового облучения объемные аддукты метаболитов ультрафиолетового облучения объемные аддукты метаболитов попадающих из окружающей среды таких как продукты сгорания курения попадающих из окружающей среды таких как продукты сгорания курения например антрацены и бензапиренынапример антрацены и бензапирены

Синтез ДНК через повреждениеСинтез ДНК через повреждение((Translesion synthesisTranslesion synthesis ndash TLS)ndash TLS)

В случае синтеза с использованием поврежденной ДНК-матрицы транслезионными (translesion) ДНК-полимеразами (например η ι κ θ μ ζ) также возникают искажения в структуре ДНК

TLS ДНК-полимеразы ведущие синтез через повреждение матрицы не обладают корректирующей активностью поскольку их задачей является ввести во чтобы то ни стало нуклеотидное звено дабы избежать остановки репликативной вилки на повреждении матрицы Затем поврежденный участок ДНК восстанавливается системами репарации

Мутации вводимые репликативными Мутации вводимые репликативными ДНК-полимеразами в ходе репликативного синтеза ДНК-полимеразами в ходе репликативного синтеза

играют не только вредную рольиграют не только вредную роль Мутации в ДНК являются движущей Мутации в ДНК являются движущей

силой эволюциисилой эволюции

• Slide 1
• Slide 2
• Slide 3
• Slide 4
• Slide 5
• Slide 6
• Slide 7
• Slide 8
• Slide 9
• Slide 10
• Slide 11
• Slide 12
• Slide 13
• Slide 14
• Slide 15
• Slide 16
• Slide 17
• Slide 18
• Slide 19
• Slide 20
• Slide 21
• Slide 22
• Slide 23
• Slide 24
• Slide 25
• Slide 26
• Slide 27
• Slide 28
• Slide 29
• Slide 30
• Slide 31
• Slide 32
• Slide 33
• Slide 34
• Slide 35
• Slide 36
• Slide 37
• Slide 38
• Slide 39
• Slide 40
• Slide 41

Комплементарность фермента исходному Комплементарность фермента исходному субстратусубстрату

Допустим максимальная внутренняя свободная энергия связывания равна ∆Gb В рассмотренном случае она реализуется в исходном фермент-субстратном комплексе обеспечивая прочное связывание КM - константа диссоциации фермент-субстратного комплекса ndash будет мала Образование переходного состояния будет сопровождаться изменением геометрии субстрата и ухудшением его соответствия что приведет к уменьшению энергии связывания ∆GR ndash увеличение свободной энергии вызванное ухудшением структурного соответствия между ферментом и субстратом ∆G0 ndash свободная энергия активации для образования и разрыва химических связей на стадии определяемой константой kcatНаблюдаемая свободная энергия активации для стадии химического превращения субстрата с константой скорости kcat равна∆Gne=∆G0

ne+∆GR и∆GS=∆Gb

Энергия активации Гиббса для процесса

∆GТne=∆G0

ne+∆GR+∆Gb

Пунктирная линия ndash фермент структурно комплементарен субстрату сплошная ndash переходному состоянию (∆GS = ∆Gb - отрицательная величина ∆G0 и ∆GR ndash положительны)

График изменения энергии ГиббсаГрафик изменения энергии Гиббса

E + S ES продукты

Полная энергия связывания ∆Gb реализуется в переходном состоянии Исходному фермент-субстратному комплексу соответствует положительный член ∆GR который отражает возрастание энергии за счет структурного несоответствия исходного состояния переходному Этот член увеличивает КМ а прирост энергии связывания по мере приближения к переходному состоянию увеличивает kcat∆Gne = ∆G0

ne - ∆GR

∆GS = ∆Gb + ∆GR

Энергия активации Гиббса для перехода характеризующегося константой kcatKM

∆GТne=∆G ne + ∆GS = ∆G0

ne + ∆Gb

∆GR из конечного уравнения исключается

Когда фермент комплементарен переходному состоянию субстрата а не самому субстрату kcatKM возрастает в exp(∆GRRT) раз kcatKM не зависит от взаимодействий в исходном фермент-субстратном комплексе поскольку член ∆GR не входит в уравнение

Комплементарность фермента переходному Комплементарность фермента переходному состоянию субстратасостоянию субстрата

Наличие сильного связывания фермента с субстратом или Наличие сильного связывания фермента с субстратом или низкое значение Книзкое значение КМ М не является необходимым условием не является необходимым условием

протекания ферментативной реакции Для катализа важны протекания ферментативной реакции Для катализа важны высокие значения Квысокие значения КММ

Процесс эволюции ферментов направленный на увеличение Процесс эволюции ферментов направленный на увеличение скорости катализируемых ими реакций можно разделить на два скорости катализируемых ими реакций можно разделить на два этапаэтапа

11 Увеличение Увеличение kkcatcatKKMM за счет повышения комплементарности фермента за счет повышения комплементарности фермента переходному состоянию субстратапереходному состоянию субстрата

22 Увеличение концентрации фермента за счет повышения КУвеличение концентрации фермента за счет повышения КММ направленное на то чтобы в свободном состоянии находилось направленное на то чтобы в свободном состоянии находилось максимально возможное количество ферментамаксимально возможное количество фермента

Исключение ndash ферменты которые выполняют регуляторные функцииИх активность регулируется путем изменения КМ субстратов через

аллостерическое воздействие

Модель laquoключ-замокraquoМодель laquoключ-замокraquo

Теория комплементарности при фермент-субстратном взаимодействии принадлежит Э Фишеру воплотившему ее в модели laquoключ-замокraquo В 1890 г Э Фишер предложил модель согласно которой специфичность ферментов определяется точным соответствием формы фермента и субстрата Однако хотя эта модель объясняла высокую специфичность ферментов она не объясняла явления стабилизации переходного состояния которое наблюдается на практике

Герман Эмиль ФишерГерман Эмиль Фишер1852 Ойскирхен ndash 1919 Берлин1852 Ойскирхен ndash 1919 Берлин

Немецкий химик-органик и Немецкий химик-органик и биохимикбиохимик

Нобелевская премияпо химии 1902 г

Концепция деформацииКонцепция деформации(ДжБС Холдейн и Л Полинг)(ДжБС Холдейн и Л Полинг)

Активный центр фермента структурно комплементарен не самому субстрату а переходному состоянию При связывании с ферментом переходное состояние субстрата взаимодействует с ферментом более эффективно чем сам субстрат и поэтому полная энергия связывания не реализуется до тех пор пока не сформируется переходное состояние

Лайнус Карл ПолингЛайнус Карл Полинг1901 Портленд ndash 1994 Биг-Сюр1901 Портленд ndash 1994 Биг-Сюр

американский химикамериканский химикНобелевская премия

по химии 1954 г и мира 1962 г

Теория индуцированного Теория индуцированного соответствиясоответствия

Объясняет отсутствие ферментативной активности с небольшими субстратами такими как вода в которых нет групп способных обеспечить связывание и энергию для приведения фермента в активное состояние Является модификацией модели laquoключ-замокraquo - модель laquoрука-перчаткаraquo Предполагается что в отсутствии субстрата фермент структурно некомплементарен переходному состоянию Однако поскольку молекула фермента довольно гибкая а субстрат имеет жесткую структуру при образовании фермент-субстратного комплекса каталитические группы на ферменте ориентируются оптимальным для катализа образом фермент становится комплементарным переходному состоянию только после связывания субстрата Перестройка области активного центра при связывании с субстратом названа процессом конформационной адаптации

Дэниэл Эдвард КошландДэниэл Эдвард Кошланд1920 Нью-Йорк ndash 1919 Калифорния1920 Нью-Йорк ndash 1919 Калифорния

американский биохимикамериканский биохимик

Гипотеза непродуктивного связыванияГипотеза непродуктивного связывания

Было предложено что помимо продуктивного связывания в активном центре возможны другие способы связывания когда небольшие субстраты связываются но не подвергаются каталитическому превращению

Например в молекуле лизоцима активный центр имеет протяженную структуру состоящую из шести центров связывания ndash A B C D E F Для осуществления реакции необходимо чтобы молекула субстрата заняла центры D и Е Небольшие субстраты способны присоединяться с любой сторону вдоль вытянутого активного центра лизоцима не связываясь с подцентром где происходит расщепление

ДеформацияДеформация вносит положительный вклад в катализ вносит положительный вклад в катализ при условии комплементарности фермента при условии комплементарности фермента переходному состоянию субстрата увеличивая переходному состоянию субстрата увеличивая kkcatcat и и KKMM что приводит к увеличению скорости реакции что приводит к увеличению скорости реакции

ИндуцированноеИндуцированное соответствиесоответствие уменьшает уменьшает эффективность катализа увеличивая эффективность катализа увеличивая KKMM без без соответствующего увеличения соответствующего увеличения kkcatcat по сравнению с по сравнению с ферментом находящимся в кативной форме в ферментом находящимся в кативной форме в отсутствие субстрата отсутствие субстрата

Механизм непродуктивного связыванияМеханизм непродуктивного связывания не не затрагивает каталитического превращения затрагивает каталитического превращения специфических субстратов однако он приводит к специфических субстратов однако он приводит к появлению дополнительных связывающих центров для появлению дополнительных связывающих центров для конкурирующих между собой неспецифических конкурирующих между собой неспецифических субстратовсубстратов

Специфичность ферментаСпецифичность фермента

Способность фермента узнавать Способность фермента узнавать определенный субстрат из нескольких определенный субстрат из нескольких

конкурирующих за активный центрконкурирующих за активный центр

Функция слагающаяся из прочности связывания Функция слагающаяся из прочности связывания

каждого из субстратов и кинетической каждого из субстратов и кинетической

(каталитической) специфичности (каталитической) специфичности

характеризующейся скоростью катализахарактеризующейся скоростью катализа

laquoСуммарнаяraquo специфичность характеризуется laquoСуммарнаяraquo специфичность характеризуется

отношением отношением kkcatcatKKMM

Специфичность и относительная Специфичность и относительная реакционная способностьреакционная способность

Центральная проблема специфичности Центральная проблема специфичности каким образом фермент отличает специфический каким образом фермент отличает специфический субстрат от другого меньшего или равного ему по субстрат от другого меньшего или равного ему по размерам (изостерического) субстратаразмерам (изостерического) субстрата

Такую задачу постоянно решают аминоацил-тРНК-синтетазы Если синтетаза (ЕХ) ошибочно активирует чужую аминокислоту (Y) и далее катализирует ее перенос на laquoсвоюraquo тРНКХ

или если она ошибочно этерифицирует истинной субстратной аминокислотой Х чужую тРНК

то каждое из этих событий приведет к ошибке в последовательности синтезируемой полипептидной цепи

Дискриминация аминокислот меньших или изостеричных (равных по размеру) специфическому субстрату способных разместиться в активном центре фермента определяется предпочтительным связыванием истинного субстрата за счет незначительных различий в структуре

Валил-тРНК-синтетаза

Наличие разницы в энергии связывания не до конца обеспечивает Наличие разницы в энергии связывания не до конца обеспечивает в этих случаях точность работы системы аминоацилированияв этих случаях точность работы системы аминоацилирования

валин

Изолейцил-тРНК-синтетаза

изолейцин валин треонин

Треонин связывается с валил-тРНК синтетазой в 100-200 раз слабее валина несмотря на то что он изостеричен валину поскольку в гидрофобный карман погружается гидроксильная группа вместо метиленовой Энергия активации реакции представляет собой сумму двух составляющих одна из них ndash энергия активации для стадии химического превращения а вторая ndash энергия связывания фермента с субстратом

Валил-тРНК-синтетаза

валин треонин

Различие в энергии связывания специфичного субстрата (Различие в энергии связывания специфичного субстрата (RSRS) и ) и меньшего по размерам конкурирующего соединения меньшего по размерам конкурирующего соединения HSHS равно равно дополнительной энергии связывания группы дополнительной энергии связывания группы RR имеющейся у имеющейся у специфичного субстрата и отсутствующей у меньшего специфичного субстрата и отсутствующей у меньшего субстрата по отношению к водороду субстрата по отношению к водороду

Поскольку энергия взаимодействия группы R не только входит в энергию связывания но и понижает энергию активации стадии химического превращения вклад заместителя R следует оценивать из сравнения параметров kcatKM для двух субстратов RS и HS Например если величину kcat для валина для активации валил-тРНК-синтетазой принять за 1 то для других аминокислот эта величина будет для аланина 003 для изолейцина 00019 для серина 005

Дополнительную энергию связывания группы Дополнительную энергию связывания группы RR по отношению к по отношению к водороду можно определить по формулеводороду можно определить по формуле

∆Gb=RTln(kcatKM)RS ln(kcatKM)HS

Для пары изолейцил-тРНК-синтетаза-валин неспецифический субстрат по критерию kcatKM хуже в 140-200 раз В клетках EColi [Ile][Val] = 018 Уровень ошибок изолейцил-тРНК-синтетазы на стадии активации 003-004 Экспериментально обнаружено уровень ошибок при замене Ile на Val в биосинтезе овальбумина цыпленка и гемоглобина кролика равен 310-4

Изолейцил-тРНК-синтетаза

изолейцин валин

Чему соответствует этот уровень ошибокЧему соответствует этот уровень ошибок

Ошибочное включение одной аминокислоты на Ошибочное включение одной аминокислоты на каждые 10000 остатковкаждые 10000 остатков

Одна из 20 белковых молекул длиной в 500 остатков Одна из 20 белковых молекул длиной в 500 остатков будет содержать единственную ошибочную будет содержать единственную ошибочную

аминокислотуаминокислоту

Предположив что только около 10 всех ошибок Предположив что только около 10 всех ошибок серьезно сказываются на биологической функции серьезно сказываются на биологической функции

белка можно сделать заключение что одна белка можно сделать заключение что одна молекула белка из 200 синтезированных окажется молекула белка из 200 синтезированных окажется

бесполезной (или даже вредной) в клеточном бесполезной (или даже вредной) в клеточном метаболизмеметаболизме

Коррекция ошибок в реакциях катализируемых

аминоацил-тРНК- синтетазами

Существование механизмов Существование механизмов коррекции для аминоацил-коррекции для аминоацил-

тРНК-синтетазтРНК-синтетаз

Поль Наим БергПоль Наим Берг19219266 Бруклин СШАБруклин США

Американский биохимикАмериканский биохимикНобелевская премия

по химии 1980 г

Изолейцил-тРНК-синтетаза ошибочно активирует валин Добавление тРНК к комплексу с изолейциладенилатом приводит к образованию изолейцил-тРНК а у валиладенилат-ферментного комплекса не наблюдается образование валил-тРНК поскольку при добавлении тРНК происходит гидролиз ошибочного аминоациладенилата

Существование механизмов коррекции для Существование механизмов коррекции для аминоацил-тРНК-синтетазаминоацил-тРНК-синтетаз

В присутствии тРНКВ присутствии тРНКIleIle изолейцил-тРНК-синтетаза изолейцил-тРНК-синтетаза непроизводительно гидролизует АТР АМР + непроизводительно гидролизует АТР АМР + ppppii

ИзбыточныйИзбыточный гидролиз АТРгидролиз АТР по отношению к по отношению к синтезированному продукту за счет АТР-синтезированному продукту за счет АТР-пирофосфогидролазной активности синтетазы пирофосфогидролазной активности синтетазы является является критерием существования корректирующего механизмакритерием существования корректирующего механизма включающего дополнительную стадию разрушения ошибочного включающего дополнительную стадию разрушения ошибочного продукта реакции продукта реакции

У цистеинил- и тирозил-тРНК-синтетаз специфичность высокая У цистеинил- и тирозил-тРНК-синтетаз специфичность высокая и гидролиза АТР не наблюдается и гидролиза АТР не наблюдается

В некоторых случаях когда дискриминация аминокислот на В некоторых случаях когда дискриминация аминокислот на стадии активации была недостаточной наблюдался быстрый стадии активации была недостаточной наблюдался быстрый гидролиз ошибочного аминоациладенилата вместо переноса гидролиз ошибочного аминоациладенилата вместо переноса laquoнеправильнойraquo аминокислоты на субстратную тРНКlaquoнеправильнойraquo аминокислоты на субстратную тРНК

Роль тРНК в коррекцииРоль тРНК в коррекции

Индуцирует ли тРНК гидролиз аминоациладенилата или же служит акцептором ошибочно активированной аминокислоты а затем подвергается ферментативному деацилированию

Возможные последовательности реакций катализируемых синтетазами можно записать в виде следующей схемы (АК-аминокислота)

Роль тРНК в коррекцииРоль тРНК в коррекции

Предложенные механизмы коррекции можно разделить на две группы в зависимости от того какое соединение в них гидролизуется Механизм отбраковки ошибочной аминокислоты (Механизм отбраковки ошибочной аминокислоты (стадии 1

2 5 ndash гидролиз аминоацил-тРНК) Механизм коррекции за счет гидролиза промежуточного Механизм коррекции за счет гидролиза промежуточного

аминоациладенилата (аминоациладенилата (стадии 1 и 4 ndash гидролиз аминоациладенилата)

В каждом из возможных маршрутов коррекции исправление ошибки достигается благодаря введению в реакционный путь laquoнеобратимогоraquo ответвления (реакции 4 или 5) обеспечивающего гидролиз нежелательных соединений

Механизм отбраковки ошибочной аминокислотыМеханизм отбраковки ошибочной аминокислоты

Доказательство существования механизма гидролиза аминоацил-тРНК аминоацил-тРНК-синтетазами было получено при изучении аминоацилирования тРНКVal треонином катализируемого валил-тРНК-синтетазой из BStearothermophilus

Валил-тРНК-синтетаза образует с треонином стабильный комплекс Валил-тРНК-синтетаза образует с треонином стабильный комплекс который быстро гидролизуется при добавлении тРНКкоторый быстро гидролизуется при добавлении тРНКValVal

Предшествует ли гидролизу перенос аминоацильного остатка на тРНКПредшествует ли гидролизу перенос аминоацильного остатка на тРНКValVal

Импульсный метод laquoзамороженнойraquo струиКомплекс [14С]-треонил-АМРЕVal + тРНК [14С]-треонил-тРНК

Константа гидролиза треонил-тРНК в присутствии валил-тРНК-синтетазы 40 сКонстанта гидролиза треонил-тРНК в присутствии валил-тРНК-синтетазы 40 с -1-1а для специфичной валил-тРНК 0015 са для специфичной валил-тРНК 0015 с-1-1 то есть более чем в 2000 раз ниже то есть более чем в 2000 раз ниже

Механизм коррекции за счет гидролиза Механизм коррекции за счет гидролиза промежуточного аминоациладенилатапромежуточного аминоациладенилата

Ошибочное промежуточное соединение образующееся в ходе реакции диссоциирует с фермента и гиролизуется быстрее чем правильное Для правильного аминоациладенилата скорость переноса на тРНК выше чем диссоциация те коррекция определяется соотношением кинетических констант определенных стадий

Джон Джозеф ХопфилдДжон Джозеф Хопфилд1933 Чикаго США1933 Чикаго США

биофизик и биофизик и молекулярный биологмолекулярный биолог

Механизм кинетического корректированияМеханизм кинетического корректирования

Механизм коррекции за счет гидролиза Механизм коррекции за счет гидролиза промежуточного аминоациладенилатапромежуточного аминоациладенилата

Экспериментальное доказательствоЭкспериментальное доказательствоДля валил-тРНК-синтетазы из желтого люпина в отсутствие тРНК наблюдался гидролиз

АТР АМР + ppi зависящий от присутствия несубстратных аминокислот (Cys Thr Ser и α-аминомасляной кислоты)

Константа скорости гидролиза для этих кислот 07-13 мин-1 Специфический валиладенилат-ферментный комплекс гидролизуется с константой скорости 0018 мин-1 те например в 720 раз медленнее чем комплекс валил-тРНК-синтетазы с цистеинил-аденилатом

Коррекция ошибок в реакциях Коррекция ошибок в реакциях катализируемыхкатализируемых

ДНК-полимеразамиДНК-полимеразами

Механизм коррекции при репликации ДНКМеханизм коррекции при репликации ДНК

При синтезе ДНК ошибка исправляется после полимеризации Молекула ДНК синтезируется в направлении 5rsquo-3rsquo нуклеотиды присоединяются к 3rsquo-гидроксильной группе растущей цепи ДНК

Репликативные ДНК-полимеразы обладают Репликативные ДНК-полимеразы обладают корректирующей 3rsquo-5rsquo-экзонуклеазной активностью корректирующей 3rsquo-5rsquo-экзонуклеазной активностью

выщепляющей из цепи ошибочно встроенный нуклеотидвыщепляющей из цепи ошибочно встроенный нуклеотид

Частота мутации фага Т4 коррелирует с экзонуклеазной активностью проявляемой ДНК-полимеразой Частота мутации для ЕСoli составляет 10-6-10-8 и следовательно точность репликации ДНК либо равна этим величинам либо еще выше

Механизм коррекции при репликации ДНКМеханизм коррекции при репликации ДНК

С помощью экзонуклеазной активности исправляются ошибки которые накапливаются в процессе биосинтеза Однако нарушения структуры ДНК могут возникать не только по причине неточной работы в ходе синтеза но и в результате внешних воздействий таких как ионизирующее и ультрафиолетовое облучение окислительный стресс

Возможна различная пострепликационная коррекция структуры ДНКВозможна различная пострепликационная коррекция структуры ДНК(репарация)(репарация)

Система репарации ошибочно-встроенных нуклеотидов (Система репарации ошибочно-встроенных нуклеотидов (mismatch mismatch repairrepair) специально предназначена для удаления ошибок возникших в ) специально предназначена для удаления ошибок возникших в ДНК в ходе репликацииДНК в ходе репликации

Система эксцизионной репарации оснований исправляет повреждения в Система эксцизионной репарации оснований исправляет повреждения в ДНК возникающие в результате окислительного стресса то есть ДНК возникающие в результате окислительного стресса то есть модифицированные (окисленные) основания и разрывы в одной из цепей модифицированные (окисленные) основания и разрывы в одной из цепей ДНКДНК

Система эксцизионной репарации нуклеотидов удаляет из ДНК объемные Система эксцизионной репарации нуклеотидов удаляет из ДНК объемные повреждения фотодимеры возникающие под действием повреждения фотодимеры возникающие под действием ультрафиолетового облучения объемные аддукты метаболитов ультрафиолетового облучения объемные аддукты метаболитов попадающих из окружающей среды таких как продукты сгорания курения попадающих из окружающей среды таких как продукты сгорания курения например антрацены и бензапиренынапример антрацены и бензапирены

Синтез ДНК через повреждениеСинтез ДНК через повреждение((Translesion synthesisTranslesion synthesis ndash TLS)ndash TLS)

В случае синтеза с использованием поврежденной ДНК-матрицы транслезионными (translesion) ДНК-полимеразами (например η ι κ θ μ ζ) также возникают искажения в структуре ДНК

TLS ДНК-полимеразы ведущие синтез через повреждение матрицы не обладают корректирующей активностью поскольку их задачей является ввести во чтобы то ни стало нуклеотидное звено дабы избежать остановки репликативной вилки на повреждении матрицы Затем поврежденный участок ДНК восстанавливается системами репарации

Мутации вводимые репликативными Мутации вводимые репликативными ДНК-полимеразами в ходе репликативного синтеза ДНК-полимеразами в ходе репликативного синтеза

играют не только вредную рольиграют не только вредную роль Мутации в ДНК являются движущей Мутации в ДНК являются движущей

силой эволюциисилой эволюции

• Slide 1
• Slide 2
• Slide 3
• Slide 4
• Slide 5
• Slide 6
• Slide 7
• Slide 8
• Slide 9
• Slide 10
• Slide 11
• Slide 12
• Slide 13
• Slide 14
• Slide 15
• Slide 16
• Slide 17
• Slide 18
• Slide 19
• Slide 20
• Slide 21
• Slide 22
• Slide 23
• Slide 24
• Slide 25
• Slide 26
• Slide 27
• Slide 28
• Slide 29
• Slide 30
• Slide 31
• Slide 32
• Slide 33
• Slide 34
• Slide 35
• Slide 36
• Slide 37
• Slide 38
• Slide 39
• Slide 40
• Slide 41

Пунктирная линия ndash фермент структурно комплементарен субстрату сплошная ndash переходному состоянию (∆GS = ∆Gb - отрицательная величина ∆G0 и ∆GR ndash положительны)

График изменения энергии ГиббсаГрафик изменения энергии Гиббса

E + S ES продукты

Полная энергия связывания ∆Gb реализуется в переходном состоянии Исходному фермент-субстратному комплексу соответствует положительный член ∆GR который отражает возрастание энергии за счет структурного несоответствия исходного состояния переходному Этот член увеличивает КМ а прирост энергии связывания по мере приближения к переходному состоянию увеличивает kcat∆Gne = ∆G0

ne - ∆GR

∆GS = ∆Gb + ∆GR

Энергия активации Гиббса для перехода характеризующегося константой kcatKM

∆GТne=∆G ne + ∆GS = ∆G0

ne + ∆Gb

∆GR из конечного уравнения исключается

Когда фермент комплементарен переходному состоянию субстрата а не самому субстрату kcatKM возрастает в exp(∆GRRT) раз kcatKM не зависит от взаимодействий в исходном фермент-субстратном комплексе поскольку член ∆GR не входит в уравнение

Комплементарность фермента переходному Комплементарность фермента переходному состоянию субстратасостоянию субстрата

Наличие сильного связывания фермента с субстратом или Наличие сильного связывания фермента с субстратом или низкое значение Книзкое значение КМ М не является необходимым условием не является необходимым условием

протекания ферментативной реакции Для катализа важны протекания ферментативной реакции Для катализа важны высокие значения Квысокие значения КММ

Процесс эволюции ферментов направленный на увеличение Процесс эволюции ферментов направленный на увеличение скорости катализируемых ими реакций можно разделить на два скорости катализируемых ими реакций можно разделить на два этапаэтапа

11 Увеличение Увеличение kkcatcatKKMM за счет повышения комплементарности фермента за счет повышения комплементарности фермента переходному состоянию субстратапереходному состоянию субстрата

22 Увеличение концентрации фермента за счет повышения КУвеличение концентрации фермента за счет повышения КММ направленное на то чтобы в свободном состоянии находилось направленное на то чтобы в свободном состоянии находилось максимально возможное количество ферментамаксимально возможное количество фермента

Исключение ndash ферменты которые выполняют регуляторные функцииИх активность регулируется путем изменения КМ субстратов через

аллостерическое воздействие

Модель laquoключ-замокraquoМодель laquoключ-замокraquo

Теория комплементарности при фермент-субстратном взаимодействии принадлежит Э Фишеру воплотившему ее в модели laquoключ-замокraquo В 1890 г Э Фишер предложил модель согласно которой специфичность ферментов определяется точным соответствием формы фермента и субстрата Однако хотя эта модель объясняла высокую специфичность ферментов она не объясняла явления стабилизации переходного состояния которое наблюдается на практике

Герман Эмиль ФишерГерман Эмиль Фишер1852 Ойскирхен ndash 1919 Берлин1852 Ойскирхен ndash 1919 Берлин

Немецкий химик-органик и Немецкий химик-органик и биохимикбиохимик

Нобелевская премияпо химии 1902 г

Концепция деформацииКонцепция деформации(ДжБС Холдейн и Л Полинг)(ДжБС Холдейн и Л Полинг)

Активный центр фермента структурно комплементарен не самому субстрату а переходному состоянию При связывании с ферментом переходное состояние субстрата взаимодействует с ферментом более эффективно чем сам субстрат и поэтому полная энергия связывания не реализуется до тех пор пока не сформируется переходное состояние

Лайнус Карл ПолингЛайнус Карл Полинг1901 Портленд ndash 1994 Биг-Сюр1901 Портленд ndash 1994 Биг-Сюр

американский химикамериканский химикНобелевская премия

по химии 1954 г и мира 1962 г

Теория индуцированного Теория индуцированного соответствиясоответствия

Объясняет отсутствие ферментативной активности с небольшими субстратами такими как вода в которых нет групп способных обеспечить связывание и энергию для приведения фермента в активное состояние Является модификацией модели laquoключ-замокraquo - модель laquoрука-перчаткаraquo Предполагается что в отсутствии субстрата фермент структурно некомплементарен переходному состоянию Однако поскольку молекула фермента довольно гибкая а субстрат имеет жесткую структуру при образовании фермент-субстратного комплекса каталитические группы на ферменте ориентируются оптимальным для катализа образом фермент становится комплементарным переходному состоянию только после связывания субстрата Перестройка области активного центра при связывании с субстратом названа процессом конформационной адаптации

Дэниэл Эдвард КошландДэниэл Эдвард Кошланд1920 Нью-Йорк ndash 1919 Калифорния1920 Нью-Йорк ndash 1919 Калифорния

американский биохимикамериканский биохимик

Гипотеза непродуктивного связыванияГипотеза непродуктивного связывания

Было предложено что помимо продуктивного связывания в активном центре возможны другие способы связывания когда небольшие субстраты связываются но не подвергаются каталитическому превращению

Например в молекуле лизоцима активный центр имеет протяженную структуру состоящую из шести центров связывания ndash A B C D E F Для осуществления реакции необходимо чтобы молекула субстрата заняла центры D и Е Небольшие субстраты способны присоединяться с любой сторону вдоль вытянутого активного центра лизоцима не связываясь с подцентром где происходит расщепление

ДеформацияДеформация вносит положительный вклад в катализ вносит положительный вклад в катализ при условии комплементарности фермента при условии комплементарности фермента переходному состоянию субстрата увеличивая переходному состоянию субстрата увеличивая kkcatcat и и KKMM что приводит к увеличению скорости реакции что приводит к увеличению скорости реакции

ИндуцированноеИндуцированное соответствиесоответствие уменьшает уменьшает эффективность катализа увеличивая эффективность катализа увеличивая KKMM без без соответствующего увеличения соответствующего увеличения kkcatcat по сравнению с по сравнению с ферментом находящимся в кативной форме в ферментом находящимся в кативной форме в отсутствие субстрата отсутствие субстрата

Механизм непродуктивного связыванияМеханизм непродуктивного связывания не не затрагивает каталитического превращения затрагивает каталитического превращения специфических субстратов однако он приводит к специфических субстратов однако он приводит к появлению дополнительных связывающих центров для появлению дополнительных связывающих центров для конкурирующих между собой неспецифических конкурирующих между собой неспецифических субстратовсубстратов

Специфичность ферментаСпецифичность фермента

Способность фермента узнавать Способность фермента узнавать определенный субстрат из нескольких определенный субстрат из нескольких

конкурирующих за активный центрконкурирующих за активный центр

Функция слагающаяся из прочности связывания Функция слагающаяся из прочности связывания

каждого из субстратов и кинетической каждого из субстратов и кинетической

(каталитической) специфичности (каталитической) специфичности

характеризующейся скоростью катализахарактеризующейся скоростью катализа

laquoСуммарнаяraquo специфичность характеризуется laquoСуммарнаяraquo специфичность характеризуется

отношением отношением kkcatcatKKMM

Специфичность и относительная Специфичность и относительная реакционная способностьреакционная способность

Центральная проблема специфичности Центральная проблема специфичности каким образом фермент отличает специфический каким образом фермент отличает специфический субстрат от другого меньшего или равного ему по субстрат от другого меньшего или равного ему по размерам (изостерического) субстратаразмерам (изостерического) субстрата

Такую задачу постоянно решают аминоацил-тРНК-синтетазы Если синтетаза (ЕХ) ошибочно активирует чужую аминокислоту (Y) и далее катализирует ее перенос на laquoсвоюraquo тРНКХ

или если она ошибочно этерифицирует истинной субстратной аминокислотой Х чужую тРНК

то каждое из этих событий приведет к ошибке в последовательности синтезируемой полипептидной цепи

Дискриминация аминокислот меньших или изостеричных (равных по размеру) специфическому субстрату способных разместиться в активном центре фермента определяется предпочтительным связыванием истинного субстрата за счет незначительных различий в структуре

Валил-тРНК-синтетаза

Наличие разницы в энергии связывания не до конца обеспечивает Наличие разницы в энергии связывания не до конца обеспечивает в этих случаях точность работы системы аминоацилированияв этих случаях точность работы системы аминоацилирования

валин

Изолейцил-тРНК-синтетаза

изолейцин валин треонин

Треонин связывается с валил-тРНК синтетазой в 100-200 раз слабее валина несмотря на то что он изостеричен валину поскольку в гидрофобный карман погружается гидроксильная группа вместо метиленовой Энергия активации реакции представляет собой сумму двух составляющих одна из них ndash энергия активации для стадии химического превращения а вторая ndash энергия связывания фермента с субстратом

Валил-тРНК-синтетаза

валин треонин

Различие в энергии связывания специфичного субстрата (Различие в энергии связывания специфичного субстрата (RSRS) и ) и меньшего по размерам конкурирующего соединения меньшего по размерам конкурирующего соединения HSHS равно равно дополнительной энергии связывания группы дополнительной энергии связывания группы RR имеющейся у имеющейся у специфичного субстрата и отсутствующей у меньшего специфичного субстрата и отсутствующей у меньшего субстрата по отношению к водороду субстрата по отношению к водороду

Поскольку энергия взаимодействия группы R не только входит в энергию связывания но и понижает энергию активации стадии химического превращения вклад заместителя R следует оценивать из сравнения параметров kcatKM для двух субстратов RS и HS Например если величину kcat для валина для активации валил-тРНК-синтетазой принять за 1 то для других аминокислот эта величина будет для аланина 003 для изолейцина 00019 для серина 005

Дополнительную энергию связывания группы Дополнительную энергию связывания группы RR по отношению к по отношению к водороду можно определить по формулеводороду можно определить по формуле

∆Gb=RTln(kcatKM)RS ln(kcatKM)HS

Для пары изолейцил-тРНК-синтетаза-валин неспецифический субстрат по критерию kcatKM хуже в 140-200 раз В клетках EColi [Ile][Val] = 018 Уровень ошибок изолейцил-тРНК-синтетазы на стадии активации 003-004 Экспериментально обнаружено уровень ошибок при замене Ile на Val в биосинтезе овальбумина цыпленка и гемоглобина кролика равен 310-4

Изолейцил-тРНК-синтетаза

изолейцин валин

Чему соответствует этот уровень ошибокЧему соответствует этот уровень ошибок

Ошибочное включение одной аминокислоты на Ошибочное включение одной аминокислоты на каждые 10000 остатковкаждые 10000 остатков

Одна из 20 белковых молекул длиной в 500 остатков Одна из 20 белковых молекул длиной в 500 остатков будет содержать единственную ошибочную будет содержать единственную ошибочную

аминокислотуаминокислоту

Предположив что только около 10 всех ошибок Предположив что только около 10 всех ошибок серьезно сказываются на биологической функции серьезно сказываются на биологической функции

белка можно сделать заключение что одна белка можно сделать заключение что одна молекула белка из 200 синтезированных окажется молекула белка из 200 синтезированных окажется

бесполезной (или даже вредной) в клеточном бесполезной (или даже вредной) в клеточном метаболизмеметаболизме

Коррекция ошибок в реакциях катализируемых

аминоацил-тРНК- синтетазами

Существование механизмов Существование механизмов коррекции для аминоацил-коррекции для аминоацил-

тРНК-синтетазтРНК-синтетаз

Поль Наим БергПоль Наим Берг19219266 Бруклин СШАБруклин США

Американский биохимикАмериканский биохимикНобелевская премия

по химии 1980 г

Изолейцил-тРНК-синтетаза ошибочно активирует валин Добавление тРНК к комплексу с изолейциладенилатом приводит к образованию изолейцил-тРНК а у валиладенилат-ферментного комплекса не наблюдается образование валил-тРНК поскольку при добавлении тРНК происходит гидролиз ошибочного аминоациладенилата

Существование механизмов коррекции для Существование механизмов коррекции для аминоацил-тРНК-синтетазаминоацил-тРНК-синтетаз

В присутствии тРНКВ присутствии тРНКIleIle изолейцил-тРНК-синтетаза изолейцил-тРНК-синтетаза непроизводительно гидролизует АТР АМР + непроизводительно гидролизует АТР АМР + ppppii

ИзбыточныйИзбыточный гидролиз АТРгидролиз АТР по отношению к по отношению к синтезированному продукту за счет АТР-синтезированному продукту за счет АТР-пирофосфогидролазной активности синтетазы пирофосфогидролазной активности синтетазы является является критерием существования корректирующего механизмакритерием существования корректирующего механизма включающего дополнительную стадию разрушения ошибочного включающего дополнительную стадию разрушения ошибочного продукта реакции продукта реакции

У цистеинил- и тирозил-тРНК-синтетаз специфичность высокая У цистеинил- и тирозил-тРНК-синтетаз специфичность высокая и гидролиза АТР не наблюдается и гидролиза АТР не наблюдается

В некоторых случаях когда дискриминация аминокислот на В некоторых случаях когда дискриминация аминокислот на стадии активации была недостаточной наблюдался быстрый стадии активации была недостаточной наблюдался быстрый гидролиз ошибочного аминоациладенилата вместо переноса гидролиз ошибочного аминоациладенилата вместо переноса laquoнеправильнойraquo аминокислоты на субстратную тРНКlaquoнеправильнойraquo аминокислоты на субстратную тРНК

Роль тРНК в коррекцииРоль тРНК в коррекции

Индуцирует ли тРНК гидролиз аминоациладенилата или же служит акцептором ошибочно активированной аминокислоты а затем подвергается ферментативному деацилированию

Возможные последовательности реакций катализируемых синтетазами можно записать в виде следующей схемы (АК-аминокислота)

Роль тРНК в коррекцииРоль тРНК в коррекции

Предложенные механизмы коррекции можно разделить на две группы в зависимости от того какое соединение в них гидролизуется Механизм отбраковки ошибочной аминокислоты (Механизм отбраковки ошибочной аминокислоты (стадии 1

2 5 ndash гидролиз аминоацил-тРНК) Механизм коррекции за счет гидролиза промежуточного Механизм коррекции за счет гидролиза промежуточного

аминоациладенилата (аминоациладенилата (стадии 1 и 4 ndash гидролиз аминоациладенилата)

В каждом из возможных маршрутов коррекции исправление ошибки достигается благодаря введению в реакционный путь laquoнеобратимогоraquo ответвления (реакции 4 или 5) обеспечивающего гидролиз нежелательных соединений

Механизм отбраковки ошибочной аминокислотыМеханизм отбраковки ошибочной аминокислоты

Доказательство существования механизма гидролиза аминоацил-тРНК аминоацил-тРНК-синтетазами было получено при изучении аминоацилирования тРНКVal треонином катализируемого валил-тРНК-синтетазой из BStearothermophilus

Валил-тРНК-синтетаза образует с треонином стабильный комплекс Валил-тРНК-синтетаза образует с треонином стабильный комплекс который быстро гидролизуется при добавлении тРНКкоторый быстро гидролизуется при добавлении тРНКValVal

Предшествует ли гидролизу перенос аминоацильного остатка на тРНКПредшествует ли гидролизу перенос аминоацильного остатка на тРНКValVal

Импульсный метод laquoзамороженнойraquo струиКомплекс [14С]-треонил-АМРЕVal + тРНК [14С]-треонил-тРНК

Константа гидролиза треонил-тРНК в присутствии валил-тРНК-синтетазы 40 сКонстанта гидролиза треонил-тРНК в присутствии валил-тРНК-синтетазы 40 с -1-1а для специфичной валил-тРНК 0015 са для специфичной валил-тРНК 0015 с-1-1 то есть более чем в 2000 раз ниже то есть более чем в 2000 раз ниже

Механизм коррекции за счет гидролиза Механизм коррекции за счет гидролиза промежуточного аминоациладенилатапромежуточного аминоациладенилата

Ошибочное промежуточное соединение образующееся в ходе реакции диссоциирует с фермента и гиролизуется быстрее чем правильное Для правильного аминоациладенилата скорость переноса на тРНК выше чем диссоциация те коррекция определяется соотношением кинетических констант определенных стадий

Джон Джозеф ХопфилдДжон Джозеф Хопфилд1933 Чикаго США1933 Чикаго США

биофизик и биофизик и молекулярный биологмолекулярный биолог

Механизм кинетического корректированияМеханизм кинетического корректирования

Механизм коррекции за счет гидролиза Механизм коррекции за счет гидролиза промежуточного аминоациладенилатапромежуточного аминоациладенилата

Экспериментальное доказательствоЭкспериментальное доказательствоДля валил-тРНК-синтетазы из желтого люпина в отсутствие тРНК наблюдался гидролиз

АТР АМР + ppi зависящий от присутствия несубстратных аминокислот (Cys Thr Ser и α-аминомасляной кислоты)

Константа скорости гидролиза для этих кислот 07-13 мин-1 Специфический валиладенилат-ферментный комплекс гидролизуется с константой скорости 0018 мин-1 те например в 720 раз медленнее чем комплекс валил-тРНК-синтетазы с цистеинил-аденилатом

Коррекция ошибок в реакциях Коррекция ошибок в реакциях катализируемыхкатализируемых

ДНК-полимеразамиДНК-полимеразами

Механизм коррекции при репликации ДНКМеханизм коррекции при репликации ДНК

При синтезе ДНК ошибка исправляется после полимеризации Молекула ДНК синтезируется в направлении 5rsquo-3rsquo нуклеотиды присоединяются к 3rsquo-гидроксильной группе растущей цепи ДНК

Репликативные ДНК-полимеразы обладают Репликативные ДНК-полимеразы обладают корректирующей 3rsquo-5rsquo-экзонуклеазной активностью корректирующей 3rsquo-5rsquo-экзонуклеазной активностью

выщепляющей из цепи ошибочно встроенный нуклеотидвыщепляющей из цепи ошибочно встроенный нуклеотид

Частота мутации фага Т4 коррелирует с экзонуклеазной активностью проявляемой ДНК-полимеразой Частота мутации для ЕСoli составляет 10-6-10-8 и следовательно точность репликации ДНК либо равна этим величинам либо еще выше

Механизм коррекции при репликации ДНКМеханизм коррекции при репликации ДНК

С помощью экзонуклеазной активности исправляются ошибки которые накапливаются в процессе биосинтеза Однако нарушения структуры ДНК могут возникать не только по причине неточной работы в ходе синтеза но и в результате внешних воздействий таких как ионизирующее и ультрафиолетовое облучение окислительный стресс

Возможна различная пострепликационная коррекция структуры ДНКВозможна различная пострепликационная коррекция структуры ДНК(репарация)(репарация)

Система репарации ошибочно-встроенных нуклеотидов (Система репарации ошибочно-встроенных нуклеотидов (mismatch mismatch repairrepair) специально предназначена для удаления ошибок возникших в ) специально предназначена для удаления ошибок возникших в ДНК в ходе репликацииДНК в ходе репликации

Система эксцизионной репарации оснований исправляет повреждения в Система эксцизионной репарации оснований исправляет повреждения в ДНК возникающие в результате окислительного стресса то есть ДНК возникающие в результате окислительного стресса то есть модифицированные (окисленные) основания и разрывы в одной из цепей модифицированные (окисленные) основания и разрывы в одной из цепей ДНКДНК

Система эксцизионной репарации нуклеотидов удаляет из ДНК объемные Система эксцизионной репарации нуклеотидов удаляет из ДНК объемные повреждения фотодимеры возникающие под действием повреждения фотодимеры возникающие под действием ультрафиолетового облучения объемные аддукты метаболитов ультрафиолетового облучения объемные аддукты метаболитов попадающих из окружающей среды таких как продукты сгорания курения попадающих из окружающей среды таких как продукты сгорания курения например антрацены и бензапиренынапример антрацены и бензапирены

Синтез ДНК через повреждениеСинтез ДНК через повреждение((Translesion synthesisTranslesion synthesis ndash TLS)ndash TLS)

В случае синтеза с использованием поврежденной ДНК-матрицы транслезионными (translesion) ДНК-полимеразами (например η ι κ θ μ ζ) также возникают искажения в структуре ДНК

TLS ДНК-полимеразы ведущие синтез через повреждение матрицы не обладают корректирующей активностью поскольку их задачей является ввести во чтобы то ни стало нуклеотидное звено дабы избежать остановки репликативной вилки на повреждении матрицы Затем поврежденный участок ДНК восстанавливается системами репарации

Мутации вводимые репликативными Мутации вводимые репликативными ДНК-полимеразами в ходе репликативного синтеза ДНК-полимеразами в ходе репликативного синтеза

играют не только вредную рольиграют не только вредную роль Мутации в ДНК являются движущей Мутации в ДНК являются движущей

силой эволюциисилой эволюции

• Slide 1
• Slide 2
• Slide 3
• Slide 4
• Slide 5
• Slide 6
• Slide 7
• Slide 8
• Slide 9
• Slide 10
• Slide 11
• Slide 12
• Slide 13
• Slide 14
• Slide 15
• Slide 16
• Slide 17
• Slide 18
• Slide 19
• Slide 20
• Slide 21
• Slide 22
• Slide 23
• Slide 24
• Slide 25
• Slide 26
• Slide 27
• Slide 28
• Slide 29
• Slide 30
• Slide 31
• Slide 32
• Slide 33
• Slide 34
• Slide 35
• Slide 36
• Slide 37
• Slide 38
• Slide 39
• Slide 40
• Slide 41

Полная энергия связывания ∆Gb реализуется в переходном состоянии Исходному фермент-субстратному комплексу соответствует положительный член ∆GR который отражает возрастание энергии за счет структурного несоответствия исходного состояния переходному Этот член увеличивает КМ а прирост энергии связывания по мере приближения к переходному состоянию увеличивает kcat∆Gne = ∆G0

ne - ∆GR

∆GS = ∆Gb + ∆GR

Энергия активации Гиббса для перехода характеризующегося константой kcatKM

∆GТne=∆G ne + ∆GS = ∆G0

ne + ∆Gb

∆GR из конечного уравнения исключается

Когда фермент комплементарен переходному состоянию субстрата а не самому субстрату kcatKM возрастает в exp(∆GRRT) раз kcatKM не зависит от взаимодействий в исходном фермент-субстратном комплексе поскольку член ∆GR не входит в уравнение

Комплементарность фермента переходному Комплементарность фермента переходному состоянию субстратасостоянию субстрата

Наличие сильного связывания фермента с субстратом или Наличие сильного связывания фермента с субстратом или низкое значение Книзкое значение КМ М не является необходимым условием не является необходимым условием

протекания ферментативной реакции Для катализа важны протекания ферментативной реакции Для катализа важны высокие значения Квысокие значения КММ

Процесс эволюции ферментов направленный на увеличение Процесс эволюции ферментов направленный на увеличение скорости катализируемых ими реакций можно разделить на два скорости катализируемых ими реакций можно разделить на два этапаэтапа

11 Увеличение Увеличение kkcatcatKKMM за счет повышения комплементарности фермента за счет повышения комплементарности фермента переходному состоянию субстратапереходному состоянию субстрата

22 Увеличение концентрации фермента за счет повышения КУвеличение концентрации фермента за счет повышения КММ направленное на то чтобы в свободном состоянии находилось направленное на то чтобы в свободном состоянии находилось максимально возможное количество ферментамаксимально возможное количество фермента

Исключение ndash ферменты которые выполняют регуляторные функцииИх активность регулируется путем изменения КМ субстратов через

аллостерическое воздействие

Модель laquoключ-замокraquoМодель laquoключ-замокraquo

Теория комплементарности при фермент-субстратном взаимодействии принадлежит Э Фишеру воплотившему ее в модели laquoключ-замокraquo В 1890 г Э Фишер предложил модель согласно которой специфичность ферментов определяется точным соответствием формы фермента и субстрата Однако хотя эта модель объясняла высокую специфичность ферментов она не объясняла явления стабилизации переходного состояния которое наблюдается на практике

Герман Эмиль ФишерГерман Эмиль Фишер1852 Ойскирхен ndash 1919 Берлин1852 Ойскирхен ndash 1919 Берлин

Немецкий химик-органик и Немецкий химик-органик и биохимикбиохимик

Нобелевская премияпо химии 1902 г

Концепция деформацииКонцепция деформации(ДжБС Холдейн и Л Полинг)(ДжБС Холдейн и Л Полинг)

Активный центр фермента структурно комплементарен не самому субстрату а переходному состоянию При связывании с ферментом переходное состояние субстрата взаимодействует с ферментом более эффективно чем сам субстрат и поэтому полная энергия связывания не реализуется до тех пор пока не сформируется переходное состояние

Лайнус Карл ПолингЛайнус Карл Полинг1901 Портленд ndash 1994 Биг-Сюр1901 Портленд ndash 1994 Биг-Сюр

американский химикамериканский химикНобелевская премия

по химии 1954 г и мира 1962 г

Теория индуцированного Теория индуцированного соответствиясоответствия

Объясняет отсутствие ферментативной активности с небольшими субстратами такими как вода в которых нет групп способных обеспечить связывание и энергию для приведения фермента в активное состояние Является модификацией модели laquoключ-замокraquo - модель laquoрука-перчаткаraquo Предполагается что в отсутствии субстрата фермент структурно некомплементарен переходному состоянию Однако поскольку молекула фермента довольно гибкая а субстрат имеет жесткую структуру при образовании фермент-субстратного комплекса каталитические группы на ферменте ориентируются оптимальным для катализа образом фермент становится комплементарным переходному состоянию только после связывания субстрата Перестройка области активного центра при связывании с субстратом названа процессом конформационной адаптации

Дэниэл Эдвард КошландДэниэл Эдвард Кошланд1920 Нью-Йорк ndash 1919 Калифорния1920 Нью-Йорк ndash 1919 Калифорния

американский биохимикамериканский биохимик

Гипотеза непродуктивного связыванияГипотеза непродуктивного связывания

Было предложено что помимо продуктивного связывания в активном центре возможны другие способы связывания когда небольшие субстраты связываются но не подвергаются каталитическому превращению

Например в молекуле лизоцима активный центр имеет протяженную структуру состоящую из шести центров связывания ndash A B C D E F Для осуществления реакции необходимо чтобы молекула субстрата заняла центры D и Е Небольшие субстраты способны присоединяться с любой сторону вдоль вытянутого активного центра лизоцима не связываясь с подцентром где происходит расщепление

ДеформацияДеформация вносит положительный вклад в катализ вносит положительный вклад в катализ при условии комплементарности фермента при условии комплементарности фермента переходному состоянию субстрата увеличивая переходному состоянию субстрата увеличивая kkcatcat и и KKMM что приводит к увеличению скорости реакции что приводит к увеличению скорости реакции

ИндуцированноеИндуцированное соответствиесоответствие уменьшает уменьшает эффективность катализа увеличивая эффективность катализа увеличивая KKMM без без соответствующего увеличения соответствующего увеличения kkcatcat по сравнению с по сравнению с ферментом находящимся в кативной форме в ферментом находящимся в кативной форме в отсутствие субстрата отсутствие субстрата

Механизм непродуктивного связыванияМеханизм непродуктивного связывания не не затрагивает каталитического превращения затрагивает каталитического превращения специфических субстратов однако он приводит к специфических субстратов однако он приводит к появлению дополнительных связывающих центров для появлению дополнительных связывающих центров для конкурирующих между собой неспецифических конкурирующих между собой неспецифических субстратовсубстратов

Специфичность ферментаСпецифичность фермента

Способность фермента узнавать Способность фермента узнавать определенный субстрат из нескольких определенный субстрат из нескольких

конкурирующих за активный центрконкурирующих за активный центр

Функция слагающаяся из прочности связывания Функция слагающаяся из прочности связывания

каждого из субстратов и кинетической каждого из субстратов и кинетической

(каталитической) специфичности (каталитической) специфичности

характеризующейся скоростью катализахарактеризующейся скоростью катализа

laquoСуммарнаяraquo специфичность характеризуется laquoСуммарнаяraquo специфичность характеризуется

отношением отношением kkcatcatKKMM

Специфичность и относительная Специфичность и относительная реакционная способностьреакционная способность

Центральная проблема специфичности Центральная проблема специфичности каким образом фермент отличает специфический каким образом фермент отличает специфический субстрат от другого меньшего или равного ему по субстрат от другого меньшего или равного ему по размерам (изостерического) субстратаразмерам (изостерического) субстрата

Такую задачу постоянно решают аминоацил-тРНК-синтетазы Если синтетаза (ЕХ) ошибочно активирует чужую аминокислоту (Y) и далее катализирует ее перенос на laquoсвоюraquo тРНКХ

или если она ошибочно этерифицирует истинной субстратной аминокислотой Х чужую тРНК

то каждое из этих событий приведет к ошибке в последовательности синтезируемой полипептидной цепи

Дискриминация аминокислот меньших или изостеричных (равных по размеру) специфическому субстрату способных разместиться в активном центре фермента определяется предпочтительным связыванием истинного субстрата за счет незначительных различий в структуре

Валил-тРНК-синтетаза

Наличие разницы в энергии связывания не до конца обеспечивает Наличие разницы в энергии связывания не до конца обеспечивает в этих случаях точность работы системы аминоацилированияв этих случаях точность работы системы аминоацилирования

валин

Изолейцил-тРНК-синтетаза

изолейцин валин треонин

Треонин связывается с валил-тРНК синтетазой в 100-200 раз слабее валина несмотря на то что он изостеричен валину поскольку в гидрофобный карман погружается гидроксильная группа вместо метиленовой Энергия активации реакции представляет собой сумму двух составляющих одна из них ndash энергия активации для стадии химического превращения а вторая ndash энергия связывания фермента с субстратом

Валил-тРНК-синтетаза

валин треонин

Различие в энергии связывания специфичного субстрата (Различие в энергии связывания специфичного субстрата (RSRS) и ) и меньшего по размерам конкурирующего соединения меньшего по размерам конкурирующего соединения HSHS равно равно дополнительной энергии связывания группы дополнительной энергии связывания группы RR имеющейся у имеющейся у специфичного субстрата и отсутствующей у меньшего специфичного субстрата и отсутствующей у меньшего субстрата по отношению к водороду субстрата по отношению к водороду

Поскольку энергия взаимодействия группы R не только входит в энергию связывания но и понижает энергию активации стадии химического превращения вклад заместителя R следует оценивать из сравнения параметров kcatKM для двух субстратов RS и HS Например если величину kcat для валина для активации валил-тРНК-синтетазой принять за 1 то для других аминокислот эта величина будет для аланина 003 для изолейцина 00019 для серина 005

Дополнительную энергию связывания группы Дополнительную энергию связывания группы RR по отношению к по отношению к водороду можно определить по формулеводороду можно определить по формуле

∆Gb=RTln(kcatKM)RS ln(kcatKM)HS

Для пары изолейцил-тРНК-синтетаза-валин неспецифический субстрат по критерию kcatKM хуже в 140-200 раз В клетках EColi [Ile][Val] = 018 Уровень ошибок изолейцил-тРНК-синтетазы на стадии активации 003-004 Экспериментально обнаружено уровень ошибок при замене Ile на Val в биосинтезе овальбумина цыпленка и гемоглобина кролика равен 310-4

Изолейцил-тРНК-синтетаза

изолейцин валин

Чему соответствует этот уровень ошибокЧему соответствует этот уровень ошибок

Ошибочное включение одной аминокислоты на Ошибочное включение одной аминокислоты на каждые 10000 остатковкаждые 10000 остатков

Одна из 20 белковых молекул длиной в 500 остатков Одна из 20 белковых молекул длиной в 500 остатков будет содержать единственную ошибочную будет содержать единственную ошибочную

аминокислотуаминокислоту

Предположив что только около 10 всех ошибок Предположив что только около 10 всех ошибок серьезно сказываются на биологической функции серьезно сказываются на биологической функции

белка можно сделать заключение что одна белка можно сделать заключение что одна молекула белка из 200 синтезированных окажется молекула белка из 200 синтезированных окажется

бесполезной (или даже вредной) в клеточном бесполезной (или даже вредной) в клеточном метаболизмеметаболизме

Коррекция ошибок в реакциях катализируемых

аминоацил-тРНК- синтетазами

Существование механизмов Существование механизмов коррекции для аминоацил-коррекции для аминоацил-

тРНК-синтетазтРНК-синтетаз

Поль Наим БергПоль Наим Берг19219266 Бруклин СШАБруклин США

Американский биохимикАмериканский биохимикНобелевская премия

по химии 1980 г

Изолейцил-тРНК-синтетаза ошибочно активирует валин Добавление тРНК к комплексу с изолейциладенилатом приводит к образованию изолейцил-тРНК а у валиладенилат-ферментного комплекса не наблюдается образование валил-тРНК поскольку при добавлении тРНК происходит гидролиз ошибочного аминоациладенилата

Существование механизмов коррекции для Существование механизмов коррекции для аминоацил-тРНК-синтетазаминоацил-тРНК-синтетаз

В присутствии тРНКВ присутствии тРНКIleIle изолейцил-тРНК-синтетаза изолейцил-тРНК-синтетаза непроизводительно гидролизует АТР АМР + непроизводительно гидролизует АТР АМР + ppppii

ИзбыточныйИзбыточный гидролиз АТРгидролиз АТР по отношению к по отношению к синтезированному продукту за счет АТР-синтезированному продукту за счет АТР-пирофосфогидролазной активности синтетазы пирофосфогидролазной активности синтетазы является является критерием существования корректирующего механизмакритерием существования корректирующего механизма включающего дополнительную стадию разрушения ошибочного включающего дополнительную стадию разрушения ошибочного продукта реакции продукта реакции

У цистеинил- и тирозил-тРНК-синтетаз специфичность высокая У цистеинил- и тирозил-тРНК-синтетаз специфичность высокая и гидролиза АТР не наблюдается и гидролиза АТР не наблюдается

В некоторых случаях когда дискриминация аминокислот на В некоторых случаях когда дискриминация аминокислот на стадии активации была недостаточной наблюдался быстрый стадии активации была недостаточной наблюдался быстрый гидролиз ошибочного аминоациладенилата вместо переноса гидролиз ошибочного аминоациладенилата вместо переноса laquoнеправильнойraquo аминокислоты на субстратную тРНКlaquoнеправильнойraquo аминокислоты на субстратную тРНК

Роль тРНК в коррекцииРоль тРНК в коррекции

Индуцирует ли тРНК гидролиз аминоациладенилата или же служит акцептором ошибочно активированной аминокислоты а затем подвергается ферментативному деацилированию

Возможные последовательности реакций катализируемых синтетазами можно записать в виде следующей схемы (АК-аминокислота)

Роль тРНК в коррекцииРоль тРНК в коррекции

Предложенные механизмы коррекции можно разделить на две группы в зависимости от того какое соединение в них гидролизуется Механизм отбраковки ошибочной аминокислоты (Механизм отбраковки ошибочной аминокислоты (стадии 1

2 5 ndash гидролиз аминоацил-тРНК) Механизм коррекции за счет гидролиза промежуточного Механизм коррекции за счет гидролиза промежуточного

аминоациладенилата (аминоациладенилата (стадии 1 и 4 ndash гидролиз аминоациладенилата)

В каждом из возможных маршрутов коррекции исправление ошибки достигается благодаря введению в реакционный путь laquoнеобратимогоraquo ответвления (реакции 4 или 5) обеспечивающего гидролиз нежелательных соединений

Механизм отбраковки ошибочной аминокислотыМеханизм отбраковки ошибочной аминокислоты

Доказательство существования механизма гидролиза аминоацил-тРНК аминоацил-тРНК-синтетазами было получено при изучении аминоацилирования тРНКVal треонином катализируемого валил-тРНК-синтетазой из BStearothermophilus

Валил-тРНК-синтетаза образует с треонином стабильный комплекс Валил-тРНК-синтетаза образует с треонином стабильный комплекс который быстро гидролизуется при добавлении тРНКкоторый быстро гидролизуется при добавлении тРНКValVal

Предшествует ли гидролизу перенос аминоацильного остатка на тРНКПредшествует ли гидролизу перенос аминоацильного остатка на тРНКValVal

Импульсный метод laquoзамороженнойraquo струиКомплекс [14С]-треонил-АМРЕVal + тРНК [14С]-треонил-тРНК

Константа гидролиза треонил-тРНК в присутствии валил-тРНК-синтетазы 40 сКонстанта гидролиза треонил-тРНК в присутствии валил-тРНК-синтетазы 40 с -1-1а для специфичной валил-тРНК 0015 са для специфичной валил-тРНК 0015 с-1-1 то есть более чем в 2000 раз ниже то есть более чем в 2000 раз ниже

Механизм коррекции за счет гидролиза Механизм коррекции за счет гидролиза промежуточного аминоациладенилатапромежуточного аминоациладенилата

Ошибочное промежуточное соединение образующееся в ходе реакции диссоциирует с фермента и гиролизуется быстрее чем правильное Для правильного аминоациладенилата скорость переноса на тРНК выше чем диссоциация те коррекция определяется соотношением кинетических констант определенных стадий

Джон Джозеф ХопфилдДжон Джозеф Хопфилд1933 Чикаго США1933 Чикаго США

биофизик и биофизик и молекулярный биологмолекулярный биолог

Механизм кинетического корректированияМеханизм кинетического корректирования

Механизм коррекции за счет гидролиза Механизм коррекции за счет гидролиза промежуточного аминоациладенилатапромежуточного аминоациладенилата

Экспериментальное доказательствоЭкспериментальное доказательствоДля валил-тРНК-синтетазы из желтого люпина в отсутствие тРНК наблюдался гидролиз

АТР АМР + ppi зависящий от присутствия несубстратных аминокислот (Cys Thr Ser и α-аминомасляной кислоты)

Константа скорости гидролиза для этих кислот 07-13 мин-1 Специфический валиладенилат-ферментный комплекс гидролизуется с константой скорости 0018 мин-1 те например в 720 раз медленнее чем комплекс валил-тРНК-синтетазы с цистеинил-аденилатом

Коррекция ошибок в реакциях Коррекция ошибок в реакциях катализируемыхкатализируемых

ДНК-полимеразамиДНК-полимеразами

Механизм коррекции при репликации ДНКМеханизм коррекции при репликации ДНК

При синтезе ДНК ошибка исправляется после полимеризации Молекула ДНК синтезируется в направлении 5rsquo-3rsquo нуклеотиды присоединяются к 3rsquo-гидроксильной группе растущей цепи ДНК

Репликативные ДНК-полимеразы обладают Репликативные ДНК-полимеразы обладают корректирующей 3rsquo-5rsquo-экзонуклеазной активностью корректирующей 3rsquo-5rsquo-экзонуклеазной активностью

выщепляющей из цепи ошибочно встроенный нуклеотидвыщепляющей из цепи ошибочно встроенный нуклеотид

Частота мутации фага Т4 коррелирует с экзонуклеазной активностью проявляемой ДНК-полимеразой Частота мутации для ЕСoli составляет 10-6-10-8 и следовательно точность репликации ДНК либо равна этим величинам либо еще выше

Механизм коррекции при репликации ДНКМеханизм коррекции при репликации ДНК

С помощью экзонуклеазной активности исправляются ошибки которые накапливаются в процессе биосинтеза Однако нарушения структуры ДНК могут возникать не только по причине неточной работы в ходе синтеза но и в результате внешних воздействий таких как ионизирующее и ультрафиолетовое облучение окислительный стресс

Возможна различная пострепликационная коррекция структуры ДНКВозможна различная пострепликационная коррекция структуры ДНК(репарация)(репарация)

Система репарации ошибочно-встроенных нуклеотидов (Система репарации ошибочно-встроенных нуклеотидов (mismatch mismatch repairrepair) специально предназначена для удаления ошибок возникших в ) специально предназначена для удаления ошибок возникших в ДНК в ходе репликацииДНК в ходе репликации

Система эксцизионной репарации оснований исправляет повреждения в Система эксцизионной репарации оснований исправляет повреждения в ДНК возникающие в результате окислительного стресса то есть ДНК возникающие в результате окислительного стресса то есть модифицированные (окисленные) основания и разрывы в одной из цепей модифицированные (окисленные) основания и разрывы в одной из цепей ДНКДНК

Система эксцизионной репарации нуклеотидов удаляет из ДНК объемные Система эксцизионной репарации нуклеотидов удаляет из ДНК объемные повреждения фотодимеры возникающие под действием повреждения фотодимеры возникающие под действием ультрафиолетового облучения объемные аддукты метаболитов ультрафиолетового облучения объемные аддукты метаболитов попадающих из окружающей среды таких как продукты сгорания курения попадающих из окружающей среды таких как продукты сгорания курения например антрацены и бензапиренынапример антрацены и бензапирены

Синтез ДНК через повреждениеСинтез ДНК через повреждение((Translesion synthesisTranslesion synthesis ndash TLS)ndash TLS)

В случае синтеза с использованием поврежденной ДНК-матрицы транслезионными (translesion) ДНК-полимеразами (например η ι κ θ μ ζ) также возникают искажения в структуре ДНК

TLS ДНК-полимеразы ведущие синтез через повреждение матрицы не обладают корректирующей активностью поскольку их задачей является ввести во чтобы то ни стало нуклеотидное звено дабы избежать остановки репликативной вилки на повреждении матрицы Затем поврежденный участок ДНК восстанавливается системами репарации

Мутации вводимые репликативными Мутации вводимые репликативными ДНК-полимеразами в ходе репликативного синтеза ДНК-полимеразами в ходе репликативного синтеза

играют не только вредную рольиграют не только вредную роль Мутации в ДНК являются движущей Мутации в ДНК являются движущей

силой эволюциисилой эволюции

• Slide 1
• Slide 2
• Slide 3
• Slide 4
• Slide 5
• Slide 6
• Slide 7
• Slide 8
• Slide 9
• Slide 10
• Slide 11
• Slide 12
• Slide 13
• Slide 14
• Slide 15
• Slide 16
• Slide 17
• Slide 18
• Slide 19
• Slide 20
• Slide 21
• Slide 22
• Slide 23
• Slide 24
• Slide 25
• Slide 26
• Slide 27
• Slide 28
• Slide 29
• Slide 30
• Slide 31
• Slide 32
• Slide 33
• Slide 34
• Slide 35
• Slide 36
• Slide 37
• Slide 38
• Slide 39
• Slide 40
• Slide 41

Наличие сильного связывания фермента с субстратом или Наличие сильного связывания фермента с субстратом или низкое значение Книзкое значение КМ М не является необходимым условием не является необходимым условием

протекания ферментативной реакции Для катализа важны протекания ферментативной реакции Для катализа важны высокие значения Квысокие значения КММ

Процесс эволюции ферментов направленный на увеличение Процесс эволюции ферментов направленный на увеличение скорости катализируемых ими реакций можно разделить на два скорости катализируемых ими реакций можно разделить на два этапаэтапа

11 Увеличение Увеличение kkcatcatKKMM за счет повышения комплементарности фермента за счет повышения комплементарности фермента переходному состоянию субстратапереходному состоянию субстрата

22 Увеличение концентрации фермента за счет повышения КУвеличение концентрации фермента за счет повышения КММ направленное на то чтобы в свободном состоянии находилось направленное на то чтобы в свободном состоянии находилось максимально возможное количество ферментамаксимально возможное количество фермента

Исключение ndash ферменты которые выполняют регуляторные функцииИх активность регулируется путем изменения КМ субстратов через

аллостерическое воздействие

Модель laquoключ-замокraquoМодель laquoключ-замокraquo

Теория комплементарности при фермент-субстратном взаимодействии принадлежит Э Фишеру воплотившему ее в модели laquoключ-замокraquo В 1890 г Э Фишер предложил модель согласно которой специфичность ферментов определяется точным соответствием формы фермента и субстрата Однако хотя эта модель объясняла высокую специфичность ферментов она не объясняла явления стабилизации переходного состояния которое наблюдается на практике

Герман Эмиль ФишерГерман Эмиль Фишер1852 Ойскирхен ndash 1919 Берлин1852 Ойскирхен ndash 1919 Берлин

Немецкий химик-органик и Немецкий химик-органик и биохимикбиохимик

Нобелевская премияпо химии 1902 г

Концепция деформацииКонцепция деформации(ДжБС Холдейн и Л Полинг)(ДжБС Холдейн и Л Полинг)

Активный центр фермента структурно комплементарен не самому субстрату а переходному состоянию При связывании с ферментом переходное состояние субстрата взаимодействует с ферментом более эффективно чем сам субстрат и поэтому полная энергия связывания не реализуется до тех пор пока не сформируется переходное состояние

Лайнус Карл ПолингЛайнус Карл Полинг1901 Портленд ndash 1994 Биг-Сюр1901 Портленд ndash 1994 Биг-Сюр

американский химикамериканский химикНобелевская премия

по химии 1954 г и мира 1962 г

Теория индуцированного Теория индуцированного соответствиясоответствия

Объясняет отсутствие ферментативной активности с небольшими субстратами такими как вода в которых нет групп способных обеспечить связывание и энергию для приведения фермента в активное состояние Является модификацией модели laquoключ-замокraquo - модель laquoрука-перчаткаraquo Предполагается что в отсутствии субстрата фермент структурно некомплементарен переходному состоянию Однако поскольку молекула фермента довольно гибкая а субстрат имеет жесткую структуру при образовании фермент-субстратного комплекса каталитические группы на ферменте ориентируются оптимальным для катализа образом фермент становится комплементарным переходному состоянию только после связывания субстрата Перестройка области активного центра при связывании с субстратом названа процессом конформационной адаптации

Дэниэл Эдвард КошландДэниэл Эдвард Кошланд1920 Нью-Йорк ndash 1919 Калифорния1920 Нью-Йорк ndash 1919 Калифорния

американский биохимикамериканский биохимик

Гипотеза непродуктивного связыванияГипотеза непродуктивного связывания

Было предложено что помимо продуктивного связывания в активном центре возможны другие способы связывания когда небольшие субстраты связываются но не подвергаются каталитическому превращению

Например в молекуле лизоцима активный центр имеет протяженную структуру состоящую из шести центров связывания ndash A B C D E F Для осуществления реакции необходимо чтобы молекула субстрата заняла центры D и Е Небольшие субстраты способны присоединяться с любой сторону вдоль вытянутого активного центра лизоцима не связываясь с подцентром где происходит расщепление

ДеформацияДеформация вносит положительный вклад в катализ вносит положительный вклад в катализ при условии комплементарности фермента при условии комплементарности фермента переходному состоянию субстрата увеличивая переходному состоянию субстрата увеличивая kkcatcat и и KKMM что приводит к увеличению скорости реакции что приводит к увеличению скорости реакции

ИндуцированноеИндуцированное соответствиесоответствие уменьшает уменьшает эффективность катализа увеличивая эффективность катализа увеличивая KKMM без без соответствующего увеличения соответствующего увеличения kkcatcat по сравнению с по сравнению с ферментом находящимся в кативной форме в ферментом находящимся в кативной форме в отсутствие субстрата отсутствие субстрата

Механизм непродуктивного связыванияМеханизм непродуктивного связывания не не затрагивает каталитического превращения затрагивает каталитического превращения специфических субстратов однако он приводит к специфических субстратов однако он приводит к появлению дополнительных связывающих центров для появлению дополнительных связывающих центров для конкурирующих между собой неспецифических конкурирующих между собой неспецифических субстратовсубстратов

Специфичность ферментаСпецифичность фермента

Способность фермента узнавать Способность фермента узнавать определенный субстрат из нескольких определенный субстрат из нескольких

конкурирующих за активный центрконкурирующих за активный центр

Функция слагающаяся из прочности связывания Функция слагающаяся из прочности связывания

каждого из субстратов и кинетической каждого из субстратов и кинетической

(каталитической) специфичности (каталитической) специфичности

характеризующейся скоростью катализахарактеризующейся скоростью катализа

laquoСуммарнаяraquo специфичность характеризуется laquoСуммарнаяraquo специфичность характеризуется

отношением отношением kkcatcatKKMM

Специфичность и относительная Специфичность и относительная реакционная способностьреакционная способность

Центральная проблема специфичности Центральная проблема специфичности каким образом фермент отличает специфический каким образом фермент отличает специфический субстрат от другого меньшего или равного ему по субстрат от другого меньшего или равного ему по размерам (изостерического) субстратаразмерам (изостерического) субстрата

Такую задачу постоянно решают аминоацил-тРНК-синтетазы Если синтетаза (ЕХ) ошибочно активирует чужую аминокислоту (Y) и далее катализирует ее перенос на laquoсвоюraquo тРНКХ

или если она ошибочно этерифицирует истинной субстратной аминокислотой Х чужую тРНК

то каждое из этих событий приведет к ошибке в последовательности синтезируемой полипептидной цепи

Дискриминация аминокислот меньших или изостеричных (равных по размеру) специфическому субстрату способных разместиться в активном центре фермента определяется предпочтительным связыванием истинного субстрата за счет незначительных различий в структуре

Валил-тРНК-синтетаза

Наличие разницы в энергии связывания не до конца обеспечивает Наличие разницы в энергии связывания не до конца обеспечивает в этих случаях точность работы системы аминоацилированияв этих случаях точность работы системы аминоацилирования

валин

Изолейцил-тРНК-синтетаза

изолейцин валин треонин

Треонин связывается с валил-тРНК синтетазой в 100-200 раз слабее валина несмотря на то что он изостеричен валину поскольку в гидрофобный карман погружается гидроксильная группа вместо метиленовой Энергия активации реакции представляет собой сумму двух составляющих одна из них ndash энергия активации для стадии химического превращения а вторая ndash энергия связывания фермента с субстратом

Валил-тРНК-синтетаза

валин треонин

Различие в энергии связывания специфичного субстрата (Различие в энергии связывания специфичного субстрата (RSRS) и ) и меньшего по размерам конкурирующего соединения меньшего по размерам конкурирующего соединения HSHS равно равно дополнительной энергии связывания группы дополнительной энергии связывания группы RR имеющейся у имеющейся у специфичного субстрата и отсутствующей у меньшего специфичного субстрата и отсутствующей у меньшего субстрата по отношению к водороду субстрата по отношению к водороду

Поскольку энергия взаимодействия группы R не только входит в энергию связывания но и понижает энергию активации стадии химического превращения вклад заместителя R следует оценивать из сравнения параметров kcatKM для двух субстратов RS и HS Например если величину kcat для валина для активации валил-тРНК-синтетазой принять за 1 то для других аминокислот эта величина будет для аланина 003 для изолейцина 00019 для серина 005

Дополнительную энергию связывания группы Дополнительную энергию связывания группы RR по отношению к по отношению к водороду можно определить по формулеводороду можно определить по формуле

∆Gb=RTln(kcatKM)RS ln(kcatKM)HS

Для пары изолейцил-тРНК-синтетаза-валин неспецифический субстрат по критерию kcatKM хуже в 140-200 раз В клетках EColi [Ile][Val] = 018 Уровень ошибок изолейцил-тРНК-синтетазы на стадии активации 003-004 Экспериментально обнаружено уровень ошибок при замене Ile на Val в биосинтезе овальбумина цыпленка и гемоглобина кролика равен 310-4

Изолейцил-тРНК-синтетаза

изолейцин валин

Чему соответствует этот уровень ошибокЧему соответствует этот уровень ошибок

Ошибочное включение одной аминокислоты на Ошибочное включение одной аминокислоты на каждые 10000 остатковкаждые 10000 остатков

Одна из 20 белковых молекул длиной в 500 остатков Одна из 20 белковых молекул длиной в 500 остатков будет содержать единственную ошибочную будет содержать единственную ошибочную

аминокислотуаминокислоту

Предположив что только около 10 всех ошибок Предположив что только около 10 всех ошибок серьезно сказываются на биологической функции серьезно сказываются на биологической функции

белка можно сделать заключение что одна белка можно сделать заключение что одна молекула белка из 200 синтезированных окажется молекула белка из 200 синтезированных окажется

бесполезной (или даже вредной) в клеточном бесполезной (или даже вредной) в клеточном метаболизмеметаболизме

Коррекция ошибок в реакциях катализируемых

аминоацил-тРНК- синтетазами

Существование механизмов Существование механизмов коррекции для аминоацил-коррекции для аминоацил-

тРНК-синтетазтРНК-синтетаз

Поль Наим БергПоль Наим Берг19219266 Бруклин СШАБруклин США

Американский биохимикАмериканский биохимикНобелевская премия

по химии 1980 г

Изолейцил-тРНК-синтетаза ошибочно активирует валин Добавление тРНК к комплексу с изолейциладенилатом приводит к образованию изолейцил-тРНК а у валиладенилат-ферментного комплекса не наблюдается образование валил-тРНК поскольку при добавлении тРНК происходит гидролиз ошибочного аминоациладенилата

Существование механизмов коррекции для Существование механизмов коррекции для аминоацил-тРНК-синтетазаминоацил-тРНК-синтетаз

В присутствии тРНКВ присутствии тРНКIleIle изолейцил-тРНК-синтетаза изолейцил-тРНК-синтетаза непроизводительно гидролизует АТР АМР + непроизводительно гидролизует АТР АМР + ppppii

ИзбыточныйИзбыточный гидролиз АТРгидролиз АТР по отношению к по отношению к синтезированному продукту за счет АТР-синтезированному продукту за счет АТР-пирофосфогидролазной активности синтетазы пирофосфогидролазной активности синтетазы является является критерием существования корректирующего механизмакритерием существования корректирующего механизма включающего дополнительную стадию разрушения ошибочного включающего дополнительную стадию разрушения ошибочного продукта реакции продукта реакции

У цистеинил- и тирозил-тРНК-синтетаз специфичность высокая У цистеинил- и тирозил-тРНК-синтетаз специфичность высокая и гидролиза АТР не наблюдается и гидролиза АТР не наблюдается

В некоторых случаях когда дискриминация аминокислот на В некоторых случаях когда дискриминация аминокислот на стадии активации была недостаточной наблюдался быстрый стадии активации была недостаточной наблюдался быстрый гидролиз ошибочного аминоациладенилата вместо переноса гидролиз ошибочного аминоациладенилата вместо переноса laquoнеправильнойraquo аминокислоты на субстратную тРНКlaquoнеправильнойraquo аминокислоты на субстратную тРНК

Роль тРНК в коррекцииРоль тРНК в коррекции

Индуцирует ли тРНК гидролиз аминоациладенилата или же служит акцептором ошибочно активированной аминокислоты а затем подвергается ферментативному деацилированию

Возможные последовательности реакций катализируемых синтетазами можно записать в виде следующей схемы (АК-аминокислота)

Роль тРНК в коррекцииРоль тРНК в коррекции

Предложенные механизмы коррекции можно разделить на две группы в зависимости от того какое соединение в них гидролизуется Механизм отбраковки ошибочной аминокислоты (Механизм отбраковки ошибочной аминокислоты (стадии 1

2 5 ndash гидролиз аминоацил-тРНК) Механизм коррекции за счет гидролиза промежуточного Механизм коррекции за счет гидролиза промежуточного

аминоациладенилата (аминоациладенилата (стадии 1 и 4 ndash гидролиз аминоациладенилата)

В каждом из возможных маршрутов коррекции исправление ошибки достигается благодаря введению в реакционный путь laquoнеобратимогоraquo ответвления (реакции 4 или 5) обеспечивающего гидролиз нежелательных соединений

Механизм отбраковки ошибочной аминокислотыМеханизм отбраковки ошибочной аминокислоты

Доказательство существования механизма гидролиза аминоацил-тРНК аминоацил-тРНК-синтетазами было получено при изучении аминоацилирования тРНКVal треонином катализируемого валил-тРНК-синтетазой из BStearothermophilus

Валил-тРНК-синтетаза образует с треонином стабильный комплекс Валил-тРНК-синтетаза образует с треонином стабильный комплекс который быстро гидролизуется при добавлении тРНКкоторый быстро гидролизуется при добавлении тРНКValVal

Предшествует ли гидролизу перенос аминоацильного остатка на тРНКПредшествует ли гидролизу перенос аминоацильного остатка на тРНКValVal

Импульсный метод laquoзамороженнойraquo струиКомплекс [14С]-треонил-АМРЕVal + тРНК [14С]-треонил-тРНК

Константа гидролиза треонил-тРНК в присутствии валил-тРНК-синтетазы 40 сКонстанта гидролиза треонил-тРНК в присутствии валил-тРНК-синтетазы 40 с -1-1а для специфичной валил-тРНК 0015 са для специфичной валил-тРНК 0015 с-1-1 то есть более чем в 2000 раз ниже то есть более чем в 2000 раз ниже

Механизм коррекции за счет гидролиза Механизм коррекции за счет гидролиза промежуточного аминоациладенилатапромежуточного аминоациладенилата

Ошибочное промежуточное соединение образующееся в ходе реакции диссоциирует с фермента и гиролизуется быстрее чем правильное Для правильного аминоациладенилата скорость переноса на тРНК выше чем диссоциация те коррекция определяется соотношением кинетических констант определенных стадий

Джон Джозеф ХопфилдДжон Джозеф Хопфилд1933 Чикаго США1933 Чикаго США

биофизик и биофизик и молекулярный биологмолекулярный биолог

Механизм кинетического корректированияМеханизм кинетического корректирования

Механизм коррекции за счет гидролиза Механизм коррекции за счет гидролиза промежуточного аминоациладенилатапромежуточного аминоациладенилата

Экспериментальное доказательствоЭкспериментальное доказательствоДля валил-тРНК-синтетазы из желтого люпина в отсутствие тРНК наблюдался гидролиз

АТР АМР + ppi зависящий от присутствия несубстратных аминокислот (Cys Thr Ser и α-аминомасляной кислоты)

Константа скорости гидролиза для этих кислот 07-13 мин-1 Специфический валиладенилат-ферментный комплекс гидролизуется с константой скорости 0018 мин-1 те например в 720 раз медленнее чем комплекс валил-тРНК-синтетазы с цистеинил-аденилатом

Коррекция ошибок в реакциях Коррекция ошибок в реакциях катализируемыхкатализируемых

ДНК-полимеразамиДНК-полимеразами

Механизм коррекции при репликации ДНКМеханизм коррекции при репликации ДНК

При синтезе ДНК ошибка исправляется после полимеризации Молекула ДНК синтезируется в направлении 5rsquo-3rsquo нуклеотиды присоединяются к 3rsquo-гидроксильной группе растущей цепи ДНК

Репликативные ДНК-полимеразы обладают Репликативные ДНК-полимеразы обладают корректирующей 3rsquo-5rsquo-экзонуклеазной активностью корректирующей 3rsquo-5rsquo-экзонуклеазной активностью

выщепляющей из цепи ошибочно встроенный нуклеотидвыщепляющей из цепи ошибочно встроенный нуклеотид

Частота мутации фага Т4 коррелирует с экзонуклеазной активностью проявляемой ДНК-полимеразой Частота мутации для ЕСoli составляет 10-6-10-8 и следовательно точность репликации ДНК либо равна этим величинам либо еще выше

Механизм коррекции при репликации ДНКМеханизм коррекции при репликации ДНК

С помощью экзонуклеазной активности исправляются ошибки которые накапливаются в процессе биосинтеза Однако нарушения структуры ДНК могут возникать не только по причине неточной работы в ходе синтеза но и в результате внешних воздействий таких как ионизирующее и ультрафиолетовое облучение окислительный стресс

Возможна различная пострепликационная коррекция структуры ДНКВозможна различная пострепликационная коррекция структуры ДНК(репарация)(репарация)

Система репарации ошибочно-встроенных нуклеотидов (Система репарации ошибочно-встроенных нуклеотидов (mismatch mismatch repairrepair) специально предназначена для удаления ошибок возникших в ) специально предназначена для удаления ошибок возникших в ДНК в ходе репликацииДНК в ходе репликации

Система эксцизионной репарации оснований исправляет повреждения в Система эксцизионной репарации оснований исправляет повреждения в ДНК возникающие в результате окислительного стресса то есть ДНК возникающие в результате окислительного стресса то есть модифицированные (окисленные) основания и разрывы в одной из цепей модифицированные (окисленные) основания и разрывы в одной из цепей ДНКДНК

Система эксцизионной репарации нуклеотидов удаляет из ДНК объемные Система эксцизионной репарации нуклеотидов удаляет из ДНК объемные повреждения фотодимеры возникающие под действием повреждения фотодимеры возникающие под действием ультрафиолетового облучения объемные аддукты метаболитов ультрафиолетового облучения объемные аддукты метаболитов попадающих из окружающей среды таких как продукты сгорания курения попадающих из окружающей среды таких как продукты сгорания курения например антрацены и бензапиренынапример антрацены и бензапирены

Синтез ДНК через повреждениеСинтез ДНК через повреждение((Translesion synthesisTranslesion synthesis ndash TLS)ndash TLS)

В случае синтеза с использованием поврежденной ДНК-матрицы транслезионными (translesion) ДНК-полимеразами (например η ι κ θ μ ζ) также возникают искажения в структуре ДНК

TLS ДНК-полимеразы ведущие синтез через повреждение матрицы не обладают корректирующей активностью поскольку их задачей является ввести во чтобы то ни стало нуклеотидное звено дабы избежать остановки репликативной вилки на повреждении матрицы Затем поврежденный участок ДНК восстанавливается системами репарации

Мутации вводимые репликативными Мутации вводимые репликативными ДНК-полимеразами в ходе репликативного синтеза ДНК-полимеразами в ходе репликативного синтеза

играют не только вредную рольиграют не только вредную роль Мутации в ДНК являются движущей Мутации в ДНК являются движущей

силой эволюциисилой эволюции

• Slide 1
• Slide 2
• Slide 3
• Slide 4
• Slide 5
• Slide 6
• Slide 7
• Slide 8
• Slide 9
• Slide 10
• Slide 11
• Slide 12
• Slide 13
• Slide 14
• Slide 15
• Slide 16
• Slide 17
• Slide 18
• Slide 19
• Slide 20
• Slide 21
• Slide 22
• Slide 23
• Slide 24
• Slide 25
• Slide 26
• Slide 27
• Slide 28
• Slide 29
• Slide 30
• Slide 31
• Slide 32
• Slide 33
• Slide 34
• Slide 35
• Slide 36
• Slide 37
• Slide 38
• Slide 39
• Slide 40
• Slide 41

Модель laquoключ-замокraquoМодель laquoключ-замокraquo

Теория комплементарности при фермент-субстратном взаимодействии принадлежит Э Фишеру воплотившему ее в модели laquoключ-замокraquo В 1890 г Э Фишер предложил модель согласно которой специфичность ферментов определяется точным соответствием формы фермента и субстрата Однако хотя эта модель объясняла высокую специфичность ферментов она не объясняла явления стабилизации переходного состояния которое наблюдается на практике

Герман Эмиль ФишерГерман Эмиль Фишер1852 Ойскирхен ndash 1919 Берлин1852 Ойскирхен ndash 1919 Берлин

Немецкий химик-органик и Немецкий химик-органик и биохимикбиохимик

Нобелевская премияпо химии 1902 г

Концепция деформацииКонцепция деформации(ДжБС Холдейн и Л Полинг)(ДжБС Холдейн и Л Полинг)

Активный центр фермента структурно комплементарен не самому субстрату а переходному состоянию При связывании с ферментом переходное состояние субстрата взаимодействует с ферментом более эффективно чем сам субстрат и поэтому полная энергия связывания не реализуется до тех пор пока не сформируется переходное состояние

Лайнус Карл ПолингЛайнус Карл Полинг1901 Портленд ndash 1994 Биг-Сюр1901 Портленд ndash 1994 Биг-Сюр

американский химикамериканский химикНобелевская премия

по химии 1954 г и мира 1962 г

Теория индуцированного Теория индуцированного соответствиясоответствия

Объясняет отсутствие ферментативной активности с небольшими субстратами такими как вода в которых нет групп способных обеспечить связывание и энергию для приведения фермента в активное состояние Является модификацией модели laquoключ-замокraquo - модель laquoрука-перчаткаraquo Предполагается что в отсутствии субстрата фермент структурно некомплементарен переходному состоянию Однако поскольку молекула фермента довольно гибкая а субстрат имеет жесткую структуру при образовании фермент-субстратного комплекса каталитические группы на ферменте ориентируются оптимальным для катализа образом фермент становится комплементарным переходному состоянию только после связывания субстрата Перестройка области активного центра при связывании с субстратом названа процессом конформационной адаптации

Дэниэл Эдвард КошландДэниэл Эдвард Кошланд1920 Нью-Йорк ndash 1919 Калифорния1920 Нью-Йорк ndash 1919 Калифорния

американский биохимикамериканский биохимик

Гипотеза непродуктивного связыванияГипотеза непродуктивного связывания

Было предложено что помимо продуктивного связывания в активном центре возможны другие способы связывания когда небольшие субстраты связываются но не подвергаются каталитическому превращению

Например в молекуле лизоцима активный центр имеет протяженную структуру состоящую из шести центров связывания ndash A B C D E F Для осуществления реакции необходимо чтобы молекула субстрата заняла центры D и Е Небольшие субстраты способны присоединяться с любой сторону вдоль вытянутого активного центра лизоцима не связываясь с подцентром где происходит расщепление

ДеформацияДеформация вносит положительный вклад в катализ вносит положительный вклад в катализ при условии комплементарности фермента при условии комплементарности фермента переходному состоянию субстрата увеличивая переходному состоянию субстрата увеличивая kkcatcat и и KKMM что приводит к увеличению скорости реакции что приводит к увеличению скорости реакции

ИндуцированноеИндуцированное соответствиесоответствие уменьшает уменьшает эффективность катализа увеличивая эффективность катализа увеличивая KKMM без без соответствующего увеличения соответствующего увеличения kkcatcat по сравнению с по сравнению с ферментом находящимся в кативной форме в ферментом находящимся в кативной форме в отсутствие субстрата отсутствие субстрата

Механизм непродуктивного связыванияМеханизм непродуктивного связывания не не затрагивает каталитического превращения затрагивает каталитического превращения специфических субстратов однако он приводит к специфических субстратов однако он приводит к появлению дополнительных связывающих центров для появлению дополнительных связывающих центров для конкурирующих между собой неспецифических конкурирующих между собой неспецифических субстратовсубстратов

Специфичность ферментаСпецифичность фермента

Способность фермента узнавать Способность фермента узнавать определенный субстрат из нескольких определенный субстрат из нескольких

конкурирующих за активный центрконкурирующих за активный центр

Функция слагающаяся из прочности связывания Функция слагающаяся из прочности связывания

каждого из субстратов и кинетической каждого из субстратов и кинетической

(каталитической) специфичности (каталитической) специфичности

характеризующейся скоростью катализахарактеризующейся скоростью катализа

laquoСуммарнаяraquo специфичность характеризуется laquoСуммарнаяraquo специфичность характеризуется

отношением отношением kkcatcatKKMM

Специфичность и относительная Специфичность и относительная реакционная способностьреакционная способность

Центральная проблема специфичности Центральная проблема специфичности каким образом фермент отличает специфический каким образом фермент отличает специфический субстрат от другого меньшего или равного ему по субстрат от другого меньшего или равного ему по размерам (изостерического) субстратаразмерам (изостерического) субстрата

Такую задачу постоянно решают аминоацил-тРНК-синтетазы Если синтетаза (ЕХ) ошибочно активирует чужую аминокислоту (Y) и далее катализирует ее перенос на laquoсвоюraquo тРНКХ

или если она ошибочно этерифицирует истинной субстратной аминокислотой Х чужую тРНК

то каждое из этих событий приведет к ошибке в последовательности синтезируемой полипептидной цепи

Дискриминация аминокислот меньших или изостеричных (равных по размеру) специфическому субстрату способных разместиться в активном центре фермента определяется предпочтительным связыванием истинного субстрата за счет незначительных различий в структуре

Валил-тРНК-синтетаза

Наличие разницы в энергии связывания не до конца обеспечивает Наличие разницы в энергии связывания не до конца обеспечивает в этих случаях точность работы системы аминоацилированияв этих случаях точность работы системы аминоацилирования

валин

Изолейцил-тРНК-синтетаза

изолейцин валин треонин

Треонин связывается с валил-тРНК синтетазой в 100-200 раз слабее валина несмотря на то что он изостеричен валину поскольку в гидрофобный карман погружается гидроксильная группа вместо метиленовой Энергия активации реакции представляет собой сумму двух составляющих одна из них ndash энергия активации для стадии химического превращения а вторая ndash энергия связывания фермента с субстратом

Валил-тРНК-синтетаза

валин треонин

Различие в энергии связывания специфичного субстрата (Различие в энергии связывания специфичного субстрата (RSRS) и ) и меньшего по размерам конкурирующего соединения меньшего по размерам конкурирующего соединения HSHS равно равно дополнительной энергии связывания группы дополнительной энергии связывания группы RR имеющейся у имеющейся у специфичного субстрата и отсутствующей у меньшего специфичного субстрата и отсутствующей у меньшего субстрата по отношению к водороду субстрата по отношению к водороду

Поскольку энергия взаимодействия группы R не только входит в энергию связывания но и понижает энергию активации стадии химического превращения вклад заместителя R следует оценивать из сравнения параметров kcatKM для двух субстратов RS и HS Например если величину kcat для валина для активации валил-тРНК-синтетазой принять за 1 то для других аминокислот эта величина будет для аланина 003 для изолейцина 00019 для серина 005

Дополнительную энергию связывания группы Дополнительную энергию связывания группы RR по отношению к по отношению к водороду можно определить по формулеводороду можно определить по формуле

∆Gb=RTln(kcatKM)RS ln(kcatKM)HS

Для пары изолейцил-тРНК-синтетаза-валин неспецифический субстрат по критерию kcatKM хуже в 140-200 раз В клетках EColi [Ile][Val] = 018 Уровень ошибок изолейцил-тРНК-синтетазы на стадии активации 003-004 Экспериментально обнаружено уровень ошибок при замене Ile на Val в биосинтезе овальбумина цыпленка и гемоглобина кролика равен 310-4

Изолейцил-тРНК-синтетаза

изолейцин валин

Чему соответствует этот уровень ошибокЧему соответствует этот уровень ошибок

Ошибочное включение одной аминокислоты на Ошибочное включение одной аминокислоты на каждые 10000 остатковкаждые 10000 остатков

Одна из 20 белковых молекул длиной в 500 остатков Одна из 20 белковых молекул длиной в 500 остатков будет содержать единственную ошибочную будет содержать единственную ошибочную

аминокислотуаминокислоту

Предположив что только около 10 всех ошибок Предположив что только около 10 всех ошибок серьезно сказываются на биологической функции серьезно сказываются на биологической функции

белка можно сделать заключение что одна белка можно сделать заключение что одна молекула белка из 200 синтезированных окажется молекула белка из 200 синтезированных окажется

бесполезной (или даже вредной) в клеточном бесполезной (или даже вредной) в клеточном метаболизмеметаболизме

Коррекция ошибок в реакциях катализируемых

аминоацил-тРНК- синтетазами

Существование механизмов Существование механизмов коррекции для аминоацил-коррекции для аминоацил-

тРНК-синтетазтРНК-синтетаз

Поль Наим БергПоль Наим Берг19219266 Бруклин СШАБруклин США

Американский биохимикАмериканский биохимикНобелевская премия

по химии 1980 г

Изолейцил-тРНК-синтетаза ошибочно активирует валин Добавление тРНК к комплексу с изолейциладенилатом приводит к образованию изолейцил-тРНК а у валиладенилат-ферментного комплекса не наблюдается образование валил-тРНК поскольку при добавлении тРНК происходит гидролиз ошибочного аминоациладенилата

Существование механизмов коррекции для Существование механизмов коррекции для аминоацил-тРНК-синтетазаминоацил-тРНК-синтетаз

В присутствии тРНКВ присутствии тРНКIleIle изолейцил-тРНК-синтетаза изолейцил-тРНК-синтетаза непроизводительно гидролизует АТР АМР + непроизводительно гидролизует АТР АМР + ppppii

ИзбыточныйИзбыточный гидролиз АТРгидролиз АТР по отношению к по отношению к синтезированному продукту за счет АТР-синтезированному продукту за счет АТР-пирофосфогидролазной активности синтетазы пирофосфогидролазной активности синтетазы является является критерием существования корректирующего механизмакритерием существования корректирующего механизма включающего дополнительную стадию разрушения ошибочного включающего дополнительную стадию разрушения ошибочного продукта реакции продукта реакции

У цистеинил- и тирозил-тРНК-синтетаз специфичность высокая У цистеинил- и тирозил-тРНК-синтетаз специфичность высокая и гидролиза АТР не наблюдается и гидролиза АТР не наблюдается

В некоторых случаях когда дискриминация аминокислот на В некоторых случаях когда дискриминация аминокислот на стадии активации была недостаточной наблюдался быстрый стадии активации была недостаточной наблюдался быстрый гидролиз ошибочного аминоациладенилата вместо переноса гидролиз ошибочного аминоациладенилата вместо переноса laquoнеправильнойraquo аминокислоты на субстратную тРНКlaquoнеправильнойraquo аминокислоты на субстратную тРНК

Роль тРНК в коррекцииРоль тРНК в коррекции

Индуцирует ли тРНК гидролиз аминоациладенилата или же служит акцептором ошибочно активированной аминокислоты а затем подвергается ферментативному деацилированию

Возможные последовательности реакций катализируемых синтетазами можно записать в виде следующей схемы (АК-аминокислота)

Роль тРНК в коррекцииРоль тРНК в коррекции

Предложенные механизмы коррекции можно разделить на две группы в зависимости от того какое соединение в них гидролизуется Механизм отбраковки ошибочной аминокислоты (Механизм отбраковки ошибочной аминокислоты (стадии 1

2 5 ndash гидролиз аминоацил-тРНК) Механизм коррекции за счет гидролиза промежуточного Механизм коррекции за счет гидролиза промежуточного

аминоациладенилата (аминоациладенилата (стадии 1 и 4 ndash гидролиз аминоациладенилата)

В каждом из возможных маршрутов коррекции исправление ошибки достигается благодаря введению в реакционный путь laquoнеобратимогоraquo ответвления (реакции 4 или 5) обеспечивающего гидролиз нежелательных соединений

Механизм отбраковки ошибочной аминокислотыМеханизм отбраковки ошибочной аминокислоты

Доказательство существования механизма гидролиза аминоацил-тРНК аминоацил-тРНК-синтетазами было получено при изучении аминоацилирования тРНКVal треонином катализируемого валил-тРНК-синтетазой из BStearothermophilus

Валил-тРНК-синтетаза образует с треонином стабильный комплекс Валил-тРНК-синтетаза образует с треонином стабильный комплекс который быстро гидролизуется при добавлении тРНКкоторый быстро гидролизуется при добавлении тРНКValVal

Предшествует ли гидролизу перенос аминоацильного остатка на тРНКПредшествует ли гидролизу перенос аминоацильного остатка на тРНКValVal

Импульсный метод laquoзамороженнойraquo струиКомплекс [14С]-треонил-АМРЕVal + тРНК [14С]-треонил-тРНК

Константа гидролиза треонил-тРНК в присутствии валил-тРНК-синтетазы 40 сКонстанта гидролиза треонил-тРНК в присутствии валил-тРНК-синтетазы 40 с -1-1а для специфичной валил-тРНК 0015 са для специфичной валил-тРНК 0015 с-1-1 то есть более чем в 2000 раз ниже то есть более чем в 2000 раз ниже

Механизм коррекции за счет гидролиза Механизм коррекции за счет гидролиза промежуточного аминоациладенилатапромежуточного аминоациладенилата

Ошибочное промежуточное соединение образующееся в ходе реакции диссоциирует с фермента и гиролизуется быстрее чем правильное Для правильного аминоациладенилата скорость переноса на тРНК выше чем диссоциация те коррекция определяется соотношением кинетических констант определенных стадий

Джон Джозеф ХопфилдДжон Джозеф Хопфилд1933 Чикаго США1933 Чикаго США

биофизик и биофизик и молекулярный биологмолекулярный биолог

Механизм кинетического корректированияМеханизм кинетического корректирования

Механизм коррекции за счет гидролиза Механизм коррекции за счет гидролиза промежуточного аминоациладенилатапромежуточного аминоациладенилата

Экспериментальное доказательствоЭкспериментальное доказательствоДля валил-тРНК-синтетазы из желтого люпина в отсутствие тРНК наблюдался гидролиз

АТР АМР + ppi зависящий от присутствия несубстратных аминокислот (Cys Thr Ser и α-аминомасляной кислоты)

Константа скорости гидролиза для этих кислот 07-13 мин-1 Специфический валиладенилат-ферментный комплекс гидролизуется с константой скорости 0018 мин-1 те например в 720 раз медленнее чем комплекс валил-тРНК-синтетазы с цистеинил-аденилатом

Коррекция ошибок в реакциях Коррекция ошибок в реакциях катализируемыхкатализируемых

ДНК-полимеразамиДНК-полимеразами

Механизм коррекции при репликации ДНКМеханизм коррекции при репликации ДНК

При синтезе ДНК ошибка исправляется после полимеризации Молекула ДНК синтезируется в направлении 5rsquo-3rsquo нуклеотиды присоединяются к 3rsquo-гидроксильной группе растущей цепи ДНК

Репликативные ДНК-полимеразы обладают Репликативные ДНК-полимеразы обладают корректирующей 3rsquo-5rsquo-экзонуклеазной активностью корректирующей 3rsquo-5rsquo-экзонуклеазной активностью

выщепляющей из цепи ошибочно встроенный нуклеотидвыщепляющей из цепи ошибочно встроенный нуклеотид

Частота мутации фага Т4 коррелирует с экзонуклеазной активностью проявляемой ДНК-полимеразой Частота мутации для ЕСoli составляет 10-6-10-8 и следовательно точность репликации ДНК либо равна этим величинам либо еще выше

Механизм коррекции при репликации ДНКМеханизм коррекции при репликации ДНК

С помощью экзонуклеазной активности исправляются ошибки которые накапливаются в процессе биосинтеза Однако нарушения структуры ДНК могут возникать не только по причине неточной работы в ходе синтеза но и в результате внешних воздействий таких как ионизирующее и ультрафиолетовое облучение окислительный стресс

Возможна различная пострепликационная коррекция структуры ДНКВозможна различная пострепликационная коррекция структуры ДНК(репарация)(репарация)

Система репарации ошибочно-встроенных нуклеотидов (Система репарации ошибочно-встроенных нуклеотидов (mismatch mismatch repairrepair) специально предназначена для удаления ошибок возникших в ) специально предназначена для удаления ошибок возникших в ДНК в ходе репликацииДНК в ходе репликации

Система эксцизионной репарации оснований исправляет повреждения в Система эксцизионной репарации оснований исправляет повреждения в ДНК возникающие в результате окислительного стресса то есть ДНК возникающие в результате окислительного стресса то есть модифицированные (окисленные) основания и разрывы в одной из цепей модифицированные (окисленные) основания и разрывы в одной из цепей ДНКДНК

Система эксцизионной репарации нуклеотидов удаляет из ДНК объемные Система эксцизионной репарации нуклеотидов удаляет из ДНК объемные повреждения фотодимеры возникающие под действием повреждения фотодимеры возникающие под действием ультрафиолетового облучения объемные аддукты метаболитов ультрафиолетового облучения объемные аддукты метаболитов попадающих из окружающей среды таких как продукты сгорания курения попадающих из окружающей среды таких как продукты сгорания курения например антрацены и бензапиренынапример антрацены и бензапирены

Синтез ДНК через повреждениеСинтез ДНК через повреждение((Translesion synthesisTranslesion synthesis ndash TLS)ndash TLS)

В случае синтеза с использованием поврежденной ДНК-матрицы транслезионными (translesion) ДНК-полимеразами (например η ι κ θ μ ζ) также возникают искажения в структуре ДНК

TLS ДНК-полимеразы ведущие синтез через повреждение матрицы не обладают корректирующей активностью поскольку их задачей является ввести во чтобы то ни стало нуклеотидное звено дабы избежать остановки репликативной вилки на повреждении матрицы Затем поврежденный участок ДНК восстанавливается системами репарации

Мутации вводимые репликативными Мутации вводимые репликативными ДНК-полимеразами в ходе репликативного синтеза ДНК-полимеразами в ходе репликативного синтеза

играют не только вредную рольиграют не только вредную роль Мутации в ДНК являются движущей Мутации в ДНК являются движущей

силой эволюциисилой эволюции

• Slide 1
• Slide 2
• Slide 3
• Slide 4
• Slide 5
• Slide 6
• Slide 7
• Slide 8
• Slide 9
• Slide 10
• Slide 11
• Slide 12
• Slide 13
• Slide 14
• Slide 15
• Slide 16
• Slide 17
• Slide 18
• Slide 19
• Slide 20
• Slide 21
• Slide 22
• Slide 23
• Slide 24
• Slide 25
• Slide 26
• Slide 27
• Slide 28
• Slide 29
• Slide 30
• Slide 31
• Slide 32
• Slide 33
• Slide 34
• Slide 35
• Slide 36
• Slide 37
• Slide 38
• Slide 39
• Slide 40
• Slide 41

Концепция деформацииКонцепция деформации(ДжБС Холдейн и Л Полинг)(ДжБС Холдейн и Л Полинг)

Активный центр фермента структурно комплементарен не самому субстрату а переходному состоянию При связывании с ферментом переходное состояние субстрата взаимодействует с ферментом более эффективно чем сам субстрат и поэтому полная энергия связывания не реализуется до тех пор пока не сформируется переходное состояние

Лайнус Карл ПолингЛайнус Карл Полинг1901 Портленд ndash 1994 Биг-Сюр1901 Портленд ndash 1994 Биг-Сюр

американский химикамериканский химикНобелевская премия

по химии 1954 г и мира 1962 г

Теория индуцированного Теория индуцированного соответствиясоответствия

Объясняет отсутствие ферментативной активности с небольшими субстратами такими как вода в которых нет групп способных обеспечить связывание и энергию для приведения фермента в активное состояние Является модификацией модели laquoключ-замокraquo - модель laquoрука-перчаткаraquo Предполагается что в отсутствии субстрата фермент структурно некомплементарен переходному состоянию Однако поскольку молекула фермента довольно гибкая а субстрат имеет жесткую структуру при образовании фермент-субстратного комплекса каталитические группы на ферменте ориентируются оптимальным для катализа образом фермент становится комплементарным переходному состоянию только после связывания субстрата Перестройка области активного центра при связывании с субстратом названа процессом конформационной адаптации

Дэниэл Эдвард КошландДэниэл Эдвард Кошланд1920 Нью-Йорк ndash 1919 Калифорния1920 Нью-Йорк ndash 1919 Калифорния

американский биохимикамериканский биохимик

Гипотеза непродуктивного связыванияГипотеза непродуктивного связывания

Было предложено что помимо продуктивного связывания в активном центре возможны другие способы связывания когда небольшие субстраты связываются но не подвергаются каталитическому превращению

Например в молекуле лизоцима активный центр имеет протяженную структуру состоящую из шести центров связывания ndash A B C D E F Для осуществления реакции необходимо чтобы молекула субстрата заняла центры D и Е Небольшие субстраты способны присоединяться с любой сторону вдоль вытянутого активного центра лизоцима не связываясь с подцентром где происходит расщепление

ДеформацияДеформация вносит положительный вклад в катализ вносит положительный вклад в катализ при условии комплементарности фермента при условии комплементарности фермента переходному состоянию субстрата увеличивая переходному состоянию субстрата увеличивая kkcatcat и и KKMM что приводит к увеличению скорости реакции что приводит к увеличению скорости реакции

ИндуцированноеИндуцированное соответствиесоответствие уменьшает уменьшает эффективность катализа увеличивая эффективность катализа увеличивая KKMM без без соответствующего увеличения соответствующего увеличения kkcatcat по сравнению с по сравнению с ферментом находящимся в кативной форме в ферментом находящимся в кативной форме в отсутствие субстрата отсутствие субстрата

Механизм непродуктивного связыванияМеханизм непродуктивного связывания не не затрагивает каталитического превращения затрагивает каталитического превращения специфических субстратов однако он приводит к специфических субстратов однако он приводит к появлению дополнительных связывающих центров для появлению дополнительных связывающих центров для конкурирующих между собой неспецифических конкурирующих между собой неспецифических субстратовсубстратов

Специфичность ферментаСпецифичность фермента

Способность фермента узнавать Способность фермента узнавать определенный субстрат из нескольких определенный субстрат из нескольких

конкурирующих за активный центрконкурирующих за активный центр

Функция слагающаяся из прочности связывания Функция слагающаяся из прочности связывания

каждого из субстратов и кинетической каждого из субстратов и кинетической

(каталитической) специфичности (каталитической) специфичности

характеризующейся скоростью катализахарактеризующейся скоростью катализа

laquoСуммарнаяraquo специфичность характеризуется laquoСуммарнаяraquo специфичность характеризуется

отношением отношением kkcatcatKKMM

Специфичность и относительная Специфичность и относительная реакционная способностьреакционная способность

Центральная проблема специфичности Центральная проблема специфичности каким образом фермент отличает специфический каким образом фермент отличает специфический субстрат от другого меньшего или равного ему по субстрат от другого меньшего или равного ему по размерам (изостерического) субстратаразмерам (изостерического) субстрата

Такую задачу постоянно решают аминоацил-тРНК-синтетазы Если синтетаза (ЕХ) ошибочно активирует чужую аминокислоту (Y) и далее катализирует ее перенос на laquoсвоюraquo тРНКХ

или если она ошибочно этерифицирует истинной субстратной аминокислотой Х чужую тРНК

то каждое из этих событий приведет к ошибке в последовательности синтезируемой полипептидной цепи

Дискриминация аминокислот меньших или изостеричных (равных по размеру) специфическому субстрату способных разместиться в активном центре фермента определяется предпочтительным связыванием истинного субстрата за счет незначительных различий в структуре

Валил-тРНК-синтетаза

Наличие разницы в энергии связывания не до конца обеспечивает Наличие разницы в энергии связывания не до конца обеспечивает в этих случаях точность работы системы аминоацилированияв этих случаях точность работы системы аминоацилирования

валин

Изолейцил-тРНК-синтетаза

изолейцин валин треонин

Треонин связывается с валил-тРНК синтетазой в 100-200 раз слабее валина несмотря на то что он изостеричен валину поскольку в гидрофобный карман погружается гидроксильная группа вместо метиленовой Энергия активации реакции представляет собой сумму двух составляющих одна из них ndash энергия активации для стадии химического превращения а вторая ndash энергия связывания фермента с субстратом

Валил-тРНК-синтетаза

валин треонин

Различие в энергии связывания специфичного субстрата (Различие в энергии связывания специфичного субстрата (RSRS) и ) и меньшего по размерам конкурирующего соединения меньшего по размерам конкурирующего соединения HSHS равно равно дополнительной энергии связывания группы дополнительной энергии связывания группы RR имеющейся у имеющейся у специфичного субстрата и отсутствующей у меньшего специфичного субстрата и отсутствующей у меньшего субстрата по отношению к водороду субстрата по отношению к водороду

Поскольку энергия взаимодействия группы R не только входит в энергию связывания но и понижает энергию активации стадии химического превращения вклад заместителя R следует оценивать из сравнения параметров kcatKM для двух субстратов RS и HS Например если величину kcat для валина для активации валил-тРНК-синтетазой принять за 1 то для других аминокислот эта величина будет для аланина 003 для изолейцина 00019 для серина 005

Дополнительную энергию связывания группы Дополнительную энергию связывания группы RR по отношению к по отношению к водороду можно определить по формулеводороду можно определить по формуле

∆Gb=RTln(kcatKM)RS ln(kcatKM)HS

Для пары изолейцил-тРНК-синтетаза-валин неспецифический субстрат по критерию kcatKM хуже в 140-200 раз В клетках EColi [Ile][Val] = 018 Уровень ошибок изолейцил-тРНК-синтетазы на стадии активации 003-004 Экспериментально обнаружено уровень ошибок при замене Ile на Val в биосинтезе овальбумина цыпленка и гемоглобина кролика равен 310-4

Изолейцил-тРНК-синтетаза

изолейцин валин

Чему соответствует этот уровень ошибокЧему соответствует этот уровень ошибок

Ошибочное включение одной аминокислоты на Ошибочное включение одной аминокислоты на каждые 10000 остатковкаждые 10000 остатков

Одна из 20 белковых молекул длиной в 500 остатков Одна из 20 белковых молекул длиной в 500 остатков будет содержать единственную ошибочную будет содержать единственную ошибочную

аминокислотуаминокислоту

Предположив что только около 10 всех ошибок Предположив что только около 10 всех ошибок серьезно сказываются на биологической функции серьезно сказываются на биологической функции

белка можно сделать заключение что одна белка можно сделать заключение что одна молекула белка из 200 синтезированных окажется молекула белка из 200 синтезированных окажется

бесполезной (или даже вредной) в клеточном бесполезной (или даже вредной) в клеточном метаболизмеметаболизме

Коррекция ошибок в реакциях катализируемых

аминоацил-тРНК- синтетазами

Существование механизмов Существование механизмов коррекции для аминоацил-коррекции для аминоацил-

тРНК-синтетазтРНК-синтетаз

Поль Наим БергПоль Наим Берг19219266 Бруклин СШАБруклин США

Американский биохимикАмериканский биохимикНобелевская премия

по химии 1980 г

Изолейцил-тРНК-синтетаза ошибочно активирует валин Добавление тРНК к комплексу с изолейциладенилатом приводит к образованию изолейцил-тРНК а у валиладенилат-ферментного комплекса не наблюдается образование валил-тРНК поскольку при добавлении тРНК происходит гидролиз ошибочного аминоациладенилата

Существование механизмов коррекции для Существование механизмов коррекции для аминоацил-тРНК-синтетазаминоацил-тРНК-синтетаз

В присутствии тРНКВ присутствии тРНКIleIle изолейцил-тРНК-синтетаза изолейцил-тРНК-синтетаза непроизводительно гидролизует АТР АМР + непроизводительно гидролизует АТР АМР + ppppii

ИзбыточныйИзбыточный гидролиз АТРгидролиз АТР по отношению к по отношению к синтезированному продукту за счет АТР-синтезированному продукту за счет АТР-пирофосфогидролазной активности синтетазы пирофосфогидролазной активности синтетазы является является критерием существования корректирующего механизмакритерием существования корректирующего механизма включающего дополнительную стадию разрушения ошибочного включающего дополнительную стадию разрушения ошибочного продукта реакции продукта реакции

У цистеинил- и тирозил-тРНК-синтетаз специфичность высокая У цистеинил- и тирозил-тРНК-синтетаз специфичность высокая и гидролиза АТР не наблюдается и гидролиза АТР не наблюдается

В некоторых случаях когда дискриминация аминокислот на В некоторых случаях когда дискриминация аминокислот на стадии активации была недостаточной наблюдался быстрый стадии активации была недостаточной наблюдался быстрый гидролиз ошибочного аминоациладенилата вместо переноса гидролиз ошибочного аминоациладенилата вместо переноса laquoнеправильнойraquo аминокислоты на субстратную тРНКlaquoнеправильнойraquo аминокислоты на субстратную тРНК

Роль тРНК в коррекцииРоль тРНК в коррекции

Индуцирует ли тРНК гидролиз аминоациладенилата или же служит акцептором ошибочно активированной аминокислоты а затем подвергается ферментативному деацилированию

Возможные последовательности реакций катализируемых синтетазами можно записать в виде следующей схемы (АК-аминокислота)

Роль тРНК в коррекцииРоль тРНК в коррекции

Предложенные механизмы коррекции можно разделить на две группы в зависимости от того какое соединение в них гидролизуется Механизм отбраковки ошибочной аминокислоты (Механизм отбраковки ошибочной аминокислоты (стадии 1

2 5 ndash гидролиз аминоацил-тРНК) Механизм коррекции за счет гидролиза промежуточного Механизм коррекции за счет гидролиза промежуточного

аминоациладенилата (аминоациладенилата (стадии 1 и 4 ndash гидролиз аминоациладенилата)

В каждом из возможных маршрутов коррекции исправление ошибки достигается благодаря введению в реакционный путь laquoнеобратимогоraquo ответвления (реакции 4 или 5) обеспечивающего гидролиз нежелательных соединений

Механизм отбраковки ошибочной аминокислотыМеханизм отбраковки ошибочной аминокислоты

Доказательство существования механизма гидролиза аминоацил-тРНК аминоацил-тРНК-синтетазами было получено при изучении аминоацилирования тРНКVal треонином катализируемого валил-тРНК-синтетазой из BStearothermophilus

Валил-тРНК-синтетаза образует с треонином стабильный комплекс Валил-тРНК-синтетаза образует с треонином стабильный комплекс который быстро гидролизуется при добавлении тРНКкоторый быстро гидролизуется при добавлении тРНКValVal

Предшествует ли гидролизу перенос аминоацильного остатка на тРНКПредшествует ли гидролизу перенос аминоацильного остатка на тРНКValVal

Импульсный метод laquoзамороженнойraquo струиКомплекс [14С]-треонил-АМРЕVal + тРНК [14С]-треонил-тРНК

Константа гидролиза треонил-тРНК в присутствии валил-тРНК-синтетазы 40 сКонстанта гидролиза треонил-тРНК в присутствии валил-тРНК-синтетазы 40 с -1-1а для специфичной валил-тРНК 0015 са для специфичной валил-тРНК 0015 с-1-1 то есть более чем в 2000 раз ниже то есть более чем в 2000 раз ниже

Механизм коррекции за счет гидролиза Механизм коррекции за счет гидролиза промежуточного аминоациладенилатапромежуточного аминоациладенилата

Ошибочное промежуточное соединение образующееся в ходе реакции диссоциирует с фермента и гиролизуется быстрее чем правильное Для правильного аминоациладенилата скорость переноса на тРНК выше чем диссоциация те коррекция определяется соотношением кинетических констант определенных стадий

Джон Джозеф ХопфилдДжон Джозеф Хопфилд1933 Чикаго США1933 Чикаго США

биофизик и биофизик и молекулярный биологмолекулярный биолог

Механизм кинетического корректированияМеханизм кинетического корректирования

Механизм коррекции за счет гидролиза Механизм коррекции за счет гидролиза промежуточного аминоациладенилатапромежуточного аминоациладенилата

Экспериментальное доказательствоЭкспериментальное доказательствоДля валил-тРНК-синтетазы из желтого люпина в отсутствие тРНК наблюдался гидролиз

АТР АМР + ppi зависящий от присутствия несубстратных аминокислот (Cys Thr Ser и α-аминомасляной кислоты)

Константа скорости гидролиза для этих кислот 07-13 мин-1 Специфический валиладенилат-ферментный комплекс гидролизуется с константой скорости 0018 мин-1 те например в 720 раз медленнее чем комплекс валил-тРНК-синтетазы с цистеинил-аденилатом

Коррекция ошибок в реакциях Коррекция ошибок в реакциях катализируемыхкатализируемых

ДНК-полимеразамиДНК-полимеразами

Механизм коррекции при репликации ДНКМеханизм коррекции при репликации ДНК

При синтезе ДНК ошибка исправляется после полимеризации Молекула ДНК синтезируется в направлении 5rsquo-3rsquo нуклеотиды присоединяются к 3rsquo-гидроксильной группе растущей цепи ДНК

Репликативные ДНК-полимеразы обладают Репликативные ДНК-полимеразы обладают корректирующей 3rsquo-5rsquo-экзонуклеазной активностью корректирующей 3rsquo-5rsquo-экзонуклеазной активностью

выщепляющей из цепи ошибочно встроенный нуклеотидвыщепляющей из цепи ошибочно встроенный нуклеотид

Частота мутации фага Т4 коррелирует с экзонуклеазной активностью проявляемой ДНК-полимеразой Частота мутации для ЕСoli составляет 10-6-10-8 и следовательно точность репликации ДНК либо равна этим величинам либо еще выше

Механизм коррекции при репликации ДНКМеханизм коррекции при репликации ДНК

С помощью экзонуклеазной активности исправляются ошибки которые накапливаются в процессе биосинтеза Однако нарушения структуры ДНК могут возникать не только по причине неточной работы в ходе синтеза но и в результате внешних воздействий таких как ионизирующее и ультрафиолетовое облучение окислительный стресс

Возможна различная пострепликационная коррекция структуры ДНКВозможна различная пострепликационная коррекция структуры ДНК(репарация)(репарация)

Система репарации ошибочно-встроенных нуклеотидов (Система репарации ошибочно-встроенных нуклеотидов (mismatch mismatch repairrepair) специально предназначена для удаления ошибок возникших в ) специально предназначена для удаления ошибок возникших в ДНК в ходе репликацииДНК в ходе репликации

Система эксцизионной репарации оснований исправляет повреждения в Система эксцизионной репарации оснований исправляет повреждения в ДНК возникающие в результате окислительного стресса то есть ДНК возникающие в результате окислительного стресса то есть модифицированные (окисленные) основания и разрывы в одной из цепей модифицированные (окисленные) основания и разрывы в одной из цепей ДНКДНК

Система эксцизионной репарации нуклеотидов удаляет из ДНК объемные Система эксцизионной репарации нуклеотидов удаляет из ДНК объемные повреждения фотодимеры возникающие под действием повреждения фотодимеры возникающие под действием ультрафиолетового облучения объемные аддукты метаболитов ультрафиолетового облучения объемные аддукты метаболитов попадающих из окружающей среды таких как продукты сгорания курения попадающих из окружающей среды таких как продукты сгорания курения например антрацены и бензапиренынапример антрацены и бензапирены

Синтез ДНК через повреждениеСинтез ДНК через повреждение((Translesion synthesisTranslesion synthesis ndash TLS)ndash TLS)

В случае синтеза с использованием поврежденной ДНК-матрицы транслезионными (translesion) ДНК-полимеразами (например η ι κ θ μ ζ) также возникают искажения в структуре ДНК

TLS ДНК-полимеразы ведущие синтез через повреждение матрицы не обладают корректирующей активностью поскольку их задачей является ввести во чтобы то ни стало нуклеотидное звено дабы избежать остановки репликативной вилки на повреждении матрицы Затем поврежденный участок ДНК восстанавливается системами репарации

Мутации вводимые репликативными Мутации вводимые репликативными ДНК-полимеразами в ходе репликативного синтеза ДНК-полимеразами в ходе репликативного синтеза

играют не только вредную рольиграют не только вредную роль Мутации в ДНК являются движущей Мутации в ДНК являются движущей

силой эволюциисилой эволюции

• Slide 1
• Slide 2
• Slide 3
• Slide 4
• Slide 5
• Slide 6
• Slide 7
• Slide 8
• Slide 9
• Slide 10
• Slide 11
• Slide 12
• Slide 13
• Slide 14
• Slide 15
• Slide 16
• Slide 17
• Slide 18
• Slide 19
• Slide 20
• Slide 21
• Slide 22
• Slide 23
• Slide 24
• Slide 25
• Slide 26
• Slide 27
• Slide 28
• Slide 29
• Slide 30
• Slide 31
• Slide 32
• Slide 33
• Slide 34
• Slide 35
• Slide 36
• Slide 37
• Slide 38
• Slide 39
• Slide 40
• Slide 41

Теория индуцированного Теория индуцированного соответствиясоответствия

Объясняет отсутствие ферментативной активности с небольшими субстратами такими как вода в которых нет групп способных обеспечить связывание и энергию для приведения фермента в активное состояние Является модификацией модели laquoключ-замокraquo - модель laquoрука-перчаткаraquo Предполагается что в отсутствии субстрата фермент структурно некомплементарен переходному состоянию Однако поскольку молекула фермента довольно гибкая а субстрат имеет жесткую структуру при образовании фермент-субстратного комплекса каталитические группы на ферменте ориентируются оптимальным для катализа образом фермент становится комплементарным переходному состоянию только после связывания субстрата Перестройка области активного центра при связывании с субстратом названа процессом конформационной адаптации

Дэниэл Эдвард КошландДэниэл Эдвард Кошланд1920 Нью-Йорк ndash 1919 Калифорния1920 Нью-Йорк ndash 1919 Калифорния

американский биохимикамериканский биохимик

Гипотеза непродуктивного связыванияГипотеза непродуктивного связывания

Было предложено что помимо продуктивного связывания в активном центре возможны другие способы связывания когда небольшие субстраты связываются но не подвергаются каталитическому превращению

Например в молекуле лизоцима активный центр имеет протяженную структуру состоящую из шести центров связывания ndash A B C D E F Для осуществления реакции необходимо чтобы молекула субстрата заняла центры D и Е Небольшие субстраты способны присоединяться с любой сторону вдоль вытянутого активного центра лизоцима не связываясь с подцентром где происходит расщепление

ДеформацияДеформация вносит положительный вклад в катализ вносит положительный вклад в катализ при условии комплементарности фермента при условии комплементарности фермента переходному состоянию субстрата увеличивая переходному состоянию субстрата увеличивая kkcatcat и и KKMM что приводит к увеличению скорости реакции что приводит к увеличению скорости реакции

ИндуцированноеИндуцированное соответствиесоответствие уменьшает уменьшает эффективность катализа увеличивая эффективность катализа увеличивая KKMM без без соответствующего увеличения соответствующего увеличения kkcatcat по сравнению с по сравнению с ферментом находящимся в кативной форме в ферментом находящимся в кативной форме в отсутствие субстрата отсутствие субстрата

Механизм непродуктивного связыванияМеханизм непродуктивного связывания не не затрагивает каталитического превращения затрагивает каталитического превращения специфических субстратов однако он приводит к специфических субстратов однако он приводит к появлению дополнительных связывающих центров для появлению дополнительных связывающих центров для конкурирующих между собой неспецифических конкурирующих между собой неспецифических субстратовсубстратов

Специфичность ферментаСпецифичность фермента

Способность фермента узнавать Способность фермента узнавать определенный субстрат из нескольких определенный субстрат из нескольких

конкурирующих за активный центрконкурирующих за активный центр

Функция слагающаяся из прочности связывания Функция слагающаяся из прочности связывания

каждого из субстратов и кинетической каждого из субстратов и кинетической

(каталитической) специфичности (каталитической) специфичности

характеризующейся скоростью катализахарактеризующейся скоростью катализа

laquoСуммарнаяraquo специфичность характеризуется laquoСуммарнаяraquo специфичность характеризуется

отношением отношением kkcatcatKKMM

Специфичность и относительная Специфичность и относительная реакционная способностьреакционная способность

Центральная проблема специфичности Центральная проблема специфичности каким образом фермент отличает специфический каким образом фермент отличает специфический субстрат от другого меньшего или равного ему по субстрат от другого меньшего или равного ему по размерам (изостерического) субстратаразмерам (изостерического) субстрата

Такую задачу постоянно решают аминоацил-тРНК-синтетазы Если синтетаза (ЕХ) ошибочно активирует чужую аминокислоту (Y) и далее катализирует ее перенос на laquoсвоюraquo тРНКХ

или если она ошибочно этерифицирует истинной субстратной аминокислотой Х чужую тРНК

то каждое из этих событий приведет к ошибке в последовательности синтезируемой полипептидной цепи

Дискриминация аминокислот меньших или изостеричных (равных по размеру) специфическому субстрату способных разместиться в активном центре фермента определяется предпочтительным связыванием истинного субстрата за счет незначительных различий в структуре

Валил-тРНК-синтетаза

Наличие разницы в энергии связывания не до конца обеспечивает Наличие разницы в энергии связывания не до конца обеспечивает в этих случаях точность работы системы аминоацилированияв этих случаях точность работы системы аминоацилирования

валин

Изолейцил-тРНК-синтетаза

изолейцин валин треонин

Треонин связывается с валил-тРНК синтетазой в 100-200 раз слабее валина несмотря на то что он изостеричен валину поскольку в гидрофобный карман погружается гидроксильная группа вместо метиленовой Энергия активации реакции представляет собой сумму двух составляющих одна из них ndash энергия активации для стадии химического превращения а вторая ndash энергия связывания фермента с субстратом

Валил-тРНК-синтетаза

валин треонин

Различие в энергии связывания специфичного субстрата (Различие в энергии связывания специфичного субстрата (RSRS) и ) и меньшего по размерам конкурирующего соединения меньшего по размерам конкурирующего соединения HSHS равно равно дополнительной энергии связывания группы дополнительной энергии связывания группы RR имеющейся у имеющейся у специфичного субстрата и отсутствующей у меньшего специфичного субстрата и отсутствующей у меньшего субстрата по отношению к водороду субстрата по отношению к водороду

Поскольку энергия взаимодействия группы R не только входит в энергию связывания но и понижает энергию активации стадии химического превращения вклад заместителя R следует оценивать из сравнения параметров kcatKM для двух субстратов RS и HS Например если величину kcat для валина для активации валил-тРНК-синтетазой принять за 1 то для других аминокислот эта величина будет для аланина 003 для изолейцина 00019 для серина 005

Дополнительную энергию связывания группы Дополнительную энергию связывания группы RR по отношению к по отношению к водороду можно определить по формулеводороду можно определить по формуле

∆Gb=RTln(kcatKM)RS ln(kcatKM)HS

Для пары изолейцил-тРНК-синтетаза-валин неспецифический субстрат по критерию kcatKM хуже в 140-200 раз В клетках EColi [Ile][Val] = 018 Уровень ошибок изолейцил-тРНК-синтетазы на стадии активации 003-004 Экспериментально обнаружено уровень ошибок при замене Ile на Val в биосинтезе овальбумина цыпленка и гемоглобина кролика равен 310-4

Изолейцил-тРНК-синтетаза

изолейцин валин

Чему соответствует этот уровень ошибокЧему соответствует этот уровень ошибок

Ошибочное включение одной аминокислоты на Ошибочное включение одной аминокислоты на каждые 10000 остатковкаждые 10000 остатков

Одна из 20 белковых молекул длиной в 500 остатков Одна из 20 белковых молекул длиной в 500 остатков будет содержать единственную ошибочную будет содержать единственную ошибочную

аминокислотуаминокислоту

Предположив что только около 10 всех ошибок Предположив что только около 10 всех ошибок серьезно сказываются на биологической функции серьезно сказываются на биологической функции

белка можно сделать заключение что одна белка можно сделать заключение что одна молекула белка из 200 синтезированных окажется молекула белка из 200 синтезированных окажется

бесполезной (или даже вредной) в клеточном бесполезной (или даже вредной) в клеточном метаболизмеметаболизме

Коррекция ошибок в реакциях катализируемых

аминоацил-тРНК- синтетазами

Существование механизмов Существование механизмов коррекции для аминоацил-коррекции для аминоацил-

тРНК-синтетазтРНК-синтетаз

Поль Наим БергПоль Наим Берг19219266 Бруклин СШАБруклин США

Американский биохимикАмериканский биохимикНобелевская премия

по химии 1980 г

Изолейцил-тРНК-синтетаза ошибочно активирует валин Добавление тРНК к комплексу с изолейциладенилатом приводит к образованию изолейцил-тРНК а у валиладенилат-ферментного комплекса не наблюдается образование валил-тРНК поскольку при добавлении тРНК происходит гидролиз ошибочного аминоациладенилата

Существование механизмов коррекции для Существование механизмов коррекции для аминоацил-тРНК-синтетазаминоацил-тРНК-синтетаз

В присутствии тРНКВ присутствии тРНКIleIle изолейцил-тРНК-синтетаза изолейцил-тРНК-синтетаза непроизводительно гидролизует АТР АМР + непроизводительно гидролизует АТР АМР + ppppii

ИзбыточныйИзбыточный гидролиз АТРгидролиз АТР по отношению к по отношению к синтезированному продукту за счет АТР-синтезированному продукту за счет АТР-пирофосфогидролазной активности синтетазы пирофосфогидролазной активности синтетазы является является критерием существования корректирующего механизмакритерием существования корректирующего механизма включающего дополнительную стадию разрушения ошибочного включающего дополнительную стадию разрушения ошибочного продукта реакции продукта реакции

У цистеинил- и тирозил-тРНК-синтетаз специфичность высокая У цистеинил- и тирозил-тРНК-синтетаз специфичность высокая и гидролиза АТР не наблюдается и гидролиза АТР не наблюдается

В некоторых случаях когда дискриминация аминокислот на В некоторых случаях когда дискриминация аминокислот на стадии активации была недостаточной наблюдался быстрый стадии активации была недостаточной наблюдался быстрый гидролиз ошибочного аминоациладенилата вместо переноса гидролиз ошибочного аминоациладенилата вместо переноса laquoнеправильнойraquo аминокислоты на субстратную тРНКlaquoнеправильнойraquo аминокислоты на субстратную тРНК

Роль тРНК в коррекцииРоль тРНК в коррекции

Индуцирует ли тРНК гидролиз аминоациладенилата или же служит акцептором ошибочно активированной аминокислоты а затем подвергается ферментативному деацилированию

Возможные последовательности реакций катализируемых синтетазами можно записать в виде следующей схемы (АК-аминокислота)

Роль тРНК в коррекцииРоль тРНК в коррекции

Предложенные механизмы коррекции можно разделить на две группы в зависимости от того какое соединение в них гидролизуется Механизм отбраковки ошибочной аминокислоты (Механизм отбраковки ошибочной аминокислоты (стадии 1

2 5 ndash гидролиз аминоацил-тРНК) Механизм коррекции за счет гидролиза промежуточного Механизм коррекции за счет гидролиза промежуточного

аминоациладенилата (аминоациладенилата (стадии 1 и 4 ndash гидролиз аминоациладенилата)

В каждом из возможных маршрутов коррекции исправление ошибки достигается благодаря введению в реакционный путь laquoнеобратимогоraquo ответвления (реакции 4 или 5) обеспечивающего гидролиз нежелательных соединений

Механизм отбраковки ошибочной аминокислотыМеханизм отбраковки ошибочной аминокислоты

Доказательство существования механизма гидролиза аминоацил-тРНК аминоацил-тРНК-синтетазами было получено при изучении аминоацилирования тРНКVal треонином катализируемого валил-тРНК-синтетазой из BStearothermophilus

Валил-тРНК-синтетаза образует с треонином стабильный комплекс Валил-тРНК-синтетаза образует с треонином стабильный комплекс который быстро гидролизуется при добавлении тРНКкоторый быстро гидролизуется при добавлении тРНКValVal

Предшествует ли гидролизу перенос аминоацильного остатка на тРНКПредшествует ли гидролизу перенос аминоацильного остатка на тРНКValVal

Импульсный метод laquoзамороженнойraquo струиКомплекс [14С]-треонил-АМРЕVal + тРНК [14С]-треонил-тРНК

Константа гидролиза треонил-тРНК в присутствии валил-тРНК-синтетазы 40 сКонстанта гидролиза треонил-тРНК в присутствии валил-тРНК-синтетазы 40 с -1-1а для специфичной валил-тРНК 0015 са для специфичной валил-тРНК 0015 с-1-1 то есть более чем в 2000 раз ниже то есть более чем в 2000 раз ниже

Механизм коррекции за счет гидролиза Механизм коррекции за счет гидролиза промежуточного аминоациладенилатапромежуточного аминоациладенилата

Ошибочное промежуточное соединение образующееся в ходе реакции диссоциирует с фермента и гиролизуется быстрее чем правильное Для правильного аминоациладенилата скорость переноса на тРНК выше чем диссоциация те коррекция определяется соотношением кинетических констант определенных стадий

Джон Джозеф ХопфилдДжон Джозеф Хопфилд1933 Чикаго США1933 Чикаго США

биофизик и биофизик и молекулярный биологмолекулярный биолог

Механизм кинетического корректированияМеханизм кинетического корректирования

Механизм коррекции за счет гидролиза Механизм коррекции за счет гидролиза промежуточного аминоациладенилатапромежуточного аминоациладенилата

Экспериментальное доказательствоЭкспериментальное доказательствоДля валил-тРНК-синтетазы из желтого люпина в отсутствие тРНК наблюдался гидролиз

АТР АМР + ppi зависящий от присутствия несубстратных аминокислот (Cys Thr Ser и α-аминомасляной кислоты)

Константа скорости гидролиза для этих кислот 07-13 мин-1 Специфический валиладенилат-ферментный комплекс гидролизуется с константой скорости 0018 мин-1 те например в 720 раз медленнее чем комплекс валил-тРНК-синтетазы с цистеинил-аденилатом

Коррекция ошибок в реакциях Коррекция ошибок в реакциях катализируемыхкатализируемых

ДНК-полимеразамиДНК-полимеразами

Механизм коррекции при репликации ДНКМеханизм коррекции при репликации ДНК

При синтезе ДНК ошибка исправляется после полимеризации Молекула ДНК синтезируется в направлении 5rsquo-3rsquo нуклеотиды присоединяются к 3rsquo-гидроксильной группе растущей цепи ДНК

Репликативные ДНК-полимеразы обладают Репликативные ДНК-полимеразы обладают корректирующей 3rsquo-5rsquo-экзонуклеазной активностью корректирующей 3rsquo-5rsquo-экзонуклеазной активностью

выщепляющей из цепи ошибочно встроенный нуклеотидвыщепляющей из цепи ошибочно встроенный нуклеотид

Частота мутации фага Т4 коррелирует с экзонуклеазной активностью проявляемой ДНК-полимеразой Частота мутации для ЕСoli составляет 10-6-10-8 и следовательно точность репликации ДНК либо равна этим величинам либо еще выше

Механизм коррекции при репликации ДНКМеханизм коррекции при репликации ДНК

С помощью экзонуклеазной активности исправляются ошибки которые накапливаются в процессе биосинтеза Однако нарушения структуры ДНК могут возникать не только по причине неточной работы в ходе синтеза но и в результате внешних воздействий таких как ионизирующее и ультрафиолетовое облучение окислительный стресс

Возможна различная пострепликационная коррекция структуры ДНКВозможна различная пострепликационная коррекция структуры ДНК(репарация)(репарация)

Система репарации ошибочно-встроенных нуклеотидов (Система репарации ошибочно-встроенных нуклеотидов (mismatch mismatch repairrepair) специально предназначена для удаления ошибок возникших в ) специально предназначена для удаления ошибок возникших в ДНК в ходе репликацииДНК в ходе репликации

Система эксцизионной репарации оснований исправляет повреждения в Система эксцизионной репарации оснований исправляет повреждения в ДНК возникающие в результате окислительного стресса то есть ДНК возникающие в результате окислительного стресса то есть модифицированные (окисленные) основания и разрывы в одной из цепей модифицированные (окисленные) основания и разрывы в одной из цепей ДНКДНК

Система эксцизионной репарации нуклеотидов удаляет из ДНК объемные Система эксцизионной репарации нуклеотидов удаляет из ДНК объемные повреждения фотодимеры возникающие под действием повреждения фотодимеры возникающие под действием ультрафиолетового облучения объемные аддукты метаболитов ультрафиолетового облучения объемные аддукты метаболитов попадающих из окружающей среды таких как продукты сгорания курения попадающих из окружающей среды таких как продукты сгорания курения например антрацены и бензапиренынапример антрацены и бензапирены

Синтез ДНК через повреждениеСинтез ДНК через повреждение((Translesion synthesisTranslesion synthesis ndash TLS)ndash TLS)

В случае синтеза с использованием поврежденной ДНК-матрицы транслезионными (translesion) ДНК-полимеразами (например η ι κ θ μ ζ) также возникают искажения в структуре ДНК

TLS ДНК-полимеразы ведущие синтез через повреждение матрицы не обладают корректирующей активностью поскольку их задачей является ввести во чтобы то ни стало нуклеотидное звено дабы избежать остановки репликативной вилки на повреждении матрицы Затем поврежденный участок ДНК восстанавливается системами репарации

Мутации вводимые репликативными Мутации вводимые репликативными ДНК-полимеразами в ходе репликативного синтеза ДНК-полимеразами в ходе репликативного синтеза

играют не только вредную рольиграют не только вредную роль Мутации в ДНК являются движущей Мутации в ДНК являются движущей

силой эволюциисилой эволюции

• Slide 1
• Slide 2
• Slide 3
• Slide 4
• Slide 5
• Slide 6
• Slide 7
• Slide 8
• Slide 9
• Slide 10
• Slide 11
• Slide 12
• Slide 13
• Slide 14
• Slide 15
• Slide 16
• Slide 17
• Slide 18
• Slide 19
• Slide 20
• Slide 21
• Slide 22
• Slide 23
• Slide 24
• Slide 25
• Slide 26
• Slide 27
• Slide 28
• Slide 29
• Slide 30
• Slide 31
• Slide 32
• Slide 33
• Slide 34
• Slide 35
• Slide 36
• Slide 37
• Slide 38
• Slide 39
• Slide 40
• Slide 41

Гипотеза непродуктивного связыванияГипотеза непродуктивного связывания

Было предложено что помимо продуктивного связывания в активном центре возможны другие способы связывания когда небольшие субстраты связываются но не подвергаются каталитическому превращению

Например в молекуле лизоцима активный центр имеет протяженную структуру состоящую из шести центров связывания ndash A B C D E F Для осуществления реакции необходимо чтобы молекула субстрата заняла центры D и Е Небольшие субстраты способны присоединяться с любой сторону вдоль вытянутого активного центра лизоцима не связываясь с подцентром где происходит расщепление

ДеформацияДеформация вносит положительный вклад в катализ вносит положительный вклад в катализ при условии комплементарности фермента при условии комплементарности фермента переходному состоянию субстрата увеличивая переходному состоянию субстрата увеличивая kkcatcat и и KKMM что приводит к увеличению скорости реакции что приводит к увеличению скорости реакции

ИндуцированноеИндуцированное соответствиесоответствие уменьшает уменьшает эффективность катализа увеличивая эффективность катализа увеличивая KKMM без без соответствующего увеличения соответствующего увеличения kkcatcat по сравнению с по сравнению с ферментом находящимся в кативной форме в ферментом находящимся в кативной форме в отсутствие субстрата отсутствие субстрата

Механизм непродуктивного связыванияМеханизм непродуктивного связывания не не затрагивает каталитического превращения затрагивает каталитического превращения специфических субстратов однако он приводит к специфических субстратов однако он приводит к появлению дополнительных связывающих центров для появлению дополнительных связывающих центров для конкурирующих между собой неспецифических конкурирующих между собой неспецифических субстратовсубстратов

Специфичность ферментаСпецифичность фермента

Способность фермента узнавать Способность фермента узнавать определенный субстрат из нескольких определенный субстрат из нескольких

конкурирующих за активный центрконкурирующих за активный центр

Функция слагающаяся из прочности связывания Функция слагающаяся из прочности связывания

каждого из субстратов и кинетической каждого из субстратов и кинетической

(каталитической) специфичности (каталитической) специфичности

характеризующейся скоростью катализахарактеризующейся скоростью катализа

laquoСуммарнаяraquo специфичность характеризуется laquoСуммарнаяraquo специфичность характеризуется

отношением отношением kkcatcatKKMM

Специфичность и относительная Специфичность и относительная реакционная способностьреакционная способность

Центральная проблема специфичности Центральная проблема специфичности каким образом фермент отличает специфический каким образом фермент отличает специфический субстрат от другого меньшего или равного ему по субстрат от другого меньшего или равного ему по размерам (изостерического) субстратаразмерам (изостерического) субстрата

Такую задачу постоянно решают аминоацил-тРНК-синтетазы Если синтетаза (ЕХ) ошибочно активирует чужую аминокислоту (Y) и далее катализирует ее перенос на laquoсвоюraquo тРНКХ

или если она ошибочно этерифицирует истинной субстратной аминокислотой Х чужую тРНК

то каждое из этих событий приведет к ошибке в последовательности синтезируемой полипептидной цепи

Дискриминация аминокислот меньших или изостеричных (равных по размеру) специфическому субстрату способных разместиться в активном центре фермента определяется предпочтительным связыванием истинного субстрата за счет незначительных различий в структуре

Валил-тРНК-синтетаза

Наличие разницы в энергии связывания не до конца обеспечивает Наличие разницы в энергии связывания не до конца обеспечивает в этих случаях точность работы системы аминоацилированияв этих случаях точность работы системы аминоацилирования

валин

Изолейцил-тРНК-синтетаза

изолейцин валин треонин

Треонин связывается с валил-тРНК синтетазой в 100-200 раз слабее валина несмотря на то что он изостеричен валину поскольку в гидрофобный карман погружается гидроксильная группа вместо метиленовой Энергия активации реакции представляет собой сумму двух составляющих одна из них ndash энергия активации для стадии химического превращения а вторая ndash энергия связывания фермента с субстратом

Валил-тРНК-синтетаза

валин треонин

Различие в энергии связывания специфичного субстрата (Различие в энергии связывания специфичного субстрата (RSRS) и ) и меньшего по размерам конкурирующего соединения меньшего по размерам конкурирующего соединения HSHS равно равно дополнительной энергии связывания группы дополнительной энергии связывания группы RR имеющейся у имеющейся у специфичного субстрата и отсутствующей у меньшего специфичного субстрата и отсутствующей у меньшего субстрата по отношению к водороду субстрата по отношению к водороду

Поскольку энергия взаимодействия группы R не только входит в энергию связывания но и понижает энергию активации стадии химического превращения вклад заместителя R следует оценивать из сравнения параметров kcatKM для двух субстратов RS и HS Например если величину kcat для валина для активации валил-тРНК-синтетазой принять за 1 то для других аминокислот эта величина будет для аланина 003 для изолейцина 00019 для серина 005

Дополнительную энергию связывания группы Дополнительную энергию связывания группы RR по отношению к по отношению к водороду можно определить по формулеводороду можно определить по формуле

∆Gb=RTln(kcatKM)RS ln(kcatKM)HS

Для пары изолейцил-тРНК-синтетаза-валин неспецифический субстрат по критерию kcatKM хуже в 140-200 раз В клетках EColi [Ile][Val] = 018 Уровень ошибок изолейцил-тРНК-синтетазы на стадии активации 003-004 Экспериментально обнаружено уровень ошибок при замене Ile на Val в биосинтезе овальбумина цыпленка и гемоглобина кролика равен 310-4

Изолейцил-тРНК-синтетаза

изолейцин валин

Чему соответствует этот уровень ошибокЧему соответствует этот уровень ошибок

Ошибочное включение одной аминокислоты на Ошибочное включение одной аминокислоты на каждые 10000 остатковкаждые 10000 остатков

Одна из 20 белковых молекул длиной в 500 остатков Одна из 20 белковых молекул длиной в 500 остатков будет содержать единственную ошибочную будет содержать единственную ошибочную

аминокислотуаминокислоту

Предположив что только около 10 всех ошибок Предположив что только около 10 всех ошибок серьезно сказываются на биологической функции серьезно сказываются на биологической функции

белка можно сделать заключение что одна белка можно сделать заключение что одна молекула белка из 200 синтезированных окажется молекула белка из 200 синтезированных окажется

бесполезной (или даже вредной) в клеточном бесполезной (или даже вредной) в клеточном метаболизмеметаболизме

Коррекция ошибок в реакциях катализируемых

аминоацил-тРНК- синтетазами

Существование механизмов Существование механизмов коррекции для аминоацил-коррекции для аминоацил-

тРНК-синтетазтРНК-синтетаз

Поль Наим БергПоль Наим Берг19219266 Бруклин СШАБруклин США

Американский биохимикАмериканский биохимикНобелевская премия

по химии 1980 г

Изолейцил-тРНК-синтетаза ошибочно активирует валин Добавление тРНК к комплексу с изолейциладенилатом приводит к образованию изолейцил-тРНК а у валиладенилат-ферментного комплекса не наблюдается образование валил-тРНК поскольку при добавлении тРНК происходит гидролиз ошибочного аминоациладенилата

Существование механизмов коррекции для Существование механизмов коррекции для аминоацил-тРНК-синтетазаминоацил-тРНК-синтетаз

В присутствии тРНКВ присутствии тРНКIleIle изолейцил-тРНК-синтетаза изолейцил-тРНК-синтетаза непроизводительно гидролизует АТР АМР + непроизводительно гидролизует АТР АМР + ppppii

ИзбыточныйИзбыточный гидролиз АТРгидролиз АТР по отношению к по отношению к синтезированному продукту за счет АТР-синтезированному продукту за счет АТР-пирофосфогидролазной активности синтетазы пирофосфогидролазной активности синтетазы является является критерием существования корректирующего механизмакритерием существования корректирующего механизма включающего дополнительную стадию разрушения ошибочного включающего дополнительную стадию разрушения ошибочного продукта реакции продукта реакции

У цистеинил- и тирозил-тРНК-синтетаз специфичность высокая У цистеинил- и тирозил-тРНК-синтетаз специфичность высокая и гидролиза АТР не наблюдается и гидролиза АТР не наблюдается

В некоторых случаях когда дискриминация аминокислот на В некоторых случаях когда дискриминация аминокислот на стадии активации была недостаточной наблюдался быстрый стадии активации была недостаточной наблюдался быстрый гидролиз ошибочного аминоациладенилата вместо переноса гидролиз ошибочного аминоациладенилата вместо переноса laquoнеправильнойraquo аминокислоты на субстратную тРНКlaquoнеправильнойraquo аминокислоты на субстратную тРНК

Роль тРНК в коррекцииРоль тРНК в коррекции

Индуцирует ли тРНК гидролиз аминоациладенилата или же служит акцептором ошибочно активированной аминокислоты а затем подвергается ферментативному деацилированию

Возможные последовательности реакций катализируемых синтетазами можно записать в виде следующей схемы (АК-аминокислота)

Роль тРНК в коррекцииРоль тРНК в коррекции

Предложенные механизмы коррекции можно разделить на две группы в зависимости от того какое соединение в них гидролизуется Механизм отбраковки ошибочной аминокислоты (Механизм отбраковки ошибочной аминокислоты (стадии 1

2 5 ndash гидролиз аминоацил-тРНК) Механизм коррекции за счет гидролиза промежуточного Механизм коррекции за счет гидролиза промежуточного

аминоациладенилата (аминоациладенилата (стадии 1 и 4 ndash гидролиз аминоациладенилата)

В каждом из возможных маршрутов коррекции исправление ошибки достигается благодаря введению в реакционный путь laquoнеобратимогоraquo ответвления (реакции 4 или 5) обеспечивающего гидролиз нежелательных соединений

Механизм отбраковки ошибочной аминокислотыМеханизм отбраковки ошибочной аминокислоты

Доказательство существования механизма гидролиза аминоацил-тРНК аминоацил-тРНК-синтетазами было получено при изучении аминоацилирования тРНКVal треонином катализируемого валил-тРНК-синтетазой из BStearothermophilus

Валил-тРНК-синтетаза образует с треонином стабильный комплекс Валил-тРНК-синтетаза образует с треонином стабильный комплекс который быстро гидролизуется при добавлении тРНКкоторый быстро гидролизуется при добавлении тРНКValVal

Предшествует ли гидролизу перенос аминоацильного остатка на тРНКПредшествует ли гидролизу перенос аминоацильного остатка на тРНКValVal

Импульсный метод laquoзамороженнойraquo струиКомплекс [14С]-треонил-АМРЕVal + тРНК [14С]-треонил-тРНК

Константа гидролиза треонил-тРНК в присутствии валил-тРНК-синтетазы 40 сКонстанта гидролиза треонил-тРНК в присутствии валил-тРНК-синтетазы 40 с -1-1а для специфичной валил-тРНК 0015 са для специфичной валил-тРНК 0015 с-1-1 то есть более чем в 2000 раз ниже то есть более чем в 2000 раз ниже

Механизм коррекции за счет гидролиза Механизм коррекции за счет гидролиза промежуточного аминоациладенилатапромежуточного аминоациладенилата

Ошибочное промежуточное соединение образующееся в ходе реакции диссоциирует с фермента и гиролизуется быстрее чем правильное Для правильного аминоациладенилата скорость переноса на тРНК выше чем диссоциация те коррекция определяется соотношением кинетических констант определенных стадий

Джон Джозеф ХопфилдДжон Джозеф Хопфилд1933 Чикаго США1933 Чикаго США

биофизик и биофизик и молекулярный биологмолекулярный биолог

Механизм кинетического корректированияМеханизм кинетического корректирования

Механизм коррекции за счет гидролиза Механизм коррекции за счет гидролиза промежуточного аминоациладенилатапромежуточного аминоациладенилата

Экспериментальное доказательствоЭкспериментальное доказательствоДля валил-тРНК-синтетазы из желтого люпина в отсутствие тРНК наблюдался гидролиз

АТР АМР + ppi зависящий от присутствия несубстратных аминокислот (Cys Thr Ser и α-аминомасляной кислоты)

Константа скорости гидролиза для этих кислот 07-13 мин-1 Специфический валиладенилат-ферментный комплекс гидролизуется с константой скорости 0018 мин-1 те например в 720 раз медленнее чем комплекс валил-тРНК-синтетазы с цистеинил-аденилатом

Коррекция ошибок в реакциях Коррекция ошибок в реакциях катализируемыхкатализируемых

ДНК-полимеразамиДНК-полимеразами

Механизм коррекции при репликации ДНКМеханизм коррекции при репликации ДНК

При синтезе ДНК ошибка исправляется после полимеризации Молекула ДНК синтезируется в направлении 5rsquo-3rsquo нуклеотиды присоединяются к 3rsquo-гидроксильной группе растущей цепи ДНК

Репликативные ДНК-полимеразы обладают Репликативные ДНК-полимеразы обладают корректирующей 3rsquo-5rsquo-экзонуклеазной активностью корректирующей 3rsquo-5rsquo-экзонуклеазной активностью

выщепляющей из цепи ошибочно встроенный нуклеотидвыщепляющей из цепи ошибочно встроенный нуклеотид

Частота мутации фага Т4 коррелирует с экзонуклеазной активностью проявляемой ДНК-полимеразой Частота мутации для ЕСoli составляет 10-6-10-8 и следовательно точность репликации ДНК либо равна этим величинам либо еще выше

Механизм коррекции при репликации ДНКМеханизм коррекции при репликации ДНК

С помощью экзонуклеазной активности исправляются ошибки которые накапливаются в процессе биосинтеза Однако нарушения структуры ДНК могут возникать не только по причине неточной работы в ходе синтеза но и в результате внешних воздействий таких как ионизирующее и ультрафиолетовое облучение окислительный стресс

Возможна различная пострепликационная коррекция структуры ДНКВозможна различная пострепликационная коррекция структуры ДНК(репарация)(репарация)

Система репарации ошибочно-встроенных нуклеотидов (Система репарации ошибочно-встроенных нуклеотидов (mismatch mismatch repairrepair) специально предназначена для удаления ошибок возникших в ) специально предназначена для удаления ошибок возникших в ДНК в ходе репликацииДНК в ходе репликации

Система эксцизионной репарации оснований исправляет повреждения в Система эксцизионной репарации оснований исправляет повреждения в ДНК возникающие в результате окислительного стресса то есть ДНК возникающие в результате окислительного стресса то есть модифицированные (окисленные) основания и разрывы в одной из цепей модифицированные (окисленные) основания и разрывы в одной из цепей ДНКДНК

Система эксцизионной репарации нуклеотидов удаляет из ДНК объемные Система эксцизионной репарации нуклеотидов удаляет из ДНК объемные повреждения фотодимеры возникающие под действием повреждения фотодимеры возникающие под действием ультрафиолетового облучения объемные аддукты метаболитов ультрафиолетового облучения объемные аддукты метаболитов попадающих из окружающей среды таких как продукты сгорания курения попадающих из окружающей среды таких как продукты сгорания курения например антрацены и бензапиренынапример антрацены и бензапирены

Синтез ДНК через повреждениеСинтез ДНК через повреждение((Translesion synthesisTranslesion synthesis ndash TLS)ndash TLS)

В случае синтеза с использованием поврежденной ДНК-матрицы транслезионными (translesion) ДНК-полимеразами (например η ι κ θ μ ζ) также возникают искажения в структуре ДНК

TLS ДНК-полимеразы ведущие синтез через повреждение матрицы не обладают корректирующей активностью поскольку их задачей является ввести во чтобы то ни стало нуклеотидное звено дабы избежать остановки репликативной вилки на повреждении матрицы Затем поврежденный участок ДНК восстанавливается системами репарации

Мутации вводимые репликативными Мутации вводимые репликативными ДНК-полимеразами в ходе репликативного синтеза ДНК-полимеразами в ходе репликативного синтеза

играют не только вредную рольиграют не только вредную роль Мутации в ДНК являются движущей Мутации в ДНК являются движущей

силой эволюциисилой эволюции

• Slide 1
• Slide 2
• Slide 3
• Slide 4
• Slide 5
• Slide 6
• Slide 7
• Slide 8
• Slide 9
• Slide 10
• Slide 11
• Slide 12
• Slide 13
• Slide 14
• Slide 15
• Slide 16
• Slide 17
• Slide 18
• Slide 19
• Slide 20
• Slide 21
• Slide 22
• Slide 23
• Slide 24
• Slide 25
• Slide 26
• Slide 27
• Slide 28
• Slide 29
• Slide 30
• Slide 31
• Slide 32
• Slide 33
• Slide 34
• Slide 35
• Slide 36
• Slide 37
• Slide 38
• Slide 39
• Slide 40
• Slide 41

ДеформацияДеформация вносит положительный вклад в катализ вносит положительный вклад в катализ при условии комплементарности фермента при условии комплементарности фермента переходному состоянию субстрата увеличивая переходному состоянию субстрата увеличивая kkcatcat и и KKMM что приводит к увеличению скорости реакции что приводит к увеличению скорости реакции

ИндуцированноеИндуцированное соответствиесоответствие уменьшает уменьшает эффективность катализа увеличивая эффективность катализа увеличивая KKMM без без соответствующего увеличения соответствующего увеличения kkcatcat по сравнению с по сравнению с ферментом находящимся в кативной форме в ферментом находящимся в кативной форме в отсутствие субстрата отсутствие субстрата

Механизм непродуктивного связыванияМеханизм непродуктивного связывания не не затрагивает каталитического превращения затрагивает каталитического превращения специфических субстратов однако он приводит к специфических субстратов однако он приводит к появлению дополнительных связывающих центров для появлению дополнительных связывающих центров для конкурирующих между собой неспецифических конкурирующих между собой неспецифических субстратовсубстратов

Специфичность ферментаСпецифичность фермента

Способность фермента узнавать Способность фермента узнавать определенный субстрат из нескольких определенный субстрат из нескольких

конкурирующих за активный центрконкурирующих за активный центр

Функция слагающаяся из прочности связывания Функция слагающаяся из прочности связывания

каждого из субстратов и кинетической каждого из субстратов и кинетической

(каталитической) специфичности (каталитической) специфичности

характеризующейся скоростью катализахарактеризующейся скоростью катализа

laquoСуммарнаяraquo специфичность характеризуется laquoСуммарнаяraquo специфичность характеризуется

отношением отношением kkcatcatKKMM

Специфичность и относительная Специфичность и относительная реакционная способностьреакционная способность

Центральная проблема специфичности Центральная проблема специфичности каким образом фермент отличает специфический каким образом фермент отличает специфический субстрат от другого меньшего или равного ему по субстрат от другого меньшего или равного ему по размерам (изостерического) субстратаразмерам (изостерического) субстрата

Такую задачу постоянно решают аминоацил-тРНК-синтетазы Если синтетаза (ЕХ) ошибочно активирует чужую аминокислоту (Y) и далее катализирует ее перенос на laquoсвоюraquo тРНКХ

или если она ошибочно этерифицирует истинной субстратной аминокислотой Х чужую тРНК

то каждое из этих событий приведет к ошибке в последовательности синтезируемой полипептидной цепи

Дискриминация аминокислот меньших или изостеричных (равных по размеру) специфическому субстрату способных разместиться в активном центре фермента определяется предпочтительным связыванием истинного субстрата за счет незначительных различий в структуре

Валил-тРНК-синтетаза

Наличие разницы в энергии связывания не до конца обеспечивает Наличие разницы в энергии связывания не до конца обеспечивает в этих случаях точность работы системы аминоацилированияв этих случаях точность работы системы аминоацилирования

валин

Изолейцил-тРНК-синтетаза

изолейцин валин треонин

Треонин связывается с валил-тРНК синтетазой в 100-200 раз слабее валина несмотря на то что он изостеричен валину поскольку в гидрофобный карман погружается гидроксильная группа вместо метиленовой Энергия активации реакции представляет собой сумму двух составляющих одна из них ndash энергия активации для стадии химического превращения а вторая ndash энергия связывания фермента с субстратом

Валил-тРНК-синтетаза

валин треонин

Различие в энергии связывания специфичного субстрата (Различие в энергии связывания специфичного субстрата (RSRS) и ) и меньшего по размерам конкурирующего соединения меньшего по размерам конкурирующего соединения HSHS равно равно дополнительной энергии связывания группы дополнительной энергии связывания группы RR имеющейся у имеющейся у специфичного субстрата и отсутствующей у меньшего специфичного субстрата и отсутствующей у меньшего субстрата по отношению к водороду субстрата по отношению к водороду

Поскольку энергия взаимодействия группы R не только входит в энергию связывания но и понижает энергию активации стадии химического превращения вклад заместителя R следует оценивать из сравнения параметров kcatKM для двух субстратов RS и HS Например если величину kcat для валина для активации валил-тРНК-синтетазой принять за 1 то для других аминокислот эта величина будет для аланина 003 для изолейцина 00019 для серина 005

Дополнительную энергию связывания группы Дополнительную энергию связывания группы RR по отношению к по отношению к водороду можно определить по формулеводороду можно определить по формуле

∆Gb=RTln(kcatKM)RS ln(kcatKM)HS

Для пары изолейцил-тРНК-синтетаза-валин неспецифический субстрат по критерию kcatKM хуже в 140-200 раз В клетках EColi [Ile][Val] = 018 Уровень ошибок изолейцил-тРНК-синтетазы на стадии активации 003-004 Экспериментально обнаружено уровень ошибок при замене Ile на Val в биосинтезе овальбумина цыпленка и гемоглобина кролика равен 310-4

Изолейцил-тРНК-синтетаза

изолейцин валин

Чему соответствует этот уровень ошибокЧему соответствует этот уровень ошибок

Ошибочное включение одной аминокислоты на Ошибочное включение одной аминокислоты на каждые 10000 остатковкаждые 10000 остатков

Одна из 20 белковых молекул длиной в 500 остатков Одна из 20 белковых молекул длиной в 500 остатков будет содержать единственную ошибочную будет содержать единственную ошибочную

аминокислотуаминокислоту

Предположив что только около 10 всех ошибок Предположив что только около 10 всех ошибок серьезно сказываются на биологической функции серьезно сказываются на биологической функции

белка можно сделать заключение что одна белка можно сделать заключение что одна молекула белка из 200 синтезированных окажется молекула белка из 200 синтезированных окажется

бесполезной (или даже вредной) в клеточном бесполезной (или даже вредной) в клеточном метаболизмеметаболизме

Коррекция ошибок в реакциях катализируемых

аминоацил-тРНК- синтетазами

Существование механизмов Существование механизмов коррекции для аминоацил-коррекции для аминоацил-

тРНК-синтетазтРНК-синтетаз

Поль Наим БергПоль Наим Берг19219266 Бруклин СШАБруклин США

Американский биохимикАмериканский биохимикНобелевская премия

по химии 1980 г

Изолейцил-тРНК-синтетаза ошибочно активирует валин Добавление тРНК к комплексу с изолейциладенилатом приводит к образованию изолейцил-тРНК а у валиладенилат-ферментного комплекса не наблюдается образование валил-тРНК поскольку при добавлении тРНК происходит гидролиз ошибочного аминоациладенилата

Существование механизмов коррекции для Существование механизмов коррекции для аминоацил-тРНК-синтетазаминоацил-тРНК-синтетаз

В присутствии тРНКВ присутствии тРНКIleIle изолейцил-тРНК-синтетаза изолейцил-тРНК-синтетаза непроизводительно гидролизует АТР АМР + непроизводительно гидролизует АТР АМР + ppppii

ИзбыточныйИзбыточный гидролиз АТРгидролиз АТР по отношению к по отношению к синтезированному продукту за счет АТР-синтезированному продукту за счет АТР-пирофосфогидролазной активности синтетазы пирофосфогидролазной активности синтетазы является является критерием существования корректирующего механизмакритерием существования корректирующего механизма включающего дополнительную стадию разрушения ошибочного включающего дополнительную стадию разрушения ошибочного продукта реакции продукта реакции

У цистеинил- и тирозил-тРНК-синтетаз специфичность высокая У цистеинил- и тирозил-тРНК-синтетаз специфичность высокая и гидролиза АТР не наблюдается и гидролиза АТР не наблюдается

В некоторых случаях когда дискриминация аминокислот на В некоторых случаях когда дискриминация аминокислот на стадии активации была недостаточной наблюдался быстрый стадии активации была недостаточной наблюдался быстрый гидролиз ошибочного аминоациладенилата вместо переноса гидролиз ошибочного аминоациладенилата вместо переноса laquoнеправильнойraquo аминокислоты на субстратную тРНКlaquoнеправильнойraquo аминокислоты на субстратную тРНК

Роль тРНК в коррекцииРоль тРНК в коррекции

Индуцирует ли тРНК гидролиз аминоациладенилата или же служит акцептором ошибочно активированной аминокислоты а затем подвергается ферментативному деацилированию

Возможные последовательности реакций катализируемых синтетазами можно записать в виде следующей схемы (АК-аминокислота)

Роль тРНК в коррекцииРоль тРНК в коррекции

Предложенные механизмы коррекции можно разделить на две группы в зависимости от того какое соединение в них гидролизуется Механизм отбраковки ошибочной аминокислоты (Механизм отбраковки ошибочной аминокислоты (стадии 1

2 5 ndash гидролиз аминоацил-тРНК) Механизм коррекции за счет гидролиза промежуточного Механизм коррекции за счет гидролиза промежуточного

аминоациладенилата (аминоациладенилата (стадии 1 и 4 ndash гидролиз аминоациладенилата)

В каждом из возможных маршрутов коррекции исправление ошибки достигается благодаря введению в реакционный путь laquoнеобратимогоraquo ответвления (реакции 4 или 5) обеспечивающего гидролиз нежелательных соединений

Механизм отбраковки ошибочной аминокислотыМеханизм отбраковки ошибочной аминокислоты

Доказательство существования механизма гидролиза аминоацил-тРНК аминоацил-тРНК-синтетазами было получено при изучении аминоацилирования тРНКVal треонином катализируемого валил-тРНК-синтетазой из BStearothermophilus

Валил-тРНК-синтетаза образует с треонином стабильный комплекс Валил-тРНК-синтетаза образует с треонином стабильный комплекс который быстро гидролизуется при добавлении тРНКкоторый быстро гидролизуется при добавлении тРНКValVal

Предшествует ли гидролизу перенос аминоацильного остатка на тРНКПредшествует ли гидролизу перенос аминоацильного остатка на тРНКValVal

Импульсный метод laquoзамороженнойraquo струиКомплекс [14С]-треонил-АМРЕVal + тРНК [14С]-треонил-тРНК

Константа гидролиза треонил-тРНК в присутствии валил-тРНК-синтетазы 40 сКонстанта гидролиза треонил-тРНК в присутствии валил-тРНК-синтетазы 40 с -1-1а для специфичной валил-тРНК 0015 са для специфичной валил-тРНК 0015 с-1-1 то есть более чем в 2000 раз ниже то есть более чем в 2000 раз ниже

Механизм коррекции за счет гидролиза Механизм коррекции за счет гидролиза промежуточного аминоациладенилатапромежуточного аминоациладенилата

Ошибочное промежуточное соединение образующееся в ходе реакции диссоциирует с фермента и гиролизуется быстрее чем правильное Для правильного аминоациладенилата скорость переноса на тРНК выше чем диссоциация те коррекция определяется соотношением кинетических констант определенных стадий

Джон Джозеф ХопфилдДжон Джозеф Хопфилд1933 Чикаго США1933 Чикаго США

биофизик и биофизик и молекулярный биологмолекулярный биолог

Механизм кинетического корректированияМеханизм кинетического корректирования

Механизм коррекции за счет гидролиза Механизм коррекции за счет гидролиза промежуточного аминоациладенилатапромежуточного аминоациладенилата

Экспериментальное доказательствоЭкспериментальное доказательствоДля валил-тРНК-синтетазы из желтого люпина в отсутствие тРНК наблюдался гидролиз

АТР АМР + ppi зависящий от присутствия несубстратных аминокислот (Cys Thr Ser и α-аминомасляной кислоты)

Константа скорости гидролиза для этих кислот 07-13 мин-1 Специфический валиладенилат-ферментный комплекс гидролизуется с константой скорости 0018 мин-1 те например в 720 раз медленнее чем комплекс валил-тРНК-синтетазы с цистеинил-аденилатом

Коррекция ошибок в реакциях Коррекция ошибок в реакциях катализируемыхкатализируемых

ДНК-полимеразамиДНК-полимеразами

Механизм коррекции при репликации ДНКМеханизм коррекции при репликации ДНК

При синтезе ДНК ошибка исправляется после полимеризации Молекула ДНК синтезируется в направлении 5rsquo-3rsquo нуклеотиды присоединяются к 3rsquo-гидроксильной группе растущей цепи ДНК

Репликативные ДНК-полимеразы обладают Репликативные ДНК-полимеразы обладают корректирующей 3rsquo-5rsquo-экзонуклеазной активностью корректирующей 3rsquo-5rsquo-экзонуклеазной активностью

выщепляющей из цепи ошибочно встроенный нуклеотидвыщепляющей из цепи ошибочно встроенный нуклеотид

Частота мутации фага Т4 коррелирует с экзонуклеазной активностью проявляемой ДНК-полимеразой Частота мутации для ЕСoli составляет 10-6-10-8 и следовательно точность репликации ДНК либо равна этим величинам либо еще выше

Механизм коррекции при репликации ДНКМеханизм коррекции при репликации ДНК

С помощью экзонуклеазной активности исправляются ошибки которые накапливаются в процессе биосинтеза Однако нарушения структуры ДНК могут возникать не только по причине неточной работы в ходе синтеза но и в результате внешних воздействий таких как ионизирующее и ультрафиолетовое облучение окислительный стресс

Возможна различная пострепликационная коррекция структуры ДНКВозможна различная пострепликационная коррекция структуры ДНК(репарация)(репарация)

Система репарации ошибочно-встроенных нуклеотидов (Система репарации ошибочно-встроенных нуклеотидов (mismatch mismatch repairrepair) специально предназначена для удаления ошибок возникших в ) специально предназначена для удаления ошибок возникших в ДНК в ходе репликацииДНК в ходе репликации

Система эксцизионной репарации оснований исправляет повреждения в Система эксцизионной репарации оснований исправляет повреждения в ДНК возникающие в результате окислительного стресса то есть ДНК возникающие в результате окислительного стресса то есть модифицированные (окисленные) основания и разрывы в одной из цепей модифицированные (окисленные) основания и разрывы в одной из цепей ДНКДНК

Система эксцизионной репарации нуклеотидов удаляет из ДНК объемные Система эксцизионной репарации нуклеотидов удаляет из ДНК объемные повреждения фотодимеры возникающие под действием повреждения фотодимеры возникающие под действием ультрафиолетового облучения объемные аддукты метаболитов ультрафиолетового облучения объемные аддукты метаболитов попадающих из окружающей среды таких как продукты сгорания курения попадающих из окружающей среды таких как продукты сгорания курения например антрацены и бензапиренынапример антрацены и бензапирены

Синтез ДНК через повреждениеСинтез ДНК через повреждение((Translesion synthesisTranslesion synthesis ndash TLS)ndash TLS)

В случае синтеза с использованием поврежденной ДНК-матрицы транслезионными (translesion) ДНК-полимеразами (например η ι κ θ μ ζ) также возникают искажения в структуре ДНК

TLS ДНК-полимеразы ведущие синтез через повреждение матрицы не обладают корректирующей активностью поскольку их задачей является ввести во чтобы то ни стало нуклеотидное звено дабы избежать остановки репликативной вилки на повреждении матрицы Затем поврежденный участок ДНК восстанавливается системами репарации

Мутации вводимые репликативными Мутации вводимые репликативными ДНК-полимеразами в ходе репликативного синтеза ДНК-полимеразами в ходе репликативного синтеза

играют не только вредную рольиграют не только вредную роль Мутации в ДНК являются движущей Мутации в ДНК являются движущей

силой эволюциисилой эволюции

• Slide 1
• Slide 2
• Slide 3
• Slide 4
• Slide 5
• Slide 6
• Slide 7
• Slide 8
• Slide 9
• Slide 10
• Slide 11
• Slide 12
• Slide 13
• Slide 14
• Slide 15
• Slide 16
• Slide 17
• Slide 18
• Slide 19
• Slide 20
• Slide 21
• Slide 22
• Slide 23
• Slide 24
• Slide 25
• Slide 26
• Slide 27
• Slide 28
• Slide 29
• Slide 30
• Slide 31
• Slide 32
• Slide 33
• Slide 34
• Slide 35
• Slide 36
• Slide 37
• Slide 38
• Slide 39
• Slide 40
• Slide 41

Специфичность ферментаСпецифичность фермента

Способность фермента узнавать Способность фермента узнавать определенный субстрат из нескольких определенный субстрат из нескольких

конкурирующих за активный центрконкурирующих за активный центр

Функция слагающаяся из прочности связывания Функция слагающаяся из прочности связывания

каждого из субстратов и кинетической каждого из субстратов и кинетической

(каталитической) специфичности (каталитической) специфичности

характеризующейся скоростью катализахарактеризующейся скоростью катализа

laquoСуммарнаяraquo специфичность характеризуется laquoСуммарнаяraquo специфичность характеризуется

отношением отношением kkcatcatKKMM

Специфичность и относительная Специфичность и относительная реакционная способностьреакционная способность

Центральная проблема специфичности Центральная проблема специфичности каким образом фермент отличает специфический каким образом фермент отличает специфический субстрат от другого меньшего или равного ему по субстрат от другого меньшего или равного ему по размерам (изостерического) субстратаразмерам (изостерического) субстрата

Такую задачу постоянно решают аминоацил-тРНК-синтетазы Если синтетаза (ЕХ) ошибочно активирует чужую аминокислоту (Y) и далее катализирует ее перенос на laquoсвоюraquo тРНКХ

или если она ошибочно этерифицирует истинной субстратной аминокислотой Х чужую тРНК

то каждое из этих событий приведет к ошибке в последовательности синтезируемой полипептидной цепи

Дискриминация аминокислот меньших или изостеричных (равных по размеру) специфическому субстрату способных разместиться в активном центре фермента определяется предпочтительным связыванием истинного субстрата за счет незначительных различий в структуре

Валил-тРНК-синтетаза

Наличие разницы в энергии связывания не до конца обеспечивает Наличие разницы в энергии связывания не до конца обеспечивает в этих случаях точность работы системы аминоацилированияв этих случаях точность работы системы аминоацилирования

валин

Изолейцил-тРНК-синтетаза

изолейцин валин треонин

Треонин связывается с валил-тРНК синтетазой в 100-200 раз слабее валина несмотря на то что он изостеричен валину поскольку в гидрофобный карман погружается гидроксильная группа вместо метиленовой Энергия активации реакции представляет собой сумму двух составляющих одна из них ndash энергия активации для стадии химического превращения а вторая ndash энергия связывания фермента с субстратом

Валил-тРНК-синтетаза

валин треонин

Различие в энергии связывания специфичного субстрата (Различие в энергии связывания специфичного субстрата (RSRS) и ) и меньшего по размерам конкурирующего соединения меньшего по размерам конкурирующего соединения HSHS равно равно дополнительной энергии связывания группы дополнительной энергии связывания группы RR имеющейся у имеющейся у специфичного субстрата и отсутствующей у меньшего специфичного субстрата и отсутствующей у меньшего субстрата по отношению к водороду субстрата по отношению к водороду

Поскольку энергия взаимодействия группы R не только входит в энергию связывания но и понижает энергию активации стадии химического превращения вклад заместителя R следует оценивать из сравнения параметров kcatKM для двух субстратов RS и HS Например если величину kcat для валина для активации валил-тРНК-синтетазой принять за 1 то для других аминокислот эта величина будет для аланина 003 для изолейцина 00019 для серина 005

Дополнительную энергию связывания группы Дополнительную энергию связывания группы RR по отношению к по отношению к водороду можно определить по формулеводороду можно определить по формуле

∆Gb=RTln(kcatKM)RS ln(kcatKM)HS

Для пары изолейцил-тРНК-синтетаза-валин неспецифический субстрат по критерию kcatKM хуже в 140-200 раз В клетках EColi [Ile][Val] = 018 Уровень ошибок изолейцил-тРНК-синтетазы на стадии активации 003-004 Экспериментально обнаружено уровень ошибок при замене Ile на Val в биосинтезе овальбумина цыпленка и гемоглобина кролика равен 310-4

Изолейцил-тРНК-синтетаза

изолейцин валин

Чему соответствует этот уровень ошибокЧему соответствует этот уровень ошибок

Ошибочное включение одной аминокислоты на Ошибочное включение одной аминокислоты на каждые 10000 остатковкаждые 10000 остатков

Одна из 20 белковых молекул длиной в 500 остатков Одна из 20 белковых молекул длиной в 500 остатков будет содержать единственную ошибочную будет содержать единственную ошибочную

аминокислотуаминокислоту

Предположив что только около 10 всех ошибок Предположив что только около 10 всех ошибок серьезно сказываются на биологической функции серьезно сказываются на биологической функции

белка можно сделать заключение что одна белка можно сделать заключение что одна молекула белка из 200 синтезированных окажется молекула белка из 200 синтезированных окажется

бесполезной (или даже вредной) в клеточном бесполезной (или даже вредной) в клеточном метаболизмеметаболизме

Коррекция ошибок в реакциях катализируемых

аминоацил-тРНК- синтетазами

Существование механизмов Существование механизмов коррекции для аминоацил-коррекции для аминоацил-

тРНК-синтетазтРНК-синтетаз

Поль Наим БергПоль Наим Берг19219266 Бруклин СШАБруклин США

Американский биохимикАмериканский биохимикНобелевская премия

по химии 1980 г

Изолейцил-тРНК-синтетаза ошибочно активирует валин Добавление тРНК к комплексу с изолейциладенилатом приводит к образованию изолейцил-тРНК а у валиладенилат-ферментного комплекса не наблюдается образование валил-тРНК поскольку при добавлении тРНК происходит гидролиз ошибочного аминоациладенилата

Существование механизмов коррекции для Существование механизмов коррекции для аминоацил-тРНК-синтетазаминоацил-тРНК-синтетаз

В присутствии тРНКВ присутствии тРНКIleIle изолейцил-тРНК-синтетаза изолейцил-тРНК-синтетаза непроизводительно гидролизует АТР АМР + непроизводительно гидролизует АТР АМР + ppppii

ИзбыточныйИзбыточный гидролиз АТРгидролиз АТР по отношению к по отношению к синтезированному продукту за счет АТР-синтезированному продукту за счет АТР-пирофосфогидролазной активности синтетазы пирофосфогидролазной активности синтетазы является является критерием существования корректирующего механизмакритерием существования корректирующего механизма включающего дополнительную стадию разрушения ошибочного включающего дополнительную стадию разрушения ошибочного продукта реакции продукта реакции

У цистеинил- и тирозил-тРНК-синтетаз специфичность высокая У цистеинил- и тирозил-тРНК-синтетаз специфичность высокая и гидролиза АТР не наблюдается и гидролиза АТР не наблюдается

В некоторых случаях когда дискриминация аминокислот на В некоторых случаях когда дискриминация аминокислот на стадии активации была недостаточной наблюдался быстрый стадии активации была недостаточной наблюдался быстрый гидролиз ошибочного аминоациладенилата вместо переноса гидролиз ошибочного аминоациладенилата вместо переноса laquoнеправильнойraquo аминокислоты на субстратную тРНКlaquoнеправильнойraquo аминокислоты на субстратную тРНК

Роль тРНК в коррекцииРоль тРНК в коррекции

Индуцирует ли тРНК гидролиз аминоациладенилата или же служит акцептором ошибочно активированной аминокислоты а затем подвергается ферментативному деацилированию

Возможные последовательности реакций катализируемых синтетазами можно записать в виде следующей схемы (АК-аминокислота)

Роль тРНК в коррекцииРоль тРНК в коррекции

Предложенные механизмы коррекции можно разделить на две группы в зависимости от того какое соединение в них гидролизуется Механизм отбраковки ошибочной аминокислоты (Механизм отбраковки ошибочной аминокислоты (стадии 1

2 5 ndash гидролиз аминоацил-тРНК) Механизм коррекции за счет гидролиза промежуточного Механизм коррекции за счет гидролиза промежуточного

аминоациладенилата (аминоациладенилата (стадии 1 и 4 ndash гидролиз аминоациладенилата)

В каждом из возможных маршрутов коррекции исправление ошибки достигается благодаря введению в реакционный путь laquoнеобратимогоraquo ответвления (реакции 4 или 5) обеспечивающего гидролиз нежелательных соединений

Механизм отбраковки ошибочной аминокислотыМеханизм отбраковки ошибочной аминокислоты

Доказательство существования механизма гидролиза аминоацил-тРНК аминоацил-тРНК-синтетазами было получено при изучении аминоацилирования тРНКVal треонином катализируемого валил-тРНК-синтетазой из BStearothermophilus

Валил-тРНК-синтетаза образует с треонином стабильный комплекс Валил-тРНК-синтетаза образует с треонином стабильный комплекс который быстро гидролизуется при добавлении тРНКкоторый быстро гидролизуется при добавлении тРНКValVal

Предшествует ли гидролизу перенос аминоацильного остатка на тРНКПредшествует ли гидролизу перенос аминоацильного остатка на тРНКValVal

Импульсный метод laquoзамороженнойraquo струиКомплекс [14С]-треонил-АМРЕVal + тРНК [14С]-треонил-тРНК

Константа гидролиза треонил-тРНК в присутствии валил-тРНК-синтетазы 40 сКонстанта гидролиза треонил-тРНК в присутствии валил-тРНК-синтетазы 40 с -1-1а для специфичной валил-тРНК 0015 са для специфичной валил-тРНК 0015 с-1-1 то есть более чем в 2000 раз ниже то есть более чем в 2000 раз ниже

Механизм коррекции за счет гидролиза Механизм коррекции за счет гидролиза промежуточного аминоациладенилатапромежуточного аминоациладенилата

Ошибочное промежуточное соединение образующееся в ходе реакции диссоциирует с фермента и гиролизуется быстрее чем правильное Для правильного аминоациладенилата скорость переноса на тРНК выше чем диссоциация те коррекция определяется соотношением кинетических констант определенных стадий

Джон Джозеф ХопфилдДжон Джозеф Хопфилд1933 Чикаго США1933 Чикаго США

биофизик и биофизик и молекулярный биологмолекулярный биолог

Механизм кинетического корректированияМеханизм кинетического корректирования

Механизм коррекции за счет гидролиза Механизм коррекции за счет гидролиза промежуточного аминоациладенилатапромежуточного аминоациладенилата

Экспериментальное доказательствоЭкспериментальное доказательствоДля валил-тРНК-синтетазы из желтого люпина в отсутствие тРНК наблюдался гидролиз

АТР АМР + ppi зависящий от присутствия несубстратных аминокислот (Cys Thr Ser и α-аминомасляной кислоты)

Константа скорости гидролиза для этих кислот 07-13 мин-1 Специфический валиладенилат-ферментный комплекс гидролизуется с константой скорости 0018 мин-1 те например в 720 раз медленнее чем комплекс валил-тРНК-синтетазы с цистеинил-аденилатом

Коррекция ошибок в реакциях Коррекция ошибок в реакциях катализируемыхкатализируемых

ДНК-полимеразамиДНК-полимеразами

Механизм коррекции при репликации ДНКМеханизм коррекции при репликации ДНК

При синтезе ДНК ошибка исправляется после полимеризации Молекула ДНК синтезируется в направлении 5rsquo-3rsquo нуклеотиды присоединяются к 3rsquo-гидроксильной группе растущей цепи ДНК

Репликативные ДНК-полимеразы обладают Репликативные ДНК-полимеразы обладают корректирующей 3rsquo-5rsquo-экзонуклеазной активностью корректирующей 3rsquo-5rsquo-экзонуклеазной активностью

выщепляющей из цепи ошибочно встроенный нуклеотидвыщепляющей из цепи ошибочно встроенный нуклеотид

Частота мутации фага Т4 коррелирует с экзонуклеазной активностью проявляемой ДНК-полимеразой Частота мутации для ЕСoli составляет 10-6-10-8 и следовательно точность репликации ДНК либо равна этим величинам либо еще выше

Механизм коррекции при репликации ДНКМеханизм коррекции при репликации ДНК

С помощью экзонуклеазной активности исправляются ошибки которые накапливаются в процессе биосинтеза Однако нарушения структуры ДНК могут возникать не только по причине неточной работы в ходе синтеза но и в результате внешних воздействий таких как ионизирующее и ультрафиолетовое облучение окислительный стресс

Возможна различная пострепликационная коррекция структуры ДНКВозможна различная пострепликационная коррекция структуры ДНК(репарация)(репарация)

Система репарации ошибочно-встроенных нуклеотидов (Система репарации ошибочно-встроенных нуклеотидов (mismatch mismatch repairrepair) специально предназначена для удаления ошибок возникших в ) специально предназначена для удаления ошибок возникших в ДНК в ходе репликацииДНК в ходе репликации

Система эксцизионной репарации оснований исправляет повреждения в Система эксцизионной репарации оснований исправляет повреждения в ДНК возникающие в результате окислительного стресса то есть ДНК возникающие в результате окислительного стресса то есть модифицированные (окисленные) основания и разрывы в одной из цепей модифицированные (окисленные) основания и разрывы в одной из цепей ДНКДНК

Система эксцизионной репарации нуклеотидов удаляет из ДНК объемные Система эксцизионной репарации нуклеотидов удаляет из ДНК объемные повреждения фотодимеры возникающие под действием повреждения фотодимеры возникающие под действием ультрафиолетового облучения объемные аддукты метаболитов ультрафиолетового облучения объемные аддукты метаболитов попадающих из окружающей среды таких как продукты сгорания курения попадающих из окружающей среды таких как продукты сгорания курения например антрацены и бензапиренынапример антрацены и бензапирены

Синтез ДНК через повреждениеСинтез ДНК через повреждение((Translesion synthesisTranslesion synthesis ndash TLS)ndash TLS)

В случае синтеза с использованием поврежденной ДНК-матрицы транслезионными (translesion) ДНК-полимеразами (например η ι κ θ μ ζ) также возникают искажения в структуре ДНК

TLS ДНК-полимеразы ведущие синтез через повреждение матрицы не обладают корректирующей активностью поскольку их задачей является ввести во чтобы то ни стало нуклеотидное звено дабы избежать остановки репликативной вилки на повреждении матрицы Затем поврежденный участок ДНК восстанавливается системами репарации

Мутации вводимые репликативными Мутации вводимые репликативными ДНК-полимеразами в ходе репликативного синтеза ДНК-полимеразами в ходе репликативного синтеза

играют не только вредную рольиграют не только вредную роль Мутации в ДНК являются движущей Мутации в ДНК являются движущей

силой эволюциисилой эволюции

• Slide 1
• Slide 2
• Slide 3
• Slide 4
• Slide 5
• Slide 6
• Slide 7
• Slide 8
• Slide 9
• Slide 10
• Slide 11
• Slide 12
• Slide 13
• Slide 14
• Slide 15
• Slide 16
• Slide 17
• Slide 18
• Slide 19
• Slide 20
• Slide 21
• Slide 22
• Slide 23
• Slide 24
• Slide 25
• Slide 26
• Slide 27
• Slide 28
• Slide 29
• Slide 30
• Slide 31
• Slide 32
• Slide 33
• Slide 34
• Slide 35
• Slide 36
• Slide 37
• Slide 38
• Slide 39
• Slide 40
• Slide 41

Специфичность и относительная Специфичность и относительная реакционная способностьреакционная способность

Центральная проблема специфичности Центральная проблема специфичности каким образом фермент отличает специфический каким образом фермент отличает специфический субстрат от другого меньшего или равного ему по субстрат от другого меньшего или равного ему по размерам (изостерического) субстратаразмерам (изостерического) субстрата

Такую задачу постоянно решают аминоацил-тРНК-синтетазы Если синтетаза (ЕХ) ошибочно активирует чужую аминокислоту (Y) и далее катализирует ее перенос на laquoсвоюraquo тРНКХ

или если она ошибочно этерифицирует истинной субстратной аминокислотой Х чужую тРНК

то каждое из этих событий приведет к ошибке в последовательности синтезируемой полипептидной цепи

Дискриминация аминокислот меньших или изостеричных (равных по размеру) специфическому субстрату способных разместиться в активном центре фермента определяется предпочтительным связыванием истинного субстрата за счет незначительных различий в структуре

Валил-тРНК-синтетаза

Наличие разницы в энергии связывания не до конца обеспечивает Наличие разницы в энергии связывания не до конца обеспечивает в этих случаях точность работы системы аминоацилированияв этих случаях точность работы системы аминоацилирования

валин

Изолейцил-тРНК-синтетаза

изолейцин валин треонин

Треонин связывается с валил-тРНК синтетазой в 100-200 раз слабее валина несмотря на то что он изостеричен валину поскольку в гидрофобный карман погружается гидроксильная группа вместо метиленовой Энергия активации реакции представляет собой сумму двух составляющих одна из них ndash энергия активации для стадии химического превращения а вторая ndash энергия связывания фермента с субстратом

Валил-тРНК-синтетаза

валин треонин

Различие в энергии связывания специфичного субстрата (Различие в энергии связывания специфичного субстрата (RSRS) и ) и меньшего по размерам конкурирующего соединения меньшего по размерам конкурирующего соединения HSHS равно равно дополнительной энергии связывания группы дополнительной энергии связывания группы RR имеющейся у имеющейся у специфичного субстрата и отсутствующей у меньшего специфичного субстрата и отсутствующей у меньшего субстрата по отношению к водороду субстрата по отношению к водороду

Поскольку энергия взаимодействия группы R не только входит в энергию связывания но и понижает энергию активации стадии химического превращения вклад заместителя R следует оценивать из сравнения параметров kcatKM для двух субстратов RS и HS Например если величину kcat для валина для активации валил-тРНК-синтетазой принять за 1 то для других аминокислот эта величина будет для аланина 003 для изолейцина 00019 для серина 005

Дополнительную энергию связывания группы Дополнительную энергию связывания группы RR по отношению к по отношению к водороду можно определить по формулеводороду можно определить по формуле

∆Gb=RTln(kcatKM)RS ln(kcatKM)HS

Для пары изолейцил-тРНК-синтетаза-валин неспецифический субстрат по критерию kcatKM хуже в 140-200 раз В клетках EColi [Ile][Val] = 018 Уровень ошибок изолейцил-тРНК-синтетазы на стадии активации 003-004 Экспериментально обнаружено уровень ошибок при замене Ile на Val в биосинтезе овальбумина цыпленка и гемоглобина кролика равен 310-4

Изолейцил-тРНК-синтетаза

изолейцин валин

Чему соответствует этот уровень ошибокЧему соответствует этот уровень ошибок

Ошибочное включение одной аминокислоты на Ошибочное включение одной аминокислоты на каждые 10000 остатковкаждые 10000 остатков

Одна из 20 белковых молекул длиной в 500 остатков Одна из 20 белковых молекул длиной в 500 остатков будет содержать единственную ошибочную будет содержать единственную ошибочную

аминокислотуаминокислоту

Предположив что только около 10 всех ошибок Предположив что только около 10 всех ошибок серьезно сказываются на биологической функции серьезно сказываются на биологической функции

белка можно сделать заключение что одна белка можно сделать заключение что одна молекула белка из 200 синтезированных окажется молекула белка из 200 синтезированных окажется

бесполезной (или даже вредной) в клеточном бесполезной (или даже вредной) в клеточном метаболизмеметаболизме

Коррекция ошибок в реакциях катализируемых

аминоацил-тРНК- синтетазами

Существование механизмов Существование механизмов коррекции для аминоацил-коррекции для аминоацил-

тРНК-синтетазтРНК-синтетаз

Поль Наим БергПоль Наим Берг19219266 Бруклин СШАБруклин США

Американский биохимикАмериканский биохимикНобелевская премия

по химии 1980 г

Изолейцил-тРНК-синтетаза ошибочно активирует валин Добавление тРНК к комплексу с изолейциладенилатом приводит к образованию изолейцил-тРНК а у валиладенилат-ферментного комплекса не наблюдается образование валил-тРНК поскольку при добавлении тРНК происходит гидролиз ошибочного аминоациладенилата

Существование механизмов коррекции для Существование механизмов коррекции для аминоацил-тРНК-синтетазаминоацил-тРНК-синтетаз

В присутствии тРНКВ присутствии тРНКIleIle изолейцил-тРНК-синтетаза изолейцил-тРНК-синтетаза непроизводительно гидролизует АТР АМР + непроизводительно гидролизует АТР АМР + ppppii

ИзбыточныйИзбыточный гидролиз АТРгидролиз АТР по отношению к по отношению к синтезированному продукту за счет АТР-синтезированному продукту за счет АТР-пирофосфогидролазной активности синтетазы пирофосфогидролазной активности синтетазы является является критерием существования корректирующего механизмакритерием существования корректирующего механизма включающего дополнительную стадию разрушения ошибочного включающего дополнительную стадию разрушения ошибочного продукта реакции продукта реакции

У цистеинил- и тирозил-тРНК-синтетаз специфичность высокая У цистеинил- и тирозил-тРНК-синтетаз специфичность высокая и гидролиза АТР не наблюдается и гидролиза АТР не наблюдается

В некоторых случаях когда дискриминация аминокислот на В некоторых случаях когда дискриминация аминокислот на стадии активации была недостаточной наблюдался быстрый стадии активации была недостаточной наблюдался быстрый гидролиз ошибочного аминоациладенилата вместо переноса гидролиз ошибочного аминоациладенилата вместо переноса laquoнеправильнойraquo аминокислоты на субстратную тРНКlaquoнеправильнойraquo аминокислоты на субстратную тРНК

Роль тРНК в коррекцииРоль тРНК в коррекции

Индуцирует ли тРНК гидролиз аминоациладенилата или же служит акцептором ошибочно активированной аминокислоты а затем подвергается ферментативному деацилированию

Возможные последовательности реакций катализируемых синтетазами можно записать в виде следующей схемы (АК-аминокислота)

Роль тРНК в коррекцииРоль тРНК в коррекции

Предложенные механизмы коррекции можно разделить на две группы в зависимости от того какое соединение в них гидролизуется Механизм отбраковки ошибочной аминокислоты (Механизм отбраковки ошибочной аминокислоты (стадии 1

2 5 ndash гидролиз аминоацил-тРНК) Механизм коррекции за счет гидролиза промежуточного Механизм коррекции за счет гидролиза промежуточного

аминоациладенилата (аминоациладенилата (стадии 1 и 4 ndash гидролиз аминоациладенилата)

В каждом из возможных маршрутов коррекции исправление ошибки достигается благодаря введению в реакционный путь laquoнеобратимогоraquo ответвления (реакции 4 или 5) обеспечивающего гидролиз нежелательных соединений

Механизм отбраковки ошибочной аминокислотыМеханизм отбраковки ошибочной аминокислоты

Доказательство существования механизма гидролиза аминоацил-тРНК аминоацил-тРНК-синтетазами было получено при изучении аминоацилирования тРНКVal треонином катализируемого валил-тРНК-синтетазой из BStearothermophilus

Валил-тРНК-синтетаза образует с треонином стабильный комплекс Валил-тРНК-синтетаза образует с треонином стабильный комплекс который быстро гидролизуется при добавлении тРНКкоторый быстро гидролизуется при добавлении тРНКValVal

Предшествует ли гидролизу перенос аминоацильного остатка на тРНКПредшествует ли гидролизу перенос аминоацильного остатка на тРНКValVal

Импульсный метод laquoзамороженнойraquo струиКомплекс [14С]-треонил-АМРЕVal + тРНК [14С]-треонил-тРНК

Константа гидролиза треонил-тРНК в присутствии валил-тРНК-синтетазы 40 сКонстанта гидролиза треонил-тРНК в присутствии валил-тРНК-синтетазы 40 с -1-1а для специфичной валил-тРНК 0015 са для специфичной валил-тРНК 0015 с-1-1 то есть более чем в 2000 раз ниже то есть более чем в 2000 раз ниже

Механизм коррекции за счет гидролиза Механизм коррекции за счет гидролиза промежуточного аминоациладенилатапромежуточного аминоациладенилата

Ошибочное промежуточное соединение образующееся в ходе реакции диссоциирует с фермента и гиролизуется быстрее чем правильное Для правильного аминоациладенилата скорость переноса на тРНК выше чем диссоциация те коррекция определяется соотношением кинетических констант определенных стадий

Джон Джозеф ХопфилдДжон Джозеф Хопфилд1933 Чикаго США1933 Чикаго США

биофизик и биофизик и молекулярный биологмолекулярный биолог

Механизм кинетического корректированияМеханизм кинетического корректирования

Механизм коррекции за счет гидролиза Механизм коррекции за счет гидролиза промежуточного аминоациладенилатапромежуточного аминоациладенилата

Экспериментальное доказательствоЭкспериментальное доказательствоДля валил-тРНК-синтетазы из желтого люпина в отсутствие тРНК наблюдался гидролиз

АТР АМР + ppi зависящий от присутствия несубстратных аминокислот (Cys Thr Ser и α-аминомасляной кислоты)

Константа скорости гидролиза для этих кислот 07-13 мин-1 Специфический валиладенилат-ферментный комплекс гидролизуется с константой скорости 0018 мин-1 те например в 720 раз медленнее чем комплекс валил-тРНК-синтетазы с цистеинил-аденилатом

Коррекция ошибок в реакциях Коррекция ошибок в реакциях катализируемыхкатализируемых

ДНК-полимеразамиДНК-полимеразами

Механизм коррекции при репликации ДНКМеханизм коррекции при репликации ДНК

При синтезе ДНК ошибка исправляется после полимеризации Молекула ДНК синтезируется в направлении 5rsquo-3rsquo нуклеотиды присоединяются к 3rsquo-гидроксильной группе растущей цепи ДНК

Репликативные ДНК-полимеразы обладают Репликативные ДНК-полимеразы обладают корректирующей 3rsquo-5rsquo-экзонуклеазной активностью корректирующей 3rsquo-5rsquo-экзонуклеазной активностью

выщепляющей из цепи ошибочно встроенный нуклеотидвыщепляющей из цепи ошибочно встроенный нуклеотид

Частота мутации фага Т4 коррелирует с экзонуклеазной активностью проявляемой ДНК-полимеразой Частота мутации для ЕСoli составляет 10-6-10-8 и следовательно точность репликации ДНК либо равна этим величинам либо еще выше

Механизм коррекции при репликации ДНКМеханизм коррекции при репликации ДНК

С помощью экзонуклеазной активности исправляются ошибки которые накапливаются в процессе биосинтеза Однако нарушения структуры ДНК могут возникать не только по причине неточной работы в ходе синтеза но и в результате внешних воздействий таких как ионизирующее и ультрафиолетовое облучение окислительный стресс

Возможна различная пострепликационная коррекция структуры ДНКВозможна различная пострепликационная коррекция структуры ДНК(репарация)(репарация)

Система репарации ошибочно-встроенных нуклеотидов (Система репарации ошибочно-встроенных нуклеотидов (mismatch mismatch repairrepair) специально предназначена для удаления ошибок возникших в ) специально предназначена для удаления ошибок возникших в ДНК в ходе репликацииДНК в ходе репликации

Система эксцизионной репарации оснований исправляет повреждения в Система эксцизионной репарации оснований исправляет повреждения в ДНК возникающие в результате окислительного стресса то есть ДНК возникающие в результате окислительного стресса то есть модифицированные (окисленные) основания и разрывы в одной из цепей модифицированные (окисленные) основания и разрывы в одной из цепей ДНКДНК

Система эксцизионной репарации нуклеотидов удаляет из ДНК объемные Система эксцизионной репарации нуклеотидов удаляет из ДНК объемные повреждения фотодимеры возникающие под действием повреждения фотодимеры возникающие под действием ультрафиолетового облучения объемные аддукты метаболитов ультрафиолетового облучения объемные аддукты метаболитов попадающих из окружающей среды таких как продукты сгорания курения попадающих из окружающей среды таких как продукты сгорания курения например антрацены и бензапиренынапример антрацены и бензапирены

Синтез ДНК через повреждениеСинтез ДНК через повреждение((Translesion synthesisTranslesion synthesis ndash TLS)ndash TLS)

В случае синтеза с использованием поврежденной ДНК-матрицы транслезионными (translesion) ДНК-полимеразами (например η ι κ θ μ ζ) также возникают искажения в структуре ДНК

TLS ДНК-полимеразы ведущие синтез через повреждение матрицы не обладают корректирующей активностью поскольку их задачей является ввести во чтобы то ни стало нуклеотидное звено дабы избежать остановки репликативной вилки на повреждении матрицы Затем поврежденный участок ДНК восстанавливается системами репарации

Мутации вводимые репликативными Мутации вводимые репликативными ДНК-полимеразами в ходе репликативного синтеза ДНК-полимеразами в ходе репликативного синтеза

играют не только вредную рольиграют не только вредную роль Мутации в ДНК являются движущей Мутации в ДНК являются движущей

силой эволюциисилой эволюции

• Slide 1
• Slide 2
• Slide 3
• Slide 4
• Slide 5
• Slide 6
• Slide 7
• Slide 8
• Slide 9
• Slide 10
• Slide 11
• Slide 12
• Slide 13
• Slide 14
• Slide 15
• Slide 16
• Slide 17
• Slide 18
• Slide 19
• Slide 20
• Slide 21
• Slide 22
• Slide 23
• Slide 24
• Slide 25
• Slide 26
• Slide 27
• Slide 28
• Slide 29
• Slide 30
• Slide 31
• Slide 32
• Slide 33
• Slide 34
• Slide 35
• Slide 36
• Slide 37
• Slide 38
• Slide 39
• Slide 40
• Slide 41

Дискриминация аминокислот меньших или изостеричных (равных по размеру) специфическому субстрату способных разместиться в активном центре фермента определяется предпочтительным связыванием истинного субстрата за счет незначительных различий в структуре

Валил-тРНК-синтетаза

Наличие разницы в энергии связывания не до конца обеспечивает Наличие разницы в энергии связывания не до конца обеспечивает в этих случаях точность работы системы аминоацилированияв этих случаях точность работы системы аминоацилирования

валин

Изолейцил-тРНК-синтетаза

изолейцин валин треонин

Треонин связывается с валил-тРНК синтетазой в 100-200 раз слабее валина несмотря на то что он изостеричен валину поскольку в гидрофобный карман погружается гидроксильная группа вместо метиленовой Энергия активации реакции представляет собой сумму двух составляющих одна из них ndash энергия активации для стадии химического превращения а вторая ndash энергия связывания фермента с субстратом

Валил-тРНК-синтетаза

валин треонин

Различие в энергии связывания специфичного субстрата (Различие в энергии связывания специфичного субстрата (RSRS) и ) и меньшего по размерам конкурирующего соединения меньшего по размерам конкурирующего соединения HSHS равно равно дополнительной энергии связывания группы дополнительной энергии связывания группы RR имеющейся у имеющейся у специфичного субстрата и отсутствующей у меньшего специфичного субстрата и отсутствующей у меньшего субстрата по отношению к водороду субстрата по отношению к водороду

Поскольку энергия взаимодействия группы R не только входит в энергию связывания но и понижает энергию активации стадии химического превращения вклад заместителя R следует оценивать из сравнения параметров kcatKM для двух субстратов RS и HS Например если величину kcat для валина для активации валил-тРНК-синтетазой принять за 1 то для других аминокислот эта величина будет для аланина 003 для изолейцина 00019 для серина 005

Дополнительную энергию связывания группы Дополнительную энергию связывания группы RR по отношению к по отношению к водороду можно определить по формулеводороду можно определить по формуле

∆Gb=RTln(kcatKM)RS ln(kcatKM)HS

Для пары изолейцил-тРНК-синтетаза-валин неспецифический субстрат по критерию kcatKM хуже в 140-200 раз В клетках EColi [Ile][Val] = 018 Уровень ошибок изолейцил-тРНК-синтетазы на стадии активации 003-004 Экспериментально обнаружено уровень ошибок при замене Ile на Val в биосинтезе овальбумина цыпленка и гемоглобина кролика равен 310-4

Изолейцил-тРНК-синтетаза

изолейцин валин

Чему соответствует этот уровень ошибокЧему соответствует этот уровень ошибок

Ошибочное включение одной аминокислоты на Ошибочное включение одной аминокислоты на каждые 10000 остатковкаждые 10000 остатков

Одна из 20 белковых молекул длиной в 500 остатков Одна из 20 белковых молекул длиной в 500 остатков будет содержать единственную ошибочную будет содержать единственную ошибочную

аминокислотуаминокислоту

Предположив что только около 10 всех ошибок Предположив что только около 10 всех ошибок серьезно сказываются на биологической функции серьезно сказываются на биологической функции

белка можно сделать заключение что одна белка можно сделать заключение что одна молекула белка из 200 синтезированных окажется молекула белка из 200 синтезированных окажется

бесполезной (или даже вредной) в клеточном бесполезной (или даже вредной) в клеточном метаболизмеметаболизме

Коррекция ошибок в реакциях катализируемых

аминоацил-тРНК- синтетазами

Существование механизмов Существование механизмов коррекции для аминоацил-коррекции для аминоацил-

тРНК-синтетазтРНК-синтетаз

Поль Наим БергПоль Наим Берг19219266 Бруклин СШАБруклин США

Американский биохимикАмериканский биохимикНобелевская премия

по химии 1980 г

Изолейцил-тРНК-синтетаза ошибочно активирует валин Добавление тРНК к комплексу с изолейциладенилатом приводит к образованию изолейцил-тРНК а у валиладенилат-ферментного комплекса не наблюдается образование валил-тРНК поскольку при добавлении тРНК происходит гидролиз ошибочного аминоациладенилата

Существование механизмов коррекции для Существование механизмов коррекции для аминоацил-тРНК-синтетазаминоацил-тРНК-синтетаз

В присутствии тРНКВ присутствии тРНКIleIle изолейцил-тРНК-синтетаза изолейцил-тРНК-синтетаза непроизводительно гидролизует АТР АМР + непроизводительно гидролизует АТР АМР + ppppii

ИзбыточныйИзбыточный гидролиз АТРгидролиз АТР по отношению к по отношению к синтезированному продукту за счет АТР-синтезированному продукту за счет АТР-пирофосфогидролазной активности синтетазы пирофосфогидролазной активности синтетазы является является критерием существования корректирующего механизмакритерием существования корректирующего механизма включающего дополнительную стадию разрушения ошибочного включающего дополнительную стадию разрушения ошибочного продукта реакции продукта реакции

У цистеинил- и тирозил-тРНК-синтетаз специфичность высокая У цистеинил- и тирозил-тРНК-синтетаз специфичность высокая и гидролиза АТР не наблюдается и гидролиза АТР не наблюдается

В некоторых случаях когда дискриминация аминокислот на В некоторых случаях когда дискриминация аминокислот на стадии активации была недостаточной наблюдался быстрый стадии активации была недостаточной наблюдался быстрый гидролиз ошибочного аминоациладенилата вместо переноса гидролиз ошибочного аминоациладенилата вместо переноса laquoнеправильнойraquo аминокислоты на субстратную тРНКlaquoнеправильнойraquo аминокислоты на субстратную тРНК

Роль тРНК в коррекцииРоль тРНК в коррекции

Индуцирует ли тРНК гидролиз аминоациладенилата или же служит акцептором ошибочно активированной аминокислоты а затем подвергается ферментативному деацилированию

Возможные последовательности реакций катализируемых синтетазами можно записать в виде следующей схемы (АК-аминокислота)

Роль тРНК в коррекцииРоль тРНК в коррекции

Предложенные механизмы коррекции можно разделить на две группы в зависимости от того какое соединение в них гидролизуется Механизм отбраковки ошибочной аминокислоты (Механизм отбраковки ошибочной аминокислоты (стадии 1

2 5 ndash гидролиз аминоацил-тРНК) Механизм коррекции за счет гидролиза промежуточного Механизм коррекции за счет гидролиза промежуточного

аминоациладенилата (аминоациладенилата (стадии 1 и 4 ndash гидролиз аминоациладенилата)

В каждом из возможных маршрутов коррекции исправление ошибки достигается благодаря введению в реакционный путь laquoнеобратимогоraquo ответвления (реакции 4 или 5) обеспечивающего гидролиз нежелательных соединений

Механизм отбраковки ошибочной аминокислотыМеханизм отбраковки ошибочной аминокислоты

Доказательство существования механизма гидролиза аминоацил-тРНК аминоацил-тРНК-синтетазами было получено при изучении аминоацилирования тРНКVal треонином катализируемого валил-тРНК-синтетазой из BStearothermophilus

Валил-тРНК-синтетаза образует с треонином стабильный комплекс Валил-тРНК-синтетаза образует с треонином стабильный комплекс который быстро гидролизуется при добавлении тРНКкоторый быстро гидролизуется при добавлении тРНКValVal

Предшествует ли гидролизу перенос аминоацильного остатка на тРНКПредшествует ли гидролизу перенос аминоацильного остатка на тРНКValVal

Импульсный метод laquoзамороженнойraquo струиКомплекс [14С]-треонил-АМРЕVal + тРНК [14С]-треонил-тРНК

Константа гидролиза треонил-тРНК в присутствии валил-тРНК-синтетазы 40 сКонстанта гидролиза треонил-тРНК в присутствии валил-тРНК-синтетазы 40 с -1-1а для специфичной валил-тРНК 0015 са для специфичной валил-тРНК 0015 с-1-1 то есть более чем в 2000 раз ниже то есть более чем в 2000 раз ниже

Механизм коррекции за счет гидролиза Механизм коррекции за счет гидролиза промежуточного аминоациладенилатапромежуточного аминоациладенилата

Ошибочное промежуточное соединение образующееся в ходе реакции диссоциирует с фермента и гиролизуется быстрее чем правильное Для правильного аминоациладенилата скорость переноса на тРНК выше чем диссоциация те коррекция определяется соотношением кинетических констант определенных стадий

Джон Джозеф ХопфилдДжон Джозеф Хопфилд1933 Чикаго США1933 Чикаго США

биофизик и биофизик и молекулярный биологмолекулярный биолог

Механизм кинетического корректированияМеханизм кинетического корректирования

Механизм коррекции за счет гидролиза Механизм коррекции за счет гидролиза промежуточного аминоациладенилатапромежуточного аминоациладенилата

Экспериментальное доказательствоЭкспериментальное доказательствоДля валил-тРНК-синтетазы из желтого люпина в отсутствие тРНК наблюдался гидролиз

АТР АМР + ppi зависящий от присутствия несубстратных аминокислот (Cys Thr Ser и α-аминомасляной кислоты)

Константа скорости гидролиза для этих кислот 07-13 мин-1 Специфический валиладенилат-ферментный комплекс гидролизуется с константой скорости 0018 мин-1 те например в 720 раз медленнее чем комплекс валил-тРНК-синтетазы с цистеинил-аденилатом

Коррекция ошибок в реакциях Коррекция ошибок в реакциях катализируемыхкатализируемых

ДНК-полимеразамиДНК-полимеразами

Механизм коррекции при репликации ДНКМеханизм коррекции при репликации ДНК

При синтезе ДНК ошибка исправляется после полимеризации Молекула ДНК синтезируется в направлении 5rsquo-3rsquo нуклеотиды присоединяются к 3rsquo-гидроксильной группе растущей цепи ДНК

Репликативные ДНК-полимеразы обладают Репликативные ДНК-полимеразы обладают корректирующей 3rsquo-5rsquo-экзонуклеазной активностью корректирующей 3rsquo-5rsquo-экзонуклеазной активностью

выщепляющей из цепи ошибочно встроенный нуклеотидвыщепляющей из цепи ошибочно встроенный нуклеотид

Частота мутации фага Т4 коррелирует с экзонуклеазной активностью проявляемой ДНК-полимеразой Частота мутации для ЕСoli составляет 10-6-10-8 и следовательно точность репликации ДНК либо равна этим величинам либо еще выше

Механизм коррекции при репликации ДНКМеханизм коррекции при репликации ДНК

С помощью экзонуклеазной активности исправляются ошибки которые накапливаются в процессе биосинтеза Однако нарушения структуры ДНК могут возникать не только по причине неточной работы в ходе синтеза но и в результате внешних воздействий таких как ионизирующее и ультрафиолетовое облучение окислительный стресс

Возможна различная пострепликационная коррекция структуры ДНКВозможна различная пострепликационная коррекция структуры ДНК(репарация)(репарация)

Система репарации ошибочно-встроенных нуклеотидов (Система репарации ошибочно-встроенных нуклеотидов (mismatch mismatch repairrepair) специально предназначена для удаления ошибок возникших в ) специально предназначена для удаления ошибок возникших в ДНК в ходе репликацииДНК в ходе репликации

Система эксцизионной репарации оснований исправляет повреждения в Система эксцизионной репарации оснований исправляет повреждения в ДНК возникающие в результате окислительного стресса то есть ДНК возникающие в результате окислительного стресса то есть модифицированные (окисленные) основания и разрывы в одной из цепей модифицированные (окисленные) основания и разрывы в одной из цепей ДНКДНК

Система эксцизионной репарации нуклеотидов удаляет из ДНК объемные Система эксцизионной репарации нуклеотидов удаляет из ДНК объемные повреждения фотодимеры возникающие под действием повреждения фотодимеры возникающие под действием ультрафиолетового облучения объемные аддукты метаболитов ультрафиолетового облучения объемные аддукты метаболитов попадающих из окружающей среды таких как продукты сгорания курения попадающих из окружающей среды таких как продукты сгорания курения например антрацены и бензапиренынапример антрацены и бензапирены

Синтез ДНК через повреждениеСинтез ДНК через повреждение((Translesion synthesisTranslesion synthesis ndash TLS)ndash TLS)

В случае синтеза с использованием поврежденной ДНК-матрицы транслезионными (translesion) ДНК-полимеразами (например η ι κ θ μ ζ) также возникают искажения в структуре ДНК

TLS ДНК-полимеразы ведущие синтез через повреждение матрицы не обладают корректирующей активностью поскольку их задачей является ввести во чтобы то ни стало нуклеотидное звено дабы избежать остановки репликативной вилки на повреждении матрицы Затем поврежденный участок ДНК восстанавливается системами репарации

Мутации вводимые репликативными Мутации вводимые репликативными ДНК-полимеразами в ходе репликативного синтеза ДНК-полимеразами в ходе репликативного синтеза

играют не только вредную рольиграют не только вредную роль Мутации в ДНК являются движущей Мутации в ДНК являются движущей

силой эволюциисилой эволюции

• Slide 1
• Slide 2
• Slide 3
• Slide 4
• Slide 5
• Slide 6
• Slide 7
• Slide 8
• Slide 9
• Slide 10
• Slide 11
• Slide 12
• Slide 13
• Slide 14
• Slide 15
• Slide 16
• Slide 17
• Slide 18
• Slide 19
• Slide 20
• Slide 21
• Slide 22
• Slide 23
• Slide 24
• Slide 25
• Slide 26
• Slide 27
• Slide 28
• Slide 29
• Slide 30
• Slide 31
• Slide 32
• Slide 33
• Slide 34
• Slide 35
• Slide 36
• Slide 37
• Slide 38
• Slide 39
• Slide 40
• Slide 41

Треонин связывается с валил-тРНК синтетазой в 100-200 раз слабее валина несмотря на то что он изостеричен валину поскольку в гидрофобный карман погружается гидроксильная группа вместо метиленовой Энергия активации реакции представляет собой сумму двух составляющих одна из них ndash энергия активации для стадии химического превращения а вторая ndash энергия связывания фермента с субстратом

Валил-тРНК-синтетаза

валин треонин

Различие в энергии связывания специфичного субстрата (Различие в энергии связывания специфичного субстрата (RSRS) и ) и меньшего по размерам конкурирующего соединения меньшего по размерам конкурирующего соединения HSHS равно равно дополнительной энергии связывания группы дополнительной энергии связывания группы RR имеющейся у имеющейся у специфичного субстрата и отсутствующей у меньшего специфичного субстрата и отсутствующей у меньшего субстрата по отношению к водороду субстрата по отношению к водороду

Поскольку энергия взаимодействия группы R не только входит в энергию связывания но и понижает энергию активации стадии химического превращения вклад заместителя R следует оценивать из сравнения параметров kcatKM для двух субстратов RS и HS Например если величину kcat для валина для активации валил-тРНК-синтетазой принять за 1 то для других аминокислот эта величина будет для аланина 003 для изолейцина 00019 для серина 005

Дополнительную энергию связывания группы Дополнительную энергию связывания группы RR по отношению к по отношению к водороду можно определить по формулеводороду можно определить по формуле

∆Gb=RTln(kcatKM)RS ln(kcatKM)HS

Для пары изолейцил-тРНК-синтетаза-валин неспецифический субстрат по критерию kcatKM хуже в 140-200 раз В клетках EColi [Ile][Val] = 018 Уровень ошибок изолейцил-тРНК-синтетазы на стадии активации 003-004 Экспериментально обнаружено уровень ошибок при замене Ile на Val в биосинтезе овальбумина цыпленка и гемоглобина кролика равен 310-4

Изолейцил-тРНК-синтетаза

изолейцин валин

Чему соответствует этот уровень ошибокЧему соответствует этот уровень ошибок

Ошибочное включение одной аминокислоты на Ошибочное включение одной аминокислоты на каждые 10000 остатковкаждые 10000 остатков

Одна из 20 белковых молекул длиной в 500 остатков Одна из 20 белковых молекул длиной в 500 остатков будет содержать единственную ошибочную будет содержать единственную ошибочную

аминокислотуаминокислоту

Предположив что только около 10 всех ошибок Предположив что только около 10 всех ошибок серьезно сказываются на биологической функции серьезно сказываются на биологической функции

белка можно сделать заключение что одна белка можно сделать заключение что одна молекула белка из 200 синтезированных окажется молекула белка из 200 синтезированных окажется

бесполезной (или даже вредной) в клеточном бесполезной (или даже вредной) в клеточном метаболизмеметаболизме

Коррекция ошибок в реакциях катализируемых

аминоацил-тРНК- синтетазами

Существование механизмов Существование механизмов коррекции для аминоацил-коррекции для аминоацил-

тРНК-синтетазтРНК-синтетаз

Поль Наим БергПоль Наим Берг19219266 Бруклин СШАБруклин США

Американский биохимикАмериканский биохимикНобелевская премия

по химии 1980 г

Изолейцил-тРНК-синтетаза ошибочно активирует валин Добавление тРНК к комплексу с изолейциладенилатом приводит к образованию изолейцил-тРНК а у валиладенилат-ферментного комплекса не наблюдается образование валил-тРНК поскольку при добавлении тРНК происходит гидролиз ошибочного аминоациладенилата

Существование механизмов коррекции для Существование механизмов коррекции для аминоацил-тРНК-синтетазаминоацил-тРНК-синтетаз

В присутствии тРНКВ присутствии тРНКIleIle изолейцил-тРНК-синтетаза изолейцил-тРНК-синтетаза непроизводительно гидролизует АТР АМР + непроизводительно гидролизует АТР АМР + ppppii

ИзбыточныйИзбыточный гидролиз АТРгидролиз АТР по отношению к по отношению к синтезированному продукту за счет АТР-синтезированному продукту за счет АТР-пирофосфогидролазной активности синтетазы пирофосфогидролазной активности синтетазы является является критерием существования корректирующего механизмакритерием существования корректирующего механизма включающего дополнительную стадию разрушения ошибочного включающего дополнительную стадию разрушения ошибочного продукта реакции продукта реакции

У цистеинил- и тирозил-тРНК-синтетаз специфичность высокая У цистеинил- и тирозил-тРНК-синтетаз специфичность высокая и гидролиза АТР не наблюдается и гидролиза АТР не наблюдается

В некоторых случаях когда дискриминация аминокислот на В некоторых случаях когда дискриминация аминокислот на стадии активации была недостаточной наблюдался быстрый стадии активации была недостаточной наблюдался быстрый гидролиз ошибочного аминоациладенилата вместо переноса гидролиз ошибочного аминоациладенилата вместо переноса laquoнеправильнойraquo аминокислоты на субстратную тРНКlaquoнеправильнойraquo аминокислоты на субстратную тРНК

Роль тРНК в коррекцииРоль тРНК в коррекции

Индуцирует ли тРНК гидролиз аминоациладенилата или же служит акцептором ошибочно активированной аминокислоты а затем подвергается ферментативному деацилированию

Возможные последовательности реакций катализируемых синтетазами можно записать в виде следующей схемы (АК-аминокислота)

Роль тРНК в коррекцииРоль тРНК в коррекции

Предложенные механизмы коррекции можно разделить на две группы в зависимости от того какое соединение в них гидролизуется Механизм отбраковки ошибочной аминокислоты (Механизм отбраковки ошибочной аминокислоты (стадии 1

2 5 ndash гидролиз аминоацил-тРНК) Механизм коррекции за счет гидролиза промежуточного Механизм коррекции за счет гидролиза промежуточного

аминоациладенилата (аминоациладенилата (стадии 1 и 4 ndash гидролиз аминоациладенилата)

В каждом из возможных маршрутов коррекции исправление ошибки достигается благодаря введению в реакционный путь laquoнеобратимогоraquo ответвления (реакции 4 или 5) обеспечивающего гидролиз нежелательных соединений

Механизм отбраковки ошибочной аминокислотыМеханизм отбраковки ошибочной аминокислоты

Доказательство существования механизма гидролиза аминоацил-тРНК аминоацил-тРНК-синтетазами было получено при изучении аминоацилирования тРНКVal треонином катализируемого валил-тРНК-синтетазой из BStearothermophilus

Валил-тРНК-синтетаза образует с треонином стабильный комплекс Валил-тРНК-синтетаза образует с треонином стабильный комплекс который быстро гидролизуется при добавлении тРНКкоторый быстро гидролизуется при добавлении тРНКValVal

Предшествует ли гидролизу перенос аминоацильного остатка на тРНКПредшествует ли гидролизу перенос аминоацильного остатка на тРНКValVal

Импульсный метод laquoзамороженнойraquo струиКомплекс [14С]-треонил-АМРЕVal + тРНК [14С]-треонил-тРНК

Константа гидролиза треонил-тРНК в присутствии валил-тРНК-синтетазы 40 сКонстанта гидролиза треонил-тРНК в присутствии валил-тРНК-синтетазы 40 с -1-1а для специфичной валил-тРНК 0015 са для специфичной валил-тРНК 0015 с-1-1 то есть более чем в 2000 раз ниже то есть более чем в 2000 раз ниже

Механизм коррекции за счет гидролиза Механизм коррекции за счет гидролиза промежуточного аминоациладенилатапромежуточного аминоациладенилата

Ошибочное промежуточное соединение образующееся в ходе реакции диссоциирует с фермента и гиролизуется быстрее чем правильное Для правильного аминоациладенилата скорость переноса на тРНК выше чем диссоциация те коррекция определяется соотношением кинетических констант определенных стадий

Джон Джозеф ХопфилдДжон Джозеф Хопфилд1933 Чикаго США1933 Чикаго США

биофизик и биофизик и молекулярный биологмолекулярный биолог

Механизм кинетического корректированияМеханизм кинетического корректирования

Механизм коррекции за счет гидролиза Механизм коррекции за счет гидролиза промежуточного аминоациладенилатапромежуточного аминоациладенилата

Экспериментальное доказательствоЭкспериментальное доказательствоДля валил-тРНК-синтетазы из желтого люпина в отсутствие тРНК наблюдался гидролиз

АТР АМР + ppi зависящий от присутствия несубстратных аминокислот (Cys Thr Ser и α-аминомасляной кислоты)

Константа скорости гидролиза для этих кислот 07-13 мин-1 Специфический валиладенилат-ферментный комплекс гидролизуется с константой скорости 0018 мин-1 те например в 720 раз медленнее чем комплекс валил-тРНК-синтетазы с цистеинил-аденилатом

Коррекция ошибок в реакциях Коррекция ошибок в реакциях катализируемыхкатализируемых

ДНК-полимеразамиДНК-полимеразами

Механизм коррекции при репликации ДНКМеханизм коррекции при репликации ДНК

При синтезе ДНК ошибка исправляется после полимеризации Молекула ДНК синтезируется в направлении 5rsquo-3rsquo нуклеотиды присоединяются к 3rsquo-гидроксильной группе растущей цепи ДНК

Репликативные ДНК-полимеразы обладают Репликативные ДНК-полимеразы обладают корректирующей 3rsquo-5rsquo-экзонуклеазной активностью корректирующей 3rsquo-5rsquo-экзонуклеазной активностью

выщепляющей из цепи ошибочно встроенный нуклеотидвыщепляющей из цепи ошибочно встроенный нуклеотид

Частота мутации фага Т4 коррелирует с экзонуклеазной активностью проявляемой ДНК-полимеразой Частота мутации для ЕСoli составляет 10-6-10-8 и следовательно точность репликации ДНК либо равна этим величинам либо еще выше

Механизм коррекции при репликации ДНКМеханизм коррекции при репликации ДНК

С помощью экзонуклеазной активности исправляются ошибки которые накапливаются в процессе биосинтеза Однако нарушения структуры ДНК могут возникать не только по причине неточной работы в ходе синтеза но и в результате внешних воздействий таких как ионизирующее и ультрафиолетовое облучение окислительный стресс

Возможна различная пострепликационная коррекция структуры ДНКВозможна различная пострепликационная коррекция структуры ДНК(репарация)(репарация)

Система репарации ошибочно-встроенных нуклеотидов (Система репарации ошибочно-встроенных нуклеотидов (mismatch mismatch repairrepair) специально предназначена для удаления ошибок возникших в ) специально предназначена для удаления ошибок возникших в ДНК в ходе репликацииДНК в ходе репликации

Система эксцизионной репарации оснований исправляет повреждения в Система эксцизионной репарации оснований исправляет повреждения в ДНК возникающие в результате окислительного стресса то есть ДНК возникающие в результате окислительного стресса то есть модифицированные (окисленные) основания и разрывы в одной из цепей модифицированные (окисленные) основания и разрывы в одной из цепей ДНКДНК

Система эксцизионной репарации нуклеотидов удаляет из ДНК объемные Система эксцизионной репарации нуклеотидов удаляет из ДНК объемные повреждения фотодимеры возникающие под действием повреждения фотодимеры возникающие под действием ультрафиолетового облучения объемные аддукты метаболитов ультрафиолетового облучения объемные аддукты метаболитов попадающих из окружающей среды таких как продукты сгорания курения попадающих из окружающей среды таких как продукты сгорания курения например антрацены и бензапиренынапример антрацены и бензапирены

Синтез ДНК через повреждениеСинтез ДНК через повреждение((Translesion synthesisTranslesion synthesis ndash TLS)ndash TLS)

В случае синтеза с использованием поврежденной ДНК-матрицы транслезионными (translesion) ДНК-полимеразами (например η ι κ θ μ ζ) также возникают искажения в структуре ДНК

TLS ДНК-полимеразы ведущие синтез через повреждение матрицы не обладают корректирующей активностью поскольку их задачей является ввести во чтобы то ни стало нуклеотидное звено дабы избежать остановки репликативной вилки на повреждении матрицы Затем поврежденный участок ДНК восстанавливается системами репарации

Мутации вводимые репликативными Мутации вводимые репликативными ДНК-полимеразами в ходе репликативного синтеза ДНК-полимеразами в ходе репликативного синтеза

играют не только вредную рольиграют не только вредную роль Мутации в ДНК являются движущей Мутации в ДНК являются движущей

силой эволюциисилой эволюции

• Slide 1
• Slide 2
• Slide 3
• Slide 4
• Slide 5
• Slide 6
• Slide 7
• Slide 8
• Slide 9
• Slide 10
• Slide 11
• Slide 12
• Slide 13
• Slide 14
• Slide 15
• Slide 16
• Slide 17
• Slide 18
• Slide 19
• Slide 20
• Slide 21
• Slide 22
• Slide 23
• Slide 24
• Slide 25
• Slide 26
• Slide 27
• Slide 28
• Slide 29
• Slide 30
• Slide 31
• Slide 32
• Slide 33
• Slide 34
• Slide 35
• Slide 36
• Slide 37
• Slide 38
• Slide 39
• Slide 40
• Slide 41

Различие в энергии связывания специфичного субстрата (Различие в энергии связывания специфичного субстрата (RSRS) и ) и меньшего по размерам конкурирующего соединения меньшего по размерам конкурирующего соединения HSHS равно равно дополнительной энергии связывания группы дополнительной энергии связывания группы RR имеющейся у имеющейся у специфичного субстрата и отсутствующей у меньшего специфичного субстрата и отсутствующей у меньшего субстрата по отношению к водороду субстрата по отношению к водороду

Поскольку энергия взаимодействия группы R не только входит в энергию связывания но и понижает энергию активации стадии химического превращения вклад заместителя R следует оценивать из сравнения параметров kcatKM для двух субстратов RS и HS Например если величину kcat для валина для активации валил-тРНК-синтетазой принять за 1 то для других аминокислот эта величина будет для аланина 003 для изолейцина 00019 для серина 005

Дополнительную энергию связывания группы Дополнительную энергию связывания группы RR по отношению к по отношению к водороду можно определить по формулеводороду можно определить по формуле

∆Gb=RTln(kcatKM)RS ln(kcatKM)HS

Для пары изолейцил-тРНК-синтетаза-валин неспецифический субстрат по критерию kcatKM хуже в 140-200 раз В клетках EColi [Ile][Val] = 018 Уровень ошибок изолейцил-тРНК-синтетазы на стадии активации 003-004 Экспериментально обнаружено уровень ошибок при замене Ile на Val в биосинтезе овальбумина цыпленка и гемоглобина кролика равен 310-4

Изолейцил-тРНК-синтетаза

изолейцин валин

Чему соответствует этот уровень ошибокЧему соответствует этот уровень ошибок

Ошибочное включение одной аминокислоты на Ошибочное включение одной аминокислоты на каждые 10000 остатковкаждые 10000 остатков

Одна из 20 белковых молекул длиной в 500 остатков Одна из 20 белковых молекул длиной в 500 остатков будет содержать единственную ошибочную будет содержать единственную ошибочную

аминокислотуаминокислоту

Предположив что только около 10 всех ошибок Предположив что только около 10 всех ошибок серьезно сказываются на биологической функции серьезно сказываются на биологической функции

белка можно сделать заключение что одна белка можно сделать заключение что одна молекула белка из 200 синтезированных окажется молекула белка из 200 синтезированных окажется

бесполезной (или даже вредной) в клеточном бесполезной (или даже вредной) в клеточном метаболизмеметаболизме

Коррекция ошибок в реакциях катализируемых

аминоацил-тРНК- синтетазами

Существование механизмов Существование механизмов коррекции для аминоацил-коррекции для аминоацил-

тРНК-синтетазтРНК-синтетаз

Поль Наим БергПоль Наим Берг19219266 Бруклин СШАБруклин США

Американский биохимикАмериканский биохимикНобелевская премия

по химии 1980 г

Изолейцил-тРНК-синтетаза ошибочно активирует валин Добавление тРНК к комплексу с изолейциладенилатом приводит к образованию изолейцил-тРНК а у валиладенилат-ферментного комплекса не наблюдается образование валил-тРНК поскольку при добавлении тРНК происходит гидролиз ошибочного аминоациладенилата

Существование механизмов коррекции для Существование механизмов коррекции для аминоацил-тРНК-синтетазаминоацил-тРНК-синтетаз

В присутствии тРНКВ присутствии тРНКIleIle изолейцил-тРНК-синтетаза изолейцил-тРНК-синтетаза непроизводительно гидролизует АТР АМР + непроизводительно гидролизует АТР АМР + ppppii

ИзбыточныйИзбыточный гидролиз АТРгидролиз АТР по отношению к по отношению к синтезированному продукту за счет АТР-синтезированному продукту за счет АТР-пирофосфогидролазной активности синтетазы пирофосфогидролазной активности синтетазы является является критерием существования корректирующего механизмакритерием существования корректирующего механизма включающего дополнительную стадию разрушения ошибочного включающего дополнительную стадию разрушения ошибочного продукта реакции продукта реакции

У цистеинил- и тирозил-тРНК-синтетаз специфичность высокая У цистеинил- и тирозил-тРНК-синтетаз специфичность высокая и гидролиза АТР не наблюдается и гидролиза АТР не наблюдается

В некоторых случаях когда дискриминация аминокислот на В некоторых случаях когда дискриминация аминокислот на стадии активации была недостаточной наблюдался быстрый стадии активации была недостаточной наблюдался быстрый гидролиз ошибочного аминоациладенилата вместо переноса гидролиз ошибочного аминоациладенилата вместо переноса laquoнеправильнойraquo аминокислоты на субстратную тРНКlaquoнеправильнойraquo аминокислоты на субстратную тРНК

Роль тРНК в коррекцииРоль тРНК в коррекции

Индуцирует ли тРНК гидролиз аминоациладенилата или же служит акцептором ошибочно активированной аминокислоты а затем подвергается ферментативному деацилированию

Возможные последовательности реакций катализируемых синтетазами можно записать в виде следующей схемы (АК-аминокислота)

Роль тРНК в коррекцииРоль тРНК в коррекции

Предложенные механизмы коррекции можно разделить на две группы в зависимости от того какое соединение в них гидролизуется Механизм отбраковки ошибочной аминокислоты (Механизм отбраковки ошибочной аминокислоты (стадии 1

2 5 ndash гидролиз аминоацил-тРНК) Механизм коррекции за счет гидролиза промежуточного Механизм коррекции за счет гидролиза промежуточного

аминоациладенилата (аминоациладенилата (стадии 1 и 4 ndash гидролиз аминоациладенилата)

В каждом из возможных маршрутов коррекции исправление ошибки достигается благодаря введению в реакционный путь laquoнеобратимогоraquo ответвления (реакции 4 или 5) обеспечивающего гидролиз нежелательных соединений

Механизм отбраковки ошибочной аминокислотыМеханизм отбраковки ошибочной аминокислоты

Доказательство существования механизма гидролиза аминоацил-тРНК аминоацил-тРНК-синтетазами было получено при изучении аминоацилирования тРНКVal треонином катализируемого валил-тРНК-синтетазой из BStearothermophilus

Валил-тРНК-синтетаза образует с треонином стабильный комплекс Валил-тРНК-синтетаза образует с треонином стабильный комплекс который быстро гидролизуется при добавлении тРНКкоторый быстро гидролизуется при добавлении тРНКValVal

Предшествует ли гидролизу перенос аминоацильного остатка на тРНКПредшествует ли гидролизу перенос аминоацильного остатка на тРНКValVal

Импульсный метод laquoзамороженнойraquo струиКомплекс [14С]-треонил-АМРЕVal + тРНК [14С]-треонил-тРНК

Константа гидролиза треонил-тРНК в присутствии валил-тРНК-синтетазы 40 сКонстанта гидролиза треонил-тРНК в присутствии валил-тРНК-синтетазы 40 с -1-1а для специфичной валил-тРНК 0015 са для специфичной валил-тРНК 0015 с-1-1 то есть более чем в 2000 раз ниже то есть более чем в 2000 раз ниже

Механизм коррекции за счет гидролиза Механизм коррекции за счет гидролиза промежуточного аминоациладенилатапромежуточного аминоациладенилата

Ошибочное промежуточное соединение образующееся в ходе реакции диссоциирует с фермента и гиролизуется быстрее чем правильное Для правильного аминоациладенилата скорость переноса на тРНК выше чем диссоциация те коррекция определяется соотношением кинетических констант определенных стадий

Джон Джозеф ХопфилдДжон Джозеф Хопфилд1933 Чикаго США1933 Чикаго США

биофизик и биофизик и молекулярный биологмолекулярный биолог

Механизм кинетического корректированияМеханизм кинетического корректирования

Механизм коррекции за счет гидролиза Механизм коррекции за счет гидролиза промежуточного аминоациладенилатапромежуточного аминоациладенилата

Экспериментальное доказательствоЭкспериментальное доказательствоДля валил-тРНК-синтетазы из желтого люпина в отсутствие тРНК наблюдался гидролиз

АТР АМР + ppi зависящий от присутствия несубстратных аминокислот (Cys Thr Ser и α-аминомасляной кислоты)

Константа скорости гидролиза для этих кислот 07-13 мин-1 Специфический валиладенилат-ферментный комплекс гидролизуется с константой скорости 0018 мин-1 те например в 720 раз медленнее чем комплекс валил-тРНК-синтетазы с цистеинил-аденилатом

Коррекция ошибок в реакциях Коррекция ошибок в реакциях катализируемыхкатализируемых

ДНК-полимеразамиДНК-полимеразами

Механизм коррекции при репликации ДНКМеханизм коррекции при репликации ДНК

При синтезе ДНК ошибка исправляется после полимеризации Молекула ДНК синтезируется в направлении 5rsquo-3rsquo нуклеотиды присоединяются к 3rsquo-гидроксильной группе растущей цепи ДНК

Репликативные ДНК-полимеразы обладают Репликативные ДНК-полимеразы обладают корректирующей 3rsquo-5rsquo-экзонуклеазной активностью корректирующей 3rsquo-5rsquo-экзонуклеазной активностью

выщепляющей из цепи ошибочно встроенный нуклеотидвыщепляющей из цепи ошибочно встроенный нуклеотид

Частота мутации фага Т4 коррелирует с экзонуклеазной активностью проявляемой ДНК-полимеразой Частота мутации для ЕСoli составляет 10-6-10-8 и следовательно точность репликации ДНК либо равна этим величинам либо еще выше

Механизм коррекции при репликации ДНКМеханизм коррекции при репликации ДНК

С помощью экзонуклеазной активности исправляются ошибки которые накапливаются в процессе биосинтеза Однако нарушения структуры ДНК могут возникать не только по причине неточной работы в ходе синтеза но и в результате внешних воздействий таких как ионизирующее и ультрафиолетовое облучение окислительный стресс

Возможна различная пострепликационная коррекция структуры ДНКВозможна различная пострепликационная коррекция структуры ДНК(репарация)(репарация)

Система репарации ошибочно-встроенных нуклеотидов (Система репарации ошибочно-встроенных нуклеотидов (mismatch mismatch repairrepair) специально предназначена для удаления ошибок возникших в ) специально предназначена для удаления ошибок возникших в ДНК в ходе репликацииДНК в ходе репликации

Система эксцизионной репарации оснований исправляет повреждения в Система эксцизионной репарации оснований исправляет повреждения в ДНК возникающие в результате окислительного стресса то есть ДНК возникающие в результате окислительного стресса то есть модифицированные (окисленные) основания и разрывы в одной из цепей модифицированные (окисленные) основания и разрывы в одной из цепей ДНКДНК

Система эксцизионной репарации нуклеотидов удаляет из ДНК объемные Система эксцизионной репарации нуклеотидов удаляет из ДНК объемные повреждения фотодимеры возникающие под действием повреждения фотодимеры возникающие под действием ультрафиолетового облучения объемные аддукты метаболитов ультрафиолетового облучения объемные аддукты метаболитов попадающих из окружающей среды таких как продукты сгорания курения попадающих из окружающей среды таких как продукты сгорания курения например антрацены и бензапиренынапример антрацены и бензапирены

Синтез ДНК через повреждениеСинтез ДНК через повреждение((Translesion synthesisTranslesion synthesis ndash TLS)ndash TLS)

В случае синтеза с использованием поврежденной ДНК-матрицы транслезионными (translesion) ДНК-полимеразами (например η ι κ θ μ ζ) также возникают искажения в структуре ДНК

TLS ДНК-полимеразы ведущие синтез через повреждение матрицы не обладают корректирующей активностью поскольку их задачей является ввести во чтобы то ни стало нуклеотидное звено дабы избежать остановки репликативной вилки на повреждении матрицы Затем поврежденный участок ДНК восстанавливается системами репарации

Мутации вводимые репликативными Мутации вводимые репликативными ДНК-полимеразами в ходе репликативного синтеза ДНК-полимеразами в ходе репликативного синтеза

играют не только вредную рольиграют не только вредную роль Мутации в ДНК являются движущей Мутации в ДНК являются движущей

силой эволюциисилой эволюции

• Slide 1
• Slide 2
• Slide 3
• Slide 4
• Slide 5
• Slide 6
• Slide 7
• Slide 8
• Slide 9
• Slide 10
• Slide 11
• Slide 12
• Slide 13
• Slide 14
• Slide 15
• Slide 16
• Slide 17
• Slide 18
• Slide 19
• Slide 20
• Slide 21
• Slide 22
• Slide 23
• Slide 24
• Slide 25
• Slide 26
• Slide 27
• Slide 28
• Slide 29
• Slide 30
• Slide 31
• Slide 32
• Slide 33
• Slide 34
• Slide 35
• Slide 36
• Slide 37
• Slide 38
• Slide 39
• Slide 40
• Slide 41

Для пары изолейцил-тРНК-синтетаза-валин неспецифический субстрат по критерию kcatKM хуже в 140-200 раз В клетках EColi [Ile][Val] = 018 Уровень ошибок изолейцил-тРНК-синтетазы на стадии активации 003-004 Экспериментально обнаружено уровень ошибок при замене Ile на Val в биосинтезе овальбумина цыпленка и гемоглобина кролика равен 310-4

Изолейцил-тРНК-синтетаза

изолейцин валин

Чему соответствует этот уровень ошибокЧему соответствует этот уровень ошибок

Ошибочное включение одной аминокислоты на Ошибочное включение одной аминокислоты на каждые 10000 остатковкаждые 10000 остатков

Одна из 20 белковых молекул длиной в 500 остатков Одна из 20 белковых молекул длиной в 500 остатков будет содержать единственную ошибочную будет содержать единственную ошибочную

аминокислотуаминокислоту

Предположив что только около 10 всех ошибок Предположив что только около 10 всех ошибок серьезно сказываются на биологической функции серьезно сказываются на биологической функции

белка можно сделать заключение что одна белка можно сделать заключение что одна молекула белка из 200 синтезированных окажется молекула белка из 200 синтезированных окажется

бесполезной (или даже вредной) в клеточном бесполезной (или даже вредной) в клеточном метаболизмеметаболизме

Коррекция ошибок в реакциях катализируемых

аминоацил-тРНК- синтетазами

Существование механизмов Существование механизмов коррекции для аминоацил-коррекции для аминоацил-

тРНК-синтетазтРНК-синтетаз

Поль Наим БергПоль Наим Берг19219266 Бруклин СШАБруклин США

Американский биохимикАмериканский биохимикНобелевская премия

по химии 1980 г

Изолейцил-тРНК-синтетаза ошибочно активирует валин Добавление тРНК к комплексу с изолейциладенилатом приводит к образованию изолейцил-тРНК а у валиладенилат-ферментного комплекса не наблюдается образование валил-тРНК поскольку при добавлении тРНК происходит гидролиз ошибочного аминоациладенилата

Существование механизмов коррекции для Существование механизмов коррекции для аминоацил-тРНК-синтетазаминоацил-тРНК-синтетаз

В присутствии тРНКВ присутствии тРНКIleIle изолейцил-тРНК-синтетаза изолейцил-тРНК-синтетаза непроизводительно гидролизует АТР АМР + непроизводительно гидролизует АТР АМР + ppppii

ИзбыточныйИзбыточный гидролиз АТРгидролиз АТР по отношению к по отношению к синтезированному продукту за счет АТР-синтезированному продукту за счет АТР-пирофосфогидролазной активности синтетазы пирофосфогидролазной активности синтетазы является является критерием существования корректирующего механизмакритерием существования корректирующего механизма включающего дополнительную стадию разрушения ошибочного включающего дополнительную стадию разрушения ошибочного продукта реакции продукта реакции

У цистеинил- и тирозил-тРНК-синтетаз специфичность высокая У цистеинил- и тирозил-тРНК-синтетаз специфичность высокая и гидролиза АТР не наблюдается и гидролиза АТР не наблюдается

В некоторых случаях когда дискриминация аминокислот на В некоторых случаях когда дискриминация аминокислот на стадии активации была недостаточной наблюдался быстрый стадии активации была недостаточной наблюдался быстрый гидролиз ошибочного аминоациладенилата вместо переноса гидролиз ошибочного аминоациладенилата вместо переноса laquoнеправильнойraquo аминокислоты на субстратную тРНКlaquoнеправильнойraquo аминокислоты на субстратную тРНК

Роль тРНК в коррекцииРоль тРНК в коррекции

Индуцирует ли тРНК гидролиз аминоациладенилата или же служит акцептором ошибочно активированной аминокислоты а затем подвергается ферментативному деацилированию

Возможные последовательности реакций катализируемых синтетазами можно записать в виде следующей схемы (АК-аминокислота)

Роль тРНК в коррекцииРоль тРНК в коррекции

Предложенные механизмы коррекции можно разделить на две группы в зависимости от того какое соединение в них гидролизуется Механизм отбраковки ошибочной аминокислоты (Механизм отбраковки ошибочной аминокислоты (стадии 1

2 5 ndash гидролиз аминоацил-тРНК) Механизм коррекции за счет гидролиза промежуточного Механизм коррекции за счет гидролиза промежуточного

аминоациладенилата (аминоациладенилата (стадии 1 и 4 ndash гидролиз аминоациладенилата)

В каждом из возможных маршрутов коррекции исправление ошибки достигается благодаря введению в реакционный путь laquoнеобратимогоraquo ответвления (реакции 4 или 5) обеспечивающего гидролиз нежелательных соединений

Механизм отбраковки ошибочной аминокислотыМеханизм отбраковки ошибочной аминокислоты

Доказательство существования механизма гидролиза аминоацил-тРНК аминоацил-тРНК-синтетазами было получено при изучении аминоацилирования тРНКVal треонином катализируемого валил-тРНК-синтетазой из BStearothermophilus

Валил-тРНК-синтетаза образует с треонином стабильный комплекс Валил-тРНК-синтетаза образует с треонином стабильный комплекс который быстро гидролизуется при добавлении тРНКкоторый быстро гидролизуется при добавлении тРНКValVal

Предшествует ли гидролизу перенос аминоацильного остатка на тРНКПредшествует ли гидролизу перенос аминоацильного остатка на тРНКValVal

Импульсный метод laquoзамороженнойraquo струиКомплекс [14С]-треонил-АМРЕVal + тРНК [14С]-треонил-тРНК

Константа гидролиза треонил-тРНК в присутствии валил-тРНК-синтетазы 40 сКонстанта гидролиза треонил-тРНК в присутствии валил-тРНК-синтетазы 40 с -1-1а для специфичной валил-тРНК 0015 са для специфичной валил-тРНК 0015 с-1-1 то есть более чем в 2000 раз ниже то есть более чем в 2000 раз ниже

Механизм коррекции за счет гидролиза Механизм коррекции за счет гидролиза промежуточного аминоациладенилатапромежуточного аминоациладенилата

Ошибочное промежуточное соединение образующееся в ходе реакции диссоциирует с фермента и гиролизуется быстрее чем правильное Для правильного аминоациладенилата скорость переноса на тРНК выше чем диссоциация те коррекция определяется соотношением кинетических констант определенных стадий

Джон Джозеф ХопфилдДжон Джозеф Хопфилд1933 Чикаго США1933 Чикаго США

биофизик и биофизик и молекулярный биологмолекулярный биолог

Механизм кинетического корректированияМеханизм кинетического корректирования

Механизм коррекции за счет гидролиза Механизм коррекции за счет гидролиза промежуточного аминоациладенилатапромежуточного аминоациладенилата

Экспериментальное доказательствоЭкспериментальное доказательствоДля валил-тРНК-синтетазы из желтого люпина в отсутствие тРНК наблюдался гидролиз

АТР АМР + ppi зависящий от присутствия несубстратных аминокислот (Cys Thr Ser и α-аминомасляной кислоты)

Константа скорости гидролиза для этих кислот 07-13 мин-1 Специфический валиладенилат-ферментный комплекс гидролизуется с константой скорости 0018 мин-1 те например в 720 раз медленнее чем комплекс валил-тРНК-синтетазы с цистеинил-аденилатом

Коррекция ошибок в реакциях Коррекция ошибок в реакциях катализируемыхкатализируемых

ДНК-полимеразамиДНК-полимеразами

Механизм коррекции при репликации ДНКМеханизм коррекции при репликации ДНК

При синтезе ДНК ошибка исправляется после полимеризации Молекула ДНК синтезируется в направлении 5rsquo-3rsquo нуклеотиды присоединяются к 3rsquo-гидроксильной группе растущей цепи ДНК

Репликативные ДНК-полимеразы обладают Репликативные ДНК-полимеразы обладают корректирующей 3rsquo-5rsquo-экзонуклеазной активностью корректирующей 3rsquo-5rsquo-экзонуклеазной активностью

выщепляющей из цепи ошибочно встроенный нуклеотидвыщепляющей из цепи ошибочно встроенный нуклеотид

Частота мутации фага Т4 коррелирует с экзонуклеазной активностью проявляемой ДНК-полимеразой Частота мутации для ЕСoli составляет 10-6-10-8 и следовательно точность репликации ДНК либо равна этим величинам либо еще выше

Механизм коррекции при репликации ДНКМеханизм коррекции при репликации ДНК

С помощью экзонуклеазной активности исправляются ошибки которые накапливаются в процессе биосинтеза Однако нарушения структуры ДНК могут возникать не только по причине неточной работы в ходе синтеза но и в результате внешних воздействий таких как ионизирующее и ультрафиолетовое облучение окислительный стресс

Возможна различная пострепликационная коррекция структуры ДНКВозможна различная пострепликационная коррекция структуры ДНК(репарация)(репарация)

Система репарации ошибочно-встроенных нуклеотидов (Система репарации ошибочно-встроенных нуклеотидов (mismatch mismatch repairrepair) специально предназначена для удаления ошибок возникших в ) специально предназначена для удаления ошибок возникших в ДНК в ходе репликацииДНК в ходе репликации

Система эксцизионной репарации оснований исправляет повреждения в Система эксцизионной репарации оснований исправляет повреждения в ДНК возникающие в результате окислительного стресса то есть ДНК возникающие в результате окислительного стресса то есть модифицированные (окисленные) основания и разрывы в одной из цепей модифицированные (окисленные) основания и разрывы в одной из цепей ДНКДНК

Система эксцизионной репарации нуклеотидов удаляет из ДНК объемные Система эксцизионной репарации нуклеотидов удаляет из ДНК объемные повреждения фотодимеры возникающие под действием повреждения фотодимеры возникающие под действием ультрафиолетового облучения объемные аддукты метаболитов ультрафиолетового облучения объемные аддукты метаболитов попадающих из окружающей среды таких как продукты сгорания курения попадающих из окружающей среды таких как продукты сгорания курения например антрацены и бензапиренынапример антрацены и бензапирены

Синтез ДНК через повреждениеСинтез ДНК через повреждение((Translesion synthesisTranslesion synthesis ndash TLS)ndash TLS)

В случае синтеза с использованием поврежденной ДНК-матрицы транслезионными (translesion) ДНК-полимеразами (например η ι κ θ μ ζ) также возникают искажения в структуре ДНК

TLS ДНК-полимеразы ведущие синтез через повреждение матрицы не обладают корректирующей активностью поскольку их задачей является ввести во чтобы то ни стало нуклеотидное звено дабы избежать остановки репликативной вилки на повреждении матрицы Затем поврежденный участок ДНК восстанавливается системами репарации

Мутации вводимые репликативными Мутации вводимые репликативными ДНК-полимеразами в ходе репликативного синтеза ДНК-полимеразами в ходе репликативного синтеза

играют не только вредную рольиграют не только вредную роль Мутации в ДНК являются движущей Мутации в ДНК являются движущей

силой эволюциисилой эволюции

• Slide 1
• Slide 2
• Slide 3
• Slide 4
• Slide 5
• Slide 6
• Slide 7
• Slide 8
• Slide 9
• Slide 10
• Slide 11
• Slide 12
• Slide 13
• Slide 14
• Slide 15
• Slide 16
• Slide 17
• Slide 18
• Slide 19
• Slide 20
• Slide 21
• Slide 22
• Slide 23
• Slide 24
• Slide 25
• Slide 26
• Slide 27
• Slide 28
• Slide 29
• Slide 30
• Slide 31
• Slide 32
• Slide 33
• Slide 34
• Slide 35
• Slide 36
• Slide 37
• Slide 38
• Slide 39
• Slide 40
• Slide 41

Чему соответствует этот уровень ошибокЧему соответствует этот уровень ошибок

Ошибочное включение одной аминокислоты на Ошибочное включение одной аминокислоты на каждые 10000 остатковкаждые 10000 остатков

Одна из 20 белковых молекул длиной в 500 остатков Одна из 20 белковых молекул длиной в 500 остатков будет содержать единственную ошибочную будет содержать единственную ошибочную

аминокислотуаминокислоту

Предположив что только около 10 всех ошибок Предположив что только около 10 всех ошибок серьезно сказываются на биологической функции серьезно сказываются на биологической функции

белка можно сделать заключение что одна белка можно сделать заключение что одна молекула белка из 200 синтезированных окажется молекула белка из 200 синтезированных окажется

бесполезной (или даже вредной) в клеточном бесполезной (или даже вредной) в клеточном метаболизмеметаболизме

Коррекция ошибок в реакциях катализируемых

аминоацил-тРНК- синтетазами

Существование механизмов Существование механизмов коррекции для аминоацил-коррекции для аминоацил-

тРНК-синтетазтРНК-синтетаз

Поль Наим БергПоль Наим Берг19219266 Бруклин СШАБруклин США

Американский биохимикАмериканский биохимикНобелевская премия

по химии 1980 г

Изолейцил-тРНК-синтетаза ошибочно активирует валин Добавление тРНК к комплексу с изолейциладенилатом приводит к образованию изолейцил-тРНК а у валиладенилат-ферментного комплекса не наблюдается образование валил-тРНК поскольку при добавлении тРНК происходит гидролиз ошибочного аминоациладенилата

Существование механизмов коррекции для Существование механизмов коррекции для аминоацил-тРНК-синтетазаминоацил-тРНК-синтетаз

В присутствии тРНКВ присутствии тРНКIleIle изолейцил-тРНК-синтетаза изолейцил-тРНК-синтетаза непроизводительно гидролизует АТР АМР + непроизводительно гидролизует АТР АМР + ppppii

ИзбыточныйИзбыточный гидролиз АТРгидролиз АТР по отношению к по отношению к синтезированному продукту за счет АТР-синтезированному продукту за счет АТР-пирофосфогидролазной активности синтетазы пирофосфогидролазной активности синтетазы является является критерием существования корректирующего механизмакритерием существования корректирующего механизма включающего дополнительную стадию разрушения ошибочного включающего дополнительную стадию разрушения ошибочного продукта реакции продукта реакции

У цистеинил- и тирозил-тРНК-синтетаз специфичность высокая У цистеинил- и тирозил-тРНК-синтетаз специфичность высокая и гидролиза АТР не наблюдается и гидролиза АТР не наблюдается

В некоторых случаях когда дискриминация аминокислот на В некоторых случаях когда дискриминация аминокислот на стадии активации была недостаточной наблюдался быстрый стадии активации была недостаточной наблюдался быстрый гидролиз ошибочного аминоациладенилата вместо переноса гидролиз ошибочного аминоациладенилата вместо переноса laquoнеправильнойraquo аминокислоты на субстратную тРНКlaquoнеправильнойraquo аминокислоты на субстратную тРНК

Роль тРНК в коррекцииРоль тРНК в коррекции

Индуцирует ли тРНК гидролиз аминоациладенилата или же служит акцептором ошибочно активированной аминокислоты а затем подвергается ферментативному деацилированию

Возможные последовательности реакций катализируемых синтетазами можно записать в виде следующей схемы (АК-аминокислота)

Роль тРНК в коррекцииРоль тРНК в коррекции

Предложенные механизмы коррекции можно разделить на две группы в зависимости от того какое соединение в них гидролизуется Механизм отбраковки ошибочной аминокислоты (Механизм отбраковки ошибочной аминокислоты (стадии 1

2 5 ndash гидролиз аминоацил-тРНК) Механизм коррекции за счет гидролиза промежуточного Механизм коррекции за счет гидролиза промежуточного

аминоациладенилата (аминоациладенилата (стадии 1 и 4 ndash гидролиз аминоациладенилата)

В каждом из возможных маршрутов коррекции исправление ошибки достигается благодаря введению в реакционный путь laquoнеобратимогоraquo ответвления (реакции 4 или 5) обеспечивающего гидролиз нежелательных соединений

Механизм отбраковки ошибочной аминокислотыМеханизм отбраковки ошибочной аминокислоты

Доказательство существования механизма гидролиза аминоацил-тРНК аминоацил-тРНК-синтетазами было получено при изучении аминоацилирования тРНКVal треонином катализируемого валил-тРНК-синтетазой из BStearothermophilus

Валил-тРНК-синтетаза образует с треонином стабильный комплекс Валил-тРНК-синтетаза образует с треонином стабильный комплекс который быстро гидролизуется при добавлении тРНКкоторый быстро гидролизуется при добавлении тРНКValVal

Предшествует ли гидролизу перенос аминоацильного остатка на тРНКПредшествует ли гидролизу перенос аминоацильного остатка на тРНКValVal

Импульсный метод laquoзамороженнойraquo струиКомплекс [14С]-треонил-АМРЕVal + тРНК [14С]-треонил-тРНК

Константа гидролиза треонил-тРНК в присутствии валил-тРНК-синтетазы 40 сКонстанта гидролиза треонил-тРНК в присутствии валил-тРНК-синтетазы 40 с -1-1а для специфичной валил-тРНК 0015 са для специфичной валил-тРНК 0015 с-1-1 то есть более чем в 2000 раз ниже то есть более чем в 2000 раз ниже

Механизм коррекции за счет гидролиза Механизм коррекции за счет гидролиза промежуточного аминоациладенилатапромежуточного аминоациладенилата

Ошибочное промежуточное соединение образующееся в ходе реакции диссоциирует с фермента и гиролизуется быстрее чем правильное Для правильного аминоациладенилата скорость переноса на тРНК выше чем диссоциация те коррекция определяется соотношением кинетических констант определенных стадий

Джон Джозеф ХопфилдДжон Джозеф Хопфилд1933 Чикаго США1933 Чикаго США

биофизик и биофизик и молекулярный биологмолекулярный биолог

Механизм кинетического корректированияМеханизм кинетического корректирования

Механизм коррекции за счет гидролиза Механизм коррекции за счет гидролиза промежуточного аминоациладенилатапромежуточного аминоациладенилата

Экспериментальное доказательствоЭкспериментальное доказательствоДля валил-тРНК-синтетазы из желтого люпина в отсутствие тРНК наблюдался гидролиз

АТР АМР + ppi зависящий от присутствия несубстратных аминокислот (Cys Thr Ser и α-аминомасляной кислоты)

Константа скорости гидролиза для этих кислот 07-13 мин-1 Специфический валиладенилат-ферментный комплекс гидролизуется с константой скорости 0018 мин-1 те например в 720 раз медленнее чем комплекс валил-тРНК-синтетазы с цистеинил-аденилатом

Коррекция ошибок в реакциях Коррекция ошибок в реакциях катализируемыхкатализируемых

ДНК-полимеразамиДНК-полимеразами

Механизм коррекции при репликации ДНКМеханизм коррекции при репликации ДНК

При синтезе ДНК ошибка исправляется после полимеризации Молекула ДНК синтезируется в направлении 5rsquo-3rsquo нуклеотиды присоединяются к 3rsquo-гидроксильной группе растущей цепи ДНК

Репликативные ДНК-полимеразы обладают Репликативные ДНК-полимеразы обладают корректирующей 3rsquo-5rsquo-экзонуклеазной активностью корректирующей 3rsquo-5rsquo-экзонуклеазной активностью

выщепляющей из цепи ошибочно встроенный нуклеотидвыщепляющей из цепи ошибочно встроенный нуклеотид

Частота мутации фага Т4 коррелирует с экзонуклеазной активностью проявляемой ДНК-полимеразой Частота мутации для ЕСoli составляет 10-6-10-8 и следовательно точность репликации ДНК либо равна этим величинам либо еще выше

Механизм коррекции при репликации ДНКМеханизм коррекции при репликации ДНК

С помощью экзонуклеазной активности исправляются ошибки которые накапливаются в процессе биосинтеза Однако нарушения структуры ДНК могут возникать не только по причине неточной работы в ходе синтеза но и в результате внешних воздействий таких как ионизирующее и ультрафиолетовое облучение окислительный стресс

Возможна различная пострепликационная коррекция структуры ДНКВозможна различная пострепликационная коррекция структуры ДНК(репарация)(репарация)

Система репарации ошибочно-встроенных нуклеотидов (Система репарации ошибочно-встроенных нуклеотидов (mismatch mismatch repairrepair) специально предназначена для удаления ошибок возникших в ) специально предназначена для удаления ошибок возникших в ДНК в ходе репликацииДНК в ходе репликации

Система эксцизионной репарации оснований исправляет повреждения в Система эксцизионной репарации оснований исправляет повреждения в ДНК возникающие в результате окислительного стресса то есть ДНК возникающие в результате окислительного стресса то есть модифицированные (окисленные) основания и разрывы в одной из цепей модифицированные (окисленные) основания и разрывы в одной из цепей ДНКДНК

Система эксцизионной репарации нуклеотидов удаляет из ДНК объемные Система эксцизионной репарации нуклеотидов удаляет из ДНК объемные повреждения фотодимеры возникающие под действием повреждения фотодимеры возникающие под действием ультрафиолетового облучения объемные аддукты метаболитов ультрафиолетового облучения объемные аддукты метаболитов попадающих из окружающей среды таких как продукты сгорания курения попадающих из окружающей среды таких как продукты сгорания курения например антрацены и бензапиренынапример антрацены и бензапирены

Синтез ДНК через повреждениеСинтез ДНК через повреждение((Translesion synthesisTranslesion synthesis ndash TLS)ndash TLS)

В случае синтеза с использованием поврежденной ДНК-матрицы транслезионными (translesion) ДНК-полимеразами (например η ι κ θ μ ζ) также возникают искажения в структуре ДНК

TLS ДНК-полимеразы ведущие синтез через повреждение матрицы не обладают корректирующей активностью поскольку их задачей является ввести во чтобы то ни стало нуклеотидное звено дабы избежать остановки репликативной вилки на повреждении матрицы Затем поврежденный участок ДНК восстанавливается системами репарации

Мутации вводимые репликативными Мутации вводимые репликативными ДНК-полимеразами в ходе репликативного синтеза ДНК-полимеразами в ходе репликативного синтеза

играют не только вредную рольиграют не только вредную роль Мутации в ДНК являются движущей Мутации в ДНК являются движущей

силой эволюциисилой эволюции

• Slide 1
• Slide 2
• Slide 3
• Slide 4
• Slide 5
• Slide 6
• Slide 7
• Slide 8
• Slide 9
• Slide 10
• Slide 11
• Slide 12
• Slide 13
• Slide 14
• Slide 15
• Slide 16
• Slide 17
• Slide 18
• Slide 19
• Slide 20
• Slide 21
• Slide 22
• Slide 23
• Slide 24
• Slide 25
• Slide 26
• Slide 27
• Slide 28
• Slide 29
• Slide 30
• Slide 31
• Slide 32
• Slide 33
• Slide 34
• Slide 35
• Slide 36
• Slide 37
• Slide 38
• Slide 39
• Slide 40
• Slide 41

Коррекция ошибок в реакциях катализируемых

аминоацил-тРНК- синтетазами

Существование механизмов Существование механизмов коррекции для аминоацил-коррекции для аминоацил-

тРНК-синтетазтРНК-синтетаз

Поль Наим БергПоль Наим Берг19219266 Бруклин СШАБруклин США

Американский биохимикАмериканский биохимикНобелевская премия

по химии 1980 г

Изолейцил-тРНК-синтетаза ошибочно активирует валин Добавление тРНК к комплексу с изолейциладенилатом приводит к образованию изолейцил-тРНК а у валиладенилат-ферментного комплекса не наблюдается образование валил-тРНК поскольку при добавлении тРНК происходит гидролиз ошибочного аминоациладенилата

Существование механизмов коррекции для Существование механизмов коррекции для аминоацил-тРНК-синтетазаминоацил-тРНК-синтетаз

В присутствии тРНКВ присутствии тРНКIleIle изолейцил-тРНК-синтетаза изолейцил-тРНК-синтетаза непроизводительно гидролизует АТР АМР + непроизводительно гидролизует АТР АМР + ppppii

ИзбыточныйИзбыточный гидролиз АТРгидролиз АТР по отношению к по отношению к синтезированному продукту за счет АТР-синтезированному продукту за счет АТР-пирофосфогидролазной активности синтетазы пирофосфогидролазной активности синтетазы является является критерием существования корректирующего механизмакритерием существования корректирующего механизма включающего дополнительную стадию разрушения ошибочного включающего дополнительную стадию разрушения ошибочного продукта реакции продукта реакции

У цистеинил- и тирозил-тРНК-синтетаз специфичность высокая У цистеинил- и тирозил-тРНК-синтетаз специфичность высокая и гидролиза АТР не наблюдается и гидролиза АТР не наблюдается

В некоторых случаях когда дискриминация аминокислот на В некоторых случаях когда дискриминация аминокислот на стадии активации была недостаточной наблюдался быстрый стадии активации была недостаточной наблюдался быстрый гидролиз ошибочного аминоациладенилата вместо переноса гидролиз ошибочного аминоациладенилата вместо переноса laquoнеправильнойraquo аминокислоты на субстратную тРНКlaquoнеправильнойraquo аминокислоты на субстратную тРНК

Роль тРНК в коррекцииРоль тРНК в коррекции

Индуцирует ли тРНК гидролиз аминоациладенилата или же служит акцептором ошибочно активированной аминокислоты а затем подвергается ферментативному деацилированию

Возможные последовательности реакций катализируемых синтетазами можно записать в виде следующей схемы (АК-аминокислота)

Роль тРНК в коррекцииРоль тРНК в коррекции

Предложенные механизмы коррекции можно разделить на две группы в зависимости от того какое соединение в них гидролизуется Механизм отбраковки ошибочной аминокислоты (Механизм отбраковки ошибочной аминокислоты (стадии 1

2 5 ndash гидролиз аминоацил-тРНК) Механизм коррекции за счет гидролиза промежуточного Механизм коррекции за счет гидролиза промежуточного

аминоациладенилата (аминоациладенилата (стадии 1 и 4 ndash гидролиз аминоациладенилата)

В каждом из возможных маршрутов коррекции исправление ошибки достигается благодаря введению в реакционный путь laquoнеобратимогоraquo ответвления (реакции 4 или 5) обеспечивающего гидролиз нежелательных соединений

Механизм отбраковки ошибочной аминокислотыМеханизм отбраковки ошибочной аминокислоты

Доказательство существования механизма гидролиза аминоацил-тРНК аминоацил-тРНК-синтетазами было получено при изучении аминоацилирования тРНКVal треонином катализируемого валил-тРНК-синтетазой из BStearothermophilus

Валил-тРНК-синтетаза образует с треонином стабильный комплекс Валил-тРНК-синтетаза образует с треонином стабильный комплекс который быстро гидролизуется при добавлении тРНКкоторый быстро гидролизуется при добавлении тРНКValVal

Предшествует ли гидролизу перенос аминоацильного остатка на тРНКПредшествует ли гидролизу перенос аминоацильного остатка на тРНКValVal

Импульсный метод laquoзамороженнойraquo струиКомплекс [14С]-треонил-АМРЕVal + тРНК [14С]-треонил-тРНК

Константа гидролиза треонил-тРНК в присутствии валил-тРНК-синтетазы 40 сКонстанта гидролиза треонил-тРНК в присутствии валил-тРНК-синтетазы 40 с -1-1а для специфичной валил-тРНК 0015 са для специфичной валил-тРНК 0015 с-1-1 то есть более чем в 2000 раз ниже то есть более чем в 2000 раз ниже

Механизм коррекции за счет гидролиза Механизм коррекции за счет гидролиза промежуточного аминоациладенилатапромежуточного аминоациладенилата

Ошибочное промежуточное соединение образующееся в ходе реакции диссоциирует с фермента и гиролизуется быстрее чем правильное Для правильного аминоациладенилата скорость переноса на тРНК выше чем диссоциация те коррекция определяется соотношением кинетических констант определенных стадий

Джон Джозеф ХопфилдДжон Джозеф Хопфилд1933 Чикаго США1933 Чикаго США

биофизик и биофизик и молекулярный биологмолекулярный биолог

Механизм кинетического корректированияМеханизм кинетического корректирования

Механизм коррекции за счет гидролиза Механизм коррекции за счет гидролиза промежуточного аминоациладенилатапромежуточного аминоациладенилата

Экспериментальное доказательствоЭкспериментальное доказательствоДля валил-тРНК-синтетазы из желтого люпина в отсутствие тРНК наблюдался гидролиз

АТР АМР + ppi зависящий от присутствия несубстратных аминокислот (Cys Thr Ser и α-аминомасляной кислоты)

Константа скорости гидролиза для этих кислот 07-13 мин-1 Специфический валиладенилат-ферментный комплекс гидролизуется с константой скорости 0018 мин-1 те например в 720 раз медленнее чем комплекс валил-тРНК-синтетазы с цистеинил-аденилатом

Коррекция ошибок в реакциях Коррекция ошибок в реакциях катализируемыхкатализируемых

ДНК-полимеразамиДНК-полимеразами

Механизм коррекции при репликации ДНКМеханизм коррекции при репликации ДНК

При синтезе ДНК ошибка исправляется после полимеризации Молекула ДНК синтезируется в направлении 5rsquo-3rsquo нуклеотиды присоединяются к 3rsquo-гидроксильной группе растущей цепи ДНК

Репликативные ДНК-полимеразы обладают Репликативные ДНК-полимеразы обладают корректирующей 3rsquo-5rsquo-экзонуклеазной активностью корректирующей 3rsquo-5rsquo-экзонуклеазной активностью

выщепляющей из цепи ошибочно встроенный нуклеотидвыщепляющей из цепи ошибочно встроенный нуклеотид

Частота мутации фага Т4 коррелирует с экзонуклеазной активностью проявляемой ДНК-полимеразой Частота мутации для ЕСoli составляет 10-6-10-8 и следовательно точность репликации ДНК либо равна этим величинам либо еще выше

Механизм коррекции при репликации ДНКМеханизм коррекции при репликации ДНК

С помощью экзонуклеазной активности исправляются ошибки которые накапливаются в процессе биосинтеза Однако нарушения структуры ДНК могут возникать не только по причине неточной работы в ходе синтеза но и в результате внешних воздействий таких как ионизирующее и ультрафиолетовое облучение окислительный стресс

Возможна различная пострепликационная коррекция структуры ДНКВозможна различная пострепликационная коррекция структуры ДНК(репарация)(репарация)

Система репарации ошибочно-встроенных нуклеотидов (Система репарации ошибочно-встроенных нуклеотидов (mismatch mismatch repairrepair) специально предназначена для удаления ошибок возникших в ) специально предназначена для удаления ошибок возникших в ДНК в ходе репликацииДНК в ходе репликации

Система эксцизионной репарации оснований исправляет повреждения в Система эксцизионной репарации оснований исправляет повреждения в ДНК возникающие в результате окислительного стресса то есть ДНК возникающие в результате окислительного стресса то есть модифицированные (окисленные) основания и разрывы в одной из цепей модифицированные (окисленные) основания и разрывы в одной из цепей ДНКДНК

Система эксцизионной репарации нуклеотидов удаляет из ДНК объемные Система эксцизионной репарации нуклеотидов удаляет из ДНК объемные повреждения фотодимеры возникающие под действием повреждения фотодимеры возникающие под действием ультрафиолетового облучения объемные аддукты метаболитов ультрафиолетового облучения объемные аддукты метаболитов попадающих из окружающей среды таких как продукты сгорания курения попадающих из окружающей среды таких как продукты сгорания курения например антрацены и бензапиренынапример антрацены и бензапирены

Синтез ДНК через повреждениеСинтез ДНК через повреждение((Translesion synthesisTranslesion synthesis ndash TLS)ndash TLS)

В случае синтеза с использованием поврежденной ДНК-матрицы транслезионными (translesion) ДНК-полимеразами (например η ι κ θ μ ζ) также возникают искажения в структуре ДНК

TLS ДНК-полимеразы ведущие синтез через повреждение матрицы не обладают корректирующей активностью поскольку их задачей является ввести во чтобы то ни стало нуклеотидное звено дабы избежать остановки репликативной вилки на повреждении матрицы Затем поврежденный участок ДНК восстанавливается системами репарации

Мутации вводимые репликативными Мутации вводимые репликативными ДНК-полимеразами в ходе репликативного синтеза ДНК-полимеразами в ходе репликативного синтеза

играют не только вредную рольиграют не только вредную роль Мутации в ДНК являются движущей Мутации в ДНК являются движущей

силой эволюциисилой эволюции

• Slide 1
• Slide 2
• Slide 3
• Slide 4
• Slide 5
• Slide 6
• Slide 7
• Slide 8
• Slide 9
• Slide 10
• Slide 11
• Slide 12
• Slide 13
• Slide 14
• Slide 15
• Slide 16
• Slide 17
• Slide 18
• Slide 19
• Slide 20
• Slide 21
• Slide 22
• Slide 23
• Slide 24
• Slide 25
• Slide 26
• Slide 27
• Slide 28
• Slide 29
• Slide 30
• Slide 31
• Slide 32
• Slide 33
• Slide 34
• Slide 35
• Slide 36
• Slide 37
• Slide 38
• Slide 39
• Slide 40
• Slide 41

Существование механизмов Существование механизмов коррекции для аминоацил-коррекции для аминоацил-

тРНК-синтетазтРНК-синтетаз

Поль Наим БергПоль Наим Берг19219266 Бруклин СШАБруклин США

Американский биохимикАмериканский биохимикНобелевская премия

по химии 1980 г

Изолейцил-тРНК-синтетаза ошибочно активирует валин Добавление тРНК к комплексу с изолейциладенилатом приводит к образованию изолейцил-тРНК а у валиладенилат-ферментного комплекса не наблюдается образование валил-тРНК поскольку при добавлении тРНК происходит гидролиз ошибочного аминоациладенилата

Существование механизмов коррекции для Существование механизмов коррекции для аминоацил-тРНК-синтетазаминоацил-тРНК-синтетаз

В присутствии тРНКВ присутствии тРНКIleIle изолейцил-тРНК-синтетаза изолейцил-тРНК-синтетаза непроизводительно гидролизует АТР АМР + непроизводительно гидролизует АТР АМР + ppppii

ИзбыточныйИзбыточный гидролиз АТРгидролиз АТР по отношению к по отношению к синтезированному продукту за счет АТР-синтезированному продукту за счет АТР-пирофосфогидролазной активности синтетазы пирофосфогидролазной активности синтетазы является является критерием существования корректирующего механизмакритерием существования корректирующего механизма включающего дополнительную стадию разрушения ошибочного включающего дополнительную стадию разрушения ошибочного продукта реакции продукта реакции

У цистеинил- и тирозил-тРНК-синтетаз специфичность высокая У цистеинил- и тирозил-тРНК-синтетаз специфичность высокая и гидролиза АТР не наблюдается и гидролиза АТР не наблюдается

В некоторых случаях когда дискриминация аминокислот на В некоторых случаях когда дискриминация аминокислот на стадии активации была недостаточной наблюдался быстрый стадии активации была недостаточной наблюдался быстрый гидролиз ошибочного аминоациладенилата вместо переноса гидролиз ошибочного аминоациладенилата вместо переноса laquoнеправильнойraquo аминокислоты на субстратную тРНКlaquoнеправильнойraquo аминокислоты на субстратную тРНК

Роль тРНК в коррекцииРоль тРНК в коррекции

Индуцирует ли тРНК гидролиз аминоациладенилата или же служит акцептором ошибочно активированной аминокислоты а затем подвергается ферментативному деацилированию

Возможные последовательности реакций катализируемых синтетазами можно записать в виде следующей схемы (АК-аминокислота)

Роль тРНК в коррекцииРоль тРНК в коррекции

Предложенные механизмы коррекции можно разделить на две группы в зависимости от того какое соединение в них гидролизуется Механизм отбраковки ошибочной аминокислоты (Механизм отбраковки ошибочной аминокислоты (стадии 1

2 5 ndash гидролиз аминоацил-тРНК) Механизм коррекции за счет гидролиза промежуточного Механизм коррекции за счет гидролиза промежуточного

аминоациладенилата (аминоациладенилата (стадии 1 и 4 ndash гидролиз аминоациладенилата)

В каждом из возможных маршрутов коррекции исправление ошибки достигается благодаря введению в реакционный путь laquoнеобратимогоraquo ответвления (реакции 4 или 5) обеспечивающего гидролиз нежелательных соединений

Механизм отбраковки ошибочной аминокислотыМеханизм отбраковки ошибочной аминокислоты

Доказательство существования механизма гидролиза аминоацил-тРНК аминоацил-тРНК-синтетазами было получено при изучении аминоацилирования тРНКVal треонином катализируемого валил-тРНК-синтетазой из BStearothermophilus

Валил-тРНК-синтетаза образует с треонином стабильный комплекс Валил-тРНК-синтетаза образует с треонином стабильный комплекс который быстро гидролизуется при добавлении тРНКкоторый быстро гидролизуется при добавлении тРНКValVal

Предшествует ли гидролизу перенос аминоацильного остатка на тРНКПредшествует ли гидролизу перенос аминоацильного остатка на тРНКValVal

Импульсный метод laquoзамороженнойraquo струиКомплекс [14С]-треонил-АМРЕVal + тРНК [14С]-треонил-тРНК

Константа гидролиза треонил-тРНК в присутствии валил-тРНК-синтетазы 40 сКонстанта гидролиза треонил-тРНК в присутствии валил-тРНК-синтетазы 40 с -1-1а для специфичной валил-тРНК 0015 са для специфичной валил-тРНК 0015 с-1-1 то есть более чем в 2000 раз ниже то есть более чем в 2000 раз ниже

Механизм коррекции за счет гидролиза Механизм коррекции за счет гидролиза промежуточного аминоациладенилатапромежуточного аминоациладенилата

Ошибочное промежуточное соединение образующееся в ходе реакции диссоциирует с фермента и гиролизуется быстрее чем правильное Для правильного аминоациладенилата скорость переноса на тРНК выше чем диссоциация те коррекция определяется соотношением кинетических констант определенных стадий

Джон Джозеф ХопфилдДжон Джозеф Хопфилд1933 Чикаго США1933 Чикаго США

биофизик и биофизик и молекулярный биологмолекулярный биолог

Механизм кинетического корректированияМеханизм кинетического корректирования

Механизм коррекции за счет гидролиза Механизм коррекции за счет гидролиза промежуточного аминоациладенилатапромежуточного аминоациладенилата

Экспериментальное доказательствоЭкспериментальное доказательствоДля валил-тРНК-синтетазы из желтого люпина в отсутствие тРНК наблюдался гидролиз

АТР АМР + ppi зависящий от присутствия несубстратных аминокислот (Cys Thr Ser и α-аминомасляной кислоты)

Константа скорости гидролиза для этих кислот 07-13 мин-1 Специфический валиладенилат-ферментный комплекс гидролизуется с константой скорости 0018 мин-1 те например в 720 раз медленнее чем комплекс валил-тРНК-синтетазы с цистеинил-аденилатом

Коррекция ошибок в реакциях Коррекция ошибок в реакциях катализируемыхкатализируемых

ДНК-полимеразамиДНК-полимеразами

Механизм коррекции при репликации ДНКМеханизм коррекции при репликации ДНК

При синтезе ДНК ошибка исправляется после полимеризации Молекула ДНК синтезируется в направлении 5rsquo-3rsquo нуклеотиды присоединяются к 3rsquo-гидроксильной группе растущей цепи ДНК

Репликативные ДНК-полимеразы обладают Репликативные ДНК-полимеразы обладают корректирующей 3rsquo-5rsquo-экзонуклеазной активностью корректирующей 3rsquo-5rsquo-экзонуклеазной активностью

выщепляющей из цепи ошибочно встроенный нуклеотидвыщепляющей из цепи ошибочно встроенный нуклеотид

Частота мутации фага Т4 коррелирует с экзонуклеазной активностью проявляемой ДНК-полимеразой Частота мутации для ЕСoli составляет 10-6-10-8 и следовательно точность репликации ДНК либо равна этим величинам либо еще выше

Механизм коррекции при репликации ДНКМеханизм коррекции при репликации ДНК

С помощью экзонуклеазной активности исправляются ошибки которые накапливаются в процессе биосинтеза Однако нарушения структуры ДНК могут возникать не только по причине неточной работы в ходе синтеза но и в результате внешних воздействий таких как ионизирующее и ультрафиолетовое облучение окислительный стресс

Возможна различная пострепликационная коррекция структуры ДНКВозможна различная пострепликационная коррекция структуры ДНК(репарация)(репарация)

Система репарации ошибочно-встроенных нуклеотидов (Система репарации ошибочно-встроенных нуклеотидов (mismatch mismatch repairrepair) специально предназначена для удаления ошибок возникших в ) специально предназначена для удаления ошибок возникших в ДНК в ходе репликацииДНК в ходе репликации

Система эксцизионной репарации оснований исправляет повреждения в Система эксцизионной репарации оснований исправляет повреждения в ДНК возникающие в результате окислительного стресса то есть ДНК возникающие в результате окислительного стресса то есть модифицированные (окисленные) основания и разрывы в одной из цепей модифицированные (окисленные) основания и разрывы в одной из цепей ДНКДНК

Система эксцизионной репарации нуклеотидов удаляет из ДНК объемные Система эксцизионной репарации нуклеотидов удаляет из ДНК объемные повреждения фотодимеры возникающие под действием повреждения фотодимеры возникающие под действием ультрафиолетового облучения объемные аддукты метаболитов ультрафиолетового облучения объемные аддукты метаболитов попадающих из окружающей среды таких как продукты сгорания курения попадающих из окружающей среды таких как продукты сгорания курения например антрацены и бензапиренынапример антрацены и бензапирены

Синтез ДНК через повреждениеСинтез ДНК через повреждение((Translesion synthesisTranslesion synthesis ndash TLS)ndash TLS)

В случае синтеза с использованием поврежденной ДНК-матрицы транслезионными (translesion) ДНК-полимеразами (например η ι κ θ μ ζ) также возникают искажения в структуре ДНК

TLS ДНК-полимеразы ведущие синтез через повреждение матрицы не обладают корректирующей активностью поскольку их задачей является ввести во чтобы то ни стало нуклеотидное звено дабы избежать остановки репликативной вилки на повреждении матрицы Затем поврежденный участок ДНК восстанавливается системами репарации

Мутации вводимые репликативными Мутации вводимые репликативными ДНК-полимеразами в ходе репликативного синтеза ДНК-полимеразами в ходе репликативного синтеза

играют не только вредную рольиграют не только вредную роль Мутации в ДНК являются движущей Мутации в ДНК являются движущей

силой эволюциисилой эволюции

• Slide 1
• Slide 2
• Slide 3
• Slide 4
• Slide 5
• Slide 6
• Slide 7
• Slide 8
• Slide 9
• Slide 10
• Slide 11
• Slide 12
• Slide 13
• Slide 14
• Slide 15
• Slide 16
• Slide 17
• Slide 18
• Slide 19
• Slide 20
• Slide 21
• Slide 22
• Slide 23
• Slide 24
• Slide 25
• Slide 26
• Slide 27
• Slide 28
• Slide 29
• Slide 30
• Slide 31
• Slide 32
• Slide 33
• Slide 34
• Slide 35
• Slide 36
• Slide 37
• Slide 38
• Slide 39
• Slide 40
• Slide 41

Существование механизмов коррекции для Существование механизмов коррекции для аминоацил-тРНК-синтетазаминоацил-тРНК-синтетаз

В присутствии тРНКВ присутствии тРНКIleIle изолейцил-тРНК-синтетаза изолейцил-тРНК-синтетаза непроизводительно гидролизует АТР АМР + непроизводительно гидролизует АТР АМР + ppppii

ИзбыточныйИзбыточный гидролиз АТРгидролиз АТР по отношению к по отношению к синтезированному продукту за счет АТР-синтезированному продукту за счет АТР-пирофосфогидролазной активности синтетазы пирофосфогидролазной активности синтетазы является является критерием существования корректирующего механизмакритерием существования корректирующего механизма включающего дополнительную стадию разрушения ошибочного включающего дополнительную стадию разрушения ошибочного продукта реакции продукта реакции

У цистеинил- и тирозил-тРНК-синтетаз специфичность высокая У цистеинил- и тирозил-тРНК-синтетаз специфичность высокая и гидролиза АТР не наблюдается и гидролиза АТР не наблюдается

В некоторых случаях когда дискриминация аминокислот на В некоторых случаях когда дискриминация аминокислот на стадии активации была недостаточной наблюдался быстрый стадии активации была недостаточной наблюдался быстрый гидролиз ошибочного аминоациладенилата вместо переноса гидролиз ошибочного аминоациладенилата вместо переноса laquoнеправильнойraquo аминокислоты на субстратную тРНКlaquoнеправильнойraquo аминокислоты на субстратную тРНК

Роль тРНК в коррекцииРоль тРНК в коррекции

Индуцирует ли тРНК гидролиз аминоациладенилата или же служит акцептором ошибочно активированной аминокислоты а затем подвергается ферментативному деацилированию

Возможные последовательности реакций катализируемых синтетазами можно записать в виде следующей схемы (АК-аминокислота)

Роль тРНК в коррекцииРоль тРНК в коррекции

Предложенные механизмы коррекции можно разделить на две группы в зависимости от того какое соединение в них гидролизуется Механизм отбраковки ошибочной аминокислоты (Механизм отбраковки ошибочной аминокислоты (стадии 1

2 5 ndash гидролиз аминоацил-тРНК) Механизм коррекции за счет гидролиза промежуточного Механизм коррекции за счет гидролиза промежуточного

аминоациладенилата (аминоациладенилата (стадии 1 и 4 ndash гидролиз аминоациладенилата)

В каждом из возможных маршрутов коррекции исправление ошибки достигается благодаря введению в реакционный путь laquoнеобратимогоraquo ответвления (реакции 4 или 5) обеспечивающего гидролиз нежелательных соединений

Механизм отбраковки ошибочной аминокислотыМеханизм отбраковки ошибочной аминокислоты

Доказательство существования механизма гидролиза аминоацил-тРНК аминоацил-тРНК-синтетазами было получено при изучении аминоацилирования тРНКVal треонином катализируемого валил-тРНК-синтетазой из BStearothermophilus

Валил-тРНК-синтетаза образует с треонином стабильный комплекс Валил-тРНК-синтетаза образует с треонином стабильный комплекс который быстро гидролизуется при добавлении тРНКкоторый быстро гидролизуется при добавлении тРНКValVal

Предшествует ли гидролизу перенос аминоацильного остатка на тРНКПредшествует ли гидролизу перенос аминоацильного остатка на тРНКValVal

Импульсный метод laquoзамороженнойraquo струиКомплекс [14С]-треонил-АМРЕVal + тРНК [14С]-треонил-тРНК

Константа гидролиза треонил-тРНК в присутствии валил-тРНК-синтетазы 40 сКонстанта гидролиза треонил-тРНК в присутствии валил-тРНК-синтетазы 40 с -1-1а для специфичной валил-тРНК 0015 са для специфичной валил-тРНК 0015 с-1-1 то есть более чем в 2000 раз ниже то есть более чем в 2000 раз ниже

Механизм коррекции за счет гидролиза Механизм коррекции за счет гидролиза промежуточного аминоациладенилатапромежуточного аминоациладенилата

Ошибочное промежуточное соединение образующееся в ходе реакции диссоциирует с фермента и гиролизуется быстрее чем правильное Для правильного аминоациладенилата скорость переноса на тРНК выше чем диссоциация те коррекция определяется соотношением кинетических констант определенных стадий

Джон Джозеф ХопфилдДжон Джозеф Хопфилд1933 Чикаго США1933 Чикаго США

биофизик и биофизик и молекулярный биологмолекулярный биолог

Механизм кинетического корректированияМеханизм кинетического корректирования

Механизм коррекции за счет гидролиза Механизм коррекции за счет гидролиза промежуточного аминоациладенилатапромежуточного аминоациладенилата

Экспериментальное доказательствоЭкспериментальное доказательствоДля валил-тРНК-синтетазы из желтого люпина в отсутствие тРНК наблюдался гидролиз

АТР АМР + ppi зависящий от присутствия несубстратных аминокислот (Cys Thr Ser и α-аминомасляной кислоты)

Константа скорости гидролиза для этих кислот 07-13 мин-1 Специфический валиладенилат-ферментный комплекс гидролизуется с константой скорости 0018 мин-1 те например в 720 раз медленнее чем комплекс валил-тРНК-синтетазы с цистеинил-аденилатом

Коррекция ошибок в реакциях Коррекция ошибок в реакциях катализируемыхкатализируемых

ДНК-полимеразамиДНК-полимеразами

Механизм коррекции при репликации ДНКМеханизм коррекции при репликации ДНК

При синтезе ДНК ошибка исправляется после полимеризации Молекула ДНК синтезируется в направлении 5rsquo-3rsquo нуклеотиды присоединяются к 3rsquo-гидроксильной группе растущей цепи ДНК

Репликативные ДНК-полимеразы обладают Репликативные ДНК-полимеразы обладают корректирующей 3rsquo-5rsquo-экзонуклеазной активностью корректирующей 3rsquo-5rsquo-экзонуклеазной активностью

выщепляющей из цепи ошибочно встроенный нуклеотидвыщепляющей из цепи ошибочно встроенный нуклеотид

Частота мутации фага Т4 коррелирует с экзонуклеазной активностью проявляемой ДНК-полимеразой Частота мутации для ЕСoli составляет 10-6-10-8 и следовательно точность репликации ДНК либо равна этим величинам либо еще выше

Механизм коррекции при репликации ДНКМеханизм коррекции при репликации ДНК

С помощью экзонуклеазной активности исправляются ошибки которые накапливаются в процессе биосинтеза Однако нарушения структуры ДНК могут возникать не только по причине неточной работы в ходе синтеза но и в результате внешних воздействий таких как ионизирующее и ультрафиолетовое облучение окислительный стресс

Возможна различная пострепликационная коррекция структуры ДНКВозможна различная пострепликационная коррекция структуры ДНК(репарация)(репарация)

Система репарации ошибочно-встроенных нуклеотидов (Система репарации ошибочно-встроенных нуклеотидов (mismatch mismatch repairrepair) специально предназначена для удаления ошибок возникших в ) специально предназначена для удаления ошибок возникших в ДНК в ходе репликацииДНК в ходе репликации

Система эксцизионной репарации оснований исправляет повреждения в Система эксцизионной репарации оснований исправляет повреждения в ДНК возникающие в результате окислительного стресса то есть ДНК возникающие в результате окислительного стресса то есть модифицированные (окисленные) основания и разрывы в одной из цепей модифицированные (окисленные) основания и разрывы в одной из цепей ДНКДНК

Система эксцизионной репарации нуклеотидов удаляет из ДНК объемные Система эксцизионной репарации нуклеотидов удаляет из ДНК объемные повреждения фотодимеры возникающие под действием повреждения фотодимеры возникающие под действием ультрафиолетового облучения объемные аддукты метаболитов ультрафиолетового облучения объемные аддукты метаболитов попадающих из окружающей среды таких как продукты сгорания курения попадающих из окружающей среды таких как продукты сгорания курения например антрацены и бензапиренынапример антрацены и бензапирены

Синтез ДНК через повреждениеСинтез ДНК через повреждение((Translesion synthesisTranslesion synthesis ndash TLS)ndash TLS)

В случае синтеза с использованием поврежденной ДНК-матрицы транслезионными (translesion) ДНК-полимеразами (например η ι κ θ μ ζ) также возникают искажения в структуре ДНК

TLS ДНК-полимеразы ведущие синтез через повреждение матрицы не обладают корректирующей активностью поскольку их задачей является ввести во чтобы то ни стало нуклеотидное звено дабы избежать остановки репликативной вилки на повреждении матрицы Затем поврежденный участок ДНК восстанавливается системами репарации

Мутации вводимые репликативными Мутации вводимые репликативными ДНК-полимеразами в ходе репликативного синтеза ДНК-полимеразами в ходе репликативного синтеза

играют не только вредную рольиграют не только вредную роль Мутации в ДНК являются движущей Мутации в ДНК являются движущей

силой эволюциисилой эволюции

• Slide 1
• Slide 2
• Slide 3
• Slide 4
• Slide 5
• Slide 6
• Slide 7
• Slide 8
• Slide 9
• Slide 10
• Slide 11
• Slide 12
• Slide 13
• Slide 14
• Slide 15
• Slide 16
• Slide 17
• Slide 18
• Slide 19
• Slide 20
• Slide 21
• Slide 22
• Slide 23
• Slide 24
• Slide 25
• Slide 26
• Slide 27
• Slide 28
• Slide 29
• Slide 30
• Slide 31
• Slide 32
• Slide 33
• Slide 34
• Slide 35
• Slide 36
• Slide 37
• Slide 38
• Slide 39
• Slide 40
• Slide 41

Роль тРНК в коррекцииРоль тРНК в коррекции

Индуцирует ли тРНК гидролиз аминоациладенилата или же служит акцептором ошибочно активированной аминокислоты а затем подвергается ферментативному деацилированию

Возможные последовательности реакций катализируемых синтетазами можно записать в виде следующей схемы (АК-аминокислота)

Роль тРНК в коррекцииРоль тРНК в коррекции

Предложенные механизмы коррекции можно разделить на две группы в зависимости от того какое соединение в них гидролизуется Механизм отбраковки ошибочной аминокислоты (Механизм отбраковки ошибочной аминокислоты (стадии 1

2 5 ndash гидролиз аминоацил-тРНК) Механизм коррекции за счет гидролиза промежуточного Механизм коррекции за счет гидролиза промежуточного

аминоациладенилата (аминоациладенилата (стадии 1 и 4 ndash гидролиз аминоациладенилата)

В каждом из возможных маршрутов коррекции исправление ошибки достигается благодаря введению в реакционный путь laquoнеобратимогоraquo ответвления (реакции 4 или 5) обеспечивающего гидролиз нежелательных соединений

Механизм отбраковки ошибочной аминокислотыМеханизм отбраковки ошибочной аминокислоты

Доказательство существования механизма гидролиза аминоацил-тРНК аминоацил-тРНК-синтетазами было получено при изучении аминоацилирования тРНКVal треонином катализируемого валил-тРНК-синтетазой из BStearothermophilus

Валил-тРНК-синтетаза образует с треонином стабильный комплекс Валил-тРНК-синтетаза образует с треонином стабильный комплекс который быстро гидролизуется при добавлении тРНКкоторый быстро гидролизуется при добавлении тРНКValVal

Предшествует ли гидролизу перенос аминоацильного остатка на тРНКПредшествует ли гидролизу перенос аминоацильного остатка на тРНКValVal

Импульсный метод laquoзамороженнойraquo струиКомплекс [14С]-треонил-АМРЕVal + тРНК [14С]-треонил-тРНК

Константа гидролиза треонил-тРНК в присутствии валил-тРНК-синтетазы 40 сКонстанта гидролиза треонил-тРНК в присутствии валил-тРНК-синтетазы 40 с -1-1а для специфичной валил-тРНК 0015 са для специфичной валил-тРНК 0015 с-1-1 то есть более чем в 2000 раз ниже то есть более чем в 2000 раз ниже

Механизм коррекции за счет гидролиза Механизм коррекции за счет гидролиза промежуточного аминоациладенилатапромежуточного аминоациладенилата

Ошибочное промежуточное соединение образующееся в ходе реакции диссоциирует с фермента и гиролизуется быстрее чем правильное Для правильного аминоациладенилата скорость переноса на тРНК выше чем диссоциация те коррекция определяется соотношением кинетических констант определенных стадий

Джон Джозеф ХопфилдДжон Джозеф Хопфилд1933 Чикаго США1933 Чикаго США

биофизик и биофизик и молекулярный биологмолекулярный биолог

Механизм кинетического корректированияМеханизм кинетического корректирования

Механизм коррекции за счет гидролиза Механизм коррекции за счет гидролиза промежуточного аминоациладенилатапромежуточного аминоациладенилата

Экспериментальное доказательствоЭкспериментальное доказательствоДля валил-тРНК-синтетазы из желтого люпина в отсутствие тРНК наблюдался гидролиз

АТР АМР + ppi зависящий от присутствия несубстратных аминокислот (Cys Thr Ser и α-аминомасляной кислоты)

Константа скорости гидролиза для этих кислот 07-13 мин-1 Специфический валиладенилат-ферментный комплекс гидролизуется с константой скорости 0018 мин-1 те например в 720 раз медленнее чем комплекс валил-тРНК-синтетазы с цистеинил-аденилатом

Коррекция ошибок в реакциях Коррекция ошибок в реакциях катализируемыхкатализируемых

ДНК-полимеразамиДНК-полимеразами

Механизм коррекции при репликации ДНКМеханизм коррекции при репликации ДНК

При синтезе ДНК ошибка исправляется после полимеризации Молекула ДНК синтезируется в направлении 5rsquo-3rsquo нуклеотиды присоединяются к 3rsquo-гидроксильной группе растущей цепи ДНК

Репликативные ДНК-полимеразы обладают Репликативные ДНК-полимеразы обладают корректирующей 3rsquo-5rsquo-экзонуклеазной активностью корректирующей 3rsquo-5rsquo-экзонуклеазной активностью

выщепляющей из цепи ошибочно встроенный нуклеотидвыщепляющей из цепи ошибочно встроенный нуклеотид

Частота мутации фага Т4 коррелирует с экзонуклеазной активностью проявляемой ДНК-полимеразой Частота мутации для ЕСoli составляет 10-6-10-8 и следовательно точность репликации ДНК либо равна этим величинам либо еще выше

Механизм коррекции при репликации ДНКМеханизм коррекции при репликации ДНК

С помощью экзонуклеазной активности исправляются ошибки которые накапливаются в процессе биосинтеза Однако нарушения структуры ДНК могут возникать не только по причине неточной работы в ходе синтеза но и в результате внешних воздействий таких как ионизирующее и ультрафиолетовое облучение окислительный стресс

Возможна различная пострепликационная коррекция структуры ДНКВозможна различная пострепликационная коррекция структуры ДНК(репарация)(репарация)

Система репарации ошибочно-встроенных нуклеотидов (Система репарации ошибочно-встроенных нуклеотидов (mismatch mismatch repairrepair) специально предназначена для удаления ошибок возникших в ) специально предназначена для удаления ошибок возникших в ДНК в ходе репликацииДНК в ходе репликации

Система эксцизионной репарации оснований исправляет повреждения в Система эксцизионной репарации оснований исправляет повреждения в ДНК возникающие в результате окислительного стресса то есть ДНК возникающие в результате окислительного стресса то есть модифицированные (окисленные) основания и разрывы в одной из цепей модифицированные (окисленные) основания и разрывы в одной из цепей ДНКДНК

Система эксцизионной репарации нуклеотидов удаляет из ДНК объемные Система эксцизионной репарации нуклеотидов удаляет из ДНК объемные повреждения фотодимеры возникающие под действием повреждения фотодимеры возникающие под действием ультрафиолетового облучения объемные аддукты метаболитов ультрафиолетового облучения объемные аддукты метаболитов попадающих из окружающей среды таких как продукты сгорания курения попадающих из окружающей среды таких как продукты сгорания курения например антрацены и бензапиренынапример антрацены и бензапирены

Синтез ДНК через повреждениеСинтез ДНК через повреждение((Translesion synthesisTranslesion synthesis ndash TLS)ndash TLS)

В случае синтеза с использованием поврежденной ДНК-матрицы транслезионными (translesion) ДНК-полимеразами (например η ι κ θ μ ζ) также возникают искажения в структуре ДНК

TLS ДНК-полимеразы ведущие синтез через повреждение матрицы не обладают корректирующей активностью поскольку их задачей является ввести во чтобы то ни стало нуклеотидное звено дабы избежать остановки репликативной вилки на повреждении матрицы Затем поврежденный участок ДНК восстанавливается системами репарации

Мутации вводимые репликативными Мутации вводимые репликативными ДНК-полимеразами в ходе репликативного синтеза ДНК-полимеразами в ходе репликативного синтеза

играют не только вредную рольиграют не только вредную роль Мутации в ДНК являются движущей Мутации в ДНК являются движущей

силой эволюциисилой эволюции

• Slide 1
• Slide 2
• Slide 3
• Slide 4
• Slide 5
• Slide 6
• Slide 7
• Slide 8
• Slide 9
• Slide 10
• Slide 11
• Slide 12
• Slide 13
• Slide 14
• Slide 15
• Slide 16
• Slide 17
• Slide 18
• Slide 19
• Slide 20
• Slide 21
• Slide 22
• Slide 23
• Slide 24
• Slide 25
• Slide 26
• Slide 27
• Slide 28
• Slide 29
• Slide 30
• Slide 31
• Slide 32
• Slide 33
• Slide 34
• Slide 35
• Slide 36
• Slide 37
• Slide 38
• Slide 39
• Slide 40
• Slide 41

Роль тРНК в коррекцииРоль тРНК в коррекции

Предложенные механизмы коррекции можно разделить на две группы в зависимости от того какое соединение в них гидролизуется Механизм отбраковки ошибочной аминокислоты (Механизм отбраковки ошибочной аминокислоты (стадии 1

2 5 ndash гидролиз аминоацил-тРНК) Механизм коррекции за счет гидролиза промежуточного Механизм коррекции за счет гидролиза промежуточного

аминоациладенилата (аминоациладенилата (стадии 1 и 4 ndash гидролиз аминоациладенилата)

В каждом из возможных маршрутов коррекции исправление ошибки достигается благодаря введению в реакционный путь laquoнеобратимогоraquo ответвления (реакции 4 или 5) обеспечивающего гидролиз нежелательных соединений

Механизм отбраковки ошибочной аминокислотыМеханизм отбраковки ошибочной аминокислоты

Доказательство существования механизма гидролиза аминоацил-тРНК аминоацил-тРНК-синтетазами было получено при изучении аминоацилирования тРНКVal треонином катализируемого валил-тРНК-синтетазой из BStearothermophilus

Валил-тРНК-синтетаза образует с треонином стабильный комплекс Валил-тРНК-синтетаза образует с треонином стабильный комплекс который быстро гидролизуется при добавлении тРНКкоторый быстро гидролизуется при добавлении тРНКValVal

Предшествует ли гидролизу перенос аминоацильного остатка на тРНКПредшествует ли гидролизу перенос аминоацильного остатка на тРНКValVal

Импульсный метод laquoзамороженнойraquo струиКомплекс [14С]-треонил-АМРЕVal + тРНК [14С]-треонил-тРНК

Константа гидролиза треонил-тРНК в присутствии валил-тРНК-синтетазы 40 сКонстанта гидролиза треонил-тРНК в присутствии валил-тРНК-синтетазы 40 с -1-1а для специфичной валил-тРНК 0015 са для специфичной валил-тРНК 0015 с-1-1 то есть более чем в 2000 раз ниже то есть более чем в 2000 раз ниже

Механизм коррекции за счет гидролиза Механизм коррекции за счет гидролиза промежуточного аминоациладенилатапромежуточного аминоациладенилата

Ошибочное промежуточное соединение образующееся в ходе реакции диссоциирует с фермента и гиролизуется быстрее чем правильное Для правильного аминоациладенилата скорость переноса на тРНК выше чем диссоциация те коррекция определяется соотношением кинетических констант определенных стадий

Джон Джозеф ХопфилдДжон Джозеф Хопфилд1933 Чикаго США1933 Чикаго США

биофизик и биофизик и молекулярный биологмолекулярный биолог

Механизм кинетического корректированияМеханизм кинетического корректирования

Механизм коррекции за счет гидролиза Механизм коррекции за счет гидролиза промежуточного аминоациладенилатапромежуточного аминоациладенилата

Экспериментальное доказательствоЭкспериментальное доказательствоДля валил-тРНК-синтетазы из желтого люпина в отсутствие тРНК наблюдался гидролиз

АТР АМР + ppi зависящий от присутствия несубстратных аминокислот (Cys Thr Ser и α-аминомасляной кислоты)

Константа скорости гидролиза для этих кислот 07-13 мин-1 Специфический валиладенилат-ферментный комплекс гидролизуется с константой скорости 0018 мин-1 те например в 720 раз медленнее чем комплекс валил-тРНК-синтетазы с цистеинил-аденилатом

Коррекция ошибок в реакциях Коррекция ошибок в реакциях катализируемыхкатализируемых

ДНК-полимеразамиДНК-полимеразами

Механизм коррекции при репликации ДНКМеханизм коррекции при репликации ДНК

При синтезе ДНК ошибка исправляется после полимеризации Молекула ДНК синтезируется в направлении 5rsquo-3rsquo нуклеотиды присоединяются к 3rsquo-гидроксильной группе растущей цепи ДНК

Репликативные ДНК-полимеразы обладают Репликативные ДНК-полимеразы обладают корректирующей 3rsquo-5rsquo-экзонуклеазной активностью корректирующей 3rsquo-5rsquo-экзонуклеазной активностью

выщепляющей из цепи ошибочно встроенный нуклеотидвыщепляющей из цепи ошибочно встроенный нуклеотид

Частота мутации фага Т4 коррелирует с экзонуклеазной активностью проявляемой ДНК-полимеразой Частота мутации для ЕСoli составляет 10-6-10-8 и следовательно точность репликации ДНК либо равна этим величинам либо еще выше

Механизм коррекции при репликации ДНКМеханизм коррекции при репликации ДНК

С помощью экзонуклеазной активности исправляются ошибки которые накапливаются в процессе биосинтеза Однако нарушения структуры ДНК могут возникать не только по причине неточной работы в ходе синтеза но и в результате внешних воздействий таких как ионизирующее и ультрафиолетовое облучение окислительный стресс

Возможна различная пострепликационная коррекция структуры ДНКВозможна различная пострепликационная коррекция структуры ДНК(репарация)(репарация)

Система репарации ошибочно-встроенных нуклеотидов (Система репарации ошибочно-встроенных нуклеотидов (mismatch mismatch repairrepair) специально предназначена для удаления ошибок возникших в ) специально предназначена для удаления ошибок возникших в ДНК в ходе репликацииДНК в ходе репликации

Система эксцизионной репарации оснований исправляет повреждения в Система эксцизионной репарации оснований исправляет повреждения в ДНК возникающие в результате окислительного стресса то есть ДНК возникающие в результате окислительного стресса то есть модифицированные (окисленные) основания и разрывы в одной из цепей модифицированные (окисленные) основания и разрывы в одной из цепей ДНКДНК

Система эксцизионной репарации нуклеотидов удаляет из ДНК объемные Система эксцизионной репарации нуклеотидов удаляет из ДНК объемные повреждения фотодимеры возникающие под действием повреждения фотодимеры возникающие под действием ультрафиолетового облучения объемные аддукты метаболитов ультрафиолетового облучения объемные аддукты метаболитов попадающих из окружающей среды таких как продукты сгорания курения попадающих из окружающей среды таких как продукты сгорания курения например антрацены и бензапиренынапример антрацены и бензапирены

Синтез ДНК через повреждениеСинтез ДНК через повреждение((Translesion synthesisTranslesion synthesis ndash TLS)ndash TLS)

В случае синтеза с использованием поврежденной ДНК-матрицы транслезионными (translesion) ДНК-полимеразами (например η ι κ θ μ ζ) также возникают искажения в структуре ДНК

TLS ДНК-полимеразы ведущие синтез через повреждение матрицы не обладают корректирующей активностью поскольку их задачей является ввести во чтобы то ни стало нуклеотидное звено дабы избежать остановки репликативной вилки на повреждении матрицы Затем поврежденный участок ДНК восстанавливается системами репарации

Мутации вводимые репликативными Мутации вводимые репликативными ДНК-полимеразами в ходе репликативного синтеза ДНК-полимеразами в ходе репликативного синтеза

играют не только вредную рольиграют не только вредную роль Мутации в ДНК являются движущей Мутации в ДНК являются движущей

силой эволюциисилой эволюции

• Slide 1
• Slide 2
• Slide 3
• Slide 4
• Slide 5
• Slide 6
• Slide 7
• Slide 8
• Slide 9
• Slide 10
• Slide 11
• Slide 12
• Slide 13
• Slide 14
• Slide 15
• Slide 16
• Slide 17
• Slide 18
• Slide 19
• Slide 20
• Slide 21
• Slide 22
• Slide 23
• Slide 24
• Slide 25
• Slide 26
• Slide 27
• Slide 28
• Slide 29
• Slide 30
• Slide 31
• Slide 32
• Slide 33
• Slide 34
• Slide 35
• Slide 36
• Slide 37
• Slide 38
• Slide 39
• Slide 40
• Slide 41

Механизм отбраковки ошибочной аминокислотыМеханизм отбраковки ошибочной аминокислоты

Доказательство существования механизма гидролиза аминоацил-тРНК аминоацил-тРНК-синтетазами было получено при изучении аминоацилирования тРНКVal треонином катализируемого валил-тРНК-синтетазой из BStearothermophilus

Валил-тРНК-синтетаза образует с треонином стабильный комплекс Валил-тРНК-синтетаза образует с треонином стабильный комплекс который быстро гидролизуется при добавлении тРНКкоторый быстро гидролизуется при добавлении тРНКValVal

Предшествует ли гидролизу перенос аминоацильного остатка на тРНКПредшествует ли гидролизу перенос аминоацильного остатка на тРНКValVal

Импульсный метод laquoзамороженнойraquo струиКомплекс [14С]-треонил-АМРЕVal + тРНК [14С]-треонил-тРНК

Константа гидролиза треонил-тРНК в присутствии валил-тРНК-синтетазы 40 сКонстанта гидролиза треонил-тРНК в присутствии валил-тРНК-синтетазы 40 с -1-1а для специфичной валил-тРНК 0015 са для специфичной валил-тРНК 0015 с-1-1 то есть более чем в 2000 раз ниже то есть более чем в 2000 раз ниже

Механизм коррекции за счет гидролиза Механизм коррекции за счет гидролиза промежуточного аминоациладенилатапромежуточного аминоациладенилата

Ошибочное промежуточное соединение образующееся в ходе реакции диссоциирует с фермента и гиролизуется быстрее чем правильное Для правильного аминоациладенилата скорость переноса на тРНК выше чем диссоциация те коррекция определяется соотношением кинетических констант определенных стадий

Джон Джозеф ХопфилдДжон Джозеф Хопфилд1933 Чикаго США1933 Чикаго США

биофизик и биофизик и молекулярный биологмолекулярный биолог

Механизм кинетического корректированияМеханизм кинетического корректирования

Механизм коррекции за счет гидролиза Механизм коррекции за счет гидролиза промежуточного аминоациладенилатапромежуточного аминоациладенилата

Экспериментальное доказательствоЭкспериментальное доказательствоДля валил-тРНК-синтетазы из желтого люпина в отсутствие тРНК наблюдался гидролиз

АТР АМР + ppi зависящий от присутствия несубстратных аминокислот (Cys Thr Ser и α-аминомасляной кислоты)

Константа скорости гидролиза для этих кислот 07-13 мин-1 Специфический валиладенилат-ферментный комплекс гидролизуется с константой скорости 0018 мин-1 те например в 720 раз медленнее чем комплекс валил-тРНК-синтетазы с цистеинил-аденилатом

Коррекция ошибок в реакциях Коррекция ошибок в реакциях катализируемыхкатализируемых

ДНК-полимеразамиДНК-полимеразами

Механизм коррекции при репликации ДНКМеханизм коррекции при репликации ДНК

При синтезе ДНК ошибка исправляется после полимеризации Молекула ДНК синтезируется в направлении 5rsquo-3rsquo нуклеотиды присоединяются к 3rsquo-гидроксильной группе растущей цепи ДНК

Репликативные ДНК-полимеразы обладают Репликативные ДНК-полимеразы обладают корректирующей 3rsquo-5rsquo-экзонуклеазной активностью корректирующей 3rsquo-5rsquo-экзонуклеазной активностью

выщепляющей из цепи ошибочно встроенный нуклеотидвыщепляющей из цепи ошибочно встроенный нуклеотид

Частота мутации фага Т4 коррелирует с экзонуклеазной активностью проявляемой ДНК-полимеразой Частота мутации для ЕСoli составляет 10-6-10-8 и следовательно точность репликации ДНК либо равна этим величинам либо еще выше

Механизм коррекции при репликации ДНКМеханизм коррекции при репликации ДНК

С помощью экзонуклеазной активности исправляются ошибки которые накапливаются в процессе биосинтеза Однако нарушения структуры ДНК могут возникать не только по причине неточной работы в ходе синтеза но и в результате внешних воздействий таких как ионизирующее и ультрафиолетовое облучение окислительный стресс

Возможна различная пострепликационная коррекция структуры ДНКВозможна различная пострепликационная коррекция структуры ДНК(репарация)(репарация)

Система репарации ошибочно-встроенных нуклеотидов (Система репарации ошибочно-встроенных нуклеотидов (mismatch mismatch repairrepair) специально предназначена для удаления ошибок возникших в ) специально предназначена для удаления ошибок возникших в ДНК в ходе репликацииДНК в ходе репликации

Система эксцизионной репарации оснований исправляет повреждения в Система эксцизионной репарации оснований исправляет повреждения в ДНК возникающие в результате окислительного стресса то есть ДНК возникающие в результате окислительного стресса то есть модифицированные (окисленные) основания и разрывы в одной из цепей модифицированные (окисленные) основания и разрывы в одной из цепей ДНКДНК

Система эксцизионной репарации нуклеотидов удаляет из ДНК объемные Система эксцизионной репарации нуклеотидов удаляет из ДНК объемные повреждения фотодимеры возникающие под действием повреждения фотодимеры возникающие под действием ультрафиолетового облучения объемные аддукты метаболитов ультрафиолетового облучения объемные аддукты метаболитов попадающих из окружающей среды таких как продукты сгорания курения попадающих из окружающей среды таких как продукты сгорания курения например антрацены и бензапиренынапример антрацены и бензапирены

Синтез ДНК через повреждениеСинтез ДНК через повреждение((Translesion synthesisTranslesion synthesis ndash TLS)ndash TLS)

В случае синтеза с использованием поврежденной ДНК-матрицы транслезионными (translesion) ДНК-полимеразами (например η ι κ θ μ ζ) также возникают искажения в структуре ДНК

TLS ДНК-полимеразы ведущие синтез через повреждение матрицы не обладают корректирующей активностью поскольку их задачей является ввести во чтобы то ни стало нуклеотидное звено дабы избежать остановки репликативной вилки на повреждении матрицы Затем поврежденный участок ДНК восстанавливается системами репарации

Мутации вводимые репликативными Мутации вводимые репликативными ДНК-полимеразами в ходе репликативного синтеза ДНК-полимеразами в ходе репликативного синтеза

играют не только вредную рольиграют не только вредную роль Мутации в ДНК являются движущей Мутации в ДНК являются движущей

силой эволюциисилой эволюции

• Slide 1
• Slide 2
• Slide 3
• Slide 4
• Slide 5
• Slide 6
• Slide 7
• Slide 8
• Slide 9
• Slide 10
• Slide 11
• Slide 12
• Slide 13
• Slide 14
• Slide 15
• Slide 16
• Slide 17
• Slide 18
• Slide 19
• Slide 20
• Slide 21
• Slide 22
• Slide 23
• Slide 24
• Slide 25
• Slide 26
• Slide 27
• Slide 28
• Slide 29
• Slide 30
• Slide 31
• Slide 32
• Slide 33
• Slide 34
• Slide 35
• Slide 36
• Slide 37
• Slide 38
• Slide 39
• Slide 40
• Slide 41

Механизм коррекции за счет гидролиза Механизм коррекции за счет гидролиза промежуточного аминоациладенилатапромежуточного аминоациладенилата

Ошибочное промежуточное соединение образующееся в ходе реакции диссоциирует с фермента и гиролизуется быстрее чем правильное Для правильного аминоациладенилата скорость переноса на тРНК выше чем диссоциация те коррекция определяется соотношением кинетических констант определенных стадий

Джон Джозеф ХопфилдДжон Джозеф Хопфилд1933 Чикаго США1933 Чикаго США

биофизик и биофизик и молекулярный биологмолекулярный биолог

Механизм кинетического корректированияМеханизм кинетического корректирования

Механизм коррекции за счет гидролиза Механизм коррекции за счет гидролиза промежуточного аминоациладенилатапромежуточного аминоациладенилата

Экспериментальное доказательствоЭкспериментальное доказательствоДля валил-тРНК-синтетазы из желтого люпина в отсутствие тРНК наблюдался гидролиз

АТР АМР + ppi зависящий от присутствия несубстратных аминокислот (Cys Thr Ser и α-аминомасляной кислоты)

Константа скорости гидролиза для этих кислот 07-13 мин-1 Специфический валиладенилат-ферментный комплекс гидролизуется с константой скорости 0018 мин-1 те например в 720 раз медленнее чем комплекс валил-тРНК-синтетазы с цистеинил-аденилатом

Коррекция ошибок в реакциях Коррекция ошибок в реакциях катализируемыхкатализируемых

ДНК-полимеразамиДНК-полимеразами

Механизм коррекции при репликации ДНКМеханизм коррекции при репликации ДНК

При синтезе ДНК ошибка исправляется после полимеризации Молекула ДНК синтезируется в направлении 5rsquo-3rsquo нуклеотиды присоединяются к 3rsquo-гидроксильной группе растущей цепи ДНК

Репликативные ДНК-полимеразы обладают Репликативные ДНК-полимеразы обладают корректирующей 3rsquo-5rsquo-экзонуклеазной активностью корректирующей 3rsquo-5rsquo-экзонуклеазной активностью

выщепляющей из цепи ошибочно встроенный нуклеотидвыщепляющей из цепи ошибочно встроенный нуклеотид

Частота мутации фага Т4 коррелирует с экзонуклеазной активностью проявляемой ДНК-полимеразой Частота мутации для ЕСoli составляет 10-6-10-8 и следовательно точность репликации ДНК либо равна этим величинам либо еще выше

Механизм коррекции при репликации ДНКМеханизм коррекции при репликации ДНК

С помощью экзонуклеазной активности исправляются ошибки которые накапливаются в процессе биосинтеза Однако нарушения структуры ДНК могут возникать не только по причине неточной работы в ходе синтеза но и в результате внешних воздействий таких как ионизирующее и ультрафиолетовое облучение окислительный стресс

Возможна различная пострепликационная коррекция структуры ДНКВозможна различная пострепликационная коррекция структуры ДНК(репарация)(репарация)

Система репарации ошибочно-встроенных нуклеотидов (Система репарации ошибочно-встроенных нуклеотидов (mismatch mismatch repairrepair) специально предназначена для удаления ошибок возникших в ) специально предназначена для удаления ошибок возникших в ДНК в ходе репликацииДНК в ходе репликации

Система эксцизионной репарации оснований исправляет повреждения в Система эксцизионной репарации оснований исправляет повреждения в ДНК возникающие в результате окислительного стресса то есть ДНК возникающие в результате окислительного стресса то есть модифицированные (окисленные) основания и разрывы в одной из цепей модифицированные (окисленные) основания и разрывы в одной из цепей ДНКДНК

Система эксцизионной репарации нуклеотидов удаляет из ДНК объемные Система эксцизионной репарации нуклеотидов удаляет из ДНК объемные повреждения фотодимеры возникающие под действием повреждения фотодимеры возникающие под действием ультрафиолетового облучения объемные аддукты метаболитов ультрафиолетового облучения объемные аддукты метаболитов попадающих из окружающей среды таких как продукты сгорания курения попадающих из окружающей среды таких как продукты сгорания курения например антрацены и бензапиренынапример антрацены и бензапирены

Синтез ДНК через повреждениеСинтез ДНК через повреждение((Translesion synthesisTranslesion synthesis ndash TLS)ndash TLS)

В случае синтеза с использованием поврежденной ДНК-матрицы транслезионными (translesion) ДНК-полимеразами (например η ι κ θ μ ζ) также возникают искажения в структуре ДНК

TLS ДНК-полимеразы ведущие синтез через повреждение матрицы не обладают корректирующей активностью поскольку их задачей является ввести во чтобы то ни стало нуклеотидное звено дабы избежать остановки репликативной вилки на повреждении матрицы Затем поврежденный участок ДНК восстанавливается системами репарации

Мутации вводимые репликативными Мутации вводимые репликативными ДНК-полимеразами в ходе репликативного синтеза ДНК-полимеразами в ходе репликативного синтеза

играют не только вредную рольиграют не только вредную роль Мутации в ДНК являются движущей Мутации в ДНК являются движущей

силой эволюциисилой эволюции

• Slide 1
• Slide 2
• Slide 3
• Slide 4
• Slide 5
• Slide 6
• Slide 7
• Slide 8
• Slide 9
• Slide 10
• Slide 11
• Slide 12
• Slide 13
• Slide 14
• Slide 15
• Slide 16
• Slide 17
• Slide 18
• Slide 19
• Slide 20
• Slide 21
• Slide 22
• Slide 23
• Slide 24
• Slide 25
• Slide 26
• Slide 27
• Slide 28
• Slide 29
• Slide 30
• Slide 31
• Slide 32
• Slide 33
• Slide 34
• Slide 35
• Slide 36
• Slide 37
• Slide 38
• Slide 39
• Slide 40
• Slide 41

Механизм коррекции за счет гидролиза Механизм коррекции за счет гидролиза промежуточного аминоациладенилатапромежуточного аминоациладенилата

Экспериментальное доказательствоЭкспериментальное доказательствоДля валил-тРНК-синтетазы из желтого люпина в отсутствие тРНК наблюдался гидролиз

АТР АМР + ppi зависящий от присутствия несубстратных аминокислот (Cys Thr Ser и α-аминомасляной кислоты)

Константа скорости гидролиза для этих кислот 07-13 мин-1 Специфический валиладенилат-ферментный комплекс гидролизуется с константой скорости 0018 мин-1 те например в 720 раз медленнее чем комплекс валил-тРНК-синтетазы с цистеинил-аденилатом

Коррекция ошибок в реакциях Коррекция ошибок в реакциях катализируемыхкатализируемых

ДНК-полимеразамиДНК-полимеразами

Механизм коррекции при репликации ДНКМеханизм коррекции при репликации ДНК

При синтезе ДНК ошибка исправляется после полимеризации Молекула ДНК синтезируется в направлении 5rsquo-3rsquo нуклеотиды присоединяются к 3rsquo-гидроксильной группе растущей цепи ДНК

Репликативные ДНК-полимеразы обладают Репликативные ДНК-полимеразы обладают корректирующей 3rsquo-5rsquo-экзонуклеазной активностью корректирующей 3rsquo-5rsquo-экзонуклеазной активностью

выщепляющей из цепи ошибочно встроенный нуклеотидвыщепляющей из цепи ошибочно встроенный нуклеотид

Частота мутации фага Т4 коррелирует с экзонуклеазной активностью проявляемой ДНК-полимеразой Частота мутации для ЕСoli составляет 10-6-10-8 и следовательно точность репликации ДНК либо равна этим величинам либо еще выше

Механизм коррекции при репликации ДНКМеханизм коррекции при репликации ДНК

С помощью экзонуклеазной активности исправляются ошибки которые накапливаются в процессе биосинтеза Однако нарушения структуры ДНК могут возникать не только по причине неточной работы в ходе синтеза но и в результате внешних воздействий таких как ионизирующее и ультрафиолетовое облучение окислительный стресс

Возможна различная пострепликационная коррекция структуры ДНКВозможна различная пострепликационная коррекция структуры ДНК(репарация)(репарация)

Система репарации ошибочно-встроенных нуклеотидов (Система репарации ошибочно-встроенных нуклеотидов (mismatch mismatch repairrepair) специально предназначена для удаления ошибок возникших в ) специально предназначена для удаления ошибок возникших в ДНК в ходе репликацииДНК в ходе репликации

Система эксцизионной репарации оснований исправляет повреждения в Система эксцизионной репарации оснований исправляет повреждения в ДНК возникающие в результате окислительного стресса то есть ДНК возникающие в результате окислительного стресса то есть модифицированные (окисленные) основания и разрывы в одной из цепей модифицированные (окисленные) основания и разрывы в одной из цепей ДНКДНК

Система эксцизионной репарации нуклеотидов удаляет из ДНК объемные Система эксцизионной репарации нуклеотидов удаляет из ДНК объемные повреждения фотодимеры возникающие под действием повреждения фотодимеры возникающие под действием ультрафиолетового облучения объемные аддукты метаболитов ультрафиолетового облучения объемные аддукты метаболитов попадающих из окружающей среды таких как продукты сгорания курения попадающих из окружающей среды таких как продукты сгорания курения например антрацены и бензапиренынапример антрацены и бензапирены

Синтез ДНК через повреждениеСинтез ДНК через повреждение((Translesion synthesisTranslesion synthesis ndash TLS)ndash TLS)

В случае синтеза с использованием поврежденной ДНК-матрицы транслезионными (translesion) ДНК-полимеразами (например η ι κ θ μ ζ) также возникают искажения в структуре ДНК

TLS ДНК-полимеразы ведущие синтез через повреждение матрицы не обладают корректирующей активностью поскольку их задачей является ввести во чтобы то ни стало нуклеотидное звено дабы избежать остановки репликативной вилки на повреждении матрицы Затем поврежденный участок ДНК восстанавливается системами репарации

Мутации вводимые репликативными Мутации вводимые репликативными ДНК-полимеразами в ходе репликативного синтеза ДНК-полимеразами в ходе репликативного синтеза

играют не только вредную рольиграют не только вредную роль Мутации в ДНК являются движущей Мутации в ДНК являются движущей

силой эволюциисилой эволюции

• Slide 1
• Slide 2
• Slide 3
• Slide 4
• Slide 5
• Slide 6
• Slide 7
• Slide 8
• Slide 9
• Slide 10
• Slide 11
• Slide 12
• Slide 13
• Slide 14
• Slide 15
• Slide 16
• Slide 17
• Slide 18
• Slide 19
• Slide 20
• Slide 21
• Slide 22
• Slide 23
• Slide 24
• Slide 25
• Slide 26
• Slide 27
• Slide 28
• Slide 29
• Slide 30
• Slide 31
• Slide 32
• Slide 33
• Slide 34
• Slide 35
• Slide 36
• Slide 37
• Slide 38
• Slide 39
• Slide 40
• Slide 41

Коррекция ошибок в реакциях Коррекция ошибок в реакциях катализируемыхкатализируемых

ДНК-полимеразамиДНК-полимеразами

Механизм коррекции при репликации ДНКМеханизм коррекции при репликации ДНК

При синтезе ДНК ошибка исправляется после полимеризации Молекула ДНК синтезируется в направлении 5rsquo-3rsquo нуклеотиды присоединяются к 3rsquo-гидроксильной группе растущей цепи ДНК

Репликативные ДНК-полимеразы обладают Репликативные ДНК-полимеразы обладают корректирующей 3rsquo-5rsquo-экзонуклеазной активностью корректирующей 3rsquo-5rsquo-экзонуклеазной активностью

выщепляющей из цепи ошибочно встроенный нуклеотидвыщепляющей из цепи ошибочно встроенный нуклеотид

Частота мутации фага Т4 коррелирует с экзонуклеазной активностью проявляемой ДНК-полимеразой Частота мутации для ЕСoli составляет 10-6-10-8 и следовательно точность репликации ДНК либо равна этим величинам либо еще выше

Механизм коррекции при репликации ДНКМеханизм коррекции при репликации ДНК

С помощью экзонуклеазной активности исправляются ошибки которые накапливаются в процессе биосинтеза Однако нарушения структуры ДНК могут возникать не только по причине неточной работы в ходе синтеза но и в результате внешних воздействий таких как ионизирующее и ультрафиолетовое облучение окислительный стресс

Возможна различная пострепликационная коррекция структуры ДНКВозможна различная пострепликационная коррекция структуры ДНК(репарация)(репарация)

Система репарации ошибочно-встроенных нуклеотидов (Система репарации ошибочно-встроенных нуклеотидов (mismatch mismatch repairrepair) специально предназначена для удаления ошибок возникших в ) специально предназначена для удаления ошибок возникших в ДНК в ходе репликацииДНК в ходе репликации

Система эксцизионной репарации оснований исправляет повреждения в Система эксцизионной репарации оснований исправляет повреждения в ДНК возникающие в результате окислительного стресса то есть ДНК возникающие в результате окислительного стресса то есть модифицированные (окисленные) основания и разрывы в одной из цепей модифицированные (окисленные) основания и разрывы в одной из цепей ДНКДНК

Система эксцизионной репарации нуклеотидов удаляет из ДНК объемные Система эксцизионной репарации нуклеотидов удаляет из ДНК объемные повреждения фотодимеры возникающие под действием повреждения фотодимеры возникающие под действием ультрафиолетового облучения объемные аддукты метаболитов ультрафиолетового облучения объемные аддукты метаболитов попадающих из окружающей среды таких как продукты сгорания курения попадающих из окружающей среды таких как продукты сгорания курения например антрацены и бензапиренынапример антрацены и бензапирены

Синтез ДНК через повреждениеСинтез ДНК через повреждение((Translesion synthesisTranslesion synthesis ndash TLS)ndash TLS)

В случае синтеза с использованием поврежденной ДНК-матрицы транслезионными (translesion) ДНК-полимеразами (например η ι κ θ μ ζ) также возникают искажения в структуре ДНК

TLS ДНК-полимеразы ведущие синтез через повреждение матрицы не обладают корректирующей активностью поскольку их задачей является ввести во чтобы то ни стало нуклеотидное звено дабы избежать остановки репликативной вилки на повреждении матрицы Затем поврежденный участок ДНК восстанавливается системами репарации

Мутации вводимые репликативными Мутации вводимые репликативными ДНК-полимеразами в ходе репликативного синтеза ДНК-полимеразами в ходе репликативного синтеза

играют не только вредную рольиграют не только вредную роль Мутации в ДНК являются движущей Мутации в ДНК являются движущей

силой эволюциисилой эволюции

• Slide 1
• Slide 2
• Slide 3
• Slide 4
• Slide 5
• Slide 6
• Slide 7
• Slide 8
• Slide 9
• Slide 10
• Slide 11
• Slide 12
• Slide 13
• Slide 14
• Slide 15
• Slide 16
• Slide 17
• Slide 18
• Slide 19
• Slide 20
• Slide 21
• Slide 22
• Slide 23
• Slide 24
• Slide 25
• Slide 26
• Slide 27
• Slide 28
• Slide 29
• Slide 30
• Slide 31
• Slide 32
• Slide 33
• Slide 34
• Slide 35
• Slide 36
• Slide 37
• Slide 38
• Slide 39
• Slide 40
• Slide 41

Механизм коррекции при репликации ДНКМеханизм коррекции при репликации ДНК

При синтезе ДНК ошибка исправляется после полимеризации Молекула ДНК синтезируется в направлении 5rsquo-3rsquo нуклеотиды присоединяются к 3rsquo-гидроксильной группе растущей цепи ДНК

Репликативные ДНК-полимеразы обладают Репликативные ДНК-полимеразы обладают корректирующей 3rsquo-5rsquo-экзонуклеазной активностью корректирующей 3rsquo-5rsquo-экзонуклеазной активностью

выщепляющей из цепи ошибочно встроенный нуклеотидвыщепляющей из цепи ошибочно встроенный нуклеотид

Частота мутации фага Т4 коррелирует с экзонуклеазной активностью проявляемой ДНК-полимеразой Частота мутации для ЕСoli составляет 10-6-10-8 и следовательно точность репликации ДНК либо равна этим величинам либо еще выше

Механизм коррекции при репликации ДНКМеханизм коррекции при репликации ДНК

С помощью экзонуклеазной активности исправляются ошибки которые накапливаются в процессе биосинтеза Однако нарушения структуры ДНК могут возникать не только по причине неточной работы в ходе синтеза но и в результате внешних воздействий таких как ионизирующее и ультрафиолетовое облучение окислительный стресс

Возможна различная пострепликационная коррекция структуры ДНКВозможна различная пострепликационная коррекция структуры ДНК(репарация)(репарация)

Система репарации ошибочно-встроенных нуклеотидов (Система репарации ошибочно-встроенных нуклеотидов (mismatch mismatch repairrepair) специально предназначена для удаления ошибок возникших в ) специально предназначена для удаления ошибок возникших в ДНК в ходе репликацииДНК в ходе репликации

Система эксцизионной репарации оснований исправляет повреждения в Система эксцизионной репарации оснований исправляет повреждения в ДНК возникающие в результате окислительного стресса то есть ДНК возникающие в результате окислительного стресса то есть модифицированные (окисленные) основания и разрывы в одной из цепей модифицированные (окисленные) основания и разрывы в одной из цепей ДНКДНК

Система эксцизионной репарации нуклеотидов удаляет из ДНК объемные Система эксцизионной репарации нуклеотидов удаляет из ДНК объемные повреждения фотодимеры возникающие под действием повреждения фотодимеры возникающие под действием ультрафиолетового облучения объемные аддукты метаболитов ультрафиолетового облучения объемные аддукты метаболитов попадающих из окружающей среды таких как продукты сгорания курения попадающих из окружающей среды таких как продукты сгорания курения например антрацены и бензапиренынапример антрацены и бензапирены

Синтез ДНК через повреждениеСинтез ДНК через повреждение((Translesion synthesisTranslesion synthesis ndash TLS)ndash TLS)

В случае синтеза с использованием поврежденной ДНК-матрицы транслезионными (translesion) ДНК-полимеразами (например η ι κ θ μ ζ) также возникают искажения в структуре ДНК

TLS ДНК-полимеразы ведущие синтез через повреждение матрицы не обладают корректирующей активностью поскольку их задачей является ввести во чтобы то ни стало нуклеотидное звено дабы избежать остановки репликативной вилки на повреждении матрицы Затем поврежденный участок ДНК восстанавливается системами репарации

Мутации вводимые репликативными Мутации вводимые репликативными ДНК-полимеразами в ходе репликативного синтеза ДНК-полимеразами в ходе репликативного синтеза

играют не только вредную рольиграют не только вредную роль Мутации в ДНК являются движущей Мутации в ДНК являются движущей

силой эволюциисилой эволюции

• Slide 1
• Slide 2
• Slide 3
• Slide 4
• Slide 5
• Slide 6
• Slide 7
• Slide 8
• Slide 9
• Slide 10
• Slide 11
• Slide 12
• Slide 13
• Slide 14
• Slide 15
• Slide 16
• Slide 17
• Slide 18
• Slide 19
• Slide 20
• Slide 21
• Slide 22
• Slide 23
• Slide 24
• Slide 25
• Slide 26
• Slide 27
• Slide 28
• Slide 29
• Slide 30
• Slide 31
• Slide 32
• Slide 33
• Slide 34
• Slide 35
• Slide 36
• Slide 37
• Slide 38
• Slide 39
• Slide 40
• Slide 41

Механизм коррекции при репликации ДНКМеханизм коррекции при репликации ДНК

С помощью экзонуклеазной активности исправляются ошибки которые накапливаются в процессе биосинтеза Однако нарушения структуры ДНК могут возникать не только по причине неточной работы в ходе синтеза но и в результате внешних воздействий таких как ионизирующее и ультрафиолетовое облучение окислительный стресс

Возможна различная пострепликационная коррекция структуры ДНКВозможна различная пострепликационная коррекция структуры ДНК(репарация)(репарация)

Система репарации ошибочно-встроенных нуклеотидов (Система репарации ошибочно-встроенных нуклеотидов (mismatch mismatch repairrepair) специально предназначена для удаления ошибок возникших в ) специально предназначена для удаления ошибок возникших в ДНК в ходе репликацииДНК в ходе репликации

Система эксцизионной репарации оснований исправляет повреждения в Система эксцизионной репарации оснований исправляет повреждения в ДНК возникающие в результате окислительного стресса то есть ДНК возникающие в результате окислительного стресса то есть модифицированные (окисленные) основания и разрывы в одной из цепей модифицированные (окисленные) основания и разрывы в одной из цепей ДНКДНК

Система эксцизионной репарации нуклеотидов удаляет из ДНК объемные Система эксцизионной репарации нуклеотидов удаляет из ДНК объемные повреждения фотодимеры возникающие под действием повреждения фотодимеры возникающие под действием ультрафиолетового облучения объемные аддукты метаболитов ультрафиолетового облучения объемные аддукты метаболитов попадающих из окружающей среды таких как продукты сгорания курения попадающих из окружающей среды таких как продукты сгорания курения например антрацены и бензапиренынапример антрацены и бензапирены

Синтез ДНК через повреждениеСинтез ДНК через повреждение((Translesion synthesisTranslesion synthesis ndash TLS)ndash TLS)

В случае синтеза с использованием поврежденной ДНК-матрицы транслезионными (translesion) ДНК-полимеразами (например η ι κ θ μ ζ) также возникают искажения в структуре ДНК

TLS ДНК-полимеразы ведущие синтез через повреждение матрицы не обладают корректирующей активностью поскольку их задачей является ввести во чтобы то ни стало нуклеотидное звено дабы избежать остановки репликативной вилки на повреждении матрицы Затем поврежденный участок ДНК восстанавливается системами репарации

Мутации вводимые репликативными Мутации вводимые репликативными ДНК-полимеразами в ходе репликативного синтеза ДНК-полимеразами в ходе репликативного синтеза

играют не только вредную рольиграют не только вредную роль Мутации в ДНК являются движущей Мутации в ДНК являются движущей

силой эволюциисилой эволюции

• Slide 1
• Slide 2
• Slide 3
• Slide 4
• Slide 5
• Slide 6
• Slide 7
• Slide 8
• Slide 9
• Slide 10
• Slide 11
• Slide 12
• Slide 13
• Slide 14
• Slide 15
• Slide 16
• Slide 17
• Slide 18
• Slide 19
• Slide 20
• Slide 21
• Slide 22
• Slide 23
• Slide 24
• Slide 25
• Slide 26
• Slide 27
• Slide 28
• Slide 29
• Slide 30
• Slide 31
• Slide 32
• Slide 33
• Slide 34
• Slide 35
• Slide 36
• Slide 37
• Slide 38
• Slide 39
• Slide 40
• Slide 41

Синтез ДНК через повреждениеСинтез ДНК через повреждение((Translesion synthesisTranslesion synthesis ndash TLS)ndash TLS)

В случае синтеза с использованием поврежденной ДНК-матрицы транслезионными (translesion) ДНК-полимеразами (например η ι κ θ μ ζ) также возникают искажения в структуре ДНК

TLS ДНК-полимеразы ведущие синтез через повреждение матрицы не обладают корректирующей активностью поскольку их задачей является ввести во чтобы то ни стало нуклеотидное звено дабы избежать остановки репликативной вилки на повреждении матрицы Затем поврежденный участок ДНК восстанавливается системами репарации

Мутации вводимые репликативными Мутации вводимые репликативными ДНК-полимеразами в ходе репликативного синтеза ДНК-полимеразами в ходе репликативного синтеза

играют не только вредную рольиграют не только вредную роль Мутации в ДНК являются движущей Мутации в ДНК являются движущей

силой эволюциисилой эволюции

• Slide 1
• Slide 2
• Slide 3
• Slide 4
• Slide 5
• Slide 6
• Slide 7
• Slide 8
• Slide 9
• Slide 10
• Slide 11
• Slide 12
• Slide 13
• Slide 14
• Slide 15
• Slide 16
• Slide 17
• Slide 18
• Slide 19
• Slide 20
• Slide 21
• Slide 22
• Slide 23
• Slide 24
• Slide 25
• Slide 26
• Slide 27
• Slide 28
• Slide 29
• Slide 30
• Slide 31
• Slide 32
• Slide 33
• Slide 34
• Slide 35
• Slide 36
• Slide 37
• Slide 38
• Slide 39
• Slide 40
• Slide 41

Мутации вводимые репликативными Мутации вводимые репликативными ДНК-полимеразами в ходе репликативного синтеза ДНК-полимеразами в ходе репликативного синтеза

играют не только вредную рольиграют не только вредную роль Мутации в ДНК являются движущей Мутации в ДНК являются движущей

силой эволюциисилой эволюции

• Slide 1
• Slide 2
• Slide 3
• Slide 4
• Slide 5
• Slide 6
• Slide 7
• Slide 8
• Slide 9
• Slide 10
• Slide 11
• Slide 12
• Slide 13
• Slide 14
• Slide 15
• Slide 16
• Slide 17
• Slide 18
• Slide 19
• Slide 20
• Slide 21
• Slide 22
• Slide 23
• Slide 24
• Slide 25
• Slide 26
• Slide 27
• Slide 28
• Slide 29
• Slide 30
• Slide 31
• Slide 32
• Slide 33
• Slide 34
• Slide 35
• Slide 36
• Slide 37
• Slide 38
• Slide 39
• Slide 40
• Slide 41