СТАНДАРТИЗАЦИИ МЕТОДА ПРОТОЧНОЙ … - 2012/9.pdfХайдуков С.В....

Хайдуков С.В.

СТАНДАРТИЗАЦИИ МЕТОДА ПРОТОЧНОЙ ЦИТОМЕТРИИ ДЛЯ ИММУНОФЕНОТИПИРОВАНИЯ.

ПРАВИЛА ПОДГОТОВКА ПРОТОКОЛОВ И НАСТРОЙКИ ЦИТОМЕТРОВ ДЛЯ АНАЛИЗА

Хайдуков С.В., д.б.н.

-  ФГБУН Институт биоорганической химии им. акад. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Москва; -  ФГБУ Федеральный Научно-Клинический Центр детской гематологии, онкологии и иммунологии им. Дмитрия Рогачева, Минздравсоцразвития, Москва.

-


Что может привести к не качественному анализу?

1. Отсутствие правильной настройки проточного цитометра

2. Отсутствие правильной настройки протоколов анализа

3. Некачественные или просроченные регенты

4. Ошибки при подготовке образца для анализа


Необходимо для качественного анализа и контроля качества в Проточной Цитометрии.

• 1. Калибровка •  Использование латексных частиц для

проверки оптического выравнивания источника света.

•  Использование латексных частиц для контроля мощности источника света. • Делается как правило один раз в день или в случаях получения не корректных результатов.


Необходимо для качественного анализа и контроля качества в Проточной Цитометрии.

•  2. Контроль •  Контроль образца перед началом работы •  Изотипический контроль •  Контроль методологии и процесса анализа

Как правило выполняется каждый день или при изменениях в работе системы. Некоторые лаборатории выполняют с каждой партией, до и после нее. Проверка работы системы.


Установки светорассеяния

Низкое напряжение на PMT FS

Низкое напряжение на PMT SS

Высокое напряжение на PMT FS

Высокое напряжение на PMT SS

1

2 3

1.  Лимфоциты

2.  Моноциты

3.  Гранулоциты


Дискриминатор

Заниженное значение дискриминатора

Оптимальное значение дискриминатора

Завышенное значение дискриминатора


Низкое напряжение на PMT

Высокое напряжение на PMT

Оптимальное напряжение на PMT

Установки напряжения на фотоэлектронных умножителях (PMT)


5 цветов FITC/PE/ECD/PC5/PC7


Компенсация


Компенсация I


Компенсация II

Первое правило Компенсация 1 FL1 против FL2 Mean-канал региона D3 = D4 Компенсация 2 FL2 против FL1 Mean-канал региона D1 = D3

FL1

FL2


Как себя проверить?


Второе правило Если мысленно нарисовать линии из центров областей позитивных клеток, то они должны быть приблизительно параллельны осям X и Y или должен образоваться прямоугольник.

Компенсация III


Взаимосвязь между усилением напряжения на PMT и компенсацией

Не достаточное напряжение на PMT –

заниженные результаты анализа

Повышение напряжение на PMT без коррекции компенсации – не

достоверные результаты анализа

Повышение напряжение на PMT и коррекция компенсации

– достоверные результаты анализа

Повышение напряжения на одном из PМТ приводит к дополнительному вкладу интенсивности флуоресценции в

данный канал за счет других флуорохромов.


Взаимосвязь между плотностью экспрессии маркеров и компенсацией


Аутофлуоресценция A = до B = после антибиотиков


Выбор зоны анализа лимфоцитов по морфологическим параметрам

базофилы


Второе логическое ограничение В

Алгоритм выбора зоны анализа лимфоцитов при использовании логических ограничений по CD45 и

морфологическим параметрам. Последовательное внесение логических ограничений в

морфологическую гистограмму I. Выделение зоны

лимфоцитов по CD45

Анализ клеток одновременно попадающих в зоны А и В

Лимфоциты CD45bright

дуплеты

разрушенные клетки

Первое логическое ограничение А


Алгоритм настройки протокола (ручной вариант) для многоцветного анализа при использовании CD45 для выбора зоны лимфоцитов

ПРИМЕР. Комбинация моноклональных антител и

флуорохромов CD8-FITC, CD38-PE, CD45-ECD, CD3-PC5,

CD4-PC7


Алгоритм настройки протокола для многоцветного анализа при использовании CD45 (шаг 1)

Выбор зоны анализа лимфоцитов по алгоритму для CD45.


Настройка чувствительности каналов флуоресценции (негативные клетки должны находиться в 1-ой декаде)



Компенсация всех флуорохромов против флуорохрома, связанного с CD45 (негативные клетки должны находиться в 1-

ой декаде)



Компенсация остальных флуорохромов друг против друга, используя основные правила компенсации.



Компенсация всех флуорохромов против всех



•  Внутрилабораторная проверка •  Последовательная проверка

•  Количество клеток в гейте, которые являются лимфоцитами либо по морфологическим признакам, либо по CD45. Цель: > 95%

•  % CD3+ клеток в каждой пробирке +/- 3 % •  Процент лимфоцитов в образце, которые попадают в гейт по CD45. Либо по маркеру, который наиболее часто использован в данном анализе, например CD3. Цель: > 95 %

•  Контрольная сумма лимфоцитов •  (% CD3+ клеток + % CD19+ клеток + % CD3-CD16+/CD56+

клеток) в лимфоцитарном гейте = 100 % (+/- 5%) •  % CD3+/CD4+ клеток + % CD3+/CD8+ клеток ≈ % CD3+

клеток

Контроль качества Внутренний контроль качества


Контроль качества Внешний контроль качества

18

18

14

32

25

48

32

72

24

90

30

95

29

104

0102030405060708090

100110

2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010

Участие в разделе ФСВОК "Проточная цитофлуориметрия" по годам

не участвовали в предыдущих циклах всего участников


Контроль качества Внешний контроль качества

Контрольная сумма = %Т–клеток + %В-клеток + %NK-клеток ≈ 100 ± 5 %

Результат оценки качества цитометрических исследований по материалам ФСВОК (2004 – 2011 г.г.) Доля лабораторий с результатом

в диапазоне допустимых значений по контрольной сумме лимфоцитов (95-105%)

Доля результатов по контрольной сумме в диапазоне допустимых значений

60%

50%56%

59%66%

80% 83%77% 74%

86%78% 76%

86%91% 94%

83%88% 88%

0%10%20%30%40%50%60%70%80%90%

100%

1-04 2-04 1-05 2-05 1-06 2-06 1-07 2-07 1-08 2-08 1-09 2-09 3-09 1-10 2-10 3-10 1-11 2-11


СПАСИБО ЗА ВНИМАНИЕ

СТАНДАРТИЗАЦИИ МЕТОДА ПРОТОЧНОЙ … - 2012/9.pdfХайдуков С.В....

Documents