1028985 manual completo de inmunohematologia

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FACULTAD DE BIOANALISIS  LIC. QUIMICA CLINICA. NOMBRE: MIGUEL ANGEL ORTIZ GIL. INMUNOHEMATOLOGIA. CATEDRATICA: Q.C. RUTH ESTRADA MARQUEZ DIVULGACION CIENTIFICA DE LA QUIMICA CLINICA OBTENIDO DE: www.quimicaclinicauv.blogspot.com  1

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FACULTAD DE BIOANALISIS

LIC QUIMICA CLINICA

NOMBRE MIGUEL ANGEL ORTIZ GIL

INMUNOHEMATOLOGIA

CATEDRATICA QC RUTH ESTRADA MARQUEZ

DIVULGACION CIENTIFICA DE

LA QUIMICA CLINICA

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CONTENIDO

1 ldquoDETERMINACIOacuteN DE GRUPO SANGUIacuteNEO ABO Y RHrdquo

2 DETERMUNACION DE SUBGRUPOS

3 DETERMINACION DE RH

4 DETERMINACION DE GRUPO SANGUINEO POR TECNICA DE GEL

5 PRUEBA DE COMPATIBILIDAD

6 PRUEBA DE COMPATIBILIDAD SANGIacuteNEA (TEacuteCNICA SALINA)

7 PRUEBA DE COMPATIBILIDAD SANGUIacuteNEA (TEacuteCNICA ALBUMINA)

8 PRUEBA DE COMPATIBILIDAD SANGUINEA PRUEBA DE LISS

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9 DETERMINACION DE COOMBS DIRECTO

10IDENTIFICACION DE ANTICUERPOS IRREGULARES

Practica No 1

ldquoDeterminacioacuten de grupo sanguiacuteneo ABO y Rhrdquo

Introduccioacuten

Un grupo sanguiacuteneo es una forma de agrupar ciertas caracteriacutesticas de la sangre quedependen de los antiacutegenos presentes en la superficie de los gloacutebulos rojos y en el suero de lasangre

Esta ha sido la base para que se pueda clasificar a la sangre en cuatro grupos en cuanto alsistema ABO grupo A grupo AB grupo B y grupo O y en dos con respecto al sistema Rh Rhnegativo o Rh positivo Lo que a la postre trae ocho grupos posibles por las combinacionesposibles entre ambos sistemas

Las transfusiones de sangre entre grupos incompatibles pueden provocar una reaccioacuteninmunoloacutegica que puede desembocar en muerte

Las personas con sangre del tipo A tienen gloacutebulos rojos que expresan antiacutegenos de tipo A ensu superficie y anticuerpos contra los antiacutegenos B en el suero de su sangre

Las personas con sangre del tipo B tiene la combinacioacuten contraria gloacutebulos rojos con antiacutegenosde tipo B en su superficie y anticuerpos contra los antiacutegenos A en el suero de su sangre

Los individuos con sangre del tipo O no expresan ninguna de los dos antiacutegenos (A o B) en lasuperficie de sus gloacutebulos rojos pero pueden fabricar anticuerpos contra ambos tipos mientrasque las personas con tipo AB expresan ambos antiacutegenos en su superficie y no fabrican ninguno

de los dos anticuerpos

A causa de estas combinaciones el tipo O puede ser transfundido sin ninguacuten problema acualquier persona con cualquier tipo ABO y el tipo AB puede recibir de cualquier tipo ABO

Los donantes de sangre y los receptores deben tener grupos compatibles El grupo O- escompatible con todos por lo que quien tiene dicho grupo se dice que es un donante universalPor otro lado una persona cuyo grupo sea AB+ podraacute recibir sangre de cualquier grupo y sedice que es un receptor universal

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Material y equipo

bull 40 tubos de ensayo de 12 x 75

bull 4 pipetas Pasteur

bull 1 gradilla de unicel

bull 3 tubos Vacutiner con muestra sanguiacutenea anticoagulada con EDTA

bull 1 tubo Vacutainer con muestra sanguiacutenea sin anticoagulante

bull Antisuero Anti-A Anti-AB Anti-B y Anti-D

bull Eritrocitos con antiacutegenos conocidos A1 A2 B y O

bull 1 centrifuga

Reactivos

Antisuero A monoclonal Lafon Antisuero AB monoclonal LafonLote9662 Lote 8764Cad 09NOV08 Cad 31OCT08Aspecto transparente AspectotransparenteColor azul Color incoloro

Antisuero B monoclonal Lafon Antisuero D monoclonal NOVACLONE

Lote 9762A Lote NDMG04305Cad09NOV08 Cad 29MAR08Aspecto transperente Aspecto transperenteColor amarillo Color incoloro

Teacutecnica

Meacutetodo directo

1 Centrifugar los 3 tubos Vacutiner con muestra sanguiacutenea anticoagulada con EDTA y eltubo Vacutainer con muestra sanguiacutenea sin anticoagulante a una velocidad de 2500rpm por 10 minutos pues se utilizaran plasma y eritrocitos por separado

2 Rotular los tubos de ensayo de la siguiente manera en cada tubo rotular dos nuacutemeros

en la muestra uno correspondiente del 1 al 4 el otro numero corresponde al que yatraiacutea la muestra y con el tipo de antisuero Anti-A Anti-AB Anti-B oacute Anti-D Ejemplo 113 Anti-A 113 Anti-AB etc El procedimiento se repite para las tres muestrasrestantes

3 En cuatro tubos limpios hacer una dilucioacuten de 2-5 de eritrocitos con agua destiladade cada muestra La dilucioacuten tomara un color rojo tenue similar a la sangriacutea

4 Colocar en cada tubo rotulado una gota de la dilucioacuten de eritrocitos preparada y unagota de antisuero seguacuten corresponda

5 Al concluir lo anterior llevar los tubos a la centrifuga y centrifugar por solo 15 segundosa una velocidad de 1000 rpm para observar mejor la reaccioacuten antigeno-anticuerpo(formacioacuten de un botoacuten)

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6 Por ultimo leer los tubos observando si hubo reaccioacuten o no y correlacionando losdatos obtenidos con el meacutetodo inverso para determinar el grupo sanguiacuteneo

Metodo inverso

1 Centrifugar los 3 tubos Vacutiner con muestra sanguiacutenea anticoagulada con EDTA y eltubo Vacutainer con muestra sanguiacutenea sin anticoagulante a una velocidad de 2500rpm por 10 minutos pues se utilizaran plasma y eritrocitos por separado

2 Rotular los tubos de ensayo de la siguiente manera en cada tubo rotular dos nuacutemeros

en la muestra uno correspondiente del 1 al 4 el otro numero corresponde al que yatraiacutea la muestra y con el tipo de eritrocitos con antigeno conocido A 1 A2 B y OEjemplo 113 A1 113 A2 etc El procedimiento se repite para las tres muestrasrestantes

3 Colocar en cada tubo rotulado dos gotas ya sea de plasma o suero seguacuten corresponday una gota de los eritrocitos con antigeno conocido

4 Al concluir lo anterior llevar los tubos a la centrifuga y centrifugar por solo 15 segundos

a una velocidad de 1000 rpm para observar mejor la reaccioacuten antigeno-anticuerpo(formacioacuten de un botoacuten)

5 Por ultimo leer los tubos observando si hubo reaccioacuten o no y correlacionando losdatos obtenidos con el meacutetodo inverso para determinar el grupo sanguiacuteneo

Resultados

Muestra Meacutetodo directo Meacutetodo inverso

Anti-A Anti-AB Anti-B Anti-D A1 A2 B O

Grupo y

Rh1 - - - + + + + - O +

2 - + + + + + - - B +

3 + + - + - - + - A +

4 + + + + + - - - AB +

InterpretacioacutenPara el meacutetodo directo la loacutegica fue si en un tubo hay formacioacuten de botoacuten (reaccioacuten antigeno-anticuerpo) quiere decir que los eritrocitos ensayados tienen el antigeno que reacciona con losanticuerpos presentes en el antisuero para ese tubo y si no presentan aglutinacioacuten querraacutedecir que no corresponde el antigeno del eritrocito con el anticuerpo del antisuero o que el

antigeno esta ausente en esos eritrocitos De ahiacute que pueda observarse que una muestrasanguiacutenea muestre un solo tipo de antiacutegenos del sistema ABO sobre su membrana (A o B)ambos antiacutegenos (AB) o ninguno de ellos (O) lo mismo sucede para el sistema Rh alpresentarlo (Rh +) o no (Rh -)Para el meacutetodo inverso el razonamiento fue si en un tubo hay formacioacuten del botoacuten (reaccioacutenantigeno-anticuerpo) quiere decir que el plasma del paciente ensayado tiene los anticuerposque reaccionan con los eritrocitos con antigeno conocido los cuales sirven de reactivo paraesta prueba Por lo tanto una reaccioacuten positiva en este meacutetodo definitivamente indica que elpaciente no tiene eritrocitos con antiacutegenos que reaccionariacutean con los anticuerpos de su plasmaDe ahiacute que el meacutetodo se le nombre inverso

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ConclusioacutenConcluyo que Para realizar una transfusioacuten sanguiacutenea se debe tomar en cuenta la sangre deldonante y la del receptor Los individuos pertenecientes al grupo O pueden donar sangre acualquier otro grupo sanguiacuteneo porque sus eritrocitos carecen de antigeno que puedan ser reconocidos por la sangre del receptor Las personas del grupo AB pueden recibir sangre decualquier grupo ya que carecen de anticuerpos

PRACTICA Nordm 2DETERMUNACION DE SUBGRUPOS

Anti- A1 Lectina(Dolichos biflorus)

Lectina de grupo sanguiacuteneo

INTRODUCCION

El sistema de grupos sanguiacuteneos ABO sigue siendo el primeroa tener en cuenta en el momento de realizar una transfusioacutende sangre Los antiacutegenos A y B son productos geacutenicosfaacutecilmente detectables y constituyen marcadoresgeneacuteticos de gran valor Entre los individuos A se

distinguen 2 categoriacuteas A1y A2

La diferenciacioacuten entre ambas se realiza mediante lautilizacioacuten de anticuerpos monoclonales y lectinasespeciacuteficas de grupo sanguiacuteneo Dolichos biflorus (anti A1)y Ulex europaeus (anti H)

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Uso Inmucor anti-A1 Lectin se utiliza para diferenciar ceacutelulas rojas A1 de otros

subgrupos A en pruebas en tubo o en placa

MATERIAL Y EQUIPObull Tubos de ensaye de 1075 mm

bull Cronometro

bull Marcador

bull Centrifuga seroloacutegica

MUESTRA BIOLOGICAbull Ceacutelulas rojas de donador o paciente

REACTIVObull Inmucor anti-A1 Lectin en gotero

MARCA INMUCOR INC

LOTE SN2132

CADUCIDAD 2007-12-14

TECNICA

1 Adicione una gota de anti-A1 a tubos adecuadamente marcados

2 Adicione una gota de una suspensioacuten de eritrocitos bajo prueba del 3-5 en

salina Mezcle completamente el contenido del tubo

3 Centrifugar de 15-30 minutos de 900-1000 rpm

4 Agite suavemente el tubo y resuspenda el botoacuten celular Examine las reacciones

resultantes macroscoacutepicamente Registre resultados

RESULTADOS ESPERADOS DE TIPIFICACION

GRUPOSANGUINEO

Anti-A Anti-A1 Porciento

A1 + + 80 DE TODOSLOS GRUPOS A

A1b + + 80 DE TODOSLOS GRUPOS AB

A2 + 0 20 DE TODOSLOS GRUPOS A

A2B + 0 20 DE TODOSLOS GRUPOS AB

A1NT + +DEBIL NO COMUNA3AM1AX1 + DEBIL 0 NO CUMUN

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ANTI-H (LECTINA)

Ulex europeaus

Para la determinacioacuten de del estado secretor y tipificacioacuten de las ceacutelulas rojas

INTRODUCCIONLa mayoriacutea de los grupos sanguiacuteneos ABO que se determinanen el banco de sangre cumplen con las leyes establecidas deantiacutegenos y anticuerpos reciacuteprocos para ese sistema

Los anticuerpos del sistema ABO existen en el individuodesde el momento en que son capaces de tener una respuestainmunoloacutegica y se producen contra los antiacutegenos A y B

Los subgrupos son fenotipos ABO que difieren en la cantidad

de antiacutegeno presente en los eritrocitos y en la saliva delos secretores Se hallan con mayor frecuencia y tienen maacutesrelevancia cliacutenica los de A que los de B Al utilizarlectinas se definen los subgrupos A1 y A2 con el extractode Dolichos biflorus se aglutinan los eritrocitos A1 perono los de A2 y el anti H semilla Ulex europeus aglutinaeritrocitos que tienen antiacutegeno H

MATERIAL Y EQUIPObull Tubos de ensaye de 1075mm

bull Cronometro

bull Marcador

bull Centrifuga seroloacutegica

MUESTRA BIOLOGICAbull Ceacutelulas rojas de donador o paciente

REACTIVObull Inmucor anti-H (Lectina) en gotero

MARCA GANMA

LOTE ML1581

CADUCIDAD 2007-11-14

TECNICA

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1 Adicione una gota de una suspensioacuten de eritrocitos bajo prueba del 3-5 en

salina en tubos adecuadamente marcados

2 Adicione dos gotas de anti-H Lectina y mezcle completamente el contenido del

tubo

3 incube durante 5 minutos a temperatura ambiente

4 Centrifugar de 15-30 minutos a 1000 rpm5 Agite suavemente el tubo y resuspenda el botoacuten celular Examine las reacciones

resultantes macroscoacutepicamente Registre resultados

INTERPRETACIOacuteN

PROBLEMA ANTI A1 ANTI H

(ANTI A2)

RESULTADO

SUBGRUPO

PACIENTE 1 + - ANTI A1

PACIENTE 2 - + ANTI A2

bull Prueba positiva Aglutinacioacuten de las ceacutelulas rojas

Nota La hemoacutelisis no debe interpretarse como un resultado positivo ya que esto

puede indetificarse como contaminacioacuten del reactivo

bull Prueba negativa Ausencia de aglutinacioacuten de las ceacutelulas rojas

CONCLUSIONES

Concluyo que para realizar unatransfusioacuten sanguiacutenea se debe tomar encuenta los subgrupos del donante y del

receptor Los subgrupo con mayorfrecuencia y tienen maacutes relevanciacliacutenica los de A que los de B Y seidentifican por medio de utilizarlectinas Los subgrupos A maacutesimportantes son A1 y A2

PRACTICA 3DETERMINACION DE Rh

INTRODUCCIOacuteN

El factor Rh es una clase de proteiacutena que se encuentra enlos gloacutebulos rojos de la sangre cuando alguien tiene esaproteiacutena se le considera ldquoRh Positivordquo Cuando no la tienees ldquoRh Negativordquo El factor Rh es hereditario y setransmite en dos genes El Factor Rh positivo es dominantees decir si una persona tiene un gen positivo y otronegativo su factor Rh seraacute positivo

Esta prueba es importante en el diagnostico y estudio

de la eritroblastosis fetal en la que los gloacutebulosrojos del nintildeo se encuentran sensibilizados con

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anticuerpo materno Es uacutetil tambieacuten en el diagnosticode la anemia hemoliacutetica adquirida (anticuerpos sobrelos gloacutebulo rojos del mismo paciente) asiacute como ladeterminacioacuten de eritrocitos sensibilizados en sangreusados para transfusioacuten

Las dos clasificaciones maacutes importantes para describirgrupos sanguiacuteneos en humanos son los antiacutegenos y el factorRh Las transfusiones de sangre entre grupos incompatiblespueden provocar una reaccioacuten inmunoloacutegica que puededesembocar en hemoacutelisis anemia fallo renal shock omuerte

MATERIAL

bull Tubos de ensayo de 12 x 75

bull Pipetas Pasteur

bull Gradilla

EQUIPO

bull Centrifuga

MUESTRA BIOLOacuteGICA

bull Eritrocitos lavados 3-5 del paciente

REACTIVOS

bull Antisuero Anti-D

bull Suero anti globulina humanabull Suero reactivo control

Antisuero D monoclonal NOVACLONELote NDMG04305CAD 29MAR08Aspecto transparenteColor incoloroSuero anti globulina HumanaLote 405CAD 06-NOV-08Aspecto transparenteColor verde

Reactivo control GAMMA-CLONELote GCM115-3CAD 2008-12-08Aspecto transparenteColor incoloro

TEacuteCNICA

Determinacioacuten de Rh

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bull Prepare una suspensioacuten de gloacutebulos rojos al 3-5 en solucioacuten salina Los gloacutebulos deben serlavados previamente 5 veces con el objeto deeliminar las proteiacutenas del plasma

bull Rotular 3 tubos para la previa identificacioacuten

de Rhbull Ponga 1 gota de la suspensioacuten lavada en cada

tubo

bull Antildeada una gota de anti suero D monoclonal

bull Mezcle y centrifugue 15 seg Y observe si hayaglutinacioacuten

Preparacioacuten del control negativo

bull Ponga una gota de eritrocitos lavados al 3-5

bull Antildeada una gota de reactivo control

bull

Centrifugue 15 seg y observe si hay aglutinacioacuten

Deteccioacuten de sangre Du

Nota esta teacutecnica se le realizo a los tubos problemasque no aglutinaron

bull Los tubos que no tuvieron aglutinacioacuten en ladeterminacioacuten de Rh se incuban 15 min yposteriormente se lavan 3 veces con sol Salina

bull Previamente lavados se le agregan 2 gotas de suerode COOMBS

bull Centrifugar 15 seg y observar desprender boton

ESQUEMAS

RESULTADOS problemas Aglutinacioacuten resultado2 positiva Rh +10 negativa Rh -11 negativa Rh -

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Paciente 2 coacutedigo 021612 plata Lugo JavierPaciente 10 coacutedigo 021620 Hernaacutendez Loacutepez GuillermoPaciente 11 coacutedigo 021621 camarillo Sonia rebeca

INTERPRETACIOacuteNPara el primer meacutetodoAglutinacion Rh positivoNo aglutinacioacuten realizar prueba de deteccioacuten desangre Du

Deteccioacuten de sangre DuAglutinacioacuten D deacutebil (Du positivo)No aglutinacioacuten Rh negativo

CONCLUSIONESCon el descubrimiento del sistema Rh se denominan Rhpositivos los hematiacutees que son aglutinados por esteanticuerpo y tienen por tanto el antiacutegeno Rh en lasuperficie Se denominan Rh negativos los que no sonaglutinados y que por tanto no poseen el antiacutegeno Rh ensu superficie

De la misma manera que en el sistema ABO en el sistema Rh

no se puede transfundir el antiacutegeno Rh a las personas queno lo tienen ya que podriacutea originar la produccioacuten deanticuerpos Rh en el receptor Los sujetos Rh negativossoacutelo podraacuten recibir sangre de donantes Rh negativos

PRACTICA 4INMUNOHEMATOLOGIA

DETERMINACION DE GRUPO SANGUINEO POR TECNICA DE GEL

INTRODUCCION

El sistema utilizado en inmunohematologiacutea para investigar e identificar antiacutegenos y

anticuerpos antieritrocitarios Es de tecnologiacutea de microtipificacioacuten en gel se basa en la

separacioacuten por tamantildeo de los eritrocitos aglutinados durante un proceso de

centrifugacioacuten en un gel poroso

Los eritrocitos van perdiendo elasticidad en sus membranas de forma que los

aglutinados grandes quedan atrapados en la zona superior y los pequentildeos quedan

distribuidos a lo largo de la columna

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Esta teacutecnica nos permite que estandaricemos la lectura de la reaccioacuten antiacutegeno-

anticuerpo con facilidad y repetitividad Asiacute como la estandariza del uso de reactivos

tiempos y lecturas disminuyendo sustancialmente la influencia de la mano de operador

OBJETIVO determinacioacuten de los antigenos del sistema ABORh (D) y determinacion

del grupo serico en tecnica de gel

FUNDAMENTOS

El principio del metdo se basa en la tecnica de gel descrita por Y Lapierre para la

deteccion de las reacciones de aglutinacion de los hematies La aglutinacion se produce

al entar en contacto los eritrocitos con los anticuerpos correspondientes

La tarjeta DG gel es un soporte de plastico constituidos por 8 microtubulos Cada

microtubulo esta formado por una columna y una camara de dispersionincubacion

La tecnologiacutea de microtipificacioacuten en gel se basa en la separacioacuten por tamantildeo de los

eritrocitos aglutinados durante un proceso de centrifugacioacuten en un gel poroso

Los eritrocitos van perdiendo elasticidad en sus membranas de forma que los

aglutinados grandes quedan atrapados en la zona superior y los pequentildeos quedan

distribuidos a lo largo de la columna

MATERIAL

Pipeta automaacutetica 10 ul 50ul 1 ml

Puntas de pipeta desechable Tubos de vidrios

DEG sol

Centrifugas para tarjetas DG gel

Hematies de reactivos para grupo inverso

MUESTRA BIOLOGICACeacutelulas rojas de donador o paciente

REACTIVO

Placa de gelReactivo de gel sol

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TECNICA1- determinacion de los antigenos del sistema ABORh

-preparar una suspension de hematies al 5 de DG sol Asegurar la resuspencion de lso

hematies antes de utilizar

Anadir en cada microtubulos indicados 10 ul de una suspension de hematies al 5

2- determinacion de l grupo serico-homogenizar los hematies recativos A1B

- dispersar el microtubulo N a1 50 ul de hematies reactivos A1 en un microtubulo Nb

50 ul de hematies reactivos B

-antildeadir suero o plasma

3- centrigugar en centrifuga para DG sol

Leer los resultados

RESULTADOS

NEGATIVO - Banda de hematies al fondo de la columna resto de la columna sin

aglutinados

POSITIVO

+- Escasoa glutinados de pequentildeo tamantildea d ela columna

1+ Algunos aglutinados pequentildeso en la columna

2+ aglutinados pequentildeso en la columna o mediano a lo largo de la columna

3+ Banda superior de aglutinado

4+ Banda de aglutinados en la parte superior de la columna

DP Doble poblacion (doble banda de hematies en el fondo y en la parte

superior

INTERPRETACION DE RESULTADOS

GRUPO HEMATICO GRUPO SERICOmicrotubo

Amicrotubo

Bmicrotubo

ABmicrotubo

CTL

MICROTUBUBON+ a1

MICROTUBUBON+ B

ABOGRUPO

0 0 0 0 + + 0+ 0 + 0 0 + A

0 + + 0 + 0 B

+ + + 0 0 0 AB

SISTEMA RhMicrutubo D Micrutubo

DrdquoMicrutuboCTL

INTERPRETACION

+ + 0 D positivo

0 0 0 D negativo

0 + 0

+ 0 0

D deacutebil parcial

RESULTADO E INTERPRETACION DE LA PRACTICA

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Resultado A+

CONCLUSION

Concluyo que esta teacutecnica es una forma de estabilizar las reacciones de aglutinacioacuten y

reducir los resultados falsamente negativos a consecuencia de una teacutecnica inapropiada

asi como crear un meacutetodo de interpretaciones sencillas y constantes

Practica No 5ldquoPrueba de compatibilidadrdquo

Introduccioacuten

Para requerir una oacuteptima transfusioacuten actualmente serequiere de aceptaciones inmunoloacutegicas receptor - donanteya que la transfusioacuten de sangre o la de sus componentescelulares de un donante a un receptor es una forma detransplante

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La prueba de Coombs se usa para determinar la presencia deanticuerpos no aglutinantes en el suero de sujetossensibilizados a uno o mas antiacutegenos sanguiacuteneos Es uacutetil enel estudio del suero de mujeres con isoinmunizacioacutenmaterno-fetal y se emplea tambieacuten en otro tipo de pruebas

como identificacioacuten de anticuerpos autoinmunes deteccioacutende algunos sistemas sanguiacuteneos y pruebas de compatibilidadsanguiacutenea

La prueba indirecta se realiza con eritrocitos normalesincubados in Vitro con el suero de estudio Durante esteperiodo si existe un anticuerpo este se fija sobre surespectivo determinante antigeacutenico Una vez fijados loseritrocitos son igualmente lavados y se agrega el reactivode Coombs produciendo aglutinacioacuten

Una prueba de Coombs indirecta positiva significa queexisten anticuerpos libres en el suero de la persona loscuales puedan ser igualmente auto-anticuerpos oisoanticuerpos

Material y equipo

bull Pipetas automaacuteticas de 10 microl 25 microl 50 microl y 1 ml

bull Puntas de pipetas desechables

bull Tubos de vidrio

bull Incubador para tarjetas DG Gel

bull Centrifuga para tarjetas DG Gel

Material bioloacutegico

bull Hematiacutees reactivo para investigacioacuten e identificacioacuten de anticuerpos irregulares de

Diagnostic Grifols SA

bull Suero de hemoclasificacioacuten

bull Muestras de sangre de extraccioacuten reciente recogida con anticoagulante o sin

anticoagulante

Reactivos

bull Tarjetas DG Gel

bull DG Gel Sol

Reactivos

Tarjetas DG Gel Coombs DG Gel SolRango de temperatura entre 2 y 25 ordmC Rango de temperatura entre 2 y 8ordmCLote 704901 Lote 7003701Cad 2008-03 Cad 2008-06Aspecto transparente Aspecto transparenteColor verde Color incoloro

TeacutecnicaMeacutetodo manual

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1 Dejar atemperar (18-25ordmC) muestras y reactivo2 Inspeccionar el estado de las tarjetas antes de utilizar3 Identificar las tarjetas y muestras a utilizar4 Despegar con precaucioacuten la lamina de metal que cubre los microtubos para prevenir

contaminaciones cruzadas entre ellos

5 Preparar una suspensioacuten con hematiacutees al 1 en DG Gel Sol (10 microl de sedimento oconcentrado de hematiacutees en 1 ml de DG Gel Sol) Utilizar los hematiacutees del donantepara la PC mayor y hematiacutees del receptor para la PC menor Asegurar la suspensioacuten delos hematiacutees antes de utilizar

6 Dispensar en el tubo correspondiente 50 microl de suspensioacuten de los hematiacutees al 1 deldonante (PC mayor) o 50 microl de suspensioacuten de los hematiacutees al 1 del receptor (PCmenor)

7 Antildeadir 25 microl de suero o plasma del receptor (PC mayor) o 25 microl de suero o plasma deldonante (PC menor)

8 Preparar auto control con 50 microl de suspensioacuten de los hematiacutees al 1 del receptor y 25microl de suero o plasma del receptor

9 Incubar 15 minutos a 37 ordmC10 Centrifugar en la centrifuga para tarjetas DG Gel

11 Leer los resultados

InterpretacioacutenNegativo - Banda de hematiacutees en el fondo de la columna resto de la columna sin aglutinados visibles

Positivo +- Escasos aglutinados de pequentildeo tamantildeo en la mitad inferior de la columna

1+ Algunos aglutinados de pequentildeo tamantildeo en la columna

2+ Aglutinados de tamantildeo pequentildeo o mediano a lo largo de la columna

3+ Banda superior de aglutinados de tamantildeo mediano en la mitad superior de la columna

4+ Banda de hematiacutees aglutinados en la parte superior de la columna

DP Doble poblacioacuten (doble banda de hematiacutees en el fondo y en la parte superior de la columna

Resultados

Paciente Lira Cabrera Carlos Alberto (AB+)Donador 1 Orea Valero Erasmo (A+)Donador 2 Moreno Adolfo (O+)

M1 m1 M2 m2 AutocontrolGR de donador 1 +suero del paciente

GR del paciente +suero de donador 1

GR de donador 2 +suero del paciente

GR del paciente +suero de donador 2

GR del paciente +suero del paciente

- + - + -

Por lo antes expuesto se puede deducir que el donador 1 (A+) puede donar eritrocitos al

paciente (AB+) lo mismo que el donador 2 (O+) puede donarle eritrocitos no asiacute plasma por parte de ambos donadores pues la prueba muestra que hubo reaccioacuten en ambas pruebasmenores

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Conclusioacuten

Concluyo que es esencial que toda la sangre sea estudiadaantes de la transfusioacuten para Asegurar que todos losgloacutebulos rojos transfundidos son compatibles con losanticuerpos en el plasma del paciente Evitar estimular laproduccioacuten de nuevos anticuerpos contra los gloacutebulos rojosen el receptor especialmente anti-Rh D

PRAacuteCTICA No 6PRUEBA DE COMPATIBILIDAD SANGIacuteNEA

(Teacutecnica salina)

INTRODUCCIOacuteN

Landsteiner constatoacute que cuando un aglutinoacutegeno se pone

en contacto con la aglutinina homoacuteloga se produce unaaglutinacioacuten

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La compatibilidad sanguiacutenea es la posibilidad de mezclade sangre sin que se produzcan trastornos tales como losfenoacutemenos de la lisis o de la aglutinacioacuten

A causa de este fenoacutemeno bioloacutegico en las transfusiones

de sangre no es suficiente con conocer que la sangre deldonante y la del receptor son del mismo grupo o bien quela del donante pertenezca al grupo O (cero) sino que esnecesario conocer si la compatibilidad es perfecta porqueninguacuten otro fenoacutemeno de inmunizacioacuten interfiera Es eneste sentido por lo que son empleadas las pruebascruzadas

Ademaacutes de los 6 antiacutegenos del sistema ABO en loseritrocitos humanos existen numerosos sistemas deaglutinoacutegenos que contienen muchos antiacutegenos individuales

en los eritrocitos (maacutes de 500000 millones posibles defenotipos de grupos sanguiacuteneos conocidos) Para evitaraccidentes transfusionales es indispensable tener encuenta el sistema Rh ademaacutes del ABO

Del sistema de antiacutegenos Rh es el D el maacutes antigeacutenico yel teacutermino Rh positivo indica que el individuo presentaaglutinoacutegeno D El individuo Rh negativo no tiene antiacutegenoD y forma la aglutinina anti-D en contacto con eacuteste

Las reacciones antiacutegeno-anticuerpo pueden observarse in

vitro por

mdash Hemoacutelisis la unioacuten antiacutegeno-anticuerpo se traduce enlisis de los eritrocitos en presenciadel complemento (siempre que el anticoagulante empleado nocapture losiones Ca y Mg necesarios para la activacioacuten delcomplemento) mdash Aglutinacioacuten los anticuerpos que reaccionan en mediosalino se conocen comoanticuerpos completos o aglutinantes (comuacutenmente tipo

IgM)

OBJETIVO Determinacioacuten de los antigenos del sistema ABORh (D) y su compatibilidad entre un paciente Donador y unPaciente Receptor

MATERIAL5 Tubos de ensaye6 Pipetas Pasteur

1Gradilla1 Bulbo

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EQUIPOMicrocentriacutefugaBantildeo Mariacutea oacute Estufa

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Papel Parafilm

MUESTRA Muestra de sangre con Anticoagulante EDTA

REACTIVOSAntisuero RO-Antiglobulina humana (Poliespeciacutefico Anti IgG C-d) Para prueba de CoombsLABORATORIOS LAFON SA de C VFecha de Caducidad 31-Ene-09Lote 406Hecho en MeacutexicoAspecto TransparenteColor Verde

TEacuteCNICA

Lavar los eritrocitos con solucioacuten salina (3 veces)

SALINA RAacutePIDA1 Agregar una gota de Eritrocitos Lavados2 Diluirlo al 3-5 con solucioacuten salina 093 Agregar 2 gotas de suero4 Centrifugar y observar anotar desprendimiento del botoacuten

SALINA 37deg BANtildeO MARIacuteA

1 Incubar tubos a Bantildeo mariacutea a 37degC durante 1hora (o 20 min)2 Centirfugar despueacutes de haber pasado el

tiempo3 Desprender el botoacuten de eritrocitos y

observarAGLUTINACIOacuteNndash No es compatibleNO AGLUTINACIOacuteN - Lavar 3 veces

SALINA COOMBS

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PRUEBA MAYOR

G Rojos del DONADOR+

Suero del RECEPTOR(paciente)

PRUEBA MENOR

G Rojos del RECEPTOR(paciente)

+Suero del DONADOR

AUTOTESTIGO

G Rojos del RECEPTOR(paciente)

+Suero del RECEPTOR

(paciente)

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1 Con solucioacuten salina 09 lavar loseritrocitos de los tubos q no tuvieronaglutinacioacuten 3 veces

2 Decantar y agregar 2 gotas de reactivode Coombs

AGLUTINACIOacuteN ndash No es compatibleNO AGLUTINACIOacuteN - Lavar 3 veces

RESULTADOS

Paciente Madrigal Meacutendez Luis Eduardo (B+)Folio 009164Fecha301007

Donador 1 Torres Avileacutes Joseacute Ramoacuten (O+)Folio 022604Fecha311007

Donador 2 Rodriacuteguez Nuacutentildeez Joseacute Angel (A+) Folio 022605

Fecha311007

SALINA RAacutePIDA

M1 m1 M2 m2 AutotestigoGR de donador 1+ suero del

paciente

GR del paciente+ suero dedonador 1

GR de donador 2+ suero del

paciente

GR del paciente+ suero dedonador 2

GR del paciente+ suero del

paciente

- 4+ 4+ 4+ -

SALINA 37deg BANtildeO MARIacuteA

M1 m1 M2 m2 Autotestigo- 4+ 4+ 4+ -

Compatible Nocompatible

Nocompatible

Nocompatible

Compatible

SALINA COOMBS

Por lo tanto se puede decir que el donador 1 (O+) puededonar suero al paciente (B+) debido a que en el suero nohay anticuerpos de ninguacuten tipo que reaccionen con losantiacutegenos de los eritrocios del Donador 1 Mientras tantoel Donador 2 no puede donar al Paciente ni suero nieritrocitos

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M1 Autotestigo- -

Compatible

Compatible

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INTERPRETACIOacuteN

PRUEBA POSITIVA Existe una aglutinacioacuten de lasceacutelulas sanguiacuteneas que indica la presencia delantiacutegeno A o B En el suero de Coombs notamos si esta

la precencia de Antiacutegeno D en los eritrocitos Lahemoacutelisis no se debe interpretar como resultadopositivo ya que puede indicar contaminacioacuten delreactivo

PRUEBA NEGATIVA La no aglutinacioacuten indica unresultado negativo e indica que las ceacutelulas sonnegativas para Antiacutegenos del sisitema ABO y D

CONCLUSIOacuteN

He concluido que en las transfusiones de sangre no essuficiente con conocer que la sangre del donante y la delreceptor son del mismo grupo o bien que la del donantepertenezca al grupo O (cero) sino que es necesarioconocer si la compatibilidad es perfecta porque ninguacutenotro fenoacutemeno de inmunizacioacuten interfiera Es en estesentido por lo que son empleadas las pruebas cruzadas

Praacutectica No 7ldquoPrueba de compatibilidad sanguiacutenea (teacutecnica albumina)rdquo

IntroduccioacutenLa tipificacioacuten de sangre identifica el tipo sanguiacuteneo determinandoantiacutegenos presentes en los eritrocitos detecta aloanticuerpos encontra esos antiacutegenos Asiacute los aloanticuerpos pueden aparecernaturalmente o ser inducidos y pueden ser dirigidos contra del grupoconocido o a los antiacutegenos de superficie de los eritrocitos La prueba

de compatibilidad sanguiacutenea o cross matching esta formada por laprueba mayor y menorLa prueba de cruzamiento mayor para losaloanticuerpos consiste en probar el plasma del receptor contra los

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gloacutebulos rojos del donante Es incompatible cuando se genera unareaccioacuten hemoliacutetica los eritrocitos del donante se destruyen por losaloanticuerpos del plasma del receptor La prueba menor es una pruebapara los aloanticuerpos del plasma del donante en contra los gloacutebulosrojos del receptor Una incompatibilidad menor es una causa menosfrecuente para causar una reaccioacuten en contra una transfusioacuten porque

el volumen de plasma del donante es menor y es diluido marcadamente enel receptor Para llevar a cabo dicho procedimiento se utilizandiversos reactivos como potencializadores que mejoran la unioacuten deeritrocitos con alguacuten tipo de anticuerpo Uno de esospotencializadores es la albuacutemina La albumina bovina polimerizada esun reactivo muy utilizado en el laboratorio de inmunohematologia y encentros de bancos de sangre funciona como un potencializador quefacilita la reaccion de aglutinacioacuten de eritrocitos sensibilizados Alfinal de la prueba se prueban los eritrocitos con el reactivo deCoombs El principio de la prueba de Coombs fue descrito por Moreschien 1908 pero Coombs Mourant y Race en 1946 la introdujeron en elestudio de los grupos sanguiacuteneos y anticuerpos cuando una parte desangre (suero) fue usada para la inoculacioacuten de animales para

inmunizarlos con proteiacutena humana utilizando el anticuerpo obtenido enla deteccioacuten de los llamados anticuerpos incompletos Esta prueba seusa para determinar la presencia de anticuerpos no aglutinantes en elsuero de sujetos sensibilizados a uno o mas antiacutegenos sanguiacuteneos Esuacutetil en el estudio del suero de mujeres con isoinmunizacioacuten materno-fetal y se emplea tambieacuten en otro tipo de pruebas como identificacioacutende anticuerpos autoinmunes deteccioacuten de algunos sistemas sanguiacuteneos ypruebas de compatibilidad sanguiacutenea La prueba indirecta se realizacon eritrocitos normales incubados in Vitro con el suero de estudioDurante este periodo si existe un anticuerpo este se fija sobre surespectivo determinante antigeacutenico Una vez fijados los eritrocitosson igualmente lavados y se agrega el reactivo de Coombs produciendoaglutinacioacuten Una prueba de Coombs indirecta positiva significa que

existen anticuerpos libres en el suero de la persona los cualespuedan ser igualmente auto-anticuerpos o isoanticuerpos

Objetivo Determinacioacuten de los antiacutegenos del sistema ABO Rh (D) y sucompatibilidad entre un paciente Donador y un Paciente Receptor

Material y equipo

5 Tubos de ensaye

6 Pipetas Pasteur

1Gradilla

1 Bulbo

Papel Parafilm

Microcentriacutefuga

Bantildeo Mariacutea oacute Estufa

Material bioloacutegico

Muestras de sangre de extraccioacuten reciente recogida conanticoagulante o sin anticoagulante

ReactivosSuero de CoombsAlbuacutemina bovina deg

Suero anti-globulina humana Lafon Lote 406 Cad 310109 Color verde Aspecto

transparentedegAlbumina de bovino polimerizada Interbiol Lote APO107 Cad 150109 Color incoloroAspecto transparente

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Teacutecnica

1 Montar prueba mayor 1 y 2 prueba menor 1 y 2 y autotestigocon el procedimiento ya anteriormente conocido

2 Agregar 2 gotas de albuacutemina al 223 Centrifugar 20 segundos4 observar aglutinacioacuten o hemolisis o no aglutinacioacuten5 A los tubos con lecturas negativas incubar 20 minutos en bantildeo

Mariacutea a 37 degC6 Centrifugar y observar

bull Aglutinacioacuten o hemoacutelisis reportar incompatible

bull No aglutinacioacuten llevar a Coombs

7 Lavar tres veces decantar y quitar el exceso de salina congasa y agregar 2 gotas de reactivo de Coombs y centrifugar 20segundos y observar

bull Aglutinacioacuten o hemoacutelisis reportar incompatible

bull No aglutinacioacuten reportar compatible

Resultados1 PRUEBA MAYOR 1 2 Gotas de suero del paciente + 1 gota de GR al 3-5 del

donador 12 PRUEBA MENOR 1 2 Gotas de suero del donador 1 + 1 gota de GR al 3-5 del

paciente3 PRUEBA MAYOR 2 2 Gotas de suero del paciente + 1 gota de GR al 3-5 del

donador 24 PRUEBA MENOR 2 2 Gotas de suero del donador 2 + 1 gota de GR al 3-5 del

paciente5 AUTOTESTIGO 2 Gotas de suero del paciente + 1 gota de GR al 3-5 del paciente

M1 m1 M2 m2 AutotestigoCon albuacutemina - - - - -Despueacutes de incubacioacuten a 37 degC - - - - -Despueacutes de Coombs - - - - -Despueacutes de validacioacuten con gloacutebulos

positivos+ + + + +

InterpretacioacutenPrueba positiva Alutinacioacuten o hemolisis Indica no compatibilidadPrueba negativaNo aglutinacioacuten Indica compatibilidad

Esquemas

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ConclusioacutenConcluyo que la prueba de compatibilidad sanguiacutenea en su modalidad conalbuacutemina bovina ofrece mucha ventaja al ser al igual que otrosreactivos un potencializador de la reaccioacuten antiacutegeno-anticuerpo Estopermite que el operador o realizador de la prueba tenga mayorconfianza y certeza en los resultados que obtenga

PRACTICA No 8PRUEBA DE COMPATIBILIDAD SANGUINEA PRUEBA DE LISS

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FUNDAMENTO

LISS es utilizado para reducir la fuerza ioacutenica del medio

de reaccioacuten en los procedimientos de deteccioacuten eidentificacioacuten de anticuerpos y en las pruebas decompatibilidad La presencia de este reactivo refuerza lainteraccioacuten antiacutegeno - anticuerpo durante la incubacioacuten

GENERALIDADESEl uso de solucioacuten salina de baja fuerza ioacutenica fuedescrito inicialmente en 1964 por Hughes-Jones y col y

Elliot y col pero en ese tiempo su uso era limitado yaque la concentracioacuten molar obtenida provocaba la hemoacutelisisde los eritrocitos suspendidos

En 1974 Low y Messeter describieron el uso rutinario de lasolucioacuten Liss de 003 M que lograba reducir el tiempo deincubacioacuten y no presentaba tendencia a la hemoacutelisis al sersuspendidos en salina a baja fuerza ioacutenica restableciendola presioacuten osmoacutetica de la solucioacuten mediante la adicioacuten deglicinaLas soluciones de baja fuerza ioacutenica son actualmente lasmaacutes utilizadas en inmunohematologiacutea provocando un aumentoen la velocidad de asociacioacuten entre antiacutegenos y anticuerpospermitiendo asiacute acortar el tiempo de incubacioacuten de 60minutos a 10-15 minutos sin sacrificar la sensibilidad delas mismas y sin costos elevadosSe ha observado que lasreacciones antiacutegeno-anticuerpo se ven potenciadas alreducir la fuerza ioacutenica del medio de reaccioacuten

La fuerza ioacutenica es uno de los factores maacutes importantes quedeterminan la tasa y la cantidad de captacioacuten deanticuerpos por parte de los eritrocitos El uso de mediosde reaccioacuten de baja fuerza ioacutenica permite disminuir eltiempo de incubacioacuten y potenciar las reacciones de losanticuerpos sin incrementar las reacciones inespeciacuteficas

Los iones Na+ y Cl- presentes en la solucioacuten salinafisioloacutegica se agrupan alrededor de las moleacuteculas deantiacutegeno y anticuerpo neutralizando sus cargas opuestas locual dificulta la unioacuten entre ellos Este efecto se reduceutilizando soluciones de baja fuerza ioacutenica y disminuyendode esta manera la incubacioacuten de las pruebas

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En esta etapa de sensibilizacioacuten las posibilidades deasociacioacuten pueden incrementarse mediante agitacioacutencentrifugacioacuten yo variacioacuten de la concentracioacuten delanticuerpo

Despueacutes de que el anticuerpo se ha fijado al antiacutegeno loseritrocitos sensibilizados deben unirse para dar lugar a laaglutinacioacuten visible esta red tambieacuten solidifica yestabiliza la reaccioacuten

En esta etapa la reaccioacuten depende de factores como lascaracteriacutesticas del anticuerpo localizacioacuten en la membranay nuacutemero de sitios antigeacutenicos fuerzas que mantienen ladistancia entre los eritrocitos

Las caracteriacutesticas del anticuerpo que deben considerarse

son el tamantildeo del anticuerpo involucrado y el nuacutemero desitios de combinacioacuten con el antiacutegeno Los anticuerpos IgMpueden establecer puentes entre los eritrocitos yaglutinarlos espontaacuteneamente en solucioacuten salina mientrasque los IgG no ya que las IgM pentameacutericas poseen 10sitios de combinacioacuten con el antiacutegeno y las IgG diacutemerossoacutelo dos sitios

Los eritrocitos tienen una carga neta negativa en susuperficie su interaccioacuten con los iones del medio alteraesta carga y producen una carga neta criacutetica denominada

potencial zeta y la reduccioacuten de dicha carga permite quelos eritrocitos se aproximen lo suficiente para que seanaglutinados por medio de los IgG que los sensibilizaron

Las soluciones de baja fuerza ionica empleadas en banco desangre tienen un pH entre 65 ndash 70 se recomienda unaosmolalidad de 270 ndash 305 mosmkg y una conductividad de 37mmcm El control diario implica el examen de su aparienciafiacutesica ausencia de turbidez particulas o sedimento asiacutecomo corroborar la capacidad para generar hemoacutelisiscrenacion o prueba de coombs positiva en eritrocitos

normales Cada lote nuevo se valora mediante el rastreo deun anticuerpo ya sea un anti- D un anti- jk anti- fy oanti- kell diluido se compara su capacidad de deteccioacutencontra un medio salino normal incubando 10min a 37ordmC enLISS debe poder rastrearse un anticuerpo en tanto que enmedio salino no

MATERIAL Y EQUIPO

Material Cantidad10 Tubos de ensayo de 12 x 75

1 Gradilla10 Pipetas pasteur

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1 Bulbo1 Marcador1 Microcentriacutefuga1 Bantildeo Mariacutea

MATERIAL BIOLOGICO

Gloacutebulos rojos lavados al 3 - 5Suero

REACTIVOS

Reactivo de LISSReactivo de Coombs

TECNICA1- Lavar los eritrocitos

Separar el suero del paquete de gloacutebulos rojos

Agregar cierta cantidad de eritrocitos a un tubo deensayo y agregarle solucioacuten salina

Centrifugar y decantar

Repetir este proceso 3 veces

2- Realizar la Prueba de LISS

Enumerar los tubos Poner dos gotas de LISS en cada tubo agregar una gota

de eritrocitos lavados y al 3 - 5 seguacuten el nuacutemero detubo correspondiente

Mezclar y centrifugar un minuto decantar elsobrenadante y con la ayuda de una gasa limpiar elexceso del reactivo

Poner nuevamente 2 gota de LISS resuspender poragitacioacuten agregar 2 gotas de suero problema mezclarincubar 15 minutos a 37ordm C centrifugar 30 seg A 1000

RPM Anotar los resultados

3- A las pruebas negativas realizar Coombs

Lavar 3 veces las ceacutelulas agregar suero de Coombscentrifugar 30 seg

Leer aglutinaciones y anotar resultados

REACTIVOS UTILIZADOS

REACTIVO MARCA FECHA DECADUCIDAD

ASPECTO COLOR LOTE

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SueroAntiglobuina

humana

Lafon 31 01 2009 Transparente Verde 406

LISS Caserorealizado enCMNSIGLOXXI

1 antildeo Transparente Transparente

----------

PACIENTE ASCANIO MENDEZ JOSUE O (+)DONADOR 1 GARCIA CARBAJAL OSCAR O (+)DONADOR 2 GARCIA SUAREZ ORLANDO A (+)

RESULTADOS

INTERPRETACIOacuteN DE LOS RESULTADOS

La hemoacutelisis o la aglutinacioacuten representan un resultado positivo e indican lapresencia de una reaccioacuten antiacutegeno-anticuerpo Los resultados negativos no severa aglutinacioacuten o hemolisis

ESQUEMAS

CONCLUSIONES

Concluyo que la prueba de compatibilidad sanguiacutenea en su modalidad conliss ofrece mucha ventaja al ser al igual que otros reactivos unpotencializador de la reaccioacuten antiacutegeno-anticuerpo Esto permite queel operador o realizador de la prueba tenga mayor confianza y certezaen los resultados que obtenga

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Tubo Resultado

M1 NEGATIVOm1 NEGATIVO

M2 POSITIVO

M2 NEGATIVO

AUTOTES NEGATIVO

29

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PRACTICA 9INMUNOHEMATOLOGIA

DETERMINACION DE COOMBS DIRECTO

INTRODUCCIONPRUEBA DE COOMBS DIRECTA

El examen de Coombs directo se utiliza para detectar autoanticuerpos contralos propios gloacutebulos rojos (GR) de un individuo Es una prueba que sirve parademostrar el revestimiento de los eritrocitos in vivo (mientras los eritrocitosestaacuten circulando en el individuo) La prueba se realiza agregando directamenteel reactivo de Coombs a los eritrocitos previamente lavados para eliminar otras proteiacutenas no fijadas a el una prueba directa positiva significa que larelacioacuten antiacutegeno-anticuerpo ocurrioacute in vivo es decir que la fijacioacuten del

anticuerpo sobre el antiacutegeno se realizo en el organismo del individuo enestudio

Las indicaciones principales de esta prueba son diagnostico de enfermedadeshemoliacuteticas ictericia o anomaliacuteas en la apariencia de los gloacutebulos rojos bajo elmicroscopio ya que estos anticuerpos algunas veces destruyen los gloacutebulosrojos y causan anemia para investigar reacciones en transfusiones Parainvestigar la induccioacuten de drogas en ceacutelulas rojas sensibilizadas medicamentos(por ejemplo quinidina metildopa procainamida y otros) que pueden llevar a la produccioacuten de estos anticuerpos

OBJETIVO Determinar la presencia de anticuerpos en la superficie de losgloacutebulos rojos del individuo

MATERIAL

bull 10 Tubos de 1275

bull 10 Pipetas Pasteur

bull 1 Gradilla

bull 1 Bulbo

bull Papel Parafilm

bull Microcentriacutefuga

bull Bantildeo Mariacutea a 37degC

MUESTRA BIOLOGICA

Eritrocitos lavados de (3-5) del donador o pacienteREACTIVO

Suero de CoombsSuero anti-globulina humana Lafon Lote 406 Cad 310109 Color verde Aspecto transparente

TECNICA

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Colocar en un tubo de ensaye dos gotas de suero de Coombs mas una gota deglobulos rojos (3-5)Centrifugar a 1000 rpm durante 20 segDesprender el boton suavemente y buscar la presencia de aglutinacionRotular y enumerar 8 tubos de ensayes con las diferentes diluciones

(frac12frac1418)Enumerar 8 tubos mas del 1 al 8Agregar a cada tubo de las diluciones 10 gotas de solucion salina mas 10 gotasde suero de CoombsColocar Al primer tubo de la dilucion 1 gota de globulos rojos (3-5) mezclar completamente y agregar al tubo 1Centrifugar todos los tubos a 1000 rpm durante 20 seg

LECTURA

Aglutina- Prueba de Coombs directa es positiva

No aglutina- Prueba de Coombs directa es negativa

ESQUEMAS y RESULTADOS

CONCLUCION

He concluido que la prueba de Coombs directa es una prueba que se utiliza para medir

la presencia de anticuerpos en la superficie de los gloacutebulos rojos que se encuentran

circulando en el paciente y se realiza para investigar reacciones en transfusiones ademaacutes

sirve para la determinacioacuten de anemia hemoliacutetica autoinmune entre otras afecciones

Practica 10

IDENTIFICACION DE ANTICUERPOS IRREGULARES

Fundamento

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DILUCIONES

frac12 positiva

frac14 positiva

18 positiva

116 negativa

132 negativa

164 negativa

1128 negativa1256 negativa

31

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Los anticuerpos del sistema ABO aparecen una vez que elindividuo entra en contacto con el medio ambiente y en elcual se encuentran microorganismos como algunas bacteriascoliformes que contienen sustancias quiacutemicas en suestructura parecidas a las de este sistema Por anticuerpos

regulares debemos identificar a los que existen en todoslos individuos y que eacutestos tendraacuten durante toda su vida

Los anticuerpos irregulares son los que no estaacuten de esamanera aunque en el caso de los naturales no se conoce aciencia cierta queacute o coacutemo se induce su produccioacuten Losadquiridos se conocen tambieacuten como inmunes y son elresultado de la exposicioacuten a antiacutegenos desconocidos por elindividuo al momento de la transfusioacuten o en las mujerespor el embarazo estos anticuerpos son dirigidos contraantiacutegenos de sistemas diferentes al ABO

Los anticuerpos naturales regulares son preferentementeinmunoglobulinas M las cuales fijan de manera taneficiente el complemento que pueden provocar lisisintravascular y ocasionar insuficiencia renal o incluso lamuerte del paciente Los anticuerpos adquiridos o inmunesson generalmente inmunoglobulinas G las cuales producenhemoacutelisis extravascular en el bazo o en el hiacutegado mediantefagocitosis del complejo eritrocito maacutes anticuerpo

Los aloanticuerpos irregulares (adquiridos) maacutes comunes en

nuestra poblacioacuten son los que involucran a los sistemasMNSs P1 Kidd (Jka Jkb) Duffy (Fya Fyb) Kell Lewis yDiego

OBJETIVO identificacioacuten del anticuerpo irregular a traveacutesde las diferentes teacutecnicas

MATERIAL

bull 10 Tubos de ensaye

bull 10 Pipetas Pasteur

bull

1Gradillabull 1 Bulbo

bull Papel Parafim

MATERIAL BIOLOGICO

bull Gloacutebulos rojos lavados al 3 - 5

bull Suero

bull REACTIVOSReactivos

1 Suero de Coombs2 Albuacutemina bovina

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bull EQUIPO1 Microcentriacutefuga2 Bantildeo Mariacutea oacute Estufa

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3 SOLUCION SALINA4 SOLUCION DE LISS

TEacuteCNICA SOLUCION SALINA

Lavar los eritrocitos con solucioacuten salina (3veces)SALINA RAacutePIDA

Agregar una gota de Eritrocitos LavadosDiluiacuterlo al 3-5 con solucioacuten salina 09Agregar 2 gotas de sueroCentrifugar y observar anotar desprendimientodel botoacuten

SALINA 37deg BANtildeO MARIacuteA1) Incubar tubos a Bantildeo mariacutea a 37degC durante 1

hora (o 20 min)

2) Centirfugar despueacutes de haber pasado eltiempo

3) Desprender el botoacuten de eritrocitos yobservar

AGLUTINACIOacuteNndash No es compatibleNO AGLUTINACIOacuteN - Lavar 3 veces

SALINA COOMBS1) Con solucioacuten salina 09 lavar los

eritrocitos de los tubos q no tuvieronaglutinacioacuten 3 veces

2) Decantar y agregar 2 gotas de reactivode Coombs

AGLUTINACIOacuteN ndash No es compatibleNO AGLUTINACIOacuteN - Lavar 3 veces

TECNICA LISS

1 Poner dos gotas de LISS en cada tubo agregar una gotade eritrocitos lavados y al 3 - 5 seguacuten el nuacutemero detubo correspondiente

2 Mezclar y centrifugar un minuto decantar el

sobrenadante y con la ayuda de una gasa limpiar elexceso del reactivo

3 Poner nuevamente 2 gota de LISS resuspender poragitacioacuten agregar 2 gotas de suero problema mezclarincubar 15 minutos a 37ordm C centrifugar 30 seg A 1000RPM

4 Anotar los resultados

A las pruebas negativas realizar Coombs

1 Lavar 3 veces las ceacutelulas agregar suero de Coombs

centrifugar 30 seg2 Leer aglutinaciones y anotar resultados

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TECNICA ALBUMINA BOVINA 8 Agregar 2 gotas de albuacutemina al 229 Centrifugar 20 segundos10observar aglutinacioacuten o hemolisis o no aglutinacioacuten

11A los tubos con lecturas negativas incubar 20minutos en bantildeo Mariacutea a 37 degC12Centrifugar y observar

bull Aglutinacioacuten o hemoacutelisis reportar incompatible

bull No aglutinacioacuten llevar a Coombs

13Lavar tres veces decantar y quitar el exceso desalina con gasa y agregar 2 gotas de reactivo deCoombs y centrifugar 20 segundos y observar

bull Aglutinacioacuten o hemoacutelisis reportar incompatible

bull No aglutinacioacuten reportar compatible

Resultados ANTICUERPO IRREGULAR Anticuerpo c

InterpretacioacutenEstos anticuerpos son generalmente inmunoglobulinas tipo My ocasionalmente tipo G y debido a esa temperatura dereaccioacuten carecen de importancia cliacutenica salvo que sureaccioacuten ocurra tambieacuten a 37 degC su importancia radica enpacientes que seraacuten intervenido a 22 ordmc como es el caso de

operacioacuten de corazoacuten

Los llamados anticuerpos calientes tienen una temperatura oacuteptima dereaccioacuten a 37 degC a Estos anticuerpos tienen una relevanteimportancia cliacutenica ya que se les asocia con reaccionestransfusionales de intensidad moderada a severa que puedenocasionar la muerte

Esquemas

CONCLUSIONHe concluido que es importante determinar los anticuerposirregulares ya que estos anticuerpos tienen una relevanteimportancia cliacutenica ya que se les asocia con reaccionestransfusionales de intensidad moderada a severa

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CONTENIDO

1 ldquoDETERMINACIOacuteN DE GRUPO SANGUIacuteNEO ABO Y RHrdquo

2 DETERMUNACION DE SUBGRUPOS

3 DETERMINACION DE RH

4 DETERMINACION DE GRUPO SANGUINEO POR TECNICA DE GEL

5 PRUEBA DE COMPATIBILIDAD

6 PRUEBA DE COMPATIBILIDAD SANGIacuteNEA (TEacuteCNICA SALINA)

7 PRUEBA DE COMPATIBILIDAD SANGUIacuteNEA (TEacuteCNICA ALBUMINA)

8 PRUEBA DE COMPATIBILIDAD SANGUINEA PRUEBA DE LISS

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9 DETERMINACION DE COOMBS DIRECTO

10IDENTIFICACION DE ANTICUERPOS IRREGULARES

Practica No 1

ldquoDeterminacioacuten de grupo sanguiacuteneo ABO y Rhrdquo

Introduccioacuten

Un grupo sanguiacuteneo es una forma de agrupar ciertas caracteriacutesticas de la sangre quedependen de los antiacutegenos presentes en la superficie de los gloacutebulos rojos y en el suero de lasangre

Esta ha sido la base para que se pueda clasificar a la sangre en cuatro grupos en cuanto alsistema ABO grupo A grupo AB grupo B y grupo O y en dos con respecto al sistema Rh Rhnegativo o Rh positivo Lo que a la postre trae ocho grupos posibles por las combinacionesposibles entre ambos sistemas

Las transfusiones de sangre entre grupos incompatibles pueden provocar una reaccioacuteninmunoloacutegica que puede desembocar en muerte

Las personas con sangre del tipo A tienen gloacutebulos rojos que expresan antiacutegenos de tipo A ensu superficie y anticuerpos contra los antiacutegenos B en el suero de su sangre

Las personas con sangre del tipo B tiene la combinacioacuten contraria gloacutebulos rojos con antiacutegenosde tipo B en su superficie y anticuerpos contra los antiacutegenos A en el suero de su sangre

Los individuos con sangre del tipo O no expresan ninguna de los dos antiacutegenos (A o B) en lasuperficie de sus gloacutebulos rojos pero pueden fabricar anticuerpos contra ambos tipos mientrasque las personas con tipo AB expresan ambos antiacutegenos en su superficie y no fabrican ninguno

de los dos anticuerpos

A causa de estas combinaciones el tipo O puede ser transfundido sin ninguacuten problema acualquier persona con cualquier tipo ABO y el tipo AB puede recibir de cualquier tipo ABO

Los donantes de sangre y los receptores deben tener grupos compatibles El grupo O- escompatible con todos por lo que quien tiene dicho grupo se dice que es un donante universalPor otro lado una persona cuyo grupo sea AB+ podraacute recibir sangre de cualquier grupo y sedice que es un receptor universal

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Material y equipo

bull 40 tubos de ensayo de 12 x 75

bull 4 pipetas Pasteur

bull 1 gradilla de unicel

bull 3 tubos Vacutiner con muestra sanguiacutenea anticoagulada con EDTA

bull 1 tubo Vacutainer con muestra sanguiacutenea sin anticoagulante

bull Antisuero Anti-A Anti-AB Anti-B y Anti-D

bull Eritrocitos con antiacutegenos conocidos A1 A2 B y O

bull 1 centrifuga

Reactivos

Antisuero A monoclonal Lafon Antisuero AB monoclonal LafonLote9662 Lote 8764Cad 09NOV08 Cad 31OCT08Aspecto transparente AspectotransparenteColor azul Color incoloro

Antisuero B monoclonal Lafon Antisuero D monoclonal NOVACLONE

Lote 9762A Lote NDMG04305Cad09NOV08 Cad 29MAR08Aspecto transperente Aspecto transperenteColor amarillo Color incoloro

Teacutecnica

Meacutetodo directo

1 Centrifugar los 3 tubos Vacutiner con muestra sanguiacutenea anticoagulada con EDTA y eltubo Vacutainer con muestra sanguiacutenea sin anticoagulante a una velocidad de 2500rpm por 10 minutos pues se utilizaran plasma y eritrocitos por separado

2 Rotular los tubos de ensayo de la siguiente manera en cada tubo rotular dos nuacutemeros

en la muestra uno correspondiente del 1 al 4 el otro numero corresponde al que yatraiacutea la muestra y con el tipo de antisuero Anti-A Anti-AB Anti-B oacute Anti-D Ejemplo 113 Anti-A 113 Anti-AB etc El procedimiento se repite para las tres muestrasrestantes

3 En cuatro tubos limpios hacer una dilucioacuten de 2-5 de eritrocitos con agua destiladade cada muestra La dilucioacuten tomara un color rojo tenue similar a la sangriacutea

4 Colocar en cada tubo rotulado una gota de la dilucioacuten de eritrocitos preparada y unagota de antisuero seguacuten corresponda

5 Al concluir lo anterior llevar los tubos a la centrifuga y centrifugar por solo 15 segundosa una velocidad de 1000 rpm para observar mejor la reaccioacuten antigeno-anticuerpo(formacioacuten de un botoacuten)

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6 Por ultimo leer los tubos observando si hubo reaccioacuten o no y correlacionando losdatos obtenidos con el meacutetodo inverso para determinar el grupo sanguiacuteneo

Metodo inverso

1 Centrifugar los 3 tubos Vacutiner con muestra sanguiacutenea anticoagulada con EDTA y eltubo Vacutainer con muestra sanguiacutenea sin anticoagulante a una velocidad de 2500rpm por 10 minutos pues se utilizaran plasma y eritrocitos por separado

2 Rotular los tubos de ensayo de la siguiente manera en cada tubo rotular dos nuacutemeros

en la muestra uno correspondiente del 1 al 4 el otro numero corresponde al que yatraiacutea la muestra y con el tipo de eritrocitos con antigeno conocido A 1 A2 B y OEjemplo 113 A1 113 A2 etc El procedimiento se repite para las tres muestrasrestantes

3 Colocar en cada tubo rotulado dos gotas ya sea de plasma o suero seguacuten corresponday una gota de los eritrocitos con antigeno conocido

4 Al concluir lo anterior llevar los tubos a la centrifuga y centrifugar por solo 15 segundos

a una velocidad de 1000 rpm para observar mejor la reaccioacuten antigeno-anticuerpo(formacioacuten de un botoacuten)

5 Por ultimo leer los tubos observando si hubo reaccioacuten o no y correlacionando losdatos obtenidos con el meacutetodo inverso para determinar el grupo sanguiacuteneo

Resultados

Muestra Meacutetodo directo Meacutetodo inverso

Anti-A Anti-AB Anti-B Anti-D A1 A2 B O

Grupo y

Rh1 - - - + + + + - O +

2 - + + + + + - - B +

3 + + - + - - + - A +

4 + + + + + - - - AB +

InterpretacioacutenPara el meacutetodo directo la loacutegica fue si en un tubo hay formacioacuten de botoacuten (reaccioacuten antigeno-anticuerpo) quiere decir que los eritrocitos ensayados tienen el antigeno que reacciona con losanticuerpos presentes en el antisuero para ese tubo y si no presentan aglutinacioacuten querraacutedecir que no corresponde el antigeno del eritrocito con el anticuerpo del antisuero o que el

antigeno esta ausente en esos eritrocitos De ahiacute que pueda observarse que una muestrasanguiacutenea muestre un solo tipo de antiacutegenos del sistema ABO sobre su membrana (A o B)ambos antiacutegenos (AB) o ninguno de ellos (O) lo mismo sucede para el sistema Rh alpresentarlo (Rh +) o no (Rh -)Para el meacutetodo inverso el razonamiento fue si en un tubo hay formacioacuten del botoacuten (reaccioacutenantigeno-anticuerpo) quiere decir que el plasma del paciente ensayado tiene los anticuerposque reaccionan con los eritrocitos con antigeno conocido los cuales sirven de reactivo paraesta prueba Por lo tanto una reaccioacuten positiva en este meacutetodo definitivamente indica que elpaciente no tiene eritrocitos con antiacutegenos que reaccionariacutean con los anticuerpos de su plasmaDe ahiacute que el meacutetodo se le nombre inverso

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ConclusioacutenConcluyo que Para realizar una transfusioacuten sanguiacutenea se debe tomar en cuenta la sangre deldonante y la del receptor Los individuos pertenecientes al grupo O pueden donar sangre acualquier otro grupo sanguiacuteneo porque sus eritrocitos carecen de antigeno que puedan ser reconocidos por la sangre del receptor Las personas del grupo AB pueden recibir sangre decualquier grupo ya que carecen de anticuerpos

PRACTICA Nordm 2DETERMUNACION DE SUBGRUPOS

Anti- A1 Lectina(Dolichos biflorus)

Lectina de grupo sanguiacuteneo

INTRODUCCION

El sistema de grupos sanguiacuteneos ABO sigue siendo el primeroa tener en cuenta en el momento de realizar una transfusioacutende sangre Los antiacutegenos A y B son productos geacutenicosfaacutecilmente detectables y constituyen marcadoresgeneacuteticos de gran valor Entre los individuos A se

distinguen 2 categoriacuteas A1y A2

La diferenciacioacuten entre ambas se realiza mediante lautilizacioacuten de anticuerpos monoclonales y lectinasespeciacuteficas de grupo sanguiacuteneo Dolichos biflorus (anti A1)y Ulex europaeus (anti H)

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Uso Inmucor anti-A1 Lectin se utiliza para diferenciar ceacutelulas rojas A1 de otros

subgrupos A en pruebas en tubo o en placa

MATERIAL Y EQUIPObull Tubos de ensaye de 1075 mm

bull Cronometro

bull Marcador

bull Centrifuga seroloacutegica

MUESTRA BIOLOGICAbull Ceacutelulas rojas de donador o paciente

REACTIVObull Inmucor anti-A1 Lectin en gotero

MARCA INMUCOR INC

LOTE SN2132

CADUCIDAD 2007-12-14

TECNICA

1 Adicione una gota de anti-A1 a tubos adecuadamente marcados

2 Adicione una gota de una suspensioacuten de eritrocitos bajo prueba del 3-5 en

salina Mezcle completamente el contenido del tubo

3 Centrifugar de 15-30 minutos de 900-1000 rpm

4 Agite suavemente el tubo y resuspenda el botoacuten celular Examine las reacciones

resultantes macroscoacutepicamente Registre resultados

RESULTADOS ESPERADOS DE TIPIFICACION

GRUPOSANGUINEO

Anti-A Anti-A1 Porciento

A1 + + 80 DE TODOSLOS GRUPOS A

A1b + + 80 DE TODOSLOS GRUPOS AB

A2 + 0 20 DE TODOSLOS GRUPOS A

A2B + 0 20 DE TODOSLOS GRUPOS AB

A1NT + +DEBIL NO COMUNA3AM1AX1 + DEBIL 0 NO CUMUN

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ANTI-H (LECTINA)

Ulex europeaus

Para la determinacioacuten de del estado secretor y tipificacioacuten de las ceacutelulas rojas

INTRODUCCIONLa mayoriacutea de los grupos sanguiacuteneos ABO que se determinanen el banco de sangre cumplen con las leyes establecidas deantiacutegenos y anticuerpos reciacuteprocos para ese sistema

Los anticuerpos del sistema ABO existen en el individuodesde el momento en que son capaces de tener una respuestainmunoloacutegica y se producen contra los antiacutegenos A y B

Los subgrupos son fenotipos ABO que difieren en la cantidad

de antiacutegeno presente en los eritrocitos y en la saliva delos secretores Se hallan con mayor frecuencia y tienen maacutesrelevancia cliacutenica los de A que los de B Al utilizarlectinas se definen los subgrupos A1 y A2 con el extractode Dolichos biflorus se aglutinan los eritrocitos A1 perono los de A2 y el anti H semilla Ulex europeus aglutinaeritrocitos que tienen antiacutegeno H

MATERIAL Y EQUIPObull Tubos de ensaye de 1075mm

bull Cronometro

bull Marcador

bull Centrifuga seroloacutegica

MUESTRA BIOLOGICAbull Ceacutelulas rojas de donador o paciente

REACTIVObull Inmucor anti-H (Lectina) en gotero

MARCA GANMA

LOTE ML1581

CADUCIDAD 2007-11-14

TECNICA

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1 Adicione una gota de una suspensioacuten de eritrocitos bajo prueba del 3-5 en

salina en tubos adecuadamente marcados

2 Adicione dos gotas de anti-H Lectina y mezcle completamente el contenido del

tubo

3 incube durante 5 minutos a temperatura ambiente

4 Centrifugar de 15-30 minutos a 1000 rpm5 Agite suavemente el tubo y resuspenda el botoacuten celular Examine las reacciones

resultantes macroscoacutepicamente Registre resultados

INTERPRETACIOacuteN

PROBLEMA ANTI A1 ANTI H

(ANTI A2)

RESULTADO

SUBGRUPO

PACIENTE 1 + - ANTI A1

PACIENTE 2 - + ANTI A2

bull Prueba positiva Aglutinacioacuten de las ceacutelulas rojas

Nota La hemoacutelisis no debe interpretarse como un resultado positivo ya que esto

puede indetificarse como contaminacioacuten del reactivo

bull Prueba negativa Ausencia de aglutinacioacuten de las ceacutelulas rojas

CONCLUSIONES

Concluyo que para realizar unatransfusioacuten sanguiacutenea se debe tomar encuenta los subgrupos del donante y del

receptor Los subgrupo con mayorfrecuencia y tienen maacutes relevanciacliacutenica los de A que los de B Y seidentifican por medio de utilizarlectinas Los subgrupos A maacutesimportantes son A1 y A2

PRACTICA 3DETERMINACION DE Rh

INTRODUCCIOacuteN

El factor Rh es una clase de proteiacutena que se encuentra enlos gloacutebulos rojos de la sangre cuando alguien tiene esaproteiacutena se le considera ldquoRh Positivordquo Cuando no la tienees ldquoRh Negativordquo El factor Rh es hereditario y setransmite en dos genes El Factor Rh positivo es dominantees decir si una persona tiene un gen positivo y otronegativo su factor Rh seraacute positivo

Esta prueba es importante en el diagnostico y estudio

de la eritroblastosis fetal en la que los gloacutebulosrojos del nintildeo se encuentran sensibilizados con

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anticuerpo materno Es uacutetil tambieacuten en el diagnosticode la anemia hemoliacutetica adquirida (anticuerpos sobrelos gloacutebulo rojos del mismo paciente) asiacute como ladeterminacioacuten de eritrocitos sensibilizados en sangreusados para transfusioacuten

Las dos clasificaciones maacutes importantes para describirgrupos sanguiacuteneos en humanos son los antiacutegenos y el factorRh Las transfusiones de sangre entre grupos incompatiblespueden provocar una reaccioacuten inmunoloacutegica que puededesembocar en hemoacutelisis anemia fallo renal shock omuerte

MATERIAL

bull Tubos de ensayo de 12 x 75

bull Pipetas Pasteur

bull Gradilla

EQUIPO

bull Centrifuga

MUESTRA BIOLOacuteGICA

bull Eritrocitos lavados 3-5 del paciente

REACTIVOS

bull Antisuero Anti-D

bull Suero anti globulina humanabull Suero reactivo control

Antisuero D monoclonal NOVACLONELote NDMG04305CAD 29MAR08Aspecto transparenteColor incoloroSuero anti globulina HumanaLote 405CAD 06-NOV-08Aspecto transparenteColor verde

Reactivo control GAMMA-CLONELote GCM115-3CAD 2008-12-08Aspecto transparenteColor incoloro

TEacuteCNICA

Determinacioacuten de Rh

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bull Prepare una suspensioacuten de gloacutebulos rojos al 3-5 en solucioacuten salina Los gloacutebulos deben serlavados previamente 5 veces con el objeto deeliminar las proteiacutenas del plasma

bull Rotular 3 tubos para la previa identificacioacuten

de Rhbull Ponga 1 gota de la suspensioacuten lavada en cada

tubo

bull Antildeada una gota de anti suero D monoclonal

bull Mezcle y centrifugue 15 seg Y observe si hayaglutinacioacuten

Preparacioacuten del control negativo

bull Ponga una gota de eritrocitos lavados al 3-5

bull Antildeada una gota de reactivo control

bull

Centrifugue 15 seg y observe si hay aglutinacioacuten

Deteccioacuten de sangre Du

Nota esta teacutecnica se le realizo a los tubos problemasque no aglutinaron

bull Los tubos que no tuvieron aglutinacioacuten en ladeterminacioacuten de Rh se incuban 15 min yposteriormente se lavan 3 veces con sol Salina

bull Previamente lavados se le agregan 2 gotas de suerode COOMBS

bull Centrifugar 15 seg y observar desprender boton

ESQUEMAS

RESULTADOS problemas Aglutinacioacuten resultado2 positiva Rh +10 negativa Rh -11 negativa Rh -

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Paciente 2 coacutedigo 021612 plata Lugo JavierPaciente 10 coacutedigo 021620 Hernaacutendez Loacutepez GuillermoPaciente 11 coacutedigo 021621 camarillo Sonia rebeca

INTERPRETACIOacuteNPara el primer meacutetodoAglutinacion Rh positivoNo aglutinacioacuten realizar prueba de deteccioacuten desangre Du

Deteccioacuten de sangre DuAglutinacioacuten D deacutebil (Du positivo)No aglutinacioacuten Rh negativo

CONCLUSIONESCon el descubrimiento del sistema Rh se denominan Rhpositivos los hematiacutees que son aglutinados por esteanticuerpo y tienen por tanto el antiacutegeno Rh en lasuperficie Se denominan Rh negativos los que no sonaglutinados y que por tanto no poseen el antiacutegeno Rh ensu superficie

De la misma manera que en el sistema ABO en el sistema Rh

no se puede transfundir el antiacutegeno Rh a las personas queno lo tienen ya que podriacutea originar la produccioacuten deanticuerpos Rh en el receptor Los sujetos Rh negativossoacutelo podraacuten recibir sangre de donantes Rh negativos

PRACTICA 4INMUNOHEMATOLOGIA

DETERMINACION DE GRUPO SANGUINEO POR TECNICA DE GEL

INTRODUCCION

El sistema utilizado en inmunohematologiacutea para investigar e identificar antiacutegenos y

anticuerpos antieritrocitarios Es de tecnologiacutea de microtipificacioacuten en gel se basa en la

separacioacuten por tamantildeo de los eritrocitos aglutinados durante un proceso de

centrifugacioacuten en un gel poroso

Los eritrocitos van perdiendo elasticidad en sus membranas de forma que los

aglutinados grandes quedan atrapados en la zona superior y los pequentildeos quedan

distribuidos a lo largo de la columna

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Esta teacutecnica nos permite que estandaricemos la lectura de la reaccioacuten antiacutegeno-

anticuerpo con facilidad y repetitividad Asiacute como la estandariza del uso de reactivos

tiempos y lecturas disminuyendo sustancialmente la influencia de la mano de operador

OBJETIVO determinacioacuten de los antigenos del sistema ABORh (D) y determinacion

del grupo serico en tecnica de gel

FUNDAMENTOS

El principio del metdo se basa en la tecnica de gel descrita por Y Lapierre para la

deteccion de las reacciones de aglutinacion de los hematies La aglutinacion se produce

al entar en contacto los eritrocitos con los anticuerpos correspondientes

La tarjeta DG gel es un soporte de plastico constituidos por 8 microtubulos Cada

microtubulo esta formado por una columna y una camara de dispersionincubacion

La tecnologiacutea de microtipificacioacuten en gel se basa en la separacioacuten por tamantildeo de los

eritrocitos aglutinados durante un proceso de centrifugacioacuten en un gel poroso

Los eritrocitos van perdiendo elasticidad en sus membranas de forma que los

aglutinados grandes quedan atrapados en la zona superior y los pequentildeos quedan

distribuidos a lo largo de la columna

MATERIAL

Pipeta automaacutetica 10 ul 50ul 1 ml

Puntas de pipeta desechable Tubos de vidrios

DEG sol

Centrifugas para tarjetas DG gel

Hematies de reactivos para grupo inverso

MUESTRA BIOLOGICACeacutelulas rojas de donador o paciente

REACTIVO

Placa de gelReactivo de gel sol

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TECNICA1- determinacion de los antigenos del sistema ABORh

-preparar una suspension de hematies al 5 de DG sol Asegurar la resuspencion de lso

hematies antes de utilizar

Anadir en cada microtubulos indicados 10 ul de una suspension de hematies al 5

2- determinacion de l grupo serico-homogenizar los hematies recativos A1B

- dispersar el microtubulo N a1 50 ul de hematies reactivos A1 en un microtubulo Nb

50 ul de hematies reactivos B

-antildeadir suero o plasma

3- centrigugar en centrifuga para DG sol

Leer los resultados

RESULTADOS

NEGATIVO - Banda de hematies al fondo de la columna resto de la columna sin

aglutinados

POSITIVO

+- Escasoa glutinados de pequentildeo tamantildea d ela columna

1+ Algunos aglutinados pequentildeso en la columna

2+ aglutinados pequentildeso en la columna o mediano a lo largo de la columna

3+ Banda superior de aglutinado

4+ Banda de aglutinados en la parte superior de la columna

DP Doble poblacion (doble banda de hematies en el fondo y en la parte

superior

INTERPRETACION DE RESULTADOS

GRUPO HEMATICO GRUPO SERICOmicrotubo

Amicrotubo

Bmicrotubo

ABmicrotubo

CTL

MICROTUBUBON+ a1

MICROTUBUBON+ B

ABOGRUPO

0 0 0 0 + + 0+ 0 + 0 0 + A

0 + + 0 + 0 B

+ + + 0 0 0 AB

SISTEMA RhMicrutubo D Micrutubo

DrdquoMicrutuboCTL

INTERPRETACION

+ + 0 D positivo

0 0 0 D negativo

0 + 0

+ 0 0

D deacutebil parcial

RESULTADO E INTERPRETACION DE LA PRACTICA

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Resultado A+

CONCLUSION

Concluyo que esta teacutecnica es una forma de estabilizar las reacciones de aglutinacioacuten y

reducir los resultados falsamente negativos a consecuencia de una teacutecnica inapropiada

asi como crear un meacutetodo de interpretaciones sencillas y constantes

Practica No 5ldquoPrueba de compatibilidadrdquo

Introduccioacuten

Para requerir una oacuteptima transfusioacuten actualmente serequiere de aceptaciones inmunoloacutegicas receptor - donanteya que la transfusioacuten de sangre o la de sus componentescelulares de un donante a un receptor es una forma detransplante

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La prueba de Coombs se usa para determinar la presencia deanticuerpos no aglutinantes en el suero de sujetossensibilizados a uno o mas antiacutegenos sanguiacuteneos Es uacutetil enel estudio del suero de mujeres con isoinmunizacioacutenmaterno-fetal y se emplea tambieacuten en otro tipo de pruebas

como identificacioacuten de anticuerpos autoinmunes deteccioacutende algunos sistemas sanguiacuteneos y pruebas de compatibilidadsanguiacutenea

La prueba indirecta se realiza con eritrocitos normalesincubados in Vitro con el suero de estudio Durante esteperiodo si existe un anticuerpo este se fija sobre surespectivo determinante antigeacutenico Una vez fijados loseritrocitos son igualmente lavados y se agrega el reactivode Coombs produciendo aglutinacioacuten

Una prueba de Coombs indirecta positiva significa queexisten anticuerpos libres en el suero de la persona loscuales puedan ser igualmente auto-anticuerpos oisoanticuerpos

Material y equipo

bull Pipetas automaacuteticas de 10 microl 25 microl 50 microl y 1 ml

bull Puntas de pipetas desechables

bull Tubos de vidrio

bull Incubador para tarjetas DG Gel

bull Centrifuga para tarjetas DG Gel

Material bioloacutegico

bull Hematiacutees reactivo para investigacioacuten e identificacioacuten de anticuerpos irregulares de

Diagnostic Grifols SA

bull Suero de hemoclasificacioacuten

bull Muestras de sangre de extraccioacuten reciente recogida con anticoagulante o sin

anticoagulante

Reactivos

bull Tarjetas DG Gel

bull DG Gel Sol

Reactivos

Tarjetas DG Gel Coombs DG Gel SolRango de temperatura entre 2 y 25 ordmC Rango de temperatura entre 2 y 8ordmCLote 704901 Lote 7003701Cad 2008-03 Cad 2008-06Aspecto transparente Aspecto transparenteColor verde Color incoloro

TeacutecnicaMeacutetodo manual

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1 Dejar atemperar (18-25ordmC) muestras y reactivo2 Inspeccionar el estado de las tarjetas antes de utilizar3 Identificar las tarjetas y muestras a utilizar4 Despegar con precaucioacuten la lamina de metal que cubre los microtubos para prevenir

contaminaciones cruzadas entre ellos

5 Preparar una suspensioacuten con hematiacutees al 1 en DG Gel Sol (10 microl de sedimento oconcentrado de hematiacutees en 1 ml de DG Gel Sol) Utilizar los hematiacutees del donantepara la PC mayor y hematiacutees del receptor para la PC menor Asegurar la suspensioacuten delos hematiacutees antes de utilizar

6 Dispensar en el tubo correspondiente 50 microl de suspensioacuten de los hematiacutees al 1 deldonante (PC mayor) o 50 microl de suspensioacuten de los hematiacutees al 1 del receptor (PCmenor)

7 Antildeadir 25 microl de suero o plasma del receptor (PC mayor) o 25 microl de suero o plasma deldonante (PC menor)

8 Preparar auto control con 50 microl de suspensioacuten de los hematiacutees al 1 del receptor y 25microl de suero o plasma del receptor

9 Incubar 15 minutos a 37 ordmC10 Centrifugar en la centrifuga para tarjetas DG Gel

11 Leer los resultados

InterpretacioacutenNegativo - Banda de hematiacutees en el fondo de la columna resto de la columna sin aglutinados visibles

Positivo +- Escasos aglutinados de pequentildeo tamantildeo en la mitad inferior de la columna

1+ Algunos aglutinados de pequentildeo tamantildeo en la columna

2+ Aglutinados de tamantildeo pequentildeo o mediano a lo largo de la columna

3+ Banda superior de aglutinados de tamantildeo mediano en la mitad superior de la columna

4+ Banda de hematiacutees aglutinados en la parte superior de la columna

DP Doble poblacioacuten (doble banda de hematiacutees en el fondo y en la parte superior de la columna

Resultados

Paciente Lira Cabrera Carlos Alberto (AB+)Donador 1 Orea Valero Erasmo (A+)Donador 2 Moreno Adolfo (O+)

M1 m1 M2 m2 AutocontrolGR de donador 1 +suero del paciente

GR del paciente +suero de donador 1

GR de donador 2 +suero del paciente

GR del paciente +suero de donador 2

GR del paciente +suero del paciente

- + - + -

Por lo antes expuesto se puede deducir que el donador 1 (A+) puede donar eritrocitos al

paciente (AB+) lo mismo que el donador 2 (O+) puede donarle eritrocitos no asiacute plasma por parte de ambos donadores pues la prueba muestra que hubo reaccioacuten en ambas pruebasmenores

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Conclusioacuten

Concluyo que es esencial que toda la sangre sea estudiadaantes de la transfusioacuten para Asegurar que todos losgloacutebulos rojos transfundidos son compatibles con losanticuerpos en el plasma del paciente Evitar estimular laproduccioacuten de nuevos anticuerpos contra los gloacutebulos rojosen el receptor especialmente anti-Rh D

PRAacuteCTICA No 6PRUEBA DE COMPATIBILIDAD SANGIacuteNEA

(Teacutecnica salina)

INTRODUCCIOacuteN

Landsteiner constatoacute que cuando un aglutinoacutegeno se pone

en contacto con la aglutinina homoacuteloga se produce unaaglutinacioacuten

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La compatibilidad sanguiacutenea es la posibilidad de mezclade sangre sin que se produzcan trastornos tales como losfenoacutemenos de la lisis o de la aglutinacioacuten

A causa de este fenoacutemeno bioloacutegico en las transfusiones

de sangre no es suficiente con conocer que la sangre deldonante y la del receptor son del mismo grupo o bien quela del donante pertenezca al grupo O (cero) sino que esnecesario conocer si la compatibilidad es perfecta porqueninguacuten otro fenoacutemeno de inmunizacioacuten interfiera Es eneste sentido por lo que son empleadas las pruebascruzadas

Ademaacutes de los 6 antiacutegenos del sistema ABO en loseritrocitos humanos existen numerosos sistemas deaglutinoacutegenos que contienen muchos antiacutegenos individuales

en los eritrocitos (maacutes de 500000 millones posibles defenotipos de grupos sanguiacuteneos conocidos) Para evitaraccidentes transfusionales es indispensable tener encuenta el sistema Rh ademaacutes del ABO

Del sistema de antiacutegenos Rh es el D el maacutes antigeacutenico yel teacutermino Rh positivo indica que el individuo presentaaglutinoacutegeno D El individuo Rh negativo no tiene antiacutegenoD y forma la aglutinina anti-D en contacto con eacuteste

Las reacciones antiacutegeno-anticuerpo pueden observarse in

vitro por

mdash Hemoacutelisis la unioacuten antiacutegeno-anticuerpo se traduce enlisis de los eritrocitos en presenciadel complemento (siempre que el anticoagulante empleado nocapture losiones Ca y Mg necesarios para la activacioacuten delcomplemento) mdash Aglutinacioacuten los anticuerpos que reaccionan en mediosalino se conocen comoanticuerpos completos o aglutinantes (comuacutenmente tipo

IgM)

OBJETIVO Determinacioacuten de los antigenos del sistema ABORh (D) y su compatibilidad entre un paciente Donador y unPaciente Receptor

MATERIAL5 Tubos de ensaye6 Pipetas Pasteur

1Gradilla1 Bulbo

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EQUIPOMicrocentriacutefugaBantildeo Mariacutea oacute Estufa

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Papel Parafilm

MUESTRA Muestra de sangre con Anticoagulante EDTA

REACTIVOSAntisuero RO-Antiglobulina humana (Poliespeciacutefico Anti IgG C-d) Para prueba de CoombsLABORATORIOS LAFON SA de C VFecha de Caducidad 31-Ene-09Lote 406Hecho en MeacutexicoAspecto TransparenteColor Verde

TEacuteCNICA

Lavar los eritrocitos con solucioacuten salina (3 veces)

SALINA RAacutePIDA1 Agregar una gota de Eritrocitos Lavados2 Diluirlo al 3-5 con solucioacuten salina 093 Agregar 2 gotas de suero4 Centrifugar y observar anotar desprendimiento del botoacuten

SALINA 37deg BANtildeO MARIacuteA

1 Incubar tubos a Bantildeo mariacutea a 37degC durante 1hora (o 20 min)2 Centirfugar despueacutes de haber pasado el

tiempo3 Desprender el botoacuten de eritrocitos y

observarAGLUTINACIOacuteNndash No es compatibleNO AGLUTINACIOacuteN - Lavar 3 veces

SALINA COOMBS

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PRUEBA MAYOR

G Rojos del DONADOR+

Suero del RECEPTOR(paciente)

PRUEBA MENOR

G Rojos del RECEPTOR(paciente)

+Suero del DONADOR

AUTOTESTIGO

G Rojos del RECEPTOR(paciente)

+Suero del RECEPTOR

(paciente)

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1 Con solucioacuten salina 09 lavar loseritrocitos de los tubos q no tuvieronaglutinacioacuten 3 veces

2 Decantar y agregar 2 gotas de reactivode Coombs

AGLUTINACIOacuteN ndash No es compatibleNO AGLUTINACIOacuteN - Lavar 3 veces

RESULTADOS

Paciente Madrigal Meacutendez Luis Eduardo (B+)Folio 009164Fecha301007

Donador 1 Torres Avileacutes Joseacute Ramoacuten (O+)Folio 022604Fecha311007

Donador 2 Rodriacuteguez Nuacutentildeez Joseacute Angel (A+) Folio 022605

Fecha311007

SALINA RAacutePIDA

M1 m1 M2 m2 AutotestigoGR de donador 1+ suero del

paciente

GR del paciente+ suero dedonador 1

GR de donador 2+ suero del

paciente

GR del paciente+ suero dedonador 2

GR del paciente+ suero del

paciente

- 4+ 4+ 4+ -

SALINA 37deg BANtildeO MARIacuteA

M1 m1 M2 m2 Autotestigo- 4+ 4+ 4+ -

Compatible Nocompatible

Nocompatible

Nocompatible

Compatible

SALINA COOMBS

Por lo tanto se puede decir que el donador 1 (O+) puededonar suero al paciente (B+) debido a que en el suero nohay anticuerpos de ninguacuten tipo que reaccionen con losantiacutegenos de los eritrocios del Donador 1 Mientras tantoel Donador 2 no puede donar al Paciente ni suero nieritrocitos

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M1 Autotestigo- -

Compatible

Compatible

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INTERPRETACIOacuteN

PRUEBA POSITIVA Existe una aglutinacioacuten de lasceacutelulas sanguiacuteneas que indica la presencia delantiacutegeno A o B En el suero de Coombs notamos si esta

la precencia de Antiacutegeno D en los eritrocitos Lahemoacutelisis no se debe interpretar como resultadopositivo ya que puede indicar contaminacioacuten delreactivo

PRUEBA NEGATIVA La no aglutinacioacuten indica unresultado negativo e indica que las ceacutelulas sonnegativas para Antiacutegenos del sisitema ABO y D

CONCLUSIOacuteN

He concluido que en las transfusiones de sangre no essuficiente con conocer que la sangre del donante y la delreceptor son del mismo grupo o bien que la del donantepertenezca al grupo O (cero) sino que es necesarioconocer si la compatibilidad es perfecta porque ninguacutenotro fenoacutemeno de inmunizacioacuten interfiera Es en estesentido por lo que son empleadas las pruebas cruzadas

Praacutectica No 7ldquoPrueba de compatibilidad sanguiacutenea (teacutecnica albumina)rdquo

IntroduccioacutenLa tipificacioacuten de sangre identifica el tipo sanguiacuteneo determinandoantiacutegenos presentes en los eritrocitos detecta aloanticuerpos encontra esos antiacutegenos Asiacute los aloanticuerpos pueden aparecernaturalmente o ser inducidos y pueden ser dirigidos contra del grupoconocido o a los antiacutegenos de superficie de los eritrocitos La prueba

de compatibilidad sanguiacutenea o cross matching esta formada por laprueba mayor y menorLa prueba de cruzamiento mayor para losaloanticuerpos consiste en probar el plasma del receptor contra los

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gloacutebulos rojos del donante Es incompatible cuando se genera unareaccioacuten hemoliacutetica los eritrocitos del donante se destruyen por losaloanticuerpos del plasma del receptor La prueba menor es una pruebapara los aloanticuerpos del plasma del donante en contra los gloacutebulosrojos del receptor Una incompatibilidad menor es una causa menosfrecuente para causar una reaccioacuten en contra una transfusioacuten porque

el volumen de plasma del donante es menor y es diluido marcadamente enel receptor Para llevar a cabo dicho procedimiento se utilizandiversos reactivos como potencializadores que mejoran la unioacuten deeritrocitos con alguacuten tipo de anticuerpo Uno de esospotencializadores es la albuacutemina La albumina bovina polimerizada esun reactivo muy utilizado en el laboratorio de inmunohematologia y encentros de bancos de sangre funciona como un potencializador quefacilita la reaccion de aglutinacioacuten de eritrocitos sensibilizados Alfinal de la prueba se prueban los eritrocitos con el reactivo deCoombs El principio de la prueba de Coombs fue descrito por Moreschien 1908 pero Coombs Mourant y Race en 1946 la introdujeron en elestudio de los grupos sanguiacuteneos y anticuerpos cuando una parte desangre (suero) fue usada para la inoculacioacuten de animales para

inmunizarlos con proteiacutena humana utilizando el anticuerpo obtenido enla deteccioacuten de los llamados anticuerpos incompletos Esta prueba seusa para determinar la presencia de anticuerpos no aglutinantes en elsuero de sujetos sensibilizados a uno o mas antiacutegenos sanguiacuteneos Esuacutetil en el estudio del suero de mujeres con isoinmunizacioacuten materno-fetal y se emplea tambieacuten en otro tipo de pruebas como identificacioacutende anticuerpos autoinmunes deteccioacuten de algunos sistemas sanguiacuteneos ypruebas de compatibilidad sanguiacutenea La prueba indirecta se realizacon eritrocitos normales incubados in Vitro con el suero de estudioDurante este periodo si existe un anticuerpo este se fija sobre surespectivo determinante antigeacutenico Una vez fijados los eritrocitosson igualmente lavados y se agrega el reactivo de Coombs produciendoaglutinacioacuten Una prueba de Coombs indirecta positiva significa que

existen anticuerpos libres en el suero de la persona los cualespuedan ser igualmente auto-anticuerpos o isoanticuerpos

Objetivo Determinacioacuten de los antiacutegenos del sistema ABO Rh (D) y sucompatibilidad entre un paciente Donador y un Paciente Receptor

Material y equipo

5 Tubos de ensaye

6 Pipetas Pasteur

1Gradilla

1 Bulbo

Papel Parafilm

Microcentriacutefuga

Bantildeo Mariacutea oacute Estufa

Material bioloacutegico

Muestras de sangre de extraccioacuten reciente recogida conanticoagulante o sin anticoagulante

ReactivosSuero de CoombsAlbuacutemina bovina deg

Suero anti-globulina humana Lafon Lote 406 Cad 310109 Color verde Aspecto

transparentedegAlbumina de bovino polimerizada Interbiol Lote APO107 Cad 150109 Color incoloroAspecto transparente

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Teacutecnica

1 Montar prueba mayor 1 y 2 prueba menor 1 y 2 y autotestigocon el procedimiento ya anteriormente conocido

2 Agregar 2 gotas de albuacutemina al 223 Centrifugar 20 segundos4 observar aglutinacioacuten o hemolisis o no aglutinacioacuten5 A los tubos con lecturas negativas incubar 20 minutos en bantildeo

Mariacutea a 37 degC6 Centrifugar y observar

bull Aglutinacioacuten o hemoacutelisis reportar incompatible

bull No aglutinacioacuten llevar a Coombs

7 Lavar tres veces decantar y quitar el exceso de salina congasa y agregar 2 gotas de reactivo de Coombs y centrifugar 20segundos y observar

bull Aglutinacioacuten o hemoacutelisis reportar incompatible

bull No aglutinacioacuten reportar compatible

Resultados1 PRUEBA MAYOR 1 2 Gotas de suero del paciente + 1 gota de GR al 3-5 del

donador 12 PRUEBA MENOR 1 2 Gotas de suero del donador 1 + 1 gota de GR al 3-5 del

paciente3 PRUEBA MAYOR 2 2 Gotas de suero del paciente + 1 gota de GR al 3-5 del

donador 24 PRUEBA MENOR 2 2 Gotas de suero del donador 2 + 1 gota de GR al 3-5 del

paciente5 AUTOTESTIGO 2 Gotas de suero del paciente + 1 gota de GR al 3-5 del paciente

M1 m1 M2 m2 AutotestigoCon albuacutemina - - - - -Despueacutes de incubacioacuten a 37 degC - - - - -Despueacutes de Coombs - - - - -Despueacutes de validacioacuten con gloacutebulos

positivos+ + + + +

InterpretacioacutenPrueba positiva Alutinacioacuten o hemolisis Indica no compatibilidadPrueba negativaNo aglutinacioacuten Indica compatibilidad

Esquemas

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ConclusioacutenConcluyo que la prueba de compatibilidad sanguiacutenea en su modalidad conalbuacutemina bovina ofrece mucha ventaja al ser al igual que otrosreactivos un potencializador de la reaccioacuten antiacutegeno-anticuerpo Estopermite que el operador o realizador de la prueba tenga mayorconfianza y certeza en los resultados que obtenga

PRACTICA No 8PRUEBA DE COMPATIBILIDAD SANGUINEA PRUEBA DE LISS

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FUNDAMENTO

LISS es utilizado para reducir la fuerza ioacutenica del medio

de reaccioacuten en los procedimientos de deteccioacuten eidentificacioacuten de anticuerpos y en las pruebas decompatibilidad La presencia de este reactivo refuerza lainteraccioacuten antiacutegeno - anticuerpo durante la incubacioacuten

GENERALIDADESEl uso de solucioacuten salina de baja fuerza ioacutenica fuedescrito inicialmente en 1964 por Hughes-Jones y col y

Elliot y col pero en ese tiempo su uso era limitado yaque la concentracioacuten molar obtenida provocaba la hemoacutelisisde los eritrocitos suspendidos

En 1974 Low y Messeter describieron el uso rutinario de lasolucioacuten Liss de 003 M que lograba reducir el tiempo deincubacioacuten y no presentaba tendencia a la hemoacutelisis al sersuspendidos en salina a baja fuerza ioacutenica restableciendola presioacuten osmoacutetica de la solucioacuten mediante la adicioacuten deglicinaLas soluciones de baja fuerza ioacutenica son actualmente lasmaacutes utilizadas en inmunohematologiacutea provocando un aumentoen la velocidad de asociacioacuten entre antiacutegenos y anticuerpospermitiendo asiacute acortar el tiempo de incubacioacuten de 60minutos a 10-15 minutos sin sacrificar la sensibilidad delas mismas y sin costos elevadosSe ha observado que lasreacciones antiacutegeno-anticuerpo se ven potenciadas alreducir la fuerza ioacutenica del medio de reaccioacuten

La fuerza ioacutenica es uno de los factores maacutes importantes quedeterminan la tasa y la cantidad de captacioacuten deanticuerpos por parte de los eritrocitos El uso de mediosde reaccioacuten de baja fuerza ioacutenica permite disminuir eltiempo de incubacioacuten y potenciar las reacciones de losanticuerpos sin incrementar las reacciones inespeciacuteficas

Los iones Na+ y Cl- presentes en la solucioacuten salinafisioloacutegica se agrupan alrededor de las moleacuteculas deantiacutegeno y anticuerpo neutralizando sus cargas opuestas locual dificulta la unioacuten entre ellos Este efecto se reduceutilizando soluciones de baja fuerza ioacutenica y disminuyendode esta manera la incubacioacuten de las pruebas

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En esta etapa de sensibilizacioacuten las posibilidades deasociacioacuten pueden incrementarse mediante agitacioacutencentrifugacioacuten yo variacioacuten de la concentracioacuten delanticuerpo

Despueacutes de que el anticuerpo se ha fijado al antiacutegeno loseritrocitos sensibilizados deben unirse para dar lugar a laaglutinacioacuten visible esta red tambieacuten solidifica yestabiliza la reaccioacuten

En esta etapa la reaccioacuten depende de factores como lascaracteriacutesticas del anticuerpo localizacioacuten en la membranay nuacutemero de sitios antigeacutenicos fuerzas que mantienen ladistancia entre los eritrocitos

Las caracteriacutesticas del anticuerpo que deben considerarse

son el tamantildeo del anticuerpo involucrado y el nuacutemero desitios de combinacioacuten con el antiacutegeno Los anticuerpos IgMpueden establecer puentes entre los eritrocitos yaglutinarlos espontaacuteneamente en solucioacuten salina mientrasque los IgG no ya que las IgM pentameacutericas poseen 10sitios de combinacioacuten con el antiacutegeno y las IgG diacutemerossoacutelo dos sitios

Los eritrocitos tienen una carga neta negativa en susuperficie su interaccioacuten con los iones del medio alteraesta carga y producen una carga neta criacutetica denominada

potencial zeta y la reduccioacuten de dicha carga permite quelos eritrocitos se aproximen lo suficiente para que seanaglutinados por medio de los IgG que los sensibilizaron

Las soluciones de baja fuerza ionica empleadas en banco desangre tienen un pH entre 65 ndash 70 se recomienda unaosmolalidad de 270 ndash 305 mosmkg y una conductividad de 37mmcm El control diario implica el examen de su aparienciafiacutesica ausencia de turbidez particulas o sedimento asiacutecomo corroborar la capacidad para generar hemoacutelisiscrenacion o prueba de coombs positiva en eritrocitos

normales Cada lote nuevo se valora mediante el rastreo deun anticuerpo ya sea un anti- D un anti- jk anti- fy oanti- kell diluido se compara su capacidad de deteccioacutencontra un medio salino normal incubando 10min a 37ordmC enLISS debe poder rastrearse un anticuerpo en tanto que enmedio salino no

MATERIAL Y EQUIPO

Material Cantidad10 Tubos de ensayo de 12 x 75

1 Gradilla10 Pipetas pasteur

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1 Bulbo1 Marcador1 Microcentriacutefuga1 Bantildeo Mariacutea

MATERIAL BIOLOGICO

Gloacutebulos rojos lavados al 3 - 5Suero

REACTIVOS

Reactivo de LISSReactivo de Coombs

TECNICA1- Lavar los eritrocitos

Separar el suero del paquete de gloacutebulos rojos

Agregar cierta cantidad de eritrocitos a un tubo deensayo y agregarle solucioacuten salina

Centrifugar y decantar

Repetir este proceso 3 veces

2- Realizar la Prueba de LISS

Enumerar los tubos Poner dos gotas de LISS en cada tubo agregar una gota

de eritrocitos lavados y al 3 - 5 seguacuten el nuacutemero detubo correspondiente

Mezclar y centrifugar un minuto decantar elsobrenadante y con la ayuda de una gasa limpiar elexceso del reactivo

Poner nuevamente 2 gota de LISS resuspender poragitacioacuten agregar 2 gotas de suero problema mezclarincubar 15 minutos a 37ordm C centrifugar 30 seg A 1000

RPM Anotar los resultados

3- A las pruebas negativas realizar Coombs

Lavar 3 veces las ceacutelulas agregar suero de Coombscentrifugar 30 seg

Leer aglutinaciones y anotar resultados

REACTIVOS UTILIZADOS

REACTIVO MARCA FECHA DECADUCIDAD

ASPECTO COLOR LOTE

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SueroAntiglobuina

humana

Lafon 31 01 2009 Transparente Verde 406

LISS Caserorealizado enCMNSIGLOXXI

1 antildeo Transparente Transparente

----------

PACIENTE ASCANIO MENDEZ JOSUE O (+)DONADOR 1 GARCIA CARBAJAL OSCAR O (+)DONADOR 2 GARCIA SUAREZ ORLANDO A (+)

RESULTADOS

INTERPRETACIOacuteN DE LOS RESULTADOS

La hemoacutelisis o la aglutinacioacuten representan un resultado positivo e indican lapresencia de una reaccioacuten antiacutegeno-anticuerpo Los resultados negativos no severa aglutinacioacuten o hemolisis

ESQUEMAS

CONCLUSIONES

Concluyo que la prueba de compatibilidad sanguiacutenea en su modalidad conliss ofrece mucha ventaja al ser al igual que otros reactivos unpotencializador de la reaccioacuten antiacutegeno-anticuerpo Esto permite queel operador o realizador de la prueba tenga mayor confianza y certezaen los resultados que obtenga

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Tubo Resultado

M1 NEGATIVOm1 NEGATIVO

M2 POSITIVO

M2 NEGATIVO

AUTOTES NEGATIVO

29

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PRACTICA 9INMUNOHEMATOLOGIA

DETERMINACION DE COOMBS DIRECTO

INTRODUCCIONPRUEBA DE COOMBS DIRECTA

El examen de Coombs directo se utiliza para detectar autoanticuerpos contralos propios gloacutebulos rojos (GR) de un individuo Es una prueba que sirve parademostrar el revestimiento de los eritrocitos in vivo (mientras los eritrocitosestaacuten circulando en el individuo) La prueba se realiza agregando directamenteel reactivo de Coombs a los eritrocitos previamente lavados para eliminar otras proteiacutenas no fijadas a el una prueba directa positiva significa que larelacioacuten antiacutegeno-anticuerpo ocurrioacute in vivo es decir que la fijacioacuten del

anticuerpo sobre el antiacutegeno se realizo en el organismo del individuo enestudio

Las indicaciones principales de esta prueba son diagnostico de enfermedadeshemoliacuteticas ictericia o anomaliacuteas en la apariencia de los gloacutebulos rojos bajo elmicroscopio ya que estos anticuerpos algunas veces destruyen los gloacutebulosrojos y causan anemia para investigar reacciones en transfusiones Parainvestigar la induccioacuten de drogas en ceacutelulas rojas sensibilizadas medicamentos(por ejemplo quinidina metildopa procainamida y otros) que pueden llevar a la produccioacuten de estos anticuerpos

OBJETIVO Determinar la presencia de anticuerpos en la superficie de losgloacutebulos rojos del individuo

MATERIAL

bull 10 Tubos de 1275

bull 10 Pipetas Pasteur

bull 1 Gradilla

bull 1 Bulbo

bull Papel Parafilm

bull Microcentriacutefuga

bull Bantildeo Mariacutea a 37degC

MUESTRA BIOLOGICA

Eritrocitos lavados de (3-5) del donador o pacienteREACTIVO

Suero de CoombsSuero anti-globulina humana Lafon Lote 406 Cad 310109 Color verde Aspecto transparente

TECNICA

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Colocar en un tubo de ensaye dos gotas de suero de Coombs mas una gota deglobulos rojos (3-5)Centrifugar a 1000 rpm durante 20 segDesprender el boton suavemente y buscar la presencia de aglutinacionRotular y enumerar 8 tubos de ensayes con las diferentes diluciones

(frac12frac1418)Enumerar 8 tubos mas del 1 al 8Agregar a cada tubo de las diluciones 10 gotas de solucion salina mas 10 gotasde suero de CoombsColocar Al primer tubo de la dilucion 1 gota de globulos rojos (3-5) mezclar completamente y agregar al tubo 1Centrifugar todos los tubos a 1000 rpm durante 20 seg

LECTURA

Aglutina- Prueba de Coombs directa es positiva

No aglutina- Prueba de Coombs directa es negativa

ESQUEMAS y RESULTADOS

CONCLUCION

He concluido que la prueba de Coombs directa es una prueba que se utiliza para medir

la presencia de anticuerpos en la superficie de los gloacutebulos rojos que se encuentran

circulando en el paciente y se realiza para investigar reacciones en transfusiones ademaacutes

sirve para la determinacioacuten de anemia hemoliacutetica autoinmune entre otras afecciones

Practica 10

IDENTIFICACION DE ANTICUERPOS IRREGULARES

Fundamento

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DILUCIONES

frac12 positiva

frac14 positiva

18 positiva

116 negativa

132 negativa

164 negativa

1128 negativa1256 negativa

31

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Los anticuerpos del sistema ABO aparecen una vez que elindividuo entra en contacto con el medio ambiente y en elcual se encuentran microorganismos como algunas bacteriascoliformes que contienen sustancias quiacutemicas en suestructura parecidas a las de este sistema Por anticuerpos

regulares debemos identificar a los que existen en todoslos individuos y que eacutestos tendraacuten durante toda su vida

Los anticuerpos irregulares son los que no estaacuten de esamanera aunque en el caso de los naturales no se conoce aciencia cierta queacute o coacutemo se induce su produccioacuten Losadquiridos se conocen tambieacuten como inmunes y son elresultado de la exposicioacuten a antiacutegenos desconocidos por elindividuo al momento de la transfusioacuten o en las mujerespor el embarazo estos anticuerpos son dirigidos contraantiacutegenos de sistemas diferentes al ABO

Los anticuerpos naturales regulares son preferentementeinmunoglobulinas M las cuales fijan de manera taneficiente el complemento que pueden provocar lisisintravascular y ocasionar insuficiencia renal o incluso lamuerte del paciente Los anticuerpos adquiridos o inmunesson generalmente inmunoglobulinas G las cuales producenhemoacutelisis extravascular en el bazo o en el hiacutegado mediantefagocitosis del complejo eritrocito maacutes anticuerpo

Los aloanticuerpos irregulares (adquiridos) maacutes comunes en

nuestra poblacioacuten son los que involucran a los sistemasMNSs P1 Kidd (Jka Jkb) Duffy (Fya Fyb) Kell Lewis yDiego

OBJETIVO identificacioacuten del anticuerpo irregular a traveacutesde las diferentes teacutecnicas

MATERIAL

bull 10 Tubos de ensaye

bull 10 Pipetas Pasteur

bull

1Gradillabull 1 Bulbo

bull Papel Parafim

MATERIAL BIOLOGICO

bull Gloacutebulos rojos lavados al 3 - 5

bull Suero

bull REACTIVOSReactivos

1 Suero de Coombs2 Albuacutemina bovina

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bull EQUIPO1 Microcentriacutefuga2 Bantildeo Mariacutea oacute Estufa

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3 SOLUCION SALINA4 SOLUCION DE LISS

TEacuteCNICA SOLUCION SALINA

Lavar los eritrocitos con solucioacuten salina (3veces)SALINA RAacutePIDA

Agregar una gota de Eritrocitos LavadosDiluiacuterlo al 3-5 con solucioacuten salina 09Agregar 2 gotas de sueroCentrifugar y observar anotar desprendimientodel botoacuten

SALINA 37deg BANtildeO MARIacuteA1) Incubar tubos a Bantildeo mariacutea a 37degC durante 1

hora (o 20 min)

2) Centirfugar despueacutes de haber pasado eltiempo

3) Desprender el botoacuten de eritrocitos yobservar

AGLUTINACIOacuteNndash No es compatibleNO AGLUTINACIOacuteN - Lavar 3 veces

SALINA COOMBS1) Con solucioacuten salina 09 lavar los

eritrocitos de los tubos q no tuvieronaglutinacioacuten 3 veces

2) Decantar y agregar 2 gotas de reactivode Coombs

AGLUTINACIOacuteN ndash No es compatibleNO AGLUTINACIOacuteN - Lavar 3 veces

TECNICA LISS

1 Poner dos gotas de LISS en cada tubo agregar una gotade eritrocitos lavados y al 3 - 5 seguacuten el nuacutemero detubo correspondiente

2 Mezclar y centrifugar un minuto decantar el

sobrenadante y con la ayuda de una gasa limpiar elexceso del reactivo

3 Poner nuevamente 2 gota de LISS resuspender poragitacioacuten agregar 2 gotas de suero problema mezclarincubar 15 minutos a 37ordm C centrifugar 30 seg A 1000RPM

4 Anotar los resultados

A las pruebas negativas realizar Coombs

1 Lavar 3 veces las ceacutelulas agregar suero de Coombs

centrifugar 30 seg2 Leer aglutinaciones y anotar resultados

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TECNICA ALBUMINA BOVINA 8 Agregar 2 gotas de albuacutemina al 229 Centrifugar 20 segundos10observar aglutinacioacuten o hemolisis o no aglutinacioacuten

11A los tubos con lecturas negativas incubar 20minutos en bantildeo Mariacutea a 37 degC12Centrifugar y observar

bull Aglutinacioacuten o hemoacutelisis reportar incompatible

bull No aglutinacioacuten llevar a Coombs

13Lavar tres veces decantar y quitar el exceso desalina con gasa y agregar 2 gotas de reactivo deCoombs y centrifugar 20 segundos y observar

bull Aglutinacioacuten o hemoacutelisis reportar incompatible

bull No aglutinacioacuten reportar compatible

Resultados ANTICUERPO IRREGULAR Anticuerpo c

InterpretacioacutenEstos anticuerpos son generalmente inmunoglobulinas tipo My ocasionalmente tipo G y debido a esa temperatura dereaccioacuten carecen de importancia cliacutenica salvo que sureaccioacuten ocurra tambieacuten a 37 degC su importancia radica enpacientes que seraacuten intervenido a 22 ordmc como es el caso de

operacioacuten de corazoacuten

Los llamados anticuerpos calientes tienen una temperatura oacuteptima dereaccioacuten a 37 degC a Estos anticuerpos tienen una relevanteimportancia cliacutenica ya que se les asocia con reaccionestransfusionales de intensidad moderada a severa que puedenocasionar la muerte

Esquemas

CONCLUSIONHe concluido que es importante determinar los anticuerposirregulares ya que estos anticuerpos tienen una relevanteimportancia cliacutenica ya que se les asocia con reaccionestransfusionales de intensidad moderada a severa

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9 DETERMINACION DE COOMBS DIRECTO

10IDENTIFICACION DE ANTICUERPOS IRREGULARES

Practica No 1

ldquoDeterminacioacuten de grupo sanguiacuteneo ABO y Rhrdquo

Introduccioacuten

Un grupo sanguiacuteneo es una forma de agrupar ciertas caracteriacutesticas de la sangre quedependen de los antiacutegenos presentes en la superficie de los gloacutebulos rojos y en el suero de lasangre

Esta ha sido la base para que se pueda clasificar a la sangre en cuatro grupos en cuanto alsistema ABO grupo A grupo AB grupo B y grupo O y en dos con respecto al sistema Rh Rhnegativo o Rh positivo Lo que a la postre trae ocho grupos posibles por las combinacionesposibles entre ambos sistemas

Las transfusiones de sangre entre grupos incompatibles pueden provocar una reaccioacuteninmunoloacutegica que puede desembocar en muerte

Las personas con sangre del tipo A tienen gloacutebulos rojos que expresan antiacutegenos de tipo A ensu superficie y anticuerpos contra los antiacutegenos B en el suero de su sangre

Las personas con sangre del tipo B tiene la combinacioacuten contraria gloacutebulos rojos con antiacutegenosde tipo B en su superficie y anticuerpos contra los antiacutegenos A en el suero de su sangre

Los individuos con sangre del tipo O no expresan ninguna de los dos antiacutegenos (A o B) en lasuperficie de sus gloacutebulos rojos pero pueden fabricar anticuerpos contra ambos tipos mientrasque las personas con tipo AB expresan ambos antiacutegenos en su superficie y no fabrican ninguno

de los dos anticuerpos

A causa de estas combinaciones el tipo O puede ser transfundido sin ninguacuten problema acualquier persona con cualquier tipo ABO y el tipo AB puede recibir de cualquier tipo ABO

Los donantes de sangre y los receptores deben tener grupos compatibles El grupo O- escompatible con todos por lo que quien tiene dicho grupo se dice que es un donante universalPor otro lado una persona cuyo grupo sea AB+ podraacute recibir sangre de cualquier grupo y sedice que es un receptor universal

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Material y equipo

bull 40 tubos de ensayo de 12 x 75

bull 4 pipetas Pasteur

bull 1 gradilla de unicel

bull 3 tubos Vacutiner con muestra sanguiacutenea anticoagulada con EDTA

bull 1 tubo Vacutainer con muestra sanguiacutenea sin anticoagulante

bull Antisuero Anti-A Anti-AB Anti-B y Anti-D

bull Eritrocitos con antiacutegenos conocidos A1 A2 B y O

bull 1 centrifuga

Reactivos

Antisuero A monoclonal Lafon Antisuero AB monoclonal LafonLote9662 Lote 8764Cad 09NOV08 Cad 31OCT08Aspecto transparente AspectotransparenteColor azul Color incoloro

Antisuero B monoclonal Lafon Antisuero D monoclonal NOVACLONE

Lote 9762A Lote NDMG04305Cad09NOV08 Cad 29MAR08Aspecto transperente Aspecto transperenteColor amarillo Color incoloro

Teacutecnica

Meacutetodo directo

1 Centrifugar los 3 tubos Vacutiner con muestra sanguiacutenea anticoagulada con EDTA y eltubo Vacutainer con muestra sanguiacutenea sin anticoagulante a una velocidad de 2500rpm por 10 minutos pues se utilizaran plasma y eritrocitos por separado

2 Rotular los tubos de ensayo de la siguiente manera en cada tubo rotular dos nuacutemeros

en la muestra uno correspondiente del 1 al 4 el otro numero corresponde al que yatraiacutea la muestra y con el tipo de antisuero Anti-A Anti-AB Anti-B oacute Anti-D Ejemplo 113 Anti-A 113 Anti-AB etc El procedimiento se repite para las tres muestrasrestantes

3 En cuatro tubos limpios hacer una dilucioacuten de 2-5 de eritrocitos con agua destiladade cada muestra La dilucioacuten tomara un color rojo tenue similar a la sangriacutea

4 Colocar en cada tubo rotulado una gota de la dilucioacuten de eritrocitos preparada y unagota de antisuero seguacuten corresponda

5 Al concluir lo anterior llevar los tubos a la centrifuga y centrifugar por solo 15 segundosa una velocidad de 1000 rpm para observar mejor la reaccioacuten antigeno-anticuerpo(formacioacuten de un botoacuten)

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6 Por ultimo leer los tubos observando si hubo reaccioacuten o no y correlacionando losdatos obtenidos con el meacutetodo inverso para determinar el grupo sanguiacuteneo

Metodo inverso

1 Centrifugar los 3 tubos Vacutiner con muestra sanguiacutenea anticoagulada con EDTA y eltubo Vacutainer con muestra sanguiacutenea sin anticoagulante a una velocidad de 2500rpm por 10 minutos pues se utilizaran plasma y eritrocitos por separado

2 Rotular los tubos de ensayo de la siguiente manera en cada tubo rotular dos nuacutemeros

en la muestra uno correspondiente del 1 al 4 el otro numero corresponde al que yatraiacutea la muestra y con el tipo de eritrocitos con antigeno conocido A 1 A2 B y OEjemplo 113 A1 113 A2 etc El procedimiento se repite para las tres muestrasrestantes

3 Colocar en cada tubo rotulado dos gotas ya sea de plasma o suero seguacuten corresponday una gota de los eritrocitos con antigeno conocido

4 Al concluir lo anterior llevar los tubos a la centrifuga y centrifugar por solo 15 segundos

a una velocidad de 1000 rpm para observar mejor la reaccioacuten antigeno-anticuerpo(formacioacuten de un botoacuten)

5 Por ultimo leer los tubos observando si hubo reaccioacuten o no y correlacionando losdatos obtenidos con el meacutetodo inverso para determinar el grupo sanguiacuteneo

Resultados

Muestra Meacutetodo directo Meacutetodo inverso

Anti-A Anti-AB Anti-B Anti-D A1 A2 B O

Grupo y

Rh1 - - - + + + + - O +

2 - + + + + + - - B +

3 + + - + - - + - A +

4 + + + + + - - - AB +

InterpretacioacutenPara el meacutetodo directo la loacutegica fue si en un tubo hay formacioacuten de botoacuten (reaccioacuten antigeno-anticuerpo) quiere decir que los eritrocitos ensayados tienen el antigeno que reacciona con losanticuerpos presentes en el antisuero para ese tubo y si no presentan aglutinacioacuten querraacutedecir que no corresponde el antigeno del eritrocito con el anticuerpo del antisuero o que el

antigeno esta ausente en esos eritrocitos De ahiacute que pueda observarse que una muestrasanguiacutenea muestre un solo tipo de antiacutegenos del sistema ABO sobre su membrana (A o B)ambos antiacutegenos (AB) o ninguno de ellos (O) lo mismo sucede para el sistema Rh alpresentarlo (Rh +) o no (Rh -)Para el meacutetodo inverso el razonamiento fue si en un tubo hay formacioacuten del botoacuten (reaccioacutenantigeno-anticuerpo) quiere decir que el plasma del paciente ensayado tiene los anticuerposque reaccionan con los eritrocitos con antigeno conocido los cuales sirven de reactivo paraesta prueba Por lo tanto una reaccioacuten positiva en este meacutetodo definitivamente indica que elpaciente no tiene eritrocitos con antiacutegenos que reaccionariacutean con los anticuerpos de su plasmaDe ahiacute que el meacutetodo se le nombre inverso

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ConclusioacutenConcluyo que Para realizar una transfusioacuten sanguiacutenea se debe tomar en cuenta la sangre deldonante y la del receptor Los individuos pertenecientes al grupo O pueden donar sangre acualquier otro grupo sanguiacuteneo porque sus eritrocitos carecen de antigeno que puedan ser reconocidos por la sangre del receptor Las personas del grupo AB pueden recibir sangre decualquier grupo ya que carecen de anticuerpos

PRACTICA Nordm 2DETERMUNACION DE SUBGRUPOS

Anti- A1 Lectina(Dolichos biflorus)

Lectina de grupo sanguiacuteneo

INTRODUCCION

El sistema de grupos sanguiacuteneos ABO sigue siendo el primeroa tener en cuenta en el momento de realizar una transfusioacutende sangre Los antiacutegenos A y B son productos geacutenicosfaacutecilmente detectables y constituyen marcadoresgeneacuteticos de gran valor Entre los individuos A se

distinguen 2 categoriacuteas A1y A2

La diferenciacioacuten entre ambas se realiza mediante lautilizacioacuten de anticuerpos monoclonales y lectinasespeciacuteficas de grupo sanguiacuteneo Dolichos biflorus (anti A1)y Ulex europaeus (anti H)

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Uso Inmucor anti-A1 Lectin se utiliza para diferenciar ceacutelulas rojas A1 de otros

subgrupos A en pruebas en tubo o en placa

MATERIAL Y EQUIPObull Tubos de ensaye de 1075 mm

bull Cronometro

bull Marcador

bull Centrifuga seroloacutegica

MUESTRA BIOLOGICAbull Ceacutelulas rojas de donador o paciente

REACTIVObull Inmucor anti-A1 Lectin en gotero

MARCA INMUCOR INC

LOTE SN2132

CADUCIDAD 2007-12-14

TECNICA

1 Adicione una gota de anti-A1 a tubos adecuadamente marcados

2 Adicione una gota de una suspensioacuten de eritrocitos bajo prueba del 3-5 en

salina Mezcle completamente el contenido del tubo

3 Centrifugar de 15-30 minutos de 900-1000 rpm

4 Agite suavemente el tubo y resuspenda el botoacuten celular Examine las reacciones

resultantes macroscoacutepicamente Registre resultados

RESULTADOS ESPERADOS DE TIPIFICACION

GRUPOSANGUINEO

Anti-A Anti-A1 Porciento

A1 + + 80 DE TODOSLOS GRUPOS A

A1b + + 80 DE TODOSLOS GRUPOS AB

A2 + 0 20 DE TODOSLOS GRUPOS A

A2B + 0 20 DE TODOSLOS GRUPOS AB

A1NT + +DEBIL NO COMUNA3AM1AX1 + DEBIL 0 NO CUMUN

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ANTI-H (LECTINA)

Ulex europeaus

Para la determinacioacuten de del estado secretor y tipificacioacuten de las ceacutelulas rojas

INTRODUCCIONLa mayoriacutea de los grupos sanguiacuteneos ABO que se determinanen el banco de sangre cumplen con las leyes establecidas deantiacutegenos y anticuerpos reciacuteprocos para ese sistema

Los anticuerpos del sistema ABO existen en el individuodesde el momento en que son capaces de tener una respuestainmunoloacutegica y se producen contra los antiacutegenos A y B

Los subgrupos son fenotipos ABO que difieren en la cantidad

de antiacutegeno presente en los eritrocitos y en la saliva delos secretores Se hallan con mayor frecuencia y tienen maacutesrelevancia cliacutenica los de A que los de B Al utilizarlectinas se definen los subgrupos A1 y A2 con el extractode Dolichos biflorus se aglutinan los eritrocitos A1 perono los de A2 y el anti H semilla Ulex europeus aglutinaeritrocitos que tienen antiacutegeno H

MATERIAL Y EQUIPObull Tubos de ensaye de 1075mm

bull Cronometro

bull Marcador

bull Centrifuga seroloacutegica

MUESTRA BIOLOGICAbull Ceacutelulas rojas de donador o paciente

REACTIVObull Inmucor anti-H (Lectina) en gotero

MARCA GANMA

LOTE ML1581

CADUCIDAD 2007-11-14

TECNICA

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1 Adicione una gota de una suspensioacuten de eritrocitos bajo prueba del 3-5 en

salina en tubos adecuadamente marcados

2 Adicione dos gotas de anti-H Lectina y mezcle completamente el contenido del

tubo

3 incube durante 5 minutos a temperatura ambiente

4 Centrifugar de 15-30 minutos a 1000 rpm5 Agite suavemente el tubo y resuspenda el botoacuten celular Examine las reacciones

resultantes macroscoacutepicamente Registre resultados

INTERPRETACIOacuteN

PROBLEMA ANTI A1 ANTI H

(ANTI A2)

RESULTADO

SUBGRUPO

PACIENTE 1 + - ANTI A1

PACIENTE 2 - + ANTI A2

bull Prueba positiva Aglutinacioacuten de las ceacutelulas rojas

Nota La hemoacutelisis no debe interpretarse como un resultado positivo ya que esto

puede indetificarse como contaminacioacuten del reactivo

bull Prueba negativa Ausencia de aglutinacioacuten de las ceacutelulas rojas

CONCLUSIONES

Concluyo que para realizar unatransfusioacuten sanguiacutenea se debe tomar encuenta los subgrupos del donante y del

receptor Los subgrupo con mayorfrecuencia y tienen maacutes relevanciacliacutenica los de A que los de B Y seidentifican por medio de utilizarlectinas Los subgrupos A maacutesimportantes son A1 y A2

PRACTICA 3DETERMINACION DE Rh

INTRODUCCIOacuteN

El factor Rh es una clase de proteiacutena que se encuentra enlos gloacutebulos rojos de la sangre cuando alguien tiene esaproteiacutena se le considera ldquoRh Positivordquo Cuando no la tienees ldquoRh Negativordquo El factor Rh es hereditario y setransmite en dos genes El Factor Rh positivo es dominantees decir si una persona tiene un gen positivo y otronegativo su factor Rh seraacute positivo

Esta prueba es importante en el diagnostico y estudio

de la eritroblastosis fetal en la que los gloacutebulosrojos del nintildeo se encuentran sensibilizados con

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anticuerpo materno Es uacutetil tambieacuten en el diagnosticode la anemia hemoliacutetica adquirida (anticuerpos sobrelos gloacutebulo rojos del mismo paciente) asiacute como ladeterminacioacuten de eritrocitos sensibilizados en sangreusados para transfusioacuten

Las dos clasificaciones maacutes importantes para describirgrupos sanguiacuteneos en humanos son los antiacutegenos y el factorRh Las transfusiones de sangre entre grupos incompatiblespueden provocar una reaccioacuten inmunoloacutegica que puededesembocar en hemoacutelisis anemia fallo renal shock omuerte

MATERIAL

bull Tubos de ensayo de 12 x 75

bull Pipetas Pasteur

bull Gradilla

EQUIPO

bull Centrifuga

MUESTRA BIOLOacuteGICA

bull Eritrocitos lavados 3-5 del paciente

REACTIVOS

bull Antisuero Anti-D

bull Suero anti globulina humanabull Suero reactivo control

Antisuero D monoclonal NOVACLONELote NDMG04305CAD 29MAR08Aspecto transparenteColor incoloroSuero anti globulina HumanaLote 405CAD 06-NOV-08Aspecto transparenteColor verde

Reactivo control GAMMA-CLONELote GCM115-3CAD 2008-12-08Aspecto transparenteColor incoloro

TEacuteCNICA

Determinacioacuten de Rh

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bull Prepare una suspensioacuten de gloacutebulos rojos al 3-5 en solucioacuten salina Los gloacutebulos deben serlavados previamente 5 veces con el objeto deeliminar las proteiacutenas del plasma

bull Rotular 3 tubos para la previa identificacioacuten

de Rhbull Ponga 1 gota de la suspensioacuten lavada en cada

tubo

bull Antildeada una gota de anti suero D monoclonal

bull Mezcle y centrifugue 15 seg Y observe si hayaglutinacioacuten

Preparacioacuten del control negativo

bull Ponga una gota de eritrocitos lavados al 3-5

bull Antildeada una gota de reactivo control

bull

Centrifugue 15 seg y observe si hay aglutinacioacuten

Deteccioacuten de sangre Du

Nota esta teacutecnica se le realizo a los tubos problemasque no aglutinaron

bull Los tubos que no tuvieron aglutinacioacuten en ladeterminacioacuten de Rh se incuban 15 min yposteriormente se lavan 3 veces con sol Salina

bull Previamente lavados se le agregan 2 gotas de suerode COOMBS

bull Centrifugar 15 seg y observar desprender boton

ESQUEMAS

RESULTADOS problemas Aglutinacioacuten resultado2 positiva Rh +10 negativa Rh -11 negativa Rh -

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Paciente 2 coacutedigo 021612 plata Lugo JavierPaciente 10 coacutedigo 021620 Hernaacutendez Loacutepez GuillermoPaciente 11 coacutedigo 021621 camarillo Sonia rebeca

INTERPRETACIOacuteNPara el primer meacutetodoAglutinacion Rh positivoNo aglutinacioacuten realizar prueba de deteccioacuten desangre Du

Deteccioacuten de sangre DuAglutinacioacuten D deacutebil (Du positivo)No aglutinacioacuten Rh negativo

CONCLUSIONESCon el descubrimiento del sistema Rh se denominan Rhpositivos los hematiacutees que son aglutinados por esteanticuerpo y tienen por tanto el antiacutegeno Rh en lasuperficie Se denominan Rh negativos los que no sonaglutinados y que por tanto no poseen el antiacutegeno Rh ensu superficie

De la misma manera que en el sistema ABO en el sistema Rh

no se puede transfundir el antiacutegeno Rh a las personas queno lo tienen ya que podriacutea originar la produccioacuten deanticuerpos Rh en el receptor Los sujetos Rh negativossoacutelo podraacuten recibir sangre de donantes Rh negativos

PRACTICA 4INMUNOHEMATOLOGIA

DETERMINACION DE GRUPO SANGUINEO POR TECNICA DE GEL

INTRODUCCION

El sistema utilizado en inmunohematologiacutea para investigar e identificar antiacutegenos y

anticuerpos antieritrocitarios Es de tecnologiacutea de microtipificacioacuten en gel se basa en la

separacioacuten por tamantildeo de los eritrocitos aglutinados durante un proceso de

centrifugacioacuten en un gel poroso

Los eritrocitos van perdiendo elasticidad en sus membranas de forma que los

aglutinados grandes quedan atrapados en la zona superior y los pequentildeos quedan

distribuidos a lo largo de la columna

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Esta teacutecnica nos permite que estandaricemos la lectura de la reaccioacuten antiacutegeno-

anticuerpo con facilidad y repetitividad Asiacute como la estandariza del uso de reactivos

tiempos y lecturas disminuyendo sustancialmente la influencia de la mano de operador

OBJETIVO determinacioacuten de los antigenos del sistema ABORh (D) y determinacion

del grupo serico en tecnica de gel

FUNDAMENTOS

El principio del metdo se basa en la tecnica de gel descrita por Y Lapierre para la

deteccion de las reacciones de aglutinacion de los hematies La aglutinacion se produce

al entar en contacto los eritrocitos con los anticuerpos correspondientes

La tarjeta DG gel es un soporte de plastico constituidos por 8 microtubulos Cada

microtubulo esta formado por una columna y una camara de dispersionincubacion

La tecnologiacutea de microtipificacioacuten en gel se basa en la separacioacuten por tamantildeo de los

eritrocitos aglutinados durante un proceso de centrifugacioacuten en un gel poroso

Los eritrocitos van perdiendo elasticidad en sus membranas de forma que los

aglutinados grandes quedan atrapados en la zona superior y los pequentildeos quedan

distribuidos a lo largo de la columna

MATERIAL

Pipeta automaacutetica 10 ul 50ul 1 ml

Puntas de pipeta desechable Tubos de vidrios

DEG sol

Centrifugas para tarjetas DG gel

Hematies de reactivos para grupo inverso

MUESTRA BIOLOGICACeacutelulas rojas de donador o paciente

REACTIVO

Placa de gelReactivo de gel sol

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TECNICA1- determinacion de los antigenos del sistema ABORh

-preparar una suspension de hematies al 5 de DG sol Asegurar la resuspencion de lso

hematies antes de utilizar

Anadir en cada microtubulos indicados 10 ul de una suspension de hematies al 5

2- determinacion de l grupo serico-homogenizar los hematies recativos A1B

- dispersar el microtubulo N a1 50 ul de hematies reactivos A1 en un microtubulo Nb

50 ul de hematies reactivos B

-antildeadir suero o plasma

3- centrigugar en centrifuga para DG sol

Leer los resultados

RESULTADOS

NEGATIVO - Banda de hematies al fondo de la columna resto de la columna sin

aglutinados

POSITIVO

+- Escasoa glutinados de pequentildeo tamantildea d ela columna

1+ Algunos aglutinados pequentildeso en la columna

2+ aglutinados pequentildeso en la columna o mediano a lo largo de la columna

3+ Banda superior de aglutinado

4+ Banda de aglutinados en la parte superior de la columna

DP Doble poblacion (doble banda de hematies en el fondo y en la parte

superior

INTERPRETACION DE RESULTADOS

GRUPO HEMATICO GRUPO SERICOmicrotubo

Amicrotubo

Bmicrotubo

ABmicrotubo

CTL

MICROTUBUBON+ a1

MICROTUBUBON+ B

ABOGRUPO

0 0 0 0 + + 0+ 0 + 0 0 + A

0 + + 0 + 0 B

+ + + 0 0 0 AB

SISTEMA RhMicrutubo D Micrutubo

DrdquoMicrutuboCTL

INTERPRETACION

+ + 0 D positivo

0 0 0 D negativo

0 + 0

+ 0 0

D deacutebil parcial

RESULTADO E INTERPRETACION DE LA PRACTICA

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Resultado A+

CONCLUSION

Concluyo que esta teacutecnica es una forma de estabilizar las reacciones de aglutinacioacuten y

reducir los resultados falsamente negativos a consecuencia de una teacutecnica inapropiada

asi como crear un meacutetodo de interpretaciones sencillas y constantes

Practica No 5ldquoPrueba de compatibilidadrdquo

Introduccioacuten

Para requerir una oacuteptima transfusioacuten actualmente serequiere de aceptaciones inmunoloacutegicas receptor - donanteya que la transfusioacuten de sangre o la de sus componentescelulares de un donante a un receptor es una forma detransplante

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La prueba de Coombs se usa para determinar la presencia deanticuerpos no aglutinantes en el suero de sujetossensibilizados a uno o mas antiacutegenos sanguiacuteneos Es uacutetil enel estudio del suero de mujeres con isoinmunizacioacutenmaterno-fetal y se emplea tambieacuten en otro tipo de pruebas

como identificacioacuten de anticuerpos autoinmunes deteccioacutende algunos sistemas sanguiacuteneos y pruebas de compatibilidadsanguiacutenea

La prueba indirecta se realiza con eritrocitos normalesincubados in Vitro con el suero de estudio Durante esteperiodo si existe un anticuerpo este se fija sobre surespectivo determinante antigeacutenico Una vez fijados loseritrocitos son igualmente lavados y se agrega el reactivode Coombs produciendo aglutinacioacuten

Una prueba de Coombs indirecta positiva significa queexisten anticuerpos libres en el suero de la persona loscuales puedan ser igualmente auto-anticuerpos oisoanticuerpos

Material y equipo

bull Pipetas automaacuteticas de 10 microl 25 microl 50 microl y 1 ml

bull Puntas de pipetas desechables

bull Tubos de vidrio

bull Incubador para tarjetas DG Gel

bull Centrifuga para tarjetas DG Gel

Material bioloacutegico

bull Hematiacutees reactivo para investigacioacuten e identificacioacuten de anticuerpos irregulares de

Diagnostic Grifols SA

bull Suero de hemoclasificacioacuten

bull Muestras de sangre de extraccioacuten reciente recogida con anticoagulante o sin

anticoagulante

Reactivos

bull Tarjetas DG Gel

bull DG Gel Sol

Reactivos

Tarjetas DG Gel Coombs DG Gel SolRango de temperatura entre 2 y 25 ordmC Rango de temperatura entre 2 y 8ordmCLote 704901 Lote 7003701Cad 2008-03 Cad 2008-06Aspecto transparente Aspecto transparenteColor verde Color incoloro

TeacutecnicaMeacutetodo manual

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1 Dejar atemperar (18-25ordmC) muestras y reactivo2 Inspeccionar el estado de las tarjetas antes de utilizar3 Identificar las tarjetas y muestras a utilizar4 Despegar con precaucioacuten la lamina de metal que cubre los microtubos para prevenir

contaminaciones cruzadas entre ellos

5 Preparar una suspensioacuten con hematiacutees al 1 en DG Gel Sol (10 microl de sedimento oconcentrado de hematiacutees en 1 ml de DG Gel Sol) Utilizar los hematiacutees del donantepara la PC mayor y hematiacutees del receptor para la PC menor Asegurar la suspensioacuten delos hematiacutees antes de utilizar

6 Dispensar en el tubo correspondiente 50 microl de suspensioacuten de los hematiacutees al 1 deldonante (PC mayor) o 50 microl de suspensioacuten de los hematiacutees al 1 del receptor (PCmenor)

7 Antildeadir 25 microl de suero o plasma del receptor (PC mayor) o 25 microl de suero o plasma deldonante (PC menor)

8 Preparar auto control con 50 microl de suspensioacuten de los hematiacutees al 1 del receptor y 25microl de suero o plasma del receptor

9 Incubar 15 minutos a 37 ordmC10 Centrifugar en la centrifuga para tarjetas DG Gel

11 Leer los resultados

InterpretacioacutenNegativo - Banda de hematiacutees en el fondo de la columna resto de la columna sin aglutinados visibles

Positivo +- Escasos aglutinados de pequentildeo tamantildeo en la mitad inferior de la columna

1+ Algunos aglutinados de pequentildeo tamantildeo en la columna

2+ Aglutinados de tamantildeo pequentildeo o mediano a lo largo de la columna

3+ Banda superior de aglutinados de tamantildeo mediano en la mitad superior de la columna

4+ Banda de hematiacutees aglutinados en la parte superior de la columna

DP Doble poblacioacuten (doble banda de hematiacutees en el fondo y en la parte superior de la columna

Resultados

Paciente Lira Cabrera Carlos Alberto (AB+)Donador 1 Orea Valero Erasmo (A+)Donador 2 Moreno Adolfo (O+)

M1 m1 M2 m2 AutocontrolGR de donador 1 +suero del paciente

GR del paciente +suero de donador 1

GR de donador 2 +suero del paciente

GR del paciente +suero de donador 2

GR del paciente +suero del paciente

- + - + -

Por lo antes expuesto se puede deducir que el donador 1 (A+) puede donar eritrocitos al

paciente (AB+) lo mismo que el donador 2 (O+) puede donarle eritrocitos no asiacute plasma por parte de ambos donadores pues la prueba muestra que hubo reaccioacuten en ambas pruebasmenores

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Conclusioacuten

Concluyo que es esencial que toda la sangre sea estudiadaantes de la transfusioacuten para Asegurar que todos losgloacutebulos rojos transfundidos son compatibles con losanticuerpos en el plasma del paciente Evitar estimular laproduccioacuten de nuevos anticuerpos contra los gloacutebulos rojosen el receptor especialmente anti-Rh D

PRAacuteCTICA No 6PRUEBA DE COMPATIBILIDAD SANGIacuteNEA

(Teacutecnica salina)

INTRODUCCIOacuteN

Landsteiner constatoacute que cuando un aglutinoacutegeno se pone

en contacto con la aglutinina homoacuteloga se produce unaaglutinacioacuten

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La compatibilidad sanguiacutenea es la posibilidad de mezclade sangre sin que se produzcan trastornos tales como losfenoacutemenos de la lisis o de la aglutinacioacuten

A causa de este fenoacutemeno bioloacutegico en las transfusiones

de sangre no es suficiente con conocer que la sangre deldonante y la del receptor son del mismo grupo o bien quela del donante pertenezca al grupo O (cero) sino que esnecesario conocer si la compatibilidad es perfecta porqueninguacuten otro fenoacutemeno de inmunizacioacuten interfiera Es eneste sentido por lo que son empleadas las pruebascruzadas

Ademaacutes de los 6 antiacutegenos del sistema ABO en loseritrocitos humanos existen numerosos sistemas deaglutinoacutegenos que contienen muchos antiacutegenos individuales

en los eritrocitos (maacutes de 500000 millones posibles defenotipos de grupos sanguiacuteneos conocidos) Para evitaraccidentes transfusionales es indispensable tener encuenta el sistema Rh ademaacutes del ABO

Del sistema de antiacutegenos Rh es el D el maacutes antigeacutenico yel teacutermino Rh positivo indica que el individuo presentaaglutinoacutegeno D El individuo Rh negativo no tiene antiacutegenoD y forma la aglutinina anti-D en contacto con eacuteste

Las reacciones antiacutegeno-anticuerpo pueden observarse in

vitro por

mdash Hemoacutelisis la unioacuten antiacutegeno-anticuerpo se traduce enlisis de los eritrocitos en presenciadel complemento (siempre que el anticoagulante empleado nocapture losiones Ca y Mg necesarios para la activacioacuten delcomplemento) mdash Aglutinacioacuten los anticuerpos que reaccionan en mediosalino se conocen comoanticuerpos completos o aglutinantes (comuacutenmente tipo

IgM)

OBJETIVO Determinacioacuten de los antigenos del sistema ABORh (D) y su compatibilidad entre un paciente Donador y unPaciente Receptor

MATERIAL5 Tubos de ensaye6 Pipetas Pasteur

1Gradilla1 Bulbo

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EQUIPOMicrocentriacutefugaBantildeo Mariacutea oacute Estufa

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Papel Parafilm

MUESTRA Muestra de sangre con Anticoagulante EDTA

REACTIVOSAntisuero RO-Antiglobulina humana (Poliespeciacutefico Anti IgG C-d) Para prueba de CoombsLABORATORIOS LAFON SA de C VFecha de Caducidad 31-Ene-09Lote 406Hecho en MeacutexicoAspecto TransparenteColor Verde

TEacuteCNICA

Lavar los eritrocitos con solucioacuten salina (3 veces)

SALINA RAacutePIDA1 Agregar una gota de Eritrocitos Lavados2 Diluirlo al 3-5 con solucioacuten salina 093 Agregar 2 gotas de suero4 Centrifugar y observar anotar desprendimiento del botoacuten

SALINA 37deg BANtildeO MARIacuteA

1 Incubar tubos a Bantildeo mariacutea a 37degC durante 1hora (o 20 min)2 Centirfugar despueacutes de haber pasado el

tiempo3 Desprender el botoacuten de eritrocitos y

observarAGLUTINACIOacuteNndash No es compatibleNO AGLUTINACIOacuteN - Lavar 3 veces

SALINA COOMBS

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PRUEBA MAYOR

G Rojos del DONADOR+

Suero del RECEPTOR(paciente)

PRUEBA MENOR

G Rojos del RECEPTOR(paciente)

+Suero del DONADOR

AUTOTESTIGO

G Rojos del RECEPTOR(paciente)

+Suero del RECEPTOR

(paciente)

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1 Con solucioacuten salina 09 lavar loseritrocitos de los tubos q no tuvieronaglutinacioacuten 3 veces

2 Decantar y agregar 2 gotas de reactivode Coombs

AGLUTINACIOacuteN ndash No es compatibleNO AGLUTINACIOacuteN - Lavar 3 veces

RESULTADOS

Paciente Madrigal Meacutendez Luis Eduardo (B+)Folio 009164Fecha301007

Donador 1 Torres Avileacutes Joseacute Ramoacuten (O+)Folio 022604Fecha311007

Donador 2 Rodriacuteguez Nuacutentildeez Joseacute Angel (A+) Folio 022605

Fecha311007

SALINA RAacutePIDA

M1 m1 M2 m2 AutotestigoGR de donador 1+ suero del

paciente

GR del paciente+ suero dedonador 1

GR de donador 2+ suero del

paciente

GR del paciente+ suero dedonador 2

GR del paciente+ suero del

paciente

- 4+ 4+ 4+ -

SALINA 37deg BANtildeO MARIacuteA

M1 m1 M2 m2 Autotestigo- 4+ 4+ 4+ -

Compatible Nocompatible

Nocompatible

Nocompatible

Compatible

SALINA COOMBS

Por lo tanto se puede decir que el donador 1 (O+) puededonar suero al paciente (B+) debido a que en el suero nohay anticuerpos de ninguacuten tipo que reaccionen con losantiacutegenos de los eritrocios del Donador 1 Mientras tantoel Donador 2 no puede donar al Paciente ni suero nieritrocitos

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M1 Autotestigo- -

Compatible

Compatible

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INTERPRETACIOacuteN

PRUEBA POSITIVA Existe una aglutinacioacuten de lasceacutelulas sanguiacuteneas que indica la presencia delantiacutegeno A o B En el suero de Coombs notamos si esta

la precencia de Antiacutegeno D en los eritrocitos Lahemoacutelisis no se debe interpretar como resultadopositivo ya que puede indicar contaminacioacuten delreactivo

PRUEBA NEGATIVA La no aglutinacioacuten indica unresultado negativo e indica que las ceacutelulas sonnegativas para Antiacutegenos del sisitema ABO y D

CONCLUSIOacuteN

He concluido que en las transfusiones de sangre no essuficiente con conocer que la sangre del donante y la delreceptor son del mismo grupo o bien que la del donantepertenezca al grupo O (cero) sino que es necesarioconocer si la compatibilidad es perfecta porque ninguacutenotro fenoacutemeno de inmunizacioacuten interfiera Es en estesentido por lo que son empleadas las pruebas cruzadas

Praacutectica No 7ldquoPrueba de compatibilidad sanguiacutenea (teacutecnica albumina)rdquo

IntroduccioacutenLa tipificacioacuten de sangre identifica el tipo sanguiacuteneo determinandoantiacutegenos presentes en los eritrocitos detecta aloanticuerpos encontra esos antiacutegenos Asiacute los aloanticuerpos pueden aparecernaturalmente o ser inducidos y pueden ser dirigidos contra del grupoconocido o a los antiacutegenos de superficie de los eritrocitos La prueba

de compatibilidad sanguiacutenea o cross matching esta formada por laprueba mayor y menorLa prueba de cruzamiento mayor para losaloanticuerpos consiste en probar el plasma del receptor contra los

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gloacutebulos rojos del donante Es incompatible cuando se genera unareaccioacuten hemoliacutetica los eritrocitos del donante se destruyen por losaloanticuerpos del plasma del receptor La prueba menor es una pruebapara los aloanticuerpos del plasma del donante en contra los gloacutebulosrojos del receptor Una incompatibilidad menor es una causa menosfrecuente para causar una reaccioacuten en contra una transfusioacuten porque

el volumen de plasma del donante es menor y es diluido marcadamente enel receptor Para llevar a cabo dicho procedimiento se utilizandiversos reactivos como potencializadores que mejoran la unioacuten deeritrocitos con alguacuten tipo de anticuerpo Uno de esospotencializadores es la albuacutemina La albumina bovina polimerizada esun reactivo muy utilizado en el laboratorio de inmunohematologia y encentros de bancos de sangre funciona como un potencializador quefacilita la reaccion de aglutinacioacuten de eritrocitos sensibilizados Alfinal de la prueba se prueban los eritrocitos con el reactivo deCoombs El principio de la prueba de Coombs fue descrito por Moreschien 1908 pero Coombs Mourant y Race en 1946 la introdujeron en elestudio de los grupos sanguiacuteneos y anticuerpos cuando una parte desangre (suero) fue usada para la inoculacioacuten de animales para

inmunizarlos con proteiacutena humana utilizando el anticuerpo obtenido enla deteccioacuten de los llamados anticuerpos incompletos Esta prueba seusa para determinar la presencia de anticuerpos no aglutinantes en elsuero de sujetos sensibilizados a uno o mas antiacutegenos sanguiacuteneos Esuacutetil en el estudio del suero de mujeres con isoinmunizacioacuten materno-fetal y se emplea tambieacuten en otro tipo de pruebas como identificacioacutende anticuerpos autoinmunes deteccioacuten de algunos sistemas sanguiacuteneos ypruebas de compatibilidad sanguiacutenea La prueba indirecta se realizacon eritrocitos normales incubados in Vitro con el suero de estudioDurante este periodo si existe un anticuerpo este se fija sobre surespectivo determinante antigeacutenico Una vez fijados los eritrocitosson igualmente lavados y se agrega el reactivo de Coombs produciendoaglutinacioacuten Una prueba de Coombs indirecta positiva significa que

existen anticuerpos libres en el suero de la persona los cualespuedan ser igualmente auto-anticuerpos o isoanticuerpos

Objetivo Determinacioacuten de los antiacutegenos del sistema ABO Rh (D) y sucompatibilidad entre un paciente Donador y un Paciente Receptor

Material y equipo

5 Tubos de ensaye

6 Pipetas Pasteur

1Gradilla

1 Bulbo

Papel Parafilm

Microcentriacutefuga

Bantildeo Mariacutea oacute Estufa

Material bioloacutegico

Muestras de sangre de extraccioacuten reciente recogida conanticoagulante o sin anticoagulante

ReactivosSuero de CoombsAlbuacutemina bovina deg

Suero anti-globulina humana Lafon Lote 406 Cad 310109 Color verde Aspecto

transparentedegAlbumina de bovino polimerizada Interbiol Lote APO107 Cad 150109 Color incoloroAspecto transparente

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Teacutecnica

1 Montar prueba mayor 1 y 2 prueba menor 1 y 2 y autotestigocon el procedimiento ya anteriormente conocido

2 Agregar 2 gotas de albuacutemina al 223 Centrifugar 20 segundos4 observar aglutinacioacuten o hemolisis o no aglutinacioacuten5 A los tubos con lecturas negativas incubar 20 minutos en bantildeo

Mariacutea a 37 degC6 Centrifugar y observar

bull Aglutinacioacuten o hemoacutelisis reportar incompatible

bull No aglutinacioacuten llevar a Coombs

7 Lavar tres veces decantar y quitar el exceso de salina congasa y agregar 2 gotas de reactivo de Coombs y centrifugar 20segundos y observar

bull Aglutinacioacuten o hemoacutelisis reportar incompatible

bull No aglutinacioacuten reportar compatible

Resultados1 PRUEBA MAYOR 1 2 Gotas de suero del paciente + 1 gota de GR al 3-5 del

donador 12 PRUEBA MENOR 1 2 Gotas de suero del donador 1 + 1 gota de GR al 3-5 del

paciente3 PRUEBA MAYOR 2 2 Gotas de suero del paciente + 1 gota de GR al 3-5 del

donador 24 PRUEBA MENOR 2 2 Gotas de suero del donador 2 + 1 gota de GR al 3-5 del

paciente5 AUTOTESTIGO 2 Gotas de suero del paciente + 1 gota de GR al 3-5 del paciente

M1 m1 M2 m2 AutotestigoCon albuacutemina - - - - -Despueacutes de incubacioacuten a 37 degC - - - - -Despueacutes de Coombs - - - - -Despueacutes de validacioacuten con gloacutebulos

positivos+ + + + +

InterpretacioacutenPrueba positiva Alutinacioacuten o hemolisis Indica no compatibilidadPrueba negativaNo aglutinacioacuten Indica compatibilidad

Esquemas

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ConclusioacutenConcluyo que la prueba de compatibilidad sanguiacutenea en su modalidad conalbuacutemina bovina ofrece mucha ventaja al ser al igual que otrosreactivos un potencializador de la reaccioacuten antiacutegeno-anticuerpo Estopermite que el operador o realizador de la prueba tenga mayorconfianza y certeza en los resultados que obtenga

PRACTICA No 8PRUEBA DE COMPATIBILIDAD SANGUINEA PRUEBA DE LISS

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FUNDAMENTO

LISS es utilizado para reducir la fuerza ioacutenica del medio

de reaccioacuten en los procedimientos de deteccioacuten eidentificacioacuten de anticuerpos y en las pruebas decompatibilidad La presencia de este reactivo refuerza lainteraccioacuten antiacutegeno - anticuerpo durante la incubacioacuten

GENERALIDADESEl uso de solucioacuten salina de baja fuerza ioacutenica fuedescrito inicialmente en 1964 por Hughes-Jones y col y

Elliot y col pero en ese tiempo su uso era limitado yaque la concentracioacuten molar obtenida provocaba la hemoacutelisisde los eritrocitos suspendidos

En 1974 Low y Messeter describieron el uso rutinario de lasolucioacuten Liss de 003 M que lograba reducir el tiempo deincubacioacuten y no presentaba tendencia a la hemoacutelisis al sersuspendidos en salina a baja fuerza ioacutenica restableciendola presioacuten osmoacutetica de la solucioacuten mediante la adicioacuten deglicinaLas soluciones de baja fuerza ioacutenica son actualmente lasmaacutes utilizadas en inmunohematologiacutea provocando un aumentoen la velocidad de asociacioacuten entre antiacutegenos y anticuerpospermitiendo asiacute acortar el tiempo de incubacioacuten de 60minutos a 10-15 minutos sin sacrificar la sensibilidad delas mismas y sin costos elevadosSe ha observado que lasreacciones antiacutegeno-anticuerpo se ven potenciadas alreducir la fuerza ioacutenica del medio de reaccioacuten

La fuerza ioacutenica es uno de los factores maacutes importantes quedeterminan la tasa y la cantidad de captacioacuten deanticuerpos por parte de los eritrocitos El uso de mediosde reaccioacuten de baja fuerza ioacutenica permite disminuir eltiempo de incubacioacuten y potenciar las reacciones de losanticuerpos sin incrementar las reacciones inespeciacuteficas

Los iones Na+ y Cl- presentes en la solucioacuten salinafisioloacutegica se agrupan alrededor de las moleacuteculas deantiacutegeno y anticuerpo neutralizando sus cargas opuestas locual dificulta la unioacuten entre ellos Este efecto se reduceutilizando soluciones de baja fuerza ioacutenica y disminuyendode esta manera la incubacioacuten de las pruebas

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En esta etapa de sensibilizacioacuten las posibilidades deasociacioacuten pueden incrementarse mediante agitacioacutencentrifugacioacuten yo variacioacuten de la concentracioacuten delanticuerpo

Despueacutes de que el anticuerpo se ha fijado al antiacutegeno loseritrocitos sensibilizados deben unirse para dar lugar a laaglutinacioacuten visible esta red tambieacuten solidifica yestabiliza la reaccioacuten

En esta etapa la reaccioacuten depende de factores como lascaracteriacutesticas del anticuerpo localizacioacuten en la membranay nuacutemero de sitios antigeacutenicos fuerzas que mantienen ladistancia entre los eritrocitos

Las caracteriacutesticas del anticuerpo que deben considerarse

son el tamantildeo del anticuerpo involucrado y el nuacutemero desitios de combinacioacuten con el antiacutegeno Los anticuerpos IgMpueden establecer puentes entre los eritrocitos yaglutinarlos espontaacuteneamente en solucioacuten salina mientrasque los IgG no ya que las IgM pentameacutericas poseen 10sitios de combinacioacuten con el antiacutegeno y las IgG diacutemerossoacutelo dos sitios

Los eritrocitos tienen una carga neta negativa en susuperficie su interaccioacuten con los iones del medio alteraesta carga y producen una carga neta criacutetica denominada

potencial zeta y la reduccioacuten de dicha carga permite quelos eritrocitos se aproximen lo suficiente para que seanaglutinados por medio de los IgG que los sensibilizaron

Las soluciones de baja fuerza ionica empleadas en banco desangre tienen un pH entre 65 ndash 70 se recomienda unaosmolalidad de 270 ndash 305 mosmkg y una conductividad de 37mmcm El control diario implica el examen de su aparienciafiacutesica ausencia de turbidez particulas o sedimento asiacutecomo corroborar la capacidad para generar hemoacutelisiscrenacion o prueba de coombs positiva en eritrocitos

normales Cada lote nuevo se valora mediante el rastreo deun anticuerpo ya sea un anti- D un anti- jk anti- fy oanti- kell diluido se compara su capacidad de deteccioacutencontra un medio salino normal incubando 10min a 37ordmC enLISS debe poder rastrearse un anticuerpo en tanto que enmedio salino no

MATERIAL Y EQUIPO

Material Cantidad10 Tubos de ensayo de 12 x 75

1 Gradilla10 Pipetas pasteur

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1 Bulbo1 Marcador1 Microcentriacutefuga1 Bantildeo Mariacutea

MATERIAL BIOLOGICO

Gloacutebulos rojos lavados al 3 - 5Suero

REACTIVOS

Reactivo de LISSReactivo de Coombs

TECNICA1- Lavar los eritrocitos

Separar el suero del paquete de gloacutebulos rojos

Agregar cierta cantidad de eritrocitos a un tubo deensayo y agregarle solucioacuten salina

Centrifugar y decantar

Repetir este proceso 3 veces

2- Realizar la Prueba de LISS

Enumerar los tubos Poner dos gotas de LISS en cada tubo agregar una gota

de eritrocitos lavados y al 3 - 5 seguacuten el nuacutemero detubo correspondiente

Mezclar y centrifugar un minuto decantar elsobrenadante y con la ayuda de una gasa limpiar elexceso del reactivo

Poner nuevamente 2 gota de LISS resuspender poragitacioacuten agregar 2 gotas de suero problema mezclarincubar 15 minutos a 37ordm C centrifugar 30 seg A 1000

RPM Anotar los resultados

3- A las pruebas negativas realizar Coombs

Lavar 3 veces las ceacutelulas agregar suero de Coombscentrifugar 30 seg

Leer aglutinaciones y anotar resultados

REACTIVOS UTILIZADOS

REACTIVO MARCA FECHA DECADUCIDAD

ASPECTO COLOR LOTE

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SueroAntiglobuina

humana

Lafon 31 01 2009 Transparente Verde 406

LISS Caserorealizado enCMNSIGLOXXI

1 antildeo Transparente Transparente

----------

PACIENTE ASCANIO MENDEZ JOSUE O (+)DONADOR 1 GARCIA CARBAJAL OSCAR O (+)DONADOR 2 GARCIA SUAREZ ORLANDO A (+)

RESULTADOS

INTERPRETACIOacuteN DE LOS RESULTADOS

La hemoacutelisis o la aglutinacioacuten representan un resultado positivo e indican lapresencia de una reaccioacuten antiacutegeno-anticuerpo Los resultados negativos no severa aglutinacioacuten o hemolisis

ESQUEMAS

CONCLUSIONES

Concluyo que la prueba de compatibilidad sanguiacutenea en su modalidad conliss ofrece mucha ventaja al ser al igual que otros reactivos unpotencializador de la reaccioacuten antiacutegeno-anticuerpo Esto permite queel operador o realizador de la prueba tenga mayor confianza y certezaen los resultados que obtenga

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Tubo Resultado

M1 NEGATIVOm1 NEGATIVO

M2 POSITIVO

M2 NEGATIVO

AUTOTES NEGATIVO

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PRACTICA 9INMUNOHEMATOLOGIA

DETERMINACION DE COOMBS DIRECTO

INTRODUCCIONPRUEBA DE COOMBS DIRECTA

El examen de Coombs directo se utiliza para detectar autoanticuerpos contralos propios gloacutebulos rojos (GR) de un individuo Es una prueba que sirve parademostrar el revestimiento de los eritrocitos in vivo (mientras los eritrocitosestaacuten circulando en el individuo) La prueba se realiza agregando directamenteel reactivo de Coombs a los eritrocitos previamente lavados para eliminar otras proteiacutenas no fijadas a el una prueba directa positiva significa que larelacioacuten antiacutegeno-anticuerpo ocurrioacute in vivo es decir que la fijacioacuten del

anticuerpo sobre el antiacutegeno se realizo en el organismo del individuo enestudio

Las indicaciones principales de esta prueba son diagnostico de enfermedadeshemoliacuteticas ictericia o anomaliacuteas en la apariencia de los gloacutebulos rojos bajo elmicroscopio ya que estos anticuerpos algunas veces destruyen los gloacutebulosrojos y causan anemia para investigar reacciones en transfusiones Parainvestigar la induccioacuten de drogas en ceacutelulas rojas sensibilizadas medicamentos(por ejemplo quinidina metildopa procainamida y otros) que pueden llevar a la produccioacuten de estos anticuerpos

OBJETIVO Determinar la presencia de anticuerpos en la superficie de losgloacutebulos rojos del individuo

MATERIAL

bull 10 Tubos de 1275

bull 10 Pipetas Pasteur

bull 1 Gradilla

bull 1 Bulbo

bull Papel Parafilm

bull Microcentriacutefuga

bull Bantildeo Mariacutea a 37degC

MUESTRA BIOLOGICA

Eritrocitos lavados de (3-5) del donador o pacienteREACTIVO

Suero de CoombsSuero anti-globulina humana Lafon Lote 406 Cad 310109 Color verde Aspecto transparente

TECNICA

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Colocar en un tubo de ensaye dos gotas de suero de Coombs mas una gota deglobulos rojos (3-5)Centrifugar a 1000 rpm durante 20 segDesprender el boton suavemente y buscar la presencia de aglutinacionRotular y enumerar 8 tubos de ensayes con las diferentes diluciones

(frac12frac1418)Enumerar 8 tubos mas del 1 al 8Agregar a cada tubo de las diluciones 10 gotas de solucion salina mas 10 gotasde suero de CoombsColocar Al primer tubo de la dilucion 1 gota de globulos rojos (3-5) mezclar completamente y agregar al tubo 1Centrifugar todos los tubos a 1000 rpm durante 20 seg

LECTURA

Aglutina- Prueba de Coombs directa es positiva

No aglutina- Prueba de Coombs directa es negativa

ESQUEMAS y RESULTADOS

CONCLUCION

He concluido que la prueba de Coombs directa es una prueba que se utiliza para medir

la presencia de anticuerpos en la superficie de los gloacutebulos rojos que se encuentran

circulando en el paciente y se realiza para investigar reacciones en transfusiones ademaacutes

sirve para la determinacioacuten de anemia hemoliacutetica autoinmune entre otras afecciones

Practica 10

IDENTIFICACION DE ANTICUERPOS IRREGULARES

Fundamento

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DILUCIONES

frac12 positiva

frac14 positiva

18 positiva

116 negativa

132 negativa

164 negativa

1128 negativa1256 negativa

31

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Los anticuerpos del sistema ABO aparecen una vez que elindividuo entra en contacto con el medio ambiente y en elcual se encuentran microorganismos como algunas bacteriascoliformes que contienen sustancias quiacutemicas en suestructura parecidas a las de este sistema Por anticuerpos

regulares debemos identificar a los que existen en todoslos individuos y que eacutestos tendraacuten durante toda su vida

Los anticuerpos irregulares son los que no estaacuten de esamanera aunque en el caso de los naturales no se conoce aciencia cierta queacute o coacutemo se induce su produccioacuten Losadquiridos se conocen tambieacuten como inmunes y son elresultado de la exposicioacuten a antiacutegenos desconocidos por elindividuo al momento de la transfusioacuten o en las mujerespor el embarazo estos anticuerpos son dirigidos contraantiacutegenos de sistemas diferentes al ABO

Los anticuerpos naturales regulares son preferentementeinmunoglobulinas M las cuales fijan de manera taneficiente el complemento que pueden provocar lisisintravascular y ocasionar insuficiencia renal o incluso lamuerte del paciente Los anticuerpos adquiridos o inmunesson generalmente inmunoglobulinas G las cuales producenhemoacutelisis extravascular en el bazo o en el hiacutegado mediantefagocitosis del complejo eritrocito maacutes anticuerpo

Los aloanticuerpos irregulares (adquiridos) maacutes comunes en

nuestra poblacioacuten son los que involucran a los sistemasMNSs P1 Kidd (Jka Jkb) Duffy (Fya Fyb) Kell Lewis yDiego

OBJETIVO identificacioacuten del anticuerpo irregular a traveacutesde las diferentes teacutecnicas

MATERIAL

bull 10 Tubos de ensaye

bull 10 Pipetas Pasteur

bull

1Gradillabull 1 Bulbo

bull Papel Parafim

MATERIAL BIOLOGICO

bull Gloacutebulos rojos lavados al 3 - 5

bull Suero

bull REACTIVOSReactivos

1 Suero de Coombs2 Albuacutemina bovina

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bull EQUIPO1 Microcentriacutefuga2 Bantildeo Mariacutea oacute Estufa

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3 SOLUCION SALINA4 SOLUCION DE LISS

TEacuteCNICA SOLUCION SALINA

Lavar los eritrocitos con solucioacuten salina (3veces)SALINA RAacutePIDA

Agregar una gota de Eritrocitos LavadosDiluiacuterlo al 3-5 con solucioacuten salina 09Agregar 2 gotas de sueroCentrifugar y observar anotar desprendimientodel botoacuten

SALINA 37deg BANtildeO MARIacuteA1) Incubar tubos a Bantildeo mariacutea a 37degC durante 1

hora (o 20 min)

2) Centirfugar despueacutes de haber pasado eltiempo

3) Desprender el botoacuten de eritrocitos yobservar

AGLUTINACIOacuteNndash No es compatibleNO AGLUTINACIOacuteN - Lavar 3 veces

SALINA COOMBS1) Con solucioacuten salina 09 lavar los

eritrocitos de los tubos q no tuvieronaglutinacioacuten 3 veces

2) Decantar y agregar 2 gotas de reactivode Coombs

AGLUTINACIOacuteN ndash No es compatibleNO AGLUTINACIOacuteN - Lavar 3 veces

TECNICA LISS

1 Poner dos gotas de LISS en cada tubo agregar una gotade eritrocitos lavados y al 3 - 5 seguacuten el nuacutemero detubo correspondiente

2 Mezclar y centrifugar un minuto decantar el

sobrenadante y con la ayuda de una gasa limpiar elexceso del reactivo

3 Poner nuevamente 2 gota de LISS resuspender poragitacioacuten agregar 2 gotas de suero problema mezclarincubar 15 minutos a 37ordm C centrifugar 30 seg A 1000RPM

4 Anotar los resultados

A las pruebas negativas realizar Coombs

1 Lavar 3 veces las ceacutelulas agregar suero de Coombs

centrifugar 30 seg2 Leer aglutinaciones y anotar resultados

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TECNICA ALBUMINA BOVINA 8 Agregar 2 gotas de albuacutemina al 229 Centrifugar 20 segundos10observar aglutinacioacuten o hemolisis o no aglutinacioacuten

11A los tubos con lecturas negativas incubar 20minutos en bantildeo Mariacutea a 37 degC12Centrifugar y observar

bull Aglutinacioacuten o hemoacutelisis reportar incompatible

bull No aglutinacioacuten llevar a Coombs

13Lavar tres veces decantar y quitar el exceso desalina con gasa y agregar 2 gotas de reactivo deCoombs y centrifugar 20 segundos y observar

bull Aglutinacioacuten o hemoacutelisis reportar incompatible

bull No aglutinacioacuten reportar compatible

Resultados ANTICUERPO IRREGULAR Anticuerpo c

InterpretacioacutenEstos anticuerpos son generalmente inmunoglobulinas tipo My ocasionalmente tipo G y debido a esa temperatura dereaccioacuten carecen de importancia cliacutenica salvo que sureaccioacuten ocurra tambieacuten a 37 degC su importancia radica enpacientes que seraacuten intervenido a 22 ordmc como es el caso de

operacioacuten de corazoacuten

Los llamados anticuerpos calientes tienen una temperatura oacuteptima dereaccioacuten a 37 degC a Estos anticuerpos tienen una relevanteimportancia cliacutenica ya que se les asocia con reaccionestransfusionales de intensidad moderada a severa que puedenocasionar la muerte

Esquemas

CONCLUSIONHe concluido que es importante determinar los anticuerposirregulares ya que estos anticuerpos tienen una relevanteimportancia cliacutenica ya que se les asocia con reaccionestransfusionales de intensidad moderada a severa

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Material y equipo

bull 40 tubos de ensayo de 12 x 75

bull 4 pipetas Pasteur

bull 1 gradilla de unicel

bull 3 tubos Vacutiner con muestra sanguiacutenea anticoagulada con EDTA

bull 1 tubo Vacutainer con muestra sanguiacutenea sin anticoagulante

bull Antisuero Anti-A Anti-AB Anti-B y Anti-D

bull Eritrocitos con antiacutegenos conocidos A1 A2 B y O

bull 1 centrifuga

Reactivos

Antisuero A monoclonal Lafon Antisuero AB monoclonal LafonLote9662 Lote 8764Cad 09NOV08 Cad 31OCT08Aspecto transparente AspectotransparenteColor azul Color incoloro

Antisuero B monoclonal Lafon Antisuero D monoclonal NOVACLONE

Lote 9762A Lote NDMG04305Cad09NOV08 Cad 29MAR08Aspecto transperente Aspecto transperenteColor amarillo Color incoloro

Teacutecnica

Meacutetodo directo

1 Centrifugar los 3 tubos Vacutiner con muestra sanguiacutenea anticoagulada con EDTA y eltubo Vacutainer con muestra sanguiacutenea sin anticoagulante a una velocidad de 2500rpm por 10 minutos pues se utilizaran plasma y eritrocitos por separado

2 Rotular los tubos de ensayo de la siguiente manera en cada tubo rotular dos nuacutemeros

en la muestra uno correspondiente del 1 al 4 el otro numero corresponde al que yatraiacutea la muestra y con el tipo de antisuero Anti-A Anti-AB Anti-B oacute Anti-D Ejemplo 113 Anti-A 113 Anti-AB etc El procedimiento se repite para las tres muestrasrestantes

3 En cuatro tubos limpios hacer una dilucioacuten de 2-5 de eritrocitos con agua destiladade cada muestra La dilucioacuten tomara un color rojo tenue similar a la sangriacutea

4 Colocar en cada tubo rotulado una gota de la dilucioacuten de eritrocitos preparada y unagota de antisuero seguacuten corresponda

5 Al concluir lo anterior llevar los tubos a la centrifuga y centrifugar por solo 15 segundosa una velocidad de 1000 rpm para observar mejor la reaccioacuten antigeno-anticuerpo(formacioacuten de un botoacuten)

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6 Por ultimo leer los tubos observando si hubo reaccioacuten o no y correlacionando losdatos obtenidos con el meacutetodo inverso para determinar el grupo sanguiacuteneo

Metodo inverso

1 Centrifugar los 3 tubos Vacutiner con muestra sanguiacutenea anticoagulada con EDTA y eltubo Vacutainer con muestra sanguiacutenea sin anticoagulante a una velocidad de 2500rpm por 10 minutos pues se utilizaran plasma y eritrocitos por separado

2 Rotular los tubos de ensayo de la siguiente manera en cada tubo rotular dos nuacutemeros

en la muestra uno correspondiente del 1 al 4 el otro numero corresponde al que yatraiacutea la muestra y con el tipo de eritrocitos con antigeno conocido A 1 A2 B y OEjemplo 113 A1 113 A2 etc El procedimiento se repite para las tres muestrasrestantes

3 Colocar en cada tubo rotulado dos gotas ya sea de plasma o suero seguacuten corresponday una gota de los eritrocitos con antigeno conocido

4 Al concluir lo anterior llevar los tubos a la centrifuga y centrifugar por solo 15 segundos

a una velocidad de 1000 rpm para observar mejor la reaccioacuten antigeno-anticuerpo(formacioacuten de un botoacuten)

5 Por ultimo leer los tubos observando si hubo reaccioacuten o no y correlacionando losdatos obtenidos con el meacutetodo inverso para determinar el grupo sanguiacuteneo

Resultados

Muestra Meacutetodo directo Meacutetodo inverso

Anti-A Anti-AB Anti-B Anti-D A1 A2 B O

Grupo y

Rh1 - - - + + + + - O +

2 - + + + + + - - B +

3 + + - + - - + - A +

4 + + + + + - - - AB +

InterpretacioacutenPara el meacutetodo directo la loacutegica fue si en un tubo hay formacioacuten de botoacuten (reaccioacuten antigeno-anticuerpo) quiere decir que los eritrocitos ensayados tienen el antigeno que reacciona con losanticuerpos presentes en el antisuero para ese tubo y si no presentan aglutinacioacuten querraacutedecir que no corresponde el antigeno del eritrocito con el anticuerpo del antisuero o que el

antigeno esta ausente en esos eritrocitos De ahiacute que pueda observarse que una muestrasanguiacutenea muestre un solo tipo de antiacutegenos del sistema ABO sobre su membrana (A o B)ambos antiacutegenos (AB) o ninguno de ellos (O) lo mismo sucede para el sistema Rh alpresentarlo (Rh +) o no (Rh -)Para el meacutetodo inverso el razonamiento fue si en un tubo hay formacioacuten del botoacuten (reaccioacutenantigeno-anticuerpo) quiere decir que el plasma del paciente ensayado tiene los anticuerposque reaccionan con los eritrocitos con antigeno conocido los cuales sirven de reactivo paraesta prueba Por lo tanto una reaccioacuten positiva en este meacutetodo definitivamente indica que elpaciente no tiene eritrocitos con antiacutegenos que reaccionariacutean con los anticuerpos de su plasmaDe ahiacute que el meacutetodo se le nombre inverso

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ConclusioacutenConcluyo que Para realizar una transfusioacuten sanguiacutenea se debe tomar en cuenta la sangre deldonante y la del receptor Los individuos pertenecientes al grupo O pueden donar sangre acualquier otro grupo sanguiacuteneo porque sus eritrocitos carecen de antigeno que puedan ser reconocidos por la sangre del receptor Las personas del grupo AB pueden recibir sangre decualquier grupo ya que carecen de anticuerpos

PRACTICA Nordm 2DETERMUNACION DE SUBGRUPOS

Anti- A1 Lectina(Dolichos biflorus)

Lectina de grupo sanguiacuteneo

INTRODUCCION

El sistema de grupos sanguiacuteneos ABO sigue siendo el primeroa tener en cuenta en el momento de realizar una transfusioacutende sangre Los antiacutegenos A y B son productos geacutenicosfaacutecilmente detectables y constituyen marcadoresgeneacuteticos de gran valor Entre los individuos A se

distinguen 2 categoriacuteas A1y A2

La diferenciacioacuten entre ambas se realiza mediante lautilizacioacuten de anticuerpos monoclonales y lectinasespeciacuteficas de grupo sanguiacuteneo Dolichos biflorus (anti A1)y Ulex europaeus (anti H)

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Uso Inmucor anti-A1 Lectin se utiliza para diferenciar ceacutelulas rojas A1 de otros

subgrupos A en pruebas en tubo o en placa

MATERIAL Y EQUIPObull Tubos de ensaye de 1075 mm

bull Cronometro

bull Marcador

bull Centrifuga seroloacutegica

MUESTRA BIOLOGICAbull Ceacutelulas rojas de donador o paciente

REACTIVObull Inmucor anti-A1 Lectin en gotero

MARCA INMUCOR INC

LOTE SN2132

CADUCIDAD 2007-12-14

TECNICA

1 Adicione una gota de anti-A1 a tubos adecuadamente marcados

2 Adicione una gota de una suspensioacuten de eritrocitos bajo prueba del 3-5 en

salina Mezcle completamente el contenido del tubo

3 Centrifugar de 15-30 minutos de 900-1000 rpm

4 Agite suavemente el tubo y resuspenda el botoacuten celular Examine las reacciones

resultantes macroscoacutepicamente Registre resultados

RESULTADOS ESPERADOS DE TIPIFICACION

GRUPOSANGUINEO

Anti-A Anti-A1 Porciento

A1 + + 80 DE TODOSLOS GRUPOS A

A1b + + 80 DE TODOSLOS GRUPOS AB

A2 + 0 20 DE TODOSLOS GRUPOS A

A2B + 0 20 DE TODOSLOS GRUPOS AB

A1NT + +DEBIL NO COMUNA3AM1AX1 + DEBIL 0 NO CUMUN

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ANTI-H (LECTINA)

Ulex europeaus

Para la determinacioacuten de del estado secretor y tipificacioacuten de las ceacutelulas rojas

INTRODUCCIONLa mayoriacutea de los grupos sanguiacuteneos ABO que se determinanen el banco de sangre cumplen con las leyes establecidas deantiacutegenos y anticuerpos reciacuteprocos para ese sistema

Los anticuerpos del sistema ABO existen en el individuodesde el momento en que son capaces de tener una respuestainmunoloacutegica y se producen contra los antiacutegenos A y B

Los subgrupos son fenotipos ABO que difieren en la cantidad

de antiacutegeno presente en los eritrocitos y en la saliva delos secretores Se hallan con mayor frecuencia y tienen maacutesrelevancia cliacutenica los de A que los de B Al utilizarlectinas se definen los subgrupos A1 y A2 con el extractode Dolichos biflorus se aglutinan los eritrocitos A1 perono los de A2 y el anti H semilla Ulex europeus aglutinaeritrocitos que tienen antiacutegeno H

MATERIAL Y EQUIPObull Tubos de ensaye de 1075mm

bull Cronometro

bull Marcador

bull Centrifuga seroloacutegica

MUESTRA BIOLOGICAbull Ceacutelulas rojas de donador o paciente

REACTIVObull Inmucor anti-H (Lectina) en gotero

MARCA GANMA

LOTE ML1581

CADUCIDAD 2007-11-14

TECNICA

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1 Adicione una gota de una suspensioacuten de eritrocitos bajo prueba del 3-5 en

salina en tubos adecuadamente marcados

2 Adicione dos gotas de anti-H Lectina y mezcle completamente el contenido del

tubo

3 incube durante 5 minutos a temperatura ambiente

4 Centrifugar de 15-30 minutos a 1000 rpm5 Agite suavemente el tubo y resuspenda el botoacuten celular Examine las reacciones

resultantes macroscoacutepicamente Registre resultados

INTERPRETACIOacuteN

PROBLEMA ANTI A1 ANTI H

(ANTI A2)

RESULTADO

SUBGRUPO

PACIENTE 1 + - ANTI A1

PACIENTE 2 - + ANTI A2

bull Prueba positiva Aglutinacioacuten de las ceacutelulas rojas

Nota La hemoacutelisis no debe interpretarse como un resultado positivo ya que esto

puede indetificarse como contaminacioacuten del reactivo

bull Prueba negativa Ausencia de aglutinacioacuten de las ceacutelulas rojas

CONCLUSIONES

Concluyo que para realizar unatransfusioacuten sanguiacutenea se debe tomar encuenta los subgrupos del donante y del

receptor Los subgrupo con mayorfrecuencia y tienen maacutes relevanciacliacutenica los de A que los de B Y seidentifican por medio de utilizarlectinas Los subgrupos A maacutesimportantes son A1 y A2

PRACTICA 3DETERMINACION DE Rh

INTRODUCCIOacuteN

El factor Rh es una clase de proteiacutena que se encuentra enlos gloacutebulos rojos de la sangre cuando alguien tiene esaproteiacutena se le considera ldquoRh Positivordquo Cuando no la tienees ldquoRh Negativordquo El factor Rh es hereditario y setransmite en dos genes El Factor Rh positivo es dominantees decir si una persona tiene un gen positivo y otronegativo su factor Rh seraacute positivo

Esta prueba es importante en el diagnostico y estudio

de la eritroblastosis fetal en la que los gloacutebulosrojos del nintildeo se encuentran sensibilizados con

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anticuerpo materno Es uacutetil tambieacuten en el diagnosticode la anemia hemoliacutetica adquirida (anticuerpos sobrelos gloacutebulo rojos del mismo paciente) asiacute como ladeterminacioacuten de eritrocitos sensibilizados en sangreusados para transfusioacuten

Las dos clasificaciones maacutes importantes para describirgrupos sanguiacuteneos en humanos son los antiacutegenos y el factorRh Las transfusiones de sangre entre grupos incompatiblespueden provocar una reaccioacuten inmunoloacutegica que puededesembocar en hemoacutelisis anemia fallo renal shock omuerte

MATERIAL

bull Tubos de ensayo de 12 x 75

bull Pipetas Pasteur

bull Gradilla

EQUIPO

bull Centrifuga

MUESTRA BIOLOacuteGICA

bull Eritrocitos lavados 3-5 del paciente

REACTIVOS

bull Antisuero Anti-D

bull Suero anti globulina humanabull Suero reactivo control

Antisuero D monoclonal NOVACLONELote NDMG04305CAD 29MAR08Aspecto transparenteColor incoloroSuero anti globulina HumanaLote 405CAD 06-NOV-08Aspecto transparenteColor verde

Reactivo control GAMMA-CLONELote GCM115-3CAD 2008-12-08Aspecto transparenteColor incoloro

TEacuteCNICA

Determinacioacuten de Rh

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bull Prepare una suspensioacuten de gloacutebulos rojos al 3-5 en solucioacuten salina Los gloacutebulos deben serlavados previamente 5 veces con el objeto deeliminar las proteiacutenas del plasma

bull Rotular 3 tubos para la previa identificacioacuten

de Rhbull Ponga 1 gota de la suspensioacuten lavada en cada

tubo

bull Antildeada una gota de anti suero D monoclonal

bull Mezcle y centrifugue 15 seg Y observe si hayaglutinacioacuten

Preparacioacuten del control negativo

bull Ponga una gota de eritrocitos lavados al 3-5

bull Antildeada una gota de reactivo control

bull

Centrifugue 15 seg y observe si hay aglutinacioacuten

Deteccioacuten de sangre Du

Nota esta teacutecnica se le realizo a los tubos problemasque no aglutinaron

bull Los tubos que no tuvieron aglutinacioacuten en ladeterminacioacuten de Rh se incuban 15 min yposteriormente se lavan 3 veces con sol Salina

bull Previamente lavados se le agregan 2 gotas de suerode COOMBS

bull Centrifugar 15 seg y observar desprender boton

ESQUEMAS

RESULTADOS problemas Aglutinacioacuten resultado2 positiva Rh +10 negativa Rh -11 negativa Rh -

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Paciente 2 coacutedigo 021612 plata Lugo JavierPaciente 10 coacutedigo 021620 Hernaacutendez Loacutepez GuillermoPaciente 11 coacutedigo 021621 camarillo Sonia rebeca

INTERPRETACIOacuteNPara el primer meacutetodoAglutinacion Rh positivoNo aglutinacioacuten realizar prueba de deteccioacuten desangre Du

Deteccioacuten de sangre DuAglutinacioacuten D deacutebil (Du positivo)No aglutinacioacuten Rh negativo

CONCLUSIONESCon el descubrimiento del sistema Rh se denominan Rhpositivos los hematiacutees que son aglutinados por esteanticuerpo y tienen por tanto el antiacutegeno Rh en lasuperficie Se denominan Rh negativos los que no sonaglutinados y que por tanto no poseen el antiacutegeno Rh ensu superficie

De la misma manera que en el sistema ABO en el sistema Rh

no se puede transfundir el antiacutegeno Rh a las personas queno lo tienen ya que podriacutea originar la produccioacuten deanticuerpos Rh en el receptor Los sujetos Rh negativossoacutelo podraacuten recibir sangre de donantes Rh negativos

PRACTICA 4INMUNOHEMATOLOGIA

DETERMINACION DE GRUPO SANGUINEO POR TECNICA DE GEL

INTRODUCCION

El sistema utilizado en inmunohematologiacutea para investigar e identificar antiacutegenos y

anticuerpos antieritrocitarios Es de tecnologiacutea de microtipificacioacuten en gel se basa en la

separacioacuten por tamantildeo de los eritrocitos aglutinados durante un proceso de

centrifugacioacuten en un gel poroso

Los eritrocitos van perdiendo elasticidad en sus membranas de forma que los

aglutinados grandes quedan atrapados en la zona superior y los pequentildeos quedan

distribuidos a lo largo de la columna

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Esta teacutecnica nos permite que estandaricemos la lectura de la reaccioacuten antiacutegeno-

anticuerpo con facilidad y repetitividad Asiacute como la estandariza del uso de reactivos

tiempos y lecturas disminuyendo sustancialmente la influencia de la mano de operador

OBJETIVO determinacioacuten de los antigenos del sistema ABORh (D) y determinacion

del grupo serico en tecnica de gel

FUNDAMENTOS

El principio del metdo se basa en la tecnica de gel descrita por Y Lapierre para la

deteccion de las reacciones de aglutinacion de los hematies La aglutinacion se produce

al entar en contacto los eritrocitos con los anticuerpos correspondientes

La tarjeta DG gel es un soporte de plastico constituidos por 8 microtubulos Cada

microtubulo esta formado por una columna y una camara de dispersionincubacion

La tecnologiacutea de microtipificacioacuten en gel se basa en la separacioacuten por tamantildeo de los

eritrocitos aglutinados durante un proceso de centrifugacioacuten en un gel poroso

Los eritrocitos van perdiendo elasticidad en sus membranas de forma que los

aglutinados grandes quedan atrapados en la zona superior y los pequentildeos quedan

distribuidos a lo largo de la columna

MATERIAL

Pipeta automaacutetica 10 ul 50ul 1 ml

Puntas de pipeta desechable Tubos de vidrios

DEG sol

Centrifugas para tarjetas DG gel

Hematies de reactivos para grupo inverso

MUESTRA BIOLOGICACeacutelulas rojas de donador o paciente

REACTIVO

Placa de gelReactivo de gel sol

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TECNICA1- determinacion de los antigenos del sistema ABORh

-preparar una suspension de hematies al 5 de DG sol Asegurar la resuspencion de lso

hematies antes de utilizar

Anadir en cada microtubulos indicados 10 ul de una suspension de hematies al 5

2- determinacion de l grupo serico-homogenizar los hematies recativos A1B

- dispersar el microtubulo N a1 50 ul de hematies reactivos A1 en un microtubulo Nb

50 ul de hematies reactivos B

-antildeadir suero o plasma

3- centrigugar en centrifuga para DG sol

Leer los resultados

RESULTADOS

NEGATIVO - Banda de hematies al fondo de la columna resto de la columna sin

aglutinados

POSITIVO

+- Escasoa glutinados de pequentildeo tamantildea d ela columna

1+ Algunos aglutinados pequentildeso en la columna

2+ aglutinados pequentildeso en la columna o mediano a lo largo de la columna

3+ Banda superior de aglutinado

4+ Banda de aglutinados en la parte superior de la columna

DP Doble poblacion (doble banda de hematies en el fondo y en la parte

superior

INTERPRETACION DE RESULTADOS

GRUPO HEMATICO GRUPO SERICOmicrotubo

Amicrotubo

Bmicrotubo

ABmicrotubo

CTL

MICROTUBUBON+ a1

MICROTUBUBON+ B

ABOGRUPO

0 0 0 0 + + 0+ 0 + 0 0 + A

0 + + 0 + 0 B

+ + + 0 0 0 AB

SISTEMA RhMicrutubo D Micrutubo

DrdquoMicrutuboCTL

INTERPRETACION

+ + 0 D positivo

0 0 0 D negativo

0 + 0

+ 0 0

D deacutebil parcial

RESULTADO E INTERPRETACION DE LA PRACTICA

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Resultado A+

CONCLUSION

Concluyo que esta teacutecnica es una forma de estabilizar las reacciones de aglutinacioacuten y

reducir los resultados falsamente negativos a consecuencia de una teacutecnica inapropiada

asi como crear un meacutetodo de interpretaciones sencillas y constantes

Practica No 5ldquoPrueba de compatibilidadrdquo

Introduccioacuten

Para requerir una oacuteptima transfusioacuten actualmente serequiere de aceptaciones inmunoloacutegicas receptor - donanteya que la transfusioacuten de sangre o la de sus componentescelulares de un donante a un receptor es una forma detransplante

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La prueba de Coombs se usa para determinar la presencia deanticuerpos no aglutinantes en el suero de sujetossensibilizados a uno o mas antiacutegenos sanguiacuteneos Es uacutetil enel estudio del suero de mujeres con isoinmunizacioacutenmaterno-fetal y se emplea tambieacuten en otro tipo de pruebas

como identificacioacuten de anticuerpos autoinmunes deteccioacutende algunos sistemas sanguiacuteneos y pruebas de compatibilidadsanguiacutenea

La prueba indirecta se realiza con eritrocitos normalesincubados in Vitro con el suero de estudio Durante esteperiodo si existe un anticuerpo este se fija sobre surespectivo determinante antigeacutenico Una vez fijados loseritrocitos son igualmente lavados y se agrega el reactivode Coombs produciendo aglutinacioacuten

Una prueba de Coombs indirecta positiva significa queexisten anticuerpos libres en el suero de la persona loscuales puedan ser igualmente auto-anticuerpos oisoanticuerpos

Material y equipo

bull Pipetas automaacuteticas de 10 microl 25 microl 50 microl y 1 ml

bull Puntas de pipetas desechables

bull Tubos de vidrio

bull Incubador para tarjetas DG Gel

bull Centrifuga para tarjetas DG Gel

Material bioloacutegico

bull Hematiacutees reactivo para investigacioacuten e identificacioacuten de anticuerpos irregulares de

Diagnostic Grifols SA

bull Suero de hemoclasificacioacuten

bull Muestras de sangre de extraccioacuten reciente recogida con anticoagulante o sin

anticoagulante

Reactivos

bull Tarjetas DG Gel

bull DG Gel Sol

Reactivos

Tarjetas DG Gel Coombs DG Gel SolRango de temperatura entre 2 y 25 ordmC Rango de temperatura entre 2 y 8ordmCLote 704901 Lote 7003701Cad 2008-03 Cad 2008-06Aspecto transparente Aspecto transparenteColor verde Color incoloro

TeacutecnicaMeacutetodo manual

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1 Dejar atemperar (18-25ordmC) muestras y reactivo2 Inspeccionar el estado de las tarjetas antes de utilizar3 Identificar las tarjetas y muestras a utilizar4 Despegar con precaucioacuten la lamina de metal que cubre los microtubos para prevenir

contaminaciones cruzadas entre ellos

5 Preparar una suspensioacuten con hematiacutees al 1 en DG Gel Sol (10 microl de sedimento oconcentrado de hematiacutees en 1 ml de DG Gel Sol) Utilizar los hematiacutees del donantepara la PC mayor y hematiacutees del receptor para la PC menor Asegurar la suspensioacuten delos hematiacutees antes de utilizar

6 Dispensar en el tubo correspondiente 50 microl de suspensioacuten de los hematiacutees al 1 deldonante (PC mayor) o 50 microl de suspensioacuten de los hematiacutees al 1 del receptor (PCmenor)

7 Antildeadir 25 microl de suero o plasma del receptor (PC mayor) o 25 microl de suero o plasma deldonante (PC menor)

8 Preparar auto control con 50 microl de suspensioacuten de los hematiacutees al 1 del receptor y 25microl de suero o plasma del receptor

9 Incubar 15 minutos a 37 ordmC10 Centrifugar en la centrifuga para tarjetas DG Gel

11 Leer los resultados

InterpretacioacutenNegativo - Banda de hematiacutees en el fondo de la columna resto de la columna sin aglutinados visibles

Positivo +- Escasos aglutinados de pequentildeo tamantildeo en la mitad inferior de la columna

1+ Algunos aglutinados de pequentildeo tamantildeo en la columna

2+ Aglutinados de tamantildeo pequentildeo o mediano a lo largo de la columna

3+ Banda superior de aglutinados de tamantildeo mediano en la mitad superior de la columna

4+ Banda de hematiacutees aglutinados en la parte superior de la columna

DP Doble poblacioacuten (doble banda de hematiacutees en el fondo y en la parte superior de la columna

Resultados

Paciente Lira Cabrera Carlos Alberto (AB+)Donador 1 Orea Valero Erasmo (A+)Donador 2 Moreno Adolfo (O+)

M1 m1 M2 m2 AutocontrolGR de donador 1 +suero del paciente

GR del paciente +suero de donador 1

GR de donador 2 +suero del paciente

GR del paciente +suero de donador 2

GR del paciente +suero del paciente

- + - + -

Por lo antes expuesto se puede deducir que el donador 1 (A+) puede donar eritrocitos al

paciente (AB+) lo mismo que el donador 2 (O+) puede donarle eritrocitos no asiacute plasma por parte de ambos donadores pues la prueba muestra que hubo reaccioacuten en ambas pruebasmenores

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Conclusioacuten

Concluyo que es esencial que toda la sangre sea estudiadaantes de la transfusioacuten para Asegurar que todos losgloacutebulos rojos transfundidos son compatibles con losanticuerpos en el plasma del paciente Evitar estimular laproduccioacuten de nuevos anticuerpos contra los gloacutebulos rojosen el receptor especialmente anti-Rh D

PRAacuteCTICA No 6PRUEBA DE COMPATIBILIDAD SANGIacuteNEA

(Teacutecnica salina)

INTRODUCCIOacuteN

Landsteiner constatoacute que cuando un aglutinoacutegeno se pone

en contacto con la aglutinina homoacuteloga se produce unaaglutinacioacuten

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La compatibilidad sanguiacutenea es la posibilidad de mezclade sangre sin que se produzcan trastornos tales como losfenoacutemenos de la lisis o de la aglutinacioacuten

A causa de este fenoacutemeno bioloacutegico en las transfusiones

de sangre no es suficiente con conocer que la sangre deldonante y la del receptor son del mismo grupo o bien quela del donante pertenezca al grupo O (cero) sino que esnecesario conocer si la compatibilidad es perfecta porqueninguacuten otro fenoacutemeno de inmunizacioacuten interfiera Es eneste sentido por lo que son empleadas las pruebascruzadas

Ademaacutes de los 6 antiacutegenos del sistema ABO en loseritrocitos humanos existen numerosos sistemas deaglutinoacutegenos que contienen muchos antiacutegenos individuales

en los eritrocitos (maacutes de 500000 millones posibles defenotipos de grupos sanguiacuteneos conocidos) Para evitaraccidentes transfusionales es indispensable tener encuenta el sistema Rh ademaacutes del ABO

Del sistema de antiacutegenos Rh es el D el maacutes antigeacutenico yel teacutermino Rh positivo indica que el individuo presentaaglutinoacutegeno D El individuo Rh negativo no tiene antiacutegenoD y forma la aglutinina anti-D en contacto con eacuteste

Las reacciones antiacutegeno-anticuerpo pueden observarse in

vitro por

mdash Hemoacutelisis la unioacuten antiacutegeno-anticuerpo se traduce enlisis de los eritrocitos en presenciadel complemento (siempre que el anticoagulante empleado nocapture losiones Ca y Mg necesarios para la activacioacuten delcomplemento) mdash Aglutinacioacuten los anticuerpos que reaccionan en mediosalino se conocen comoanticuerpos completos o aglutinantes (comuacutenmente tipo

IgM)

OBJETIVO Determinacioacuten de los antigenos del sistema ABORh (D) y su compatibilidad entre un paciente Donador y unPaciente Receptor

MATERIAL5 Tubos de ensaye6 Pipetas Pasteur

1Gradilla1 Bulbo

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EQUIPOMicrocentriacutefugaBantildeo Mariacutea oacute Estufa

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Papel Parafilm

MUESTRA Muestra de sangre con Anticoagulante EDTA

REACTIVOSAntisuero RO-Antiglobulina humana (Poliespeciacutefico Anti IgG C-d) Para prueba de CoombsLABORATORIOS LAFON SA de C VFecha de Caducidad 31-Ene-09Lote 406Hecho en MeacutexicoAspecto TransparenteColor Verde

TEacuteCNICA

Lavar los eritrocitos con solucioacuten salina (3 veces)

SALINA RAacutePIDA1 Agregar una gota de Eritrocitos Lavados2 Diluirlo al 3-5 con solucioacuten salina 093 Agregar 2 gotas de suero4 Centrifugar y observar anotar desprendimiento del botoacuten

SALINA 37deg BANtildeO MARIacuteA

1 Incubar tubos a Bantildeo mariacutea a 37degC durante 1hora (o 20 min)2 Centirfugar despueacutes de haber pasado el

tiempo3 Desprender el botoacuten de eritrocitos y

observarAGLUTINACIOacuteNndash No es compatibleNO AGLUTINACIOacuteN - Lavar 3 veces

SALINA COOMBS

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PRUEBA MAYOR

G Rojos del DONADOR+

Suero del RECEPTOR(paciente)

PRUEBA MENOR

G Rojos del RECEPTOR(paciente)

+Suero del DONADOR

AUTOTESTIGO

G Rojos del RECEPTOR(paciente)

+Suero del RECEPTOR

(paciente)

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1 Con solucioacuten salina 09 lavar loseritrocitos de los tubos q no tuvieronaglutinacioacuten 3 veces

2 Decantar y agregar 2 gotas de reactivode Coombs

AGLUTINACIOacuteN ndash No es compatibleNO AGLUTINACIOacuteN - Lavar 3 veces

RESULTADOS

Paciente Madrigal Meacutendez Luis Eduardo (B+)Folio 009164Fecha301007

Donador 1 Torres Avileacutes Joseacute Ramoacuten (O+)Folio 022604Fecha311007

Donador 2 Rodriacuteguez Nuacutentildeez Joseacute Angel (A+) Folio 022605

Fecha311007

SALINA RAacutePIDA

M1 m1 M2 m2 AutotestigoGR de donador 1+ suero del

paciente

GR del paciente+ suero dedonador 1

GR de donador 2+ suero del

paciente

GR del paciente+ suero dedonador 2

GR del paciente+ suero del

paciente

- 4+ 4+ 4+ -

SALINA 37deg BANtildeO MARIacuteA

M1 m1 M2 m2 Autotestigo- 4+ 4+ 4+ -

Compatible Nocompatible

Nocompatible

Nocompatible

Compatible

SALINA COOMBS

Por lo tanto se puede decir que el donador 1 (O+) puededonar suero al paciente (B+) debido a que en el suero nohay anticuerpos de ninguacuten tipo que reaccionen con losantiacutegenos de los eritrocios del Donador 1 Mientras tantoel Donador 2 no puede donar al Paciente ni suero nieritrocitos

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M1 Autotestigo- -

Compatible

Compatible

21

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INTERPRETACIOacuteN

PRUEBA POSITIVA Existe una aglutinacioacuten de lasceacutelulas sanguiacuteneas que indica la presencia delantiacutegeno A o B En el suero de Coombs notamos si esta

la precencia de Antiacutegeno D en los eritrocitos Lahemoacutelisis no se debe interpretar como resultadopositivo ya que puede indicar contaminacioacuten delreactivo

PRUEBA NEGATIVA La no aglutinacioacuten indica unresultado negativo e indica que las ceacutelulas sonnegativas para Antiacutegenos del sisitema ABO y D

CONCLUSIOacuteN

He concluido que en las transfusiones de sangre no essuficiente con conocer que la sangre del donante y la delreceptor son del mismo grupo o bien que la del donantepertenezca al grupo O (cero) sino que es necesarioconocer si la compatibilidad es perfecta porque ninguacutenotro fenoacutemeno de inmunizacioacuten interfiera Es en estesentido por lo que son empleadas las pruebas cruzadas

Praacutectica No 7ldquoPrueba de compatibilidad sanguiacutenea (teacutecnica albumina)rdquo

IntroduccioacutenLa tipificacioacuten de sangre identifica el tipo sanguiacuteneo determinandoantiacutegenos presentes en los eritrocitos detecta aloanticuerpos encontra esos antiacutegenos Asiacute los aloanticuerpos pueden aparecernaturalmente o ser inducidos y pueden ser dirigidos contra del grupoconocido o a los antiacutegenos de superficie de los eritrocitos La prueba

de compatibilidad sanguiacutenea o cross matching esta formada por laprueba mayor y menorLa prueba de cruzamiento mayor para losaloanticuerpos consiste en probar el plasma del receptor contra los

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gloacutebulos rojos del donante Es incompatible cuando se genera unareaccioacuten hemoliacutetica los eritrocitos del donante se destruyen por losaloanticuerpos del plasma del receptor La prueba menor es una pruebapara los aloanticuerpos del plasma del donante en contra los gloacutebulosrojos del receptor Una incompatibilidad menor es una causa menosfrecuente para causar una reaccioacuten en contra una transfusioacuten porque

el volumen de plasma del donante es menor y es diluido marcadamente enel receptor Para llevar a cabo dicho procedimiento se utilizandiversos reactivos como potencializadores que mejoran la unioacuten deeritrocitos con alguacuten tipo de anticuerpo Uno de esospotencializadores es la albuacutemina La albumina bovina polimerizada esun reactivo muy utilizado en el laboratorio de inmunohematologia y encentros de bancos de sangre funciona como un potencializador quefacilita la reaccion de aglutinacioacuten de eritrocitos sensibilizados Alfinal de la prueba se prueban los eritrocitos con el reactivo deCoombs El principio de la prueba de Coombs fue descrito por Moreschien 1908 pero Coombs Mourant y Race en 1946 la introdujeron en elestudio de los grupos sanguiacuteneos y anticuerpos cuando una parte desangre (suero) fue usada para la inoculacioacuten de animales para

inmunizarlos con proteiacutena humana utilizando el anticuerpo obtenido enla deteccioacuten de los llamados anticuerpos incompletos Esta prueba seusa para determinar la presencia de anticuerpos no aglutinantes en elsuero de sujetos sensibilizados a uno o mas antiacutegenos sanguiacuteneos Esuacutetil en el estudio del suero de mujeres con isoinmunizacioacuten materno-fetal y se emplea tambieacuten en otro tipo de pruebas como identificacioacutende anticuerpos autoinmunes deteccioacuten de algunos sistemas sanguiacuteneos ypruebas de compatibilidad sanguiacutenea La prueba indirecta se realizacon eritrocitos normales incubados in Vitro con el suero de estudioDurante este periodo si existe un anticuerpo este se fija sobre surespectivo determinante antigeacutenico Una vez fijados los eritrocitosson igualmente lavados y se agrega el reactivo de Coombs produciendoaglutinacioacuten Una prueba de Coombs indirecta positiva significa que

existen anticuerpos libres en el suero de la persona los cualespuedan ser igualmente auto-anticuerpos o isoanticuerpos

Objetivo Determinacioacuten de los antiacutegenos del sistema ABO Rh (D) y sucompatibilidad entre un paciente Donador y un Paciente Receptor

Material y equipo

5 Tubos de ensaye

6 Pipetas Pasteur

1Gradilla

1 Bulbo

Papel Parafilm

Microcentriacutefuga

Bantildeo Mariacutea oacute Estufa

Material bioloacutegico

Muestras de sangre de extraccioacuten reciente recogida conanticoagulante o sin anticoagulante

ReactivosSuero de CoombsAlbuacutemina bovina deg

Suero anti-globulina humana Lafon Lote 406 Cad 310109 Color verde Aspecto

transparentedegAlbumina de bovino polimerizada Interbiol Lote APO107 Cad 150109 Color incoloroAspecto transparente

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Teacutecnica

1 Montar prueba mayor 1 y 2 prueba menor 1 y 2 y autotestigocon el procedimiento ya anteriormente conocido

2 Agregar 2 gotas de albuacutemina al 223 Centrifugar 20 segundos4 observar aglutinacioacuten o hemolisis o no aglutinacioacuten5 A los tubos con lecturas negativas incubar 20 minutos en bantildeo

Mariacutea a 37 degC6 Centrifugar y observar

bull Aglutinacioacuten o hemoacutelisis reportar incompatible

bull No aglutinacioacuten llevar a Coombs

7 Lavar tres veces decantar y quitar el exceso de salina congasa y agregar 2 gotas de reactivo de Coombs y centrifugar 20segundos y observar

bull Aglutinacioacuten o hemoacutelisis reportar incompatible

bull No aglutinacioacuten reportar compatible

Resultados1 PRUEBA MAYOR 1 2 Gotas de suero del paciente + 1 gota de GR al 3-5 del

donador 12 PRUEBA MENOR 1 2 Gotas de suero del donador 1 + 1 gota de GR al 3-5 del

paciente3 PRUEBA MAYOR 2 2 Gotas de suero del paciente + 1 gota de GR al 3-5 del

donador 24 PRUEBA MENOR 2 2 Gotas de suero del donador 2 + 1 gota de GR al 3-5 del

paciente5 AUTOTESTIGO 2 Gotas de suero del paciente + 1 gota de GR al 3-5 del paciente

M1 m1 M2 m2 AutotestigoCon albuacutemina - - - - -Despueacutes de incubacioacuten a 37 degC - - - - -Despueacutes de Coombs - - - - -Despueacutes de validacioacuten con gloacutebulos

positivos+ + + + +

InterpretacioacutenPrueba positiva Alutinacioacuten o hemolisis Indica no compatibilidadPrueba negativaNo aglutinacioacuten Indica compatibilidad

Esquemas

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ConclusioacutenConcluyo que la prueba de compatibilidad sanguiacutenea en su modalidad conalbuacutemina bovina ofrece mucha ventaja al ser al igual que otrosreactivos un potencializador de la reaccioacuten antiacutegeno-anticuerpo Estopermite que el operador o realizador de la prueba tenga mayorconfianza y certeza en los resultados que obtenga

PRACTICA No 8PRUEBA DE COMPATIBILIDAD SANGUINEA PRUEBA DE LISS

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FUNDAMENTO

LISS es utilizado para reducir la fuerza ioacutenica del medio

de reaccioacuten en los procedimientos de deteccioacuten eidentificacioacuten de anticuerpos y en las pruebas decompatibilidad La presencia de este reactivo refuerza lainteraccioacuten antiacutegeno - anticuerpo durante la incubacioacuten

GENERALIDADESEl uso de solucioacuten salina de baja fuerza ioacutenica fuedescrito inicialmente en 1964 por Hughes-Jones y col y

Elliot y col pero en ese tiempo su uso era limitado yaque la concentracioacuten molar obtenida provocaba la hemoacutelisisde los eritrocitos suspendidos

En 1974 Low y Messeter describieron el uso rutinario de lasolucioacuten Liss de 003 M que lograba reducir el tiempo deincubacioacuten y no presentaba tendencia a la hemoacutelisis al sersuspendidos en salina a baja fuerza ioacutenica restableciendola presioacuten osmoacutetica de la solucioacuten mediante la adicioacuten deglicinaLas soluciones de baja fuerza ioacutenica son actualmente lasmaacutes utilizadas en inmunohematologiacutea provocando un aumentoen la velocidad de asociacioacuten entre antiacutegenos y anticuerpospermitiendo asiacute acortar el tiempo de incubacioacuten de 60minutos a 10-15 minutos sin sacrificar la sensibilidad delas mismas y sin costos elevadosSe ha observado que lasreacciones antiacutegeno-anticuerpo se ven potenciadas alreducir la fuerza ioacutenica del medio de reaccioacuten

La fuerza ioacutenica es uno de los factores maacutes importantes quedeterminan la tasa y la cantidad de captacioacuten deanticuerpos por parte de los eritrocitos El uso de mediosde reaccioacuten de baja fuerza ioacutenica permite disminuir eltiempo de incubacioacuten y potenciar las reacciones de losanticuerpos sin incrementar las reacciones inespeciacuteficas

Los iones Na+ y Cl- presentes en la solucioacuten salinafisioloacutegica se agrupan alrededor de las moleacuteculas deantiacutegeno y anticuerpo neutralizando sus cargas opuestas locual dificulta la unioacuten entre ellos Este efecto se reduceutilizando soluciones de baja fuerza ioacutenica y disminuyendode esta manera la incubacioacuten de las pruebas

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En esta etapa de sensibilizacioacuten las posibilidades deasociacioacuten pueden incrementarse mediante agitacioacutencentrifugacioacuten yo variacioacuten de la concentracioacuten delanticuerpo

Despueacutes de que el anticuerpo se ha fijado al antiacutegeno loseritrocitos sensibilizados deben unirse para dar lugar a laaglutinacioacuten visible esta red tambieacuten solidifica yestabiliza la reaccioacuten

En esta etapa la reaccioacuten depende de factores como lascaracteriacutesticas del anticuerpo localizacioacuten en la membranay nuacutemero de sitios antigeacutenicos fuerzas que mantienen ladistancia entre los eritrocitos

Las caracteriacutesticas del anticuerpo que deben considerarse

son el tamantildeo del anticuerpo involucrado y el nuacutemero desitios de combinacioacuten con el antiacutegeno Los anticuerpos IgMpueden establecer puentes entre los eritrocitos yaglutinarlos espontaacuteneamente en solucioacuten salina mientrasque los IgG no ya que las IgM pentameacutericas poseen 10sitios de combinacioacuten con el antiacutegeno y las IgG diacutemerossoacutelo dos sitios

Los eritrocitos tienen una carga neta negativa en susuperficie su interaccioacuten con los iones del medio alteraesta carga y producen una carga neta criacutetica denominada

potencial zeta y la reduccioacuten de dicha carga permite quelos eritrocitos se aproximen lo suficiente para que seanaglutinados por medio de los IgG que los sensibilizaron

Las soluciones de baja fuerza ionica empleadas en banco desangre tienen un pH entre 65 ndash 70 se recomienda unaosmolalidad de 270 ndash 305 mosmkg y una conductividad de 37mmcm El control diario implica el examen de su aparienciafiacutesica ausencia de turbidez particulas o sedimento asiacutecomo corroborar la capacidad para generar hemoacutelisiscrenacion o prueba de coombs positiva en eritrocitos

normales Cada lote nuevo se valora mediante el rastreo deun anticuerpo ya sea un anti- D un anti- jk anti- fy oanti- kell diluido se compara su capacidad de deteccioacutencontra un medio salino normal incubando 10min a 37ordmC enLISS debe poder rastrearse un anticuerpo en tanto que enmedio salino no

MATERIAL Y EQUIPO

Material Cantidad10 Tubos de ensayo de 12 x 75

1 Gradilla10 Pipetas pasteur

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1 Bulbo1 Marcador1 Microcentriacutefuga1 Bantildeo Mariacutea

MATERIAL BIOLOGICO

Gloacutebulos rojos lavados al 3 - 5Suero

REACTIVOS

Reactivo de LISSReactivo de Coombs

TECNICA1- Lavar los eritrocitos

Separar el suero del paquete de gloacutebulos rojos

Agregar cierta cantidad de eritrocitos a un tubo deensayo y agregarle solucioacuten salina

Centrifugar y decantar

Repetir este proceso 3 veces

2- Realizar la Prueba de LISS

Enumerar los tubos Poner dos gotas de LISS en cada tubo agregar una gota

de eritrocitos lavados y al 3 - 5 seguacuten el nuacutemero detubo correspondiente

Mezclar y centrifugar un minuto decantar elsobrenadante y con la ayuda de una gasa limpiar elexceso del reactivo

Poner nuevamente 2 gota de LISS resuspender poragitacioacuten agregar 2 gotas de suero problema mezclarincubar 15 minutos a 37ordm C centrifugar 30 seg A 1000

RPM Anotar los resultados

3- A las pruebas negativas realizar Coombs

Lavar 3 veces las ceacutelulas agregar suero de Coombscentrifugar 30 seg

Leer aglutinaciones y anotar resultados

REACTIVOS UTILIZADOS

REACTIVO MARCA FECHA DECADUCIDAD

ASPECTO COLOR LOTE

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SueroAntiglobuina

humana

Lafon 31 01 2009 Transparente Verde 406

LISS Caserorealizado enCMNSIGLOXXI

1 antildeo Transparente Transparente

----------

PACIENTE ASCANIO MENDEZ JOSUE O (+)DONADOR 1 GARCIA CARBAJAL OSCAR O (+)DONADOR 2 GARCIA SUAREZ ORLANDO A (+)

RESULTADOS

INTERPRETACIOacuteN DE LOS RESULTADOS

La hemoacutelisis o la aglutinacioacuten representan un resultado positivo e indican lapresencia de una reaccioacuten antiacutegeno-anticuerpo Los resultados negativos no severa aglutinacioacuten o hemolisis

ESQUEMAS

CONCLUSIONES

Concluyo que la prueba de compatibilidad sanguiacutenea en su modalidad conliss ofrece mucha ventaja al ser al igual que otros reactivos unpotencializador de la reaccioacuten antiacutegeno-anticuerpo Esto permite queel operador o realizador de la prueba tenga mayor confianza y certezaen los resultados que obtenga

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Tubo Resultado

M1 NEGATIVOm1 NEGATIVO

M2 POSITIVO

M2 NEGATIVO

AUTOTES NEGATIVO

29

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PRACTICA 9INMUNOHEMATOLOGIA

DETERMINACION DE COOMBS DIRECTO

INTRODUCCIONPRUEBA DE COOMBS DIRECTA

El examen de Coombs directo se utiliza para detectar autoanticuerpos contralos propios gloacutebulos rojos (GR) de un individuo Es una prueba que sirve parademostrar el revestimiento de los eritrocitos in vivo (mientras los eritrocitosestaacuten circulando en el individuo) La prueba se realiza agregando directamenteel reactivo de Coombs a los eritrocitos previamente lavados para eliminar otras proteiacutenas no fijadas a el una prueba directa positiva significa que larelacioacuten antiacutegeno-anticuerpo ocurrioacute in vivo es decir que la fijacioacuten del

anticuerpo sobre el antiacutegeno se realizo en el organismo del individuo enestudio

Las indicaciones principales de esta prueba son diagnostico de enfermedadeshemoliacuteticas ictericia o anomaliacuteas en la apariencia de los gloacutebulos rojos bajo elmicroscopio ya que estos anticuerpos algunas veces destruyen los gloacutebulosrojos y causan anemia para investigar reacciones en transfusiones Parainvestigar la induccioacuten de drogas en ceacutelulas rojas sensibilizadas medicamentos(por ejemplo quinidina metildopa procainamida y otros) que pueden llevar a la produccioacuten de estos anticuerpos

OBJETIVO Determinar la presencia de anticuerpos en la superficie de losgloacutebulos rojos del individuo

MATERIAL

bull 10 Tubos de 1275

bull 10 Pipetas Pasteur

bull 1 Gradilla

bull 1 Bulbo

bull Papel Parafilm

bull Microcentriacutefuga

bull Bantildeo Mariacutea a 37degC

MUESTRA BIOLOGICA

Eritrocitos lavados de (3-5) del donador o pacienteREACTIVO

Suero de CoombsSuero anti-globulina humana Lafon Lote 406 Cad 310109 Color verde Aspecto transparente

TECNICA

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Colocar en un tubo de ensaye dos gotas de suero de Coombs mas una gota deglobulos rojos (3-5)Centrifugar a 1000 rpm durante 20 segDesprender el boton suavemente y buscar la presencia de aglutinacionRotular y enumerar 8 tubos de ensayes con las diferentes diluciones

(frac12frac1418)Enumerar 8 tubos mas del 1 al 8Agregar a cada tubo de las diluciones 10 gotas de solucion salina mas 10 gotasde suero de CoombsColocar Al primer tubo de la dilucion 1 gota de globulos rojos (3-5) mezclar completamente y agregar al tubo 1Centrifugar todos los tubos a 1000 rpm durante 20 seg

LECTURA

Aglutina- Prueba de Coombs directa es positiva

No aglutina- Prueba de Coombs directa es negativa

ESQUEMAS y RESULTADOS

CONCLUCION

He concluido que la prueba de Coombs directa es una prueba que se utiliza para medir

la presencia de anticuerpos en la superficie de los gloacutebulos rojos que se encuentran

circulando en el paciente y se realiza para investigar reacciones en transfusiones ademaacutes

sirve para la determinacioacuten de anemia hemoliacutetica autoinmune entre otras afecciones

Practica 10

IDENTIFICACION DE ANTICUERPOS IRREGULARES

Fundamento

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DILUCIONES

frac12 positiva

frac14 positiva

18 positiva

116 negativa

132 negativa

164 negativa

1128 negativa1256 negativa

31

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Los anticuerpos del sistema ABO aparecen una vez que elindividuo entra en contacto con el medio ambiente y en elcual se encuentran microorganismos como algunas bacteriascoliformes que contienen sustancias quiacutemicas en suestructura parecidas a las de este sistema Por anticuerpos

regulares debemos identificar a los que existen en todoslos individuos y que eacutestos tendraacuten durante toda su vida

Los anticuerpos irregulares son los que no estaacuten de esamanera aunque en el caso de los naturales no se conoce aciencia cierta queacute o coacutemo se induce su produccioacuten Losadquiridos se conocen tambieacuten como inmunes y son elresultado de la exposicioacuten a antiacutegenos desconocidos por elindividuo al momento de la transfusioacuten o en las mujerespor el embarazo estos anticuerpos son dirigidos contraantiacutegenos de sistemas diferentes al ABO

Los anticuerpos naturales regulares son preferentementeinmunoglobulinas M las cuales fijan de manera taneficiente el complemento que pueden provocar lisisintravascular y ocasionar insuficiencia renal o incluso lamuerte del paciente Los anticuerpos adquiridos o inmunesson generalmente inmunoglobulinas G las cuales producenhemoacutelisis extravascular en el bazo o en el hiacutegado mediantefagocitosis del complejo eritrocito maacutes anticuerpo

Los aloanticuerpos irregulares (adquiridos) maacutes comunes en

nuestra poblacioacuten son los que involucran a los sistemasMNSs P1 Kidd (Jka Jkb) Duffy (Fya Fyb) Kell Lewis yDiego

OBJETIVO identificacioacuten del anticuerpo irregular a traveacutesde las diferentes teacutecnicas

MATERIAL

bull 10 Tubos de ensaye

bull 10 Pipetas Pasteur

bull

1Gradillabull 1 Bulbo

bull Papel Parafim

MATERIAL BIOLOGICO

bull Gloacutebulos rojos lavados al 3 - 5

bull Suero

bull REACTIVOSReactivos

1 Suero de Coombs2 Albuacutemina bovina

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bull EQUIPO1 Microcentriacutefuga2 Bantildeo Mariacutea oacute Estufa

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3 SOLUCION SALINA4 SOLUCION DE LISS

TEacuteCNICA SOLUCION SALINA

Lavar los eritrocitos con solucioacuten salina (3veces)SALINA RAacutePIDA

Agregar una gota de Eritrocitos LavadosDiluiacuterlo al 3-5 con solucioacuten salina 09Agregar 2 gotas de sueroCentrifugar y observar anotar desprendimientodel botoacuten

SALINA 37deg BANtildeO MARIacuteA1) Incubar tubos a Bantildeo mariacutea a 37degC durante 1

hora (o 20 min)

2) Centirfugar despueacutes de haber pasado eltiempo

3) Desprender el botoacuten de eritrocitos yobservar

AGLUTINACIOacuteNndash No es compatibleNO AGLUTINACIOacuteN - Lavar 3 veces

SALINA COOMBS1) Con solucioacuten salina 09 lavar los

eritrocitos de los tubos q no tuvieronaglutinacioacuten 3 veces

2) Decantar y agregar 2 gotas de reactivode Coombs

AGLUTINACIOacuteN ndash No es compatibleNO AGLUTINACIOacuteN - Lavar 3 veces

TECNICA LISS

1 Poner dos gotas de LISS en cada tubo agregar una gotade eritrocitos lavados y al 3 - 5 seguacuten el nuacutemero detubo correspondiente

2 Mezclar y centrifugar un minuto decantar el

sobrenadante y con la ayuda de una gasa limpiar elexceso del reactivo

3 Poner nuevamente 2 gota de LISS resuspender poragitacioacuten agregar 2 gotas de suero problema mezclarincubar 15 minutos a 37ordm C centrifugar 30 seg A 1000RPM

4 Anotar los resultados

A las pruebas negativas realizar Coombs

1 Lavar 3 veces las ceacutelulas agregar suero de Coombs

centrifugar 30 seg2 Leer aglutinaciones y anotar resultados

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TECNICA ALBUMINA BOVINA 8 Agregar 2 gotas de albuacutemina al 229 Centrifugar 20 segundos10observar aglutinacioacuten o hemolisis o no aglutinacioacuten

11A los tubos con lecturas negativas incubar 20minutos en bantildeo Mariacutea a 37 degC12Centrifugar y observar

bull Aglutinacioacuten o hemoacutelisis reportar incompatible

bull No aglutinacioacuten llevar a Coombs

13Lavar tres veces decantar y quitar el exceso desalina con gasa y agregar 2 gotas de reactivo deCoombs y centrifugar 20 segundos y observar

bull Aglutinacioacuten o hemoacutelisis reportar incompatible

bull No aglutinacioacuten reportar compatible

Resultados ANTICUERPO IRREGULAR Anticuerpo c

InterpretacioacutenEstos anticuerpos son generalmente inmunoglobulinas tipo My ocasionalmente tipo G y debido a esa temperatura dereaccioacuten carecen de importancia cliacutenica salvo que sureaccioacuten ocurra tambieacuten a 37 degC su importancia radica enpacientes que seraacuten intervenido a 22 ordmc como es el caso de

operacioacuten de corazoacuten

Los llamados anticuerpos calientes tienen una temperatura oacuteptima dereaccioacuten a 37 degC a Estos anticuerpos tienen una relevanteimportancia cliacutenica ya que se les asocia con reaccionestransfusionales de intensidad moderada a severa que puedenocasionar la muerte

Esquemas

CONCLUSIONHe concluido que es importante determinar los anticuerposirregulares ya que estos anticuerpos tienen una relevanteimportancia cliacutenica ya que se les asocia con reaccionestransfusionales de intensidad moderada a severa

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6 Por ultimo leer los tubos observando si hubo reaccioacuten o no y correlacionando losdatos obtenidos con el meacutetodo inverso para determinar el grupo sanguiacuteneo

Metodo inverso

1 Centrifugar los 3 tubos Vacutiner con muestra sanguiacutenea anticoagulada con EDTA y eltubo Vacutainer con muestra sanguiacutenea sin anticoagulante a una velocidad de 2500rpm por 10 minutos pues se utilizaran plasma y eritrocitos por separado

2 Rotular los tubos de ensayo de la siguiente manera en cada tubo rotular dos nuacutemeros

en la muestra uno correspondiente del 1 al 4 el otro numero corresponde al que yatraiacutea la muestra y con el tipo de eritrocitos con antigeno conocido A 1 A2 B y OEjemplo 113 A1 113 A2 etc El procedimiento se repite para las tres muestrasrestantes

3 Colocar en cada tubo rotulado dos gotas ya sea de plasma o suero seguacuten corresponday una gota de los eritrocitos con antigeno conocido

4 Al concluir lo anterior llevar los tubos a la centrifuga y centrifugar por solo 15 segundos

a una velocidad de 1000 rpm para observar mejor la reaccioacuten antigeno-anticuerpo(formacioacuten de un botoacuten)

5 Por ultimo leer los tubos observando si hubo reaccioacuten o no y correlacionando losdatos obtenidos con el meacutetodo inverso para determinar el grupo sanguiacuteneo

Resultados

Muestra Meacutetodo directo Meacutetodo inverso

Anti-A Anti-AB Anti-B Anti-D A1 A2 B O

Grupo y

Rh1 - - - + + + + - O +

2 - + + + + + - - B +

3 + + - + - - + - A +

4 + + + + + - - - AB +

InterpretacioacutenPara el meacutetodo directo la loacutegica fue si en un tubo hay formacioacuten de botoacuten (reaccioacuten antigeno-anticuerpo) quiere decir que los eritrocitos ensayados tienen el antigeno que reacciona con losanticuerpos presentes en el antisuero para ese tubo y si no presentan aglutinacioacuten querraacutedecir que no corresponde el antigeno del eritrocito con el anticuerpo del antisuero o que el

antigeno esta ausente en esos eritrocitos De ahiacute que pueda observarse que una muestrasanguiacutenea muestre un solo tipo de antiacutegenos del sistema ABO sobre su membrana (A o B)ambos antiacutegenos (AB) o ninguno de ellos (O) lo mismo sucede para el sistema Rh alpresentarlo (Rh +) o no (Rh -)Para el meacutetodo inverso el razonamiento fue si en un tubo hay formacioacuten del botoacuten (reaccioacutenantigeno-anticuerpo) quiere decir que el plasma del paciente ensayado tiene los anticuerposque reaccionan con los eritrocitos con antigeno conocido los cuales sirven de reactivo paraesta prueba Por lo tanto una reaccioacuten positiva en este meacutetodo definitivamente indica que elpaciente no tiene eritrocitos con antiacutegenos que reaccionariacutean con los anticuerpos de su plasmaDe ahiacute que el meacutetodo se le nombre inverso

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ConclusioacutenConcluyo que Para realizar una transfusioacuten sanguiacutenea se debe tomar en cuenta la sangre deldonante y la del receptor Los individuos pertenecientes al grupo O pueden donar sangre acualquier otro grupo sanguiacuteneo porque sus eritrocitos carecen de antigeno que puedan ser reconocidos por la sangre del receptor Las personas del grupo AB pueden recibir sangre decualquier grupo ya que carecen de anticuerpos

PRACTICA Nordm 2DETERMUNACION DE SUBGRUPOS

Anti- A1 Lectina(Dolichos biflorus)

Lectina de grupo sanguiacuteneo

INTRODUCCION

El sistema de grupos sanguiacuteneos ABO sigue siendo el primeroa tener en cuenta en el momento de realizar una transfusioacutende sangre Los antiacutegenos A y B son productos geacutenicosfaacutecilmente detectables y constituyen marcadoresgeneacuteticos de gran valor Entre los individuos A se

distinguen 2 categoriacuteas A1y A2

La diferenciacioacuten entre ambas se realiza mediante lautilizacioacuten de anticuerpos monoclonales y lectinasespeciacuteficas de grupo sanguiacuteneo Dolichos biflorus (anti A1)y Ulex europaeus (anti H)

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Uso Inmucor anti-A1 Lectin se utiliza para diferenciar ceacutelulas rojas A1 de otros

subgrupos A en pruebas en tubo o en placa

MATERIAL Y EQUIPObull Tubos de ensaye de 1075 mm

bull Cronometro

bull Marcador

bull Centrifuga seroloacutegica

MUESTRA BIOLOGICAbull Ceacutelulas rojas de donador o paciente

REACTIVObull Inmucor anti-A1 Lectin en gotero

MARCA INMUCOR INC

LOTE SN2132

CADUCIDAD 2007-12-14

TECNICA

1 Adicione una gota de anti-A1 a tubos adecuadamente marcados

2 Adicione una gota de una suspensioacuten de eritrocitos bajo prueba del 3-5 en

salina Mezcle completamente el contenido del tubo

3 Centrifugar de 15-30 minutos de 900-1000 rpm

4 Agite suavemente el tubo y resuspenda el botoacuten celular Examine las reacciones

resultantes macroscoacutepicamente Registre resultados

RESULTADOS ESPERADOS DE TIPIFICACION

GRUPOSANGUINEO

Anti-A Anti-A1 Porciento

A1 + + 80 DE TODOSLOS GRUPOS A

A1b + + 80 DE TODOSLOS GRUPOS AB

A2 + 0 20 DE TODOSLOS GRUPOS A

A2B + 0 20 DE TODOSLOS GRUPOS AB

A1NT + +DEBIL NO COMUNA3AM1AX1 + DEBIL 0 NO CUMUN

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ANTI-H (LECTINA)

Ulex europeaus

Para la determinacioacuten de del estado secretor y tipificacioacuten de las ceacutelulas rojas

INTRODUCCIONLa mayoriacutea de los grupos sanguiacuteneos ABO que se determinanen el banco de sangre cumplen con las leyes establecidas deantiacutegenos y anticuerpos reciacuteprocos para ese sistema

Los anticuerpos del sistema ABO existen en el individuodesde el momento en que son capaces de tener una respuestainmunoloacutegica y se producen contra los antiacutegenos A y B

Los subgrupos son fenotipos ABO que difieren en la cantidad

de antiacutegeno presente en los eritrocitos y en la saliva delos secretores Se hallan con mayor frecuencia y tienen maacutesrelevancia cliacutenica los de A que los de B Al utilizarlectinas se definen los subgrupos A1 y A2 con el extractode Dolichos biflorus se aglutinan los eritrocitos A1 perono los de A2 y el anti H semilla Ulex europeus aglutinaeritrocitos que tienen antiacutegeno H

MATERIAL Y EQUIPObull Tubos de ensaye de 1075mm

bull Cronometro

bull Marcador

bull Centrifuga seroloacutegica

MUESTRA BIOLOGICAbull Ceacutelulas rojas de donador o paciente

REACTIVObull Inmucor anti-H (Lectina) en gotero

MARCA GANMA

LOTE ML1581

CADUCIDAD 2007-11-14

TECNICA

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1 Adicione una gota de una suspensioacuten de eritrocitos bajo prueba del 3-5 en

salina en tubos adecuadamente marcados

2 Adicione dos gotas de anti-H Lectina y mezcle completamente el contenido del

tubo

3 incube durante 5 minutos a temperatura ambiente

4 Centrifugar de 15-30 minutos a 1000 rpm5 Agite suavemente el tubo y resuspenda el botoacuten celular Examine las reacciones

resultantes macroscoacutepicamente Registre resultados

INTERPRETACIOacuteN

PROBLEMA ANTI A1 ANTI H

(ANTI A2)

RESULTADO

SUBGRUPO

PACIENTE 1 + - ANTI A1

PACIENTE 2 - + ANTI A2

bull Prueba positiva Aglutinacioacuten de las ceacutelulas rojas

Nota La hemoacutelisis no debe interpretarse como un resultado positivo ya que esto

puede indetificarse como contaminacioacuten del reactivo

bull Prueba negativa Ausencia de aglutinacioacuten de las ceacutelulas rojas

CONCLUSIONES

Concluyo que para realizar unatransfusioacuten sanguiacutenea se debe tomar encuenta los subgrupos del donante y del

receptor Los subgrupo con mayorfrecuencia y tienen maacutes relevanciacliacutenica los de A que los de B Y seidentifican por medio de utilizarlectinas Los subgrupos A maacutesimportantes son A1 y A2

PRACTICA 3DETERMINACION DE Rh

INTRODUCCIOacuteN

El factor Rh es una clase de proteiacutena que se encuentra enlos gloacutebulos rojos de la sangre cuando alguien tiene esaproteiacutena se le considera ldquoRh Positivordquo Cuando no la tienees ldquoRh Negativordquo El factor Rh es hereditario y setransmite en dos genes El Factor Rh positivo es dominantees decir si una persona tiene un gen positivo y otronegativo su factor Rh seraacute positivo

Esta prueba es importante en el diagnostico y estudio

de la eritroblastosis fetal en la que los gloacutebulosrojos del nintildeo se encuentran sensibilizados con

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anticuerpo materno Es uacutetil tambieacuten en el diagnosticode la anemia hemoliacutetica adquirida (anticuerpos sobrelos gloacutebulo rojos del mismo paciente) asiacute como ladeterminacioacuten de eritrocitos sensibilizados en sangreusados para transfusioacuten

Las dos clasificaciones maacutes importantes para describirgrupos sanguiacuteneos en humanos son los antiacutegenos y el factorRh Las transfusiones de sangre entre grupos incompatiblespueden provocar una reaccioacuten inmunoloacutegica que puededesembocar en hemoacutelisis anemia fallo renal shock omuerte

MATERIAL

bull Tubos de ensayo de 12 x 75

bull Pipetas Pasteur

bull Gradilla

EQUIPO

bull Centrifuga

MUESTRA BIOLOacuteGICA

bull Eritrocitos lavados 3-5 del paciente

REACTIVOS

bull Antisuero Anti-D

bull Suero anti globulina humanabull Suero reactivo control

Antisuero D monoclonal NOVACLONELote NDMG04305CAD 29MAR08Aspecto transparenteColor incoloroSuero anti globulina HumanaLote 405CAD 06-NOV-08Aspecto transparenteColor verde

Reactivo control GAMMA-CLONELote GCM115-3CAD 2008-12-08Aspecto transparenteColor incoloro

TEacuteCNICA

Determinacioacuten de Rh

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bull Prepare una suspensioacuten de gloacutebulos rojos al 3-5 en solucioacuten salina Los gloacutebulos deben serlavados previamente 5 veces con el objeto deeliminar las proteiacutenas del plasma

bull Rotular 3 tubos para la previa identificacioacuten

de Rhbull Ponga 1 gota de la suspensioacuten lavada en cada

tubo

bull Antildeada una gota de anti suero D monoclonal

bull Mezcle y centrifugue 15 seg Y observe si hayaglutinacioacuten

Preparacioacuten del control negativo

bull Ponga una gota de eritrocitos lavados al 3-5

bull Antildeada una gota de reactivo control

bull

Centrifugue 15 seg y observe si hay aglutinacioacuten

Deteccioacuten de sangre Du

Nota esta teacutecnica se le realizo a los tubos problemasque no aglutinaron

bull Los tubos que no tuvieron aglutinacioacuten en ladeterminacioacuten de Rh se incuban 15 min yposteriormente se lavan 3 veces con sol Salina

bull Previamente lavados se le agregan 2 gotas de suerode COOMBS

bull Centrifugar 15 seg y observar desprender boton

ESQUEMAS

RESULTADOS problemas Aglutinacioacuten resultado2 positiva Rh +10 negativa Rh -11 negativa Rh -

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Paciente 2 coacutedigo 021612 plata Lugo JavierPaciente 10 coacutedigo 021620 Hernaacutendez Loacutepez GuillermoPaciente 11 coacutedigo 021621 camarillo Sonia rebeca

INTERPRETACIOacuteNPara el primer meacutetodoAglutinacion Rh positivoNo aglutinacioacuten realizar prueba de deteccioacuten desangre Du

Deteccioacuten de sangre DuAglutinacioacuten D deacutebil (Du positivo)No aglutinacioacuten Rh negativo

CONCLUSIONESCon el descubrimiento del sistema Rh se denominan Rhpositivos los hematiacutees que son aglutinados por esteanticuerpo y tienen por tanto el antiacutegeno Rh en lasuperficie Se denominan Rh negativos los que no sonaglutinados y que por tanto no poseen el antiacutegeno Rh ensu superficie

De la misma manera que en el sistema ABO en el sistema Rh

no se puede transfundir el antiacutegeno Rh a las personas queno lo tienen ya que podriacutea originar la produccioacuten deanticuerpos Rh en el receptor Los sujetos Rh negativossoacutelo podraacuten recibir sangre de donantes Rh negativos

PRACTICA 4INMUNOHEMATOLOGIA

DETERMINACION DE GRUPO SANGUINEO POR TECNICA DE GEL

INTRODUCCION

El sistema utilizado en inmunohematologiacutea para investigar e identificar antiacutegenos y

anticuerpos antieritrocitarios Es de tecnologiacutea de microtipificacioacuten en gel se basa en la

separacioacuten por tamantildeo de los eritrocitos aglutinados durante un proceso de

centrifugacioacuten en un gel poroso

Los eritrocitos van perdiendo elasticidad en sus membranas de forma que los

aglutinados grandes quedan atrapados en la zona superior y los pequentildeos quedan

distribuidos a lo largo de la columna

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Esta teacutecnica nos permite que estandaricemos la lectura de la reaccioacuten antiacutegeno-

anticuerpo con facilidad y repetitividad Asiacute como la estandariza del uso de reactivos

tiempos y lecturas disminuyendo sustancialmente la influencia de la mano de operador

OBJETIVO determinacioacuten de los antigenos del sistema ABORh (D) y determinacion

del grupo serico en tecnica de gel

FUNDAMENTOS

El principio del metdo se basa en la tecnica de gel descrita por Y Lapierre para la

deteccion de las reacciones de aglutinacion de los hematies La aglutinacion se produce

al entar en contacto los eritrocitos con los anticuerpos correspondientes

La tarjeta DG gel es un soporte de plastico constituidos por 8 microtubulos Cada

microtubulo esta formado por una columna y una camara de dispersionincubacion

La tecnologiacutea de microtipificacioacuten en gel se basa en la separacioacuten por tamantildeo de los

eritrocitos aglutinados durante un proceso de centrifugacioacuten en un gel poroso

Los eritrocitos van perdiendo elasticidad en sus membranas de forma que los

aglutinados grandes quedan atrapados en la zona superior y los pequentildeos quedan

distribuidos a lo largo de la columna

MATERIAL

Pipeta automaacutetica 10 ul 50ul 1 ml

Puntas de pipeta desechable Tubos de vidrios

DEG sol

Centrifugas para tarjetas DG gel

Hematies de reactivos para grupo inverso

MUESTRA BIOLOGICACeacutelulas rojas de donador o paciente

REACTIVO

Placa de gelReactivo de gel sol

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TECNICA1- determinacion de los antigenos del sistema ABORh

-preparar una suspension de hematies al 5 de DG sol Asegurar la resuspencion de lso

hematies antes de utilizar

Anadir en cada microtubulos indicados 10 ul de una suspension de hematies al 5

2- determinacion de l grupo serico-homogenizar los hematies recativos A1B

- dispersar el microtubulo N a1 50 ul de hematies reactivos A1 en un microtubulo Nb

50 ul de hematies reactivos B

-antildeadir suero o plasma

3- centrigugar en centrifuga para DG sol

Leer los resultados

RESULTADOS

NEGATIVO - Banda de hematies al fondo de la columna resto de la columna sin

aglutinados

POSITIVO

+- Escasoa glutinados de pequentildeo tamantildea d ela columna

1+ Algunos aglutinados pequentildeso en la columna

2+ aglutinados pequentildeso en la columna o mediano a lo largo de la columna

3+ Banda superior de aglutinado

4+ Banda de aglutinados en la parte superior de la columna

DP Doble poblacion (doble banda de hematies en el fondo y en la parte

superior

INTERPRETACION DE RESULTADOS

GRUPO HEMATICO GRUPO SERICOmicrotubo

Amicrotubo

Bmicrotubo

ABmicrotubo

CTL

MICROTUBUBON+ a1

MICROTUBUBON+ B

ABOGRUPO

0 0 0 0 + + 0+ 0 + 0 0 + A

0 + + 0 + 0 B

+ + + 0 0 0 AB

SISTEMA RhMicrutubo D Micrutubo

DrdquoMicrutuboCTL

INTERPRETACION

+ + 0 D positivo

0 0 0 D negativo

0 + 0

+ 0 0

D deacutebil parcial

RESULTADO E INTERPRETACION DE LA PRACTICA

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Resultado A+

CONCLUSION

Concluyo que esta teacutecnica es una forma de estabilizar las reacciones de aglutinacioacuten y

reducir los resultados falsamente negativos a consecuencia de una teacutecnica inapropiada

asi como crear un meacutetodo de interpretaciones sencillas y constantes

Practica No 5ldquoPrueba de compatibilidadrdquo

Introduccioacuten

Para requerir una oacuteptima transfusioacuten actualmente serequiere de aceptaciones inmunoloacutegicas receptor - donanteya que la transfusioacuten de sangre o la de sus componentescelulares de un donante a un receptor es una forma detransplante

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La prueba de Coombs se usa para determinar la presencia deanticuerpos no aglutinantes en el suero de sujetossensibilizados a uno o mas antiacutegenos sanguiacuteneos Es uacutetil enel estudio del suero de mujeres con isoinmunizacioacutenmaterno-fetal y se emplea tambieacuten en otro tipo de pruebas

como identificacioacuten de anticuerpos autoinmunes deteccioacutende algunos sistemas sanguiacuteneos y pruebas de compatibilidadsanguiacutenea

La prueba indirecta se realiza con eritrocitos normalesincubados in Vitro con el suero de estudio Durante esteperiodo si existe un anticuerpo este se fija sobre surespectivo determinante antigeacutenico Una vez fijados loseritrocitos son igualmente lavados y se agrega el reactivode Coombs produciendo aglutinacioacuten

Una prueba de Coombs indirecta positiva significa queexisten anticuerpos libres en el suero de la persona loscuales puedan ser igualmente auto-anticuerpos oisoanticuerpos

Material y equipo

bull Pipetas automaacuteticas de 10 microl 25 microl 50 microl y 1 ml

bull Puntas de pipetas desechables

bull Tubos de vidrio

bull Incubador para tarjetas DG Gel

bull Centrifuga para tarjetas DG Gel

Material bioloacutegico

bull Hematiacutees reactivo para investigacioacuten e identificacioacuten de anticuerpos irregulares de

Diagnostic Grifols SA

bull Suero de hemoclasificacioacuten

bull Muestras de sangre de extraccioacuten reciente recogida con anticoagulante o sin

anticoagulante

Reactivos

bull Tarjetas DG Gel

bull DG Gel Sol

Reactivos

Tarjetas DG Gel Coombs DG Gel SolRango de temperatura entre 2 y 25 ordmC Rango de temperatura entre 2 y 8ordmCLote 704901 Lote 7003701Cad 2008-03 Cad 2008-06Aspecto transparente Aspecto transparenteColor verde Color incoloro

TeacutecnicaMeacutetodo manual

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1 Dejar atemperar (18-25ordmC) muestras y reactivo2 Inspeccionar el estado de las tarjetas antes de utilizar3 Identificar las tarjetas y muestras a utilizar4 Despegar con precaucioacuten la lamina de metal que cubre los microtubos para prevenir

contaminaciones cruzadas entre ellos

5 Preparar una suspensioacuten con hematiacutees al 1 en DG Gel Sol (10 microl de sedimento oconcentrado de hematiacutees en 1 ml de DG Gel Sol) Utilizar los hematiacutees del donantepara la PC mayor y hematiacutees del receptor para la PC menor Asegurar la suspensioacuten delos hematiacutees antes de utilizar

6 Dispensar en el tubo correspondiente 50 microl de suspensioacuten de los hematiacutees al 1 deldonante (PC mayor) o 50 microl de suspensioacuten de los hematiacutees al 1 del receptor (PCmenor)

7 Antildeadir 25 microl de suero o plasma del receptor (PC mayor) o 25 microl de suero o plasma deldonante (PC menor)

8 Preparar auto control con 50 microl de suspensioacuten de los hematiacutees al 1 del receptor y 25microl de suero o plasma del receptor

9 Incubar 15 minutos a 37 ordmC10 Centrifugar en la centrifuga para tarjetas DG Gel

11 Leer los resultados

InterpretacioacutenNegativo - Banda de hematiacutees en el fondo de la columna resto de la columna sin aglutinados visibles

Positivo +- Escasos aglutinados de pequentildeo tamantildeo en la mitad inferior de la columna

1+ Algunos aglutinados de pequentildeo tamantildeo en la columna

2+ Aglutinados de tamantildeo pequentildeo o mediano a lo largo de la columna

3+ Banda superior de aglutinados de tamantildeo mediano en la mitad superior de la columna

4+ Banda de hematiacutees aglutinados en la parte superior de la columna

DP Doble poblacioacuten (doble banda de hematiacutees en el fondo y en la parte superior de la columna

Resultados

Paciente Lira Cabrera Carlos Alberto (AB+)Donador 1 Orea Valero Erasmo (A+)Donador 2 Moreno Adolfo (O+)

M1 m1 M2 m2 AutocontrolGR de donador 1 +suero del paciente

GR del paciente +suero de donador 1

GR de donador 2 +suero del paciente

GR del paciente +suero de donador 2

GR del paciente +suero del paciente

- + - + -

Por lo antes expuesto se puede deducir que el donador 1 (A+) puede donar eritrocitos al

paciente (AB+) lo mismo que el donador 2 (O+) puede donarle eritrocitos no asiacute plasma por parte de ambos donadores pues la prueba muestra que hubo reaccioacuten en ambas pruebasmenores

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Conclusioacuten

Concluyo que es esencial que toda la sangre sea estudiadaantes de la transfusioacuten para Asegurar que todos losgloacutebulos rojos transfundidos son compatibles con losanticuerpos en el plasma del paciente Evitar estimular laproduccioacuten de nuevos anticuerpos contra los gloacutebulos rojosen el receptor especialmente anti-Rh D

PRAacuteCTICA No 6PRUEBA DE COMPATIBILIDAD SANGIacuteNEA

(Teacutecnica salina)

INTRODUCCIOacuteN

Landsteiner constatoacute que cuando un aglutinoacutegeno se pone

en contacto con la aglutinina homoacuteloga se produce unaaglutinacioacuten

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La compatibilidad sanguiacutenea es la posibilidad de mezclade sangre sin que se produzcan trastornos tales como losfenoacutemenos de la lisis o de la aglutinacioacuten

A causa de este fenoacutemeno bioloacutegico en las transfusiones

de sangre no es suficiente con conocer que la sangre deldonante y la del receptor son del mismo grupo o bien quela del donante pertenezca al grupo O (cero) sino que esnecesario conocer si la compatibilidad es perfecta porqueninguacuten otro fenoacutemeno de inmunizacioacuten interfiera Es eneste sentido por lo que son empleadas las pruebascruzadas

Ademaacutes de los 6 antiacutegenos del sistema ABO en loseritrocitos humanos existen numerosos sistemas deaglutinoacutegenos que contienen muchos antiacutegenos individuales

en los eritrocitos (maacutes de 500000 millones posibles defenotipos de grupos sanguiacuteneos conocidos) Para evitaraccidentes transfusionales es indispensable tener encuenta el sistema Rh ademaacutes del ABO

Del sistema de antiacutegenos Rh es el D el maacutes antigeacutenico yel teacutermino Rh positivo indica que el individuo presentaaglutinoacutegeno D El individuo Rh negativo no tiene antiacutegenoD y forma la aglutinina anti-D en contacto con eacuteste

Las reacciones antiacutegeno-anticuerpo pueden observarse in

vitro por

mdash Hemoacutelisis la unioacuten antiacutegeno-anticuerpo se traduce enlisis de los eritrocitos en presenciadel complemento (siempre que el anticoagulante empleado nocapture losiones Ca y Mg necesarios para la activacioacuten delcomplemento) mdash Aglutinacioacuten los anticuerpos que reaccionan en mediosalino se conocen comoanticuerpos completos o aglutinantes (comuacutenmente tipo

IgM)

OBJETIVO Determinacioacuten de los antigenos del sistema ABORh (D) y su compatibilidad entre un paciente Donador y unPaciente Receptor

MATERIAL5 Tubos de ensaye6 Pipetas Pasteur

1Gradilla1 Bulbo

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EQUIPOMicrocentriacutefugaBantildeo Mariacutea oacute Estufa

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Papel Parafilm

MUESTRA Muestra de sangre con Anticoagulante EDTA

REACTIVOSAntisuero RO-Antiglobulina humana (Poliespeciacutefico Anti IgG C-d) Para prueba de CoombsLABORATORIOS LAFON SA de C VFecha de Caducidad 31-Ene-09Lote 406Hecho en MeacutexicoAspecto TransparenteColor Verde

TEacuteCNICA

Lavar los eritrocitos con solucioacuten salina (3 veces)

SALINA RAacutePIDA1 Agregar una gota de Eritrocitos Lavados2 Diluirlo al 3-5 con solucioacuten salina 093 Agregar 2 gotas de suero4 Centrifugar y observar anotar desprendimiento del botoacuten

SALINA 37deg BANtildeO MARIacuteA

1 Incubar tubos a Bantildeo mariacutea a 37degC durante 1hora (o 20 min)2 Centirfugar despueacutes de haber pasado el

tiempo3 Desprender el botoacuten de eritrocitos y

observarAGLUTINACIOacuteNndash No es compatibleNO AGLUTINACIOacuteN - Lavar 3 veces

SALINA COOMBS

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PRUEBA MAYOR

G Rojos del DONADOR+

Suero del RECEPTOR(paciente)

PRUEBA MENOR

G Rojos del RECEPTOR(paciente)

+Suero del DONADOR

AUTOTESTIGO

G Rojos del RECEPTOR(paciente)

+Suero del RECEPTOR

(paciente)

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1 Con solucioacuten salina 09 lavar loseritrocitos de los tubos q no tuvieronaglutinacioacuten 3 veces

2 Decantar y agregar 2 gotas de reactivode Coombs

AGLUTINACIOacuteN ndash No es compatibleNO AGLUTINACIOacuteN - Lavar 3 veces

RESULTADOS

Paciente Madrigal Meacutendez Luis Eduardo (B+)Folio 009164Fecha301007

Donador 1 Torres Avileacutes Joseacute Ramoacuten (O+)Folio 022604Fecha311007

Donador 2 Rodriacuteguez Nuacutentildeez Joseacute Angel (A+) Folio 022605

Fecha311007

SALINA RAacutePIDA

M1 m1 M2 m2 AutotestigoGR de donador 1+ suero del

paciente

GR del paciente+ suero dedonador 1

GR de donador 2+ suero del

paciente

GR del paciente+ suero dedonador 2

GR del paciente+ suero del

paciente

- 4+ 4+ 4+ -

SALINA 37deg BANtildeO MARIacuteA

M1 m1 M2 m2 Autotestigo- 4+ 4+ 4+ -

Compatible Nocompatible

Nocompatible

Nocompatible

Compatible

SALINA COOMBS

Por lo tanto se puede decir que el donador 1 (O+) puededonar suero al paciente (B+) debido a que en el suero nohay anticuerpos de ninguacuten tipo que reaccionen con losantiacutegenos de los eritrocios del Donador 1 Mientras tantoel Donador 2 no puede donar al Paciente ni suero nieritrocitos

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M1 Autotestigo- -

Compatible

Compatible

21

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INTERPRETACIOacuteN

PRUEBA POSITIVA Existe una aglutinacioacuten de lasceacutelulas sanguiacuteneas que indica la presencia delantiacutegeno A o B En el suero de Coombs notamos si esta

la precencia de Antiacutegeno D en los eritrocitos Lahemoacutelisis no se debe interpretar como resultadopositivo ya que puede indicar contaminacioacuten delreactivo

PRUEBA NEGATIVA La no aglutinacioacuten indica unresultado negativo e indica que las ceacutelulas sonnegativas para Antiacutegenos del sisitema ABO y D

CONCLUSIOacuteN

He concluido que en las transfusiones de sangre no essuficiente con conocer que la sangre del donante y la delreceptor son del mismo grupo o bien que la del donantepertenezca al grupo O (cero) sino que es necesarioconocer si la compatibilidad es perfecta porque ninguacutenotro fenoacutemeno de inmunizacioacuten interfiera Es en estesentido por lo que son empleadas las pruebas cruzadas

Praacutectica No 7ldquoPrueba de compatibilidad sanguiacutenea (teacutecnica albumina)rdquo

IntroduccioacutenLa tipificacioacuten de sangre identifica el tipo sanguiacuteneo determinandoantiacutegenos presentes en los eritrocitos detecta aloanticuerpos encontra esos antiacutegenos Asiacute los aloanticuerpos pueden aparecernaturalmente o ser inducidos y pueden ser dirigidos contra del grupoconocido o a los antiacutegenos de superficie de los eritrocitos La prueba

de compatibilidad sanguiacutenea o cross matching esta formada por laprueba mayor y menorLa prueba de cruzamiento mayor para losaloanticuerpos consiste en probar el plasma del receptor contra los

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gloacutebulos rojos del donante Es incompatible cuando se genera unareaccioacuten hemoliacutetica los eritrocitos del donante se destruyen por losaloanticuerpos del plasma del receptor La prueba menor es una pruebapara los aloanticuerpos del plasma del donante en contra los gloacutebulosrojos del receptor Una incompatibilidad menor es una causa menosfrecuente para causar una reaccioacuten en contra una transfusioacuten porque

el volumen de plasma del donante es menor y es diluido marcadamente enel receptor Para llevar a cabo dicho procedimiento se utilizandiversos reactivos como potencializadores que mejoran la unioacuten deeritrocitos con alguacuten tipo de anticuerpo Uno de esospotencializadores es la albuacutemina La albumina bovina polimerizada esun reactivo muy utilizado en el laboratorio de inmunohematologia y encentros de bancos de sangre funciona como un potencializador quefacilita la reaccion de aglutinacioacuten de eritrocitos sensibilizados Alfinal de la prueba se prueban los eritrocitos con el reactivo deCoombs El principio de la prueba de Coombs fue descrito por Moreschien 1908 pero Coombs Mourant y Race en 1946 la introdujeron en elestudio de los grupos sanguiacuteneos y anticuerpos cuando una parte desangre (suero) fue usada para la inoculacioacuten de animales para

inmunizarlos con proteiacutena humana utilizando el anticuerpo obtenido enla deteccioacuten de los llamados anticuerpos incompletos Esta prueba seusa para determinar la presencia de anticuerpos no aglutinantes en elsuero de sujetos sensibilizados a uno o mas antiacutegenos sanguiacuteneos Esuacutetil en el estudio del suero de mujeres con isoinmunizacioacuten materno-fetal y se emplea tambieacuten en otro tipo de pruebas como identificacioacutende anticuerpos autoinmunes deteccioacuten de algunos sistemas sanguiacuteneos ypruebas de compatibilidad sanguiacutenea La prueba indirecta se realizacon eritrocitos normales incubados in Vitro con el suero de estudioDurante este periodo si existe un anticuerpo este se fija sobre surespectivo determinante antigeacutenico Una vez fijados los eritrocitosson igualmente lavados y se agrega el reactivo de Coombs produciendoaglutinacioacuten Una prueba de Coombs indirecta positiva significa que

existen anticuerpos libres en el suero de la persona los cualespuedan ser igualmente auto-anticuerpos o isoanticuerpos

Objetivo Determinacioacuten de los antiacutegenos del sistema ABO Rh (D) y sucompatibilidad entre un paciente Donador y un Paciente Receptor

Material y equipo

5 Tubos de ensaye

6 Pipetas Pasteur

1Gradilla

1 Bulbo

Papel Parafilm

Microcentriacutefuga

Bantildeo Mariacutea oacute Estufa

Material bioloacutegico

Muestras de sangre de extraccioacuten reciente recogida conanticoagulante o sin anticoagulante

ReactivosSuero de CoombsAlbuacutemina bovina deg

Suero anti-globulina humana Lafon Lote 406 Cad 310109 Color verde Aspecto

transparentedegAlbumina de bovino polimerizada Interbiol Lote APO107 Cad 150109 Color incoloroAspecto transparente

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Teacutecnica

1 Montar prueba mayor 1 y 2 prueba menor 1 y 2 y autotestigocon el procedimiento ya anteriormente conocido

2 Agregar 2 gotas de albuacutemina al 223 Centrifugar 20 segundos4 observar aglutinacioacuten o hemolisis o no aglutinacioacuten5 A los tubos con lecturas negativas incubar 20 minutos en bantildeo

Mariacutea a 37 degC6 Centrifugar y observar

bull Aglutinacioacuten o hemoacutelisis reportar incompatible

bull No aglutinacioacuten llevar a Coombs

7 Lavar tres veces decantar y quitar el exceso de salina congasa y agregar 2 gotas de reactivo de Coombs y centrifugar 20segundos y observar

bull Aglutinacioacuten o hemoacutelisis reportar incompatible

bull No aglutinacioacuten reportar compatible

Resultados1 PRUEBA MAYOR 1 2 Gotas de suero del paciente + 1 gota de GR al 3-5 del

donador 12 PRUEBA MENOR 1 2 Gotas de suero del donador 1 + 1 gota de GR al 3-5 del

paciente3 PRUEBA MAYOR 2 2 Gotas de suero del paciente + 1 gota de GR al 3-5 del

donador 24 PRUEBA MENOR 2 2 Gotas de suero del donador 2 + 1 gota de GR al 3-5 del

paciente5 AUTOTESTIGO 2 Gotas de suero del paciente + 1 gota de GR al 3-5 del paciente

M1 m1 M2 m2 AutotestigoCon albuacutemina - - - - -Despueacutes de incubacioacuten a 37 degC - - - - -Despueacutes de Coombs - - - - -Despueacutes de validacioacuten con gloacutebulos

positivos+ + + + +

InterpretacioacutenPrueba positiva Alutinacioacuten o hemolisis Indica no compatibilidadPrueba negativaNo aglutinacioacuten Indica compatibilidad

Esquemas

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ConclusioacutenConcluyo que la prueba de compatibilidad sanguiacutenea en su modalidad conalbuacutemina bovina ofrece mucha ventaja al ser al igual que otrosreactivos un potencializador de la reaccioacuten antiacutegeno-anticuerpo Estopermite que el operador o realizador de la prueba tenga mayorconfianza y certeza en los resultados que obtenga

PRACTICA No 8PRUEBA DE COMPATIBILIDAD SANGUINEA PRUEBA DE LISS

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FUNDAMENTO

LISS es utilizado para reducir la fuerza ioacutenica del medio

de reaccioacuten en los procedimientos de deteccioacuten eidentificacioacuten de anticuerpos y en las pruebas decompatibilidad La presencia de este reactivo refuerza lainteraccioacuten antiacutegeno - anticuerpo durante la incubacioacuten

GENERALIDADESEl uso de solucioacuten salina de baja fuerza ioacutenica fuedescrito inicialmente en 1964 por Hughes-Jones y col y

Elliot y col pero en ese tiempo su uso era limitado yaque la concentracioacuten molar obtenida provocaba la hemoacutelisisde los eritrocitos suspendidos

En 1974 Low y Messeter describieron el uso rutinario de lasolucioacuten Liss de 003 M que lograba reducir el tiempo deincubacioacuten y no presentaba tendencia a la hemoacutelisis al sersuspendidos en salina a baja fuerza ioacutenica restableciendola presioacuten osmoacutetica de la solucioacuten mediante la adicioacuten deglicinaLas soluciones de baja fuerza ioacutenica son actualmente lasmaacutes utilizadas en inmunohematologiacutea provocando un aumentoen la velocidad de asociacioacuten entre antiacutegenos y anticuerpospermitiendo asiacute acortar el tiempo de incubacioacuten de 60minutos a 10-15 minutos sin sacrificar la sensibilidad delas mismas y sin costos elevadosSe ha observado que lasreacciones antiacutegeno-anticuerpo se ven potenciadas alreducir la fuerza ioacutenica del medio de reaccioacuten

La fuerza ioacutenica es uno de los factores maacutes importantes quedeterminan la tasa y la cantidad de captacioacuten deanticuerpos por parte de los eritrocitos El uso de mediosde reaccioacuten de baja fuerza ioacutenica permite disminuir eltiempo de incubacioacuten y potenciar las reacciones de losanticuerpos sin incrementar las reacciones inespeciacuteficas

Los iones Na+ y Cl- presentes en la solucioacuten salinafisioloacutegica se agrupan alrededor de las moleacuteculas deantiacutegeno y anticuerpo neutralizando sus cargas opuestas locual dificulta la unioacuten entre ellos Este efecto se reduceutilizando soluciones de baja fuerza ioacutenica y disminuyendode esta manera la incubacioacuten de las pruebas

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En esta etapa de sensibilizacioacuten las posibilidades deasociacioacuten pueden incrementarse mediante agitacioacutencentrifugacioacuten yo variacioacuten de la concentracioacuten delanticuerpo

Despueacutes de que el anticuerpo se ha fijado al antiacutegeno loseritrocitos sensibilizados deben unirse para dar lugar a laaglutinacioacuten visible esta red tambieacuten solidifica yestabiliza la reaccioacuten

En esta etapa la reaccioacuten depende de factores como lascaracteriacutesticas del anticuerpo localizacioacuten en la membranay nuacutemero de sitios antigeacutenicos fuerzas que mantienen ladistancia entre los eritrocitos

Las caracteriacutesticas del anticuerpo que deben considerarse

son el tamantildeo del anticuerpo involucrado y el nuacutemero desitios de combinacioacuten con el antiacutegeno Los anticuerpos IgMpueden establecer puentes entre los eritrocitos yaglutinarlos espontaacuteneamente en solucioacuten salina mientrasque los IgG no ya que las IgM pentameacutericas poseen 10sitios de combinacioacuten con el antiacutegeno y las IgG diacutemerossoacutelo dos sitios

Los eritrocitos tienen una carga neta negativa en susuperficie su interaccioacuten con los iones del medio alteraesta carga y producen una carga neta criacutetica denominada

potencial zeta y la reduccioacuten de dicha carga permite quelos eritrocitos se aproximen lo suficiente para que seanaglutinados por medio de los IgG que los sensibilizaron

Las soluciones de baja fuerza ionica empleadas en banco desangre tienen un pH entre 65 ndash 70 se recomienda unaosmolalidad de 270 ndash 305 mosmkg y una conductividad de 37mmcm El control diario implica el examen de su aparienciafiacutesica ausencia de turbidez particulas o sedimento asiacutecomo corroborar la capacidad para generar hemoacutelisiscrenacion o prueba de coombs positiva en eritrocitos

normales Cada lote nuevo se valora mediante el rastreo deun anticuerpo ya sea un anti- D un anti- jk anti- fy oanti- kell diluido se compara su capacidad de deteccioacutencontra un medio salino normal incubando 10min a 37ordmC enLISS debe poder rastrearse un anticuerpo en tanto que enmedio salino no

MATERIAL Y EQUIPO

Material Cantidad10 Tubos de ensayo de 12 x 75

1 Gradilla10 Pipetas pasteur

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1 Bulbo1 Marcador1 Microcentriacutefuga1 Bantildeo Mariacutea

MATERIAL BIOLOGICO

Gloacutebulos rojos lavados al 3 - 5Suero

REACTIVOS

Reactivo de LISSReactivo de Coombs

TECNICA1- Lavar los eritrocitos

Separar el suero del paquete de gloacutebulos rojos

Agregar cierta cantidad de eritrocitos a un tubo deensayo y agregarle solucioacuten salina

Centrifugar y decantar

Repetir este proceso 3 veces

2- Realizar la Prueba de LISS

Enumerar los tubos Poner dos gotas de LISS en cada tubo agregar una gota

de eritrocitos lavados y al 3 - 5 seguacuten el nuacutemero detubo correspondiente

Mezclar y centrifugar un minuto decantar elsobrenadante y con la ayuda de una gasa limpiar elexceso del reactivo

Poner nuevamente 2 gota de LISS resuspender poragitacioacuten agregar 2 gotas de suero problema mezclarincubar 15 minutos a 37ordm C centrifugar 30 seg A 1000

RPM Anotar los resultados

3- A las pruebas negativas realizar Coombs

Lavar 3 veces las ceacutelulas agregar suero de Coombscentrifugar 30 seg

Leer aglutinaciones y anotar resultados

REACTIVOS UTILIZADOS

REACTIVO MARCA FECHA DECADUCIDAD

ASPECTO COLOR LOTE

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SueroAntiglobuina

humana

Lafon 31 01 2009 Transparente Verde 406

LISS Caserorealizado enCMNSIGLOXXI

1 antildeo Transparente Transparente

----------

PACIENTE ASCANIO MENDEZ JOSUE O (+)DONADOR 1 GARCIA CARBAJAL OSCAR O (+)DONADOR 2 GARCIA SUAREZ ORLANDO A (+)

RESULTADOS

INTERPRETACIOacuteN DE LOS RESULTADOS

La hemoacutelisis o la aglutinacioacuten representan un resultado positivo e indican lapresencia de una reaccioacuten antiacutegeno-anticuerpo Los resultados negativos no severa aglutinacioacuten o hemolisis

ESQUEMAS

CONCLUSIONES

Concluyo que la prueba de compatibilidad sanguiacutenea en su modalidad conliss ofrece mucha ventaja al ser al igual que otros reactivos unpotencializador de la reaccioacuten antiacutegeno-anticuerpo Esto permite queel operador o realizador de la prueba tenga mayor confianza y certezaen los resultados que obtenga

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Tubo Resultado

M1 NEGATIVOm1 NEGATIVO

M2 POSITIVO

M2 NEGATIVO

AUTOTES NEGATIVO

29

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PRACTICA 9INMUNOHEMATOLOGIA

DETERMINACION DE COOMBS DIRECTO

INTRODUCCIONPRUEBA DE COOMBS DIRECTA

El examen de Coombs directo se utiliza para detectar autoanticuerpos contralos propios gloacutebulos rojos (GR) de un individuo Es una prueba que sirve parademostrar el revestimiento de los eritrocitos in vivo (mientras los eritrocitosestaacuten circulando en el individuo) La prueba se realiza agregando directamenteel reactivo de Coombs a los eritrocitos previamente lavados para eliminar otras proteiacutenas no fijadas a el una prueba directa positiva significa que larelacioacuten antiacutegeno-anticuerpo ocurrioacute in vivo es decir que la fijacioacuten del

anticuerpo sobre el antiacutegeno se realizo en el organismo del individuo enestudio

Las indicaciones principales de esta prueba son diagnostico de enfermedadeshemoliacuteticas ictericia o anomaliacuteas en la apariencia de los gloacutebulos rojos bajo elmicroscopio ya que estos anticuerpos algunas veces destruyen los gloacutebulosrojos y causan anemia para investigar reacciones en transfusiones Parainvestigar la induccioacuten de drogas en ceacutelulas rojas sensibilizadas medicamentos(por ejemplo quinidina metildopa procainamida y otros) que pueden llevar a la produccioacuten de estos anticuerpos

OBJETIVO Determinar la presencia de anticuerpos en la superficie de losgloacutebulos rojos del individuo

MATERIAL

bull 10 Tubos de 1275

bull 10 Pipetas Pasteur

bull 1 Gradilla

bull 1 Bulbo

bull Papel Parafilm

bull Microcentriacutefuga

bull Bantildeo Mariacutea a 37degC

MUESTRA BIOLOGICA

Eritrocitos lavados de (3-5) del donador o pacienteREACTIVO

Suero de CoombsSuero anti-globulina humana Lafon Lote 406 Cad 310109 Color verde Aspecto transparente

TECNICA

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Colocar en un tubo de ensaye dos gotas de suero de Coombs mas una gota deglobulos rojos (3-5)Centrifugar a 1000 rpm durante 20 segDesprender el boton suavemente y buscar la presencia de aglutinacionRotular y enumerar 8 tubos de ensayes con las diferentes diluciones

(frac12frac1418)Enumerar 8 tubos mas del 1 al 8Agregar a cada tubo de las diluciones 10 gotas de solucion salina mas 10 gotasde suero de CoombsColocar Al primer tubo de la dilucion 1 gota de globulos rojos (3-5) mezclar completamente y agregar al tubo 1Centrifugar todos los tubos a 1000 rpm durante 20 seg

LECTURA

Aglutina- Prueba de Coombs directa es positiva

No aglutina- Prueba de Coombs directa es negativa

ESQUEMAS y RESULTADOS

CONCLUCION

He concluido que la prueba de Coombs directa es una prueba que se utiliza para medir

la presencia de anticuerpos en la superficie de los gloacutebulos rojos que se encuentran

circulando en el paciente y se realiza para investigar reacciones en transfusiones ademaacutes

sirve para la determinacioacuten de anemia hemoliacutetica autoinmune entre otras afecciones

Practica 10

IDENTIFICACION DE ANTICUERPOS IRREGULARES

Fundamento

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DILUCIONES

frac12 positiva

frac14 positiva

18 positiva

116 negativa

132 negativa

164 negativa

1128 negativa1256 negativa

31

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Los anticuerpos del sistema ABO aparecen una vez que elindividuo entra en contacto con el medio ambiente y en elcual se encuentran microorganismos como algunas bacteriascoliformes que contienen sustancias quiacutemicas en suestructura parecidas a las de este sistema Por anticuerpos

regulares debemos identificar a los que existen en todoslos individuos y que eacutestos tendraacuten durante toda su vida

Los anticuerpos irregulares son los que no estaacuten de esamanera aunque en el caso de los naturales no se conoce aciencia cierta queacute o coacutemo se induce su produccioacuten Losadquiridos se conocen tambieacuten como inmunes y son elresultado de la exposicioacuten a antiacutegenos desconocidos por elindividuo al momento de la transfusioacuten o en las mujerespor el embarazo estos anticuerpos son dirigidos contraantiacutegenos de sistemas diferentes al ABO

Los anticuerpos naturales regulares son preferentementeinmunoglobulinas M las cuales fijan de manera taneficiente el complemento que pueden provocar lisisintravascular y ocasionar insuficiencia renal o incluso lamuerte del paciente Los anticuerpos adquiridos o inmunesson generalmente inmunoglobulinas G las cuales producenhemoacutelisis extravascular en el bazo o en el hiacutegado mediantefagocitosis del complejo eritrocito maacutes anticuerpo

Los aloanticuerpos irregulares (adquiridos) maacutes comunes en

nuestra poblacioacuten son los que involucran a los sistemasMNSs P1 Kidd (Jka Jkb) Duffy (Fya Fyb) Kell Lewis yDiego

OBJETIVO identificacioacuten del anticuerpo irregular a traveacutesde las diferentes teacutecnicas

MATERIAL

bull 10 Tubos de ensaye

bull 10 Pipetas Pasteur

bull

1Gradillabull 1 Bulbo

bull Papel Parafim

MATERIAL BIOLOGICO

bull Gloacutebulos rojos lavados al 3 - 5

bull Suero

bull REACTIVOSReactivos

1 Suero de Coombs2 Albuacutemina bovina

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bull EQUIPO1 Microcentriacutefuga2 Bantildeo Mariacutea oacute Estufa

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3 SOLUCION SALINA4 SOLUCION DE LISS

TEacuteCNICA SOLUCION SALINA

Lavar los eritrocitos con solucioacuten salina (3veces)SALINA RAacutePIDA

Agregar una gota de Eritrocitos LavadosDiluiacuterlo al 3-5 con solucioacuten salina 09Agregar 2 gotas de sueroCentrifugar y observar anotar desprendimientodel botoacuten

SALINA 37deg BANtildeO MARIacuteA1) Incubar tubos a Bantildeo mariacutea a 37degC durante 1

hora (o 20 min)

2) Centirfugar despueacutes de haber pasado eltiempo

3) Desprender el botoacuten de eritrocitos yobservar

AGLUTINACIOacuteNndash No es compatibleNO AGLUTINACIOacuteN - Lavar 3 veces

SALINA COOMBS1) Con solucioacuten salina 09 lavar los

eritrocitos de los tubos q no tuvieronaglutinacioacuten 3 veces

2) Decantar y agregar 2 gotas de reactivode Coombs

AGLUTINACIOacuteN ndash No es compatibleNO AGLUTINACIOacuteN - Lavar 3 veces

TECNICA LISS

1 Poner dos gotas de LISS en cada tubo agregar una gotade eritrocitos lavados y al 3 - 5 seguacuten el nuacutemero detubo correspondiente

2 Mezclar y centrifugar un minuto decantar el

sobrenadante y con la ayuda de una gasa limpiar elexceso del reactivo

3 Poner nuevamente 2 gota de LISS resuspender poragitacioacuten agregar 2 gotas de suero problema mezclarincubar 15 minutos a 37ordm C centrifugar 30 seg A 1000RPM

4 Anotar los resultados

A las pruebas negativas realizar Coombs

1 Lavar 3 veces las ceacutelulas agregar suero de Coombs

centrifugar 30 seg2 Leer aglutinaciones y anotar resultados

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TECNICA ALBUMINA BOVINA 8 Agregar 2 gotas de albuacutemina al 229 Centrifugar 20 segundos10observar aglutinacioacuten o hemolisis o no aglutinacioacuten

11A los tubos con lecturas negativas incubar 20minutos en bantildeo Mariacutea a 37 degC12Centrifugar y observar

bull Aglutinacioacuten o hemoacutelisis reportar incompatible

bull No aglutinacioacuten llevar a Coombs

13Lavar tres veces decantar y quitar el exceso desalina con gasa y agregar 2 gotas de reactivo deCoombs y centrifugar 20 segundos y observar

bull Aglutinacioacuten o hemoacutelisis reportar incompatible

bull No aglutinacioacuten reportar compatible

Resultados ANTICUERPO IRREGULAR Anticuerpo c

InterpretacioacutenEstos anticuerpos son generalmente inmunoglobulinas tipo My ocasionalmente tipo G y debido a esa temperatura dereaccioacuten carecen de importancia cliacutenica salvo que sureaccioacuten ocurra tambieacuten a 37 degC su importancia radica enpacientes que seraacuten intervenido a 22 ordmc como es el caso de

operacioacuten de corazoacuten

Los llamados anticuerpos calientes tienen una temperatura oacuteptima dereaccioacuten a 37 degC a Estos anticuerpos tienen una relevanteimportancia cliacutenica ya que se les asocia con reaccionestransfusionales de intensidad moderada a severa que puedenocasionar la muerte

Esquemas

CONCLUSIONHe concluido que es importante determinar los anticuerposirregulares ya que estos anticuerpos tienen una relevanteimportancia cliacutenica ya que se les asocia con reaccionestransfusionales de intensidad moderada a severa

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ConclusioacutenConcluyo que Para realizar una transfusioacuten sanguiacutenea se debe tomar en cuenta la sangre deldonante y la del receptor Los individuos pertenecientes al grupo O pueden donar sangre acualquier otro grupo sanguiacuteneo porque sus eritrocitos carecen de antigeno que puedan ser reconocidos por la sangre del receptor Las personas del grupo AB pueden recibir sangre decualquier grupo ya que carecen de anticuerpos

PRACTICA Nordm 2DETERMUNACION DE SUBGRUPOS

Anti- A1 Lectina(Dolichos biflorus)

Lectina de grupo sanguiacuteneo

INTRODUCCION

El sistema de grupos sanguiacuteneos ABO sigue siendo el primeroa tener en cuenta en el momento de realizar una transfusioacutende sangre Los antiacutegenos A y B son productos geacutenicosfaacutecilmente detectables y constituyen marcadoresgeneacuteticos de gran valor Entre los individuos A se

distinguen 2 categoriacuteas A1y A2

La diferenciacioacuten entre ambas se realiza mediante lautilizacioacuten de anticuerpos monoclonales y lectinasespeciacuteficas de grupo sanguiacuteneo Dolichos biflorus (anti A1)y Ulex europaeus (anti H)

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Uso Inmucor anti-A1 Lectin se utiliza para diferenciar ceacutelulas rojas A1 de otros

subgrupos A en pruebas en tubo o en placa

MATERIAL Y EQUIPObull Tubos de ensaye de 1075 mm

bull Cronometro

bull Marcador

bull Centrifuga seroloacutegica

MUESTRA BIOLOGICAbull Ceacutelulas rojas de donador o paciente

REACTIVObull Inmucor anti-A1 Lectin en gotero

MARCA INMUCOR INC

LOTE SN2132

CADUCIDAD 2007-12-14

TECNICA

1 Adicione una gota de anti-A1 a tubos adecuadamente marcados

2 Adicione una gota de una suspensioacuten de eritrocitos bajo prueba del 3-5 en

salina Mezcle completamente el contenido del tubo

3 Centrifugar de 15-30 minutos de 900-1000 rpm

4 Agite suavemente el tubo y resuspenda el botoacuten celular Examine las reacciones

resultantes macroscoacutepicamente Registre resultados

RESULTADOS ESPERADOS DE TIPIFICACION

GRUPOSANGUINEO

Anti-A Anti-A1 Porciento

A1 + + 80 DE TODOSLOS GRUPOS A

A1b + + 80 DE TODOSLOS GRUPOS AB

A2 + 0 20 DE TODOSLOS GRUPOS A

A2B + 0 20 DE TODOSLOS GRUPOS AB

A1NT + +DEBIL NO COMUNA3AM1AX1 + DEBIL 0 NO CUMUN

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ANTI-H (LECTINA)

Ulex europeaus

Para la determinacioacuten de del estado secretor y tipificacioacuten de las ceacutelulas rojas

INTRODUCCIONLa mayoriacutea de los grupos sanguiacuteneos ABO que se determinanen el banco de sangre cumplen con las leyes establecidas deantiacutegenos y anticuerpos reciacuteprocos para ese sistema

Los anticuerpos del sistema ABO existen en el individuodesde el momento en que son capaces de tener una respuestainmunoloacutegica y se producen contra los antiacutegenos A y B

Los subgrupos son fenotipos ABO que difieren en la cantidad

de antiacutegeno presente en los eritrocitos y en la saliva delos secretores Se hallan con mayor frecuencia y tienen maacutesrelevancia cliacutenica los de A que los de B Al utilizarlectinas se definen los subgrupos A1 y A2 con el extractode Dolichos biflorus se aglutinan los eritrocitos A1 perono los de A2 y el anti H semilla Ulex europeus aglutinaeritrocitos que tienen antiacutegeno H

MATERIAL Y EQUIPObull Tubos de ensaye de 1075mm

bull Cronometro

bull Marcador

bull Centrifuga seroloacutegica

MUESTRA BIOLOGICAbull Ceacutelulas rojas de donador o paciente

REACTIVObull Inmucor anti-H (Lectina) en gotero

MARCA GANMA

LOTE ML1581

CADUCIDAD 2007-11-14

TECNICA

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1 Adicione una gota de una suspensioacuten de eritrocitos bajo prueba del 3-5 en

salina en tubos adecuadamente marcados

2 Adicione dos gotas de anti-H Lectina y mezcle completamente el contenido del

tubo

3 incube durante 5 minutos a temperatura ambiente

4 Centrifugar de 15-30 minutos a 1000 rpm5 Agite suavemente el tubo y resuspenda el botoacuten celular Examine las reacciones

resultantes macroscoacutepicamente Registre resultados

INTERPRETACIOacuteN

PROBLEMA ANTI A1 ANTI H

(ANTI A2)

RESULTADO

SUBGRUPO

PACIENTE 1 + - ANTI A1

PACIENTE 2 - + ANTI A2

bull Prueba positiva Aglutinacioacuten de las ceacutelulas rojas

Nota La hemoacutelisis no debe interpretarse como un resultado positivo ya que esto

puede indetificarse como contaminacioacuten del reactivo

bull Prueba negativa Ausencia de aglutinacioacuten de las ceacutelulas rojas

CONCLUSIONES

Concluyo que para realizar unatransfusioacuten sanguiacutenea se debe tomar encuenta los subgrupos del donante y del

receptor Los subgrupo con mayorfrecuencia y tienen maacutes relevanciacliacutenica los de A que los de B Y seidentifican por medio de utilizarlectinas Los subgrupos A maacutesimportantes son A1 y A2

PRACTICA 3DETERMINACION DE Rh

INTRODUCCIOacuteN

El factor Rh es una clase de proteiacutena que se encuentra enlos gloacutebulos rojos de la sangre cuando alguien tiene esaproteiacutena se le considera ldquoRh Positivordquo Cuando no la tienees ldquoRh Negativordquo El factor Rh es hereditario y setransmite en dos genes El Factor Rh positivo es dominantees decir si una persona tiene un gen positivo y otronegativo su factor Rh seraacute positivo

Esta prueba es importante en el diagnostico y estudio

de la eritroblastosis fetal en la que los gloacutebulosrojos del nintildeo se encuentran sensibilizados con

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anticuerpo materno Es uacutetil tambieacuten en el diagnosticode la anemia hemoliacutetica adquirida (anticuerpos sobrelos gloacutebulo rojos del mismo paciente) asiacute como ladeterminacioacuten de eritrocitos sensibilizados en sangreusados para transfusioacuten

Las dos clasificaciones maacutes importantes para describirgrupos sanguiacuteneos en humanos son los antiacutegenos y el factorRh Las transfusiones de sangre entre grupos incompatiblespueden provocar una reaccioacuten inmunoloacutegica que puededesembocar en hemoacutelisis anemia fallo renal shock omuerte

MATERIAL

bull Tubos de ensayo de 12 x 75

bull Pipetas Pasteur

bull Gradilla

EQUIPO

bull Centrifuga

MUESTRA BIOLOacuteGICA

bull Eritrocitos lavados 3-5 del paciente

REACTIVOS

bull Antisuero Anti-D

bull Suero anti globulina humanabull Suero reactivo control

Antisuero D monoclonal NOVACLONELote NDMG04305CAD 29MAR08Aspecto transparenteColor incoloroSuero anti globulina HumanaLote 405CAD 06-NOV-08Aspecto transparenteColor verde

Reactivo control GAMMA-CLONELote GCM115-3CAD 2008-12-08Aspecto transparenteColor incoloro

TEacuteCNICA

Determinacioacuten de Rh

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bull Prepare una suspensioacuten de gloacutebulos rojos al 3-5 en solucioacuten salina Los gloacutebulos deben serlavados previamente 5 veces con el objeto deeliminar las proteiacutenas del plasma

bull Rotular 3 tubos para la previa identificacioacuten

de Rhbull Ponga 1 gota de la suspensioacuten lavada en cada

tubo

bull Antildeada una gota de anti suero D monoclonal

bull Mezcle y centrifugue 15 seg Y observe si hayaglutinacioacuten

Preparacioacuten del control negativo

bull Ponga una gota de eritrocitos lavados al 3-5

bull Antildeada una gota de reactivo control

bull

Centrifugue 15 seg y observe si hay aglutinacioacuten

Deteccioacuten de sangre Du

Nota esta teacutecnica se le realizo a los tubos problemasque no aglutinaron

bull Los tubos que no tuvieron aglutinacioacuten en ladeterminacioacuten de Rh se incuban 15 min yposteriormente se lavan 3 veces con sol Salina

bull Previamente lavados se le agregan 2 gotas de suerode COOMBS

bull Centrifugar 15 seg y observar desprender boton

ESQUEMAS

RESULTADOS problemas Aglutinacioacuten resultado2 positiva Rh +10 negativa Rh -11 negativa Rh -

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Paciente 2 coacutedigo 021612 plata Lugo JavierPaciente 10 coacutedigo 021620 Hernaacutendez Loacutepez GuillermoPaciente 11 coacutedigo 021621 camarillo Sonia rebeca

INTERPRETACIOacuteNPara el primer meacutetodoAglutinacion Rh positivoNo aglutinacioacuten realizar prueba de deteccioacuten desangre Du

Deteccioacuten de sangre DuAglutinacioacuten D deacutebil (Du positivo)No aglutinacioacuten Rh negativo

CONCLUSIONESCon el descubrimiento del sistema Rh se denominan Rhpositivos los hematiacutees que son aglutinados por esteanticuerpo y tienen por tanto el antiacutegeno Rh en lasuperficie Se denominan Rh negativos los que no sonaglutinados y que por tanto no poseen el antiacutegeno Rh ensu superficie

De la misma manera que en el sistema ABO en el sistema Rh

no se puede transfundir el antiacutegeno Rh a las personas queno lo tienen ya que podriacutea originar la produccioacuten deanticuerpos Rh en el receptor Los sujetos Rh negativossoacutelo podraacuten recibir sangre de donantes Rh negativos

PRACTICA 4INMUNOHEMATOLOGIA

DETERMINACION DE GRUPO SANGUINEO POR TECNICA DE GEL

INTRODUCCION

El sistema utilizado en inmunohematologiacutea para investigar e identificar antiacutegenos y

anticuerpos antieritrocitarios Es de tecnologiacutea de microtipificacioacuten en gel se basa en la

separacioacuten por tamantildeo de los eritrocitos aglutinados durante un proceso de

centrifugacioacuten en un gel poroso

Los eritrocitos van perdiendo elasticidad en sus membranas de forma que los

aglutinados grandes quedan atrapados en la zona superior y los pequentildeos quedan

distribuidos a lo largo de la columna

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Esta teacutecnica nos permite que estandaricemos la lectura de la reaccioacuten antiacutegeno-

anticuerpo con facilidad y repetitividad Asiacute como la estandariza del uso de reactivos

tiempos y lecturas disminuyendo sustancialmente la influencia de la mano de operador

OBJETIVO determinacioacuten de los antigenos del sistema ABORh (D) y determinacion

del grupo serico en tecnica de gel

FUNDAMENTOS

El principio del metdo se basa en la tecnica de gel descrita por Y Lapierre para la

deteccion de las reacciones de aglutinacion de los hematies La aglutinacion se produce

al entar en contacto los eritrocitos con los anticuerpos correspondientes

La tarjeta DG gel es un soporte de plastico constituidos por 8 microtubulos Cada

microtubulo esta formado por una columna y una camara de dispersionincubacion

La tecnologiacutea de microtipificacioacuten en gel se basa en la separacioacuten por tamantildeo de los

eritrocitos aglutinados durante un proceso de centrifugacioacuten en un gel poroso

Los eritrocitos van perdiendo elasticidad en sus membranas de forma que los

aglutinados grandes quedan atrapados en la zona superior y los pequentildeos quedan

distribuidos a lo largo de la columna

MATERIAL

Pipeta automaacutetica 10 ul 50ul 1 ml

Puntas de pipeta desechable Tubos de vidrios

DEG sol

Centrifugas para tarjetas DG gel

Hematies de reactivos para grupo inverso

MUESTRA BIOLOGICACeacutelulas rojas de donador o paciente

REACTIVO

Placa de gelReactivo de gel sol

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TECNICA1- determinacion de los antigenos del sistema ABORh

-preparar una suspension de hematies al 5 de DG sol Asegurar la resuspencion de lso

hematies antes de utilizar

Anadir en cada microtubulos indicados 10 ul de una suspension de hematies al 5

2- determinacion de l grupo serico-homogenizar los hematies recativos A1B

- dispersar el microtubulo N a1 50 ul de hematies reactivos A1 en un microtubulo Nb

50 ul de hematies reactivos B

-antildeadir suero o plasma

3- centrigugar en centrifuga para DG sol

Leer los resultados

RESULTADOS

NEGATIVO - Banda de hematies al fondo de la columna resto de la columna sin

aglutinados

POSITIVO

+- Escasoa glutinados de pequentildeo tamantildea d ela columna

1+ Algunos aglutinados pequentildeso en la columna

2+ aglutinados pequentildeso en la columna o mediano a lo largo de la columna

3+ Banda superior de aglutinado

4+ Banda de aglutinados en la parte superior de la columna

DP Doble poblacion (doble banda de hematies en el fondo y en la parte

superior

INTERPRETACION DE RESULTADOS

GRUPO HEMATICO GRUPO SERICOmicrotubo

Amicrotubo

Bmicrotubo

ABmicrotubo

CTL

MICROTUBUBON+ a1

MICROTUBUBON+ B

ABOGRUPO

0 0 0 0 + + 0+ 0 + 0 0 + A

0 + + 0 + 0 B

+ + + 0 0 0 AB

SISTEMA RhMicrutubo D Micrutubo

DrdquoMicrutuboCTL

INTERPRETACION

+ + 0 D positivo

0 0 0 D negativo

0 + 0

+ 0 0

D deacutebil parcial

RESULTADO E INTERPRETACION DE LA PRACTICA

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Resultado A+

CONCLUSION

Concluyo que esta teacutecnica es una forma de estabilizar las reacciones de aglutinacioacuten y

reducir los resultados falsamente negativos a consecuencia de una teacutecnica inapropiada

asi como crear un meacutetodo de interpretaciones sencillas y constantes

Practica No 5ldquoPrueba de compatibilidadrdquo

Introduccioacuten

Para requerir una oacuteptima transfusioacuten actualmente serequiere de aceptaciones inmunoloacutegicas receptor - donanteya que la transfusioacuten de sangre o la de sus componentescelulares de un donante a un receptor es una forma detransplante

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La prueba de Coombs se usa para determinar la presencia deanticuerpos no aglutinantes en el suero de sujetossensibilizados a uno o mas antiacutegenos sanguiacuteneos Es uacutetil enel estudio del suero de mujeres con isoinmunizacioacutenmaterno-fetal y se emplea tambieacuten en otro tipo de pruebas

como identificacioacuten de anticuerpos autoinmunes deteccioacutende algunos sistemas sanguiacuteneos y pruebas de compatibilidadsanguiacutenea

La prueba indirecta se realiza con eritrocitos normalesincubados in Vitro con el suero de estudio Durante esteperiodo si existe un anticuerpo este se fija sobre surespectivo determinante antigeacutenico Una vez fijados loseritrocitos son igualmente lavados y se agrega el reactivode Coombs produciendo aglutinacioacuten

Una prueba de Coombs indirecta positiva significa queexisten anticuerpos libres en el suero de la persona loscuales puedan ser igualmente auto-anticuerpos oisoanticuerpos

Material y equipo

bull Pipetas automaacuteticas de 10 microl 25 microl 50 microl y 1 ml

bull Puntas de pipetas desechables

bull Tubos de vidrio

bull Incubador para tarjetas DG Gel

bull Centrifuga para tarjetas DG Gel

Material bioloacutegico

bull Hematiacutees reactivo para investigacioacuten e identificacioacuten de anticuerpos irregulares de

Diagnostic Grifols SA

bull Suero de hemoclasificacioacuten

bull Muestras de sangre de extraccioacuten reciente recogida con anticoagulante o sin

anticoagulante

Reactivos

bull Tarjetas DG Gel

bull DG Gel Sol

Reactivos

Tarjetas DG Gel Coombs DG Gel SolRango de temperatura entre 2 y 25 ordmC Rango de temperatura entre 2 y 8ordmCLote 704901 Lote 7003701Cad 2008-03 Cad 2008-06Aspecto transparente Aspecto transparenteColor verde Color incoloro

TeacutecnicaMeacutetodo manual

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1 Dejar atemperar (18-25ordmC) muestras y reactivo2 Inspeccionar el estado de las tarjetas antes de utilizar3 Identificar las tarjetas y muestras a utilizar4 Despegar con precaucioacuten la lamina de metal que cubre los microtubos para prevenir

contaminaciones cruzadas entre ellos

5 Preparar una suspensioacuten con hematiacutees al 1 en DG Gel Sol (10 microl de sedimento oconcentrado de hematiacutees en 1 ml de DG Gel Sol) Utilizar los hematiacutees del donantepara la PC mayor y hematiacutees del receptor para la PC menor Asegurar la suspensioacuten delos hematiacutees antes de utilizar

6 Dispensar en el tubo correspondiente 50 microl de suspensioacuten de los hematiacutees al 1 deldonante (PC mayor) o 50 microl de suspensioacuten de los hematiacutees al 1 del receptor (PCmenor)

7 Antildeadir 25 microl de suero o plasma del receptor (PC mayor) o 25 microl de suero o plasma deldonante (PC menor)

8 Preparar auto control con 50 microl de suspensioacuten de los hematiacutees al 1 del receptor y 25microl de suero o plasma del receptor

9 Incubar 15 minutos a 37 ordmC10 Centrifugar en la centrifuga para tarjetas DG Gel

11 Leer los resultados

InterpretacioacutenNegativo - Banda de hematiacutees en el fondo de la columna resto de la columna sin aglutinados visibles

Positivo +- Escasos aglutinados de pequentildeo tamantildeo en la mitad inferior de la columna

1+ Algunos aglutinados de pequentildeo tamantildeo en la columna

2+ Aglutinados de tamantildeo pequentildeo o mediano a lo largo de la columna

3+ Banda superior de aglutinados de tamantildeo mediano en la mitad superior de la columna

4+ Banda de hematiacutees aglutinados en la parte superior de la columna

DP Doble poblacioacuten (doble banda de hematiacutees en el fondo y en la parte superior de la columna

Resultados

Paciente Lira Cabrera Carlos Alberto (AB+)Donador 1 Orea Valero Erasmo (A+)Donador 2 Moreno Adolfo (O+)

M1 m1 M2 m2 AutocontrolGR de donador 1 +suero del paciente

GR del paciente +suero de donador 1

GR de donador 2 +suero del paciente

GR del paciente +suero de donador 2

GR del paciente +suero del paciente

- + - + -

Por lo antes expuesto se puede deducir que el donador 1 (A+) puede donar eritrocitos al

paciente (AB+) lo mismo que el donador 2 (O+) puede donarle eritrocitos no asiacute plasma por parte de ambos donadores pues la prueba muestra que hubo reaccioacuten en ambas pruebasmenores

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Conclusioacuten

Concluyo que es esencial que toda la sangre sea estudiadaantes de la transfusioacuten para Asegurar que todos losgloacutebulos rojos transfundidos son compatibles con losanticuerpos en el plasma del paciente Evitar estimular laproduccioacuten de nuevos anticuerpos contra los gloacutebulos rojosen el receptor especialmente anti-Rh D

PRAacuteCTICA No 6PRUEBA DE COMPATIBILIDAD SANGIacuteNEA

(Teacutecnica salina)

INTRODUCCIOacuteN

Landsteiner constatoacute que cuando un aglutinoacutegeno se pone

en contacto con la aglutinina homoacuteloga se produce unaaglutinacioacuten

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La compatibilidad sanguiacutenea es la posibilidad de mezclade sangre sin que se produzcan trastornos tales como losfenoacutemenos de la lisis o de la aglutinacioacuten

A causa de este fenoacutemeno bioloacutegico en las transfusiones

de sangre no es suficiente con conocer que la sangre deldonante y la del receptor son del mismo grupo o bien quela del donante pertenezca al grupo O (cero) sino que esnecesario conocer si la compatibilidad es perfecta porqueninguacuten otro fenoacutemeno de inmunizacioacuten interfiera Es eneste sentido por lo que son empleadas las pruebascruzadas

Ademaacutes de los 6 antiacutegenos del sistema ABO en loseritrocitos humanos existen numerosos sistemas deaglutinoacutegenos que contienen muchos antiacutegenos individuales

en los eritrocitos (maacutes de 500000 millones posibles defenotipos de grupos sanguiacuteneos conocidos) Para evitaraccidentes transfusionales es indispensable tener encuenta el sistema Rh ademaacutes del ABO

Del sistema de antiacutegenos Rh es el D el maacutes antigeacutenico yel teacutermino Rh positivo indica que el individuo presentaaglutinoacutegeno D El individuo Rh negativo no tiene antiacutegenoD y forma la aglutinina anti-D en contacto con eacuteste

Las reacciones antiacutegeno-anticuerpo pueden observarse in

vitro por

mdash Hemoacutelisis la unioacuten antiacutegeno-anticuerpo se traduce enlisis de los eritrocitos en presenciadel complemento (siempre que el anticoagulante empleado nocapture losiones Ca y Mg necesarios para la activacioacuten delcomplemento) mdash Aglutinacioacuten los anticuerpos que reaccionan en mediosalino se conocen comoanticuerpos completos o aglutinantes (comuacutenmente tipo

IgM)

OBJETIVO Determinacioacuten de los antigenos del sistema ABORh (D) y su compatibilidad entre un paciente Donador y unPaciente Receptor

MATERIAL5 Tubos de ensaye6 Pipetas Pasteur

1Gradilla1 Bulbo

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EQUIPOMicrocentriacutefugaBantildeo Mariacutea oacute Estufa

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Papel Parafilm

MUESTRA Muestra de sangre con Anticoagulante EDTA

REACTIVOSAntisuero RO-Antiglobulina humana (Poliespeciacutefico Anti IgG C-d) Para prueba de CoombsLABORATORIOS LAFON SA de C VFecha de Caducidad 31-Ene-09Lote 406Hecho en MeacutexicoAspecto TransparenteColor Verde

TEacuteCNICA

Lavar los eritrocitos con solucioacuten salina (3 veces)

SALINA RAacutePIDA1 Agregar una gota de Eritrocitos Lavados2 Diluirlo al 3-5 con solucioacuten salina 093 Agregar 2 gotas de suero4 Centrifugar y observar anotar desprendimiento del botoacuten

SALINA 37deg BANtildeO MARIacuteA

1 Incubar tubos a Bantildeo mariacutea a 37degC durante 1hora (o 20 min)2 Centirfugar despueacutes de haber pasado el

tiempo3 Desprender el botoacuten de eritrocitos y

observarAGLUTINACIOacuteNndash No es compatibleNO AGLUTINACIOacuteN - Lavar 3 veces

SALINA COOMBS

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PRUEBA MAYOR

G Rojos del DONADOR+

Suero del RECEPTOR(paciente)

PRUEBA MENOR

G Rojos del RECEPTOR(paciente)

+Suero del DONADOR

AUTOTESTIGO

G Rojos del RECEPTOR(paciente)

+Suero del RECEPTOR

(paciente)

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1 Con solucioacuten salina 09 lavar loseritrocitos de los tubos q no tuvieronaglutinacioacuten 3 veces

2 Decantar y agregar 2 gotas de reactivode Coombs

AGLUTINACIOacuteN ndash No es compatibleNO AGLUTINACIOacuteN - Lavar 3 veces

RESULTADOS

Paciente Madrigal Meacutendez Luis Eduardo (B+)Folio 009164Fecha301007

Donador 1 Torres Avileacutes Joseacute Ramoacuten (O+)Folio 022604Fecha311007

Donador 2 Rodriacuteguez Nuacutentildeez Joseacute Angel (A+) Folio 022605

Fecha311007

SALINA RAacutePIDA

M1 m1 M2 m2 AutotestigoGR de donador 1+ suero del

paciente

GR del paciente+ suero dedonador 1

GR de donador 2+ suero del

paciente

GR del paciente+ suero dedonador 2

GR del paciente+ suero del

paciente

- 4+ 4+ 4+ -

SALINA 37deg BANtildeO MARIacuteA

M1 m1 M2 m2 Autotestigo- 4+ 4+ 4+ -

Compatible Nocompatible

Nocompatible

Nocompatible

Compatible

SALINA COOMBS

Por lo tanto se puede decir que el donador 1 (O+) puededonar suero al paciente (B+) debido a que en el suero nohay anticuerpos de ninguacuten tipo que reaccionen con losantiacutegenos de los eritrocios del Donador 1 Mientras tantoel Donador 2 no puede donar al Paciente ni suero nieritrocitos

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M1 Autotestigo- -

Compatible

Compatible

21

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INTERPRETACIOacuteN

PRUEBA POSITIVA Existe una aglutinacioacuten de lasceacutelulas sanguiacuteneas que indica la presencia delantiacutegeno A o B En el suero de Coombs notamos si esta

la precencia de Antiacutegeno D en los eritrocitos Lahemoacutelisis no se debe interpretar como resultadopositivo ya que puede indicar contaminacioacuten delreactivo

PRUEBA NEGATIVA La no aglutinacioacuten indica unresultado negativo e indica que las ceacutelulas sonnegativas para Antiacutegenos del sisitema ABO y D

CONCLUSIOacuteN

He concluido que en las transfusiones de sangre no essuficiente con conocer que la sangre del donante y la delreceptor son del mismo grupo o bien que la del donantepertenezca al grupo O (cero) sino que es necesarioconocer si la compatibilidad es perfecta porque ninguacutenotro fenoacutemeno de inmunizacioacuten interfiera Es en estesentido por lo que son empleadas las pruebas cruzadas

Praacutectica No 7ldquoPrueba de compatibilidad sanguiacutenea (teacutecnica albumina)rdquo

IntroduccioacutenLa tipificacioacuten de sangre identifica el tipo sanguiacuteneo determinandoantiacutegenos presentes en los eritrocitos detecta aloanticuerpos encontra esos antiacutegenos Asiacute los aloanticuerpos pueden aparecernaturalmente o ser inducidos y pueden ser dirigidos contra del grupoconocido o a los antiacutegenos de superficie de los eritrocitos La prueba

de compatibilidad sanguiacutenea o cross matching esta formada por laprueba mayor y menorLa prueba de cruzamiento mayor para losaloanticuerpos consiste en probar el plasma del receptor contra los

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gloacutebulos rojos del donante Es incompatible cuando se genera unareaccioacuten hemoliacutetica los eritrocitos del donante se destruyen por losaloanticuerpos del plasma del receptor La prueba menor es una pruebapara los aloanticuerpos del plasma del donante en contra los gloacutebulosrojos del receptor Una incompatibilidad menor es una causa menosfrecuente para causar una reaccioacuten en contra una transfusioacuten porque

el volumen de plasma del donante es menor y es diluido marcadamente enel receptor Para llevar a cabo dicho procedimiento se utilizandiversos reactivos como potencializadores que mejoran la unioacuten deeritrocitos con alguacuten tipo de anticuerpo Uno de esospotencializadores es la albuacutemina La albumina bovina polimerizada esun reactivo muy utilizado en el laboratorio de inmunohematologia y encentros de bancos de sangre funciona como un potencializador quefacilita la reaccion de aglutinacioacuten de eritrocitos sensibilizados Alfinal de la prueba se prueban los eritrocitos con el reactivo deCoombs El principio de la prueba de Coombs fue descrito por Moreschien 1908 pero Coombs Mourant y Race en 1946 la introdujeron en elestudio de los grupos sanguiacuteneos y anticuerpos cuando una parte desangre (suero) fue usada para la inoculacioacuten de animales para

inmunizarlos con proteiacutena humana utilizando el anticuerpo obtenido enla deteccioacuten de los llamados anticuerpos incompletos Esta prueba seusa para determinar la presencia de anticuerpos no aglutinantes en elsuero de sujetos sensibilizados a uno o mas antiacutegenos sanguiacuteneos Esuacutetil en el estudio del suero de mujeres con isoinmunizacioacuten materno-fetal y se emplea tambieacuten en otro tipo de pruebas como identificacioacutende anticuerpos autoinmunes deteccioacuten de algunos sistemas sanguiacuteneos ypruebas de compatibilidad sanguiacutenea La prueba indirecta se realizacon eritrocitos normales incubados in Vitro con el suero de estudioDurante este periodo si existe un anticuerpo este se fija sobre surespectivo determinante antigeacutenico Una vez fijados los eritrocitosson igualmente lavados y se agrega el reactivo de Coombs produciendoaglutinacioacuten Una prueba de Coombs indirecta positiva significa que

existen anticuerpos libres en el suero de la persona los cualespuedan ser igualmente auto-anticuerpos o isoanticuerpos

Objetivo Determinacioacuten de los antiacutegenos del sistema ABO Rh (D) y sucompatibilidad entre un paciente Donador y un Paciente Receptor

Material y equipo

5 Tubos de ensaye

6 Pipetas Pasteur

1Gradilla

1 Bulbo

Papel Parafilm

Microcentriacutefuga

Bantildeo Mariacutea oacute Estufa

Material bioloacutegico

Muestras de sangre de extraccioacuten reciente recogida conanticoagulante o sin anticoagulante

ReactivosSuero de CoombsAlbuacutemina bovina deg

Suero anti-globulina humana Lafon Lote 406 Cad 310109 Color verde Aspecto

transparentedegAlbumina de bovino polimerizada Interbiol Lote APO107 Cad 150109 Color incoloroAspecto transparente

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Teacutecnica

1 Montar prueba mayor 1 y 2 prueba menor 1 y 2 y autotestigocon el procedimiento ya anteriormente conocido

2 Agregar 2 gotas de albuacutemina al 223 Centrifugar 20 segundos4 observar aglutinacioacuten o hemolisis o no aglutinacioacuten5 A los tubos con lecturas negativas incubar 20 minutos en bantildeo

Mariacutea a 37 degC6 Centrifugar y observar

bull Aglutinacioacuten o hemoacutelisis reportar incompatible

bull No aglutinacioacuten llevar a Coombs

7 Lavar tres veces decantar y quitar el exceso de salina congasa y agregar 2 gotas de reactivo de Coombs y centrifugar 20segundos y observar

bull Aglutinacioacuten o hemoacutelisis reportar incompatible

bull No aglutinacioacuten reportar compatible

Resultados1 PRUEBA MAYOR 1 2 Gotas de suero del paciente + 1 gota de GR al 3-5 del

donador 12 PRUEBA MENOR 1 2 Gotas de suero del donador 1 + 1 gota de GR al 3-5 del

paciente3 PRUEBA MAYOR 2 2 Gotas de suero del paciente + 1 gota de GR al 3-5 del

donador 24 PRUEBA MENOR 2 2 Gotas de suero del donador 2 + 1 gota de GR al 3-5 del

paciente5 AUTOTESTIGO 2 Gotas de suero del paciente + 1 gota de GR al 3-5 del paciente

M1 m1 M2 m2 AutotestigoCon albuacutemina - - - - -Despueacutes de incubacioacuten a 37 degC - - - - -Despueacutes de Coombs - - - - -Despueacutes de validacioacuten con gloacutebulos

positivos+ + + + +

InterpretacioacutenPrueba positiva Alutinacioacuten o hemolisis Indica no compatibilidadPrueba negativaNo aglutinacioacuten Indica compatibilidad

Esquemas

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ConclusioacutenConcluyo que la prueba de compatibilidad sanguiacutenea en su modalidad conalbuacutemina bovina ofrece mucha ventaja al ser al igual que otrosreactivos un potencializador de la reaccioacuten antiacutegeno-anticuerpo Estopermite que el operador o realizador de la prueba tenga mayorconfianza y certeza en los resultados que obtenga

PRACTICA No 8PRUEBA DE COMPATIBILIDAD SANGUINEA PRUEBA DE LISS

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FUNDAMENTO

LISS es utilizado para reducir la fuerza ioacutenica del medio

de reaccioacuten en los procedimientos de deteccioacuten eidentificacioacuten de anticuerpos y en las pruebas decompatibilidad La presencia de este reactivo refuerza lainteraccioacuten antiacutegeno - anticuerpo durante la incubacioacuten

GENERALIDADESEl uso de solucioacuten salina de baja fuerza ioacutenica fuedescrito inicialmente en 1964 por Hughes-Jones y col y

Elliot y col pero en ese tiempo su uso era limitado yaque la concentracioacuten molar obtenida provocaba la hemoacutelisisde los eritrocitos suspendidos

En 1974 Low y Messeter describieron el uso rutinario de lasolucioacuten Liss de 003 M que lograba reducir el tiempo deincubacioacuten y no presentaba tendencia a la hemoacutelisis al sersuspendidos en salina a baja fuerza ioacutenica restableciendola presioacuten osmoacutetica de la solucioacuten mediante la adicioacuten deglicinaLas soluciones de baja fuerza ioacutenica son actualmente lasmaacutes utilizadas en inmunohematologiacutea provocando un aumentoen la velocidad de asociacioacuten entre antiacutegenos y anticuerpospermitiendo asiacute acortar el tiempo de incubacioacuten de 60minutos a 10-15 minutos sin sacrificar la sensibilidad delas mismas y sin costos elevadosSe ha observado que lasreacciones antiacutegeno-anticuerpo se ven potenciadas alreducir la fuerza ioacutenica del medio de reaccioacuten

La fuerza ioacutenica es uno de los factores maacutes importantes quedeterminan la tasa y la cantidad de captacioacuten deanticuerpos por parte de los eritrocitos El uso de mediosde reaccioacuten de baja fuerza ioacutenica permite disminuir eltiempo de incubacioacuten y potenciar las reacciones de losanticuerpos sin incrementar las reacciones inespeciacuteficas

Los iones Na+ y Cl- presentes en la solucioacuten salinafisioloacutegica se agrupan alrededor de las moleacuteculas deantiacutegeno y anticuerpo neutralizando sus cargas opuestas locual dificulta la unioacuten entre ellos Este efecto se reduceutilizando soluciones de baja fuerza ioacutenica y disminuyendode esta manera la incubacioacuten de las pruebas

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En esta etapa de sensibilizacioacuten las posibilidades deasociacioacuten pueden incrementarse mediante agitacioacutencentrifugacioacuten yo variacioacuten de la concentracioacuten delanticuerpo

Despueacutes de que el anticuerpo se ha fijado al antiacutegeno loseritrocitos sensibilizados deben unirse para dar lugar a laaglutinacioacuten visible esta red tambieacuten solidifica yestabiliza la reaccioacuten

En esta etapa la reaccioacuten depende de factores como lascaracteriacutesticas del anticuerpo localizacioacuten en la membranay nuacutemero de sitios antigeacutenicos fuerzas que mantienen ladistancia entre los eritrocitos

Las caracteriacutesticas del anticuerpo que deben considerarse

son el tamantildeo del anticuerpo involucrado y el nuacutemero desitios de combinacioacuten con el antiacutegeno Los anticuerpos IgMpueden establecer puentes entre los eritrocitos yaglutinarlos espontaacuteneamente en solucioacuten salina mientrasque los IgG no ya que las IgM pentameacutericas poseen 10sitios de combinacioacuten con el antiacutegeno y las IgG diacutemerossoacutelo dos sitios

Los eritrocitos tienen una carga neta negativa en susuperficie su interaccioacuten con los iones del medio alteraesta carga y producen una carga neta criacutetica denominada

potencial zeta y la reduccioacuten de dicha carga permite quelos eritrocitos se aproximen lo suficiente para que seanaglutinados por medio de los IgG que los sensibilizaron

Las soluciones de baja fuerza ionica empleadas en banco desangre tienen un pH entre 65 ndash 70 se recomienda unaosmolalidad de 270 ndash 305 mosmkg y una conductividad de 37mmcm El control diario implica el examen de su aparienciafiacutesica ausencia de turbidez particulas o sedimento asiacutecomo corroborar la capacidad para generar hemoacutelisiscrenacion o prueba de coombs positiva en eritrocitos

normales Cada lote nuevo se valora mediante el rastreo deun anticuerpo ya sea un anti- D un anti- jk anti- fy oanti- kell diluido se compara su capacidad de deteccioacutencontra un medio salino normal incubando 10min a 37ordmC enLISS debe poder rastrearse un anticuerpo en tanto que enmedio salino no

MATERIAL Y EQUIPO

Material Cantidad10 Tubos de ensayo de 12 x 75

1 Gradilla10 Pipetas pasteur

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1 Bulbo1 Marcador1 Microcentriacutefuga1 Bantildeo Mariacutea

MATERIAL BIOLOGICO

Gloacutebulos rojos lavados al 3 - 5Suero

REACTIVOS

Reactivo de LISSReactivo de Coombs

TECNICA1- Lavar los eritrocitos

Separar el suero del paquete de gloacutebulos rojos

Agregar cierta cantidad de eritrocitos a un tubo deensayo y agregarle solucioacuten salina

Centrifugar y decantar

Repetir este proceso 3 veces

2- Realizar la Prueba de LISS

Enumerar los tubos Poner dos gotas de LISS en cada tubo agregar una gota

de eritrocitos lavados y al 3 - 5 seguacuten el nuacutemero detubo correspondiente

Mezclar y centrifugar un minuto decantar elsobrenadante y con la ayuda de una gasa limpiar elexceso del reactivo

Poner nuevamente 2 gota de LISS resuspender poragitacioacuten agregar 2 gotas de suero problema mezclarincubar 15 minutos a 37ordm C centrifugar 30 seg A 1000

RPM Anotar los resultados

3- A las pruebas negativas realizar Coombs

Lavar 3 veces las ceacutelulas agregar suero de Coombscentrifugar 30 seg

Leer aglutinaciones y anotar resultados

REACTIVOS UTILIZADOS

REACTIVO MARCA FECHA DECADUCIDAD

ASPECTO COLOR LOTE

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SueroAntiglobuina

humana

Lafon 31 01 2009 Transparente Verde 406

LISS Caserorealizado enCMNSIGLOXXI

1 antildeo Transparente Transparente

----------

PACIENTE ASCANIO MENDEZ JOSUE O (+)DONADOR 1 GARCIA CARBAJAL OSCAR O (+)DONADOR 2 GARCIA SUAREZ ORLANDO A (+)

RESULTADOS

INTERPRETACIOacuteN DE LOS RESULTADOS

La hemoacutelisis o la aglutinacioacuten representan un resultado positivo e indican lapresencia de una reaccioacuten antiacutegeno-anticuerpo Los resultados negativos no severa aglutinacioacuten o hemolisis

ESQUEMAS

CONCLUSIONES

Concluyo que la prueba de compatibilidad sanguiacutenea en su modalidad conliss ofrece mucha ventaja al ser al igual que otros reactivos unpotencializador de la reaccioacuten antiacutegeno-anticuerpo Esto permite queel operador o realizador de la prueba tenga mayor confianza y certezaen los resultados que obtenga

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Tubo Resultado

M1 NEGATIVOm1 NEGATIVO

M2 POSITIVO

M2 NEGATIVO

AUTOTES NEGATIVO

29

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PRACTICA 9INMUNOHEMATOLOGIA

DETERMINACION DE COOMBS DIRECTO

INTRODUCCIONPRUEBA DE COOMBS DIRECTA

El examen de Coombs directo se utiliza para detectar autoanticuerpos contralos propios gloacutebulos rojos (GR) de un individuo Es una prueba que sirve parademostrar el revestimiento de los eritrocitos in vivo (mientras los eritrocitosestaacuten circulando en el individuo) La prueba se realiza agregando directamenteel reactivo de Coombs a los eritrocitos previamente lavados para eliminar otras proteiacutenas no fijadas a el una prueba directa positiva significa que larelacioacuten antiacutegeno-anticuerpo ocurrioacute in vivo es decir que la fijacioacuten del

anticuerpo sobre el antiacutegeno se realizo en el organismo del individuo enestudio

Las indicaciones principales de esta prueba son diagnostico de enfermedadeshemoliacuteticas ictericia o anomaliacuteas en la apariencia de los gloacutebulos rojos bajo elmicroscopio ya que estos anticuerpos algunas veces destruyen los gloacutebulosrojos y causan anemia para investigar reacciones en transfusiones Parainvestigar la induccioacuten de drogas en ceacutelulas rojas sensibilizadas medicamentos(por ejemplo quinidina metildopa procainamida y otros) que pueden llevar a la produccioacuten de estos anticuerpos

OBJETIVO Determinar la presencia de anticuerpos en la superficie de losgloacutebulos rojos del individuo

MATERIAL

bull 10 Tubos de 1275

bull 10 Pipetas Pasteur

bull 1 Gradilla

bull 1 Bulbo

bull Papel Parafilm

bull Microcentriacutefuga

bull Bantildeo Mariacutea a 37degC

MUESTRA BIOLOGICA

Eritrocitos lavados de (3-5) del donador o pacienteREACTIVO

Suero de CoombsSuero anti-globulina humana Lafon Lote 406 Cad 310109 Color verde Aspecto transparente

TECNICA

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Colocar en un tubo de ensaye dos gotas de suero de Coombs mas una gota deglobulos rojos (3-5)Centrifugar a 1000 rpm durante 20 segDesprender el boton suavemente y buscar la presencia de aglutinacionRotular y enumerar 8 tubos de ensayes con las diferentes diluciones

(frac12frac1418)Enumerar 8 tubos mas del 1 al 8Agregar a cada tubo de las diluciones 10 gotas de solucion salina mas 10 gotasde suero de CoombsColocar Al primer tubo de la dilucion 1 gota de globulos rojos (3-5) mezclar completamente y agregar al tubo 1Centrifugar todos los tubos a 1000 rpm durante 20 seg

LECTURA

Aglutina- Prueba de Coombs directa es positiva

No aglutina- Prueba de Coombs directa es negativa

ESQUEMAS y RESULTADOS

CONCLUCION

He concluido que la prueba de Coombs directa es una prueba que se utiliza para medir

la presencia de anticuerpos en la superficie de los gloacutebulos rojos que se encuentran

circulando en el paciente y se realiza para investigar reacciones en transfusiones ademaacutes

sirve para la determinacioacuten de anemia hemoliacutetica autoinmune entre otras afecciones

Practica 10

IDENTIFICACION DE ANTICUERPOS IRREGULARES

Fundamento

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DILUCIONES

frac12 positiva

frac14 positiva

18 positiva

116 negativa

132 negativa

164 negativa

1128 negativa1256 negativa

31

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Los anticuerpos del sistema ABO aparecen una vez que elindividuo entra en contacto con el medio ambiente y en elcual se encuentran microorganismos como algunas bacteriascoliformes que contienen sustancias quiacutemicas en suestructura parecidas a las de este sistema Por anticuerpos

regulares debemos identificar a los que existen en todoslos individuos y que eacutestos tendraacuten durante toda su vida

Los anticuerpos irregulares son los que no estaacuten de esamanera aunque en el caso de los naturales no se conoce aciencia cierta queacute o coacutemo se induce su produccioacuten Losadquiridos se conocen tambieacuten como inmunes y son elresultado de la exposicioacuten a antiacutegenos desconocidos por elindividuo al momento de la transfusioacuten o en las mujerespor el embarazo estos anticuerpos son dirigidos contraantiacutegenos de sistemas diferentes al ABO

Los anticuerpos naturales regulares son preferentementeinmunoglobulinas M las cuales fijan de manera taneficiente el complemento que pueden provocar lisisintravascular y ocasionar insuficiencia renal o incluso lamuerte del paciente Los anticuerpos adquiridos o inmunesson generalmente inmunoglobulinas G las cuales producenhemoacutelisis extravascular en el bazo o en el hiacutegado mediantefagocitosis del complejo eritrocito maacutes anticuerpo

Los aloanticuerpos irregulares (adquiridos) maacutes comunes en

nuestra poblacioacuten son los que involucran a los sistemasMNSs P1 Kidd (Jka Jkb) Duffy (Fya Fyb) Kell Lewis yDiego

OBJETIVO identificacioacuten del anticuerpo irregular a traveacutesde las diferentes teacutecnicas

MATERIAL

bull 10 Tubos de ensaye

bull 10 Pipetas Pasteur

bull

1Gradillabull 1 Bulbo

bull Papel Parafim

MATERIAL BIOLOGICO

bull Gloacutebulos rojos lavados al 3 - 5

bull Suero

bull REACTIVOSReactivos

1 Suero de Coombs2 Albuacutemina bovina

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bull EQUIPO1 Microcentriacutefuga2 Bantildeo Mariacutea oacute Estufa

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3 SOLUCION SALINA4 SOLUCION DE LISS

TEacuteCNICA SOLUCION SALINA

Lavar los eritrocitos con solucioacuten salina (3veces)SALINA RAacutePIDA

Agregar una gota de Eritrocitos LavadosDiluiacuterlo al 3-5 con solucioacuten salina 09Agregar 2 gotas de sueroCentrifugar y observar anotar desprendimientodel botoacuten

SALINA 37deg BANtildeO MARIacuteA1) Incubar tubos a Bantildeo mariacutea a 37degC durante 1

hora (o 20 min)

2) Centirfugar despueacutes de haber pasado eltiempo

3) Desprender el botoacuten de eritrocitos yobservar

AGLUTINACIOacuteNndash No es compatibleNO AGLUTINACIOacuteN - Lavar 3 veces

SALINA COOMBS1) Con solucioacuten salina 09 lavar los

eritrocitos de los tubos q no tuvieronaglutinacioacuten 3 veces

2) Decantar y agregar 2 gotas de reactivode Coombs

AGLUTINACIOacuteN ndash No es compatibleNO AGLUTINACIOacuteN - Lavar 3 veces

TECNICA LISS

1 Poner dos gotas de LISS en cada tubo agregar una gotade eritrocitos lavados y al 3 - 5 seguacuten el nuacutemero detubo correspondiente

2 Mezclar y centrifugar un minuto decantar el

sobrenadante y con la ayuda de una gasa limpiar elexceso del reactivo

3 Poner nuevamente 2 gota de LISS resuspender poragitacioacuten agregar 2 gotas de suero problema mezclarincubar 15 minutos a 37ordm C centrifugar 30 seg A 1000RPM

4 Anotar los resultados

A las pruebas negativas realizar Coombs

1 Lavar 3 veces las ceacutelulas agregar suero de Coombs

centrifugar 30 seg2 Leer aglutinaciones y anotar resultados

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TECNICA ALBUMINA BOVINA 8 Agregar 2 gotas de albuacutemina al 229 Centrifugar 20 segundos10observar aglutinacioacuten o hemolisis o no aglutinacioacuten

11A los tubos con lecturas negativas incubar 20minutos en bantildeo Mariacutea a 37 degC12Centrifugar y observar

bull Aglutinacioacuten o hemoacutelisis reportar incompatible

bull No aglutinacioacuten llevar a Coombs

13Lavar tres veces decantar y quitar el exceso desalina con gasa y agregar 2 gotas de reactivo deCoombs y centrifugar 20 segundos y observar

bull Aglutinacioacuten o hemoacutelisis reportar incompatible

bull No aglutinacioacuten reportar compatible

Resultados ANTICUERPO IRREGULAR Anticuerpo c

InterpretacioacutenEstos anticuerpos son generalmente inmunoglobulinas tipo My ocasionalmente tipo G y debido a esa temperatura dereaccioacuten carecen de importancia cliacutenica salvo que sureaccioacuten ocurra tambieacuten a 37 degC su importancia radica enpacientes que seraacuten intervenido a 22 ordmc como es el caso de

operacioacuten de corazoacuten

Los llamados anticuerpos calientes tienen una temperatura oacuteptima dereaccioacuten a 37 degC a Estos anticuerpos tienen una relevanteimportancia cliacutenica ya que se les asocia con reaccionestransfusionales de intensidad moderada a severa que puedenocasionar la muerte

Esquemas

CONCLUSIONHe concluido que es importante determinar los anticuerposirregulares ya que estos anticuerpos tienen una relevanteimportancia cliacutenica ya que se les asocia con reaccionestransfusionales de intensidad moderada a severa

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Uso Inmucor anti-A1 Lectin se utiliza para diferenciar ceacutelulas rojas A1 de otros

subgrupos A en pruebas en tubo o en placa

MATERIAL Y EQUIPObull Tubos de ensaye de 1075 mm

bull Cronometro

bull Marcador

bull Centrifuga seroloacutegica

MUESTRA BIOLOGICAbull Ceacutelulas rojas de donador o paciente

REACTIVObull Inmucor anti-A1 Lectin en gotero

MARCA INMUCOR INC

LOTE SN2132

CADUCIDAD 2007-12-14

TECNICA

1 Adicione una gota de anti-A1 a tubos adecuadamente marcados

2 Adicione una gota de una suspensioacuten de eritrocitos bajo prueba del 3-5 en

salina Mezcle completamente el contenido del tubo

3 Centrifugar de 15-30 minutos de 900-1000 rpm

4 Agite suavemente el tubo y resuspenda el botoacuten celular Examine las reacciones

resultantes macroscoacutepicamente Registre resultados

RESULTADOS ESPERADOS DE TIPIFICACION

GRUPOSANGUINEO

Anti-A Anti-A1 Porciento

A1 + + 80 DE TODOSLOS GRUPOS A

A1b + + 80 DE TODOSLOS GRUPOS AB

A2 + 0 20 DE TODOSLOS GRUPOS A

A2B + 0 20 DE TODOSLOS GRUPOS AB

A1NT + +DEBIL NO COMUNA3AM1AX1 + DEBIL 0 NO CUMUN

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ANTI-H (LECTINA)

Ulex europeaus

Para la determinacioacuten de del estado secretor y tipificacioacuten de las ceacutelulas rojas

INTRODUCCIONLa mayoriacutea de los grupos sanguiacuteneos ABO que se determinanen el banco de sangre cumplen con las leyes establecidas deantiacutegenos y anticuerpos reciacuteprocos para ese sistema

Los anticuerpos del sistema ABO existen en el individuodesde el momento en que son capaces de tener una respuestainmunoloacutegica y se producen contra los antiacutegenos A y B

Los subgrupos son fenotipos ABO que difieren en la cantidad

de antiacutegeno presente en los eritrocitos y en la saliva delos secretores Se hallan con mayor frecuencia y tienen maacutesrelevancia cliacutenica los de A que los de B Al utilizarlectinas se definen los subgrupos A1 y A2 con el extractode Dolichos biflorus se aglutinan los eritrocitos A1 perono los de A2 y el anti H semilla Ulex europeus aglutinaeritrocitos que tienen antiacutegeno H

MATERIAL Y EQUIPObull Tubos de ensaye de 1075mm

bull Cronometro

bull Marcador

bull Centrifuga seroloacutegica

MUESTRA BIOLOGICAbull Ceacutelulas rojas de donador o paciente

REACTIVObull Inmucor anti-H (Lectina) en gotero

MARCA GANMA

LOTE ML1581

CADUCIDAD 2007-11-14

TECNICA

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1 Adicione una gota de una suspensioacuten de eritrocitos bajo prueba del 3-5 en

salina en tubos adecuadamente marcados

2 Adicione dos gotas de anti-H Lectina y mezcle completamente el contenido del

tubo

3 incube durante 5 minutos a temperatura ambiente

4 Centrifugar de 15-30 minutos a 1000 rpm5 Agite suavemente el tubo y resuspenda el botoacuten celular Examine las reacciones

resultantes macroscoacutepicamente Registre resultados

INTERPRETACIOacuteN

PROBLEMA ANTI A1 ANTI H

(ANTI A2)

RESULTADO

SUBGRUPO

PACIENTE 1 + - ANTI A1

PACIENTE 2 - + ANTI A2

bull Prueba positiva Aglutinacioacuten de las ceacutelulas rojas

Nota La hemoacutelisis no debe interpretarse como un resultado positivo ya que esto

puede indetificarse como contaminacioacuten del reactivo

bull Prueba negativa Ausencia de aglutinacioacuten de las ceacutelulas rojas

CONCLUSIONES

Concluyo que para realizar unatransfusioacuten sanguiacutenea se debe tomar encuenta los subgrupos del donante y del

receptor Los subgrupo con mayorfrecuencia y tienen maacutes relevanciacliacutenica los de A que los de B Y seidentifican por medio de utilizarlectinas Los subgrupos A maacutesimportantes son A1 y A2

PRACTICA 3DETERMINACION DE Rh

INTRODUCCIOacuteN

El factor Rh es una clase de proteiacutena que se encuentra enlos gloacutebulos rojos de la sangre cuando alguien tiene esaproteiacutena se le considera ldquoRh Positivordquo Cuando no la tienees ldquoRh Negativordquo El factor Rh es hereditario y setransmite en dos genes El Factor Rh positivo es dominantees decir si una persona tiene un gen positivo y otronegativo su factor Rh seraacute positivo

Esta prueba es importante en el diagnostico y estudio

de la eritroblastosis fetal en la que los gloacutebulosrojos del nintildeo se encuentran sensibilizados con

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anticuerpo materno Es uacutetil tambieacuten en el diagnosticode la anemia hemoliacutetica adquirida (anticuerpos sobrelos gloacutebulo rojos del mismo paciente) asiacute como ladeterminacioacuten de eritrocitos sensibilizados en sangreusados para transfusioacuten

Las dos clasificaciones maacutes importantes para describirgrupos sanguiacuteneos en humanos son los antiacutegenos y el factorRh Las transfusiones de sangre entre grupos incompatiblespueden provocar una reaccioacuten inmunoloacutegica que puededesembocar en hemoacutelisis anemia fallo renal shock omuerte

MATERIAL

bull Tubos de ensayo de 12 x 75

bull Pipetas Pasteur

bull Gradilla

EQUIPO

bull Centrifuga

MUESTRA BIOLOacuteGICA

bull Eritrocitos lavados 3-5 del paciente

REACTIVOS

bull Antisuero Anti-D

bull Suero anti globulina humanabull Suero reactivo control

Antisuero D monoclonal NOVACLONELote NDMG04305CAD 29MAR08Aspecto transparenteColor incoloroSuero anti globulina HumanaLote 405CAD 06-NOV-08Aspecto transparenteColor verde

Reactivo control GAMMA-CLONELote GCM115-3CAD 2008-12-08Aspecto transparenteColor incoloro

TEacuteCNICA

Determinacioacuten de Rh

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bull Prepare una suspensioacuten de gloacutebulos rojos al 3-5 en solucioacuten salina Los gloacutebulos deben serlavados previamente 5 veces con el objeto deeliminar las proteiacutenas del plasma

bull Rotular 3 tubos para la previa identificacioacuten

de Rhbull Ponga 1 gota de la suspensioacuten lavada en cada

tubo

bull Antildeada una gota de anti suero D monoclonal

bull Mezcle y centrifugue 15 seg Y observe si hayaglutinacioacuten

Preparacioacuten del control negativo

bull Ponga una gota de eritrocitos lavados al 3-5

bull Antildeada una gota de reactivo control

bull

Centrifugue 15 seg y observe si hay aglutinacioacuten

Deteccioacuten de sangre Du

Nota esta teacutecnica se le realizo a los tubos problemasque no aglutinaron

bull Los tubos que no tuvieron aglutinacioacuten en ladeterminacioacuten de Rh se incuban 15 min yposteriormente se lavan 3 veces con sol Salina

bull Previamente lavados se le agregan 2 gotas de suerode COOMBS

bull Centrifugar 15 seg y observar desprender boton

ESQUEMAS

RESULTADOS problemas Aglutinacioacuten resultado2 positiva Rh +10 negativa Rh -11 negativa Rh -

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Paciente 2 coacutedigo 021612 plata Lugo JavierPaciente 10 coacutedigo 021620 Hernaacutendez Loacutepez GuillermoPaciente 11 coacutedigo 021621 camarillo Sonia rebeca

INTERPRETACIOacuteNPara el primer meacutetodoAglutinacion Rh positivoNo aglutinacioacuten realizar prueba de deteccioacuten desangre Du

Deteccioacuten de sangre DuAglutinacioacuten D deacutebil (Du positivo)No aglutinacioacuten Rh negativo

CONCLUSIONESCon el descubrimiento del sistema Rh se denominan Rhpositivos los hematiacutees que son aglutinados por esteanticuerpo y tienen por tanto el antiacutegeno Rh en lasuperficie Se denominan Rh negativos los que no sonaglutinados y que por tanto no poseen el antiacutegeno Rh ensu superficie

De la misma manera que en el sistema ABO en el sistema Rh

no se puede transfundir el antiacutegeno Rh a las personas queno lo tienen ya que podriacutea originar la produccioacuten deanticuerpos Rh en el receptor Los sujetos Rh negativossoacutelo podraacuten recibir sangre de donantes Rh negativos

PRACTICA 4INMUNOHEMATOLOGIA

DETERMINACION DE GRUPO SANGUINEO POR TECNICA DE GEL

INTRODUCCION

El sistema utilizado en inmunohematologiacutea para investigar e identificar antiacutegenos y

anticuerpos antieritrocitarios Es de tecnologiacutea de microtipificacioacuten en gel se basa en la

separacioacuten por tamantildeo de los eritrocitos aglutinados durante un proceso de

centrifugacioacuten en un gel poroso

Los eritrocitos van perdiendo elasticidad en sus membranas de forma que los

aglutinados grandes quedan atrapados en la zona superior y los pequentildeos quedan

distribuidos a lo largo de la columna

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Esta teacutecnica nos permite que estandaricemos la lectura de la reaccioacuten antiacutegeno-

anticuerpo con facilidad y repetitividad Asiacute como la estandariza del uso de reactivos

tiempos y lecturas disminuyendo sustancialmente la influencia de la mano de operador

OBJETIVO determinacioacuten de los antigenos del sistema ABORh (D) y determinacion

del grupo serico en tecnica de gel

FUNDAMENTOS

El principio del metdo se basa en la tecnica de gel descrita por Y Lapierre para la

deteccion de las reacciones de aglutinacion de los hematies La aglutinacion se produce

al entar en contacto los eritrocitos con los anticuerpos correspondientes

La tarjeta DG gel es un soporte de plastico constituidos por 8 microtubulos Cada

microtubulo esta formado por una columna y una camara de dispersionincubacion

La tecnologiacutea de microtipificacioacuten en gel se basa en la separacioacuten por tamantildeo de los

eritrocitos aglutinados durante un proceso de centrifugacioacuten en un gel poroso

Los eritrocitos van perdiendo elasticidad en sus membranas de forma que los

aglutinados grandes quedan atrapados en la zona superior y los pequentildeos quedan

distribuidos a lo largo de la columna

MATERIAL

Pipeta automaacutetica 10 ul 50ul 1 ml

Puntas de pipeta desechable Tubos de vidrios

DEG sol

Centrifugas para tarjetas DG gel

Hematies de reactivos para grupo inverso

MUESTRA BIOLOGICACeacutelulas rojas de donador o paciente

REACTIVO

Placa de gelReactivo de gel sol

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TECNICA1- determinacion de los antigenos del sistema ABORh

-preparar una suspension de hematies al 5 de DG sol Asegurar la resuspencion de lso

hematies antes de utilizar

Anadir en cada microtubulos indicados 10 ul de una suspension de hematies al 5

2- determinacion de l grupo serico-homogenizar los hematies recativos A1B

- dispersar el microtubulo N a1 50 ul de hematies reactivos A1 en un microtubulo Nb

50 ul de hematies reactivos B

-antildeadir suero o plasma

3- centrigugar en centrifuga para DG sol

Leer los resultados

RESULTADOS

NEGATIVO - Banda de hematies al fondo de la columna resto de la columna sin

aglutinados

POSITIVO

+- Escasoa glutinados de pequentildeo tamantildea d ela columna

1+ Algunos aglutinados pequentildeso en la columna

2+ aglutinados pequentildeso en la columna o mediano a lo largo de la columna

3+ Banda superior de aglutinado

4+ Banda de aglutinados en la parte superior de la columna

DP Doble poblacion (doble banda de hematies en el fondo y en la parte

superior

INTERPRETACION DE RESULTADOS

GRUPO HEMATICO GRUPO SERICOmicrotubo

Amicrotubo

Bmicrotubo

ABmicrotubo

CTL

MICROTUBUBON+ a1

MICROTUBUBON+ B

ABOGRUPO

0 0 0 0 + + 0+ 0 + 0 0 + A

0 + + 0 + 0 B

+ + + 0 0 0 AB

SISTEMA RhMicrutubo D Micrutubo

DrdquoMicrutuboCTL

INTERPRETACION

+ + 0 D positivo

0 0 0 D negativo

0 + 0

+ 0 0

D deacutebil parcial

RESULTADO E INTERPRETACION DE LA PRACTICA

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Resultado A+

CONCLUSION

Concluyo que esta teacutecnica es una forma de estabilizar las reacciones de aglutinacioacuten y

reducir los resultados falsamente negativos a consecuencia de una teacutecnica inapropiada

asi como crear un meacutetodo de interpretaciones sencillas y constantes

Practica No 5ldquoPrueba de compatibilidadrdquo

Introduccioacuten

Para requerir una oacuteptima transfusioacuten actualmente serequiere de aceptaciones inmunoloacutegicas receptor - donanteya que la transfusioacuten de sangre o la de sus componentescelulares de un donante a un receptor es una forma detransplante

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La prueba de Coombs se usa para determinar la presencia deanticuerpos no aglutinantes en el suero de sujetossensibilizados a uno o mas antiacutegenos sanguiacuteneos Es uacutetil enel estudio del suero de mujeres con isoinmunizacioacutenmaterno-fetal y se emplea tambieacuten en otro tipo de pruebas

como identificacioacuten de anticuerpos autoinmunes deteccioacutende algunos sistemas sanguiacuteneos y pruebas de compatibilidadsanguiacutenea

La prueba indirecta se realiza con eritrocitos normalesincubados in Vitro con el suero de estudio Durante esteperiodo si existe un anticuerpo este se fija sobre surespectivo determinante antigeacutenico Una vez fijados loseritrocitos son igualmente lavados y se agrega el reactivode Coombs produciendo aglutinacioacuten

Una prueba de Coombs indirecta positiva significa queexisten anticuerpos libres en el suero de la persona loscuales puedan ser igualmente auto-anticuerpos oisoanticuerpos

Material y equipo

bull Pipetas automaacuteticas de 10 microl 25 microl 50 microl y 1 ml

bull Puntas de pipetas desechables

bull Tubos de vidrio

bull Incubador para tarjetas DG Gel

bull Centrifuga para tarjetas DG Gel

Material bioloacutegico

bull Hematiacutees reactivo para investigacioacuten e identificacioacuten de anticuerpos irregulares de

Diagnostic Grifols SA

bull Suero de hemoclasificacioacuten

bull Muestras de sangre de extraccioacuten reciente recogida con anticoagulante o sin

anticoagulante

Reactivos

bull Tarjetas DG Gel

bull DG Gel Sol

Reactivos

Tarjetas DG Gel Coombs DG Gel SolRango de temperatura entre 2 y 25 ordmC Rango de temperatura entre 2 y 8ordmCLote 704901 Lote 7003701Cad 2008-03 Cad 2008-06Aspecto transparente Aspecto transparenteColor verde Color incoloro

TeacutecnicaMeacutetodo manual

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1 Dejar atemperar (18-25ordmC) muestras y reactivo2 Inspeccionar el estado de las tarjetas antes de utilizar3 Identificar las tarjetas y muestras a utilizar4 Despegar con precaucioacuten la lamina de metal que cubre los microtubos para prevenir

contaminaciones cruzadas entre ellos

5 Preparar una suspensioacuten con hematiacutees al 1 en DG Gel Sol (10 microl de sedimento oconcentrado de hematiacutees en 1 ml de DG Gel Sol) Utilizar los hematiacutees del donantepara la PC mayor y hematiacutees del receptor para la PC menor Asegurar la suspensioacuten delos hematiacutees antes de utilizar

6 Dispensar en el tubo correspondiente 50 microl de suspensioacuten de los hematiacutees al 1 deldonante (PC mayor) o 50 microl de suspensioacuten de los hematiacutees al 1 del receptor (PCmenor)

7 Antildeadir 25 microl de suero o plasma del receptor (PC mayor) o 25 microl de suero o plasma deldonante (PC menor)

8 Preparar auto control con 50 microl de suspensioacuten de los hematiacutees al 1 del receptor y 25microl de suero o plasma del receptor

9 Incubar 15 minutos a 37 ordmC10 Centrifugar en la centrifuga para tarjetas DG Gel

11 Leer los resultados

InterpretacioacutenNegativo - Banda de hematiacutees en el fondo de la columna resto de la columna sin aglutinados visibles

Positivo +- Escasos aglutinados de pequentildeo tamantildeo en la mitad inferior de la columna

1+ Algunos aglutinados de pequentildeo tamantildeo en la columna

2+ Aglutinados de tamantildeo pequentildeo o mediano a lo largo de la columna

3+ Banda superior de aglutinados de tamantildeo mediano en la mitad superior de la columna

4+ Banda de hematiacutees aglutinados en la parte superior de la columna

DP Doble poblacioacuten (doble banda de hematiacutees en el fondo y en la parte superior de la columna

Resultados

Paciente Lira Cabrera Carlos Alberto (AB+)Donador 1 Orea Valero Erasmo (A+)Donador 2 Moreno Adolfo (O+)

M1 m1 M2 m2 AutocontrolGR de donador 1 +suero del paciente

GR del paciente +suero de donador 1

GR de donador 2 +suero del paciente

GR del paciente +suero de donador 2

GR del paciente +suero del paciente

- + - + -

Por lo antes expuesto se puede deducir que el donador 1 (A+) puede donar eritrocitos al

paciente (AB+) lo mismo que el donador 2 (O+) puede donarle eritrocitos no asiacute plasma por parte de ambos donadores pues la prueba muestra que hubo reaccioacuten en ambas pruebasmenores

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Conclusioacuten

Concluyo que es esencial que toda la sangre sea estudiadaantes de la transfusioacuten para Asegurar que todos losgloacutebulos rojos transfundidos son compatibles con losanticuerpos en el plasma del paciente Evitar estimular laproduccioacuten de nuevos anticuerpos contra los gloacutebulos rojosen el receptor especialmente anti-Rh D

PRAacuteCTICA No 6PRUEBA DE COMPATIBILIDAD SANGIacuteNEA

(Teacutecnica salina)

INTRODUCCIOacuteN

Landsteiner constatoacute que cuando un aglutinoacutegeno se pone

en contacto con la aglutinina homoacuteloga se produce unaaglutinacioacuten

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La compatibilidad sanguiacutenea es la posibilidad de mezclade sangre sin que se produzcan trastornos tales como losfenoacutemenos de la lisis o de la aglutinacioacuten

A causa de este fenoacutemeno bioloacutegico en las transfusiones

de sangre no es suficiente con conocer que la sangre deldonante y la del receptor son del mismo grupo o bien quela del donante pertenezca al grupo O (cero) sino que esnecesario conocer si la compatibilidad es perfecta porqueninguacuten otro fenoacutemeno de inmunizacioacuten interfiera Es eneste sentido por lo que son empleadas las pruebascruzadas

Ademaacutes de los 6 antiacutegenos del sistema ABO en loseritrocitos humanos existen numerosos sistemas deaglutinoacutegenos que contienen muchos antiacutegenos individuales

en los eritrocitos (maacutes de 500000 millones posibles defenotipos de grupos sanguiacuteneos conocidos) Para evitaraccidentes transfusionales es indispensable tener encuenta el sistema Rh ademaacutes del ABO

Del sistema de antiacutegenos Rh es el D el maacutes antigeacutenico yel teacutermino Rh positivo indica que el individuo presentaaglutinoacutegeno D El individuo Rh negativo no tiene antiacutegenoD y forma la aglutinina anti-D en contacto con eacuteste

Las reacciones antiacutegeno-anticuerpo pueden observarse in

vitro por

mdash Hemoacutelisis la unioacuten antiacutegeno-anticuerpo se traduce enlisis de los eritrocitos en presenciadel complemento (siempre que el anticoagulante empleado nocapture losiones Ca y Mg necesarios para la activacioacuten delcomplemento) mdash Aglutinacioacuten los anticuerpos que reaccionan en mediosalino se conocen comoanticuerpos completos o aglutinantes (comuacutenmente tipo

IgM)

OBJETIVO Determinacioacuten de los antigenos del sistema ABORh (D) y su compatibilidad entre un paciente Donador y unPaciente Receptor

MATERIAL5 Tubos de ensaye6 Pipetas Pasteur

1Gradilla1 Bulbo

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EQUIPOMicrocentriacutefugaBantildeo Mariacutea oacute Estufa

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Papel Parafilm

MUESTRA Muestra de sangre con Anticoagulante EDTA

REACTIVOSAntisuero RO-Antiglobulina humana (Poliespeciacutefico Anti IgG C-d) Para prueba de CoombsLABORATORIOS LAFON SA de C VFecha de Caducidad 31-Ene-09Lote 406Hecho en MeacutexicoAspecto TransparenteColor Verde

TEacuteCNICA

Lavar los eritrocitos con solucioacuten salina (3 veces)

SALINA RAacutePIDA1 Agregar una gota de Eritrocitos Lavados2 Diluirlo al 3-5 con solucioacuten salina 093 Agregar 2 gotas de suero4 Centrifugar y observar anotar desprendimiento del botoacuten

SALINA 37deg BANtildeO MARIacuteA

1 Incubar tubos a Bantildeo mariacutea a 37degC durante 1hora (o 20 min)2 Centirfugar despueacutes de haber pasado el

tiempo3 Desprender el botoacuten de eritrocitos y

observarAGLUTINACIOacuteNndash No es compatibleNO AGLUTINACIOacuteN - Lavar 3 veces

SALINA COOMBS

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PRUEBA MAYOR

G Rojos del DONADOR+

Suero del RECEPTOR(paciente)

PRUEBA MENOR

G Rojos del RECEPTOR(paciente)

+Suero del DONADOR

AUTOTESTIGO

G Rojos del RECEPTOR(paciente)

+Suero del RECEPTOR

(paciente)

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1 Con solucioacuten salina 09 lavar loseritrocitos de los tubos q no tuvieronaglutinacioacuten 3 veces

2 Decantar y agregar 2 gotas de reactivode Coombs

AGLUTINACIOacuteN ndash No es compatibleNO AGLUTINACIOacuteN - Lavar 3 veces

RESULTADOS

Paciente Madrigal Meacutendez Luis Eduardo (B+)Folio 009164Fecha301007

Donador 1 Torres Avileacutes Joseacute Ramoacuten (O+)Folio 022604Fecha311007

Donador 2 Rodriacuteguez Nuacutentildeez Joseacute Angel (A+) Folio 022605

Fecha311007

SALINA RAacutePIDA

M1 m1 M2 m2 AutotestigoGR de donador 1+ suero del

paciente

GR del paciente+ suero dedonador 1

GR de donador 2+ suero del

paciente

GR del paciente+ suero dedonador 2

GR del paciente+ suero del

paciente

- 4+ 4+ 4+ -

SALINA 37deg BANtildeO MARIacuteA

M1 m1 M2 m2 Autotestigo- 4+ 4+ 4+ -

Compatible Nocompatible

Nocompatible

Nocompatible

Compatible

SALINA COOMBS

Por lo tanto se puede decir que el donador 1 (O+) puededonar suero al paciente (B+) debido a que en el suero nohay anticuerpos de ninguacuten tipo que reaccionen con losantiacutegenos de los eritrocios del Donador 1 Mientras tantoel Donador 2 no puede donar al Paciente ni suero nieritrocitos

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M1 Autotestigo- -

Compatible

Compatible

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INTERPRETACIOacuteN

PRUEBA POSITIVA Existe una aglutinacioacuten de lasceacutelulas sanguiacuteneas que indica la presencia delantiacutegeno A o B En el suero de Coombs notamos si esta

la precencia de Antiacutegeno D en los eritrocitos Lahemoacutelisis no se debe interpretar como resultadopositivo ya que puede indicar contaminacioacuten delreactivo

PRUEBA NEGATIVA La no aglutinacioacuten indica unresultado negativo e indica que las ceacutelulas sonnegativas para Antiacutegenos del sisitema ABO y D

CONCLUSIOacuteN

He concluido que en las transfusiones de sangre no essuficiente con conocer que la sangre del donante y la delreceptor son del mismo grupo o bien que la del donantepertenezca al grupo O (cero) sino que es necesarioconocer si la compatibilidad es perfecta porque ninguacutenotro fenoacutemeno de inmunizacioacuten interfiera Es en estesentido por lo que son empleadas las pruebas cruzadas

Praacutectica No 7ldquoPrueba de compatibilidad sanguiacutenea (teacutecnica albumina)rdquo

IntroduccioacutenLa tipificacioacuten de sangre identifica el tipo sanguiacuteneo determinandoantiacutegenos presentes en los eritrocitos detecta aloanticuerpos encontra esos antiacutegenos Asiacute los aloanticuerpos pueden aparecernaturalmente o ser inducidos y pueden ser dirigidos contra del grupoconocido o a los antiacutegenos de superficie de los eritrocitos La prueba

de compatibilidad sanguiacutenea o cross matching esta formada por laprueba mayor y menorLa prueba de cruzamiento mayor para losaloanticuerpos consiste en probar el plasma del receptor contra los

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gloacutebulos rojos del donante Es incompatible cuando se genera unareaccioacuten hemoliacutetica los eritrocitos del donante se destruyen por losaloanticuerpos del plasma del receptor La prueba menor es una pruebapara los aloanticuerpos del plasma del donante en contra los gloacutebulosrojos del receptor Una incompatibilidad menor es una causa menosfrecuente para causar una reaccioacuten en contra una transfusioacuten porque

el volumen de plasma del donante es menor y es diluido marcadamente enel receptor Para llevar a cabo dicho procedimiento se utilizandiversos reactivos como potencializadores que mejoran la unioacuten deeritrocitos con alguacuten tipo de anticuerpo Uno de esospotencializadores es la albuacutemina La albumina bovina polimerizada esun reactivo muy utilizado en el laboratorio de inmunohematologia y encentros de bancos de sangre funciona como un potencializador quefacilita la reaccion de aglutinacioacuten de eritrocitos sensibilizados Alfinal de la prueba se prueban los eritrocitos con el reactivo deCoombs El principio de la prueba de Coombs fue descrito por Moreschien 1908 pero Coombs Mourant y Race en 1946 la introdujeron en elestudio de los grupos sanguiacuteneos y anticuerpos cuando una parte desangre (suero) fue usada para la inoculacioacuten de animales para

inmunizarlos con proteiacutena humana utilizando el anticuerpo obtenido enla deteccioacuten de los llamados anticuerpos incompletos Esta prueba seusa para determinar la presencia de anticuerpos no aglutinantes en elsuero de sujetos sensibilizados a uno o mas antiacutegenos sanguiacuteneos Esuacutetil en el estudio del suero de mujeres con isoinmunizacioacuten materno-fetal y se emplea tambieacuten en otro tipo de pruebas como identificacioacutende anticuerpos autoinmunes deteccioacuten de algunos sistemas sanguiacuteneos ypruebas de compatibilidad sanguiacutenea La prueba indirecta se realizacon eritrocitos normales incubados in Vitro con el suero de estudioDurante este periodo si existe un anticuerpo este se fija sobre surespectivo determinante antigeacutenico Una vez fijados los eritrocitosson igualmente lavados y se agrega el reactivo de Coombs produciendoaglutinacioacuten Una prueba de Coombs indirecta positiva significa que

existen anticuerpos libres en el suero de la persona los cualespuedan ser igualmente auto-anticuerpos o isoanticuerpos

Objetivo Determinacioacuten de los antiacutegenos del sistema ABO Rh (D) y sucompatibilidad entre un paciente Donador y un Paciente Receptor

Material y equipo

5 Tubos de ensaye

6 Pipetas Pasteur

1Gradilla

1 Bulbo

Papel Parafilm

Microcentriacutefuga

Bantildeo Mariacutea oacute Estufa

Material bioloacutegico

Muestras de sangre de extraccioacuten reciente recogida conanticoagulante o sin anticoagulante

ReactivosSuero de CoombsAlbuacutemina bovina deg

Suero anti-globulina humana Lafon Lote 406 Cad 310109 Color verde Aspecto

transparentedegAlbumina de bovino polimerizada Interbiol Lote APO107 Cad 150109 Color incoloroAspecto transparente

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Teacutecnica

1 Montar prueba mayor 1 y 2 prueba menor 1 y 2 y autotestigocon el procedimiento ya anteriormente conocido

2 Agregar 2 gotas de albuacutemina al 223 Centrifugar 20 segundos4 observar aglutinacioacuten o hemolisis o no aglutinacioacuten5 A los tubos con lecturas negativas incubar 20 minutos en bantildeo

Mariacutea a 37 degC6 Centrifugar y observar

bull Aglutinacioacuten o hemoacutelisis reportar incompatible

bull No aglutinacioacuten llevar a Coombs

7 Lavar tres veces decantar y quitar el exceso de salina congasa y agregar 2 gotas de reactivo de Coombs y centrifugar 20segundos y observar

bull Aglutinacioacuten o hemoacutelisis reportar incompatible

bull No aglutinacioacuten reportar compatible

Resultados1 PRUEBA MAYOR 1 2 Gotas de suero del paciente + 1 gota de GR al 3-5 del

donador 12 PRUEBA MENOR 1 2 Gotas de suero del donador 1 + 1 gota de GR al 3-5 del

paciente3 PRUEBA MAYOR 2 2 Gotas de suero del paciente + 1 gota de GR al 3-5 del

donador 24 PRUEBA MENOR 2 2 Gotas de suero del donador 2 + 1 gota de GR al 3-5 del

paciente5 AUTOTESTIGO 2 Gotas de suero del paciente + 1 gota de GR al 3-5 del paciente

M1 m1 M2 m2 AutotestigoCon albuacutemina - - - - -Despueacutes de incubacioacuten a 37 degC - - - - -Despueacutes de Coombs - - - - -Despueacutes de validacioacuten con gloacutebulos

positivos+ + + + +

InterpretacioacutenPrueba positiva Alutinacioacuten o hemolisis Indica no compatibilidadPrueba negativaNo aglutinacioacuten Indica compatibilidad

Esquemas

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ConclusioacutenConcluyo que la prueba de compatibilidad sanguiacutenea en su modalidad conalbuacutemina bovina ofrece mucha ventaja al ser al igual que otrosreactivos un potencializador de la reaccioacuten antiacutegeno-anticuerpo Estopermite que el operador o realizador de la prueba tenga mayorconfianza y certeza en los resultados que obtenga

PRACTICA No 8PRUEBA DE COMPATIBILIDAD SANGUINEA PRUEBA DE LISS

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FUNDAMENTO

LISS es utilizado para reducir la fuerza ioacutenica del medio

de reaccioacuten en los procedimientos de deteccioacuten eidentificacioacuten de anticuerpos y en las pruebas decompatibilidad La presencia de este reactivo refuerza lainteraccioacuten antiacutegeno - anticuerpo durante la incubacioacuten

GENERALIDADESEl uso de solucioacuten salina de baja fuerza ioacutenica fuedescrito inicialmente en 1964 por Hughes-Jones y col y

Elliot y col pero en ese tiempo su uso era limitado yaque la concentracioacuten molar obtenida provocaba la hemoacutelisisde los eritrocitos suspendidos

En 1974 Low y Messeter describieron el uso rutinario de lasolucioacuten Liss de 003 M que lograba reducir el tiempo deincubacioacuten y no presentaba tendencia a la hemoacutelisis al sersuspendidos en salina a baja fuerza ioacutenica restableciendola presioacuten osmoacutetica de la solucioacuten mediante la adicioacuten deglicinaLas soluciones de baja fuerza ioacutenica son actualmente lasmaacutes utilizadas en inmunohematologiacutea provocando un aumentoen la velocidad de asociacioacuten entre antiacutegenos y anticuerpospermitiendo asiacute acortar el tiempo de incubacioacuten de 60minutos a 10-15 minutos sin sacrificar la sensibilidad delas mismas y sin costos elevadosSe ha observado que lasreacciones antiacutegeno-anticuerpo se ven potenciadas alreducir la fuerza ioacutenica del medio de reaccioacuten

La fuerza ioacutenica es uno de los factores maacutes importantes quedeterminan la tasa y la cantidad de captacioacuten deanticuerpos por parte de los eritrocitos El uso de mediosde reaccioacuten de baja fuerza ioacutenica permite disminuir eltiempo de incubacioacuten y potenciar las reacciones de losanticuerpos sin incrementar las reacciones inespeciacuteficas

Los iones Na+ y Cl- presentes en la solucioacuten salinafisioloacutegica se agrupan alrededor de las moleacuteculas deantiacutegeno y anticuerpo neutralizando sus cargas opuestas locual dificulta la unioacuten entre ellos Este efecto se reduceutilizando soluciones de baja fuerza ioacutenica y disminuyendode esta manera la incubacioacuten de las pruebas

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En esta etapa de sensibilizacioacuten las posibilidades deasociacioacuten pueden incrementarse mediante agitacioacutencentrifugacioacuten yo variacioacuten de la concentracioacuten delanticuerpo

Despueacutes de que el anticuerpo se ha fijado al antiacutegeno loseritrocitos sensibilizados deben unirse para dar lugar a laaglutinacioacuten visible esta red tambieacuten solidifica yestabiliza la reaccioacuten

En esta etapa la reaccioacuten depende de factores como lascaracteriacutesticas del anticuerpo localizacioacuten en la membranay nuacutemero de sitios antigeacutenicos fuerzas que mantienen ladistancia entre los eritrocitos

Las caracteriacutesticas del anticuerpo que deben considerarse

son el tamantildeo del anticuerpo involucrado y el nuacutemero desitios de combinacioacuten con el antiacutegeno Los anticuerpos IgMpueden establecer puentes entre los eritrocitos yaglutinarlos espontaacuteneamente en solucioacuten salina mientrasque los IgG no ya que las IgM pentameacutericas poseen 10sitios de combinacioacuten con el antiacutegeno y las IgG diacutemerossoacutelo dos sitios

Los eritrocitos tienen una carga neta negativa en susuperficie su interaccioacuten con los iones del medio alteraesta carga y producen una carga neta criacutetica denominada

potencial zeta y la reduccioacuten de dicha carga permite quelos eritrocitos se aproximen lo suficiente para que seanaglutinados por medio de los IgG que los sensibilizaron

Las soluciones de baja fuerza ionica empleadas en banco desangre tienen un pH entre 65 ndash 70 se recomienda unaosmolalidad de 270 ndash 305 mosmkg y una conductividad de 37mmcm El control diario implica el examen de su aparienciafiacutesica ausencia de turbidez particulas o sedimento asiacutecomo corroborar la capacidad para generar hemoacutelisiscrenacion o prueba de coombs positiva en eritrocitos

normales Cada lote nuevo se valora mediante el rastreo deun anticuerpo ya sea un anti- D un anti- jk anti- fy oanti- kell diluido se compara su capacidad de deteccioacutencontra un medio salino normal incubando 10min a 37ordmC enLISS debe poder rastrearse un anticuerpo en tanto que enmedio salino no

MATERIAL Y EQUIPO

Material Cantidad10 Tubos de ensayo de 12 x 75

1 Gradilla10 Pipetas pasteur

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1 Bulbo1 Marcador1 Microcentriacutefuga1 Bantildeo Mariacutea

MATERIAL BIOLOGICO

Gloacutebulos rojos lavados al 3 - 5Suero

REACTIVOS

Reactivo de LISSReactivo de Coombs

TECNICA1- Lavar los eritrocitos

Separar el suero del paquete de gloacutebulos rojos

Agregar cierta cantidad de eritrocitos a un tubo deensayo y agregarle solucioacuten salina

Centrifugar y decantar

Repetir este proceso 3 veces

2- Realizar la Prueba de LISS

Enumerar los tubos Poner dos gotas de LISS en cada tubo agregar una gota

de eritrocitos lavados y al 3 - 5 seguacuten el nuacutemero detubo correspondiente

Mezclar y centrifugar un minuto decantar elsobrenadante y con la ayuda de una gasa limpiar elexceso del reactivo

Poner nuevamente 2 gota de LISS resuspender poragitacioacuten agregar 2 gotas de suero problema mezclarincubar 15 minutos a 37ordm C centrifugar 30 seg A 1000

RPM Anotar los resultados

3- A las pruebas negativas realizar Coombs

Lavar 3 veces las ceacutelulas agregar suero de Coombscentrifugar 30 seg

Leer aglutinaciones y anotar resultados

REACTIVOS UTILIZADOS

REACTIVO MARCA FECHA DECADUCIDAD

ASPECTO COLOR LOTE

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SueroAntiglobuina

humana

Lafon 31 01 2009 Transparente Verde 406

LISS Caserorealizado enCMNSIGLOXXI

1 antildeo Transparente Transparente

----------

PACIENTE ASCANIO MENDEZ JOSUE O (+)DONADOR 1 GARCIA CARBAJAL OSCAR O (+)DONADOR 2 GARCIA SUAREZ ORLANDO A (+)

RESULTADOS

INTERPRETACIOacuteN DE LOS RESULTADOS

La hemoacutelisis o la aglutinacioacuten representan un resultado positivo e indican lapresencia de una reaccioacuten antiacutegeno-anticuerpo Los resultados negativos no severa aglutinacioacuten o hemolisis

ESQUEMAS

CONCLUSIONES

Concluyo que la prueba de compatibilidad sanguiacutenea en su modalidad conliss ofrece mucha ventaja al ser al igual que otros reactivos unpotencializador de la reaccioacuten antiacutegeno-anticuerpo Esto permite queel operador o realizador de la prueba tenga mayor confianza y certezaen los resultados que obtenga

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Tubo Resultado

M1 NEGATIVOm1 NEGATIVO

M2 POSITIVO

M2 NEGATIVO

AUTOTES NEGATIVO

29

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PRACTICA 9INMUNOHEMATOLOGIA

DETERMINACION DE COOMBS DIRECTO

INTRODUCCIONPRUEBA DE COOMBS DIRECTA

El examen de Coombs directo se utiliza para detectar autoanticuerpos contralos propios gloacutebulos rojos (GR) de un individuo Es una prueba que sirve parademostrar el revestimiento de los eritrocitos in vivo (mientras los eritrocitosestaacuten circulando en el individuo) La prueba se realiza agregando directamenteel reactivo de Coombs a los eritrocitos previamente lavados para eliminar otras proteiacutenas no fijadas a el una prueba directa positiva significa que larelacioacuten antiacutegeno-anticuerpo ocurrioacute in vivo es decir que la fijacioacuten del

anticuerpo sobre el antiacutegeno se realizo en el organismo del individuo enestudio

Las indicaciones principales de esta prueba son diagnostico de enfermedadeshemoliacuteticas ictericia o anomaliacuteas en la apariencia de los gloacutebulos rojos bajo elmicroscopio ya que estos anticuerpos algunas veces destruyen los gloacutebulosrojos y causan anemia para investigar reacciones en transfusiones Parainvestigar la induccioacuten de drogas en ceacutelulas rojas sensibilizadas medicamentos(por ejemplo quinidina metildopa procainamida y otros) que pueden llevar a la produccioacuten de estos anticuerpos

OBJETIVO Determinar la presencia de anticuerpos en la superficie de losgloacutebulos rojos del individuo

MATERIAL

bull 10 Tubos de 1275

bull 10 Pipetas Pasteur

bull 1 Gradilla

bull 1 Bulbo

bull Papel Parafilm

bull Microcentriacutefuga

bull Bantildeo Mariacutea a 37degC

MUESTRA BIOLOGICA

Eritrocitos lavados de (3-5) del donador o pacienteREACTIVO

Suero de CoombsSuero anti-globulina humana Lafon Lote 406 Cad 310109 Color verde Aspecto transparente

TECNICA

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Colocar en un tubo de ensaye dos gotas de suero de Coombs mas una gota deglobulos rojos (3-5)Centrifugar a 1000 rpm durante 20 segDesprender el boton suavemente y buscar la presencia de aglutinacionRotular y enumerar 8 tubos de ensayes con las diferentes diluciones

(frac12frac1418)Enumerar 8 tubos mas del 1 al 8Agregar a cada tubo de las diluciones 10 gotas de solucion salina mas 10 gotasde suero de CoombsColocar Al primer tubo de la dilucion 1 gota de globulos rojos (3-5) mezclar completamente y agregar al tubo 1Centrifugar todos los tubos a 1000 rpm durante 20 seg

LECTURA

Aglutina- Prueba de Coombs directa es positiva

No aglutina- Prueba de Coombs directa es negativa

ESQUEMAS y RESULTADOS

CONCLUCION

He concluido que la prueba de Coombs directa es una prueba que se utiliza para medir

la presencia de anticuerpos en la superficie de los gloacutebulos rojos que se encuentran

circulando en el paciente y se realiza para investigar reacciones en transfusiones ademaacutes

sirve para la determinacioacuten de anemia hemoliacutetica autoinmune entre otras afecciones

Practica 10

IDENTIFICACION DE ANTICUERPOS IRREGULARES

Fundamento

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DILUCIONES

frac12 positiva

frac14 positiva

18 positiva

116 negativa

132 negativa

164 negativa

1128 negativa1256 negativa

31

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Los anticuerpos del sistema ABO aparecen una vez que elindividuo entra en contacto con el medio ambiente y en elcual se encuentran microorganismos como algunas bacteriascoliformes que contienen sustancias quiacutemicas en suestructura parecidas a las de este sistema Por anticuerpos

regulares debemos identificar a los que existen en todoslos individuos y que eacutestos tendraacuten durante toda su vida

Los anticuerpos irregulares son los que no estaacuten de esamanera aunque en el caso de los naturales no se conoce aciencia cierta queacute o coacutemo se induce su produccioacuten Losadquiridos se conocen tambieacuten como inmunes y son elresultado de la exposicioacuten a antiacutegenos desconocidos por elindividuo al momento de la transfusioacuten o en las mujerespor el embarazo estos anticuerpos son dirigidos contraantiacutegenos de sistemas diferentes al ABO

Los anticuerpos naturales regulares son preferentementeinmunoglobulinas M las cuales fijan de manera taneficiente el complemento que pueden provocar lisisintravascular y ocasionar insuficiencia renal o incluso lamuerte del paciente Los anticuerpos adquiridos o inmunesson generalmente inmunoglobulinas G las cuales producenhemoacutelisis extravascular en el bazo o en el hiacutegado mediantefagocitosis del complejo eritrocito maacutes anticuerpo

Los aloanticuerpos irregulares (adquiridos) maacutes comunes en

nuestra poblacioacuten son los que involucran a los sistemasMNSs P1 Kidd (Jka Jkb) Duffy (Fya Fyb) Kell Lewis yDiego

OBJETIVO identificacioacuten del anticuerpo irregular a traveacutesde las diferentes teacutecnicas

MATERIAL

bull 10 Tubos de ensaye

bull 10 Pipetas Pasteur

bull

1Gradillabull 1 Bulbo

bull Papel Parafim

MATERIAL BIOLOGICO

bull Gloacutebulos rojos lavados al 3 - 5

bull Suero

bull REACTIVOSReactivos

1 Suero de Coombs2 Albuacutemina bovina

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bull EQUIPO1 Microcentriacutefuga2 Bantildeo Mariacutea oacute Estufa

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3 SOLUCION SALINA4 SOLUCION DE LISS

TEacuteCNICA SOLUCION SALINA

Lavar los eritrocitos con solucioacuten salina (3veces)SALINA RAacutePIDA

Agregar una gota de Eritrocitos LavadosDiluiacuterlo al 3-5 con solucioacuten salina 09Agregar 2 gotas de sueroCentrifugar y observar anotar desprendimientodel botoacuten

SALINA 37deg BANtildeO MARIacuteA1) Incubar tubos a Bantildeo mariacutea a 37degC durante 1

hora (o 20 min)

2) Centirfugar despueacutes de haber pasado eltiempo

3) Desprender el botoacuten de eritrocitos yobservar

AGLUTINACIOacuteNndash No es compatibleNO AGLUTINACIOacuteN - Lavar 3 veces

SALINA COOMBS1) Con solucioacuten salina 09 lavar los

eritrocitos de los tubos q no tuvieronaglutinacioacuten 3 veces

2) Decantar y agregar 2 gotas de reactivode Coombs

AGLUTINACIOacuteN ndash No es compatibleNO AGLUTINACIOacuteN - Lavar 3 veces

TECNICA LISS

1 Poner dos gotas de LISS en cada tubo agregar una gotade eritrocitos lavados y al 3 - 5 seguacuten el nuacutemero detubo correspondiente

2 Mezclar y centrifugar un minuto decantar el

sobrenadante y con la ayuda de una gasa limpiar elexceso del reactivo

3 Poner nuevamente 2 gota de LISS resuspender poragitacioacuten agregar 2 gotas de suero problema mezclarincubar 15 minutos a 37ordm C centrifugar 30 seg A 1000RPM

4 Anotar los resultados

A las pruebas negativas realizar Coombs

1 Lavar 3 veces las ceacutelulas agregar suero de Coombs

centrifugar 30 seg2 Leer aglutinaciones y anotar resultados

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TECNICA ALBUMINA BOVINA 8 Agregar 2 gotas de albuacutemina al 229 Centrifugar 20 segundos10observar aglutinacioacuten o hemolisis o no aglutinacioacuten

11A los tubos con lecturas negativas incubar 20minutos en bantildeo Mariacutea a 37 degC12Centrifugar y observar

bull Aglutinacioacuten o hemoacutelisis reportar incompatible

bull No aglutinacioacuten llevar a Coombs

13Lavar tres veces decantar y quitar el exceso desalina con gasa y agregar 2 gotas de reactivo deCoombs y centrifugar 20 segundos y observar

bull Aglutinacioacuten o hemoacutelisis reportar incompatible

bull No aglutinacioacuten reportar compatible

Resultados ANTICUERPO IRREGULAR Anticuerpo c

InterpretacioacutenEstos anticuerpos son generalmente inmunoglobulinas tipo My ocasionalmente tipo G y debido a esa temperatura dereaccioacuten carecen de importancia cliacutenica salvo que sureaccioacuten ocurra tambieacuten a 37 degC su importancia radica enpacientes que seraacuten intervenido a 22 ordmc como es el caso de

operacioacuten de corazoacuten

Los llamados anticuerpos calientes tienen una temperatura oacuteptima dereaccioacuten a 37 degC a Estos anticuerpos tienen una relevanteimportancia cliacutenica ya que se les asocia con reaccionestransfusionales de intensidad moderada a severa que puedenocasionar la muerte

Esquemas

CONCLUSIONHe concluido que es importante determinar los anticuerposirregulares ya que estos anticuerpos tienen una relevanteimportancia cliacutenica ya que se les asocia con reaccionestransfusionales de intensidad moderada a severa

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ANTI-H (LECTINA)

Ulex europeaus

Para la determinacioacuten de del estado secretor y tipificacioacuten de las ceacutelulas rojas

INTRODUCCIONLa mayoriacutea de los grupos sanguiacuteneos ABO que se determinanen el banco de sangre cumplen con las leyes establecidas deantiacutegenos y anticuerpos reciacuteprocos para ese sistema

Los anticuerpos del sistema ABO existen en el individuodesde el momento en que son capaces de tener una respuestainmunoloacutegica y se producen contra los antiacutegenos A y B

Los subgrupos son fenotipos ABO que difieren en la cantidad

de antiacutegeno presente en los eritrocitos y en la saliva delos secretores Se hallan con mayor frecuencia y tienen maacutesrelevancia cliacutenica los de A que los de B Al utilizarlectinas se definen los subgrupos A1 y A2 con el extractode Dolichos biflorus se aglutinan los eritrocitos A1 perono los de A2 y el anti H semilla Ulex europeus aglutinaeritrocitos que tienen antiacutegeno H

MATERIAL Y EQUIPObull Tubos de ensaye de 1075mm

bull Cronometro

bull Marcador

bull Centrifuga seroloacutegica

MUESTRA BIOLOGICAbull Ceacutelulas rojas de donador o paciente

REACTIVObull Inmucor anti-H (Lectina) en gotero

MARCA GANMA

LOTE ML1581

CADUCIDAD 2007-11-14

TECNICA

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1 Adicione una gota de una suspensioacuten de eritrocitos bajo prueba del 3-5 en

salina en tubos adecuadamente marcados

2 Adicione dos gotas de anti-H Lectina y mezcle completamente el contenido del

tubo

3 incube durante 5 minutos a temperatura ambiente

4 Centrifugar de 15-30 minutos a 1000 rpm5 Agite suavemente el tubo y resuspenda el botoacuten celular Examine las reacciones

resultantes macroscoacutepicamente Registre resultados

INTERPRETACIOacuteN

PROBLEMA ANTI A1 ANTI H

(ANTI A2)

RESULTADO

SUBGRUPO

PACIENTE 1 + - ANTI A1

PACIENTE 2 - + ANTI A2

bull Prueba positiva Aglutinacioacuten de las ceacutelulas rojas

Nota La hemoacutelisis no debe interpretarse como un resultado positivo ya que esto

puede indetificarse como contaminacioacuten del reactivo

bull Prueba negativa Ausencia de aglutinacioacuten de las ceacutelulas rojas

CONCLUSIONES

Concluyo que para realizar unatransfusioacuten sanguiacutenea se debe tomar encuenta los subgrupos del donante y del

receptor Los subgrupo con mayorfrecuencia y tienen maacutes relevanciacliacutenica los de A que los de B Y seidentifican por medio de utilizarlectinas Los subgrupos A maacutesimportantes son A1 y A2

PRACTICA 3DETERMINACION DE Rh

INTRODUCCIOacuteN

El factor Rh es una clase de proteiacutena que se encuentra enlos gloacutebulos rojos de la sangre cuando alguien tiene esaproteiacutena se le considera ldquoRh Positivordquo Cuando no la tienees ldquoRh Negativordquo El factor Rh es hereditario y setransmite en dos genes El Factor Rh positivo es dominantees decir si una persona tiene un gen positivo y otronegativo su factor Rh seraacute positivo

Esta prueba es importante en el diagnostico y estudio

de la eritroblastosis fetal en la que los gloacutebulosrojos del nintildeo se encuentran sensibilizados con

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anticuerpo materno Es uacutetil tambieacuten en el diagnosticode la anemia hemoliacutetica adquirida (anticuerpos sobrelos gloacutebulo rojos del mismo paciente) asiacute como ladeterminacioacuten de eritrocitos sensibilizados en sangreusados para transfusioacuten

Las dos clasificaciones maacutes importantes para describirgrupos sanguiacuteneos en humanos son los antiacutegenos y el factorRh Las transfusiones de sangre entre grupos incompatiblespueden provocar una reaccioacuten inmunoloacutegica que puededesembocar en hemoacutelisis anemia fallo renal shock omuerte

MATERIAL

bull Tubos de ensayo de 12 x 75

bull Pipetas Pasteur

bull Gradilla

EQUIPO

bull Centrifuga

MUESTRA BIOLOacuteGICA

bull Eritrocitos lavados 3-5 del paciente

REACTIVOS

bull Antisuero Anti-D

bull Suero anti globulina humanabull Suero reactivo control

Antisuero D monoclonal NOVACLONELote NDMG04305CAD 29MAR08Aspecto transparenteColor incoloroSuero anti globulina HumanaLote 405CAD 06-NOV-08Aspecto transparenteColor verde

Reactivo control GAMMA-CLONELote GCM115-3CAD 2008-12-08Aspecto transparenteColor incoloro

TEacuteCNICA

Determinacioacuten de Rh

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bull Prepare una suspensioacuten de gloacutebulos rojos al 3-5 en solucioacuten salina Los gloacutebulos deben serlavados previamente 5 veces con el objeto deeliminar las proteiacutenas del plasma

bull Rotular 3 tubos para la previa identificacioacuten

de Rhbull Ponga 1 gota de la suspensioacuten lavada en cada

tubo

bull Antildeada una gota de anti suero D monoclonal

bull Mezcle y centrifugue 15 seg Y observe si hayaglutinacioacuten

Preparacioacuten del control negativo

bull Ponga una gota de eritrocitos lavados al 3-5

bull Antildeada una gota de reactivo control

bull

Centrifugue 15 seg y observe si hay aglutinacioacuten

Deteccioacuten de sangre Du

Nota esta teacutecnica se le realizo a los tubos problemasque no aglutinaron

bull Los tubos que no tuvieron aglutinacioacuten en ladeterminacioacuten de Rh se incuban 15 min yposteriormente se lavan 3 veces con sol Salina

bull Previamente lavados se le agregan 2 gotas de suerode COOMBS

bull Centrifugar 15 seg y observar desprender boton

ESQUEMAS

RESULTADOS problemas Aglutinacioacuten resultado2 positiva Rh +10 negativa Rh -11 negativa Rh -

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Paciente 2 coacutedigo 021612 plata Lugo JavierPaciente 10 coacutedigo 021620 Hernaacutendez Loacutepez GuillermoPaciente 11 coacutedigo 021621 camarillo Sonia rebeca

INTERPRETACIOacuteNPara el primer meacutetodoAglutinacion Rh positivoNo aglutinacioacuten realizar prueba de deteccioacuten desangre Du

Deteccioacuten de sangre DuAglutinacioacuten D deacutebil (Du positivo)No aglutinacioacuten Rh negativo

CONCLUSIONESCon el descubrimiento del sistema Rh se denominan Rhpositivos los hematiacutees que son aglutinados por esteanticuerpo y tienen por tanto el antiacutegeno Rh en lasuperficie Se denominan Rh negativos los que no sonaglutinados y que por tanto no poseen el antiacutegeno Rh ensu superficie

De la misma manera que en el sistema ABO en el sistema Rh

no se puede transfundir el antiacutegeno Rh a las personas queno lo tienen ya que podriacutea originar la produccioacuten deanticuerpos Rh en el receptor Los sujetos Rh negativossoacutelo podraacuten recibir sangre de donantes Rh negativos

PRACTICA 4INMUNOHEMATOLOGIA

DETERMINACION DE GRUPO SANGUINEO POR TECNICA DE GEL

INTRODUCCION

El sistema utilizado en inmunohematologiacutea para investigar e identificar antiacutegenos y

anticuerpos antieritrocitarios Es de tecnologiacutea de microtipificacioacuten en gel se basa en la

separacioacuten por tamantildeo de los eritrocitos aglutinados durante un proceso de

centrifugacioacuten en un gel poroso

Los eritrocitos van perdiendo elasticidad en sus membranas de forma que los

aglutinados grandes quedan atrapados en la zona superior y los pequentildeos quedan

distribuidos a lo largo de la columna

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Esta teacutecnica nos permite que estandaricemos la lectura de la reaccioacuten antiacutegeno-

anticuerpo con facilidad y repetitividad Asiacute como la estandariza del uso de reactivos

tiempos y lecturas disminuyendo sustancialmente la influencia de la mano de operador

OBJETIVO determinacioacuten de los antigenos del sistema ABORh (D) y determinacion

del grupo serico en tecnica de gel

FUNDAMENTOS

El principio del metdo se basa en la tecnica de gel descrita por Y Lapierre para la

deteccion de las reacciones de aglutinacion de los hematies La aglutinacion se produce

al entar en contacto los eritrocitos con los anticuerpos correspondientes

La tarjeta DG gel es un soporte de plastico constituidos por 8 microtubulos Cada

microtubulo esta formado por una columna y una camara de dispersionincubacion

La tecnologiacutea de microtipificacioacuten en gel se basa en la separacioacuten por tamantildeo de los

eritrocitos aglutinados durante un proceso de centrifugacioacuten en un gel poroso

Los eritrocitos van perdiendo elasticidad en sus membranas de forma que los

aglutinados grandes quedan atrapados en la zona superior y los pequentildeos quedan

distribuidos a lo largo de la columna

MATERIAL

Pipeta automaacutetica 10 ul 50ul 1 ml

Puntas de pipeta desechable Tubos de vidrios

DEG sol

Centrifugas para tarjetas DG gel

Hematies de reactivos para grupo inverso

MUESTRA BIOLOGICACeacutelulas rojas de donador o paciente

REACTIVO

Placa de gelReactivo de gel sol

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TECNICA1- determinacion de los antigenos del sistema ABORh

-preparar una suspension de hematies al 5 de DG sol Asegurar la resuspencion de lso

hematies antes de utilizar

Anadir en cada microtubulos indicados 10 ul de una suspension de hematies al 5

2- determinacion de l grupo serico-homogenizar los hematies recativos A1B

- dispersar el microtubulo N a1 50 ul de hematies reactivos A1 en un microtubulo Nb

50 ul de hematies reactivos B

-antildeadir suero o plasma

3- centrigugar en centrifuga para DG sol

Leer los resultados

RESULTADOS

NEGATIVO - Banda de hematies al fondo de la columna resto de la columna sin

aglutinados

POSITIVO

+- Escasoa glutinados de pequentildeo tamantildea d ela columna

1+ Algunos aglutinados pequentildeso en la columna

2+ aglutinados pequentildeso en la columna o mediano a lo largo de la columna

3+ Banda superior de aglutinado

4+ Banda de aglutinados en la parte superior de la columna

DP Doble poblacion (doble banda de hematies en el fondo y en la parte

superior

INTERPRETACION DE RESULTADOS

GRUPO HEMATICO GRUPO SERICOmicrotubo

Amicrotubo

Bmicrotubo

ABmicrotubo

CTL

MICROTUBUBON+ a1

MICROTUBUBON+ B

ABOGRUPO

0 0 0 0 + + 0+ 0 + 0 0 + A

0 + + 0 + 0 B

+ + + 0 0 0 AB

SISTEMA RhMicrutubo D Micrutubo

DrdquoMicrutuboCTL

INTERPRETACION

+ + 0 D positivo

0 0 0 D negativo

0 + 0

+ 0 0

D deacutebil parcial

RESULTADO E INTERPRETACION DE LA PRACTICA

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Resultado A+

CONCLUSION

Concluyo que esta teacutecnica es una forma de estabilizar las reacciones de aglutinacioacuten y

reducir los resultados falsamente negativos a consecuencia de una teacutecnica inapropiada

asi como crear un meacutetodo de interpretaciones sencillas y constantes

Practica No 5ldquoPrueba de compatibilidadrdquo

Introduccioacuten

Para requerir una oacuteptima transfusioacuten actualmente serequiere de aceptaciones inmunoloacutegicas receptor - donanteya que la transfusioacuten de sangre o la de sus componentescelulares de un donante a un receptor es una forma detransplante

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La prueba de Coombs se usa para determinar la presencia deanticuerpos no aglutinantes en el suero de sujetossensibilizados a uno o mas antiacutegenos sanguiacuteneos Es uacutetil enel estudio del suero de mujeres con isoinmunizacioacutenmaterno-fetal y se emplea tambieacuten en otro tipo de pruebas

como identificacioacuten de anticuerpos autoinmunes deteccioacutende algunos sistemas sanguiacuteneos y pruebas de compatibilidadsanguiacutenea

La prueba indirecta se realiza con eritrocitos normalesincubados in Vitro con el suero de estudio Durante esteperiodo si existe un anticuerpo este se fija sobre surespectivo determinante antigeacutenico Una vez fijados loseritrocitos son igualmente lavados y se agrega el reactivode Coombs produciendo aglutinacioacuten

Una prueba de Coombs indirecta positiva significa queexisten anticuerpos libres en el suero de la persona loscuales puedan ser igualmente auto-anticuerpos oisoanticuerpos

Material y equipo

bull Pipetas automaacuteticas de 10 microl 25 microl 50 microl y 1 ml

bull Puntas de pipetas desechables

bull Tubos de vidrio

bull Incubador para tarjetas DG Gel

bull Centrifuga para tarjetas DG Gel

Material bioloacutegico

bull Hematiacutees reactivo para investigacioacuten e identificacioacuten de anticuerpos irregulares de

Diagnostic Grifols SA

bull Suero de hemoclasificacioacuten

bull Muestras de sangre de extraccioacuten reciente recogida con anticoagulante o sin

anticoagulante

Reactivos

bull Tarjetas DG Gel

bull DG Gel Sol

Reactivos

Tarjetas DG Gel Coombs DG Gel SolRango de temperatura entre 2 y 25 ordmC Rango de temperatura entre 2 y 8ordmCLote 704901 Lote 7003701Cad 2008-03 Cad 2008-06Aspecto transparente Aspecto transparenteColor verde Color incoloro

TeacutecnicaMeacutetodo manual

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1 Dejar atemperar (18-25ordmC) muestras y reactivo2 Inspeccionar el estado de las tarjetas antes de utilizar3 Identificar las tarjetas y muestras a utilizar4 Despegar con precaucioacuten la lamina de metal que cubre los microtubos para prevenir

contaminaciones cruzadas entre ellos

5 Preparar una suspensioacuten con hematiacutees al 1 en DG Gel Sol (10 microl de sedimento oconcentrado de hematiacutees en 1 ml de DG Gel Sol) Utilizar los hematiacutees del donantepara la PC mayor y hematiacutees del receptor para la PC menor Asegurar la suspensioacuten delos hematiacutees antes de utilizar

6 Dispensar en el tubo correspondiente 50 microl de suspensioacuten de los hematiacutees al 1 deldonante (PC mayor) o 50 microl de suspensioacuten de los hematiacutees al 1 del receptor (PCmenor)

7 Antildeadir 25 microl de suero o plasma del receptor (PC mayor) o 25 microl de suero o plasma deldonante (PC menor)

8 Preparar auto control con 50 microl de suspensioacuten de los hematiacutees al 1 del receptor y 25microl de suero o plasma del receptor

9 Incubar 15 minutos a 37 ordmC10 Centrifugar en la centrifuga para tarjetas DG Gel

11 Leer los resultados

InterpretacioacutenNegativo - Banda de hematiacutees en el fondo de la columna resto de la columna sin aglutinados visibles

Positivo +- Escasos aglutinados de pequentildeo tamantildeo en la mitad inferior de la columna

1+ Algunos aglutinados de pequentildeo tamantildeo en la columna

2+ Aglutinados de tamantildeo pequentildeo o mediano a lo largo de la columna

3+ Banda superior de aglutinados de tamantildeo mediano en la mitad superior de la columna

4+ Banda de hematiacutees aglutinados en la parte superior de la columna

DP Doble poblacioacuten (doble banda de hematiacutees en el fondo y en la parte superior de la columna

Resultados

Paciente Lira Cabrera Carlos Alberto (AB+)Donador 1 Orea Valero Erasmo (A+)Donador 2 Moreno Adolfo (O+)

M1 m1 M2 m2 AutocontrolGR de donador 1 +suero del paciente

GR del paciente +suero de donador 1

GR de donador 2 +suero del paciente

GR del paciente +suero de donador 2

GR del paciente +suero del paciente

- + - + -

Por lo antes expuesto se puede deducir que el donador 1 (A+) puede donar eritrocitos al

paciente (AB+) lo mismo que el donador 2 (O+) puede donarle eritrocitos no asiacute plasma por parte de ambos donadores pues la prueba muestra que hubo reaccioacuten en ambas pruebasmenores

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Conclusioacuten

Concluyo que es esencial que toda la sangre sea estudiadaantes de la transfusioacuten para Asegurar que todos losgloacutebulos rojos transfundidos son compatibles con losanticuerpos en el plasma del paciente Evitar estimular laproduccioacuten de nuevos anticuerpos contra los gloacutebulos rojosen el receptor especialmente anti-Rh D

PRAacuteCTICA No 6PRUEBA DE COMPATIBILIDAD SANGIacuteNEA

(Teacutecnica salina)

INTRODUCCIOacuteN

Landsteiner constatoacute que cuando un aglutinoacutegeno se pone

en contacto con la aglutinina homoacuteloga se produce unaaglutinacioacuten

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La compatibilidad sanguiacutenea es la posibilidad de mezclade sangre sin que se produzcan trastornos tales como losfenoacutemenos de la lisis o de la aglutinacioacuten

A causa de este fenoacutemeno bioloacutegico en las transfusiones

de sangre no es suficiente con conocer que la sangre deldonante y la del receptor son del mismo grupo o bien quela del donante pertenezca al grupo O (cero) sino que esnecesario conocer si la compatibilidad es perfecta porqueninguacuten otro fenoacutemeno de inmunizacioacuten interfiera Es eneste sentido por lo que son empleadas las pruebascruzadas

Ademaacutes de los 6 antiacutegenos del sistema ABO en loseritrocitos humanos existen numerosos sistemas deaglutinoacutegenos que contienen muchos antiacutegenos individuales

en los eritrocitos (maacutes de 500000 millones posibles defenotipos de grupos sanguiacuteneos conocidos) Para evitaraccidentes transfusionales es indispensable tener encuenta el sistema Rh ademaacutes del ABO

Del sistema de antiacutegenos Rh es el D el maacutes antigeacutenico yel teacutermino Rh positivo indica que el individuo presentaaglutinoacutegeno D El individuo Rh negativo no tiene antiacutegenoD y forma la aglutinina anti-D en contacto con eacuteste

Las reacciones antiacutegeno-anticuerpo pueden observarse in

vitro por

mdash Hemoacutelisis la unioacuten antiacutegeno-anticuerpo se traduce enlisis de los eritrocitos en presenciadel complemento (siempre que el anticoagulante empleado nocapture losiones Ca y Mg necesarios para la activacioacuten delcomplemento) mdash Aglutinacioacuten los anticuerpos que reaccionan en mediosalino se conocen comoanticuerpos completos o aglutinantes (comuacutenmente tipo

IgM)

OBJETIVO Determinacioacuten de los antigenos del sistema ABORh (D) y su compatibilidad entre un paciente Donador y unPaciente Receptor

MATERIAL5 Tubos de ensaye6 Pipetas Pasteur

1Gradilla1 Bulbo

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EQUIPOMicrocentriacutefugaBantildeo Mariacutea oacute Estufa

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Papel Parafilm

MUESTRA Muestra de sangre con Anticoagulante EDTA

REACTIVOSAntisuero RO-Antiglobulina humana (Poliespeciacutefico Anti IgG C-d) Para prueba de CoombsLABORATORIOS LAFON SA de C VFecha de Caducidad 31-Ene-09Lote 406Hecho en MeacutexicoAspecto TransparenteColor Verde

TEacuteCNICA

Lavar los eritrocitos con solucioacuten salina (3 veces)

SALINA RAacutePIDA1 Agregar una gota de Eritrocitos Lavados2 Diluirlo al 3-5 con solucioacuten salina 093 Agregar 2 gotas de suero4 Centrifugar y observar anotar desprendimiento del botoacuten

SALINA 37deg BANtildeO MARIacuteA

1 Incubar tubos a Bantildeo mariacutea a 37degC durante 1hora (o 20 min)2 Centirfugar despueacutes de haber pasado el

tiempo3 Desprender el botoacuten de eritrocitos y

observarAGLUTINACIOacuteNndash No es compatibleNO AGLUTINACIOacuteN - Lavar 3 veces

SALINA COOMBS

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PRUEBA MAYOR

G Rojos del DONADOR+

Suero del RECEPTOR(paciente)

PRUEBA MENOR

G Rojos del RECEPTOR(paciente)

+Suero del DONADOR

AUTOTESTIGO

G Rojos del RECEPTOR(paciente)

+Suero del RECEPTOR

(paciente)

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1 Con solucioacuten salina 09 lavar loseritrocitos de los tubos q no tuvieronaglutinacioacuten 3 veces

2 Decantar y agregar 2 gotas de reactivode Coombs

AGLUTINACIOacuteN ndash No es compatibleNO AGLUTINACIOacuteN - Lavar 3 veces

RESULTADOS

Paciente Madrigal Meacutendez Luis Eduardo (B+)Folio 009164Fecha301007

Donador 1 Torres Avileacutes Joseacute Ramoacuten (O+)Folio 022604Fecha311007

Donador 2 Rodriacuteguez Nuacutentildeez Joseacute Angel (A+) Folio 022605

Fecha311007

SALINA RAacutePIDA

M1 m1 M2 m2 AutotestigoGR de donador 1+ suero del

paciente

GR del paciente+ suero dedonador 1

GR de donador 2+ suero del

paciente

GR del paciente+ suero dedonador 2

GR del paciente+ suero del

paciente

- 4+ 4+ 4+ -

SALINA 37deg BANtildeO MARIacuteA

M1 m1 M2 m2 Autotestigo- 4+ 4+ 4+ -

Compatible Nocompatible

Nocompatible

Nocompatible

Compatible

SALINA COOMBS

Por lo tanto se puede decir que el donador 1 (O+) puededonar suero al paciente (B+) debido a que en el suero nohay anticuerpos de ninguacuten tipo que reaccionen con losantiacutegenos de los eritrocios del Donador 1 Mientras tantoel Donador 2 no puede donar al Paciente ni suero nieritrocitos

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M1 Autotestigo- -

Compatible

Compatible

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INTERPRETACIOacuteN

PRUEBA POSITIVA Existe una aglutinacioacuten de lasceacutelulas sanguiacuteneas que indica la presencia delantiacutegeno A o B En el suero de Coombs notamos si esta

la precencia de Antiacutegeno D en los eritrocitos Lahemoacutelisis no se debe interpretar como resultadopositivo ya que puede indicar contaminacioacuten delreactivo

PRUEBA NEGATIVA La no aglutinacioacuten indica unresultado negativo e indica que las ceacutelulas sonnegativas para Antiacutegenos del sisitema ABO y D

CONCLUSIOacuteN

He concluido que en las transfusiones de sangre no essuficiente con conocer que la sangre del donante y la delreceptor son del mismo grupo o bien que la del donantepertenezca al grupo O (cero) sino que es necesarioconocer si la compatibilidad es perfecta porque ninguacutenotro fenoacutemeno de inmunizacioacuten interfiera Es en estesentido por lo que son empleadas las pruebas cruzadas

Praacutectica No 7ldquoPrueba de compatibilidad sanguiacutenea (teacutecnica albumina)rdquo

IntroduccioacutenLa tipificacioacuten de sangre identifica el tipo sanguiacuteneo determinandoantiacutegenos presentes en los eritrocitos detecta aloanticuerpos encontra esos antiacutegenos Asiacute los aloanticuerpos pueden aparecernaturalmente o ser inducidos y pueden ser dirigidos contra del grupoconocido o a los antiacutegenos de superficie de los eritrocitos La prueba

de compatibilidad sanguiacutenea o cross matching esta formada por laprueba mayor y menorLa prueba de cruzamiento mayor para losaloanticuerpos consiste en probar el plasma del receptor contra los

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gloacutebulos rojos del donante Es incompatible cuando se genera unareaccioacuten hemoliacutetica los eritrocitos del donante se destruyen por losaloanticuerpos del plasma del receptor La prueba menor es una pruebapara los aloanticuerpos del plasma del donante en contra los gloacutebulosrojos del receptor Una incompatibilidad menor es una causa menosfrecuente para causar una reaccioacuten en contra una transfusioacuten porque

el volumen de plasma del donante es menor y es diluido marcadamente enel receptor Para llevar a cabo dicho procedimiento se utilizandiversos reactivos como potencializadores que mejoran la unioacuten deeritrocitos con alguacuten tipo de anticuerpo Uno de esospotencializadores es la albuacutemina La albumina bovina polimerizada esun reactivo muy utilizado en el laboratorio de inmunohematologia y encentros de bancos de sangre funciona como un potencializador quefacilita la reaccion de aglutinacioacuten de eritrocitos sensibilizados Alfinal de la prueba se prueban los eritrocitos con el reactivo deCoombs El principio de la prueba de Coombs fue descrito por Moreschien 1908 pero Coombs Mourant y Race en 1946 la introdujeron en elestudio de los grupos sanguiacuteneos y anticuerpos cuando una parte desangre (suero) fue usada para la inoculacioacuten de animales para

inmunizarlos con proteiacutena humana utilizando el anticuerpo obtenido enla deteccioacuten de los llamados anticuerpos incompletos Esta prueba seusa para determinar la presencia de anticuerpos no aglutinantes en elsuero de sujetos sensibilizados a uno o mas antiacutegenos sanguiacuteneos Esuacutetil en el estudio del suero de mujeres con isoinmunizacioacuten materno-fetal y se emplea tambieacuten en otro tipo de pruebas como identificacioacutende anticuerpos autoinmunes deteccioacuten de algunos sistemas sanguiacuteneos ypruebas de compatibilidad sanguiacutenea La prueba indirecta se realizacon eritrocitos normales incubados in Vitro con el suero de estudioDurante este periodo si existe un anticuerpo este se fija sobre surespectivo determinante antigeacutenico Una vez fijados los eritrocitosson igualmente lavados y se agrega el reactivo de Coombs produciendoaglutinacioacuten Una prueba de Coombs indirecta positiva significa que

existen anticuerpos libres en el suero de la persona los cualespuedan ser igualmente auto-anticuerpos o isoanticuerpos

Objetivo Determinacioacuten de los antiacutegenos del sistema ABO Rh (D) y sucompatibilidad entre un paciente Donador y un Paciente Receptor

Material y equipo

5 Tubos de ensaye

6 Pipetas Pasteur

1Gradilla

1 Bulbo

Papel Parafilm

Microcentriacutefuga

Bantildeo Mariacutea oacute Estufa

Material bioloacutegico

Muestras de sangre de extraccioacuten reciente recogida conanticoagulante o sin anticoagulante

ReactivosSuero de CoombsAlbuacutemina bovina deg

Suero anti-globulina humana Lafon Lote 406 Cad 310109 Color verde Aspecto

transparentedegAlbumina de bovino polimerizada Interbiol Lote APO107 Cad 150109 Color incoloroAspecto transparente

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Teacutecnica

1 Montar prueba mayor 1 y 2 prueba menor 1 y 2 y autotestigocon el procedimiento ya anteriormente conocido

2 Agregar 2 gotas de albuacutemina al 223 Centrifugar 20 segundos4 observar aglutinacioacuten o hemolisis o no aglutinacioacuten5 A los tubos con lecturas negativas incubar 20 minutos en bantildeo

Mariacutea a 37 degC6 Centrifugar y observar

bull Aglutinacioacuten o hemoacutelisis reportar incompatible

bull No aglutinacioacuten llevar a Coombs

7 Lavar tres veces decantar y quitar el exceso de salina congasa y agregar 2 gotas de reactivo de Coombs y centrifugar 20segundos y observar

bull Aglutinacioacuten o hemoacutelisis reportar incompatible

bull No aglutinacioacuten reportar compatible

Resultados1 PRUEBA MAYOR 1 2 Gotas de suero del paciente + 1 gota de GR al 3-5 del

donador 12 PRUEBA MENOR 1 2 Gotas de suero del donador 1 + 1 gota de GR al 3-5 del

paciente3 PRUEBA MAYOR 2 2 Gotas de suero del paciente + 1 gota de GR al 3-5 del

donador 24 PRUEBA MENOR 2 2 Gotas de suero del donador 2 + 1 gota de GR al 3-5 del

paciente5 AUTOTESTIGO 2 Gotas de suero del paciente + 1 gota de GR al 3-5 del paciente

M1 m1 M2 m2 AutotestigoCon albuacutemina - - - - -Despueacutes de incubacioacuten a 37 degC - - - - -Despueacutes de Coombs - - - - -Despueacutes de validacioacuten con gloacutebulos

positivos+ + + + +

InterpretacioacutenPrueba positiva Alutinacioacuten o hemolisis Indica no compatibilidadPrueba negativaNo aglutinacioacuten Indica compatibilidad

Esquemas

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ConclusioacutenConcluyo que la prueba de compatibilidad sanguiacutenea en su modalidad conalbuacutemina bovina ofrece mucha ventaja al ser al igual que otrosreactivos un potencializador de la reaccioacuten antiacutegeno-anticuerpo Estopermite que el operador o realizador de la prueba tenga mayorconfianza y certeza en los resultados que obtenga

PRACTICA No 8PRUEBA DE COMPATIBILIDAD SANGUINEA PRUEBA DE LISS

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FUNDAMENTO

LISS es utilizado para reducir la fuerza ioacutenica del medio

de reaccioacuten en los procedimientos de deteccioacuten eidentificacioacuten de anticuerpos y en las pruebas decompatibilidad La presencia de este reactivo refuerza lainteraccioacuten antiacutegeno - anticuerpo durante la incubacioacuten

GENERALIDADESEl uso de solucioacuten salina de baja fuerza ioacutenica fuedescrito inicialmente en 1964 por Hughes-Jones y col y

Elliot y col pero en ese tiempo su uso era limitado yaque la concentracioacuten molar obtenida provocaba la hemoacutelisisde los eritrocitos suspendidos

En 1974 Low y Messeter describieron el uso rutinario de lasolucioacuten Liss de 003 M que lograba reducir el tiempo deincubacioacuten y no presentaba tendencia a la hemoacutelisis al sersuspendidos en salina a baja fuerza ioacutenica restableciendola presioacuten osmoacutetica de la solucioacuten mediante la adicioacuten deglicinaLas soluciones de baja fuerza ioacutenica son actualmente lasmaacutes utilizadas en inmunohematologiacutea provocando un aumentoen la velocidad de asociacioacuten entre antiacutegenos y anticuerpospermitiendo asiacute acortar el tiempo de incubacioacuten de 60minutos a 10-15 minutos sin sacrificar la sensibilidad delas mismas y sin costos elevadosSe ha observado que lasreacciones antiacutegeno-anticuerpo se ven potenciadas alreducir la fuerza ioacutenica del medio de reaccioacuten

La fuerza ioacutenica es uno de los factores maacutes importantes quedeterminan la tasa y la cantidad de captacioacuten deanticuerpos por parte de los eritrocitos El uso de mediosde reaccioacuten de baja fuerza ioacutenica permite disminuir eltiempo de incubacioacuten y potenciar las reacciones de losanticuerpos sin incrementar las reacciones inespeciacuteficas

Los iones Na+ y Cl- presentes en la solucioacuten salinafisioloacutegica se agrupan alrededor de las moleacuteculas deantiacutegeno y anticuerpo neutralizando sus cargas opuestas locual dificulta la unioacuten entre ellos Este efecto se reduceutilizando soluciones de baja fuerza ioacutenica y disminuyendode esta manera la incubacioacuten de las pruebas

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En esta etapa de sensibilizacioacuten las posibilidades deasociacioacuten pueden incrementarse mediante agitacioacutencentrifugacioacuten yo variacioacuten de la concentracioacuten delanticuerpo

Despueacutes de que el anticuerpo se ha fijado al antiacutegeno loseritrocitos sensibilizados deben unirse para dar lugar a laaglutinacioacuten visible esta red tambieacuten solidifica yestabiliza la reaccioacuten

En esta etapa la reaccioacuten depende de factores como lascaracteriacutesticas del anticuerpo localizacioacuten en la membranay nuacutemero de sitios antigeacutenicos fuerzas que mantienen ladistancia entre los eritrocitos

Las caracteriacutesticas del anticuerpo que deben considerarse

son el tamantildeo del anticuerpo involucrado y el nuacutemero desitios de combinacioacuten con el antiacutegeno Los anticuerpos IgMpueden establecer puentes entre los eritrocitos yaglutinarlos espontaacuteneamente en solucioacuten salina mientrasque los IgG no ya que las IgM pentameacutericas poseen 10sitios de combinacioacuten con el antiacutegeno y las IgG diacutemerossoacutelo dos sitios

Los eritrocitos tienen una carga neta negativa en susuperficie su interaccioacuten con los iones del medio alteraesta carga y producen una carga neta criacutetica denominada

potencial zeta y la reduccioacuten de dicha carga permite quelos eritrocitos se aproximen lo suficiente para que seanaglutinados por medio de los IgG que los sensibilizaron

Las soluciones de baja fuerza ionica empleadas en banco desangre tienen un pH entre 65 ndash 70 se recomienda unaosmolalidad de 270 ndash 305 mosmkg y una conductividad de 37mmcm El control diario implica el examen de su aparienciafiacutesica ausencia de turbidez particulas o sedimento asiacutecomo corroborar la capacidad para generar hemoacutelisiscrenacion o prueba de coombs positiva en eritrocitos

normales Cada lote nuevo se valora mediante el rastreo deun anticuerpo ya sea un anti- D un anti- jk anti- fy oanti- kell diluido se compara su capacidad de deteccioacutencontra un medio salino normal incubando 10min a 37ordmC enLISS debe poder rastrearse un anticuerpo en tanto que enmedio salino no

MATERIAL Y EQUIPO

Material Cantidad10 Tubos de ensayo de 12 x 75

1 Gradilla10 Pipetas pasteur

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1 Bulbo1 Marcador1 Microcentriacutefuga1 Bantildeo Mariacutea

MATERIAL BIOLOGICO

Gloacutebulos rojos lavados al 3 - 5Suero

REACTIVOS

Reactivo de LISSReactivo de Coombs

TECNICA1- Lavar los eritrocitos

Separar el suero del paquete de gloacutebulos rojos

Agregar cierta cantidad de eritrocitos a un tubo deensayo y agregarle solucioacuten salina

Centrifugar y decantar

Repetir este proceso 3 veces

2- Realizar la Prueba de LISS

Enumerar los tubos Poner dos gotas de LISS en cada tubo agregar una gota

de eritrocitos lavados y al 3 - 5 seguacuten el nuacutemero detubo correspondiente

Mezclar y centrifugar un minuto decantar elsobrenadante y con la ayuda de una gasa limpiar elexceso del reactivo

Poner nuevamente 2 gota de LISS resuspender poragitacioacuten agregar 2 gotas de suero problema mezclarincubar 15 minutos a 37ordm C centrifugar 30 seg A 1000

RPM Anotar los resultados

3- A las pruebas negativas realizar Coombs

Lavar 3 veces las ceacutelulas agregar suero de Coombscentrifugar 30 seg

Leer aglutinaciones y anotar resultados

REACTIVOS UTILIZADOS

REACTIVO MARCA FECHA DECADUCIDAD

ASPECTO COLOR LOTE

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SueroAntiglobuina

humana

Lafon 31 01 2009 Transparente Verde 406

LISS Caserorealizado enCMNSIGLOXXI

1 antildeo Transparente Transparente

----------

PACIENTE ASCANIO MENDEZ JOSUE O (+)DONADOR 1 GARCIA CARBAJAL OSCAR O (+)DONADOR 2 GARCIA SUAREZ ORLANDO A (+)

RESULTADOS

INTERPRETACIOacuteN DE LOS RESULTADOS

La hemoacutelisis o la aglutinacioacuten representan un resultado positivo e indican lapresencia de una reaccioacuten antiacutegeno-anticuerpo Los resultados negativos no severa aglutinacioacuten o hemolisis

ESQUEMAS

CONCLUSIONES

Concluyo que la prueba de compatibilidad sanguiacutenea en su modalidad conliss ofrece mucha ventaja al ser al igual que otros reactivos unpotencializador de la reaccioacuten antiacutegeno-anticuerpo Esto permite queel operador o realizador de la prueba tenga mayor confianza y certezaen los resultados que obtenga

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Tubo Resultado

M1 NEGATIVOm1 NEGATIVO

M2 POSITIVO

M2 NEGATIVO

AUTOTES NEGATIVO

29

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PRACTICA 9INMUNOHEMATOLOGIA

DETERMINACION DE COOMBS DIRECTO

INTRODUCCIONPRUEBA DE COOMBS DIRECTA

El examen de Coombs directo se utiliza para detectar autoanticuerpos contralos propios gloacutebulos rojos (GR) de un individuo Es una prueba que sirve parademostrar el revestimiento de los eritrocitos in vivo (mientras los eritrocitosestaacuten circulando en el individuo) La prueba se realiza agregando directamenteel reactivo de Coombs a los eritrocitos previamente lavados para eliminar otras proteiacutenas no fijadas a el una prueba directa positiva significa que larelacioacuten antiacutegeno-anticuerpo ocurrioacute in vivo es decir que la fijacioacuten del

anticuerpo sobre el antiacutegeno se realizo en el organismo del individuo enestudio

Las indicaciones principales de esta prueba son diagnostico de enfermedadeshemoliacuteticas ictericia o anomaliacuteas en la apariencia de los gloacutebulos rojos bajo elmicroscopio ya que estos anticuerpos algunas veces destruyen los gloacutebulosrojos y causan anemia para investigar reacciones en transfusiones Parainvestigar la induccioacuten de drogas en ceacutelulas rojas sensibilizadas medicamentos(por ejemplo quinidina metildopa procainamida y otros) que pueden llevar a la produccioacuten de estos anticuerpos

OBJETIVO Determinar la presencia de anticuerpos en la superficie de losgloacutebulos rojos del individuo

MATERIAL

bull 10 Tubos de 1275

bull 10 Pipetas Pasteur

bull 1 Gradilla

bull 1 Bulbo

bull Papel Parafilm

bull Microcentriacutefuga

bull Bantildeo Mariacutea a 37degC

MUESTRA BIOLOGICA

Eritrocitos lavados de (3-5) del donador o pacienteREACTIVO

Suero de CoombsSuero anti-globulina humana Lafon Lote 406 Cad 310109 Color verde Aspecto transparente

TECNICA

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Colocar en un tubo de ensaye dos gotas de suero de Coombs mas una gota deglobulos rojos (3-5)Centrifugar a 1000 rpm durante 20 segDesprender el boton suavemente y buscar la presencia de aglutinacionRotular y enumerar 8 tubos de ensayes con las diferentes diluciones

(frac12frac1418)Enumerar 8 tubos mas del 1 al 8Agregar a cada tubo de las diluciones 10 gotas de solucion salina mas 10 gotasde suero de CoombsColocar Al primer tubo de la dilucion 1 gota de globulos rojos (3-5) mezclar completamente y agregar al tubo 1Centrifugar todos los tubos a 1000 rpm durante 20 seg

LECTURA

Aglutina- Prueba de Coombs directa es positiva

No aglutina- Prueba de Coombs directa es negativa

ESQUEMAS y RESULTADOS

CONCLUCION

He concluido que la prueba de Coombs directa es una prueba que se utiliza para medir

la presencia de anticuerpos en la superficie de los gloacutebulos rojos que se encuentran

circulando en el paciente y se realiza para investigar reacciones en transfusiones ademaacutes

sirve para la determinacioacuten de anemia hemoliacutetica autoinmune entre otras afecciones

Practica 10

IDENTIFICACION DE ANTICUERPOS IRREGULARES

Fundamento

OBTENIDO DE wwwquimicaclinicauvblogspotcom

DILUCIONES

frac12 positiva

frac14 positiva

18 positiva

116 negativa

132 negativa

164 negativa

1128 negativa1256 negativa

31

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Los anticuerpos del sistema ABO aparecen una vez que elindividuo entra en contacto con el medio ambiente y en elcual se encuentran microorganismos como algunas bacteriascoliformes que contienen sustancias quiacutemicas en suestructura parecidas a las de este sistema Por anticuerpos

regulares debemos identificar a los que existen en todoslos individuos y que eacutestos tendraacuten durante toda su vida

Los anticuerpos irregulares son los que no estaacuten de esamanera aunque en el caso de los naturales no se conoce aciencia cierta queacute o coacutemo se induce su produccioacuten Losadquiridos se conocen tambieacuten como inmunes y son elresultado de la exposicioacuten a antiacutegenos desconocidos por elindividuo al momento de la transfusioacuten o en las mujerespor el embarazo estos anticuerpos son dirigidos contraantiacutegenos de sistemas diferentes al ABO

Los anticuerpos naturales regulares son preferentementeinmunoglobulinas M las cuales fijan de manera taneficiente el complemento que pueden provocar lisisintravascular y ocasionar insuficiencia renal o incluso lamuerte del paciente Los anticuerpos adquiridos o inmunesson generalmente inmunoglobulinas G las cuales producenhemoacutelisis extravascular en el bazo o en el hiacutegado mediantefagocitosis del complejo eritrocito maacutes anticuerpo

Los aloanticuerpos irregulares (adquiridos) maacutes comunes en

nuestra poblacioacuten son los que involucran a los sistemasMNSs P1 Kidd (Jka Jkb) Duffy (Fya Fyb) Kell Lewis yDiego

OBJETIVO identificacioacuten del anticuerpo irregular a traveacutesde las diferentes teacutecnicas

MATERIAL

bull 10 Tubos de ensaye

bull 10 Pipetas Pasteur

bull

1Gradillabull 1 Bulbo

bull Papel Parafim

MATERIAL BIOLOGICO

bull Gloacutebulos rojos lavados al 3 - 5

bull Suero

bull REACTIVOSReactivos

1 Suero de Coombs2 Albuacutemina bovina

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bull EQUIPO1 Microcentriacutefuga2 Bantildeo Mariacutea oacute Estufa

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3 SOLUCION SALINA4 SOLUCION DE LISS

TEacuteCNICA SOLUCION SALINA

Lavar los eritrocitos con solucioacuten salina (3veces)SALINA RAacutePIDA

Agregar una gota de Eritrocitos LavadosDiluiacuterlo al 3-5 con solucioacuten salina 09Agregar 2 gotas de sueroCentrifugar y observar anotar desprendimientodel botoacuten

SALINA 37deg BANtildeO MARIacuteA1) Incubar tubos a Bantildeo mariacutea a 37degC durante 1

hora (o 20 min)

2) Centirfugar despueacutes de haber pasado eltiempo

3) Desprender el botoacuten de eritrocitos yobservar

AGLUTINACIOacuteNndash No es compatibleNO AGLUTINACIOacuteN - Lavar 3 veces

SALINA COOMBS1) Con solucioacuten salina 09 lavar los

eritrocitos de los tubos q no tuvieronaglutinacioacuten 3 veces

2) Decantar y agregar 2 gotas de reactivode Coombs

AGLUTINACIOacuteN ndash No es compatibleNO AGLUTINACIOacuteN - Lavar 3 veces

TECNICA LISS

1 Poner dos gotas de LISS en cada tubo agregar una gotade eritrocitos lavados y al 3 - 5 seguacuten el nuacutemero detubo correspondiente

2 Mezclar y centrifugar un minuto decantar el

sobrenadante y con la ayuda de una gasa limpiar elexceso del reactivo

3 Poner nuevamente 2 gota de LISS resuspender poragitacioacuten agregar 2 gotas de suero problema mezclarincubar 15 minutos a 37ordm C centrifugar 30 seg A 1000RPM

4 Anotar los resultados

A las pruebas negativas realizar Coombs

1 Lavar 3 veces las ceacutelulas agregar suero de Coombs

centrifugar 30 seg2 Leer aglutinaciones y anotar resultados

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TECNICA ALBUMINA BOVINA 8 Agregar 2 gotas de albuacutemina al 229 Centrifugar 20 segundos10observar aglutinacioacuten o hemolisis o no aglutinacioacuten

11A los tubos con lecturas negativas incubar 20minutos en bantildeo Mariacutea a 37 degC12Centrifugar y observar

bull Aglutinacioacuten o hemoacutelisis reportar incompatible

bull No aglutinacioacuten llevar a Coombs

13Lavar tres veces decantar y quitar el exceso desalina con gasa y agregar 2 gotas de reactivo deCoombs y centrifugar 20 segundos y observar

bull Aglutinacioacuten o hemoacutelisis reportar incompatible

bull No aglutinacioacuten reportar compatible

Resultados ANTICUERPO IRREGULAR Anticuerpo c

InterpretacioacutenEstos anticuerpos son generalmente inmunoglobulinas tipo My ocasionalmente tipo G y debido a esa temperatura dereaccioacuten carecen de importancia cliacutenica salvo que sureaccioacuten ocurra tambieacuten a 37 degC su importancia radica enpacientes que seraacuten intervenido a 22 ordmc como es el caso de

operacioacuten de corazoacuten

Los llamados anticuerpos calientes tienen una temperatura oacuteptima dereaccioacuten a 37 degC a Estos anticuerpos tienen una relevanteimportancia cliacutenica ya que se les asocia con reaccionestransfusionales de intensidad moderada a severa que puedenocasionar la muerte

Esquemas

CONCLUSIONHe concluido que es importante determinar los anticuerposirregulares ya que estos anticuerpos tienen una relevanteimportancia cliacutenica ya que se les asocia con reaccionestransfusionales de intensidad moderada a severa

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1 Adicione una gota de una suspensioacuten de eritrocitos bajo prueba del 3-5 en

salina en tubos adecuadamente marcados

2 Adicione dos gotas de anti-H Lectina y mezcle completamente el contenido del

tubo

3 incube durante 5 minutos a temperatura ambiente

4 Centrifugar de 15-30 minutos a 1000 rpm5 Agite suavemente el tubo y resuspenda el botoacuten celular Examine las reacciones

resultantes macroscoacutepicamente Registre resultados

INTERPRETACIOacuteN

PROBLEMA ANTI A1 ANTI H

(ANTI A2)

RESULTADO

SUBGRUPO

PACIENTE 1 + - ANTI A1

PACIENTE 2 - + ANTI A2

bull Prueba positiva Aglutinacioacuten de las ceacutelulas rojas

Nota La hemoacutelisis no debe interpretarse como un resultado positivo ya que esto

puede indetificarse como contaminacioacuten del reactivo

bull Prueba negativa Ausencia de aglutinacioacuten de las ceacutelulas rojas

CONCLUSIONES

Concluyo que para realizar unatransfusioacuten sanguiacutenea se debe tomar encuenta los subgrupos del donante y del

receptor Los subgrupo con mayorfrecuencia y tienen maacutes relevanciacliacutenica los de A que los de B Y seidentifican por medio de utilizarlectinas Los subgrupos A maacutesimportantes son A1 y A2

PRACTICA 3DETERMINACION DE Rh

INTRODUCCIOacuteN

El factor Rh es una clase de proteiacutena que se encuentra enlos gloacutebulos rojos de la sangre cuando alguien tiene esaproteiacutena se le considera ldquoRh Positivordquo Cuando no la tienees ldquoRh Negativordquo El factor Rh es hereditario y setransmite en dos genes El Factor Rh positivo es dominantees decir si una persona tiene un gen positivo y otronegativo su factor Rh seraacute positivo

Esta prueba es importante en el diagnostico y estudio

de la eritroblastosis fetal en la que los gloacutebulosrojos del nintildeo se encuentran sensibilizados con

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anticuerpo materno Es uacutetil tambieacuten en el diagnosticode la anemia hemoliacutetica adquirida (anticuerpos sobrelos gloacutebulo rojos del mismo paciente) asiacute como ladeterminacioacuten de eritrocitos sensibilizados en sangreusados para transfusioacuten

Las dos clasificaciones maacutes importantes para describirgrupos sanguiacuteneos en humanos son los antiacutegenos y el factorRh Las transfusiones de sangre entre grupos incompatiblespueden provocar una reaccioacuten inmunoloacutegica que puededesembocar en hemoacutelisis anemia fallo renal shock omuerte

MATERIAL

bull Tubos de ensayo de 12 x 75

bull Pipetas Pasteur

bull Gradilla

EQUIPO

bull Centrifuga

MUESTRA BIOLOacuteGICA

bull Eritrocitos lavados 3-5 del paciente

REACTIVOS

bull Antisuero Anti-D

bull Suero anti globulina humanabull Suero reactivo control

Antisuero D monoclonal NOVACLONELote NDMG04305CAD 29MAR08Aspecto transparenteColor incoloroSuero anti globulina HumanaLote 405CAD 06-NOV-08Aspecto transparenteColor verde

Reactivo control GAMMA-CLONELote GCM115-3CAD 2008-12-08Aspecto transparenteColor incoloro

TEacuteCNICA

Determinacioacuten de Rh

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bull Prepare una suspensioacuten de gloacutebulos rojos al 3-5 en solucioacuten salina Los gloacutebulos deben serlavados previamente 5 veces con el objeto deeliminar las proteiacutenas del plasma

bull Rotular 3 tubos para la previa identificacioacuten

de Rhbull Ponga 1 gota de la suspensioacuten lavada en cada

tubo

bull Antildeada una gota de anti suero D monoclonal

bull Mezcle y centrifugue 15 seg Y observe si hayaglutinacioacuten

Preparacioacuten del control negativo

bull Ponga una gota de eritrocitos lavados al 3-5

bull Antildeada una gota de reactivo control

bull

Centrifugue 15 seg y observe si hay aglutinacioacuten

Deteccioacuten de sangre Du

Nota esta teacutecnica se le realizo a los tubos problemasque no aglutinaron

bull Los tubos que no tuvieron aglutinacioacuten en ladeterminacioacuten de Rh se incuban 15 min yposteriormente se lavan 3 veces con sol Salina

bull Previamente lavados se le agregan 2 gotas de suerode COOMBS

bull Centrifugar 15 seg y observar desprender boton

ESQUEMAS

RESULTADOS problemas Aglutinacioacuten resultado2 positiva Rh +10 negativa Rh -11 negativa Rh -

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Paciente 2 coacutedigo 021612 plata Lugo JavierPaciente 10 coacutedigo 021620 Hernaacutendez Loacutepez GuillermoPaciente 11 coacutedigo 021621 camarillo Sonia rebeca

INTERPRETACIOacuteNPara el primer meacutetodoAglutinacion Rh positivoNo aglutinacioacuten realizar prueba de deteccioacuten desangre Du

Deteccioacuten de sangre DuAglutinacioacuten D deacutebil (Du positivo)No aglutinacioacuten Rh negativo

CONCLUSIONESCon el descubrimiento del sistema Rh se denominan Rhpositivos los hematiacutees que son aglutinados por esteanticuerpo y tienen por tanto el antiacutegeno Rh en lasuperficie Se denominan Rh negativos los que no sonaglutinados y que por tanto no poseen el antiacutegeno Rh ensu superficie

De la misma manera que en el sistema ABO en el sistema Rh

no se puede transfundir el antiacutegeno Rh a las personas queno lo tienen ya que podriacutea originar la produccioacuten deanticuerpos Rh en el receptor Los sujetos Rh negativossoacutelo podraacuten recibir sangre de donantes Rh negativos

PRACTICA 4INMUNOHEMATOLOGIA

DETERMINACION DE GRUPO SANGUINEO POR TECNICA DE GEL

INTRODUCCION

El sistema utilizado en inmunohematologiacutea para investigar e identificar antiacutegenos y

anticuerpos antieritrocitarios Es de tecnologiacutea de microtipificacioacuten en gel se basa en la

separacioacuten por tamantildeo de los eritrocitos aglutinados durante un proceso de

centrifugacioacuten en un gel poroso

Los eritrocitos van perdiendo elasticidad en sus membranas de forma que los

aglutinados grandes quedan atrapados en la zona superior y los pequentildeos quedan

distribuidos a lo largo de la columna

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Esta teacutecnica nos permite que estandaricemos la lectura de la reaccioacuten antiacutegeno-

anticuerpo con facilidad y repetitividad Asiacute como la estandariza del uso de reactivos

tiempos y lecturas disminuyendo sustancialmente la influencia de la mano de operador

OBJETIVO determinacioacuten de los antigenos del sistema ABORh (D) y determinacion

del grupo serico en tecnica de gel

FUNDAMENTOS

El principio del metdo se basa en la tecnica de gel descrita por Y Lapierre para la

deteccion de las reacciones de aglutinacion de los hematies La aglutinacion se produce

al entar en contacto los eritrocitos con los anticuerpos correspondientes

La tarjeta DG gel es un soporte de plastico constituidos por 8 microtubulos Cada

microtubulo esta formado por una columna y una camara de dispersionincubacion

La tecnologiacutea de microtipificacioacuten en gel se basa en la separacioacuten por tamantildeo de los

eritrocitos aglutinados durante un proceso de centrifugacioacuten en un gel poroso

Los eritrocitos van perdiendo elasticidad en sus membranas de forma que los

aglutinados grandes quedan atrapados en la zona superior y los pequentildeos quedan

distribuidos a lo largo de la columna

MATERIAL

Pipeta automaacutetica 10 ul 50ul 1 ml

Puntas de pipeta desechable Tubos de vidrios

DEG sol

Centrifugas para tarjetas DG gel

Hematies de reactivos para grupo inverso

MUESTRA BIOLOGICACeacutelulas rojas de donador o paciente

REACTIVO

Placa de gelReactivo de gel sol

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TECNICA1- determinacion de los antigenos del sistema ABORh

-preparar una suspension de hematies al 5 de DG sol Asegurar la resuspencion de lso

hematies antes de utilizar

Anadir en cada microtubulos indicados 10 ul de una suspension de hematies al 5

2- determinacion de l grupo serico-homogenizar los hematies recativos A1B

- dispersar el microtubulo N a1 50 ul de hematies reactivos A1 en un microtubulo Nb

50 ul de hematies reactivos B

-antildeadir suero o plasma

3- centrigugar en centrifuga para DG sol

Leer los resultados

RESULTADOS

NEGATIVO - Banda de hematies al fondo de la columna resto de la columna sin

aglutinados

POSITIVO

+- Escasoa glutinados de pequentildeo tamantildea d ela columna

1+ Algunos aglutinados pequentildeso en la columna

2+ aglutinados pequentildeso en la columna o mediano a lo largo de la columna

3+ Banda superior de aglutinado

4+ Banda de aglutinados en la parte superior de la columna

DP Doble poblacion (doble banda de hematies en el fondo y en la parte

superior

INTERPRETACION DE RESULTADOS

GRUPO HEMATICO GRUPO SERICOmicrotubo

Amicrotubo

Bmicrotubo

ABmicrotubo

CTL

MICROTUBUBON+ a1

MICROTUBUBON+ B

ABOGRUPO

0 0 0 0 + + 0+ 0 + 0 0 + A

0 + + 0 + 0 B

+ + + 0 0 0 AB

SISTEMA RhMicrutubo D Micrutubo

DrdquoMicrutuboCTL

INTERPRETACION

+ + 0 D positivo

0 0 0 D negativo

0 + 0

+ 0 0

D deacutebil parcial

RESULTADO E INTERPRETACION DE LA PRACTICA

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Resultado A+

CONCLUSION

Concluyo que esta teacutecnica es una forma de estabilizar las reacciones de aglutinacioacuten y

reducir los resultados falsamente negativos a consecuencia de una teacutecnica inapropiada

asi como crear un meacutetodo de interpretaciones sencillas y constantes

Practica No 5ldquoPrueba de compatibilidadrdquo

Introduccioacuten

Para requerir una oacuteptima transfusioacuten actualmente serequiere de aceptaciones inmunoloacutegicas receptor - donanteya que la transfusioacuten de sangre o la de sus componentescelulares de un donante a un receptor es una forma detransplante

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La prueba de Coombs se usa para determinar la presencia deanticuerpos no aglutinantes en el suero de sujetossensibilizados a uno o mas antiacutegenos sanguiacuteneos Es uacutetil enel estudio del suero de mujeres con isoinmunizacioacutenmaterno-fetal y se emplea tambieacuten en otro tipo de pruebas

como identificacioacuten de anticuerpos autoinmunes deteccioacutende algunos sistemas sanguiacuteneos y pruebas de compatibilidadsanguiacutenea

La prueba indirecta se realiza con eritrocitos normalesincubados in Vitro con el suero de estudio Durante esteperiodo si existe un anticuerpo este se fija sobre surespectivo determinante antigeacutenico Una vez fijados loseritrocitos son igualmente lavados y se agrega el reactivode Coombs produciendo aglutinacioacuten

Una prueba de Coombs indirecta positiva significa queexisten anticuerpos libres en el suero de la persona loscuales puedan ser igualmente auto-anticuerpos oisoanticuerpos

Material y equipo

bull Pipetas automaacuteticas de 10 microl 25 microl 50 microl y 1 ml

bull Puntas de pipetas desechables

bull Tubos de vidrio

bull Incubador para tarjetas DG Gel

bull Centrifuga para tarjetas DG Gel

Material bioloacutegico

bull Hematiacutees reactivo para investigacioacuten e identificacioacuten de anticuerpos irregulares de

Diagnostic Grifols SA

bull Suero de hemoclasificacioacuten

bull Muestras de sangre de extraccioacuten reciente recogida con anticoagulante o sin

anticoagulante

Reactivos

bull Tarjetas DG Gel

bull DG Gel Sol

Reactivos

Tarjetas DG Gel Coombs DG Gel SolRango de temperatura entre 2 y 25 ordmC Rango de temperatura entre 2 y 8ordmCLote 704901 Lote 7003701Cad 2008-03 Cad 2008-06Aspecto transparente Aspecto transparenteColor verde Color incoloro

TeacutecnicaMeacutetodo manual

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1 Dejar atemperar (18-25ordmC) muestras y reactivo2 Inspeccionar el estado de las tarjetas antes de utilizar3 Identificar las tarjetas y muestras a utilizar4 Despegar con precaucioacuten la lamina de metal que cubre los microtubos para prevenir

contaminaciones cruzadas entre ellos

5 Preparar una suspensioacuten con hematiacutees al 1 en DG Gel Sol (10 microl de sedimento oconcentrado de hematiacutees en 1 ml de DG Gel Sol) Utilizar los hematiacutees del donantepara la PC mayor y hematiacutees del receptor para la PC menor Asegurar la suspensioacuten delos hematiacutees antes de utilizar

6 Dispensar en el tubo correspondiente 50 microl de suspensioacuten de los hematiacutees al 1 deldonante (PC mayor) o 50 microl de suspensioacuten de los hematiacutees al 1 del receptor (PCmenor)

7 Antildeadir 25 microl de suero o plasma del receptor (PC mayor) o 25 microl de suero o plasma deldonante (PC menor)

8 Preparar auto control con 50 microl de suspensioacuten de los hematiacutees al 1 del receptor y 25microl de suero o plasma del receptor

9 Incubar 15 minutos a 37 ordmC10 Centrifugar en la centrifuga para tarjetas DG Gel

11 Leer los resultados

InterpretacioacutenNegativo - Banda de hematiacutees en el fondo de la columna resto de la columna sin aglutinados visibles

Positivo +- Escasos aglutinados de pequentildeo tamantildeo en la mitad inferior de la columna

1+ Algunos aglutinados de pequentildeo tamantildeo en la columna

2+ Aglutinados de tamantildeo pequentildeo o mediano a lo largo de la columna

3+ Banda superior de aglutinados de tamantildeo mediano en la mitad superior de la columna

4+ Banda de hematiacutees aglutinados en la parte superior de la columna

DP Doble poblacioacuten (doble banda de hematiacutees en el fondo y en la parte superior de la columna

Resultados

Paciente Lira Cabrera Carlos Alberto (AB+)Donador 1 Orea Valero Erasmo (A+)Donador 2 Moreno Adolfo (O+)

M1 m1 M2 m2 AutocontrolGR de donador 1 +suero del paciente

GR del paciente +suero de donador 1

GR de donador 2 +suero del paciente

GR del paciente +suero de donador 2

GR del paciente +suero del paciente

- + - + -

Por lo antes expuesto se puede deducir que el donador 1 (A+) puede donar eritrocitos al

paciente (AB+) lo mismo que el donador 2 (O+) puede donarle eritrocitos no asiacute plasma por parte de ambos donadores pues la prueba muestra que hubo reaccioacuten en ambas pruebasmenores

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Conclusioacuten

Concluyo que es esencial que toda la sangre sea estudiadaantes de la transfusioacuten para Asegurar que todos losgloacutebulos rojos transfundidos son compatibles con losanticuerpos en el plasma del paciente Evitar estimular laproduccioacuten de nuevos anticuerpos contra los gloacutebulos rojosen el receptor especialmente anti-Rh D

PRAacuteCTICA No 6PRUEBA DE COMPATIBILIDAD SANGIacuteNEA

(Teacutecnica salina)

INTRODUCCIOacuteN

Landsteiner constatoacute que cuando un aglutinoacutegeno se pone

en contacto con la aglutinina homoacuteloga se produce unaaglutinacioacuten

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La compatibilidad sanguiacutenea es la posibilidad de mezclade sangre sin que se produzcan trastornos tales como losfenoacutemenos de la lisis o de la aglutinacioacuten

A causa de este fenoacutemeno bioloacutegico en las transfusiones

de sangre no es suficiente con conocer que la sangre deldonante y la del receptor son del mismo grupo o bien quela del donante pertenezca al grupo O (cero) sino que esnecesario conocer si la compatibilidad es perfecta porqueninguacuten otro fenoacutemeno de inmunizacioacuten interfiera Es eneste sentido por lo que son empleadas las pruebascruzadas

Ademaacutes de los 6 antiacutegenos del sistema ABO en loseritrocitos humanos existen numerosos sistemas deaglutinoacutegenos que contienen muchos antiacutegenos individuales

en los eritrocitos (maacutes de 500000 millones posibles defenotipos de grupos sanguiacuteneos conocidos) Para evitaraccidentes transfusionales es indispensable tener encuenta el sistema Rh ademaacutes del ABO

Del sistema de antiacutegenos Rh es el D el maacutes antigeacutenico yel teacutermino Rh positivo indica que el individuo presentaaglutinoacutegeno D El individuo Rh negativo no tiene antiacutegenoD y forma la aglutinina anti-D en contacto con eacuteste

Las reacciones antiacutegeno-anticuerpo pueden observarse in

vitro por

mdash Hemoacutelisis la unioacuten antiacutegeno-anticuerpo se traduce enlisis de los eritrocitos en presenciadel complemento (siempre que el anticoagulante empleado nocapture losiones Ca y Mg necesarios para la activacioacuten delcomplemento) mdash Aglutinacioacuten los anticuerpos que reaccionan en mediosalino se conocen comoanticuerpos completos o aglutinantes (comuacutenmente tipo

IgM)

OBJETIVO Determinacioacuten de los antigenos del sistema ABORh (D) y su compatibilidad entre un paciente Donador y unPaciente Receptor

MATERIAL5 Tubos de ensaye6 Pipetas Pasteur

1Gradilla1 Bulbo

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EQUIPOMicrocentriacutefugaBantildeo Mariacutea oacute Estufa

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Papel Parafilm

MUESTRA Muestra de sangre con Anticoagulante EDTA

REACTIVOSAntisuero RO-Antiglobulina humana (Poliespeciacutefico Anti IgG C-d) Para prueba de CoombsLABORATORIOS LAFON SA de C VFecha de Caducidad 31-Ene-09Lote 406Hecho en MeacutexicoAspecto TransparenteColor Verde

TEacuteCNICA

Lavar los eritrocitos con solucioacuten salina (3 veces)

SALINA RAacutePIDA1 Agregar una gota de Eritrocitos Lavados2 Diluirlo al 3-5 con solucioacuten salina 093 Agregar 2 gotas de suero4 Centrifugar y observar anotar desprendimiento del botoacuten

SALINA 37deg BANtildeO MARIacuteA

1 Incubar tubos a Bantildeo mariacutea a 37degC durante 1hora (o 20 min)2 Centirfugar despueacutes de haber pasado el

tiempo3 Desprender el botoacuten de eritrocitos y

observarAGLUTINACIOacuteNndash No es compatibleNO AGLUTINACIOacuteN - Lavar 3 veces

SALINA COOMBS

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PRUEBA MAYOR

G Rojos del DONADOR+

Suero del RECEPTOR(paciente)

PRUEBA MENOR

G Rojos del RECEPTOR(paciente)

+Suero del DONADOR

AUTOTESTIGO

G Rojos del RECEPTOR(paciente)

+Suero del RECEPTOR

(paciente)

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1 Con solucioacuten salina 09 lavar loseritrocitos de los tubos q no tuvieronaglutinacioacuten 3 veces

2 Decantar y agregar 2 gotas de reactivode Coombs

AGLUTINACIOacuteN ndash No es compatibleNO AGLUTINACIOacuteN - Lavar 3 veces

RESULTADOS

Paciente Madrigal Meacutendez Luis Eduardo (B+)Folio 009164Fecha301007

Donador 1 Torres Avileacutes Joseacute Ramoacuten (O+)Folio 022604Fecha311007

Donador 2 Rodriacuteguez Nuacutentildeez Joseacute Angel (A+) Folio 022605

Fecha311007

SALINA RAacutePIDA

M1 m1 M2 m2 AutotestigoGR de donador 1+ suero del

paciente

GR del paciente+ suero dedonador 1

GR de donador 2+ suero del

paciente

GR del paciente+ suero dedonador 2

GR del paciente+ suero del

paciente

- 4+ 4+ 4+ -

SALINA 37deg BANtildeO MARIacuteA

M1 m1 M2 m2 Autotestigo- 4+ 4+ 4+ -

Compatible Nocompatible

Nocompatible

Nocompatible

Compatible

SALINA COOMBS

Por lo tanto se puede decir que el donador 1 (O+) puededonar suero al paciente (B+) debido a que en el suero nohay anticuerpos de ninguacuten tipo que reaccionen con losantiacutegenos de los eritrocios del Donador 1 Mientras tantoel Donador 2 no puede donar al Paciente ni suero nieritrocitos

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M1 Autotestigo- -

Compatible

Compatible

21

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INTERPRETACIOacuteN

PRUEBA POSITIVA Existe una aglutinacioacuten de lasceacutelulas sanguiacuteneas que indica la presencia delantiacutegeno A o B En el suero de Coombs notamos si esta

la precencia de Antiacutegeno D en los eritrocitos Lahemoacutelisis no se debe interpretar como resultadopositivo ya que puede indicar contaminacioacuten delreactivo

PRUEBA NEGATIVA La no aglutinacioacuten indica unresultado negativo e indica que las ceacutelulas sonnegativas para Antiacutegenos del sisitema ABO y D

CONCLUSIOacuteN

He concluido que en las transfusiones de sangre no essuficiente con conocer que la sangre del donante y la delreceptor son del mismo grupo o bien que la del donantepertenezca al grupo O (cero) sino que es necesarioconocer si la compatibilidad es perfecta porque ninguacutenotro fenoacutemeno de inmunizacioacuten interfiera Es en estesentido por lo que son empleadas las pruebas cruzadas

Praacutectica No 7ldquoPrueba de compatibilidad sanguiacutenea (teacutecnica albumina)rdquo

IntroduccioacutenLa tipificacioacuten de sangre identifica el tipo sanguiacuteneo determinandoantiacutegenos presentes en los eritrocitos detecta aloanticuerpos encontra esos antiacutegenos Asiacute los aloanticuerpos pueden aparecernaturalmente o ser inducidos y pueden ser dirigidos contra del grupoconocido o a los antiacutegenos de superficie de los eritrocitos La prueba

de compatibilidad sanguiacutenea o cross matching esta formada por laprueba mayor y menorLa prueba de cruzamiento mayor para losaloanticuerpos consiste en probar el plasma del receptor contra los

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gloacutebulos rojos del donante Es incompatible cuando se genera unareaccioacuten hemoliacutetica los eritrocitos del donante se destruyen por losaloanticuerpos del plasma del receptor La prueba menor es una pruebapara los aloanticuerpos del plasma del donante en contra los gloacutebulosrojos del receptor Una incompatibilidad menor es una causa menosfrecuente para causar una reaccioacuten en contra una transfusioacuten porque

el volumen de plasma del donante es menor y es diluido marcadamente enel receptor Para llevar a cabo dicho procedimiento se utilizandiversos reactivos como potencializadores que mejoran la unioacuten deeritrocitos con alguacuten tipo de anticuerpo Uno de esospotencializadores es la albuacutemina La albumina bovina polimerizada esun reactivo muy utilizado en el laboratorio de inmunohematologia y encentros de bancos de sangre funciona como un potencializador quefacilita la reaccion de aglutinacioacuten de eritrocitos sensibilizados Alfinal de la prueba se prueban los eritrocitos con el reactivo deCoombs El principio de la prueba de Coombs fue descrito por Moreschien 1908 pero Coombs Mourant y Race en 1946 la introdujeron en elestudio de los grupos sanguiacuteneos y anticuerpos cuando una parte desangre (suero) fue usada para la inoculacioacuten de animales para

inmunizarlos con proteiacutena humana utilizando el anticuerpo obtenido enla deteccioacuten de los llamados anticuerpos incompletos Esta prueba seusa para determinar la presencia de anticuerpos no aglutinantes en elsuero de sujetos sensibilizados a uno o mas antiacutegenos sanguiacuteneos Esuacutetil en el estudio del suero de mujeres con isoinmunizacioacuten materno-fetal y se emplea tambieacuten en otro tipo de pruebas como identificacioacutende anticuerpos autoinmunes deteccioacuten de algunos sistemas sanguiacuteneos ypruebas de compatibilidad sanguiacutenea La prueba indirecta se realizacon eritrocitos normales incubados in Vitro con el suero de estudioDurante este periodo si existe un anticuerpo este se fija sobre surespectivo determinante antigeacutenico Una vez fijados los eritrocitosson igualmente lavados y se agrega el reactivo de Coombs produciendoaglutinacioacuten Una prueba de Coombs indirecta positiva significa que

existen anticuerpos libres en el suero de la persona los cualespuedan ser igualmente auto-anticuerpos o isoanticuerpos

Objetivo Determinacioacuten de los antiacutegenos del sistema ABO Rh (D) y sucompatibilidad entre un paciente Donador y un Paciente Receptor

Material y equipo

5 Tubos de ensaye

6 Pipetas Pasteur

1Gradilla

1 Bulbo

Papel Parafilm

Microcentriacutefuga

Bantildeo Mariacutea oacute Estufa

Material bioloacutegico

Muestras de sangre de extraccioacuten reciente recogida conanticoagulante o sin anticoagulante

ReactivosSuero de CoombsAlbuacutemina bovina deg

Suero anti-globulina humana Lafon Lote 406 Cad 310109 Color verde Aspecto

transparentedegAlbumina de bovino polimerizada Interbiol Lote APO107 Cad 150109 Color incoloroAspecto transparente

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Teacutecnica

1 Montar prueba mayor 1 y 2 prueba menor 1 y 2 y autotestigocon el procedimiento ya anteriormente conocido

2 Agregar 2 gotas de albuacutemina al 223 Centrifugar 20 segundos4 observar aglutinacioacuten o hemolisis o no aglutinacioacuten5 A los tubos con lecturas negativas incubar 20 minutos en bantildeo

Mariacutea a 37 degC6 Centrifugar y observar

bull Aglutinacioacuten o hemoacutelisis reportar incompatible

bull No aglutinacioacuten llevar a Coombs

7 Lavar tres veces decantar y quitar el exceso de salina congasa y agregar 2 gotas de reactivo de Coombs y centrifugar 20segundos y observar

bull Aglutinacioacuten o hemoacutelisis reportar incompatible

bull No aglutinacioacuten reportar compatible

Resultados1 PRUEBA MAYOR 1 2 Gotas de suero del paciente + 1 gota de GR al 3-5 del

donador 12 PRUEBA MENOR 1 2 Gotas de suero del donador 1 + 1 gota de GR al 3-5 del

paciente3 PRUEBA MAYOR 2 2 Gotas de suero del paciente + 1 gota de GR al 3-5 del

donador 24 PRUEBA MENOR 2 2 Gotas de suero del donador 2 + 1 gota de GR al 3-5 del

paciente5 AUTOTESTIGO 2 Gotas de suero del paciente + 1 gota de GR al 3-5 del paciente

M1 m1 M2 m2 AutotestigoCon albuacutemina - - - - -Despueacutes de incubacioacuten a 37 degC - - - - -Despueacutes de Coombs - - - - -Despueacutes de validacioacuten con gloacutebulos

positivos+ + + + +

InterpretacioacutenPrueba positiva Alutinacioacuten o hemolisis Indica no compatibilidadPrueba negativaNo aglutinacioacuten Indica compatibilidad

Esquemas

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ConclusioacutenConcluyo que la prueba de compatibilidad sanguiacutenea en su modalidad conalbuacutemina bovina ofrece mucha ventaja al ser al igual que otrosreactivos un potencializador de la reaccioacuten antiacutegeno-anticuerpo Estopermite que el operador o realizador de la prueba tenga mayorconfianza y certeza en los resultados que obtenga

PRACTICA No 8PRUEBA DE COMPATIBILIDAD SANGUINEA PRUEBA DE LISS

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FUNDAMENTO

LISS es utilizado para reducir la fuerza ioacutenica del medio

de reaccioacuten en los procedimientos de deteccioacuten eidentificacioacuten de anticuerpos y en las pruebas decompatibilidad La presencia de este reactivo refuerza lainteraccioacuten antiacutegeno - anticuerpo durante la incubacioacuten

GENERALIDADESEl uso de solucioacuten salina de baja fuerza ioacutenica fuedescrito inicialmente en 1964 por Hughes-Jones y col y

Elliot y col pero en ese tiempo su uso era limitado yaque la concentracioacuten molar obtenida provocaba la hemoacutelisisde los eritrocitos suspendidos

En 1974 Low y Messeter describieron el uso rutinario de lasolucioacuten Liss de 003 M que lograba reducir el tiempo deincubacioacuten y no presentaba tendencia a la hemoacutelisis al sersuspendidos en salina a baja fuerza ioacutenica restableciendola presioacuten osmoacutetica de la solucioacuten mediante la adicioacuten deglicinaLas soluciones de baja fuerza ioacutenica son actualmente lasmaacutes utilizadas en inmunohematologiacutea provocando un aumentoen la velocidad de asociacioacuten entre antiacutegenos y anticuerpospermitiendo asiacute acortar el tiempo de incubacioacuten de 60minutos a 10-15 minutos sin sacrificar la sensibilidad delas mismas y sin costos elevadosSe ha observado que lasreacciones antiacutegeno-anticuerpo se ven potenciadas alreducir la fuerza ioacutenica del medio de reaccioacuten

La fuerza ioacutenica es uno de los factores maacutes importantes quedeterminan la tasa y la cantidad de captacioacuten deanticuerpos por parte de los eritrocitos El uso de mediosde reaccioacuten de baja fuerza ioacutenica permite disminuir eltiempo de incubacioacuten y potenciar las reacciones de losanticuerpos sin incrementar las reacciones inespeciacuteficas

Los iones Na+ y Cl- presentes en la solucioacuten salinafisioloacutegica se agrupan alrededor de las moleacuteculas deantiacutegeno y anticuerpo neutralizando sus cargas opuestas locual dificulta la unioacuten entre ellos Este efecto se reduceutilizando soluciones de baja fuerza ioacutenica y disminuyendode esta manera la incubacioacuten de las pruebas

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En esta etapa de sensibilizacioacuten las posibilidades deasociacioacuten pueden incrementarse mediante agitacioacutencentrifugacioacuten yo variacioacuten de la concentracioacuten delanticuerpo

Despueacutes de que el anticuerpo se ha fijado al antiacutegeno loseritrocitos sensibilizados deben unirse para dar lugar a laaglutinacioacuten visible esta red tambieacuten solidifica yestabiliza la reaccioacuten

En esta etapa la reaccioacuten depende de factores como lascaracteriacutesticas del anticuerpo localizacioacuten en la membranay nuacutemero de sitios antigeacutenicos fuerzas que mantienen ladistancia entre los eritrocitos

Las caracteriacutesticas del anticuerpo que deben considerarse

son el tamantildeo del anticuerpo involucrado y el nuacutemero desitios de combinacioacuten con el antiacutegeno Los anticuerpos IgMpueden establecer puentes entre los eritrocitos yaglutinarlos espontaacuteneamente en solucioacuten salina mientrasque los IgG no ya que las IgM pentameacutericas poseen 10sitios de combinacioacuten con el antiacutegeno y las IgG diacutemerossoacutelo dos sitios

Los eritrocitos tienen una carga neta negativa en susuperficie su interaccioacuten con los iones del medio alteraesta carga y producen una carga neta criacutetica denominada

potencial zeta y la reduccioacuten de dicha carga permite quelos eritrocitos se aproximen lo suficiente para que seanaglutinados por medio de los IgG que los sensibilizaron

Las soluciones de baja fuerza ionica empleadas en banco desangre tienen un pH entre 65 ndash 70 se recomienda unaosmolalidad de 270 ndash 305 mosmkg y una conductividad de 37mmcm El control diario implica el examen de su aparienciafiacutesica ausencia de turbidez particulas o sedimento asiacutecomo corroborar la capacidad para generar hemoacutelisiscrenacion o prueba de coombs positiva en eritrocitos

normales Cada lote nuevo se valora mediante el rastreo deun anticuerpo ya sea un anti- D un anti- jk anti- fy oanti- kell diluido se compara su capacidad de deteccioacutencontra un medio salino normal incubando 10min a 37ordmC enLISS debe poder rastrearse un anticuerpo en tanto que enmedio salino no

MATERIAL Y EQUIPO

Material Cantidad10 Tubos de ensayo de 12 x 75

1 Gradilla10 Pipetas pasteur

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1 Bulbo1 Marcador1 Microcentriacutefuga1 Bantildeo Mariacutea

MATERIAL BIOLOGICO

Gloacutebulos rojos lavados al 3 - 5Suero

REACTIVOS

Reactivo de LISSReactivo de Coombs

TECNICA1- Lavar los eritrocitos

Separar el suero del paquete de gloacutebulos rojos

Agregar cierta cantidad de eritrocitos a un tubo deensayo y agregarle solucioacuten salina

Centrifugar y decantar

Repetir este proceso 3 veces

2- Realizar la Prueba de LISS

Enumerar los tubos Poner dos gotas de LISS en cada tubo agregar una gota

de eritrocitos lavados y al 3 - 5 seguacuten el nuacutemero detubo correspondiente

Mezclar y centrifugar un minuto decantar elsobrenadante y con la ayuda de una gasa limpiar elexceso del reactivo

Poner nuevamente 2 gota de LISS resuspender poragitacioacuten agregar 2 gotas de suero problema mezclarincubar 15 minutos a 37ordm C centrifugar 30 seg A 1000

RPM Anotar los resultados

3- A las pruebas negativas realizar Coombs

Lavar 3 veces las ceacutelulas agregar suero de Coombscentrifugar 30 seg

Leer aglutinaciones y anotar resultados

REACTIVOS UTILIZADOS

REACTIVO MARCA FECHA DECADUCIDAD

ASPECTO COLOR LOTE

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SueroAntiglobuina

humana

Lafon 31 01 2009 Transparente Verde 406

LISS Caserorealizado enCMNSIGLOXXI

1 antildeo Transparente Transparente

----------

PACIENTE ASCANIO MENDEZ JOSUE O (+)DONADOR 1 GARCIA CARBAJAL OSCAR O (+)DONADOR 2 GARCIA SUAREZ ORLANDO A (+)

RESULTADOS

INTERPRETACIOacuteN DE LOS RESULTADOS

La hemoacutelisis o la aglutinacioacuten representan un resultado positivo e indican lapresencia de una reaccioacuten antiacutegeno-anticuerpo Los resultados negativos no severa aglutinacioacuten o hemolisis

ESQUEMAS

CONCLUSIONES

Concluyo que la prueba de compatibilidad sanguiacutenea en su modalidad conliss ofrece mucha ventaja al ser al igual que otros reactivos unpotencializador de la reaccioacuten antiacutegeno-anticuerpo Esto permite queel operador o realizador de la prueba tenga mayor confianza y certezaen los resultados que obtenga

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Tubo Resultado

M1 NEGATIVOm1 NEGATIVO

M2 POSITIVO

M2 NEGATIVO

AUTOTES NEGATIVO

29

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PRACTICA 9INMUNOHEMATOLOGIA

DETERMINACION DE COOMBS DIRECTO

INTRODUCCIONPRUEBA DE COOMBS DIRECTA

El examen de Coombs directo se utiliza para detectar autoanticuerpos contralos propios gloacutebulos rojos (GR) de un individuo Es una prueba que sirve parademostrar el revestimiento de los eritrocitos in vivo (mientras los eritrocitosestaacuten circulando en el individuo) La prueba se realiza agregando directamenteel reactivo de Coombs a los eritrocitos previamente lavados para eliminar otras proteiacutenas no fijadas a el una prueba directa positiva significa que larelacioacuten antiacutegeno-anticuerpo ocurrioacute in vivo es decir que la fijacioacuten del

anticuerpo sobre el antiacutegeno se realizo en el organismo del individuo enestudio

Las indicaciones principales de esta prueba son diagnostico de enfermedadeshemoliacuteticas ictericia o anomaliacuteas en la apariencia de los gloacutebulos rojos bajo elmicroscopio ya que estos anticuerpos algunas veces destruyen los gloacutebulosrojos y causan anemia para investigar reacciones en transfusiones Parainvestigar la induccioacuten de drogas en ceacutelulas rojas sensibilizadas medicamentos(por ejemplo quinidina metildopa procainamida y otros) que pueden llevar a la produccioacuten de estos anticuerpos

OBJETIVO Determinar la presencia de anticuerpos en la superficie de losgloacutebulos rojos del individuo

MATERIAL

bull 10 Tubos de 1275

bull 10 Pipetas Pasteur

bull 1 Gradilla

bull 1 Bulbo

bull Papel Parafilm

bull Microcentriacutefuga

bull Bantildeo Mariacutea a 37degC

MUESTRA BIOLOGICA

Eritrocitos lavados de (3-5) del donador o pacienteREACTIVO

Suero de CoombsSuero anti-globulina humana Lafon Lote 406 Cad 310109 Color verde Aspecto transparente

TECNICA

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Colocar en un tubo de ensaye dos gotas de suero de Coombs mas una gota deglobulos rojos (3-5)Centrifugar a 1000 rpm durante 20 segDesprender el boton suavemente y buscar la presencia de aglutinacionRotular y enumerar 8 tubos de ensayes con las diferentes diluciones

(frac12frac1418)Enumerar 8 tubos mas del 1 al 8Agregar a cada tubo de las diluciones 10 gotas de solucion salina mas 10 gotasde suero de CoombsColocar Al primer tubo de la dilucion 1 gota de globulos rojos (3-5) mezclar completamente y agregar al tubo 1Centrifugar todos los tubos a 1000 rpm durante 20 seg

LECTURA

Aglutina- Prueba de Coombs directa es positiva

No aglutina- Prueba de Coombs directa es negativa

ESQUEMAS y RESULTADOS

CONCLUCION

He concluido que la prueba de Coombs directa es una prueba que se utiliza para medir

la presencia de anticuerpos en la superficie de los gloacutebulos rojos que se encuentran

circulando en el paciente y se realiza para investigar reacciones en transfusiones ademaacutes

sirve para la determinacioacuten de anemia hemoliacutetica autoinmune entre otras afecciones

Practica 10

IDENTIFICACION DE ANTICUERPOS IRREGULARES

Fundamento

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DILUCIONES

frac12 positiva

frac14 positiva

18 positiva

116 negativa

132 negativa

164 negativa

1128 negativa1256 negativa

31

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Los anticuerpos del sistema ABO aparecen una vez que elindividuo entra en contacto con el medio ambiente y en elcual se encuentran microorganismos como algunas bacteriascoliformes que contienen sustancias quiacutemicas en suestructura parecidas a las de este sistema Por anticuerpos

regulares debemos identificar a los que existen en todoslos individuos y que eacutestos tendraacuten durante toda su vida

Los anticuerpos irregulares son los que no estaacuten de esamanera aunque en el caso de los naturales no se conoce aciencia cierta queacute o coacutemo se induce su produccioacuten Losadquiridos se conocen tambieacuten como inmunes y son elresultado de la exposicioacuten a antiacutegenos desconocidos por elindividuo al momento de la transfusioacuten o en las mujerespor el embarazo estos anticuerpos son dirigidos contraantiacutegenos de sistemas diferentes al ABO

Los anticuerpos naturales regulares son preferentementeinmunoglobulinas M las cuales fijan de manera taneficiente el complemento que pueden provocar lisisintravascular y ocasionar insuficiencia renal o incluso lamuerte del paciente Los anticuerpos adquiridos o inmunesson generalmente inmunoglobulinas G las cuales producenhemoacutelisis extravascular en el bazo o en el hiacutegado mediantefagocitosis del complejo eritrocito maacutes anticuerpo

Los aloanticuerpos irregulares (adquiridos) maacutes comunes en

nuestra poblacioacuten son los que involucran a los sistemasMNSs P1 Kidd (Jka Jkb) Duffy (Fya Fyb) Kell Lewis yDiego

OBJETIVO identificacioacuten del anticuerpo irregular a traveacutesde las diferentes teacutecnicas

MATERIAL

bull 10 Tubos de ensaye

bull 10 Pipetas Pasteur

bull

1Gradillabull 1 Bulbo

bull Papel Parafim

MATERIAL BIOLOGICO

bull Gloacutebulos rojos lavados al 3 - 5

bull Suero

bull REACTIVOSReactivos

1 Suero de Coombs2 Albuacutemina bovina

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bull EQUIPO1 Microcentriacutefuga2 Bantildeo Mariacutea oacute Estufa

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3 SOLUCION SALINA4 SOLUCION DE LISS

TEacuteCNICA SOLUCION SALINA

Lavar los eritrocitos con solucioacuten salina (3veces)SALINA RAacutePIDA

Agregar una gota de Eritrocitos LavadosDiluiacuterlo al 3-5 con solucioacuten salina 09Agregar 2 gotas de sueroCentrifugar y observar anotar desprendimientodel botoacuten

SALINA 37deg BANtildeO MARIacuteA1) Incubar tubos a Bantildeo mariacutea a 37degC durante 1

hora (o 20 min)

2) Centirfugar despueacutes de haber pasado eltiempo

3) Desprender el botoacuten de eritrocitos yobservar

AGLUTINACIOacuteNndash No es compatibleNO AGLUTINACIOacuteN - Lavar 3 veces

SALINA COOMBS1) Con solucioacuten salina 09 lavar los

eritrocitos de los tubos q no tuvieronaglutinacioacuten 3 veces

2) Decantar y agregar 2 gotas de reactivode Coombs

AGLUTINACIOacuteN ndash No es compatibleNO AGLUTINACIOacuteN - Lavar 3 veces

TECNICA LISS

1 Poner dos gotas de LISS en cada tubo agregar una gotade eritrocitos lavados y al 3 - 5 seguacuten el nuacutemero detubo correspondiente

2 Mezclar y centrifugar un minuto decantar el

sobrenadante y con la ayuda de una gasa limpiar elexceso del reactivo

3 Poner nuevamente 2 gota de LISS resuspender poragitacioacuten agregar 2 gotas de suero problema mezclarincubar 15 minutos a 37ordm C centrifugar 30 seg A 1000RPM

4 Anotar los resultados

A las pruebas negativas realizar Coombs

1 Lavar 3 veces las ceacutelulas agregar suero de Coombs

centrifugar 30 seg2 Leer aglutinaciones y anotar resultados

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TECNICA ALBUMINA BOVINA 8 Agregar 2 gotas de albuacutemina al 229 Centrifugar 20 segundos10observar aglutinacioacuten o hemolisis o no aglutinacioacuten

11A los tubos con lecturas negativas incubar 20minutos en bantildeo Mariacutea a 37 degC12Centrifugar y observar

bull Aglutinacioacuten o hemoacutelisis reportar incompatible

bull No aglutinacioacuten llevar a Coombs

13Lavar tres veces decantar y quitar el exceso desalina con gasa y agregar 2 gotas de reactivo deCoombs y centrifugar 20 segundos y observar

bull Aglutinacioacuten o hemoacutelisis reportar incompatible

bull No aglutinacioacuten reportar compatible

Resultados ANTICUERPO IRREGULAR Anticuerpo c

InterpretacioacutenEstos anticuerpos son generalmente inmunoglobulinas tipo My ocasionalmente tipo G y debido a esa temperatura dereaccioacuten carecen de importancia cliacutenica salvo que sureaccioacuten ocurra tambieacuten a 37 degC su importancia radica enpacientes que seraacuten intervenido a 22 ordmc como es el caso de

operacioacuten de corazoacuten

Los llamados anticuerpos calientes tienen una temperatura oacuteptima dereaccioacuten a 37 degC a Estos anticuerpos tienen una relevanteimportancia cliacutenica ya que se les asocia con reaccionestransfusionales de intensidad moderada a severa que puedenocasionar la muerte

Esquemas

CONCLUSIONHe concluido que es importante determinar los anticuerposirregulares ya que estos anticuerpos tienen una relevanteimportancia cliacutenica ya que se les asocia con reaccionestransfusionales de intensidad moderada a severa

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anticuerpo materno Es uacutetil tambieacuten en el diagnosticode la anemia hemoliacutetica adquirida (anticuerpos sobrelos gloacutebulo rojos del mismo paciente) asiacute como ladeterminacioacuten de eritrocitos sensibilizados en sangreusados para transfusioacuten

Las dos clasificaciones maacutes importantes para describirgrupos sanguiacuteneos en humanos son los antiacutegenos y el factorRh Las transfusiones de sangre entre grupos incompatiblespueden provocar una reaccioacuten inmunoloacutegica que puededesembocar en hemoacutelisis anemia fallo renal shock omuerte

MATERIAL

bull Tubos de ensayo de 12 x 75

bull Pipetas Pasteur

bull Gradilla

EQUIPO

bull Centrifuga

MUESTRA BIOLOacuteGICA

bull Eritrocitos lavados 3-5 del paciente

REACTIVOS

bull Antisuero Anti-D

bull Suero anti globulina humanabull Suero reactivo control

Antisuero D monoclonal NOVACLONELote NDMG04305CAD 29MAR08Aspecto transparenteColor incoloroSuero anti globulina HumanaLote 405CAD 06-NOV-08Aspecto transparenteColor verde

Reactivo control GAMMA-CLONELote GCM115-3CAD 2008-12-08Aspecto transparenteColor incoloro

TEacuteCNICA

Determinacioacuten de Rh

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bull Prepare una suspensioacuten de gloacutebulos rojos al 3-5 en solucioacuten salina Los gloacutebulos deben serlavados previamente 5 veces con el objeto deeliminar las proteiacutenas del plasma

bull Rotular 3 tubos para la previa identificacioacuten

de Rhbull Ponga 1 gota de la suspensioacuten lavada en cada

tubo

bull Antildeada una gota de anti suero D monoclonal

bull Mezcle y centrifugue 15 seg Y observe si hayaglutinacioacuten

Preparacioacuten del control negativo

bull Ponga una gota de eritrocitos lavados al 3-5

bull Antildeada una gota de reactivo control

bull

Centrifugue 15 seg y observe si hay aglutinacioacuten

Deteccioacuten de sangre Du

Nota esta teacutecnica se le realizo a los tubos problemasque no aglutinaron

bull Los tubos que no tuvieron aglutinacioacuten en ladeterminacioacuten de Rh se incuban 15 min yposteriormente se lavan 3 veces con sol Salina

bull Previamente lavados se le agregan 2 gotas de suerode COOMBS

bull Centrifugar 15 seg y observar desprender boton

ESQUEMAS

RESULTADOS problemas Aglutinacioacuten resultado2 positiva Rh +10 negativa Rh -11 negativa Rh -

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Paciente 2 coacutedigo 021612 plata Lugo JavierPaciente 10 coacutedigo 021620 Hernaacutendez Loacutepez GuillermoPaciente 11 coacutedigo 021621 camarillo Sonia rebeca

INTERPRETACIOacuteNPara el primer meacutetodoAglutinacion Rh positivoNo aglutinacioacuten realizar prueba de deteccioacuten desangre Du

Deteccioacuten de sangre DuAglutinacioacuten D deacutebil (Du positivo)No aglutinacioacuten Rh negativo

CONCLUSIONESCon el descubrimiento del sistema Rh se denominan Rhpositivos los hematiacutees que son aglutinados por esteanticuerpo y tienen por tanto el antiacutegeno Rh en lasuperficie Se denominan Rh negativos los que no sonaglutinados y que por tanto no poseen el antiacutegeno Rh ensu superficie

De la misma manera que en el sistema ABO en el sistema Rh

no se puede transfundir el antiacutegeno Rh a las personas queno lo tienen ya que podriacutea originar la produccioacuten deanticuerpos Rh en el receptor Los sujetos Rh negativossoacutelo podraacuten recibir sangre de donantes Rh negativos

PRACTICA 4INMUNOHEMATOLOGIA

DETERMINACION DE GRUPO SANGUINEO POR TECNICA DE GEL

INTRODUCCION

El sistema utilizado en inmunohematologiacutea para investigar e identificar antiacutegenos y

anticuerpos antieritrocitarios Es de tecnologiacutea de microtipificacioacuten en gel se basa en la

separacioacuten por tamantildeo de los eritrocitos aglutinados durante un proceso de

centrifugacioacuten en un gel poroso

Los eritrocitos van perdiendo elasticidad en sus membranas de forma que los

aglutinados grandes quedan atrapados en la zona superior y los pequentildeos quedan

distribuidos a lo largo de la columna

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Esta teacutecnica nos permite que estandaricemos la lectura de la reaccioacuten antiacutegeno-

anticuerpo con facilidad y repetitividad Asiacute como la estandariza del uso de reactivos

tiempos y lecturas disminuyendo sustancialmente la influencia de la mano de operador

OBJETIVO determinacioacuten de los antigenos del sistema ABORh (D) y determinacion

del grupo serico en tecnica de gel

FUNDAMENTOS

El principio del metdo se basa en la tecnica de gel descrita por Y Lapierre para la

deteccion de las reacciones de aglutinacion de los hematies La aglutinacion se produce

al entar en contacto los eritrocitos con los anticuerpos correspondientes

La tarjeta DG gel es un soporte de plastico constituidos por 8 microtubulos Cada

microtubulo esta formado por una columna y una camara de dispersionincubacion

La tecnologiacutea de microtipificacioacuten en gel se basa en la separacioacuten por tamantildeo de los

eritrocitos aglutinados durante un proceso de centrifugacioacuten en un gel poroso

Los eritrocitos van perdiendo elasticidad en sus membranas de forma que los

aglutinados grandes quedan atrapados en la zona superior y los pequentildeos quedan

distribuidos a lo largo de la columna

MATERIAL

Pipeta automaacutetica 10 ul 50ul 1 ml

Puntas de pipeta desechable Tubos de vidrios

DEG sol

Centrifugas para tarjetas DG gel

Hematies de reactivos para grupo inverso

MUESTRA BIOLOGICACeacutelulas rojas de donador o paciente

REACTIVO

Placa de gelReactivo de gel sol

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TECNICA1- determinacion de los antigenos del sistema ABORh

-preparar una suspension de hematies al 5 de DG sol Asegurar la resuspencion de lso

hematies antes de utilizar

Anadir en cada microtubulos indicados 10 ul de una suspension de hematies al 5

2- determinacion de l grupo serico-homogenizar los hematies recativos A1B

- dispersar el microtubulo N a1 50 ul de hematies reactivos A1 en un microtubulo Nb

50 ul de hematies reactivos B

-antildeadir suero o plasma

3- centrigugar en centrifuga para DG sol

Leer los resultados

RESULTADOS

NEGATIVO - Banda de hematies al fondo de la columna resto de la columna sin

aglutinados

POSITIVO

+- Escasoa glutinados de pequentildeo tamantildea d ela columna

1+ Algunos aglutinados pequentildeso en la columna

2+ aglutinados pequentildeso en la columna o mediano a lo largo de la columna

3+ Banda superior de aglutinado

4+ Banda de aglutinados en la parte superior de la columna

DP Doble poblacion (doble banda de hematies en el fondo y en la parte

superior

INTERPRETACION DE RESULTADOS

GRUPO HEMATICO GRUPO SERICOmicrotubo

Amicrotubo

Bmicrotubo

ABmicrotubo

CTL

MICROTUBUBON+ a1

MICROTUBUBON+ B

ABOGRUPO

0 0 0 0 + + 0+ 0 + 0 0 + A

0 + + 0 + 0 B

+ + + 0 0 0 AB

SISTEMA RhMicrutubo D Micrutubo

DrdquoMicrutuboCTL

INTERPRETACION

+ + 0 D positivo

0 0 0 D negativo

0 + 0

+ 0 0

D deacutebil parcial

RESULTADO E INTERPRETACION DE LA PRACTICA

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Resultado A+

CONCLUSION

Concluyo que esta teacutecnica es una forma de estabilizar las reacciones de aglutinacioacuten y

reducir los resultados falsamente negativos a consecuencia de una teacutecnica inapropiada

asi como crear un meacutetodo de interpretaciones sencillas y constantes

Practica No 5ldquoPrueba de compatibilidadrdquo

Introduccioacuten

Para requerir una oacuteptima transfusioacuten actualmente serequiere de aceptaciones inmunoloacutegicas receptor - donanteya que la transfusioacuten de sangre o la de sus componentescelulares de un donante a un receptor es una forma detransplante

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La prueba de Coombs se usa para determinar la presencia deanticuerpos no aglutinantes en el suero de sujetossensibilizados a uno o mas antiacutegenos sanguiacuteneos Es uacutetil enel estudio del suero de mujeres con isoinmunizacioacutenmaterno-fetal y se emplea tambieacuten en otro tipo de pruebas

como identificacioacuten de anticuerpos autoinmunes deteccioacutende algunos sistemas sanguiacuteneos y pruebas de compatibilidadsanguiacutenea

La prueba indirecta se realiza con eritrocitos normalesincubados in Vitro con el suero de estudio Durante esteperiodo si existe un anticuerpo este se fija sobre surespectivo determinante antigeacutenico Una vez fijados loseritrocitos son igualmente lavados y se agrega el reactivode Coombs produciendo aglutinacioacuten

Una prueba de Coombs indirecta positiva significa queexisten anticuerpos libres en el suero de la persona loscuales puedan ser igualmente auto-anticuerpos oisoanticuerpos

Material y equipo

bull Pipetas automaacuteticas de 10 microl 25 microl 50 microl y 1 ml

bull Puntas de pipetas desechables

bull Tubos de vidrio

bull Incubador para tarjetas DG Gel

bull Centrifuga para tarjetas DG Gel

Material bioloacutegico

bull Hematiacutees reactivo para investigacioacuten e identificacioacuten de anticuerpos irregulares de

Diagnostic Grifols SA

bull Suero de hemoclasificacioacuten

bull Muestras de sangre de extraccioacuten reciente recogida con anticoagulante o sin

anticoagulante

Reactivos

bull Tarjetas DG Gel

bull DG Gel Sol

Reactivos

Tarjetas DG Gel Coombs DG Gel SolRango de temperatura entre 2 y 25 ordmC Rango de temperatura entre 2 y 8ordmCLote 704901 Lote 7003701Cad 2008-03 Cad 2008-06Aspecto transparente Aspecto transparenteColor verde Color incoloro

TeacutecnicaMeacutetodo manual

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1 Dejar atemperar (18-25ordmC) muestras y reactivo2 Inspeccionar el estado de las tarjetas antes de utilizar3 Identificar las tarjetas y muestras a utilizar4 Despegar con precaucioacuten la lamina de metal que cubre los microtubos para prevenir

contaminaciones cruzadas entre ellos

5 Preparar una suspensioacuten con hematiacutees al 1 en DG Gel Sol (10 microl de sedimento oconcentrado de hematiacutees en 1 ml de DG Gel Sol) Utilizar los hematiacutees del donantepara la PC mayor y hematiacutees del receptor para la PC menor Asegurar la suspensioacuten delos hematiacutees antes de utilizar

6 Dispensar en el tubo correspondiente 50 microl de suspensioacuten de los hematiacutees al 1 deldonante (PC mayor) o 50 microl de suspensioacuten de los hematiacutees al 1 del receptor (PCmenor)

7 Antildeadir 25 microl de suero o plasma del receptor (PC mayor) o 25 microl de suero o plasma deldonante (PC menor)

8 Preparar auto control con 50 microl de suspensioacuten de los hematiacutees al 1 del receptor y 25microl de suero o plasma del receptor

9 Incubar 15 minutos a 37 ordmC10 Centrifugar en la centrifuga para tarjetas DG Gel

11 Leer los resultados

InterpretacioacutenNegativo - Banda de hematiacutees en el fondo de la columna resto de la columna sin aglutinados visibles

Positivo +- Escasos aglutinados de pequentildeo tamantildeo en la mitad inferior de la columna

1+ Algunos aglutinados de pequentildeo tamantildeo en la columna

2+ Aglutinados de tamantildeo pequentildeo o mediano a lo largo de la columna

3+ Banda superior de aglutinados de tamantildeo mediano en la mitad superior de la columna

4+ Banda de hematiacutees aglutinados en la parte superior de la columna

DP Doble poblacioacuten (doble banda de hematiacutees en el fondo y en la parte superior de la columna

Resultados

Paciente Lira Cabrera Carlos Alberto (AB+)Donador 1 Orea Valero Erasmo (A+)Donador 2 Moreno Adolfo (O+)

M1 m1 M2 m2 AutocontrolGR de donador 1 +suero del paciente

GR del paciente +suero de donador 1

GR de donador 2 +suero del paciente

GR del paciente +suero de donador 2

GR del paciente +suero del paciente

- + - + -

Por lo antes expuesto se puede deducir que el donador 1 (A+) puede donar eritrocitos al

paciente (AB+) lo mismo que el donador 2 (O+) puede donarle eritrocitos no asiacute plasma por parte de ambos donadores pues la prueba muestra que hubo reaccioacuten en ambas pruebasmenores

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Conclusioacuten

Concluyo que es esencial que toda la sangre sea estudiadaantes de la transfusioacuten para Asegurar que todos losgloacutebulos rojos transfundidos son compatibles con losanticuerpos en el plasma del paciente Evitar estimular laproduccioacuten de nuevos anticuerpos contra los gloacutebulos rojosen el receptor especialmente anti-Rh D

PRAacuteCTICA No 6PRUEBA DE COMPATIBILIDAD SANGIacuteNEA

(Teacutecnica salina)

INTRODUCCIOacuteN

Landsteiner constatoacute que cuando un aglutinoacutegeno se pone

en contacto con la aglutinina homoacuteloga se produce unaaglutinacioacuten

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La compatibilidad sanguiacutenea es la posibilidad de mezclade sangre sin que se produzcan trastornos tales como losfenoacutemenos de la lisis o de la aglutinacioacuten

A causa de este fenoacutemeno bioloacutegico en las transfusiones

de sangre no es suficiente con conocer que la sangre deldonante y la del receptor son del mismo grupo o bien quela del donante pertenezca al grupo O (cero) sino que esnecesario conocer si la compatibilidad es perfecta porqueninguacuten otro fenoacutemeno de inmunizacioacuten interfiera Es eneste sentido por lo que son empleadas las pruebascruzadas

Ademaacutes de los 6 antiacutegenos del sistema ABO en loseritrocitos humanos existen numerosos sistemas deaglutinoacutegenos que contienen muchos antiacutegenos individuales

en los eritrocitos (maacutes de 500000 millones posibles defenotipos de grupos sanguiacuteneos conocidos) Para evitaraccidentes transfusionales es indispensable tener encuenta el sistema Rh ademaacutes del ABO

Del sistema de antiacutegenos Rh es el D el maacutes antigeacutenico yel teacutermino Rh positivo indica que el individuo presentaaglutinoacutegeno D El individuo Rh negativo no tiene antiacutegenoD y forma la aglutinina anti-D en contacto con eacuteste

Las reacciones antiacutegeno-anticuerpo pueden observarse in

vitro por

mdash Hemoacutelisis la unioacuten antiacutegeno-anticuerpo se traduce enlisis de los eritrocitos en presenciadel complemento (siempre que el anticoagulante empleado nocapture losiones Ca y Mg necesarios para la activacioacuten delcomplemento) mdash Aglutinacioacuten los anticuerpos que reaccionan en mediosalino se conocen comoanticuerpos completos o aglutinantes (comuacutenmente tipo

IgM)

OBJETIVO Determinacioacuten de los antigenos del sistema ABORh (D) y su compatibilidad entre un paciente Donador y unPaciente Receptor

MATERIAL5 Tubos de ensaye6 Pipetas Pasteur

1Gradilla1 Bulbo

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EQUIPOMicrocentriacutefugaBantildeo Mariacutea oacute Estufa

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Papel Parafilm

MUESTRA Muestra de sangre con Anticoagulante EDTA

REACTIVOSAntisuero RO-Antiglobulina humana (Poliespeciacutefico Anti IgG C-d) Para prueba de CoombsLABORATORIOS LAFON SA de C VFecha de Caducidad 31-Ene-09Lote 406Hecho en MeacutexicoAspecto TransparenteColor Verde

TEacuteCNICA

Lavar los eritrocitos con solucioacuten salina (3 veces)

SALINA RAacutePIDA1 Agregar una gota de Eritrocitos Lavados2 Diluirlo al 3-5 con solucioacuten salina 093 Agregar 2 gotas de suero4 Centrifugar y observar anotar desprendimiento del botoacuten

SALINA 37deg BANtildeO MARIacuteA

1 Incubar tubos a Bantildeo mariacutea a 37degC durante 1hora (o 20 min)2 Centirfugar despueacutes de haber pasado el

tiempo3 Desprender el botoacuten de eritrocitos y

observarAGLUTINACIOacuteNndash No es compatibleNO AGLUTINACIOacuteN - Lavar 3 veces

SALINA COOMBS

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PRUEBA MAYOR

G Rojos del DONADOR+

Suero del RECEPTOR(paciente)

PRUEBA MENOR

G Rojos del RECEPTOR(paciente)

+Suero del DONADOR

AUTOTESTIGO

G Rojos del RECEPTOR(paciente)

+Suero del RECEPTOR

(paciente)

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1 Con solucioacuten salina 09 lavar loseritrocitos de los tubos q no tuvieronaglutinacioacuten 3 veces

2 Decantar y agregar 2 gotas de reactivode Coombs

AGLUTINACIOacuteN ndash No es compatibleNO AGLUTINACIOacuteN - Lavar 3 veces

RESULTADOS

Paciente Madrigal Meacutendez Luis Eduardo (B+)Folio 009164Fecha301007

Donador 1 Torres Avileacutes Joseacute Ramoacuten (O+)Folio 022604Fecha311007

Donador 2 Rodriacuteguez Nuacutentildeez Joseacute Angel (A+) Folio 022605

Fecha311007

SALINA RAacutePIDA

M1 m1 M2 m2 AutotestigoGR de donador 1+ suero del

paciente

GR del paciente+ suero dedonador 1

GR de donador 2+ suero del

paciente

GR del paciente+ suero dedonador 2

GR del paciente+ suero del

paciente

- 4+ 4+ 4+ -

SALINA 37deg BANtildeO MARIacuteA

M1 m1 M2 m2 Autotestigo- 4+ 4+ 4+ -

Compatible Nocompatible

Nocompatible

Nocompatible

Compatible

SALINA COOMBS

Por lo tanto se puede decir que el donador 1 (O+) puededonar suero al paciente (B+) debido a que en el suero nohay anticuerpos de ninguacuten tipo que reaccionen con losantiacutegenos de los eritrocios del Donador 1 Mientras tantoel Donador 2 no puede donar al Paciente ni suero nieritrocitos

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M1 Autotestigo- -

Compatible

Compatible

21

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INTERPRETACIOacuteN

PRUEBA POSITIVA Existe una aglutinacioacuten de lasceacutelulas sanguiacuteneas que indica la presencia delantiacutegeno A o B En el suero de Coombs notamos si esta

la precencia de Antiacutegeno D en los eritrocitos Lahemoacutelisis no se debe interpretar como resultadopositivo ya que puede indicar contaminacioacuten delreactivo

PRUEBA NEGATIVA La no aglutinacioacuten indica unresultado negativo e indica que las ceacutelulas sonnegativas para Antiacutegenos del sisitema ABO y D

CONCLUSIOacuteN

He concluido que en las transfusiones de sangre no essuficiente con conocer que la sangre del donante y la delreceptor son del mismo grupo o bien que la del donantepertenezca al grupo O (cero) sino que es necesarioconocer si la compatibilidad es perfecta porque ninguacutenotro fenoacutemeno de inmunizacioacuten interfiera Es en estesentido por lo que son empleadas las pruebas cruzadas

Praacutectica No 7ldquoPrueba de compatibilidad sanguiacutenea (teacutecnica albumina)rdquo

IntroduccioacutenLa tipificacioacuten de sangre identifica el tipo sanguiacuteneo determinandoantiacutegenos presentes en los eritrocitos detecta aloanticuerpos encontra esos antiacutegenos Asiacute los aloanticuerpos pueden aparecernaturalmente o ser inducidos y pueden ser dirigidos contra del grupoconocido o a los antiacutegenos de superficie de los eritrocitos La prueba

de compatibilidad sanguiacutenea o cross matching esta formada por laprueba mayor y menorLa prueba de cruzamiento mayor para losaloanticuerpos consiste en probar el plasma del receptor contra los

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gloacutebulos rojos del donante Es incompatible cuando se genera unareaccioacuten hemoliacutetica los eritrocitos del donante se destruyen por losaloanticuerpos del plasma del receptor La prueba menor es una pruebapara los aloanticuerpos del plasma del donante en contra los gloacutebulosrojos del receptor Una incompatibilidad menor es una causa menosfrecuente para causar una reaccioacuten en contra una transfusioacuten porque

el volumen de plasma del donante es menor y es diluido marcadamente enel receptor Para llevar a cabo dicho procedimiento se utilizandiversos reactivos como potencializadores que mejoran la unioacuten deeritrocitos con alguacuten tipo de anticuerpo Uno de esospotencializadores es la albuacutemina La albumina bovina polimerizada esun reactivo muy utilizado en el laboratorio de inmunohematologia y encentros de bancos de sangre funciona como un potencializador quefacilita la reaccion de aglutinacioacuten de eritrocitos sensibilizados Alfinal de la prueba se prueban los eritrocitos con el reactivo deCoombs El principio de la prueba de Coombs fue descrito por Moreschien 1908 pero Coombs Mourant y Race en 1946 la introdujeron en elestudio de los grupos sanguiacuteneos y anticuerpos cuando una parte desangre (suero) fue usada para la inoculacioacuten de animales para

inmunizarlos con proteiacutena humana utilizando el anticuerpo obtenido enla deteccioacuten de los llamados anticuerpos incompletos Esta prueba seusa para determinar la presencia de anticuerpos no aglutinantes en elsuero de sujetos sensibilizados a uno o mas antiacutegenos sanguiacuteneos Esuacutetil en el estudio del suero de mujeres con isoinmunizacioacuten materno-fetal y se emplea tambieacuten en otro tipo de pruebas como identificacioacutende anticuerpos autoinmunes deteccioacuten de algunos sistemas sanguiacuteneos ypruebas de compatibilidad sanguiacutenea La prueba indirecta se realizacon eritrocitos normales incubados in Vitro con el suero de estudioDurante este periodo si existe un anticuerpo este se fija sobre surespectivo determinante antigeacutenico Una vez fijados los eritrocitosson igualmente lavados y se agrega el reactivo de Coombs produciendoaglutinacioacuten Una prueba de Coombs indirecta positiva significa que

existen anticuerpos libres en el suero de la persona los cualespuedan ser igualmente auto-anticuerpos o isoanticuerpos

Objetivo Determinacioacuten de los antiacutegenos del sistema ABO Rh (D) y sucompatibilidad entre un paciente Donador y un Paciente Receptor

Material y equipo

5 Tubos de ensaye

6 Pipetas Pasteur

1Gradilla

1 Bulbo

Papel Parafilm

Microcentriacutefuga

Bantildeo Mariacutea oacute Estufa

Material bioloacutegico

Muestras de sangre de extraccioacuten reciente recogida conanticoagulante o sin anticoagulante

ReactivosSuero de CoombsAlbuacutemina bovina deg

Suero anti-globulina humana Lafon Lote 406 Cad 310109 Color verde Aspecto

transparentedegAlbumina de bovino polimerizada Interbiol Lote APO107 Cad 150109 Color incoloroAspecto transparente

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Teacutecnica

1 Montar prueba mayor 1 y 2 prueba menor 1 y 2 y autotestigocon el procedimiento ya anteriormente conocido

2 Agregar 2 gotas de albuacutemina al 223 Centrifugar 20 segundos4 observar aglutinacioacuten o hemolisis o no aglutinacioacuten5 A los tubos con lecturas negativas incubar 20 minutos en bantildeo

Mariacutea a 37 degC6 Centrifugar y observar

bull Aglutinacioacuten o hemoacutelisis reportar incompatible

bull No aglutinacioacuten llevar a Coombs

7 Lavar tres veces decantar y quitar el exceso de salina congasa y agregar 2 gotas de reactivo de Coombs y centrifugar 20segundos y observar

bull Aglutinacioacuten o hemoacutelisis reportar incompatible

bull No aglutinacioacuten reportar compatible

Resultados1 PRUEBA MAYOR 1 2 Gotas de suero del paciente + 1 gota de GR al 3-5 del

donador 12 PRUEBA MENOR 1 2 Gotas de suero del donador 1 + 1 gota de GR al 3-5 del

paciente3 PRUEBA MAYOR 2 2 Gotas de suero del paciente + 1 gota de GR al 3-5 del

donador 24 PRUEBA MENOR 2 2 Gotas de suero del donador 2 + 1 gota de GR al 3-5 del

paciente5 AUTOTESTIGO 2 Gotas de suero del paciente + 1 gota de GR al 3-5 del paciente

M1 m1 M2 m2 AutotestigoCon albuacutemina - - - - -Despueacutes de incubacioacuten a 37 degC - - - - -Despueacutes de Coombs - - - - -Despueacutes de validacioacuten con gloacutebulos

positivos+ + + + +

InterpretacioacutenPrueba positiva Alutinacioacuten o hemolisis Indica no compatibilidadPrueba negativaNo aglutinacioacuten Indica compatibilidad

Esquemas

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ConclusioacutenConcluyo que la prueba de compatibilidad sanguiacutenea en su modalidad conalbuacutemina bovina ofrece mucha ventaja al ser al igual que otrosreactivos un potencializador de la reaccioacuten antiacutegeno-anticuerpo Estopermite que el operador o realizador de la prueba tenga mayorconfianza y certeza en los resultados que obtenga

PRACTICA No 8PRUEBA DE COMPATIBILIDAD SANGUINEA PRUEBA DE LISS

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FUNDAMENTO

LISS es utilizado para reducir la fuerza ioacutenica del medio

de reaccioacuten en los procedimientos de deteccioacuten eidentificacioacuten de anticuerpos y en las pruebas decompatibilidad La presencia de este reactivo refuerza lainteraccioacuten antiacutegeno - anticuerpo durante la incubacioacuten

GENERALIDADESEl uso de solucioacuten salina de baja fuerza ioacutenica fuedescrito inicialmente en 1964 por Hughes-Jones y col y

Elliot y col pero en ese tiempo su uso era limitado yaque la concentracioacuten molar obtenida provocaba la hemoacutelisisde los eritrocitos suspendidos

En 1974 Low y Messeter describieron el uso rutinario de lasolucioacuten Liss de 003 M que lograba reducir el tiempo deincubacioacuten y no presentaba tendencia a la hemoacutelisis al sersuspendidos en salina a baja fuerza ioacutenica restableciendola presioacuten osmoacutetica de la solucioacuten mediante la adicioacuten deglicinaLas soluciones de baja fuerza ioacutenica son actualmente lasmaacutes utilizadas en inmunohematologiacutea provocando un aumentoen la velocidad de asociacioacuten entre antiacutegenos y anticuerpospermitiendo asiacute acortar el tiempo de incubacioacuten de 60minutos a 10-15 minutos sin sacrificar la sensibilidad delas mismas y sin costos elevadosSe ha observado que lasreacciones antiacutegeno-anticuerpo se ven potenciadas alreducir la fuerza ioacutenica del medio de reaccioacuten

La fuerza ioacutenica es uno de los factores maacutes importantes quedeterminan la tasa y la cantidad de captacioacuten deanticuerpos por parte de los eritrocitos El uso de mediosde reaccioacuten de baja fuerza ioacutenica permite disminuir eltiempo de incubacioacuten y potenciar las reacciones de losanticuerpos sin incrementar las reacciones inespeciacuteficas

Los iones Na+ y Cl- presentes en la solucioacuten salinafisioloacutegica se agrupan alrededor de las moleacuteculas deantiacutegeno y anticuerpo neutralizando sus cargas opuestas locual dificulta la unioacuten entre ellos Este efecto se reduceutilizando soluciones de baja fuerza ioacutenica y disminuyendode esta manera la incubacioacuten de las pruebas

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En esta etapa de sensibilizacioacuten las posibilidades deasociacioacuten pueden incrementarse mediante agitacioacutencentrifugacioacuten yo variacioacuten de la concentracioacuten delanticuerpo

Despueacutes de que el anticuerpo se ha fijado al antiacutegeno loseritrocitos sensibilizados deben unirse para dar lugar a laaglutinacioacuten visible esta red tambieacuten solidifica yestabiliza la reaccioacuten

En esta etapa la reaccioacuten depende de factores como lascaracteriacutesticas del anticuerpo localizacioacuten en la membranay nuacutemero de sitios antigeacutenicos fuerzas que mantienen ladistancia entre los eritrocitos

Las caracteriacutesticas del anticuerpo que deben considerarse

son el tamantildeo del anticuerpo involucrado y el nuacutemero desitios de combinacioacuten con el antiacutegeno Los anticuerpos IgMpueden establecer puentes entre los eritrocitos yaglutinarlos espontaacuteneamente en solucioacuten salina mientrasque los IgG no ya que las IgM pentameacutericas poseen 10sitios de combinacioacuten con el antiacutegeno y las IgG diacutemerossoacutelo dos sitios

Los eritrocitos tienen una carga neta negativa en susuperficie su interaccioacuten con los iones del medio alteraesta carga y producen una carga neta criacutetica denominada

potencial zeta y la reduccioacuten de dicha carga permite quelos eritrocitos se aproximen lo suficiente para que seanaglutinados por medio de los IgG que los sensibilizaron

Las soluciones de baja fuerza ionica empleadas en banco desangre tienen un pH entre 65 ndash 70 se recomienda unaosmolalidad de 270 ndash 305 mosmkg y una conductividad de 37mmcm El control diario implica el examen de su aparienciafiacutesica ausencia de turbidez particulas o sedimento asiacutecomo corroborar la capacidad para generar hemoacutelisiscrenacion o prueba de coombs positiva en eritrocitos

normales Cada lote nuevo se valora mediante el rastreo deun anticuerpo ya sea un anti- D un anti- jk anti- fy oanti- kell diluido se compara su capacidad de deteccioacutencontra un medio salino normal incubando 10min a 37ordmC enLISS debe poder rastrearse un anticuerpo en tanto que enmedio salino no

MATERIAL Y EQUIPO

Material Cantidad10 Tubos de ensayo de 12 x 75

1 Gradilla10 Pipetas pasteur

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1 Bulbo1 Marcador1 Microcentriacutefuga1 Bantildeo Mariacutea

MATERIAL BIOLOGICO

Gloacutebulos rojos lavados al 3 - 5Suero

REACTIVOS

Reactivo de LISSReactivo de Coombs

TECNICA1- Lavar los eritrocitos

Separar el suero del paquete de gloacutebulos rojos

Agregar cierta cantidad de eritrocitos a un tubo deensayo y agregarle solucioacuten salina

Centrifugar y decantar

Repetir este proceso 3 veces

2- Realizar la Prueba de LISS

Enumerar los tubos Poner dos gotas de LISS en cada tubo agregar una gota

de eritrocitos lavados y al 3 - 5 seguacuten el nuacutemero detubo correspondiente

Mezclar y centrifugar un minuto decantar elsobrenadante y con la ayuda de una gasa limpiar elexceso del reactivo

Poner nuevamente 2 gota de LISS resuspender poragitacioacuten agregar 2 gotas de suero problema mezclarincubar 15 minutos a 37ordm C centrifugar 30 seg A 1000

RPM Anotar los resultados

3- A las pruebas negativas realizar Coombs

Lavar 3 veces las ceacutelulas agregar suero de Coombscentrifugar 30 seg

Leer aglutinaciones y anotar resultados

REACTIVOS UTILIZADOS

REACTIVO MARCA FECHA DECADUCIDAD

ASPECTO COLOR LOTE

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SueroAntiglobuina

humana

Lafon 31 01 2009 Transparente Verde 406

LISS Caserorealizado enCMNSIGLOXXI

1 antildeo Transparente Transparente

----------

PACIENTE ASCANIO MENDEZ JOSUE O (+)DONADOR 1 GARCIA CARBAJAL OSCAR O (+)DONADOR 2 GARCIA SUAREZ ORLANDO A (+)

RESULTADOS

INTERPRETACIOacuteN DE LOS RESULTADOS

La hemoacutelisis o la aglutinacioacuten representan un resultado positivo e indican lapresencia de una reaccioacuten antiacutegeno-anticuerpo Los resultados negativos no severa aglutinacioacuten o hemolisis

ESQUEMAS

CONCLUSIONES

Concluyo que la prueba de compatibilidad sanguiacutenea en su modalidad conliss ofrece mucha ventaja al ser al igual que otros reactivos unpotencializador de la reaccioacuten antiacutegeno-anticuerpo Esto permite queel operador o realizador de la prueba tenga mayor confianza y certezaen los resultados que obtenga

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Tubo Resultado

M1 NEGATIVOm1 NEGATIVO

M2 POSITIVO

M2 NEGATIVO

AUTOTES NEGATIVO

29

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PRACTICA 9INMUNOHEMATOLOGIA

DETERMINACION DE COOMBS DIRECTO

INTRODUCCIONPRUEBA DE COOMBS DIRECTA

El examen de Coombs directo se utiliza para detectar autoanticuerpos contralos propios gloacutebulos rojos (GR) de un individuo Es una prueba que sirve parademostrar el revestimiento de los eritrocitos in vivo (mientras los eritrocitosestaacuten circulando en el individuo) La prueba se realiza agregando directamenteel reactivo de Coombs a los eritrocitos previamente lavados para eliminar otras proteiacutenas no fijadas a el una prueba directa positiva significa que larelacioacuten antiacutegeno-anticuerpo ocurrioacute in vivo es decir que la fijacioacuten del

anticuerpo sobre el antiacutegeno se realizo en el organismo del individuo enestudio

Las indicaciones principales de esta prueba son diagnostico de enfermedadeshemoliacuteticas ictericia o anomaliacuteas en la apariencia de los gloacutebulos rojos bajo elmicroscopio ya que estos anticuerpos algunas veces destruyen los gloacutebulosrojos y causan anemia para investigar reacciones en transfusiones Parainvestigar la induccioacuten de drogas en ceacutelulas rojas sensibilizadas medicamentos(por ejemplo quinidina metildopa procainamida y otros) que pueden llevar a la produccioacuten de estos anticuerpos

OBJETIVO Determinar la presencia de anticuerpos en la superficie de losgloacutebulos rojos del individuo

MATERIAL

bull 10 Tubos de 1275

bull 10 Pipetas Pasteur

bull 1 Gradilla

bull 1 Bulbo

bull Papel Parafilm

bull Microcentriacutefuga

bull Bantildeo Mariacutea a 37degC

MUESTRA BIOLOGICA

Eritrocitos lavados de (3-5) del donador o pacienteREACTIVO

Suero de CoombsSuero anti-globulina humana Lafon Lote 406 Cad 310109 Color verde Aspecto transparente

TECNICA

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Colocar en un tubo de ensaye dos gotas de suero de Coombs mas una gota deglobulos rojos (3-5)Centrifugar a 1000 rpm durante 20 segDesprender el boton suavemente y buscar la presencia de aglutinacionRotular y enumerar 8 tubos de ensayes con las diferentes diluciones

(frac12frac1418)Enumerar 8 tubos mas del 1 al 8Agregar a cada tubo de las diluciones 10 gotas de solucion salina mas 10 gotasde suero de CoombsColocar Al primer tubo de la dilucion 1 gota de globulos rojos (3-5) mezclar completamente y agregar al tubo 1Centrifugar todos los tubos a 1000 rpm durante 20 seg

LECTURA

Aglutina- Prueba de Coombs directa es positiva

No aglutina- Prueba de Coombs directa es negativa

ESQUEMAS y RESULTADOS

CONCLUCION

He concluido que la prueba de Coombs directa es una prueba que se utiliza para medir

la presencia de anticuerpos en la superficie de los gloacutebulos rojos que se encuentran

circulando en el paciente y se realiza para investigar reacciones en transfusiones ademaacutes

sirve para la determinacioacuten de anemia hemoliacutetica autoinmune entre otras afecciones

Practica 10

IDENTIFICACION DE ANTICUERPOS IRREGULARES

Fundamento

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DILUCIONES

frac12 positiva

frac14 positiva

18 positiva

116 negativa

132 negativa

164 negativa

1128 negativa1256 negativa

31

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Los anticuerpos del sistema ABO aparecen una vez que elindividuo entra en contacto con el medio ambiente y en elcual se encuentran microorganismos como algunas bacteriascoliformes que contienen sustancias quiacutemicas en suestructura parecidas a las de este sistema Por anticuerpos

regulares debemos identificar a los que existen en todoslos individuos y que eacutestos tendraacuten durante toda su vida

Los anticuerpos irregulares son los que no estaacuten de esamanera aunque en el caso de los naturales no se conoce aciencia cierta queacute o coacutemo se induce su produccioacuten Losadquiridos se conocen tambieacuten como inmunes y son elresultado de la exposicioacuten a antiacutegenos desconocidos por elindividuo al momento de la transfusioacuten o en las mujerespor el embarazo estos anticuerpos son dirigidos contraantiacutegenos de sistemas diferentes al ABO

Los anticuerpos naturales regulares son preferentementeinmunoglobulinas M las cuales fijan de manera taneficiente el complemento que pueden provocar lisisintravascular y ocasionar insuficiencia renal o incluso lamuerte del paciente Los anticuerpos adquiridos o inmunesson generalmente inmunoglobulinas G las cuales producenhemoacutelisis extravascular en el bazo o en el hiacutegado mediantefagocitosis del complejo eritrocito maacutes anticuerpo

Los aloanticuerpos irregulares (adquiridos) maacutes comunes en

nuestra poblacioacuten son los que involucran a los sistemasMNSs P1 Kidd (Jka Jkb) Duffy (Fya Fyb) Kell Lewis yDiego

OBJETIVO identificacioacuten del anticuerpo irregular a traveacutesde las diferentes teacutecnicas

MATERIAL

bull 10 Tubos de ensaye

bull 10 Pipetas Pasteur

bull

1Gradillabull 1 Bulbo

bull Papel Parafim

MATERIAL BIOLOGICO

bull Gloacutebulos rojos lavados al 3 - 5

bull Suero

bull REACTIVOSReactivos

1 Suero de Coombs2 Albuacutemina bovina

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bull EQUIPO1 Microcentriacutefuga2 Bantildeo Mariacutea oacute Estufa

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3 SOLUCION SALINA4 SOLUCION DE LISS

TEacuteCNICA SOLUCION SALINA

Lavar los eritrocitos con solucioacuten salina (3veces)SALINA RAacutePIDA

Agregar una gota de Eritrocitos LavadosDiluiacuterlo al 3-5 con solucioacuten salina 09Agregar 2 gotas de sueroCentrifugar y observar anotar desprendimientodel botoacuten

SALINA 37deg BANtildeO MARIacuteA1) Incubar tubos a Bantildeo mariacutea a 37degC durante 1

hora (o 20 min)

2) Centirfugar despueacutes de haber pasado eltiempo

3) Desprender el botoacuten de eritrocitos yobservar

AGLUTINACIOacuteNndash No es compatibleNO AGLUTINACIOacuteN - Lavar 3 veces

SALINA COOMBS1) Con solucioacuten salina 09 lavar los

eritrocitos de los tubos q no tuvieronaglutinacioacuten 3 veces

2) Decantar y agregar 2 gotas de reactivode Coombs

AGLUTINACIOacuteN ndash No es compatibleNO AGLUTINACIOacuteN - Lavar 3 veces

TECNICA LISS

1 Poner dos gotas de LISS en cada tubo agregar una gotade eritrocitos lavados y al 3 - 5 seguacuten el nuacutemero detubo correspondiente

2 Mezclar y centrifugar un minuto decantar el

sobrenadante y con la ayuda de una gasa limpiar elexceso del reactivo

3 Poner nuevamente 2 gota de LISS resuspender poragitacioacuten agregar 2 gotas de suero problema mezclarincubar 15 minutos a 37ordm C centrifugar 30 seg A 1000RPM

4 Anotar los resultados

A las pruebas negativas realizar Coombs

1 Lavar 3 veces las ceacutelulas agregar suero de Coombs

centrifugar 30 seg2 Leer aglutinaciones y anotar resultados

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TECNICA ALBUMINA BOVINA 8 Agregar 2 gotas de albuacutemina al 229 Centrifugar 20 segundos10observar aglutinacioacuten o hemolisis o no aglutinacioacuten

11A los tubos con lecturas negativas incubar 20minutos en bantildeo Mariacutea a 37 degC12Centrifugar y observar

bull Aglutinacioacuten o hemoacutelisis reportar incompatible

bull No aglutinacioacuten llevar a Coombs

13Lavar tres veces decantar y quitar el exceso desalina con gasa y agregar 2 gotas de reactivo deCoombs y centrifugar 20 segundos y observar

bull Aglutinacioacuten o hemoacutelisis reportar incompatible

bull No aglutinacioacuten reportar compatible

Resultados ANTICUERPO IRREGULAR Anticuerpo c

InterpretacioacutenEstos anticuerpos son generalmente inmunoglobulinas tipo My ocasionalmente tipo G y debido a esa temperatura dereaccioacuten carecen de importancia cliacutenica salvo que sureaccioacuten ocurra tambieacuten a 37 degC su importancia radica enpacientes que seraacuten intervenido a 22 ordmc como es el caso de

operacioacuten de corazoacuten

Los llamados anticuerpos calientes tienen una temperatura oacuteptima dereaccioacuten a 37 degC a Estos anticuerpos tienen una relevanteimportancia cliacutenica ya que se les asocia con reaccionestransfusionales de intensidad moderada a severa que puedenocasionar la muerte

Esquemas

CONCLUSIONHe concluido que es importante determinar los anticuerposirregulares ya que estos anticuerpos tienen una relevanteimportancia cliacutenica ya que se les asocia con reaccionestransfusionales de intensidad moderada a severa

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bull Prepare una suspensioacuten de gloacutebulos rojos al 3-5 en solucioacuten salina Los gloacutebulos deben serlavados previamente 5 veces con el objeto deeliminar las proteiacutenas del plasma

bull Rotular 3 tubos para la previa identificacioacuten

de Rhbull Ponga 1 gota de la suspensioacuten lavada en cada

tubo

bull Antildeada una gota de anti suero D monoclonal

bull Mezcle y centrifugue 15 seg Y observe si hayaglutinacioacuten

Preparacioacuten del control negativo

bull Ponga una gota de eritrocitos lavados al 3-5

bull Antildeada una gota de reactivo control

bull

Centrifugue 15 seg y observe si hay aglutinacioacuten

Deteccioacuten de sangre Du

Nota esta teacutecnica se le realizo a los tubos problemasque no aglutinaron

bull Los tubos que no tuvieron aglutinacioacuten en ladeterminacioacuten de Rh se incuban 15 min yposteriormente se lavan 3 veces con sol Salina

bull Previamente lavados se le agregan 2 gotas de suerode COOMBS

bull Centrifugar 15 seg y observar desprender boton

ESQUEMAS

RESULTADOS problemas Aglutinacioacuten resultado2 positiva Rh +10 negativa Rh -11 negativa Rh -

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Paciente 2 coacutedigo 021612 plata Lugo JavierPaciente 10 coacutedigo 021620 Hernaacutendez Loacutepez GuillermoPaciente 11 coacutedigo 021621 camarillo Sonia rebeca

INTERPRETACIOacuteNPara el primer meacutetodoAglutinacion Rh positivoNo aglutinacioacuten realizar prueba de deteccioacuten desangre Du

Deteccioacuten de sangre DuAglutinacioacuten D deacutebil (Du positivo)No aglutinacioacuten Rh negativo

CONCLUSIONESCon el descubrimiento del sistema Rh se denominan Rhpositivos los hematiacutees que son aglutinados por esteanticuerpo y tienen por tanto el antiacutegeno Rh en lasuperficie Se denominan Rh negativos los que no sonaglutinados y que por tanto no poseen el antiacutegeno Rh ensu superficie

De la misma manera que en el sistema ABO en el sistema Rh

no se puede transfundir el antiacutegeno Rh a las personas queno lo tienen ya que podriacutea originar la produccioacuten deanticuerpos Rh en el receptor Los sujetos Rh negativossoacutelo podraacuten recibir sangre de donantes Rh negativos

PRACTICA 4INMUNOHEMATOLOGIA

DETERMINACION DE GRUPO SANGUINEO POR TECNICA DE GEL

INTRODUCCION

El sistema utilizado en inmunohematologiacutea para investigar e identificar antiacutegenos y

anticuerpos antieritrocitarios Es de tecnologiacutea de microtipificacioacuten en gel se basa en la

separacioacuten por tamantildeo de los eritrocitos aglutinados durante un proceso de

centrifugacioacuten en un gel poroso

Los eritrocitos van perdiendo elasticidad en sus membranas de forma que los

aglutinados grandes quedan atrapados en la zona superior y los pequentildeos quedan

distribuidos a lo largo de la columna

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Esta teacutecnica nos permite que estandaricemos la lectura de la reaccioacuten antiacutegeno-

anticuerpo con facilidad y repetitividad Asiacute como la estandariza del uso de reactivos

tiempos y lecturas disminuyendo sustancialmente la influencia de la mano de operador

OBJETIVO determinacioacuten de los antigenos del sistema ABORh (D) y determinacion

del grupo serico en tecnica de gel

FUNDAMENTOS

El principio del metdo se basa en la tecnica de gel descrita por Y Lapierre para la

deteccion de las reacciones de aglutinacion de los hematies La aglutinacion se produce

al entar en contacto los eritrocitos con los anticuerpos correspondientes

La tarjeta DG gel es un soporte de plastico constituidos por 8 microtubulos Cada

microtubulo esta formado por una columna y una camara de dispersionincubacion

La tecnologiacutea de microtipificacioacuten en gel se basa en la separacioacuten por tamantildeo de los

eritrocitos aglutinados durante un proceso de centrifugacioacuten en un gel poroso

Los eritrocitos van perdiendo elasticidad en sus membranas de forma que los

aglutinados grandes quedan atrapados en la zona superior y los pequentildeos quedan

distribuidos a lo largo de la columna

MATERIAL

Pipeta automaacutetica 10 ul 50ul 1 ml

Puntas de pipeta desechable Tubos de vidrios

DEG sol

Centrifugas para tarjetas DG gel

Hematies de reactivos para grupo inverso

MUESTRA BIOLOGICACeacutelulas rojas de donador o paciente

REACTIVO

Placa de gelReactivo de gel sol

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TECNICA1- determinacion de los antigenos del sistema ABORh

-preparar una suspension de hematies al 5 de DG sol Asegurar la resuspencion de lso

hematies antes de utilizar

Anadir en cada microtubulos indicados 10 ul de una suspension de hematies al 5

2- determinacion de l grupo serico-homogenizar los hematies recativos A1B

- dispersar el microtubulo N a1 50 ul de hematies reactivos A1 en un microtubulo Nb

50 ul de hematies reactivos B

-antildeadir suero o plasma

3- centrigugar en centrifuga para DG sol

Leer los resultados

RESULTADOS

NEGATIVO - Banda de hematies al fondo de la columna resto de la columna sin

aglutinados

POSITIVO

+- Escasoa glutinados de pequentildeo tamantildea d ela columna

1+ Algunos aglutinados pequentildeso en la columna

2+ aglutinados pequentildeso en la columna o mediano a lo largo de la columna

3+ Banda superior de aglutinado

4+ Banda de aglutinados en la parte superior de la columna

DP Doble poblacion (doble banda de hematies en el fondo y en la parte

superior

INTERPRETACION DE RESULTADOS

GRUPO HEMATICO GRUPO SERICOmicrotubo

Amicrotubo

Bmicrotubo

ABmicrotubo

CTL

MICROTUBUBON+ a1

MICROTUBUBON+ B

ABOGRUPO

0 0 0 0 + + 0+ 0 + 0 0 + A

0 + + 0 + 0 B

+ + + 0 0 0 AB

SISTEMA RhMicrutubo D Micrutubo

DrdquoMicrutuboCTL

INTERPRETACION

+ + 0 D positivo

0 0 0 D negativo

0 + 0

+ 0 0

D deacutebil parcial

RESULTADO E INTERPRETACION DE LA PRACTICA

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Resultado A+

CONCLUSION

Concluyo que esta teacutecnica es una forma de estabilizar las reacciones de aglutinacioacuten y

reducir los resultados falsamente negativos a consecuencia de una teacutecnica inapropiada

asi como crear un meacutetodo de interpretaciones sencillas y constantes

Practica No 5ldquoPrueba de compatibilidadrdquo

Introduccioacuten

Para requerir una oacuteptima transfusioacuten actualmente serequiere de aceptaciones inmunoloacutegicas receptor - donanteya que la transfusioacuten de sangre o la de sus componentescelulares de un donante a un receptor es una forma detransplante

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La prueba de Coombs se usa para determinar la presencia deanticuerpos no aglutinantes en el suero de sujetossensibilizados a uno o mas antiacutegenos sanguiacuteneos Es uacutetil enel estudio del suero de mujeres con isoinmunizacioacutenmaterno-fetal y se emplea tambieacuten en otro tipo de pruebas

como identificacioacuten de anticuerpos autoinmunes deteccioacutende algunos sistemas sanguiacuteneos y pruebas de compatibilidadsanguiacutenea

La prueba indirecta se realiza con eritrocitos normalesincubados in Vitro con el suero de estudio Durante esteperiodo si existe un anticuerpo este se fija sobre surespectivo determinante antigeacutenico Una vez fijados loseritrocitos son igualmente lavados y se agrega el reactivode Coombs produciendo aglutinacioacuten

Una prueba de Coombs indirecta positiva significa queexisten anticuerpos libres en el suero de la persona loscuales puedan ser igualmente auto-anticuerpos oisoanticuerpos

Material y equipo

bull Pipetas automaacuteticas de 10 microl 25 microl 50 microl y 1 ml

bull Puntas de pipetas desechables

bull Tubos de vidrio

bull Incubador para tarjetas DG Gel

bull Centrifuga para tarjetas DG Gel

Material bioloacutegico

bull Hematiacutees reactivo para investigacioacuten e identificacioacuten de anticuerpos irregulares de

Diagnostic Grifols SA

bull Suero de hemoclasificacioacuten

bull Muestras de sangre de extraccioacuten reciente recogida con anticoagulante o sin

anticoagulante

Reactivos

bull Tarjetas DG Gel

bull DG Gel Sol

Reactivos

Tarjetas DG Gel Coombs DG Gel SolRango de temperatura entre 2 y 25 ordmC Rango de temperatura entre 2 y 8ordmCLote 704901 Lote 7003701Cad 2008-03 Cad 2008-06Aspecto transparente Aspecto transparenteColor verde Color incoloro

TeacutecnicaMeacutetodo manual

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1 Dejar atemperar (18-25ordmC) muestras y reactivo2 Inspeccionar el estado de las tarjetas antes de utilizar3 Identificar las tarjetas y muestras a utilizar4 Despegar con precaucioacuten la lamina de metal que cubre los microtubos para prevenir

contaminaciones cruzadas entre ellos

5 Preparar una suspensioacuten con hematiacutees al 1 en DG Gel Sol (10 microl de sedimento oconcentrado de hematiacutees en 1 ml de DG Gel Sol) Utilizar los hematiacutees del donantepara la PC mayor y hematiacutees del receptor para la PC menor Asegurar la suspensioacuten delos hematiacutees antes de utilizar

6 Dispensar en el tubo correspondiente 50 microl de suspensioacuten de los hematiacutees al 1 deldonante (PC mayor) o 50 microl de suspensioacuten de los hematiacutees al 1 del receptor (PCmenor)

7 Antildeadir 25 microl de suero o plasma del receptor (PC mayor) o 25 microl de suero o plasma deldonante (PC menor)

8 Preparar auto control con 50 microl de suspensioacuten de los hematiacutees al 1 del receptor y 25microl de suero o plasma del receptor

9 Incubar 15 minutos a 37 ordmC10 Centrifugar en la centrifuga para tarjetas DG Gel

11 Leer los resultados

InterpretacioacutenNegativo - Banda de hematiacutees en el fondo de la columna resto de la columna sin aglutinados visibles

Positivo +- Escasos aglutinados de pequentildeo tamantildeo en la mitad inferior de la columna

1+ Algunos aglutinados de pequentildeo tamantildeo en la columna

2+ Aglutinados de tamantildeo pequentildeo o mediano a lo largo de la columna

3+ Banda superior de aglutinados de tamantildeo mediano en la mitad superior de la columna

4+ Banda de hematiacutees aglutinados en la parte superior de la columna

DP Doble poblacioacuten (doble banda de hematiacutees en el fondo y en la parte superior de la columna

Resultados

Paciente Lira Cabrera Carlos Alberto (AB+)Donador 1 Orea Valero Erasmo (A+)Donador 2 Moreno Adolfo (O+)

M1 m1 M2 m2 AutocontrolGR de donador 1 +suero del paciente

GR del paciente +suero de donador 1

GR de donador 2 +suero del paciente

GR del paciente +suero de donador 2

GR del paciente +suero del paciente

- + - + -

Por lo antes expuesto se puede deducir que el donador 1 (A+) puede donar eritrocitos al

paciente (AB+) lo mismo que el donador 2 (O+) puede donarle eritrocitos no asiacute plasma por parte de ambos donadores pues la prueba muestra que hubo reaccioacuten en ambas pruebasmenores

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Conclusioacuten

Concluyo que es esencial que toda la sangre sea estudiadaantes de la transfusioacuten para Asegurar que todos losgloacutebulos rojos transfundidos son compatibles con losanticuerpos en el plasma del paciente Evitar estimular laproduccioacuten de nuevos anticuerpos contra los gloacutebulos rojosen el receptor especialmente anti-Rh D

PRAacuteCTICA No 6PRUEBA DE COMPATIBILIDAD SANGIacuteNEA

(Teacutecnica salina)

INTRODUCCIOacuteN

Landsteiner constatoacute que cuando un aglutinoacutegeno se pone

en contacto con la aglutinina homoacuteloga se produce unaaglutinacioacuten

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La compatibilidad sanguiacutenea es la posibilidad de mezclade sangre sin que se produzcan trastornos tales como losfenoacutemenos de la lisis o de la aglutinacioacuten

A causa de este fenoacutemeno bioloacutegico en las transfusiones

de sangre no es suficiente con conocer que la sangre deldonante y la del receptor son del mismo grupo o bien quela del donante pertenezca al grupo O (cero) sino que esnecesario conocer si la compatibilidad es perfecta porqueninguacuten otro fenoacutemeno de inmunizacioacuten interfiera Es eneste sentido por lo que son empleadas las pruebascruzadas

Ademaacutes de los 6 antiacutegenos del sistema ABO en loseritrocitos humanos existen numerosos sistemas deaglutinoacutegenos que contienen muchos antiacutegenos individuales

en los eritrocitos (maacutes de 500000 millones posibles defenotipos de grupos sanguiacuteneos conocidos) Para evitaraccidentes transfusionales es indispensable tener encuenta el sistema Rh ademaacutes del ABO

Del sistema de antiacutegenos Rh es el D el maacutes antigeacutenico yel teacutermino Rh positivo indica que el individuo presentaaglutinoacutegeno D El individuo Rh negativo no tiene antiacutegenoD y forma la aglutinina anti-D en contacto con eacuteste

Las reacciones antiacutegeno-anticuerpo pueden observarse in

vitro por

mdash Hemoacutelisis la unioacuten antiacutegeno-anticuerpo se traduce enlisis de los eritrocitos en presenciadel complemento (siempre que el anticoagulante empleado nocapture losiones Ca y Mg necesarios para la activacioacuten delcomplemento) mdash Aglutinacioacuten los anticuerpos que reaccionan en mediosalino se conocen comoanticuerpos completos o aglutinantes (comuacutenmente tipo

IgM)

OBJETIVO Determinacioacuten de los antigenos del sistema ABORh (D) y su compatibilidad entre un paciente Donador y unPaciente Receptor

MATERIAL5 Tubos de ensaye6 Pipetas Pasteur

1Gradilla1 Bulbo

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EQUIPOMicrocentriacutefugaBantildeo Mariacutea oacute Estufa

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Papel Parafilm

MUESTRA Muestra de sangre con Anticoagulante EDTA

REACTIVOSAntisuero RO-Antiglobulina humana (Poliespeciacutefico Anti IgG C-d) Para prueba de CoombsLABORATORIOS LAFON SA de C VFecha de Caducidad 31-Ene-09Lote 406Hecho en MeacutexicoAspecto TransparenteColor Verde

TEacuteCNICA

Lavar los eritrocitos con solucioacuten salina (3 veces)

SALINA RAacutePIDA1 Agregar una gota de Eritrocitos Lavados2 Diluirlo al 3-5 con solucioacuten salina 093 Agregar 2 gotas de suero4 Centrifugar y observar anotar desprendimiento del botoacuten

SALINA 37deg BANtildeO MARIacuteA

1 Incubar tubos a Bantildeo mariacutea a 37degC durante 1hora (o 20 min)2 Centirfugar despueacutes de haber pasado el

tiempo3 Desprender el botoacuten de eritrocitos y

observarAGLUTINACIOacuteNndash No es compatibleNO AGLUTINACIOacuteN - Lavar 3 veces

SALINA COOMBS

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PRUEBA MAYOR

G Rojos del DONADOR+

Suero del RECEPTOR(paciente)

PRUEBA MENOR

G Rojos del RECEPTOR(paciente)

+Suero del DONADOR

AUTOTESTIGO

G Rojos del RECEPTOR(paciente)

+Suero del RECEPTOR

(paciente)

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1 Con solucioacuten salina 09 lavar loseritrocitos de los tubos q no tuvieronaglutinacioacuten 3 veces

2 Decantar y agregar 2 gotas de reactivode Coombs

AGLUTINACIOacuteN ndash No es compatibleNO AGLUTINACIOacuteN - Lavar 3 veces

RESULTADOS

Paciente Madrigal Meacutendez Luis Eduardo (B+)Folio 009164Fecha301007

Donador 1 Torres Avileacutes Joseacute Ramoacuten (O+)Folio 022604Fecha311007

Donador 2 Rodriacuteguez Nuacutentildeez Joseacute Angel (A+) Folio 022605

Fecha311007

SALINA RAacutePIDA

M1 m1 M2 m2 AutotestigoGR de donador 1+ suero del

paciente

GR del paciente+ suero dedonador 1

GR de donador 2+ suero del

paciente

GR del paciente+ suero dedonador 2

GR del paciente+ suero del

paciente

- 4+ 4+ 4+ -

SALINA 37deg BANtildeO MARIacuteA

M1 m1 M2 m2 Autotestigo- 4+ 4+ 4+ -

Compatible Nocompatible

Nocompatible

Nocompatible

Compatible

SALINA COOMBS

Por lo tanto se puede decir que el donador 1 (O+) puededonar suero al paciente (B+) debido a que en el suero nohay anticuerpos de ninguacuten tipo que reaccionen con losantiacutegenos de los eritrocios del Donador 1 Mientras tantoel Donador 2 no puede donar al Paciente ni suero nieritrocitos

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M1 Autotestigo- -

Compatible

Compatible

21

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INTERPRETACIOacuteN

PRUEBA POSITIVA Existe una aglutinacioacuten de lasceacutelulas sanguiacuteneas que indica la presencia delantiacutegeno A o B En el suero de Coombs notamos si esta

la precencia de Antiacutegeno D en los eritrocitos Lahemoacutelisis no se debe interpretar como resultadopositivo ya que puede indicar contaminacioacuten delreactivo

PRUEBA NEGATIVA La no aglutinacioacuten indica unresultado negativo e indica que las ceacutelulas sonnegativas para Antiacutegenos del sisitema ABO y D

CONCLUSIOacuteN

He concluido que en las transfusiones de sangre no essuficiente con conocer que la sangre del donante y la delreceptor son del mismo grupo o bien que la del donantepertenezca al grupo O (cero) sino que es necesarioconocer si la compatibilidad es perfecta porque ninguacutenotro fenoacutemeno de inmunizacioacuten interfiera Es en estesentido por lo que son empleadas las pruebas cruzadas

Praacutectica No 7ldquoPrueba de compatibilidad sanguiacutenea (teacutecnica albumina)rdquo

IntroduccioacutenLa tipificacioacuten de sangre identifica el tipo sanguiacuteneo determinandoantiacutegenos presentes en los eritrocitos detecta aloanticuerpos encontra esos antiacutegenos Asiacute los aloanticuerpos pueden aparecernaturalmente o ser inducidos y pueden ser dirigidos contra del grupoconocido o a los antiacutegenos de superficie de los eritrocitos La prueba

de compatibilidad sanguiacutenea o cross matching esta formada por laprueba mayor y menorLa prueba de cruzamiento mayor para losaloanticuerpos consiste en probar el plasma del receptor contra los

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gloacutebulos rojos del donante Es incompatible cuando se genera unareaccioacuten hemoliacutetica los eritrocitos del donante se destruyen por losaloanticuerpos del plasma del receptor La prueba menor es una pruebapara los aloanticuerpos del plasma del donante en contra los gloacutebulosrojos del receptor Una incompatibilidad menor es una causa menosfrecuente para causar una reaccioacuten en contra una transfusioacuten porque

el volumen de plasma del donante es menor y es diluido marcadamente enel receptor Para llevar a cabo dicho procedimiento se utilizandiversos reactivos como potencializadores que mejoran la unioacuten deeritrocitos con alguacuten tipo de anticuerpo Uno de esospotencializadores es la albuacutemina La albumina bovina polimerizada esun reactivo muy utilizado en el laboratorio de inmunohematologia y encentros de bancos de sangre funciona como un potencializador quefacilita la reaccion de aglutinacioacuten de eritrocitos sensibilizados Alfinal de la prueba se prueban los eritrocitos con el reactivo deCoombs El principio de la prueba de Coombs fue descrito por Moreschien 1908 pero Coombs Mourant y Race en 1946 la introdujeron en elestudio de los grupos sanguiacuteneos y anticuerpos cuando una parte desangre (suero) fue usada para la inoculacioacuten de animales para

inmunizarlos con proteiacutena humana utilizando el anticuerpo obtenido enla deteccioacuten de los llamados anticuerpos incompletos Esta prueba seusa para determinar la presencia de anticuerpos no aglutinantes en elsuero de sujetos sensibilizados a uno o mas antiacutegenos sanguiacuteneos Esuacutetil en el estudio del suero de mujeres con isoinmunizacioacuten materno-fetal y se emplea tambieacuten en otro tipo de pruebas como identificacioacutende anticuerpos autoinmunes deteccioacuten de algunos sistemas sanguiacuteneos ypruebas de compatibilidad sanguiacutenea La prueba indirecta se realizacon eritrocitos normales incubados in Vitro con el suero de estudioDurante este periodo si existe un anticuerpo este se fija sobre surespectivo determinante antigeacutenico Una vez fijados los eritrocitosson igualmente lavados y se agrega el reactivo de Coombs produciendoaglutinacioacuten Una prueba de Coombs indirecta positiva significa que

existen anticuerpos libres en el suero de la persona los cualespuedan ser igualmente auto-anticuerpos o isoanticuerpos

Objetivo Determinacioacuten de los antiacutegenos del sistema ABO Rh (D) y sucompatibilidad entre un paciente Donador y un Paciente Receptor

Material y equipo

5 Tubos de ensaye

6 Pipetas Pasteur

1Gradilla

1 Bulbo

Papel Parafilm

Microcentriacutefuga

Bantildeo Mariacutea oacute Estufa

Material bioloacutegico

Muestras de sangre de extraccioacuten reciente recogida conanticoagulante o sin anticoagulante

ReactivosSuero de CoombsAlbuacutemina bovina deg

Suero anti-globulina humana Lafon Lote 406 Cad 310109 Color verde Aspecto

transparentedegAlbumina de bovino polimerizada Interbiol Lote APO107 Cad 150109 Color incoloroAspecto transparente

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Teacutecnica

1 Montar prueba mayor 1 y 2 prueba menor 1 y 2 y autotestigocon el procedimiento ya anteriormente conocido

2 Agregar 2 gotas de albuacutemina al 223 Centrifugar 20 segundos4 observar aglutinacioacuten o hemolisis o no aglutinacioacuten5 A los tubos con lecturas negativas incubar 20 minutos en bantildeo

Mariacutea a 37 degC6 Centrifugar y observar

bull Aglutinacioacuten o hemoacutelisis reportar incompatible

bull No aglutinacioacuten llevar a Coombs

7 Lavar tres veces decantar y quitar el exceso de salina congasa y agregar 2 gotas de reactivo de Coombs y centrifugar 20segundos y observar

bull Aglutinacioacuten o hemoacutelisis reportar incompatible

bull No aglutinacioacuten reportar compatible

Resultados1 PRUEBA MAYOR 1 2 Gotas de suero del paciente + 1 gota de GR al 3-5 del

donador 12 PRUEBA MENOR 1 2 Gotas de suero del donador 1 + 1 gota de GR al 3-5 del

paciente3 PRUEBA MAYOR 2 2 Gotas de suero del paciente + 1 gota de GR al 3-5 del

donador 24 PRUEBA MENOR 2 2 Gotas de suero del donador 2 + 1 gota de GR al 3-5 del

paciente5 AUTOTESTIGO 2 Gotas de suero del paciente + 1 gota de GR al 3-5 del paciente

M1 m1 M2 m2 AutotestigoCon albuacutemina - - - - -Despueacutes de incubacioacuten a 37 degC - - - - -Despueacutes de Coombs - - - - -Despueacutes de validacioacuten con gloacutebulos

positivos+ + + + +

InterpretacioacutenPrueba positiva Alutinacioacuten o hemolisis Indica no compatibilidadPrueba negativaNo aglutinacioacuten Indica compatibilidad

Esquemas

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ConclusioacutenConcluyo que la prueba de compatibilidad sanguiacutenea en su modalidad conalbuacutemina bovina ofrece mucha ventaja al ser al igual que otrosreactivos un potencializador de la reaccioacuten antiacutegeno-anticuerpo Estopermite que el operador o realizador de la prueba tenga mayorconfianza y certeza en los resultados que obtenga

PRACTICA No 8PRUEBA DE COMPATIBILIDAD SANGUINEA PRUEBA DE LISS

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FUNDAMENTO

LISS es utilizado para reducir la fuerza ioacutenica del medio

de reaccioacuten en los procedimientos de deteccioacuten eidentificacioacuten de anticuerpos y en las pruebas decompatibilidad La presencia de este reactivo refuerza lainteraccioacuten antiacutegeno - anticuerpo durante la incubacioacuten

GENERALIDADESEl uso de solucioacuten salina de baja fuerza ioacutenica fuedescrito inicialmente en 1964 por Hughes-Jones y col y

Elliot y col pero en ese tiempo su uso era limitado yaque la concentracioacuten molar obtenida provocaba la hemoacutelisisde los eritrocitos suspendidos

En 1974 Low y Messeter describieron el uso rutinario de lasolucioacuten Liss de 003 M que lograba reducir el tiempo deincubacioacuten y no presentaba tendencia a la hemoacutelisis al sersuspendidos en salina a baja fuerza ioacutenica restableciendola presioacuten osmoacutetica de la solucioacuten mediante la adicioacuten deglicinaLas soluciones de baja fuerza ioacutenica son actualmente lasmaacutes utilizadas en inmunohematologiacutea provocando un aumentoen la velocidad de asociacioacuten entre antiacutegenos y anticuerpospermitiendo asiacute acortar el tiempo de incubacioacuten de 60minutos a 10-15 minutos sin sacrificar la sensibilidad delas mismas y sin costos elevadosSe ha observado que lasreacciones antiacutegeno-anticuerpo se ven potenciadas alreducir la fuerza ioacutenica del medio de reaccioacuten

La fuerza ioacutenica es uno de los factores maacutes importantes quedeterminan la tasa y la cantidad de captacioacuten deanticuerpos por parte de los eritrocitos El uso de mediosde reaccioacuten de baja fuerza ioacutenica permite disminuir eltiempo de incubacioacuten y potenciar las reacciones de losanticuerpos sin incrementar las reacciones inespeciacuteficas

Los iones Na+ y Cl- presentes en la solucioacuten salinafisioloacutegica se agrupan alrededor de las moleacuteculas deantiacutegeno y anticuerpo neutralizando sus cargas opuestas locual dificulta la unioacuten entre ellos Este efecto se reduceutilizando soluciones de baja fuerza ioacutenica y disminuyendode esta manera la incubacioacuten de las pruebas

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En esta etapa de sensibilizacioacuten las posibilidades deasociacioacuten pueden incrementarse mediante agitacioacutencentrifugacioacuten yo variacioacuten de la concentracioacuten delanticuerpo

Despueacutes de que el anticuerpo se ha fijado al antiacutegeno loseritrocitos sensibilizados deben unirse para dar lugar a laaglutinacioacuten visible esta red tambieacuten solidifica yestabiliza la reaccioacuten

En esta etapa la reaccioacuten depende de factores como lascaracteriacutesticas del anticuerpo localizacioacuten en la membranay nuacutemero de sitios antigeacutenicos fuerzas que mantienen ladistancia entre los eritrocitos

Las caracteriacutesticas del anticuerpo que deben considerarse

son el tamantildeo del anticuerpo involucrado y el nuacutemero desitios de combinacioacuten con el antiacutegeno Los anticuerpos IgMpueden establecer puentes entre los eritrocitos yaglutinarlos espontaacuteneamente en solucioacuten salina mientrasque los IgG no ya que las IgM pentameacutericas poseen 10sitios de combinacioacuten con el antiacutegeno y las IgG diacutemerossoacutelo dos sitios

Los eritrocitos tienen una carga neta negativa en susuperficie su interaccioacuten con los iones del medio alteraesta carga y producen una carga neta criacutetica denominada

potencial zeta y la reduccioacuten de dicha carga permite quelos eritrocitos se aproximen lo suficiente para que seanaglutinados por medio de los IgG que los sensibilizaron

Las soluciones de baja fuerza ionica empleadas en banco desangre tienen un pH entre 65 ndash 70 se recomienda unaosmolalidad de 270 ndash 305 mosmkg y una conductividad de 37mmcm El control diario implica el examen de su aparienciafiacutesica ausencia de turbidez particulas o sedimento asiacutecomo corroborar la capacidad para generar hemoacutelisiscrenacion o prueba de coombs positiva en eritrocitos

normales Cada lote nuevo se valora mediante el rastreo deun anticuerpo ya sea un anti- D un anti- jk anti- fy oanti- kell diluido se compara su capacidad de deteccioacutencontra un medio salino normal incubando 10min a 37ordmC enLISS debe poder rastrearse un anticuerpo en tanto que enmedio salino no

MATERIAL Y EQUIPO

Material Cantidad10 Tubos de ensayo de 12 x 75

1 Gradilla10 Pipetas pasteur

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1 Bulbo1 Marcador1 Microcentriacutefuga1 Bantildeo Mariacutea

MATERIAL BIOLOGICO

Gloacutebulos rojos lavados al 3 - 5Suero

REACTIVOS

Reactivo de LISSReactivo de Coombs

TECNICA1- Lavar los eritrocitos

Separar el suero del paquete de gloacutebulos rojos

Agregar cierta cantidad de eritrocitos a un tubo deensayo y agregarle solucioacuten salina

Centrifugar y decantar

Repetir este proceso 3 veces

2- Realizar la Prueba de LISS

Enumerar los tubos Poner dos gotas de LISS en cada tubo agregar una gota

de eritrocitos lavados y al 3 - 5 seguacuten el nuacutemero detubo correspondiente

Mezclar y centrifugar un minuto decantar elsobrenadante y con la ayuda de una gasa limpiar elexceso del reactivo

Poner nuevamente 2 gota de LISS resuspender poragitacioacuten agregar 2 gotas de suero problema mezclarincubar 15 minutos a 37ordm C centrifugar 30 seg A 1000

RPM Anotar los resultados

3- A las pruebas negativas realizar Coombs

Lavar 3 veces las ceacutelulas agregar suero de Coombscentrifugar 30 seg

Leer aglutinaciones y anotar resultados

REACTIVOS UTILIZADOS

REACTIVO MARCA FECHA DECADUCIDAD

ASPECTO COLOR LOTE

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SueroAntiglobuina

humana

Lafon 31 01 2009 Transparente Verde 406

LISS Caserorealizado enCMNSIGLOXXI

1 antildeo Transparente Transparente

----------

PACIENTE ASCANIO MENDEZ JOSUE O (+)DONADOR 1 GARCIA CARBAJAL OSCAR O (+)DONADOR 2 GARCIA SUAREZ ORLANDO A (+)

RESULTADOS

INTERPRETACIOacuteN DE LOS RESULTADOS

La hemoacutelisis o la aglutinacioacuten representan un resultado positivo e indican lapresencia de una reaccioacuten antiacutegeno-anticuerpo Los resultados negativos no severa aglutinacioacuten o hemolisis

ESQUEMAS

CONCLUSIONES

Concluyo que la prueba de compatibilidad sanguiacutenea en su modalidad conliss ofrece mucha ventaja al ser al igual que otros reactivos unpotencializador de la reaccioacuten antiacutegeno-anticuerpo Esto permite queel operador o realizador de la prueba tenga mayor confianza y certezaen los resultados que obtenga

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Tubo Resultado

M1 NEGATIVOm1 NEGATIVO

M2 POSITIVO

M2 NEGATIVO

AUTOTES NEGATIVO

29

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PRACTICA 9INMUNOHEMATOLOGIA

DETERMINACION DE COOMBS DIRECTO

INTRODUCCIONPRUEBA DE COOMBS DIRECTA

El examen de Coombs directo se utiliza para detectar autoanticuerpos contralos propios gloacutebulos rojos (GR) de un individuo Es una prueba que sirve parademostrar el revestimiento de los eritrocitos in vivo (mientras los eritrocitosestaacuten circulando en el individuo) La prueba se realiza agregando directamenteel reactivo de Coombs a los eritrocitos previamente lavados para eliminar otras proteiacutenas no fijadas a el una prueba directa positiva significa que larelacioacuten antiacutegeno-anticuerpo ocurrioacute in vivo es decir que la fijacioacuten del

anticuerpo sobre el antiacutegeno se realizo en el organismo del individuo enestudio

Las indicaciones principales de esta prueba son diagnostico de enfermedadeshemoliacuteticas ictericia o anomaliacuteas en la apariencia de los gloacutebulos rojos bajo elmicroscopio ya que estos anticuerpos algunas veces destruyen los gloacutebulosrojos y causan anemia para investigar reacciones en transfusiones Parainvestigar la induccioacuten de drogas en ceacutelulas rojas sensibilizadas medicamentos(por ejemplo quinidina metildopa procainamida y otros) que pueden llevar a la produccioacuten de estos anticuerpos

OBJETIVO Determinar la presencia de anticuerpos en la superficie de losgloacutebulos rojos del individuo

MATERIAL

bull 10 Tubos de 1275

bull 10 Pipetas Pasteur

bull 1 Gradilla

bull 1 Bulbo

bull Papel Parafilm

bull Microcentriacutefuga

bull Bantildeo Mariacutea a 37degC

MUESTRA BIOLOGICA

Eritrocitos lavados de (3-5) del donador o pacienteREACTIVO

Suero de CoombsSuero anti-globulina humana Lafon Lote 406 Cad 310109 Color verde Aspecto transparente

TECNICA

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Colocar en un tubo de ensaye dos gotas de suero de Coombs mas una gota deglobulos rojos (3-5)Centrifugar a 1000 rpm durante 20 segDesprender el boton suavemente y buscar la presencia de aglutinacionRotular y enumerar 8 tubos de ensayes con las diferentes diluciones

(frac12frac1418)Enumerar 8 tubos mas del 1 al 8Agregar a cada tubo de las diluciones 10 gotas de solucion salina mas 10 gotasde suero de CoombsColocar Al primer tubo de la dilucion 1 gota de globulos rojos (3-5) mezclar completamente y agregar al tubo 1Centrifugar todos los tubos a 1000 rpm durante 20 seg

LECTURA

Aglutina- Prueba de Coombs directa es positiva

No aglutina- Prueba de Coombs directa es negativa

ESQUEMAS y RESULTADOS

CONCLUCION

He concluido que la prueba de Coombs directa es una prueba que se utiliza para medir

la presencia de anticuerpos en la superficie de los gloacutebulos rojos que se encuentran

circulando en el paciente y se realiza para investigar reacciones en transfusiones ademaacutes

sirve para la determinacioacuten de anemia hemoliacutetica autoinmune entre otras afecciones

Practica 10

IDENTIFICACION DE ANTICUERPOS IRREGULARES

Fundamento

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DILUCIONES

frac12 positiva

frac14 positiva

18 positiva

116 negativa

132 negativa

164 negativa

1128 negativa1256 negativa

31

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Los anticuerpos del sistema ABO aparecen una vez que elindividuo entra en contacto con el medio ambiente y en elcual se encuentran microorganismos como algunas bacteriascoliformes que contienen sustancias quiacutemicas en suestructura parecidas a las de este sistema Por anticuerpos

regulares debemos identificar a los que existen en todoslos individuos y que eacutestos tendraacuten durante toda su vida

Los anticuerpos irregulares son los que no estaacuten de esamanera aunque en el caso de los naturales no se conoce aciencia cierta queacute o coacutemo se induce su produccioacuten Losadquiridos se conocen tambieacuten como inmunes y son elresultado de la exposicioacuten a antiacutegenos desconocidos por elindividuo al momento de la transfusioacuten o en las mujerespor el embarazo estos anticuerpos son dirigidos contraantiacutegenos de sistemas diferentes al ABO

Los anticuerpos naturales regulares son preferentementeinmunoglobulinas M las cuales fijan de manera taneficiente el complemento que pueden provocar lisisintravascular y ocasionar insuficiencia renal o incluso lamuerte del paciente Los anticuerpos adquiridos o inmunesson generalmente inmunoglobulinas G las cuales producenhemoacutelisis extravascular en el bazo o en el hiacutegado mediantefagocitosis del complejo eritrocito maacutes anticuerpo

Los aloanticuerpos irregulares (adquiridos) maacutes comunes en

nuestra poblacioacuten son los que involucran a los sistemasMNSs P1 Kidd (Jka Jkb) Duffy (Fya Fyb) Kell Lewis yDiego

OBJETIVO identificacioacuten del anticuerpo irregular a traveacutesde las diferentes teacutecnicas

MATERIAL

bull 10 Tubos de ensaye

bull 10 Pipetas Pasteur

bull

1Gradillabull 1 Bulbo

bull Papel Parafim

MATERIAL BIOLOGICO

bull Gloacutebulos rojos lavados al 3 - 5

bull Suero

bull REACTIVOSReactivos

1 Suero de Coombs2 Albuacutemina bovina

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bull EQUIPO1 Microcentriacutefuga2 Bantildeo Mariacutea oacute Estufa

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3 SOLUCION SALINA4 SOLUCION DE LISS

TEacuteCNICA SOLUCION SALINA

Lavar los eritrocitos con solucioacuten salina (3veces)SALINA RAacutePIDA

Agregar una gota de Eritrocitos LavadosDiluiacuterlo al 3-5 con solucioacuten salina 09Agregar 2 gotas de sueroCentrifugar y observar anotar desprendimientodel botoacuten

SALINA 37deg BANtildeO MARIacuteA1) Incubar tubos a Bantildeo mariacutea a 37degC durante 1

hora (o 20 min)

2) Centirfugar despueacutes de haber pasado eltiempo

3) Desprender el botoacuten de eritrocitos yobservar

AGLUTINACIOacuteNndash No es compatibleNO AGLUTINACIOacuteN - Lavar 3 veces

SALINA COOMBS1) Con solucioacuten salina 09 lavar los

eritrocitos de los tubos q no tuvieronaglutinacioacuten 3 veces

2) Decantar y agregar 2 gotas de reactivode Coombs

AGLUTINACIOacuteN ndash No es compatibleNO AGLUTINACIOacuteN - Lavar 3 veces

TECNICA LISS

1 Poner dos gotas de LISS en cada tubo agregar una gotade eritrocitos lavados y al 3 - 5 seguacuten el nuacutemero detubo correspondiente

2 Mezclar y centrifugar un minuto decantar el

sobrenadante y con la ayuda de una gasa limpiar elexceso del reactivo

3 Poner nuevamente 2 gota de LISS resuspender poragitacioacuten agregar 2 gotas de suero problema mezclarincubar 15 minutos a 37ordm C centrifugar 30 seg A 1000RPM

4 Anotar los resultados

A las pruebas negativas realizar Coombs

1 Lavar 3 veces las ceacutelulas agregar suero de Coombs

centrifugar 30 seg2 Leer aglutinaciones y anotar resultados

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TECNICA ALBUMINA BOVINA 8 Agregar 2 gotas de albuacutemina al 229 Centrifugar 20 segundos10observar aglutinacioacuten o hemolisis o no aglutinacioacuten

11A los tubos con lecturas negativas incubar 20minutos en bantildeo Mariacutea a 37 degC12Centrifugar y observar

bull Aglutinacioacuten o hemoacutelisis reportar incompatible

bull No aglutinacioacuten llevar a Coombs

13Lavar tres veces decantar y quitar el exceso desalina con gasa y agregar 2 gotas de reactivo deCoombs y centrifugar 20 segundos y observar

bull Aglutinacioacuten o hemoacutelisis reportar incompatible

bull No aglutinacioacuten reportar compatible

Resultados ANTICUERPO IRREGULAR Anticuerpo c

InterpretacioacutenEstos anticuerpos son generalmente inmunoglobulinas tipo My ocasionalmente tipo G y debido a esa temperatura dereaccioacuten carecen de importancia cliacutenica salvo que sureaccioacuten ocurra tambieacuten a 37 degC su importancia radica enpacientes que seraacuten intervenido a 22 ordmc como es el caso de

operacioacuten de corazoacuten

Los llamados anticuerpos calientes tienen una temperatura oacuteptima dereaccioacuten a 37 degC a Estos anticuerpos tienen una relevanteimportancia cliacutenica ya que se les asocia con reaccionestransfusionales de intensidad moderada a severa que puedenocasionar la muerte

Esquemas

CONCLUSIONHe concluido que es importante determinar los anticuerposirregulares ya que estos anticuerpos tienen una relevanteimportancia cliacutenica ya que se les asocia con reaccionestransfusionales de intensidad moderada a severa

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Paciente 2 coacutedigo 021612 plata Lugo JavierPaciente 10 coacutedigo 021620 Hernaacutendez Loacutepez GuillermoPaciente 11 coacutedigo 021621 camarillo Sonia rebeca

INTERPRETACIOacuteNPara el primer meacutetodoAglutinacion Rh positivoNo aglutinacioacuten realizar prueba de deteccioacuten desangre Du

Deteccioacuten de sangre DuAglutinacioacuten D deacutebil (Du positivo)No aglutinacioacuten Rh negativo

CONCLUSIONESCon el descubrimiento del sistema Rh se denominan Rhpositivos los hematiacutees que son aglutinados por esteanticuerpo y tienen por tanto el antiacutegeno Rh en lasuperficie Se denominan Rh negativos los que no sonaglutinados y que por tanto no poseen el antiacutegeno Rh ensu superficie

De la misma manera que en el sistema ABO en el sistema Rh

no se puede transfundir el antiacutegeno Rh a las personas queno lo tienen ya que podriacutea originar la produccioacuten deanticuerpos Rh en el receptor Los sujetos Rh negativossoacutelo podraacuten recibir sangre de donantes Rh negativos

PRACTICA 4INMUNOHEMATOLOGIA

DETERMINACION DE GRUPO SANGUINEO POR TECNICA DE GEL

INTRODUCCION

El sistema utilizado en inmunohematologiacutea para investigar e identificar antiacutegenos y

anticuerpos antieritrocitarios Es de tecnologiacutea de microtipificacioacuten en gel se basa en la

separacioacuten por tamantildeo de los eritrocitos aglutinados durante un proceso de

centrifugacioacuten en un gel poroso

Los eritrocitos van perdiendo elasticidad en sus membranas de forma que los

aglutinados grandes quedan atrapados en la zona superior y los pequentildeos quedan

distribuidos a lo largo de la columna

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Esta teacutecnica nos permite que estandaricemos la lectura de la reaccioacuten antiacutegeno-

anticuerpo con facilidad y repetitividad Asiacute como la estandariza del uso de reactivos

tiempos y lecturas disminuyendo sustancialmente la influencia de la mano de operador

OBJETIVO determinacioacuten de los antigenos del sistema ABORh (D) y determinacion

del grupo serico en tecnica de gel

FUNDAMENTOS

El principio del metdo se basa en la tecnica de gel descrita por Y Lapierre para la

deteccion de las reacciones de aglutinacion de los hematies La aglutinacion se produce

al entar en contacto los eritrocitos con los anticuerpos correspondientes

La tarjeta DG gel es un soporte de plastico constituidos por 8 microtubulos Cada

microtubulo esta formado por una columna y una camara de dispersionincubacion

La tecnologiacutea de microtipificacioacuten en gel se basa en la separacioacuten por tamantildeo de los

eritrocitos aglutinados durante un proceso de centrifugacioacuten en un gel poroso

Los eritrocitos van perdiendo elasticidad en sus membranas de forma que los

aglutinados grandes quedan atrapados en la zona superior y los pequentildeos quedan

distribuidos a lo largo de la columna

MATERIAL

Pipeta automaacutetica 10 ul 50ul 1 ml

Puntas de pipeta desechable Tubos de vidrios

DEG sol

Centrifugas para tarjetas DG gel

Hematies de reactivos para grupo inverso

MUESTRA BIOLOGICACeacutelulas rojas de donador o paciente

REACTIVO

Placa de gelReactivo de gel sol

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TECNICA1- determinacion de los antigenos del sistema ABORh

-preparar una suspension de hematies al 5 de DG sol Asegurar la resuspencion de lso

hematies antes de utilizar

Anadir en cada microtubulos indicados 10 ul de una suspension de hematies al 5

2- determinacion de l grupo serico-homogenizar los hematies recativos A1B

- dispersar el microtubulo N a1 50 ul de hematies reactivos A1 en un microtubulo Nb

50 ul de hematies reactivos B

-antildeadir suero o plasma

3- centrigugar en centrifuga para DG sol

Leer los resultados

RESULTADOS

NEGATIVO - Banda de hematies al fondo de la columna resto de la columna sin

aglutinados

POSITIVO

+- Escasoa glutinados de pequentildeo tamantildea d ela columna

1+ Algunos aglutinados pequentildeso en la columna

2+ aglutinados pequentildeso en la columna o mediano a lo largo de la columna

3+ Banda superior de aglutinado

4+ Banda de aglutinados en la parte superior de la columna

DP Doble poblacion (doble banda de hematies en el fondo y en la parte

superior

INTERPRETACION DE RESULTADOS

GRUPO HEMATICO GRUPO SERICOmicrotubo

Amicrotubo

Bmicrotubo

ABmicrotubo

CTL

MICROTUBUBON+ a1

MICROTUBUBON+ B

ABOGRUPO

0 0 0 0 + + 0+ 0 + 0 0 + A

0 + + 0 + 0 B

+ + + 0 0 0 AB

SISTEMA RhMicrutubo D Micrutubo

DrdquoMicrutuboCTL

INTERPRETACION

+ + 0 D positivo

0 0 0 D negativo

0 + 0

+ 0 0

D deacutebil parcial

RESULTADO E INTERPRETACION DE LA PRACTICA

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Resultado A+

CONCLUSION

Concluyo que esta teacutecnica es una forma de estabilizar las reacciones de aglutinacioacuten y

reducir los resultados falsamente negativos a consecuencia de una teacutecnica inapropiada

asi como crear un meacutetodo de interpretaciones sencillas y constantes

Practica No 5ldquoPrueba de compatibilidadrdquo

Introduccioacuten

Para requerir una oacuteptima transfusioacuten actualmente serequiere de aceptaciones inmunoloacutegicas receptor - donanteya que la transfusioacuten de sangre o la de sus componentescelulares de un donante a un receptor es una forma detransplante

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La prueba de Coombs se usa para determinar la presencia deanticuerpos no aglutinantes en el suero de sujetossensibilizados a uno o mas antiacutegenos sanguiacuteneos Es uacutetil enel estudio del suero de mujeres con isoinmunizacioacutenmaterno-fetal y se emplea tambieacuten en otro tipo de pruebas

como identificacioacuten de anticuerpos autoinmunes deteccioacutende algunos sistemas sanguiacuteneos y pruebas de compatibilidadsanguiacutenea

La prueba indirecta se realiza con eritrocitos normalesincubados in Vitro con el suero de estudio Durante esteperiodo si existe un anticuerpo este se fija sobre surespectivo determinante antigeacutenico Una vez fijados loseritrocitos son igualmente lavados y se agrega el reactivode Coombs produciendo aglutinacioacuten

Una prueba de Coombs indirecta positiva significa queexisten anticuerpos libres en el suero de la persona loscuales puedan ser igualmente auto-anticuerpos oisoanticuerpos

Material y equipo

bull Pipetas automaacuteticas de 10 microl 25 microl 50 microl y 1 ml

bull Puntas de pipetas desechables

bull Tubos de vidrio

bull Incubador para tarjetas DG Gel

bull Centrifuga para tarjetas DG Gel

Material bioloacutegico

bull Hematiacutees reactivo para investigacioacuten e identificacioacuten de anticuerpos irregulares de

Diagnostic Grifols SA

bull Suero de hemoclasificacioacuten

bull Muestras de sangre de extraccioacuten reciente recogida con anticoagulante o sin

anticoagulante

Reactivos

bull Tarjetas DG Gel

bull DG Gel Sol

Reactivos

Tarjetas DG Gel Coombs DG Gel SolRango de temperatura entre 2 y 25 ordmC Rango de temperatura entre 2 y 8ordmCLote 704901 Lote 7003701Cad 2008-03 Cad 2008-06Aspecto transparente Aspecto transparenteColor verde Color incoloro

TeacutecnicaMeacutetodo manual

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1 Dejar atemperar (18-25ordmC) muestras y reactivo2 Inspeccionar el estado de las tarjetas antes de utilizar3 Identificar las tarjetas y muestras a utilizar4 Despegar con precaucioacuten la lamina de metal que cubre los microtubos para prevenir

contaminaciones cruzadas entre ellos

5 Preparar una suspensioacuten con hematiacutees al 1 en DG Gel Sol (10 microl de sedimento oconcentrado de hematiacutees en 1 ml de DG Gel Sol) Utilizar los hematiacutees del donantepara la PC mayor y hematiacutees del receptor para la PC menor Asegurar la suspensioacuten delos hematiacutees antes de utilizar

6 Dispensar en el tubo correspondiente 50 microl de suspensioacuten de los hematiacutees al 1 deldonante (PC mayor) o 50 microl de suspensioacuten de los hematiacutees al 1 del receptor (PCmenor)

7 Antildeadir 25 microl de suero o plasma del receptor (PC mayor) o 25 microl de suero o plasma deldonante (PC menor)

8 Preparar auto control con 50 microl de suspensioacuten de los hematiacutees al 1 del receptor y 25microl de suero o plasma del receptor

9 Incubar 15 minutos a 37 ordmC10 Centrifugar en la centrifuga para tarjetas DG Gel

11 Leer los resultados

InterpretacioacutenNegativo - Banda de hematiacutees en el fondo de la columna resto de la columna sin aglutinados visibles

Positivo +- Escasos aglutinados de pequentildeo tamantildeo en la mitad inferior de la columna

1+ Algunos aglutinados de pequentildeo tamantildeo en la columna

2+ Aglutinados de tamantildeo pequentildeo o mediano a lo largo de la columna

3+ Banda superior de aglutinados de tamantildeo mediano en la mitad superior de la columna

4+ Banda de hematiacutees aglutinados en la parte superior de la columna

DP Doble poblacioacuten (doble banda de hematiacutees en el fondo y en la parte superior de la columna

Resultados

Paciente Lira Cabrera Carlos Alberto (AB+)Donador 1 Orea Valero Erasmo (A+)Donador 2 Moreno Adolfo (O+)

M1 m1 M2 m2 AutocontrolGR de donador 1 +suero del paciente

GR del paciente +suero de donador 1

GR de donador 2 +suero del paciente

GR del paciente +suero de donador 2

GR del paciente +suero del paciente

- + - + -

Por lo antes expuesto se puede deducir que el donador 1 (A+) puede donar eritrocitos al

paciente (AB+) lo mismo que el donador 2 (O+) puede donarle eritrocitos no asiacute plasma por parte de ambos donadores pues la prueba muestra que hubo reaccioacuten en ambas pruebasmenores

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Conclusioacuten

Concluyo que es esencial que toda la sangre sea estudiadaantes de la transfusioacuten para Asegurar que todos losgloacutebulos rojos transfundidos son compatibles con losanticuerpos en el plasma del paciente Evitar estimular laproduccioacuten de nuevos anticuerpos contra los gloacutebulos rojosen el receptor especialmente anti-Rh D

PRAacuteCTICA No 6PRUEBA DE COMPATIBILIDAD SANGIacuteNEA

(Teacutecnica salina)

INTRODUCCIOacuteN

Landsteiner constatoacute que cuando un aglutinoacutegeno se pone

en contacto con la aglutinina homoacuteloga se produce unaaglutinacioacuten

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La compatibilidad sanguiacutenea es la posibilidad de mezclade sangre sin que se produzcan trastornos tales como losfenoacutemenos de la lisis o de la aglutinacioacuten

A causa de este fenoacutemeno bioloacutegico en las transfusiones

de sangre no es suficiente con conocer que la sangre deldonante y la del receptor son del mismo grupo o bien quela del donante pertenezca al grupo O (cero) sino que esnecesario conocer si la compatibilidad es perfecta porqueninguacuten otro fenoacutemeno de inmunizacioacuten interfiera Es eneste sentido por lo que son empleadas las pruebascruzadas

Ademaacutes de los 6 antiacutegenos del sistema ABO en loseritrocitos humanos existen numerosos sistemas deaglutinoacutegenos que contienen muchos antiacutegenos individuales

en los eritrocitos (maacutes de 500000 millones posibles defenotipos de grupos sanguiacuteneos conocidos) Para evitaraccidentes transfusionales es indispensable tener encuenta el sistema Rh ademaacutes del ABO

Del sistema de antiacutegenos Rh es el D el maacutes antigeacutenico yel teacutermino Rh positivo indica que el individuo presentaaglutinoacutegeno D El individuo Rh negativo no tiene antiacutegenoD y forma la aglutinina anti-D en contacto con eacuteste

Las reacciones antiacutegeno-anticuerpo pueden observarse in

vitro por

mdash Hemoacutelisis la unioacuten antiacutegeno-anticuerpo se traduce enlisis de los eritrocitos en presenciadel complemento (siempre que el anticoagulante empleado nocapture losiones Ca y Mg necesarios para la activacioacuten delcomplemento) mdash Aglutinacioacuten los anticuerpos que reaccionan en mediosalino se conocen comoanticuerpos completos o aglutinantes (comuacutenmente tipo

IgM)

OBJETIVO Determinacioacuten de los antigenos del sistema ABORh (D) y su compatibilidad entre un paciente Donador y unPaciente Receptor

MATERIAL5 Tubos de ensaye6 Pipetas Pasteur

1Gradilla1 Bulbo

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EQUIPOMicrocentriacutefugaBantildeo Mariacutea oacute Estufa

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Papel Parafilm

MUESTRA Muestra de sangre con Anticoagulante EDTA

REACTIVOSAntisuero RO-Antiglobulina humana (Poliespeciacutefico Anti IgG C-d) Para prueba de CoombsLABORATORIOS LAFON SA de C VFecha de Caducidad 31-Ene-09Lote 406Hecho en MeacutexicoAspecto TransparenteColor Verde

TEacuteCNICA

Lavar los eritrocitos con solucioacuten salina (3 veces)

SALINA RAacutePIDA1 Agregar una gota de Eritrocitos Lavados2 Diluirlo al 3-5 con solucioacuten salina 093 Agregar 2 gotas de suero4 Centrifugar y observar anotar desprendimiento del botoacuten

SALINA 37deg BANtildeO MARIacuteA

1 Incubar tubos a Bantildeo mariacutea a 37degC durante 1hora (o 20 min)2 Centirfugar despueacutes de haber pasado el

tiempo3 Desprender el botoacuten de eritrocitos y

observarAGLUTINACIOacuteNndash No es compatibleNO AGLUTINACIOacuteN - Lavar 3 veces

SALINA COOMBS

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PRUEBA MAYOR

G Rojos del DONADOR+

Suero del RECEPTOR(paciente)

PRUEBA MENOR

G Rojos del RECEPTOR(paciente)

+Suero del DONADOR

AUTOTESTIGO

G Rojos del RECEPTOR(paciente)

+Suero del RECEPTOR

(paciente)

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1 Con solucioacuten salina 09 lavar loseritrocitos de los tubos q no tuvieronaglutinacioacuten 3 veces

2 Decantar y agregar 2 gotas de reactivode Coombs

AGLUTINACIOacuteN ndash No es compatibleNO AGLUTINACIOacuteN - Lavar 3 veces

RESULTADOS

Paciente Madrigal Meacutendez Luis Eduardo (B+)Folio 009164Fecha301007

Donador 1 Torres Avileacutes Joseacute Ramoacuten (O+)Folio 022604Fecha311007

Donador 2 Rodriacuteguez Nuacutentildeez Joseacute Angel (A+) Folio 022605

Fecha311007

SALINA RAacutePIDA

M1 m1 M2 m2 AutotestigoGR de donador 1+ suero del

paciente

GR del paciente+ suero dedonador 1

GR de donador 2+ suero del

paciente

GR del paciente+ suero dedonador 2

GR del paciente+ suero del

paciente

- 4+ 4+ 4+ -

SALINA 37deg BANtildeO MARIacuteA

M1 m1 M2 m2 Autotestigo- 4+ 4+ 4+ -

Compatible Nocompatible

Nocompatible

Nocompatible

Compatible

SALINA COOMBS

Por lo tanto se puede decir que el donador 1 (O+) puededonar suero al paciente (B+) debido a que en el suero nohay anticuerpos de ninguacuten tipo que reaccionen con losantiacutegenos de los eritrocios del Donador 1 Mientras tantoel Donador 2 no puede donar al Paciente ni suero nieritrocitos

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M1 Autotestigo- -

Compatible

Compatible

21

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INTERPRETACIOacuteN

PRUEBA POSITIVA Existe una aglutinacioacuten de lasceacutelulas sanguiacuteneas que indica la presencia delantiacutegeno A o B En el suero de Coombs notamos si esta

la precencia de Antiacutegeno D en los eritrocitos Lahemoacutelisis no se debe interpretar como resultadopositivo ya que puede indicar contaminacioacuten delreactivo

PRUEBA NEGATIVA La no aglutinacioacuten indica unresultado negativo e indica que las ceacutelulas sonnegativas para Antiacutegenos del sisitema ABO y D

CONCLUSIOacuteN

He concluido que en las transfusiones de sangre no essuficiente con conocer que la sangre del donante y la delreceptor son del mismo grupo o bien que la del donantepertenezca al grupo O (cero) sino que es necesarioconocer si la compatibilidad es perfecta porque ninguacutenotro fenoacutemeno de inmunizacioacuten interfiera Es en estesentido por lo que son empleadas las pruebas cruzadas

Praacutectica No 7ldquoPrueba de compatibilidad sanguiacutenea (teacutecnica albumina)rdquo

IntroduccioacutenLa tipificacioacuten de sangre identifica el tipo sanguiacuteneo determinandoantiacutegenos presentes en los eritrocitos detecta aloanticuerpos encontra esos antiacutegenos Asiacute los aloanticuerpos pueden aparecernaturalmente o ser inducidos y pueden ser dirigidos contra del grupoconocido o a los antiacutegenos de superficie de los eritrocitos La prueba

de compatibilidad sanguiacutenea o cross matching esta formada por laprueba mayor y menorLa prueba de cruzamiento mayor para losaloanticuerpos consiste en probar el plasma del receptor contra los

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gloacutebulos rojos del donante Es incompatible cuando se genera unareaccioacuten hemoliacutetica los eritrocitos del donante se destruyen por losaloanticuerpos del plasma del receptor La prueba menor es una pruebapara los aloanticuerpos del plasma del donante en contra los gloacutebulosrojos del receptor Una incompatibilidad menor es una causa menosfrecuente para causar una reaccioacuten en contra una transfusioacuten porque

el volumen de plasma del donante es menor y es diluido marcadamente enel receptor Para llevar a cabo dicho procedimiento se utilizandiversos reactivos como potencializadores que mejoran la unioacuten deeritrocitos con alguacuten tipo de anticuerpo Uno de esospotencializadores es la albuacutemina La albumina bovina polimerizada esun reactivo muy utilizado en el laboratorio de inmunohematologia y encentros de bancos de sangre funciona como un potencializador quefacilita la reaccion de aglutinacioacuten de eritrocitos sensibilizados Alfinal de la prueba se prueban los eritrocitos con el reactivo deCoombs El principio de la prueba de Coombs fue descrito por Moreschien 1908 pero Coombs Mourant y Race en 1946 la introdujeron en elestudio de los grupos sanguiacuteneos y anticuerpos cuando una parte desangre (suero) fue usada para la inoculacioacuten de animales para

inmunizarlos con proteiacutena humana utilizando el anticuerpo obtenido enla deteccioacuten de los llamados anticuerpos incompletos Esta prueba seusa para determinar la presencia de anticuerpos no aglutinantes en elsuero de sujetos sensibilizados a uno o mas antiacutegenos sanguiacuteneos Esuacutetil en el estudio del suero de mujeres con isoinmunizacioacuten materno-fetal y se emplea tambieacuten en otro tipo de pruebas como identificacioacutende anticuerpos autoinmunes deteccioacuten de algunos sistemas sanguiacuteneos ypruebas de compatibilidad sanguiacutenea La prueba indirecta se realizacon eritrocitos normales incubados in Vitro con el suero de estudioDurante este periodo si existe un anticuerpo este se fija sobre surespectivo determinante antigeacutenico Una vez fijados los eritrocitosson igualmente lavados y se agrega el reactivo de Coombs produciendoaglutinacioacuten Una prueba de Coombs indirecta positiva significa que

existen anticuerpos libres en el suero de la persona los cualespuedan ser igualmente auto-anticuerpos o isoanticuerpos

Objetivo Determinacioacuten de los antiacutegenos del sistema ABO Rh (D) y sucompatibilidad entre un paciente Donador y un Paciente Receptor

Material y equipo

5 Tubos de ensaye

6 Pipetas Pasteur

1Gradilla

1 Bulbo

Papel Parafilm

Microcentriacutefuga

Bantildeo Mariacutea oacute Estufa

Material bioloacutegico

Muestras de sangre de extraccioacuten reciente recogida conanticoagulante o sin anticoagulante

ReactivosSuero de CoombsAlbuacutemina bovina deg

Suero anti-globulina humana Lafon Lote 406 Cad 310109 Color verde Aspecto

transparentedegAlbumina de bovino polimerizada Interbiol Lote APO107 Cad 150109 Color incoloroAspecto transparente

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Teacutecnica

1 Montar prueba mayor 1 y 2 prueba menor 1 y 2 y autotestigocon el procedimiento ya anteriormente conocido

2 Agregar 2 gotas de albuacutemina al 223 Centrifugar 20 segundos4 observar aglutinacioacuten o hemolisis o no aglutinacioacuten5 A los tubos con lecturas negativas incubar 20 minutos en bantildeo

Mariacutea a 37 degC6 Centrifugar y observar

bull Aglutinacioacuten o hemoacutelisis reportar incompatible

bull No aglutinacioacuten llevar a Coombs

7 Lavar tres veces decantar y quitar el exceso de salina congasa y agregar 2 gotas de reactivo de Coombs y centrifugar 20segundos y observar

bull Aglutinacioacuten o hemoacutelisis reportar incompatible

bull No aglutinacioacuten reportar compatible

Resultados1 PRUEBA MAYOR 1 2 Gotas de suero del paciente + 1 gota de GR al 3-5 del

donador 12 PRUEBA MENOR 1 2 Gotas de suero del donador 1 + 1 gota de GR al 3-5 del

paciente3 PRUEBA MAYOR 2 2 Gotas de suero del paciente + 1 gota de GR al 3-5 del

donador 24 PRUEBA MENOR 2 2 Gotas de suero del donador 2 + 1 gota de GR al 3-5 del

paciente5 AUTOTESTIGO 2 Gotas de suero del paciente + 1 gota de GR al 3-5 del paciente

M1 m1 M2 m2 AutotestigoCon albuacutemina - - - - -Despueacutes de incubacioacuten a 37 degC - - - - -Despueacutes de Coombs - - - - -Despueacutes de validacioacuten con gloacutebulos

positivos+ + + + +

InterpretacioacutenPrueba positiva Alutinacioacuten o hemolisis Indica no compatibilidadPrueba negativaNo aglutinacioacuten Indica compatibilidad

Esquemas

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ConclusioacutenConcluyo que la prueba de compatibilidad sanguiacutenea en su modalidad conalbuacutemina bovina ofrece mucha ventaja al ser al igual que otrosreactivos un potencializador de la reaccioacuten antiacutegeno-anticuerpo Estopermite que el operador o realizador de la prueba tenga mayorconfianza y certeza en los resultados que obtenga

PRACTICA No 8PRUEBA DE COMPATIBILIDAD SANGUINEA PRUEBA DE LISS

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FUNDAMENTO

LISS es utilizado para reducir la fuerza ioacutenica del medio

de reaccioacuten en los procedimientos de deteccioacuten eidentificacioacuten de anticuerpos y en las pruebas decompatibilidad La presencia de este reactivo refuerza lainteraccioacuten antiacutegeno - anticuerpo durante la incubacioacuten

GENERALIDADESEl uso de solucioacuten salina de baja fuerza ioacutenica fuedescrito inicialmente en 1964 por Hughes-Jones y col y

Elliot y col pero en ese tiempo su uso era limitado yaque la concentracioacuten molar obtenida provocaba la hemoacutelisisde los eritrocitos suspendidos

En 1974 Low y Messeter describieron el uso rutinario de lasolucioacuten Liss de 003 M que lograba reducir el tiempo deincubacioacuten y no presentaba tendencia a la hemoacutelisis al sersuspendidos en salina a baja fuerza ioacutenica restableciendola presioacuten osmoacutetica de la solucioacuten mediante la adicioacuten deglicinaLas soluciones de baja fuerza ioacutenica son actualmente lasmaacutes utilizadas en inmunohematologiacutea provocando un aumentoen la velocidad de asociacioacuten entre antiacutegenos y anticuerpospermitiendo asiacute acortar el tiempo de incubacioacuten de 60minutos a 10-15 minutos sin sacrificar la sensibilidad delas mismas y sin costos elevadosSe ha observado que lasreacciones antiacutegeno-anticuerpo se ven potenciadas alreducir la fuerza ioacutenica del medio de reaccioacuten

La fuerza ioacutenica es uno de los factores maacutes importantes quedeterminan la tasa y la cantidad de captacioacuten deanticuerpos por parte de los eritrocitos El uso de mediosde reaccioacuten de baja fuerza ioacutenica permite disminuir eltiempo de incubacioacuten y potenciar las reacciones de losanticuerpos sin incrementar las reacciones inespeciacuteficas

Los iones Na+ y Cl- presentes en la solucioacuten salinafisioloacutegica se agrupan alrededor de las moleacuteculas deantiacutegeno y anticuerpo neutralizando sus cargas opuestas locual dificulta la unioacuten entre ellos Este efecto se reduceutilizando soluciones de baja fuerza ioacutenica y disminuyendode esta manera la incubacioacuten de las pruebas

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En esta etapa de sensibilizacioacuten las posibilidades deasociacioacuten pueden incrementarse mediante agitacioacutencentrifugacioacuten yo variacioacuten de la concentracioacuten delanticuerpo

Despueacutes de que el anticuerpo se ha fijado al antiacutegeno loseritrocitos sensibilizados deben unirse para dar lugar a laaglutinacioacuten visible esta red tambieacuten solidifica yestabiliza la reaccioacuten

En esta etapa la reaccioacuten depende de factores como lascaracteriacutesticas del anticuerpo localizacioacuten en la membranay nuacutemero de sitios antigeacutenicos fuerzas que mantienen ladistancia entre los eritrocitos

Las caracteriacutesticas del anticuerpo que deben considerarse

son el tamantildeo del anticuerpo involucrado y el nuacutemero desitios de combinacioacuten con el antiacutegeno Los anticuerpos IgMpueden establecer puentes entre los eritrocitos yaglutinarlos espontaacuteneamente en solucioacuten salina mientrasque los IgG no ya que las IgM pentameacutericas poseen 10sitios de combinacioacuten con el antiacutegeno y las IgG diacutemerossoacutelo dos sitios

Los eritrocitos tienen una carga neta negativa en susuperficie su interaccioacuten con los iones del medio alteraesta carga y producen una carga neta criacutetica denominada

potencial zeta y la reduccioacuten de dicha carga permite quelos eritrocitos se aproximen lo suficiente para que seanaglutinados por medio de los IgG que los sensibilizaron

Las soluciones de baja fuerza ionica empleadas en banco desangre tienen un pH entre 65 ndash 70 se recomienda unaosmolalidad de 270 ndash 305 mosmkg y una conductividad de 37mmcm El control diario implica el examen de su aparienciafiacutesica ausencia de turbidez particulas o sedimento asiacutecomo corroborar la capacidad para generar hemoacutelisiscrenacion o prueba de coombs positiva en eritrocitos

normales Cada lote nuevo se valora mediante el rastreo deun anticuerpo ya sea un anti- D un anti- jk anti- fy oanti- kell diluido se compara su capacidad de deteccioacutencontra un medio salino normal incubando 10min a 37ordmC enLISS debe poder rastrearse un anticuerpo en tanto que enmedio salino no

MATERIAL Y EQUIPO

Material Cantidad10 Tubos de ensayo de 12 x 75

1 Gradilla10 Pipetas pasteur

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1 Bulbo1 Marcador1 Microcentriacutefuga1 Bantildeo Mariacutea

MATERIAL BIOLOGICO

Gloacutebulos rojos lavados al 3 - 5Suero

REACTIVOS

Reactivo de LISSReactivo de Coombs

TECNICA1- Lavar los eritrocitos

Separar el suero del paquete de gloacutebulos rojos

Agregar cierta cantidad de eritrocitos a un tubo deensayo y agregarle solucioacuten salina

Centrifugar y decantar

Repetir este proceso 3 veces

2- Realizar la Prueba de LISS

Enumerar los tubos Poner dos gotas de LISS en cada tubo agregar una gota

de eritrocitos lavados y al 3 - 5 seguacuten el nuacutemero detubo correspondiente

Mezclar y centrifugar un minuto decantar elsobrenadante y con la ayuda de una gasa limpiar elexceso del reactivo

Poner nuevamente 2 gota de LISS resuspender poragitacioacuten agregar 2 gotas de suero problema mezclarincubar 15 minutos a 37ordm C centrifugar 30 seg A 1000

RPM Anotar los resultados

3- A las pruebas negativas realizar Coombs

Lavar 3 veces las ceacutelulas agregar suero de Coombscentrifugar 30 seg

Leer aglutinaciones y anotar resultados

REACTIVOS UTILIZADOS

REACTIVO MARCA FECHA DECADUCIDAD

ASPECTO COLOR LOTE

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SueroAntiglobuina

humana

Lafon 31 01 2009 Transparente Verde 406

LISS Caserorealizado enCMNSIGLOXXI

1 antildeo Transparente Transparente

----------

PACIENTE ASCANIO MENDEZ JOSUE O (+)DONADOR 1 GARCIA CARBAJAL OSCAR O (+)DONADOR 2 GARCIA SUAREZ ORLANDO A (+)

RESULTADOS

INTERPRETACIOacuteN DE LOS RESULTADOS

La hemoacutelisis o la aglutinacioacuten representan un resultado positivo e indican lapresencia de una reaccioacuten antiacutegeno-anticuerpo Los resultados negativos no severa aglutinacioacuten o hemolisis

ESQUEMAS

CONCLUSIONES

Concluyo que la prueba de compatibilidad sanguiacutenea en su modalidad conliss ofrece mucha ventaja al ser al igual que otros reactivos unpotencializador de la reaccioacuten antiacutegeno-anticuerpo Esto permite queel operador o realizador de la prueba tenga mayor confianza y certezaen los resultados que obtenga

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Tubo Resultado

M1 NEGATIVOm1 NEGATIVO

M2 POSITIVO

M2 NEGATIVO

AUTOTES NEGATIVO

29

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PRACTICA 9INMUNOHEMATOLOGIA

DETERMINACION DE COOMBS DIRECTO

INTRODUCCIONPRUEBA DE COOMBS DIRECTA

El examen de Coombs directo se utiliza para detectar autoanticuerpos contralos propios gloacutebulos rojos (GR) de un individuo Es una prueba que sirve parademostrar el revestimiento de los eritrocitos in vivo (mientras los eritrocitosestaacuten circulando en el individuo) La prueba se realiza agregando directamenteel reactivo de Coombs a los eritrocitos previamente lavados para eliminar otras proteiacutenas no fijadas a el una prueba directa positiva significa que larelacioacuten antiacutegeno-anticuerpo ocurrioacute in vivo es decir que la fijacioacuten del

anticuerpo sobre el antiacutegeno se realizo en el organismo del individuo enestudio

Las indicaciones principales de esta prueba son diagnostico de enfermedadeshemoliacuteticas ictericia o anomaliacuteas en la apariencia de los gloacutebulos rojos bajo elmicroscopio ya que estos anticuerpos algunas veces destruyen los gloacutebulosrojos y causan anemia para investigar reacciones en transfusiones Parainvestigar la induccioacuten de drogas en ceacutelulas rojas sensibilizadas medicamentos(por ejemplo quinidina metildopa procainamida y otros) que pueden llevar a la produccioacuten de estos anticuerpos

OBJETIVO Determinar la presencia de anticuerpos en la superficie de losgloacutebulos rojos del individuo

MATERIAL

bull 10 Tubos de 1275

bull 10 Pipetas Pasteur

bull 1 Gradilla

bull 1 Bulbo

bull Papel Parafilm

bull Microcentriacutefuga

bull Bantildeo Mariacutea a 37degC

MUESTRA BIOLOGICA

Eritrocitos lavados de (3-5) del donador o pacienteREACTIVO

Suero de CoombsSuero anti-globulina humana Lafon Lote 406 Cad 310109 Color verde Aspecto transparente

TECNICA

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Colocar en un tubo de ensaye dos gotas de suero de Coombs mas una gota deglobulos rojos (3-5)Centrifugar a 1000 rpm durante 20 segDesprender el boton suavemente y buscar la presencia de aglutinacionRotular y enumerar 8 tubos de ensayes con las diferentes diluciones

(frac12frac1418)Enumerar 8 tubos mas del 1 al 8Agregar a cada tubo de las diluciones 10 gotas de solucion salina mas 10 gotasde suero de CoombsColocar Al primer tubo de la dilucion 1 gota de globulos rojos (3-5) mezclar completamente y agregar al tubo 1Centrifugar todos los tubos a 1000 rpm durante 20 seg

LECTURA

Aglutina- Prueba de Coombs directa es positiva

No aglutina- Prueba de Coombs directa es negativa

ESQUEMAS y RESULTADOS

CONCLUCION

He concluido que la prueba de Coombs directa es una prueba que se utiliza para medir

la presencia de anticuerpos en la superficie de los gloacutebulos rojos que se encuentran

circulando en el paciente y se realiza para investigar reacciones en transfusiones ademaacutes

sirve para la determinacioacuten de anemia hemoliacutetica autoinmune entre otras afecciones

Practica 10

IDENTIFICACION DE ANTICUERPOS IRREGULARES

Fundamento

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DILUCIONES

frac12 positiva

frac14 positiva

18 positiva

116 negativa

132 negativa

164 negativa

1128 negativa1256 negativa

31

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Los anticuerpos del sistema ABO aparecen una vez que elindividuo entra en contacto con el medio ambiente y en elcual se encuentran microorganismos como algunas bacteriascoliformes que contienen sustancias quiacutemicas en suestructura parecidas a las de este sistema Por anticuerpos

regulares debemos identificar a los que existen en todoslos individuos y que eacutestos tendraacuten durante toda su vida

Los anticuerpos irregulares son los que no estaacuten de esamanera aunque en el caso de los naturales no se conoce aciencia cierta queacute o coacutemo se induce su produccioacuten Losadquiridos se conocen tambieacuten como inmunes y son elresultado de la exposicioacuten a antiacutegenos desconocidos por elindividuo al momento de la transfusioacuten o en las mujerespor el embarazo estos anticuerpos son dirigidos contraantiacutegenos de sistemas diferentes al ABO

Los anticuerpos naturales regulares son preferentementeinmunoglobulinas M las cuales fijan de manera taneficiente el complemento que pueden provocar lisisintravascular y ocasionar insuficiencia renal o incluso lamuerte del paciente Los anticuerpos adquiridos o inmunesson generalmente inmunoglobulinas G las cuales producenhemoacutelisis extravascular en el bazo o en el hiacutegado mediantefagocitosis del complejo eritrocito maacutes anticuerpo

Los aloanticuerpos irregulares (adquiridos) maacutes comunes en

nuestra poblacioacuten son los que involucran a los sistemasMNSs P1 Kidd (Jka Jkb) Duffy (Fya Fyb) Kell Lewis yDiego

OBJETIVO identificacioacuten del anticuerpo irregular a traveacutesde las diferentes teacutecnicas

MATERIAL

bull 10 Tubos de ensaye

bull 10 Pipetas Pasteur

bull

1Gradillabull 1 Bulbo

bull Papel Parafim

MATERIAL BIOLOGICO

bull Gloacutebulos rojos lavados al 3 - 5

bull Suero

bull REACTIVOSReactivos

1 Suero de Coombs2 Albuacutemina bovina

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bull EQUIPO1 Microcentriacutefuga2 Bantildeo Mariacutea oacute Estufa

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3 SOLUCION SALINA4 SOLUCION DE LISS

TEacuteCNICA SOLUCION SALINA

Lavar los eritrocitos con solucioacuten salina (3veces)SALINA RAacutePIDA

Agregar una gota de Eritrocitos LavadosDiluiacuterlo al 3-5 con solucioacuten salina 09Agregar 2 gotas de sueroCentrifugar y observar anotar desprendimientodel botoacuten

SALINA 37deg BANtildeO MARIacuteA1) Incubar tubos a Bantildeo mariacutea a 37degC durante 1

hora (o 20 min)

2) Centirfugar despueacutes de haber pasado eltiempo

3) Desprender el botoacuten de eritrocitos yobservar

AGLUTINACIOacuteNndash No es compatibleNO AGLUTINACIOacuteN - Lavar 3 veces

SALINA COOMBS1) Con solucioacuten salina 09 lavar los

eritrocitos de los tubos q no tuvieronaglutinacioacuten 3 veces

2) Decantar y agregar 2 gotas de reactivode Coombs

AGLUTINACIOacuteN ndash No es compatibleNO AGLUTINACIOacuteN - Lavar 3 veces

TECNICA LISS

1 Poner dos gotas de LISS en cada tubo agregar una gotade eritrocitos lavados y al 3 - 5 seguacuten el nuacutemero detubo correspondiente

2 Mezclar y centrifugar un minuto decantar el

sobrenadante y con la ayuda de una gasa limpiar elexceso del reactivo

3 Poner nuevamente 2 gota de LISS resuspender poragitacioacuten agregar 2 gotas de suero problema mezclarincubar 15 minutos a 37ordm C centrifugar 30 seg A 1000RPM

4 Anotar los resultados

A las pruebas negativas realizar Coombs

1 Lavar 3 veces las ceacutelulas agregar suero de Coombs

centrifugar 30 seg2 Leer aglutinaciones y anotar resultados

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TECNICA ALBUMINA BOVINA 8 Agregar 2 gotas de albuacutemina al 229 Centrifugar 20 segundos10observar aglutinacioacuten o hemolisis o no aglutinacioacuten

11A los tubos con lecturas negativas incubar 20minutos en bantildeo Mariacutea a 37 degC12Centrifugar y observar

bull Aglutinacioacuten o hemoacutelisis reportar incompatible

bull No aglutinacioacuten llevar a Coombs

13Lavar tres veces decantar y quitar el exceso desalina con gasa y agregar 2 gotas de reactivo deCoombs y centrifugar 20 segundos y observar

bull Aglutinacioacuten o hemoacutelisis reportar incompatible

bull No aglutinacioacuten reportar compatible

Resultados ANTICUERPO IRREGULAR Anticuerpo c

InterpretacioacutenEstos anticuerpos son generalmente inmunoglobulinas tipo My ocasionalmente tipo G y debido a esa temperatura dereaccioacuten carecen de importancia cliacutenica salvo que sureaccioacuten ocurra tambieacuten a 37 degC su importancia radica enpacientes que seraacuten intervenido a 22 ordmc como es el caso de

operacioacuten de corazoacuten

Los llamados anticuerpos calientes tienen una temperatura oacuteptima dereaccioacuten a 37 degC a Estos anticuerpos tienen una relevanteimportancia cliacutenica ya que se les asocia con reaccionestransfusionales de intensidad moderada a severa que puedenocasionar la muerte

Esquemas

CONCLUSIONHe concluido que es importante determinar los anticuerposirregulares ya que estos anticuerpos tienen una relevanteimportancia cliacutenica ya que se les asocia con reaccionestransfusionales de intensidad moderada a severa

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Esta teacutecnica nos permite que estandaricemos la lectura de la reaccioacuten antiacutegeno-

anticuerpo con facilidad y repetitividad Asiacute como la estandariza del uso de reactivos

tiempos y lecturas disminuyendo sustancialmente la influencia de la mano de operador

OBJETIVO determinacioacuten de los antigenos del sistema ABORh (D) y determinacion

del grupo serico en tecnica de gel

FUNDAMENTOS

El principio del metdo se basa en la tecnica de gel descrita por Y Lapierre para la

deteccion de las reacciones de aglutinacion de los hematies La aglutinacion se produce

al entar en contacto los eritrocitos con los anticuerpos correspondientes

La tarjeta DG gel es un soporte de plastico constituidos por 8 microtubulos Cada

microtubulo esta formado por una columna y una camara de dispersionincubacion

La tecnologiacutea de microtipificacioacuten en gel se basa en la separacioacuten por tamantildeo de los

eritrocitos aglutinados durante un proceso de centrifugacioacuten en un gel poroso

Los eritrocitos van perdiendo elasticidad en sus membranas de forma que los

aglutinados grandes quedan atrapados en la zona superior y los pequentildeos quedan

distribuidos a lo largo de la columna

MATERIAL

Pipeta automaacutetica 10 ul 50ul 1 ml

Puntas de pipeta desechable Tubos de vidrios

DEG sol

Centrifugas para tarjetas DG gel

Hematies de reactivos para grupo inverso

MUESTRA BIOLOGICACeacutelulas rojas de donador o paciente

REACTIVO

Placa de gelReactivo de gel sol

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TECNICA1- determinacion de los antigenos del sistema ABORh

-preparar una suspension de hematies al 5 de DG sol Asegurar la resuspencion de lso

hematies antes de utilizar

Anadir en cada microtubulos indicados 10 ul de una suspension de hematies al 5

2- determinacion de l grupo serico-homogenizar los hematies recativos A1B

- dispersar el microtubulo N a1 50 ul de hematies reactivos A1 en un microtubulo Nb

50 ul de hematies reactivos B

-antildeadir suero o plasma

3- centrigugar en centrifuga para DG sol

Leer los resultados

RESULTADOS

NEGATIVO - Banda de hematies al fondo de la columna resto de la columna sin

aglutinados

POSITIVO

+- Escasoa glutinados de pequentildeo tamantildea d ela columna

1+ Algunos aglutinados pequentildeso en la columna

2+ aglutinados pequentildeso en la columna o mediano a lo largo de la columna

3+ Banda superior de aglutinado

4+ Banda de aglutinados en la parte superior de la columna

DP Doble poblacion (doble banda de hematies en el fondo y en la parte

superior

INTERPRETACION DE RESULTADOS

GRUPO HEMATICO GRUPO SERICOmicrotubo

Amicrotubo

Bmicrotubo

ABmicrotubo

CTL

MICROTUBUBON+ a1

MICROTUBUBON+ B

ABOGRUPO

0 0 0 0 + + 0+ 0 + 0 0 + A

0 + + 0 + 0 B

+ + + 0 0 0 AB

SISTEMA RhMicrutubo D Micrutubo

DrdquoMicrutuboCTL

INTERPRETACION

+ + 0 D positivo

0 0 0 D negativo

0 + 0

+ 0 0

D deacutebil parcial

RESULTADO E INTERPRETACION DE LA PRACTICA

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Resultado A+

CONCLUSION

Concluyo que esta teacutecnica es una forma de estabilizar las reacciones de aglutinacioacuten y

reducir los resultados falsamente negativos a consecuencia de una teacutecnica inapropiada

asi como crear un meacutetodo de interpretaciones sencillas y constantes

Practica No 5ldquoPrueba de compatibilidadrdquo

Introduccioacuten

Para requerir una oacuteptima transfusioacuten actualmente serequiere de aceptaciones inmunoloacutegicas receptor - donanteya que la transfusioacuten de sangre o la de sus componentescelulares de un donante a un receptor es una forma detransplante

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La prueba de Coombs se usa para determinar la presencia deanticuerpos no aglutinantes en el suero de sujetossensibilizados a uno o mas antiacutegenos sanguiacuteneos Es uacutetil enel estudio del suero de mujeres con isoinmunizacioacutenmaterno-fetal y se emplea tambieacuten en otro tipo de pruebas

como identificacioacuten de anticuerpos autoinmunes deteccioacutende algunos sistemas sanguiacuteneos y pruebas de compatibilidadsanguiacutenea

La prueba indirecta se realiza con eritrocitos normalesincubados in Vitro con el suero de estudio Durante esteperiodo si existe un anticuerpo este se fija sobre surespectivo determinante antigeacutenico Una vez fijados loseritrocitos son igualmente lavados y se agrega el reactivode Coombs produciendo aglutinacioacuten

Una prueba de Coombs indirecta positiva significa queexisten anticuerpos libres en el suero de la persona loscuales puedan ser igualmente auto-anticuerpos oisoanticuerpos

Material y equipo

bull Pipetas automaacuteticas de 10 microl 25 microl 50 microl y 1 ml

bull Puntas de pipetas desechables

bull Tubos de vidrio

bull Incubador para tarjetas DG Gel

bull Centrifuga para tarjetas DG Gel

Material bioloacutegico

bull Hematiacutees reactivo para investigacioacuten e identificacioacuten de anticuerpos irregulares de

Diagnostic Grifols SA

bull Suero de hemoclasificacioacuten

bull Muestras de sangre de extraccioacuten reciente recogida con anticoagulante o sin

anticoagulante

Reactivos

bull Tarjetas DG Gel

bull DG Gel Sol

Reactivos

Tarjetas DG Gel Coombs DG Gel SolRango de temperatura entre 2 y 25 ordmC Rango de temperatura entre 2 y 8ordmCLote 704901 Lote 7003701Cad 2008-03 Cad 2008-06Aspecto transparente Aspecto transparenteColor verde Color incoloro

TeacutecnicaMeacutetodo manual

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1 Dejar atemperar (18-25ordmC) muestras y reactivo2 Inspeccionar el estado de las tarjetas antes de utilizar3 Identificar las tarjetas y muestras a utilizar4 Despegar con precaucioacuten la lamina de metal que cubre los microtubos para prevenir

contaminaciones cruzadas entre ellos

5 Preparar una suspensioacuten con hematiacutees al 1 en DG Gel Sol (10 microl de sedimento oconcentrado de hematiacutees en 1 ml de DG Gel Sol) Utilizar los hematiacutees del donantepara la PC mayor y hematiacutees del receptor para la PC menor Asegurar la suspensioacuten delos hematiacutees antes de utilizar

6 Dispensar en el tubo correspondiente 50 microl de suspensioacuten de los hematiacutees al 1 deldonante (PC mayor) o 50 microl de suspensioacuten de los hematiacutees al 1 del receptor (PCmenor)

7 Antildeadir 25 microl de suero o plasma del receptor (PC mayor) o 25 microl de suero o plasma deldonante (PC menor)

8 Preparar auto control con 50 microl de suspensioacuten de los hematiacutees al 1 del receptor y 25microl de suero o plasma del receptor

9 Incubar 15 minutos a 37 ordmC10 Centrifugar en la centrifuga para tarjetas DG Gel

11 Leer los resultados

InterpretacioacutenNegativo - Banda de hematiacutees en el fondo de la columna resto de la columna sin aglutinados visibles

Positivo +- Escasos aglutinados de pequentildeo tamantildeo en la mitad inferior de la columna

1+ Algunos aglutinados de pequentildeo tamantildeo en la columna

2+ Aglutinados de tamantildeo pequentildeo o mediano a lo largo de la columna

3+ Banda superior de aglutinados de tamantildeo mediano en la mitad superior de la columna

4+ Banda de hematiacutees aglutinados en la parte superior de la columna

DP Doble poblacioacuten (doble banda de hematiacutees en el fondo y en la parte superior de la columna

Resultados

Paciente Lira Cabrera Carlos Alberto (AB+)Donador 1 Orea Valero Erasmo (A+)Donador 2 Moreno Adolfo (O+)

M1 m1 M2 m2 AutocontrolGR de donador 1 +suero del paciente

GR del paciente +suero de donador 1

GR de donador 2 +suero del paciente

GR del paciente +suero de donador 2

GR del paciente +suero del paciente

- + - + -

Por lo antes expuesto se puede deducir que el donador 1 (A+) puede donar eritrocitos al

paciente (AB+) lo mismo que el donador 2 (O+) puede donarle eritrocitos no asiacute plasma por parte de ambos donadores pues la prueba muestra que hubo reaccioacuten en ambas pruebasmenores

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Conclusioacuten

Concluyo que es esencial que toda la sangre sea estudiadaantes de la transfusioacuten para Asegurar que todos losgloacutebulos rojos transfundidos son compatibles con losanticuerpos en el plasma del paciente Evitar estimular laproduccioacuten de nuevos anticuerpos contra los gloacutebulos rojosen el receptor especialmente anti-Rh D

PRAacuteCTICA No 6PRUEBA DE COMPATIBILIDAD SANGIacuteNEA

(Teacutecnica salina)

INTRODUCCIOacuteN

Landsteiner constatoacute que cuando un aglutinoacutegeno se pone

en contacto con la aglutinina homoacuteloga se produce unaaglutinacioacuten

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La compatibilidad sanguiacutenea es la posibilidad de mezclade sangre sin que se produzcan trastornos tales como losfenoacutemenos de la lisis o de la aglutinacioacuten

A causa de este fenoacutemeno bioloacutegico en las transfusiones

de sangre no es suficiente con conocer que la sangre deldonante y la del receptor son del mismo grupo o bien quela del donante pertenezca al grupo O (cero) sino que esnecesario conocer si la compatibilidad es perfecta porqueninguacuten otro fenoacutemeno de inmunizacioacuten interfiera Es eneste sentido por lo que son empleadas las pruebascruzadas

Ademaacutes de los 6 antiacutegenos del sistema ABO en loseritrocitos humanos existen numerosos sistemas deaglutinoacutegenos que contienen muchos antiacutegenos individuales

en los eritrocitos (maacutes de 500000 millones posibles defenotipos de grupos sanguiacuteneos conocidos) Para evitaraccidentes transfusionales es indispensable tener encuenta el sistema Rh ademaacutes del ABO

Del sistema de antiacutegenos Rh es el D el maacutes antigeacutenico yel teacutermino Rh positivo indica que el individuo presentaaglutinoacutegeno D El individuo Rh negativo no tiene antiacutegenoD y forma la aglutinina anti-D en contacto con eacuteste

Las reacciones antiacutegeno-anticuerpo pueden observarse in

vitro por

mdash Hemoacutelisis la unioacuten antiacutegeno-anticuerpo se traduce enlisis de los eritrocitos en presenciadel complemento (siempre que el anticoagulante empleado nocapture losiones Ca y Mg necesarios para la activacioacuten delcomplemento) mdash Aglutinacioacuten los anticuerpos que reaccionan en mediosalino se conocen comoanticuerpos completos o aglutinantes (comuacutenmente tipo

IgM)

OBJETIVO Determinacioacuten de los antigenos del sistema ABORh (D) y su compatibilidad entre un paciente Donador y unPaciente Receptor

MATERIAL5 Tubos de ensaye6 Pipetas Pasteur

1Gradilla1 Bulbo

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EQUIPOMicrocentriacutefugaBantildeo Mariacutea oacute Estufa

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Papel Parafilm

MUESTRA Muestra de sangre con Anticoagulante EDTA

REACTIVOSAntisuero RO-Antiglobulina humana (Poliespeciacutefico Anti IgG C-d) Para prueba de CoombsLABORATORIOS LAFON SA de C VFecha de Caducidad 31-Ene-09Lote 406Hecho en MeacutexicoAspecto TransparenteColor Verde

TEacuteCNICA

Lavar los eritrocitos con solucioacuten salina (3 veces)

SALINA RAacutePIDA1 Agregar una gota de Eritrocitos Lavados2 Diluirlo al 3-5 con solucioacuten salina 093 Agregar 2 gotas de suero4 Centrifugar y observar anotar desprendimiento del botoacuten

SALINA 37deg BANtildeO MARIacuteA

1 Incubar tubos a Bantildeo mariacutea a 37degC durante 1hora (o 20 min)2 Centirfugar despueacutes de haber pasado el

tiempo3 Desprender el botoacuten de eritrocitos y

observarAGLUTINACIOacuteNndash No es compatibleNO AGLUTINACIOacuteN - Lavar 3 veces

SALINA COOMBS

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PRUEBA MAYOR

G Rojos del DONADOR+

Suero del RECEPTOR(paciente)

PRUEBA MENOR

G Rojos del RECEPTOR(paciente)

+Suero del DONADOR

AUTOTESTIGO

G Rojos del RECEPTOR(paciente)

+Suero del RECEPTOR

(paciente)

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1 Con solucioacuten salina 09 lavar loseritrocitos de los tubos q no tuvieronaglutinacioacuten 3 veces

2 Decantar y agregar 2 gotas de reactivode Coombs

AGLUTINACIOacuteN ndash No es compatibleNO AGLUTINACIOacuteN - Lavar 3 veces

RESULTADOS

Paciente Madrigal Meacutendez Luis Eduardo (B+)Folio 009164Fecha301007

Donador 1 Torres Avileacutes Joseacute Ramoacuten (O+)Folio 022604Fecha311007

Donador 2 Rodriacuteguez Nuacutentildeez Joseacute Angel (A+) Folio 022605

Fecha311007

SALINA RAacutePIDA

M1 m1 M2 m2 AutotestigoGR de donador 1+ suero del

paciente

GR del paciente+ suero dedonador 1

GR de donador 2+ suero del

paciente

GR del paciente+ suero dedonador 2

GR del paciente+ suero del

paciente

- 4+ 4+ 4+ -

SALINA 37deg BANtildeO MARIacuteA

M1 m1 M2 m2 Autotestigo- 4+ 4+ 4+ -

Compatible Nocompatible

Nocompatible

Nocompatible

Compatible

SALINA COOMBS

Por lo tanto se puede decir que el donador 1 (O+) puededonar suero al paciente (B+) debido a que en el suero nohay anticuerpos de ninguacuten tipo que reaccionen con losantiacutegenos de los eritrocios del Donador 1 Mientras tantoel Donador 2 no puede donar al Paciente ni suero nieritrocitos

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M1 Autotestigo- -

Compatible

Compatible

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INTERPRETACIOacuteN

PRUEBA POSITIVA Existe una aglutinacioacuten de lasceacutelulas sanguiacuteneas que indica la presencia delantiacutegeno A o B En el suero de Coombs notamos si esta

la precencia de Antiacutegeno D en los eritrocitos Lahemoacutelisis no se debe interpretar como resultadopositivo ya que puede indicar contaminacioacuten delreactivo

PRUEBA NEGATIVA La no aglutinacioacuten indica unresultado negativo e indica que las ceacutelulas sonnegativas para Antiacutegenos del sisitema ABO y D

CONCLUSIOacuteN

He concluido que en las transfusiones de sangre no essuficiente con conocer que la sangre del donante y la delreceptor son del mismo grupo o bien que la del donantepertenezca al grupo O (cero) sino que es necesarioconocer si la compatibilidad es perfecta porque ninguacutenotro fenoacutemeno de inmunizacioacuten interfiera Es en estesentido por lo que son empleadas las pruebas cruzadas

Praacutectica No 7ldquoPrueba de compatibilidad sanguiacutenea (teacutecnica albumina)rdquo

IntroduccioacutenLa tipificacioacuten de sangre identifica el tipo sanguiacuteneo determinandoantiacutegenos presentes en los eritrocitos detecta aloanticuerpos encontra esos antiacutegenos Asiacute los aloanticuerpos pueden aparecernaturalmente o ser inducidos y pueden ser dirigidos contra del grupoconocido o a los antiacutegenos de superficie de los eritrocitos La prueba

de compatibilidad sanguiacutenea o cross matching esta formada por laprueba mayor y menorLa prueba de cruzamiento mayor para losaloanticuerpos consiste en probar el plasma del receptor contra los

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gloacutebulos rojos del donante Es incompatible cuando se genera unareaccioacuten hemoliacutetica los eritrocitos del donante se destruyen por losaloanticuerpos del plasma del receptor La prueba menor es una pruebapara los aloanticuerpos del plasma del donante en contra los gloacutebulosrojos del receptor Una incompatibilidad menor es una causa menosfrecuente para causar una reaccioacuten en contra una transfusioacuten porque

el volumen de plasma del donante es menor y es diluido marcadamente enel receptor Para llevar a cabo dicho procedimiento se utilizandiversos reactivos como potencializadores que mejoran la unioacuten deeritrocitos con alguacuten tipo de anticuerpo Uno de esospotencializadores es la albuacutemina La albumina bovina polimerizada esun reactivo muy utilizado en el laboratorio de inmunohematologia y encentros de bancos de sangre funciona como un potencializador quefacilita la reaccion de aglutinacioacuten de eritrocitos sensibilizados Alfinal de la prueba se prueban los eritrocitos con el reactivo deCoombs El principio de la prueba de Coombs fue descrito por Moreschien 1908 pero Coombs Mourant y Race en 1946 la introdujeron en elestudio de los grupos sanguiacuteneos y anticuerpos cuando una parte desangre (suero) fue usada para la inoculacioacuten de animales para

inmunizarlos con proteiacutena humana utilizando el anticuerpo obtenido enla deteccioacuten de los llamados anticuerpos incompletos Esta prueba seusa para determinar la presencia de anticuerpos no aglutinantes en elsuero de sujetos sensibilizados a uno o mas antiacutegenos sanguiacuteneos Esuacutetil en el estudio del suero de mujeres con isoinmunizacioacuten materno-fetal y se emplea tambieacuten en otro tipo de pruebas como identificacioacutende anticuerpos autoinmunes deteccioacuten de algunos sistemas sanguiacuteneos ypruebas de compatibilidad sanguiacutenea La prueba indirecta se realizacon eritrocitos normales incubados in Vitro con el suero de estudioDurante este periodo si existe un anticuerpo este se fija sobre surespectivo determinante antigeacutenico Una vez fijados los eritrocitosson igualmente lavados y se agrega el reactivo de Coombs produciendoaglutinacioacuten Una prueba de Coombs indirecta positiva significa que

existen anticuerpos libres en el suero de la persona los cualespuedan ser igualmente auto-anticuerpos o isoanticuerpos

Objetivo Determinacioacuten de los antiacutegenos del sistema ABO Rh (D) y sucompatibilidad entre un paciente Donador y un Paciente Receptor

Material y equipo

5 Tubos de ensaye

6 Pipetas Pasteur

1Gradilla

1 Bulbo

Papel Parafilm

Microcentriacutefuga

Bantildeo Mariacutea oacute Estufa

Material bioloacutegico

Muestras de sangre de extraccioacuten reciente recogida conanticoagulante o sin anticoagulante

ReactivosSuero de CoombsAlbuacutemina bovina deg

Suero anti-globulina humana Lafon Lote 406 Cad 310109 Color verde Aspecto

transparentedegAlbumina de bovino polimerizada Interbiol Lote APO107 Cad 150109 Color incoloroAspecto transparente

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Teacutecnica

1 Montar prueba mayor 1 y 2 prueba menor 1 y 2 y autotestigocon el procedimiento ya anteriormente conocido

2 Agregar 2 gotas de albuacutemina al 223 Centrifugar 20 segundos4 observar aglutinacioacuten o hemolisis o no aglutinacioacuten5 A los tubos con lecturas negativas incubar 20 minutos en bantildeo

Mariacutea a 37 degC6 Centrifugar y observar

bull Aglutinacioacuten o hemoacutelisis reportar incompatible

bull No aglutinacioacuten llevar a Coombs

7 Lavar tres veces decantar y quitar el exceso de salina congasa y agregar 2 gotas de reactivo de Coombs y centrifugar 20segundos y observar

bull Aglutinacioacuten o hemoacutelisis reportar incompatible

bull No aglutinacioacuten reportar compatible

Resultados1 PRUEBA MAYOR 1 2 Gotas de suero del paciente + 1 gota de GR al 3-5 del

donador 12 PRUEBA MENOR 1 2 Gotas de suero del donador 1 + 1 gota de GR al 3-5 del

paciente3 PRUEBA MAYOR 2 2 Gotas de suero del paciente + 1 gota de GR al 3-5 del

donador 24 PRUEBA MENOR 2 2 Gotas de suero del donador 2 + 1 gota de GR al 3-5 del

paciente5 AUTOTESTIGO 2 Gotas de suero del paciente + 1 gota de GR al 3-5 del paciente

M1 m1 M2 m2 AutotestigoCon albuacutemina - - - - -Despueacutes de incubacioacuten a 37 degC - - - - -Despueacutes de Coombs - - - - -Despueacutes de validacioacuten con gloacutebulos

positivos+ + + + +

InterpretacioacutenPrueba positiva Alutinacioacuten o hemolisis Indica no compatibilidadPrueba negativaNo aglutinacioacuten Indica compatibilidad

Esquemas

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ConclusioacutenConcluyo que la prueba de compatibilidad sanguiacutenea en su modalidad conalbuacutemina bovina ofrece mucha ventaja al ser al igual que otrosreactivos un potencializador de la reaccioacuten antiacutegeno-anticuerpo Estopermite que el operador o realizador de la prueba tenga mayorconfianza y certeza en los resultados que obtenga

PRACTICA No 8PRUEBA DE COMPATIBILIDAD SANGUINEA PRUEBA DE LISS

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FUNDAMENTO

LISS es utilizado para reducir la fuerza ioacutenica del medio

de reaccioacuten en los procedimientos de deteccioacuten eidentificacioacuten de anticuerpos y en las pruebas decompatibilidad La presencia de este reactivo refuerza lainteraccioacuten antiacutegeno - anticuerpo durante la incubacioacuten

GENERALIDADESEl uso de solucioacuten salina de baja fuerza ioacutenica fuedescrito inicialmente en 1964 por Hughes-Jones y col y

Elliot y col pero en ese tiempo su uso era limitado yaque la concentracioacuten molar obtenida provocaba la hemoacutelisisde los eritrocitos suspendidos

En 1974 Low y Messeter describieron el uso rutinario de lasolucioacuten Liss de 003 M que lograba reducir el tiempo deincubacioacuten y no presentaba tendencia a la hemoacutelisis al sersuspendidos en salina a baja fuerza ioacutenica restableciendola presioacuten osmoacutetica de la solucioacuten mediante la adicioacuten deglicinaLas soluciones de baja fuerza ioacutenica son actualmente lasmaacutes utilizadas en inmunohematologiacutea provocando un aumentoen la velocidad de asociacioacuten entre antiacutegenos y anticuerpospermitiendo asiacute acortar el tiempo de incubacioacuten de 60minutos a 10-15 minutos sin sacrificar la sensibilidad delas mismas y sin costos elevadosSe ha observado que lasreacciones antiacutegeno-anticuerpo se ven potenciadas alreducir la fuerza ioacutenica del medio de reaccioacuten

La fuerza ioacutenica es uno de los factores maacutes importantes quedeterminan la tasa y la cantidad de captacioacuten deanticuerpos por parte de los eritrocitos El uso de mediosde reaccioacuten de baja fuerza ioacutenica permite disminuir eltiempo de incubacioacuten y potenciar las reacciones de losanticuerpos sin incrementar las reacciones inespeciacuteficas

Los iones Na+ y Cl- presentes en la solucioacuten salinafisioloacutegica se agrupan alrededor de las moleacuteculas deantiacutegeno y anticuerpo neutralizando sus cargas opuestas locual dificulta la unioacuten entre ellos Este efecto se reduceutilizando soluciones de baja fuerza ioacutenica y disminuyendode esta manera la incubacioacuten de las pruebas

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En esta etapa de sensibilizacioacuten las posibilidades deasociacioacuten pueden incrementarse mediante agitacioacutencentrifugacioacuten yo variacioacuten de la concentracioacuten delanticuerpo

Despueacutes de que el anticuerpo se ha fijado al antiacutegeno loseritrocitos sensibilizados deben unirse para dar lugar a laaglutinacioacuten visible esta red tambieacuten solidifica yestabiliza la reaccioacuten

En esta etapa la reaccioacuten depende de factores como lascaracteriacutesticas del anticuerpo localizacioacuten en la membranay nuacutemero de sitios antigeacutenicos fuerzas que mantienen ladistancia entre los eritrocitos

Las caracteriacutesticas del anticuerpo que deben considerarse

son el tamantildeo del anticuerpo involucrado y el nuacutemero desitios de combinacioacuten con el antiacutegeno Los anticuerpos IgMpueden establecer puentes entre los eritrocitos yaglutinarlos espontaacuteneamente en solucioacuten salina mientrasque los IgG no ya que las IgM pentameacutericas poseen 10sitios de combinacioacuten con el antiacutegeno y las IgG diacutemerossoacutelo dos sitios

Los eritrocitos tienen una carga neta negativa en susuperficie su interaccioacuten con los iones del medio alteraesta carga y producen una carga neta criacutetica denominada

potencial zeta y la reduccioacuten de dicha carga permite quelos eritrocitos se aproximen lo suficiente para que seanaglutinados por medio de los IgG que los sensibilizaron

Las soluciones de baja fuerza ionica empleadas en banco desangre tienen un pH entre 65 ndash 70 se recomienda unaosmolalidad de 270 ndash 305 mosmkg y una conductividad de 37mmcm El control diario implica el examen de su aparienciafiacutesica ausencia de turbidez particulas o sedimento asiacutecomo corroborar la capacidad para generar hemoacutelisiscrenacion o prueba de coombs positiva en eritrocitos

normales Cada lote nuevo se valora mediante el rastreo deun anticuerpo ya sea un anti- D un anti- jk anti- fy oanti- kell diluido se compara su capacidad de deteccioacutencontra un medio salino normal incubando 10min a 37ordmC enLISS debe poder rastrearse un anticuerpo en tanto que enmedio salino no

MATERIAL Y EQUIPO

Material Cantidad10 Tubos de ensayo de 12 x 75

1 Gradilla10 Pipetas pasteur

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1 Bulbo1 Marcador1 Microcentriacutefuga1 Bantildeo Mariacutea

MATERIAL BIOLOGICO

Gloacutebulos rojos lavados al 3 - 5Suero

REACTIVOS

Reactivo de LISSReactivo de Coombs

TECNICA1- Lavar los eritrocitos

Separar el suero del paquete de gloacutebulos rojos

Agregar cierta cantidad de eritrocitos a un tubo deensayo y agregarle solucioacuten salina

Centrifugar y decantar

Repetir este proceso 3 veces

2- Realizar la Prueba de LISS

Enumerar los tubos Poner dos gotas de LISS en cada tubo agregar una gota

de eritrocitos lavados y al 3 - 5 seguacuten el nuacutemero detubo correspondiente

Mezclar y centrifugar un minuto decantar elsobrenadante y con la ayuda de una gasa limpiar elexceso del reactivo

Poner nuevamente 2 gota de LISS resuspender poragitacioacuten agregar 2 gotas de suero problema mezclarincubar 15 minutos a 37ordm C centrifugar 30 seg A 1000

RPM Anotar los resultados

3- A las pruebas negativas realizar Coombs

Lavar 3 veces las ceacutelulas agregar suero de Coombscentrifugar 30 seg

Leer aglutinaciones y anotar resultados

REACTIVOS UTILIZADOS

REACTIVO MARCA FECHA DECADUCIDAD

ASPECTO COLOR LOTE

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SueroAntiglobuina

humana

Lafon 31 01 2009 Transparente Verde 406

LISS Caserorealizado enCMNSIGLOXXI

1 antildeo Transparente Transparente

----------

PACIENTE ASCANIO MENDEZ JOSUE O (+)DONADOR 1 GARCIA CARBAJAL OSCAR O (+)DONADOR 2 GARCIA SUAREZ ORLANDO A (+)

RESULTADOS

INTERPRETACIOacuteN DE LOS RESULTADOS

La hemoacutelisis o la aglutinacioacuten representan un resultado positivo e indican lapresencia de una reaccioacuten antiacutegeno-anticuerpo Los resultados negativos no severa aglutinacioacuten o hemolisis

ESQUEMAS

CONCLUSIONES

Concluyo que la prueba de compatibilidad sanguiacutenea en su modalidad conliss ofrece mucha ventaja al ser al igual que otros reactivos unpotencializador de la reaccioacuten antiacutegeno-anticuerpo Esto permite queel operador o realizador de la prueba tenga mayor confianza y certezaen los resultados que obtenga

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Tubo Resultado

M1 NEGATIVOm1 NEGATIVO

M2 POSITIVO

M2 NEGATIVO

AUTOTES NEGATIVO

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PRACTICA 9INMUNOHEMATOLOGIA

DETERMINACION DE COOMBS DIRECTO

INTRODUCCIONPRUEBA DE COOMBS DIRECTA

El examen de Coombs directo se utiliza para detectar autoanticuerpos contralos propios gloacutebulos rojos (GR) de un individuo Es una prueba que sirve parademostrar el revestimiento de los eritrocitos in vivo (mientras los eritrocitosestaacuten circulando en el individuo) La prueba se realiza agregando directamenteel reactivo de Coombs a los eritrocitos previamente lavados para eliminar otras proteiacutenas no fijadas a el una prueba directa positiva significa que larelacioacuten antiacutegeno-anticuerpo ocurrioacute in vivo es decir que la fijacioacuten del

anticuerpo sobre el antiacutegeno se realizo en el organismo del individuo enestudio

Las indicaciones principales de esta prueba son diagnostico de enfermedadeshemoliacuteticas ictericia o anomaliacuteas en la apariencia de los gloacutebulos rojos bajo elmicroscopio ya que estos anticuerpos algunas veces destruyen los gloacutebulosrojos y causan anemia para investigar reacciones en transfusiones Parainvestigar la induccioacuten de drogas en ceacutelulas rojas sensibilizadas medicamentos(por ejemplo quinidina metildopa procainamida y otros) que pueden llevar a la produccioacuten de estos anticuerpos

OBJETIVO Determinar la presencia de anticuerpos en la superficie de losgloacutebulos rojos del individuo

MATERIAL

bull 10 Tubos de 1275

bull 10 Pipetas Pasteur

bull 1 Gradilla

bull 1 Bulbo

bull Papel Parafilm

bull Microcentriacutefuga

bull Bantildeo Mariacutea a 37degC

MUESTRA BIOLOGICA

Eritrocitos lavados de (3-5) del donador o pacienteREACTIVO

Suero de CoombsSuero anti-globulina humana Lafon Lote 406 Cad 310109 Color verde Aspecto transparente

TECNICA

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Colocar en un tubo de ensaye dos gotas de suero de Coombs mas una gota deglobulos rojos (3-5)Centrifugar a 1000 rpm durante 20 segDesprender el boton suavemente y buscar la presencia de aglutinacionRotular y enumerar 8 tubos de ensayes con las diferentes diluciones

(frac12frac1418)Enumerar 8 tubos mas del 1 al 8Agregar a cada tubo de las diluciones 10 gotas de solucion salina mas 10 gotasde suero de CoombsColocar Al primer tubo de la dilucion 1 gota de globulos rojos (3-5) mezclar completamente y agregar al tubo 1Centrifugar todos los tubos a 1000 rpm durante 20 seg

LECTURA

Aglutina- Prueba de Coombs directa es positiva

No aglutina- Prueba de Coombs directa es negativa

ESQUEMAS y RESULTADOS

CONCLUCION

He concluido que la prueba de Coombs directa es una prueba que se utiliza para medir

la presencia de anticuerpos en la superficie de los gloacutebulos rojos que se encuentran

circulando en el paciente y se realiza para investigar reacciones en transfusiones ademaacutes

sirve para la determinacioacuten de anemia hemoliacutetica autoinmune entre otras afecciones

Practica 10

IDENTIFICACION DE ANTICUERPOS IRREGULARES

Fundamento

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DILUCIONES

frac12 positiva

frac14 positiva

18 positiva

116 negativa

132 negativa

164 negativa

1128 negativa1256 negativa

31

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Los anticuerpos del sistema ABO aparecen una vez que elindividuo entra en contacto con el medio ambiente y en elcual se encuentran microorganismos como algunas bacteriascoliformes que contienen sustancias quiacutemicas en suestructura parecidas a las de este sistema Por anticuerpos

regulares debemos identificar a los que existen en todoslos individuos y que eacutestos tendraacuten durante toda su vida

Los anticuerpos irregulares son los que no estaacuten de esamanera aunque en el caso de los naturales no se conoce aciencia cierta queacute o coacutemo se induce su produccioacuten Losadquiridos se conocen tambieacuten como inmunes y son elresultado de la exposicioacuten a antiacutegenos desconocidos por elindividuo al momento de la transfusioacuten o en las mujerespor el embarazo estos anticuerpos son dirigidos contraantiacutegenos de sistemas diferentes al ABO

Los anticuerpos naturales regulares son preferentementeinmunoglobulinas M las cuales fijan de manera taneficiente el complemento que pueden provocar lisisintravascular y ocasionar insuficiencia renal o incluso lamuerte del paciente Los anticuerpos adquiridos o inmunesson generalmente inmunoglobulinas G las cuales producenhemoacutelisis extravascular en el bazo o en el hiacutegado mediantefagocitosis del complejo eritrocito maacutes anticuerpo

Los aloanticuerpos irregulares (adquiridos) maacutes comunes en

nuestra poblacioacuten son los que involucran a los sistemasMNSs P1 Kidd (Jka Jkb) Duffy (Fya Fyb) Kell Lewis yDiego

OBJETIVO identificacioacuten del anticuerpo irregular a traveacutesde las diferentes teacutecnicas

MATERIAL

bull 10 Tubos de ensaye

bull 10 Pipetas Pasteur

bull

1Gradillabull 1 Bulbo

bull Papel Parafim

MATERIAL BIOLOGICO

bull Gloacutebulos rojos lavados al 3 - 5

bull Suero

bull REACTIVOSReactivos

1 Suero de Coombs2 Albuacutemina bovina

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bull EQUIPO1 Microcentriacutefuga2 Bantildeo Mariacutea oacute Estufa

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3 SOLUCION SALINA4 SOLUCION DE LISS

TEacuteCNICA SOLUCION SALINA

Lavar los eritrocitos con solucioacuten salina (3veces)SALINA RAacutePIDA

Agregar una gota de Eritrocitos LavadosDiluiacuterlo al 3-5 con solucioacuten salina 09Agregar 2 gotas de sueroCentrifugar y observar anotar desprendimientodel botoacuten

SALINA 37deg BANtildeO MARIacuteA1) Incubar tubos a Bantildeo mariacutea a 37degC durante 1

hora (o 20 min)

2) Centirfugar despueacutes de haber pasado eltiempo

3) Desprender el botoacuten de eritrocitos yobservar

AGLUTINACIOacuteNndash No es compatibleNO AGLUTINACIOacuteN - Lavar 3 veces

SALINA COOMBS1) Con solucioacuten salina 09 lavar los

eritrocitos de los tubos q no tuvieronaglutinacioacuten 3 veces

2) Decantar y agregar 2 gotas de reactivode Coombs

AGLUTINACIOacuteN ndash No es compatibleNO AGLUTINACIOacuteN - Lavar 3 veces

TECNICA LISS

1 Poner dos gotas de LISS en cada tubo agregar una gotade eritrocitos lavados y al 3 - 5 seguacuten el nuacutemero detubo correspondiente

2 Mezclar y centrifugar un minuto decantar el

sobrenadante y con la ayuda de una gasa limpiar elexceso del reactivo

3 Poner nuevamente 2 gota de LISS resuspender poragitacioacuten agregar 2 gotas de suero problema mezclarincubar 15 minutos a 37ordm C centrifugar 30 seg A 1000RPM

4 Anotar los resultados

A las pruebas negativas realizar Coombs

1 Lavar 3 veces las ceacutelulas agregar suero de Coombs

centrifugar 30 seg2 Leer aglutinaciones y anotar resultados

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TECNICA ALBUMINA BOVINA 8 Agregar 2 gotas de albuacutemina al 229 Centrifugar 20 segundos10observar aglutinacioacuten o hemolisis o no aglutinacioacuten

11A los tubos con lecturas negativas incubar 20minutos en bantildeo Mariacutea a 37 degC12Centrifugar y observar

bull Aglutinacioacuten o hemoacutelisis reportar incompatible

bull No aglutinacioacuten llevar a Coombs

13Lavar tres veces decantar y quitar el exceso desalina con gasa y agregar 2 gotas de reactivo deCoombs y centrifugar 20 segundos y observar

bull Aglutinacioacuten o hemoacutelisis reportar incompatible

bull No aglutinacioacuten reportar compatible

Resultados ANTICUERPO IRREGULAR Anticuerpo c

InterpretacioacutenEstos anticuerpos son generalmente inmunoglobulinas tipo My ocasionalmente tipo G y debido a esa temperatura dereaccioacuten carecen de importancia cliacutenica salvo que sureaccioacuten ocurra tambieacuten a 37 degC su importancia radica enpacientes que seraacuten intervenido a 22 ordmc como es el caso de

operacioacuten de corazoacuten

Los llamados anticuerpos calientes tienen una temperatura oacuteptima dereaccioacuten a 37 degC a Estos anticuerpos tienen una relevanteimportancia cliacutenica ya que se les asocia con reaccionestransfusionales de intensidad moderada a severa que puedenocasionar la muerte

Esquemas

CONCLUSIONHe concluido que es importante determinar los anticuerposirregulares ya que estos anticuerpos tienen una relevanteimportancia cliacutenica ya que se les asocia con reaccionestransfusionales de intensidad moderada a severa

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TECNICA1- determinacion de los antigenos del sistema ABORh

-preparar una suspension de hematies al 5 de DG sol Asegurar la resuspencion de lso

hematies antes de utilizar

Anadir en cada microtubulos indicados 10 ul de una suspension de hematies al 5

2- determinacion de l grupo serico-homogenizar los hematies recativos A1B

- dispersar el microtubulo N a1 50 ul de hematies reactivos A1 en un microtubulo Nb

50 ul de hematies reactivos B

-antildeadir suero o plasma

3- centrigugar en centrifuga para DG sol

Leer los resultados

RESULTADOS

NEGATIVO - Banda de hematies al fondo de la columna resto de la columna sin

aglutinados

POSITIVO

+- Escasoa glutinados de pequentildeo tamantildea d ela columna

1+ Algunos aglutinados pequentildeso en la columna

2+ aglutinados pequentildeso en la columna o mediano a lo largo de la columna

3+ Banda superior de aglutinado

4+ Banda de aglutinados en la parte superior de la columna

DP Doble poblacion (doble banda de hematies en el fondo y en la parte

superior

INTERPRETACION DE RESULTADOS

GRUPO HEMATICO GRUPO SERICOmicrotubo

Amicrotubo

Bmicrotubo

ABmicrotubo

CTL

MICROTUBUBON+ a1

MICROTUBUBON+ B

ABOGRUPO

0 0 0 0 + + 0+ 0 + 0 0 + A

0 + + 0 + 0 B

+ + + 0 0 0 AB

SISTEMA RhMicrutubo D Micrutubo

DrdquoMicrutuboCTL

INTERPRETACION

+ + 0 D positivo

0 0 0 D negativo

0 + 0

+ 0 0

D deacutebil parcial

RESULTADO E INTERPRETACION DE LA PRACTICA

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Resultado A+

CONCLUSION

Concluyo que esta teacutecnica es una forma de estabilizar las reacciones de aglutinacioacuten y

reducir los resultados falsamente negativos a consecuencia de una teacutecnica inapropiada

asi como crear un meacutetodo de interpretaciones sencillas y constantes

Practica No 5ldquoPrueba de compatibilidadrdquo

Introduccioacuten

Para requerir una oacuteptima transfusioacuten actualmente serequiere de aceptaciones inmunoloacutegicas receptor - donanteya que la transfusioacuten de sangre o la de sus componentescelulares de un donante a un receptor es una forma detransplante

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La prueba de Coombs se usa para determinar la presencia deanticuerpos no aglutinantes en el suero de sujetossensibilizados a uno o mas antiacutegenos sanguiacuteneos Es uacutetil enel estudio del suero de mujeres con isoinmunizacioacutenmaterno-fetal y se emplea tambieacuten en otro tipo de pruebas

como identificacioacuten de anticuerpos autoinmunes deteccioacutende algunos sistemas sanguiacuteneos y pruebas de compatibilidadsanguiacutenea

La prueba indirecta se realiza con eritrocitos normalesincubados in Vitro con el suero de estudio Durante esteperiodo si existe un anticuerpo este se fija sobre surespectivo determinante antigeacutenico Una vez fijados loseritrocitos son igualmente lavados y se agrega el reactivode Coombs produciendo aglutinacioacuten

Una prueba de Coombs indirecta positiva significa queexisten anticuerpos libres en el suero de la persona loscuales puedan ser igualmente auto-anticuerpos oisoanticuerpos

Material y equipo

bull Pipetas automaacuteticas de 10 microl 25 microl 50 microl y 1 ml

bull Puntas de pipetas desechables

bull Tubos de vidrio

bull Incubador para tarjetas DG Gel

bull Centrifuga para tarjetas DG Gel

Material bioloacutegico

bull Hematiacutees reactivo para investigacioacuten e identificacioacuten de anticuerpos irregulares de

Diagnostic Grifols SA

bull Suero de hemoclasificacioacuten

bull Muestras de sangre de extraccioacuten reciente recogida con anticoagulante o sin

anticoagulante

Reactivos

bull Tarjetas DG Gel

bull DG Gel Sol

Reactivos

Tarjetas DG Gel Coombs DG Gel SolRango de temperatura entre 2 y 25 ordmC Rango de temperatura entre 2 y 8ordmCLote 704901 Lote 7003701Cad 2008-03 Cad 2008-06Aspecto transparente Aspecto transparenteColor verde Color incoloro

TeacutecnicaMeacutetodo manual

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1 Dejar atemperar (18-25ordmC) muestras y reactivo2 Inspeccionar el estado de las tarjetas antes de utilizar3 Identificar las tarjetas y muestras a utilizar4 Despegar con precaucioacuten la lamina de metal que cubre los microtubos para prevenir

contaminaciones cruzadas entre ellos

5 Preparar una suspensioacuten con hematiacutees al 1 en DG Gel Sol (10 microl de sedimento oconcentrado de hematiacutees en 1 ml de DG Gel Sol) Utilizar los hematiacutees del donantepara la PC mayor y hematiacutees del receptor para la PC menor Asegurar la suspensioacuten delos hematiacutees antes de utilizar

6 Dispensar en el tubo correspondiente 50 microl de suspensioacuten de los hematiacutees al 1 deldonante (PC mayor) o 50 microl de suspensioacuten de los hematiacutees al 1 del receptor (PCmenor)

7 Antildeadir 25 microl de suero o plasma del receptor (PC mayor) o 25 microl de suero o plasma deldonante (PC menor)

8 Preparar auto control con 50 microl de suspensioacuten de los hematiacutees al 1 del receptor y 25microl de suero o plasma del receptor

9 Incubar 15 minutos a 37 ordmC10 Centrifugar en la centrifuga para tarjetas DG Gel

11 Leer los resultados

InterpretacioacutenNegativo - Banda de hematiacutees en el fondo de la columna resto de la columna sin aglutinados visibles

Positivo +- Escasos aglutinados de pequentildeo tamantildeo en la mitad inferior de la columna

1+ Algunos aglutinados de pequentildeo tamantildeo en la columna

2+ Aglutinados de tamantildeo pequentildeo o mediano a lo largo de la columna

3+ Banda superior de aglutinados de tamantildeo mediano en la mitad superior de la columna

4+ Banda de hematiacutees aglutinados en la parte superior de la columna

DP Doble poblacioacuten (doble banda de hematiacutees en el fondo y en la parte superior de la columna

Resultados

Paciente Lira Cabrera Carlos Alberto (AB+)Donador 1 Orea Valero Erasmo (A+)Donador 2 Moreno Adolfo (O+)

M1 m1 M2 m2 AutocontrolGR de donador 1 +suero del paciente

GR del paciente +suero de donador 1

GR de donador 2 +suero del paciente

GR del paciente +suero de donador 2

GR del paciente +suero del paciente

- + - + -

Por lo antes expuesto se puede deducir que el donador 1 (A+) puede donar eritrocitos al

paciente (AB+) lo mismo que el donador 2 (O+) puede donarle eritrocitos no asiacute plasma por parte de ambos donadores pues la prueba muestra que hubo reaccioacuten en ambas pruebasmenores

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Conclusioacuten

Concluyo que es esencial que toda la sangre sea estudiadaantes de la transfusioacuten para Asegurar que todos losgloacutebulos rojos transfundidos son compatibles con losanticuerpos en el plasma del paciente Evitar estimular laproduccioacuten de nuevos anticuerpos contra los gloacutebulos rojosen el receptor especialmente anti-Rh D

PRAacuteCTICA No 6PRUEBA DE COMPATIBILIDAD SANGIacuteNEA

(Teacutecnica salina)

INTRODUCCIOacuteN

Landsteiner constatoacute que cuando un aglutinoacutegeno se pone

en contacto con la aglutinina homoacuteloga se produce unaaglutinacioacuten

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La compatibilidad sanguiacutenea es la posibilidad de mezclade sangre sin que se produzcan trastornos tales como losfenoacutemenos de la lisis o de la aglutinacioacuten

A causa de este fenoacutemeno bioloacutegico en las transfusiones

de sangre no es suficiente con conocer que la sangre deldonante y la del receptor son del mismo grupo o bien quela del donante pertenezca al grupo O (cero) sino que esnecesario conocer si la compatibilidad es perfecta porqueninguacuten otro fenoacutemeno de inmunizacioacuten interfiera Es eneste sentido por lo que son empleadas las pruebascruzadas

Ademaacutes de los 6 antiacutegenos del sistema ABO en loseritrocitos humanos existen numerosos sistemas deaglutinoacutegenos que contienen muchos antiacutegenos individuales

en los eritrocitos (maacutes de 500000 millones posibles defenotipos de grupos sanguiacuteneos conocidos) Para evitaraccidentes transfusionales es indispensable tener encuenta el sistema Rh ademaacutes del ABO

Del sistema de antiacutegenos Rh es el D el maacutes antigeacutenico yel teacutermino Rh positivo indica que el individuo presentaaglutinoacutegeno D El individuo Rh negativo no tiene antiacutegenoD y forma la aglutinina anti-D en contacto con eacuteste

Las reacciones antiacutegeno-anticuerpo pueden observarse in

vitro por

mdash Hemoacutelisis la unioacuten antiacutegeno-anticuerpo se traduce enlisis de los eritrocitos en presenciadel complemento (siempre que el anticoagulante empleado nocapture losiones Ca y Mg necesarios para la activacioacuten delcomplemento) mdash Aglutinacioacuten los anticuerpos que reaccionan en mediosalino se conocen comoanticuerpos completos o aglutinantes (comuacutenmente tipo

IgM)

OBJETIVO Determinacioacuten de los antigenos del sistema ABORh (D) y su compatibilidad entre un paciente Donador y unPaciente Receptor

MATERIAL5 Tubos de ensaye6 Pipetas Pasteur

1Gradilla1 Bulbo

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EQUIPOMicrocentriacutefugaBantildeo Mariacutea oacute Estufa

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Papel Parafilm

MUESTRA Muestra de sangre con Anticoagulante EDTA

REACTIVOSAntisuero RO-Antiglobulina humana (Poliespeciacutefico Anti IgG C-d) Para prueba de CoombsLABORATORIOS LAFON SA de C VFecha de Caducidad 31-Ene-09Lote 406Hecho en MeacutexicoAspecto TransparenteColor Verde

TEacuteCNICA

Lavar los eritrocitos con solucioacuten salina (3 veces)

SALINA RAacutePIDA1 Agregar una gota de Eritrocitos Lavados2 Diluirlo al 3-5 con solucioacuten salina 093 Agregar 2 gotas de suero4 Centrifugar y observar anotar desprendimiento del botoacuten

SALINA 37deg BANtildeO MARIacuteA

1 Incubar tubos a Bantildeo mariacutea a 37degC durante 1hora (o 20 min)2 Centirfugar despueacutes de haber pasado el

tiempo3 Desprender el botoacuten de eritrocitos y

observarAGLUTINACIOacuteNndash No es compatibleNO AGLUTINACIOacuteN - Lavar 3 veces

SALINA COOMBS

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PRUEBA MAYOR

G Rojos del DONADOR+

Suero del RECEPTOR(paciente)

PRUEBA MENOR

G Rojos del RECEPTOR(paciente)

+Suero del DONADOR

AUTOTESTIGO

G Rojos del RECEPTOR(paciente)

+Suero del RECEPTOR

(paciente)

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1 Con solucioacuten salina 09 lavar loseritrocitos de los tubos q no tuvieronaglutinacioacuten 3 veces

2 Decantar y agregar 2 gotas de reactivode Coombs

AGLUTINACIOacuteN ndash No es compatibleNO AGLUTINACIOacuteN - Lavar 3 veces

RESULTADOS

Paciente Madrigal Meacutendez Luis Eduardo (B+)Folio 009164Fecha301007

Donador 1 Torres Avileacutes Joseacute Ramoacuten (O+)Folio 022604Fecha311007

Donador 2 Rodriacuteguez Nuacutentildeez Joseacute Angel (A+) Folio 022605

Fecha311007

SALINA RAacutePIDA

M1 m1 M2 m2 AutotestigoGR de donador 1+ suero del

paciente

GR del paciente+ suero dedonador 1

GR de donador 2+ suero del

paciente

GR del paciente+ suero dedonador 2

GR del paciente+ suero del

paciente

- 4+ 4+ 4+ -

SALINA 37deg BANtildeO MARIacuteA

M1 m1 M2 m2 Autotestigo- 4+ 4+ 4+ -

Compatible Nocompatible

Nocompatible

Nocompatible

Compatible

SALINA COOMBS

Por lo tanto se puede decir que el donador 1 (O+) puededonar suero al paciente (B+) debido a que en el suero nohay anticuerpos de ninguacuten tipo que reaccionen con losantiacutegenos de los eritrocios del Donador 1 Mientras tantoel Donador 2 no puede donar al Paciente ni suero nieritrocitos

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M1 Autotestigo- -

Compatible

Compatible

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INTERPRETACIOacuteN

PRUEBA POSITIVA Existe una aglutinacioacuten de lasceacutelulas sanguiacuteneas que indica la presencia delantiacutegeno A o B En el suero de Coombs notamos si esta

la precencia de Antiacutegeno D en los eritrocitos Lahemoacutelisis no se debe interpretar como resultadopositivo ya que puede indicar contaminacioacuten delreactivo

PRUEBA NEGATIVA La no aglutinacioacuten indica unresultado negativo e indica que las ceacutelulas sonnegativas para Antiacutegenos del sisitema ABO y D

CONCLUSIOacuteN

He concluido que en las transfusiones de sangre no essuficiente con conocer que la sangre del donante y la delreceptor son del mismo grupo o bien que la del donantepertenezca al grupo O (cero) sino que es necesarioconocer si la compatibilidad es perfecta porque ninguacutenotro fenoacutemeno de inmunizacioacuten interfiera Es en estesentido por lo que son empleadas las pruebas cruzadas

Praacutectica No 7ldquoPrueba de compatibilidad sanguiacutenea (teacutecnica albumina)rdquo

IntroduccioacutenLa tipificacioacuten de sangre identifica el tipo sanguiacuteneo determinandoantiacutegenos presentes en los eritrocitos detecta aloanticuerpos encontra esos antiacutegenos Asiacute los aloanticuerpos pueden aparecernaturalmente o ser inducidos y pueden ser dirigidos contra del grupoconocido o a los antiacutegenos de superficie de los eritrocitos La prueba

de compatibilidad sanguiacutenea o cross matching esta formada por laprueba mayor y menorLa prueba de cruzamiento mayor para losaloanticuerpos consiste en probar el plasma del receptor contra los

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gloacutebulos rojos del donante Es incompatible cuando se genera unareaccioacuten hemoliacutetica los eritrocitos del donante se destruyen por losaloanticuerpos del plasma del receptor La prueba menor es una pruebapara los aloanticuerpos del plasma del donante en contra los gloacutebulosrojos del receptor Una incompatibilidad menor es una causa menosfrecuente para causar una reaccioacuten en contra una transfusioacuten porque

el volumen de plasma del donante es menor y es diluido marcadamente enel receptor Para llevar a cabo dicho procedimiento se utilizandiversos reactivos como potencializadores que mejoran la unioacuten deeritrocitos con alguacuten tipo de anticuerpo Uno de esospotencializadores es la albuacutemina La albumina bovina polimerizada esun reactivo muy utilizado en el laboratorio de inmunohematologia y encentros de bancos de sangre funciona como un potencializador quefacilita la reaccion de aglutinacioacuten de eritrocitos sensibilizados Alfinal de la prueba se prueban los eritrocitos con el reactivo deCoombs El principio de la prueba de Coombs fue descrito por Moreschien 1908 pero Coombs Mourant y Race en 1946 la introdujeron en elestudio de los grupos sanguiacuteneos y anticuerpos cuando una parte desangre (suero) fue usada para la inoculacioacuten de animales para

inmunizarlos con proteiacutena humana utilizando el anticuerpo obtenido enla deteccioacuten de los llamados anticuerpos incompletos Esta prueba seusa para determinar la presencia de anticuerpos no aglutinantes en elsuero de sujetos sensibilizados a uno o mas antiacutegenos sanguiacuteneos Esuacutetil en el estudio del suero de mujeres con isoinmunizacioacuten materno-fetal y se emplea tambieacuten en otro tipo de pruebas como identificacioacutende anticuerpos autoinmunes deteccioacuten de algunos sistemas sanguiacuteneos ypruebas de compatibilidad sanguiacutenea La prueba indirecta se realizacon eritrocitos normales incubados in Vitro con el suero de estudioDurante este periodo si existe un anticuerpo este se fija sobre surespectivo determinante antigeacutenico Una vez fijados los eritrocitosson igualmente lavados y se agrega el reactivo de Coombs produciendoaglutinacioacuten Una prueba de Coombs indirecta positiva significa que

existen anticuerpos libres en el suero de la persona los cualespuedan ser igualmente auto-anticuerpos o isoanticuerpos

Objetivo Determinacioacuten de los antiacutegenos del sistema ABO Rh (D) y sucompatibilidad entre un paciente Donador y un Paciente Receptor

Material y equipo

5 Tubos de ensaye

6 Pipetas Pasteur

1Gradilla

1 Bulbo

Papel Parafilm

Microcentriacutefuga

Bantildeo Mariacutea oacute Estufa

Material bioloacutegico

Muestras de sangre de extraccioacuten reciente recogida conanticoagulante o sin anticoagulante

ReactivosSuero de CoombsAlbuacutemina bovina deg

Suero anti-globulina humana Lafon Lote 406 Cad 310109 Color verde Aspecto

transparentedegAlbumina de bovino polimerizada Interbiol Lote APO107 Cad 150109 Color incoloroAspecto transparente

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Teacutecnica

1 Montar prueba mayor 1 y 2 prueba menor 1 y 2 y autotestigocon el procedimiento ya anteriormente conocido

2 Agregar 2 gotas de albuacutemina al 223 Centrifugar 20 segundos4 observar aglutinacioacuten o hemolisis o no aglutinacioacuten5 A los tubos con lecturas negativas incubar 20 minutos en bantildeo

Mariacutea a 37 degC6 Centrifugar y observar

bull Aglutinacioacuten o hemoacutelisis reportar incompatible

bull No aglutinacioacuten llevar a Coombs

7 Lavar tres veces decantar y quitar el exceso de salina congasa y agregar 2 gotas de reactivo de Coombs y centrifugar 20segundos y observar

bull Aglutinacioacuten o hemoacutelisis reportar incompatible

bull No aglutinacioacuten reportar compatible

Resultados1 PRUEBA MAYOR 1 2 Gotas de suero del paciente + 1 gota de GR al 3-5 del

donador 12 PRUEBA MENOR 1 2 Gotas de suero del donador 1 + 1 gota de GR al 3-5 del

paciente3 PRUEBA MAYOR 2 2 Gotas de suero del paciente + 1 gota de GR al 3-5 del

donador 24 PRUEBA MENOR 2 2 Gotas de suero del donador 2 + 1 gota de GR al 3-5 del

paciente5 AUTOTESTIGO 2 Gotas de suero del paciente + 1 gota de GR al 3-5 del paciente

M1 m1 M2 m2 AutotestigoCon albuacutemina - - - - -Despueacutes de incubacioacuten a 37 degC - - - - -Despueacutes de Coombs - - - - -Despueacutes de validacioacuten con gloacutebulos

positivos+ + + + +

InterpretacioacutenPrueba positiva Alutinacioacuten o hemolisis Indica no compatibilidadPrueba negativaNo aglutinacioacuten Indica compatibilidad

Esquemas

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ConclusioacutenConcluyo que la prueba de compatibilidad sanguiacutenea en su modalidad conalbuacutemina bovina ofrece mucha ventaja al ser al igual que otrosreactivos un potencializador de la reaccioacuten antiacutegeno-anticuerpo Estopermite que el operador o realizador de la prueba tenga mayorconfianza y certeza en los resultados que obtenga

PRACTICA No 8PRUEBA DE COMPATIBILIDAD SANGUINEA PRUEBA DE LISS

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FUNDAMENTO

LISS es utilizado para reducir la fuerza ioacutenica del medio

de reaccioacuten en los procedimientos de deteccioacuten eidentificacioacuten de anticuerpos y en las pruebas decompatibilidad La presencia de este reactivo refuerza lainteraccioacuten antiacutegeno - anticuerpo durante la incubacioacuten

GENERALIDADESEl uso de solucioacuten salina de baja fuerza ioacutenica fuedescrito inicialmente en 1964 por Hughes-Jones y col y

Elliot y col pero en ese tiempo su uso era limitado yaque la concentracioacuten molar obtenida provocaba la hemoacutelisisde los eritrocitos suspendidos

En 1974 Low y Messeter describieron el uso rutinario de lasolucioacuten Liss de 003 M que lograba reducir el tiempo deincubacioacuten y no presentaba tendencia a la hemoacutelisis al sersuspendidos en salina a baja fuerza ioacutenica restableciendola presioacuten osmoacutetica de la solucioacuten mediante la adicioacuten deglicinaLas soluciones de baja fuerza ioacutenica son actualmente lasmaacutes utilizadas en inmunohematologiacutea provocando un aumentoen la velocidad de asociacioacuten entre antiacutegenos y anticuerpospermitiendo asiacute acortar el tiempo de incubacioacuten de 60minutos a 10-15 minutos sin sacrificar la sensibilidad delas mismas y sin costos elevadosSe ha observado que lasreacciones antiacutegeno-anticuerpo se ven potenciadas alreducir la fuerza ioacutenica del medio de reaccioacuten

La fuerza ioacutenica es uno de los factores maacutes importantes quedeterminan la tasa y la cantidad de captacioacuten deanticuerpos por parte de los eritrocitos El uso de mediosde reaccioacuten de baja fuerza ioacutenica permite disminuir eltiempo de incubacioacuten y potenciar las reacciones de losanticuerpos sin incrementar las reacciones inespeciacuteficas

Los iones Na+ y Cl- presentes en la solucioacuten salinafisioloacutegica se agrupan alrededor de las moleacuteculas deantiacutegeno y anticuerpo neutralizando sus cargas opuestas locual dificulta la unioacuten entre ellos Este efecto se reduceutilizando soluciones de baja fuerza ioacutenica y disminuyendode esta manera la incubacioacuten de las pruebas

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En esta etapa de sensibilizacioacuten las posibilidades deasociacioacuten pueden incrementarse mediante agitacioacutencentrifugacioacuten yo variacioacuten de la concentracioacuten delanticuerpo

Despueacutes de que el anticuerpo se ha fijado al antiacutegeno loseritrocitos sensibilizados deben unirse para dar lugar a laaglutinacioacuten visible esta red tambieacuten solidifica yestabiliza la reaccioacuten

En esta etapa la reaccioacuten depende de factores como lascaracteriacutesticas del anticuerpo localizacioacuten en la membranay nuacutemero de sitios antigeacutenicos fuerzas que mantienen ladistancia entre los eritrocitos

Las caracteriacutesticas del anticuerpo que deben considerarse

son el tamantildeo del anticuerpo involucrado y el nuacutemero desitios de combinacioacuten con el antiacutegeno Los anticuerpos IgMpueden establecer puentes entre los eritrocitos yaglutinarlos espontaacuteneamente en solucioacuten salina mientrasque los IgG no ya que las IgM pentameacutericas poseen 10sitios de combinacioacuten con el antiacutegeno y las IgG diacutemerossoacutelo dos sitios

Los eritrocitos tienen una carga neta negativa en susuperficie su interaccioacuten con los iones del medio alteraesta carga y producen una carga neta criacutetica denominada

potencial zeta y la reduccioacuten de dicha carga permite quelos eritrocitos se aproximen lo suficiente para que seanaglutinados por medio de los IgG que los sensibilizaron

Las soluciones de baja fuerza ionica empleadas en banco desangre tienen un pH entre 65 ndash 70 se recomienda unaosmolalidad de 270 ndash 305 mosmkg y una conductividad de 37mmcm El control diario implica el examen de su aparienciafiacutesica ausencia de turbidez particulas o sedimento asiacutecomo corroborar la capacidad para generar hemoacutelisiscrenacion o prueba de coombs positiva en eritrocitos

normales Cada lote nuevo se valora mediante el rastreo deun anticuerpo ya sea un anti- D un anti- jk anti- fy oanti- kell diluido se compara su capacidad de deteccioacutencontra un medio salino normal incubando 10min a 37ordmC enLISS debe poder rastrearse un anticuerpo en tanto que enmedio salino no

MATERIAL Y EQUIPO

Material Cantidad10 Tubos de ensayo de 12 x 75

1 Gradilla10 Pipetas pasteur

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1 Bulbo1 Marcador1 Microcentriacutefuga1 Bantildeo Mariacutea

MATERIAL BIOLOGICO

Gloacutebulos rojos lavados al 3 - 5Suero

REACTIVOS

Reactivo de LISSReactivo de Coombs

TECNICA1- Lavar los eritrocitos

Separar el suero del paquete de gloacutebulos rojos

Agregar cierta cantidad de eritrocitos a un tubo deensayo y agregarle solucioacuten salina

Centrifugar y decantar

Repetir este proceso 3 veces

2- Realizar la Prueba de LISS

Enumerar los tubos Poner dos gotas de LISS en cada tubo agregar una gota

de eritrocitos lavados y al 3 - 5 seguacuten el nuacutemero detubo correspondiente

Mezclar y centrifugar un minuto decantar elsobrenadante y con la ayuda de una gasa limpiar elexceso del reactivo

Poner nuevamente 2 gota de LISS resuspender poragitacioacuten agregar 2 gotas de suero problema mezclarincubar 15 minutos a 37ordm C centrifugar 30 seg A 1000

RPM Anotar los resultados

3- A las pruebas negativas realizar Coombs

Lavar 3 veces las ceacutelulas agregar suero de Coombscentrifugar 30 seg

Leer aglutinaciones y anotar resultados

REACTIVOS UTILIZADOS

REACTIVO MARCA FECHA DECADUCIDAD

ASPECTO COLOR LOTE

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SueroAntiglobuina

humana

Lafon 31 01 2009 Transparente Verde 406

LISS Caserorealizado enCMNSIGLOXXI

1 antildeo Transparente Transparente

----------

PACIENTE ASCANIO MENDEZ JOSUE O (+)DONADOR 1 GARCIA CARBAJAL OSCAR O (+)DONADOR 2 GARCIA SUAREZ ORLANDO A (+)

RESULTADOS

INTERPRETACIOacuteN DE LOS RESULTADOS

La hemoacutelisis o la aglutinacioacuten representan un resultado positivo e indican lapresencia de una reaccioacuten antiacutegeno-anticuerpo Los resultados negativos no severa aglutinacioacuten o hemolisis

ESQUEMAS

CONCLUSIONES

Concluyo que la prueba de compatibilidad sanguiacutenea en su modalidad conliss ofrece mucha ventaja al ser al igual que otros reactivos unpotencializador de la reaccioacuten antiacutegeno-anticuerpo Esto permite queel operador o realizador de la prueba tenga mayor confianza y certezaen los resultados que obtenga

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Tubo Resultado

M1 NEGATIVOm1 NEGATIVO

M2 POSITIVO

M2 NEGATIVO

AUTOTES NEGATIVO

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PRACTICA 9INMUNOHEMATOLOGIA

DETERMINACION DE COOMBS DIRECTO

INTRODUCCIONPRUEBA DE COOMBS DIRECTA

El examen de Coombs directo se utiliza para detectar autoanticuerpos contralos propios gloacutebulos rojos (GR) de un individuo Es una prueba que sirve parademostrar el revestimiento de los eritrocitos in vivo (mientras los eritrocitosestaacuten circulando en el individuo) La prueba se realiza agregando directamenteel reactivo de Coombs a los eritrocitos previamente lavados para eliminar otras proteiacutenas no fijadas a el una prueba directa positiva significa que larelacioacuten antiacutegeno-anticuerpo ocurrioacute in vivo es decir que la fijacioacuten del

anticuerpo sobre el antiacutegeno se realizo en el organismo del individuo enestudio

Las indicaciones principales de esta prueba son diagnostico de enfermedadeshemoliacuteticas ictericia o anomaliacuteas en la apariencia de los gloacutebulos rojos bajo elmicroscopio ya que estos anticuerpos algunas veces destruyen los gloacutebulosrojos y causan anemia para investigar reacciones en transfusiones Parainvestigar la induccioacuten de drogas en ceacutelulas rojas sensibilizadas medicamentos(por ejemplo quinidina metildopa procainamida y otros) que pueden llevar a la produccioacuten de estos anticuerpos

OBJETIVO Determinar la presencia de anticuerpos en la superficie de losgloacutebulos rojos del individuo

MATERIAL

bull 10 Tubos de 1275

bull 10 Pipetas Pasteur

bull 1 Gradilla

bull 1 Bulbo

bull Papel Parafilm

bull Microcentriacutefuga

bull Bantildeo Mariacutea a 37degC

MUESTRA BIOLOGICA

Eritrocitos lavados de (3-5) del donador o pacienteREACTIVO

Suero de CoombsSuero anti-globulina humana Lafon Lote 406 Cad 310109 Color verde Aspecto transparente

TECNICA

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Colocar en un tubo de ensaye dos gotas de suero de Coombs mas una gota deglobulos rojos (3-5)Centrifugar a 1000 rpm durante 20 segDesprender el boton suavemente y buscar la presencia de aglutinacionRotular y enumerar 8 tubos de ensayes con las diferentes diluciones

(frac12frac1418)Enumerar 8 tubos mas del 1 al 8Agregar a cada tubo de las diluciones 10 gotas de solucion salina mas 10 gotasde suero de CoombsColocar Al primer tubo de la dilucion 1 gota de globulos rojos (3-5) mezclar completamente y agregar al tubo 1Centrifugar todos los tubos a 1000 rpm durante 20 seg

LECTURA

Aglutina- Prueba de Coombs directa es positiva

No aglutina- Prueba de Coombs directa es negativa

ESQUEMAS y RESULTADOS

CONCLUCION

He concluido que la prueba de Coombs directa es una prueba que se utiliza para medir

la presencia de anticuerpos en la superficie de los gloacutebulos rojos que se encuentran

circulando en el paciente y se realiza para investigar reacciones en transfusiones ademaacutes

sirve para la determinacioacuten de anemia hemoliacutetica autoinmune entre otras afecciones

Practica 10

IDENTIFICACION DE ANTICUERPOS IRREGULARES

Fundamento

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DILUCIONES

frac12 positiva

frac14 positiva

18 positiva

116 negativa

132 negativa

164 negativa

1128 negativa1256 negativa

31

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Los anticuerpos del sistema ABO aparecen una vez que elindividuo entra en contacto con el medio ambiente y en elcual se encuentran microorganismos como algunas bacteriascoliformes que contienen sustancias quiacutemicas en suestructura parecidas a las de este sistema Por anticuerpos

regulares debemos identificar a los que existen en todoslos individuos y que eacutestos tendraacuten durante toda su vida

Los anticuerpos irregulares son los que no estaacuten de esamanera aunque en el caso de los naturales no se conoce aciencia cierta queacute o coacutemo se induce su produccioacuten Losadquiridos se conocen tambieacuten como inmunes y son elresultado de la exposicioacuten a antiacutegenos desconocidos por elindividuo al momento de la transfusioacuten o en las mujerespor el embarazo estos anticuerpos son dirigidos contraantiacutegenos de sistemas diferentes al ABO

Los anticuerpos naturales regulares son preferentementeinmunoglobulinas M las cuales fijan de manera taneficiente el complemento que pueden provocar lisisintravascular y ocasionar insuficiencia renal o incluso lamuerte del paciente Los anticuerpos adquiridos o inmunesson generalmente inmunoglobulinas G las cuales producenhemoacutelisis extravascular en el bazo o en el hiacutegado mediantefagocitosis del complejo eritrocito maacutes anticuerpo

Los aloanticuerpos irregulares (adquiridos) maacutes comunes en

nuestra poblacioacuten son los que involucran a los sistemasMNSs P1 Kidd (Jka Jkb) Duffy (Fya Fyb) Kell Lewis yDiego

OBJETIVO identificacioacuten del anticuerpo irregular a traveacutesde las diferentes teacutecnicas

MATERIAL

bull 10 Tubos de ensaye

bull 10 Pipetas Pasteur

bull

1Gradillabull 1 Bulbo

bull Papel Parafim

MATERIAL BIOLOGICO

bull Gloacutebulos rojos lavados al 3 - 5

bull Suero

bull REACTIVOSReactivos

1 Suero de Coombs2 Albuacutemina bovina

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bull EQUIPO1 Microcentriacutefuga2 Bantildeo Mariacutea oacute Estufa

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3 SOLUCION SALINA4 SOLUCION DE LISS

TEacuteCNICA SOLUCION SALINA

Lavar los eritrocitos con solucioacuten salina (3veces)SALINA RAacutePIDA

Agregar una gota de Eritrocitos LavadosDiluiacuterlo al 3-5 con solucioacuten salina 09Agregar 2 gotas de sueroCentrifugar y observar anotar desprendimientodel botoacuten

SALINA 37deg BANtildeO MARIacuteA1) Incubar tubos a Bantildeo mariacutea a 37degC durante 1

hora (o 20 min)

2) Centirfugar despueacutes de haber pasado eltiempo

3) Desprender el botoacuten de eritrocitos yobservar

AGLUTINACIOacuteNndash No es compatibleNO AGLUTINACIOacuteN - Lavar 3 veces

SALINA COOMBS1) Con solucioacuten salina 09 lavar los

eritrocitos de los tubos q no tuvieronaglutinacioacuten 3 veces

2) Decantar y agregar 2 gotas de reactivode Coombs

AGLUTINACIOacuteN ndash No es compatibleNO AGLUTINACIOacuteN - Lavar 3 veces

TECNICA LISS

1 Poner dos gotas de LISS en cada tubo agregar una gotade eritrocitos lavados y al 3 - 5 seguacuten el nuacutemero detubo correspondiente

2 Mezclar y centrifugar un minuto decantar el

sobrenadante y con la ayuda de una gasa limpiar elexceso del reactivo

3 Poner nuevamente 2 gota de LISS resuspender poragitacioacuten agregar 2 gotas de suero problema mezclarincubar 15 minutos a 37ordm C centrifugar 30 seg A 1000RPM

4 Anotar los resultados

A las pruebas negativas realizar Coombs

1 Lavar 3 veces las ceacutelulas agregar suero de Coombs

centrifugar 30 seg2 Leer aglutinaciones y anotar resultados

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TECNICA ALBUMINA BOVINA 8 Agregar 2 gotas de albuacutemina al 229 Centrifugar 20 segundos10observar aglutinacioacuten o hemolisis o no aglutinacioacuten

11A los tubos con lecturas negativas incubar 20minutos en bantildeo Mariacutea a 37 degC12Centrifugar y observar

bull Aglutinacioacuten o hemoacutelisis reportar incompatible

bull No aglutinacioacuten llevar a Coombs

13Lavar tres veces decantar y quitar el exceso desalina con gasa y agregar 2 gotas de reactivo deCoombs y centrifugar 20 segundos y observar

bull Aglutinacioacuten o hemoacutelisis reportar incompatible

bull No aglutinacioacuten reportar compatible

Resultados ANTICUERPO IRREGULAR Anticuerpo c

InterpretacioacutenEstos anticuerpos son generalmente inmunoglobulinas tipo My ocasionalmente tipo G y debido a esa temperatura dereaccioacuten carecen de importancia cliacutenica salvo que sureaccioacuten ocurra tambieacuten a 37 degC su importancia radica enpacientes que seraacuten intervenido a 22 ordmc como es el caso de

operacioacuten de corazoacuten

Los llamados anticuerpos calientes tienen una temperatura oacuteptima dereaccioacuten a 37 degC a Estos anticuerpos tienen una relevanteimportancia cliacutenica ya que se les asocia con reaccionestransfusionales de intensidad moderada a severa que puedenocasionar la muerte

Esquemas

CONCLUSIONHe concluido que es importante determinar los anticuerposirregulares ya que estos anticuerpos tienen una relevanteimportancia cliacutenica ya que se les asocia con reaccionestransfusionales de intensidad moderada a severa

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Resultado A+

CONCLUSION

Concluyo que esta teacutecnica es una forma de estabilizar las reacciones de aglutinacioacuten y

reducir los resultados falsamente negativos a consecuencia de una teacutecnica inapropiada

asi como crear un meacutetodo de interpretaciones sencillas y constantes

Practica No 5ldquoPrueba de compatibilidadrdquo

Introduccioacuten

Para requerir una oacuteptima transfusioacuten actualmente serequiere de aceptaciones inmunoloacutegicas receptor - donanteya que la transfusioacuten de sangre o la de sus componentescelulares de un donante a un receptor es una forma detransplante

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La prueba de Coombs se usa para determinar la presencia deanticuerpos no aglutinantes en el suero de sujetossensibilizados a uno o mas antiacutegenos sanguiacuteneos Es uacutetil enel estudio del suero de mujeres con isoinmunizacioacutenmaterno-fetal y se emplea tambieacuten en otro tipo de pruebas

como identificacioacuten de anticuerpos autoinmunes deteccioacutende algunos sistemas sanguiacuteneos y pruebas de compatibilidadsanguiacutenea

La prueba indirecta se realiza con eritrocitos normalesincubados in Vitro con el suero de estudio Durante esteperiodo si existe un anticuerpo este se fija sobre surespectivo determinante antigeacutenico Una vez fijados loseritrocitos son igualmente lavados y se agrega el reactivode Coombs produciendo aglutinacioacuten

Una prueba de Coombs indirecta positiva significa queexisten anticuerpos libres en el suero de la persona loscuales puedan ser igualmente auto-anticuerpos oisoanticuerpos

Material y equipo

bull Pipetas automaacuteticas de 10 microl 25 microl 50 microl y 1 ml

bull Puntas de pipetas desechables

bull Tubos de vidrio

bull Incubador para tarjetas DG Gel

bull Centrifuga para tarjetas DG Gel

Material bioloacutegico

bull Hematiacutees reactivo para investigacioacuten e identificacioacuten de anticuerpos irregulares de

Diagnostic Grifols SA

bull Suero de hemoclasificacioacuten

bull Muestras de sangre de extraccioacuten reciente recogida con anticoagulante o sin

anticoagulante

Reactivos

bull Tarjetas DG Gel

bull DG Gel Sol

Reactivos

Tarjetas DG Gel Coombs DG Gel SolRango de temperatura entre 2 y 25 ordmC Rango de temperatura entre 2 y 8ordmCLote 704901 Lote 7003701Cad 2008-03 Cad 2008-06Aspecto transparente Aspecto transparenteColor verde Color incoloro

TeacutecnicaMeacutetodo manual

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1 Dejar atemperar (18-25ordmC) muestras y reactivo2 Inspeccionar el estado de las tarjetas antes de utilizar3 Identificar las tarjetas y muestras a utilizar4 Despegar con precaucioacuten la lamina de metal que cubre los microtubos para prevenir

contaminaciones cruzadas entre ellos

5 Preparar una suspensioacuten con hematiacutees al 1 en DG Gel Sol (10 microl de sedimento oconcentrado de hematiacutees en 1 ml de DG Gel Sol) Utilizar los hematiacutees del donantepara la PC mayor y hematiacutees del receptor para la PC menor Asegurar la suspensioacuten delos hematiacutees antes de utilizar

6 Dispensar en el tubo correspondiente 50 microl de suspensioacuten de los hematiacutees al 1 deldonante (PC mayor) o 50 microl de suspensioacuten de los hematiacutees al 1 del receptor (PCmenor)

7 Antildeadir 25 microl de suero o plasma del receptor (PC mayor) o 25 microl de suero o plasma deldonante (PC menor)

8 Preparar auto control con 50 microl de suspensioacuten de los hematiacutees al 1 del receptor y 25microl de suero o plasma del receptor

9 Incubar 15 minutos a 37 ordmC10 Centrifugar en la centrifuga para tarjetas DG Gel

11 Leer los resultados

InterpretacioacutenNegativo - Banda de hematiacutees en el fondo de la columna resto de la columna sin aglutinados visibles

Positivo +- Escasos aglutinados de pequentildeo tamantildeo en la mitad inferior de la columna

1+ Algunos aglutinados de pequentildeo tamantildeo en la columna

2+ Aglutinados de tamantildeo pequentildeo o mediano a lo largo de la columna

3+ Banda superior de aglutinados de tamantildeo mediano en la mitad superior de la columna

4+ Banda de hematiacutees aglutinados en la parte superior de la columna

DP Doble poblacioacuten (doble banda de hematiacutees en el fondo y en la parte superior de la columna

Resultados

Paciente Lira Cabrera Carlos Alberto (AB+)Donador 1 Orea Valero Erasmo (A+)Donador 2 Moreno Adolfo (O+)

M1 m1 M2 m2 AutocontrolGR de donador 1 +suero del paciente

GR del paciente +suero de donador 1

GR de donador 2 +suero del paciente

GR del paciente +suero de donador 2

GR del paciente +suero del paciente

- + - + -

Por lo antes expuesto se puede deducir que el donador 1 (A+) puede donar eritrocitos al

paciente (AB+) lo mismo que el donador 2 (O+) puede donarle eritrocitos no asiacute plasma por parte de ambos donadores pues la prueba muestra que hubo reaccioacuten en ambas pruebasmenores

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Conclusioacuten

Concluyo que es esencial que toda la sangre sea estudiadaantes de la transfusioacuten para Asegurar que todos losgloacutebulos rojos transfundidos son compatibles con losanticuerpos en el plasma del paciente Evitar estimular laproduccioacuten de nuevos anticuerpos contra los gloacutebulos rojosen el receptor especialmente anti-Rh D

PRAacuteCTICA No 6PRUEBA DE COMPATIBILIDAD SANGIacuteNEA

(Teacutecnica salina)

INTRODUCCIOacuteN

Landsteiner constatoacute que cuando un aglutinoacutegeno se pone

en contacto con la aglutinina homoacuteloga se produce unaaglutinacioacuten

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La compatibilidad sanguiacutenea es la posibilidad de mezclade sangre sin que se produzcan trastornos tales como losfenoacutemenos de la lisis o de la aglutinacioacuten

A causa de este fenoacutemeno bioloacutegico en las transfusiones

de sangre no es suficiente con conocer que la sangre deldonante y la del receptor son del mismo grupo o bien quela del donante pertenezca al grupo O (cero) sino que esnecesario conocer si la compatibilidad es perfecta porqueninguacuten otro fenoacutemeno de inmunizacioacuten interfiera Es eneste sentido por lo que son empleadas las pruebascruzadas

Ademaacutes de los 6 antiacutegenos del sistema ABO en loseritrocitos humanos existen numerosos sistemas deaglutinoacutegenos que contienen muchos antiacutegenos individuales

en los eritrocitos (maacutes de 500000 millones posibles defenotipos de grupos sanguiacuteneos conocidos) Para evitaraccidentes transfusionales es indispensable tener encuenta el sistema Rh ademaacutes del ABO

Del sistema de antiacutegenos Rh es el D el maacutes antigeacutenico yel teacutermino Rh positivo indica que el individuo presentaaglutinoacutegeno D El individuo Rh negativo no tiene antiacutegenoD y forma la aglutinina anti-D en contacto con eacuteste

Las reacciones antiacutegeno-anticuerpo pueden observarse in

vitro por

mdash Hemoacutelisis la unioacuten antiacutegeno-anticuerpo se traduce enlisis de los eritrocitos en presenciadel complemento (siempre que el anticoagulante empleado nocapture losiones Ca y Mg necesarios para la activacioacuten delcomplemento) mdash Aglutinacioacuten los anticuerpos que reaccionan en mediosalino se conocen comoanticuerpos completos o aglutinantes (comuacutenmente tipo

IgM)

OBJETIVO Determinacioacuten de los antigenos del sistema ABORh (D) y su compatibilidad entre un paciente Donador y unPaciente Receptor

MATERIAL5 Tubos de ensaye6 Pipetas Pasteur

1Gradilla1 Bulbo

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EQUIPOMicrocentriacutefugaBantildeo Mariacutea oacute Estufa

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Papel Parafilm

MUESTRA Muestra de sangre con Anticoagulante EDTA

REACTIVOSAntisuero RO-Antiglobulina humana (Poliespeciacutefico Anti IgG C-d) Para prueba de CoombsLABORATORIOS LAFON SA de C VFecha de Caducidad 31-Ene-09Lote 406Hecho en MeacutexicoAspecto TransparenteColor Verde

TEacuteCNICA

Lavar los eritrocitos con solucioacuten salina (3 veces)

SALINA RAacutePIDA1 Agregar una gota de Eritrocitos Lavados2 Diluirlo al 3-5 con solucioacuten salina 093 Agregar 2 gotas de suero4 Centrifugar y observar anotar desprendimiento del botoacuten

SALINA 37deg BANtildeO MARIacuteA

1 Incubar tubos a Bantildeo mariacutea a 37degC durante 1hora (o 20 min)2 Centirfugar despueacutes de haber pasado el

tiempo3 Desprender el botoacuten de eritrocitos y

observarAGLUTINACIOacuteNndash No es compatibleNO AGLUTINACIOacuteN - Lavar 3 veces

SALINA COOMBS

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PRUEBA MAYOR

G Rojos del DONADOR+

Suero del RECEPTOR(paciente)

PRUEBA MENOR

G Rojos del RECEPTOR(paciente)

+Suero del DONADOR

AUTOTESTIGO

G Rojos del RECEPTOR(paciente)

+Suero del RECEPTOR

(paciente)

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1 Con solucioacuten salina 09 lavar loseritrocitos de los tubos q no tuvieronaglutinacioacuten 3 veces

2 Decantar y agregar 2 gotas de reactivode Coombs

AGLUTINACIOacuteN ndash No es compatibleNO AGLUTINACIOacuteN - Lavar 3 veces

RESULTADOS

Paciente Madrigal Meacutendez Luis Eduardo (B+)Folio 009164Fecha301007

Donador 1 Torres Avileacutes Joseacute Ramoacuten (O+)Folio 022604Fecha311007

Donador 2 Rodriacuteguez Nuacutentildeez Joseacute Angel (A+) Folio 022605

Fecha311007

SALINA RAacutePIDA

M1 m1 M2 m2 AutotestigoGR de donador 1+ suero del

paciente

GR del paciente+ suero dedonador 1

GR de donador 2+ suero del

paciente

GR del paciente+ suero dedonador 2

GR del paciente+ suero del

paciente

- 4+ 4+ 4+ -

SALINA 37deg BANtildeO MARIacuteA

M1 m1 M2 m2 Autotestigo- 4+ 4+ 4+ -

Compatible Nocompatible

Nocompatible

Nocompatible

Compatible

SALINA COOMBS

Por lo tanto se puede decir que el donador 1 (O+) puededonar suero al paciente (B+) debido a que en el suero nohay anticuerpos de ninguacuten tipo que reaccionen con losantiacutegenos de los eritrocios del Donador 1 Mientras tantoel Donador 2 no puede donar al Paciente ni suero nieritrocitos

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M1 Autotestigo- -

Compatible

Compatible

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INTERPRETACIOacuteN

PRUEBA POSITIVA Existe una aglutinacioacuten de lasceacutelulas sanguiacuteneas que indica la presencia delantiacutegeno A o B En el suero de Coombs notamos si esta

la precencia de Antiacutegeno D en los eritrocitos Lahemoacutelisis no se debe interpretar como resultadopositivo ya que puede indicar contaminacioacuten delreactivo

PRUEBA NEGATIVA La no aglutinacioacuten indica unresultado negativo e indica que las ceacutelulas sonnegativas para Antiacutegenos del sisitema ABO y D

CONCLUSIOacuteN

He concluido que en las transfusiones de sangre no essuficiente con conocer que la sangre del donante y la delreceptor son del mismo grupo o bien que la del donantepertenezca al grupo O (cero) sino que es necesarioconocer si la compatibilidad es perfecta porque ninguacutenotro fenoacutemeno de inmunizacioacuten interfiera Es en estesentido por lo que son empleadas las pruebas cruzadas

Praacutectica No 7ldquoPrueba de compatibilidad sanguiacutenea (teacutecnica albumina)rdquo

IntroduccioacutenLa tipificacioacuten de sangre identifica el tipo sanguiacuteneo determinandoantiacutegenos presentes en los eritrocitos detecta aloanticuerpos encontra esos antiacutegenos Asiacute los aloanticuerpos pueden aparecernaturalmente o ser inducidos y pueden ser dirigidos contra del grupoconocido o a los antiacutegenos de superficie de los eritrocitos La prueba

de compatibilidad sanguiacutenea o cross matching esta formada por laprueba mayor y menorLa prueba de cruzamiento mayor para losaloanticuerpos consiste en probar el plasma del receptor contra los

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gloacutebulos rojos del donante Es incompatible cuando se genera unareaccioacuten hemoliacutetica los eritrocitos del donante se destruyen por losaloanticuerpos del plasma del receptor La prueba menor es una pruebapara los aloanticuerpos del plasma del donante en contra los gloacutebulosrojos del receptor Una incompatibilidad menor es una causa menosfrecuente para causar una reaccioacuten en contra una transfusioacuten porque

el volumen de plasma del donante es menor y es diluido marcadamente enel receptor Para llevar a cabo dicho procedimiento se utilizandiversos reactivos como potencializadores que mejoran la unioacuten deeritrocitos con alguacuten tipo de anticuerpo Uno de esospotencializadores es la albuacutemina La albumina bovina polimerizada esun reactivo muy utilizado en el laboratorio de inmunohematologia y encentros de bancos de sangre funciona como un potencializador quefacilita la reaccion de aglutinacioacuten de eritrocitos sensibilizados Alfinal de la prueba se prueban los eritrocitos con el reactivo deCoombs El principio de la prueba de Coombs fue descrito por Moreschien 1908 pero Coombs Mourant y Race en 1946 la introdujeron en elestudio de los grupos sanguiacuteneos y anticuerpos cuando una parte desangre (suero) fue usada para la inoculacioacuten de animales para

inmunizarlos con proteiacutena humana utilizando el anticuerpo obtenido enla deteccioacuten de los llamados anticuerpos incompletos Esta prueba seusa para determinar la presencia de anticuerpos no aglutinantes en elsuero de sujetos sensibilizados a uno o mas antiacutegenos sanguiacuteneos Esuacutetil en el estudio del suero de mujeres con isoinmunizacioacuten materno-fetal y se emplea tambieacuten en otro tipo de pruebas como identificacioacutende anticuerpos autoinmunes deteccioacuten de algunos sistemas sanguiacuteneos ypruebas de compatibilidad sanguiacutenea La prueba indirecta se realizacon eritrocitos normales incubados in Vitro con el suero de estudioDurante este periodo si existe un anticuerpo este se fija sobre surespectivo determinante antigeacutenico Una vez fijados los eritrocitosson igualmente lavados y se agrega el reactivo de Coombs produciendoaglutinacioacuten Una prueba de Coombs indirecta positiva significa que

existen anticuerpos libres en el suero de la persona los cualespuedan ser igualmente auto-anticuerpos o isoanticuerpos

Objetivo Determinacioacuten de los antiacutegenos del sistema ABO Rh (D) y sucompatibilidad entre un paciente Donador y un Paciente Receptor

Material y equipo

5 Tubos de ensaye

6 Pipetas Pasteur

1Gradilla

1 Bulbo

Papel Parafilm

Microcentriacutefuga

Bantildeo Mariacutea oacute Estufa

Material bioloacutegico

Muestras de sangre de extraccioacuten reciente recogida conanticoagulante o sin anticoagulante

ReactivosSuero de CoombsAlbuacutemina bovina deg

Suero anti-globulina humana Lafon Lote 406 Cad 310109 Color verde Aspecto

transparentedegAlbumina de bovino polimerizada Interbiol Lote APO107 Cad 150109 Color incoloroAspecto transparente

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Teacutecnica

1 Montar prueba mayor 1 y 2 prueba menor 1 y 2 y autotestigocon el procedimiento ya anteriormente conocido

2 Agregar 2 gotas de albuacutemina al 223 Centrifugar 20 segundos4 observar aglutinacioacuten o hemolisis o no aglutinacioacuten5 A los tubos con lecturas negativas incubar 20 minutos en bantildeo

Mariacutea a 37 degC6 Centrifugar y observar

bull Aglutinacioacuten o hemoacutelisis reportar incompatible

bull No aglutinacioacuten llevar a Coombs

7 Lavar tres veces decantar y quitar el exceso de salina congasa y agregar 2 gotas de reactivo de Coombs y centrifugar 20segundos y observar

bull Aglutinacioacuten o hemoacutelisis reportar incompatible

bull No aglutinacioacuten reportar compatible

Resultados1 PRUEBA MAYOR 1 2 Gotas de suero del paciente + 1 gota de GR al 3-5 del

donador 12 PRUEBA MENOR 1 2 Gotas de suero del donador 1 + 1 gota de GR al 3-5 del

paciente3 PRUEBA MAYOR 2 2 Gotas de suero del paciente + 1 gota de GR al 3-5 del

donador 24 PRUEBA MENOR 2 2 Gotas de suero del donador 2 + 1 gota de GR al 3-5 del

paciente5 AUTOTESTIGO 2 Gotas de suero del paciente + 1 gota de GR al 3-5 del paciente

M1 m1 M2 m2 AutotestigoCon albuacutemina - - - - -Despueacutes de incubacioacuten a 37 degC - - - - -Despueacutes de Coombs - - - - -Despueacutes de validacioacuten con gloacutebulos

positivos+ + + + +

InterpretacioacutenPrueba positiva Alutinacioacuten o hemolisis Indica no compatibilidadPrueba negativaNo aglutinacioacuten Indica compatibilidad

Esquemas

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ConclusioacutenConcluyo que la prueba de compatibilidad sanguiacutenea en su modalidad conalbuacutemina bovina ofrece mucha ventaja al ser al igual que otrosreactivos un potencializador de la reaccioacuten antiacutegeno-anticuerpo Estopermite que el operador o realizador de la prueba tenga mayorconfianza y certeza en los resultados que obtenga

PRACTICA No 8PRUEBA DE COMPATIBILIDAD SANGUINEA PRUEBA DE LISS

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FUNDAMENTO

LISS es utilizado para reducir la fuerza ioacutenica del medio

de reaccioacuten en los procedimientos de deteccioacuten eidentificacioacuten de anticuerpos y en las pruebas decompatibilidad La presencia de este reactivo refuerza lainteraccioacuten antiacutegeno - anticuerpo durante la incubacioacuten

GENERALIDADESEl uso de solucioacuten salina de baja fuerza ioacutenica fuedescrito inicialmente en 1964 por Hughes-Jones y col y

Elliot y col pero en ese tiempo su uso era limitado yaque la concentracioacuten molar obtenida provocaba la hemoacutelisisde los eritrocitos suspendidos

En 1974 Low y Messeter describieron el uso rutinario de lasolucioacuten Liss de 003 M que lograba reducir el tiempo deincubacioacuten y no presentaba tendencia a la hemoacutelisis al sersuspendidos en salina a baja fuerza ioacutenica restableciendola presioacuten osmoacutetica de la solucioacuten mediante la adicioacuten deglicinaLas soluciones de baja fuerza ioacutenica son actualmente lasmaacutes utilizadas en inmunohematologiacutea provocando un aumentoen la velocidad de asociacioacuten entre antiacutegenos y anticuerpospermitiendo asiacute acortar el tiempo de incubacioacuten de 60minutos a 10-15 minutos sin sacrificar la sensibilidad delas mismas y sin costos elevadosSe ha observado que lasreacciones antiacutegeno-anticuerpo se ven potenciadas alreducir la fuerza ioacutenica del medio de reaccioacuten

La fuerza ioacutenica es uno de los factores maacutes importantes quedeterminan la tasa y la cantidad de captacioacuten deanticuerpos por parte de los eritrocitos El uso de mediosde reaccioacuten de baja fuerza ioacutenica permite disminuir eltiempo de incubacioacuten y potenciar las reacciones de losanticuerpos sin incrementar las reacciones inespeciacuteficas

Los iones Na+ y Cl- presentes en la solucioacuten salinafisioloacutegica se agrupan alrededor de las moleacuteculas deantiacutegeno y anticuerpo neutralizando sus cargas opuestas locual dificulta la unioacuten entre ellos Este efecto se reduceutilizando soluciones de baja fuerza ioacutenica y disminuyendode esta manera la incubacioacuten de las pruebas

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En esta etapa de sensibilizacioacuten las posibilidades deasociacioacuten pueden incrementarse mediante agitacioacutencentrifugacioacuten yo variacioacuten de la concentracioacuten delanticuerpo

Despueacutes de que el anticuerpo se ha fijado al antiacutegeno loseritrocitos sensibilizados deben unirse para dar lugar a laaglutinacioacuten visible esta red tambieacuten solidifica yestabiliza la reaccioacuten

En esta etapa la reaccioacuten depende de factores como lascaracteriacutesticas del anticuerpo localizacioacuten en la membranay nuacutemero de sitios antigeacutenicos fuerzas que mantienen ladistancia entre los eritrocitos

Las caracteriacutesticas del anticuerpo que deben considerarse

son el tamantildeo del anticuerpo involucrado y el nuacutemero desitios de combinacioacuten con el antiacutegeno Los anticuerpos IgMpueden establecer puentes entre los eritrocitos yaglutinarlos espontaacuteneamente en solucioacuten salina mientrasque los IgG no ya que las IgM pentameacutericas poseen 10sitios de combinacioacuten con el antiacutegeno y las IgG diacutemerossoacutelo dos sitios

Los eritrocitos tienen una carga neta negativa en susuperficie su interaccioacuten con los iones del medio alteraesta carga y producen una carga neta criacutetica denominada

potencial zeta y la reduccioacuten de dicha carga permite quelos eritrocitos se aproximen lo suficiente para que seanaglutinados por medio de los IgG que los sensibilizaron

Las soluciones de baja fuerza ionica empleadas en banco desangre tienen un pH entre 65 ndash 70 se recomienda unaosmolalidad de 270 ndash 305 mosmkg y una conductividad de 37mmcm El control diario implica el examen de su aparienciafiacutesica ausencia de turbidez particulas o sedimento asiacutecomo corroborar la capacidad para generar hemoacutelisiscrenacion o prueba de coombs positiva en eritrocitos

normales Cada lote nuevo se valora mediante el rastreo deun anticuerpo ya sea un anti- D un anti- jk anti- fy oanti- kell diluido se compara su capacidad de deteccioacutencontra un medio salino normal incubando 10min a 37ordmC enLISS debe poder rastrearse un anticuerpo en tanto que enmedio salino no

MATERIAL Y EQUIPO

Material Cantidad10 Tubos de ensayo de 12 x 75

1 Gradilla10 Pipetas pasteur

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1 Bulbo1 Marcador1 Microcentriacutefuga1 Bantildeo Mariacutea

MATERIAL BIOLOGICO

Gloacutebulos rojos lavados al 3 - 5Suero

REACTIVOS

Reactivo de LISSReactivo de Coombs

TECNICA1- Lavar los eritrocitos

Separar el suero del paquete de gloacutebulos rojos

Agregar cierta cantidad de eritrocitos a un tubo deensayo y agregarle solucioacuten salina

Centrifugar y decantar

Repetir este proceso 3 veces

2- Realizar la Prueba de LISS

Enumerar los tubos Poner dos gotas de LISS en cada tubo agregar una gota

de eritrocitos lavados y al 3 - 5 seguacuten el nuacutemero detubo correspondiente

Mezclar y centrifugar un minuto decantar elsobrenadante y con la ayuda de una gasa limpiar elexceso del reactivo

Poner nuevamente 2 gota de LISS resuspender poragitacioacuten agregar 2 gotas de suero problema mezclarincubar 15 minutos a 37ordm C centrifugar 30 seg A 1000

RPM Anotar los resultados

3- A las pruebas negativas realizar Coombs

Lavar 3 veces las ceacutelulas agregar suero de Coombscentrifugar 30 seg

Leer aglutinaciones y anotar resultados

REACTIVOS UTILIZADOS

REACTIVO MARCA FECHA DECADUCIDAD

ASPECTO COLOR LOTE

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SueroAntiglobuina

humana

Lafon 31 01 2009 Transparente Verde 406

LISS Caserorealizado enCMNSIGLOXXI

1 antildeo Transparente Transparente

----------

PACIENTE ASCANIO MENDEZ JOSUE O (+)DONADOR 1 GARCIA CARBAJAL OSCAR O (+)DONADOR 2 GARCIA SUAREZ ORLANDO A (+)

RESULTADOS

INTERPRETACIOacuteN DE LOS RESULTADOS

La hemoacutelisis o la aglutinacioacuten representan un resultado positivo e indican lapresencia de una reaccioacuten antiacutegeno-anticuerpo Los resultados negativos no severa aglutinacioacuten o hemolisis

ESQUEMAS

CONCLUSIONES

Concluyo que la prueba de compatibilidad sanguiacutenea en su modalidad conliss ofrece mucha ventaja al ser al igual que otros reactivos unpotencializador de la reaccioacuten antiacutegeno-anticuerpo Esto permite queel operador o realizador de la prueba tenga mayor confianza y certezaen los resultados que obtenga

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Tubo Resultado

M1 NEGATIVOm1 NEGATIVO

M2 POSITIVO

M2 NEGATIVO

AUTOTES NEGATIVO

29

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PRACTICA 9INMUNOHEMATOLOGIA

DETERMINACION DE COOMBS DIRECTO

INTRODUCCIONPRUEBA DE COOMBS DIRECTA

El examen de Coombs directo se utiliza para detectar autoanticuerpos contralos propios gloacutebulos rojos (GR) de un individuo Es una prueba que sirve parademostrar el revestimiento de los eritrocitos in vivo (mientras los eritrocitosestaacuten circulando en el individuo) La prueba se realiza agregando directamenteel reactivo de Coombs a los eritrocitos previamente lavados para eliminar otras proteiacutenas no fijadas a el una prueba directa positiva significa que larelacioacuten antiacutegeno-anticuerpo ocurrioacute in vivo es decir que la fijacioacuten del

anticuerpo sobre el antiacutegeno se realizo en el organismo del individuo enestudio

Las indicaciones principales de esta prueba son diagnostico de enfermedadeshemoliacuteticas ictericia o anomaliacuteas en la apariencia de los gloacutebulos rojos bajo elmicroscopio ya que estos anticuerpos algunas veces destruyen los gloacutebulosrojos y causan anemia para investigar reacciones en transfusiones Parainvestigar la induccioacuten de drogas en ceacutelulas rojas sensibilizadas medicamentos(por ejemplo quinidina metildopa procainamida y otros) que pueden llevar a la produccioacuten de estos anticuerpos

OBJETIVO Determinar la presencia de anticuerpos en la superficie de losgloacutebulos rojos del individuo

MATERIAL

bull 10 Tubos de 1275

bull 10 Pipetas Pasteur

bull 1 Gradilla

bull 1 Bulbo

bull Papel Parafilm

bull Microcentriacutefuga

bull Bantildeo Mariacutea a 37degC

MUESTRA BIOLOGICA

Eritrocitos lavados de (3-5) del donador o pacienteREACTIVO

Suero de CoombsSuero anti-globulina humana Lafon Lote 406 Cad 310109 Color verde Aspecto transparente

TECNICA

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Colocar en un tubo de ensaye dos gotas de suero de Coombs mas una gota deglobulos rojos (3-5)Centrifugar a 1000 rpm durante 20 segDesprender el boton suavemente y buscar la presencia de aglutinacionRotular y enumerar 8 tubos de ensayes con las diferentes diluciones

(frac12frac1418)Enumerar 8 tubos mas del 1 al 8Agregar a cada tubo de las diluciones 10 gotas de solucion salina mas 10 gotasde suero de CoombsColocar Al primer tubo de la dilucion 1 gota de globulos rojos (3-5) mezclar completamente y agregar al tubo 1Centrifugar todos los tubos a 1000 rpm durante 20 seg

LECTURA

Aglutina- Prueba de Coombs directa es positiva

No aglutina- Prueba de Coombs directa es negativa

ESQUEMAS y RESULTADOS

CONCLUCION

He concluido que la prueba de Coombs directa es una prueba que se utiliza para medir

la presencia de anticuerpos en la superficie de los gloacutebulos rojos que se encuentran

circulando en el paciente y se realiza para investigar reacciones en transfusiones ademaacutes

sirve para la determinacioacuten de anemia hemoliacutetica autoinmune entre otras afecciones

Practica 10

IDENTIFICACION DE ANTICUERPOS IRREGULARES

Fundamento

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DILUCIONES

frac12 positiva

frac14 positiva

18 positiva

116 negativa

132 negativa

164 negativa

1128 negativa1256 negativa

31

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Los anticuerpos del sistema ABO aparecen una vez que elindividuo entra en contacto con el medio ambiente y en elcual se encuentran microorganismos como algunas bacteriascoliformes que contienen sustancias quiacutemicas en suestructura parecidas a las de este sistema Por anticuerpos

regulares debemos identificar a los que existen en todoslos individuos y que eacutestos tendraacuten durante toda su vida

Los anticuerpos irregulares son los que no estaacuten de esamanera aunque en el caso de los naturales no se conoce aciencia cierta queacute o coacutemo se induce su produccioacuten Losadquiridos se conocen tambieacuten como inmunes y son elresultado de la exposicioacuten a antiacutegenos desconocidos por elindividuo al momento de la transfusioacuten o en las mujerespor el embarazo estos anticuerpos son dirigidos contraantiacutegenos de sistemas diferentes al ABO

Los anticuerpos naturales regulares son preferentementeinmunoglobulinas M las cuales fijan de manera taneficiente el complemento que pueden provocar lisisintravascular y ocasionar insuficiencia renal o incluso lamuerte del paciente Los anticuerpos adquiridos o inmunesson generalmente inmunoglobulinas G las cuales producenhemoacutelisis extravascular en el bazo o en el hiacutegado mediantefagocitosis del complejo eritrocito maacutes anticuerpo

Los aloanticuerpos irregulares (adquiridos) maacutes comunes en

nuestra poblacioacuten son los que involucran a los sistemasMNSs P1 Kidd (Jka Jkb) Duffy (Fya Fyb) Kell Lewis yDiego

OBJETIVO identificacioacuten del anticuerpo irregular a traveacutesde las diferentes teacutecnicas

MATERIAL

bull 10 Tubos de ensaye

bull 10 Pipetas Pasteur

bull

1Gradillabull 1 Bulbo

bull Papel Parafim

MATERIAL BIOLOGICO

bull Gloacutebulos rojos lavados al 3 - 5

bull Suero

bull REACTIVOSReactivos

1 Suero de Coombs2 Albuacutemina bovina

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bull EQUIPO1 Microcentriacutefuga2 Bantildeo Mariacutea oacute Estufa

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3 SOLUCION SALINA4 SOLUCION DE LISS

TEacuteCNICA SOLUCION SALINA

Lavar los eritrocitos con solucioacuten salina (3veces)SALINA RAacutePIDA

Agregar una gota de Eritrocitos LavadosDiluiacuterlo al 3-5 con solucioacuten salina 09Agregar 2 gotas de sueroCentrifugar y observar anotar desprendimientodel botoacuten

SALINA 37deg BANtildeO MARIacuteA1) Incubar tubos a Bantildeo mariacutea a 37degC durante 1

hora (o 20 min)

2) Centirfugar despueacutes de haber pasado eltiempo

3) Desprender el botoacuten de eritrocitos yobservar

AGLUTINACIOacuteNndash No es compatibleNO AGLUTINACIOacuteN - Lavar 3 veces

SALINA COOMBS1) Con solucioacuten salina 09 lavar los

eritrocitos de los tubos q no tuvieronaglutinacioacuten 3 veces

2) Decantar y agregar 2 gotas de reactivode Coombs

AGLUTINACIOacuteN ndash No es compatibleNO AGLUTINACIOacuteN - Lavar 3 veces

TECNICA LISS

1 Poner dos gotas de LISS en cada tubo agregar una gotade eritrocitos lavados y al 3 - 5 seguacuten el nuacutemero detubo correspondiente

2 Mezclar y centrifugar un minuto decantar el

sobrenadante y con la ayuda de una gasa limpiar elexceso del reactivo

3 Poner nuevamente 2 gota de LISS resuspender poragitacioacuten agregar 2 gotas de suero problema mezclarincubar 15 minutos a 37ordm C centrifugar 30 seg A 1000RPM

4 Anotar los resultados

A las pruebas negativas realizar Coombs

1 Lavar 3 veces las ceacutelulas agregar suero de Coombs

centrifugar 30 seg2 Leer aglutinaciones y anotar resultados

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TECNICA ALBUMINA BOVINA 8 Agregar 2 gotas de albuacutemina al 229 Centrifugar 20 segundos10observar aglutinacioacuten o hemolisis o no aglutinacioacuten

11A los tubos con lecturas negativas incubar 20minutos en bantildeo Mariacutea a 37 degC12Centrifugar y observar

bull Aglutinacioacuten o hemoacutelisis reportar incompatible

bull No aglutinacioacuten llevar a Coombs

13Lavar tres veces decantar y quitar el exceso desalina con gasa y agregar 2 gotas de reactivo deCoombs y centrifugar 20 segundos y observar

bull Aglutinacioacuten o hemoacutelisis reportar incompatible

bull No aglutinacioacuten reportar compatible

Resultados ANTICUERPO IRREGULAR Anticuerpo c

InterpretacioacutenEstos anticuerpos son generalmente inmunoglobulinas tipo My ocasionalmente tipo G y debido a esa temperatura dereaccioacuten carecen de importancia cliacutenica salvo que sureaccioacuten ocurra tambieacuten a 37 degC su importancia radica enpacientes que seraacuten intervenido a 22 ordmc como es el caso de

operacioacuten de corazoacuten

Los llamados anticuerpos calientes tienen una temperatura oacuteptima dereaccioacuten a 37 degC a Estos anticuerpos tienen una relevanteimportancia cliacutenica ya que se les asocia con reaccionestransfusionales de intensidad moderada a severa que puedenocasionar la muerte

Esquemas

CONCLUSIONHe concluido que es importante determinar los anticuerposirregulares ya que estos anticuerpos tienen una relevanteimportancia cliacutenica ya que se les asocia con reaccionestransfusionales de intensidad moderada a severa

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La prueba de Coombs se usa para determinar la presencia deanticuerpos no aglutinantes en el suero de sujetossensibilizados a uno o mas antiacutegenos sanguiacuteneos Es uacutetil enel estudio del suero de mujeres con isoinmunizacioacutenmaterno-fetal y se emplea tambieacuten en otro tipo de pruebas

como identificacioacuten de anticuerpos autoinmunes deteccioacutende algunos sistemas sanguiacuteneos y pruebas de compatibilidadsanguiacutenea

La prueba indirecta se realiza con eritrocitos normalesincubados in Vitro con el suero de estudio Durante esteperiodo si existe un anticuerpo este se fija sobre surespectivo determinante antigeacutenico Una vez fijados loseritrocitos son igualmente lavados y se agrega el reactivode Coombs produciendo aglutinacioacuten

Una prueba de Coombs indirecta positiva significa queexisten anticuerpos libres en el suero de la persona loscuales puedan ser igualmente auto-anticuerpos oisoanticuerpos

Material y equipo

bull Pipetas automaacuteticas de 10 microl 25 microl 50 microl y 1 ml

bull Puntas de pipetas desechables

bull Tubos de vidrio

bull Incubador para tarjetas DG Gel

bull Centrifuga para tarjetas DG Gel

Material bioloacutegico

bull Hematiacutees reactivo para investigacioacuten e identificacioacuten de anticuerpos irregulares de

Diagnostic Grifols SA

bull Suero de hemoclasificacioacuten

bull Muestras de sangre de extraccioacuten reciente recogida con anticoagulante o sin

anticoagulante

Reactivos

bull Tarjetas DG Gel

bull DG Gel Sol

Reactivos

Tarjetas DG Gel Coombs DG Gel SolRango de temperatura entre 2 y 25 ordmC Rango de temperatura entre 2 y 8ordmCLote 704901 Lote 7003701Cad 2008-03 Cad 2008-06Aspecto transparente Aspecto transparenteColor verde Color incoloro

TeacutecnicaMeacutetodo manual

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1 Dejar atemperar (18-25ordmC) muestras y reactivo2 Inspeccionar el estado de las tarjetas antes de utilizar3 Identificar las tarjetas y muestras a utilizar4 Despegar con precaucioacuten la lamina de metal que cubre los microtubos para prevenir

contaminaciones cruzadas entre ellos

5 Preparar una suspensioacuten con hematiacutees al 1 en DG Gel Sol (10 microl de sedimento oconcentrado de hematiacutees en 1 ml de DG Gel Sol) Utilizar los hematiacutees del donantepara la PC mayor y hematiacutees del receptor para la PC menor Asegurar la suspensioacuten delos hematiacutees antes de utilizar

6 Dispensar en el tubo correspondiente 50 microl de suspensioacuten de los hematiacutees al 1 deldonante (PC mayor) o 50 microl de suspensioacuten de los hematiacutees al 1 del receptor (PCmenor)

7 Antildeadir 25 microl de suero o plasma del receptor (PC mayor) o 25 microl de suero o plasma deldonante (PC menor)

8 Preparar auto control con 50 microl de suspensioacuten de los hematiacutees al 1 del receptor y 25microl de suero o plasma del receptor

9 Incubar 15 minutos a 37 ordmC10 Centrifugar en la centrifuga para tarjetas DG Gel

11 Leer los resultados

InterpretacioacutenNegativo - Banda de hematiacutees en el fondo de la columna resto de la columna sin aglutinados visibles

Positivo +- Escasos aglutinados de pequentildeo tamantildeo en la mitad inferior de la columna

1+ Algunos aglutinados de pequentildeo tamantildeo en la columna

2+ Aglutinados de tamantildeo pequentildeo o mediano a lo largo de la columna

3+ Banda superior de aglutinados de tamantildeo mediano en la mitad superior de la columna

4+ Banda de hematiacutees aglutinados en la parte superior de la columna

DP Doble poblacioacuten (doble banda de hematiacutees en el fondo y en la parte superior de la columna

Resultados

Paciente Lira Cabrera Carlos Alberto (AB+)Donador 1 Orea Valero Erasmo (A+)Donador 2 Moreno Adolfo (O+)

M1 m1 M2 m2 AutocontrolGR de donador 1 +suero del paciente

GR del paciente +suero de donador 1

GR de donador 2 +suero del paciente

GR del paciente +suero de donador 2

GR del paciente +suero del paciente

- + - + -

Por lo antes expuesto se puede deducir que el donador 1 (A+) puede donar eritrocitos al

paciente (AB+) lo mismo que el donador 2 (O+) puede donarle eritrocitos no asiacute plasma por parte de ambos donadores pues la prueba muestra que hubo reaccioacuten en ambas pruebasmenores

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Conclusioacuten

Concluyo que es esencial que toda la sangre sea estudiadaantes de la transfusioacuten para Asegurar que todos losgloacutebulos rojos transfundidos son compatibles con losanticuerpos en el plasma del paciente Evitar estimular laproduccioacuten de nuevos anticuerpos contra los gloacutebulos rojosen el receptor especialmente anti-Rh D

PRAacuteCTICA No 6PRUEBA DE COMPATIBILIDAD SANGIacuteNEA

(Teacutecnica salina)

INTRODUCCIOacuteN

Landsteiner constatoacute que cuando un aglutinoacutegeno se pone

en contacto con la aglutinina homoacuteloga se produce unaaglutinacioacuten

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La compatibilidad sanguiacutenea es la posibilidad de mezclade sangre sin que se produzcan trastornos tales como losfenoacutemenos de la lisis o de la aglutinacioacuten

A causa de este fenoacutemeno bioloacutegico en las transfusiones

de sangre no es suficiente con conocer que la sangre deldonante y la del receptor son del mismo grupo o bien quela del donante pertenezca al grupo O (cero) sino que esnecesario conocer si la compatibilidad es perfecta porqueninguacuten otro fenoacutemeno de inmunizacioacuten interfiera Es eneste sentido por lo que son empleadas las pruebascruzadas

Ademaacutes de los 6 antiacutegenos del sistema ABO en loseritrocitos humanos existen numerosos sistemas deaglutinoacutegenos que contienen muchos antiacutegenos individuales

en los eritrocitos (maacutes de 500000 millones posibles defenotipos de grupos sanguiacuteneos conocidos) Para evitaraccidentes transfusionales es indispensable tener encuenta el sistema Rh ademaacutes del ABO

Del sistema de antiacutegenos Rh es el D el maacutes antigeacutenico yel teacutermino Rh positivo indica que el individuo presentaaglutinoacutegeno D El individuo Rh negativo no tiene antiacutegenoD y forma la aglutinina anti-D en contacto con eacuteste

Las reacciones antiacutegeno-anticuerpo pueden observarse in

vitro por

mdash Hemoacutelisis la unioacuten antiacutegeno-anticuerpo se traduce enlisis de los eritrocitos en presenciadel complemento (siempre que el anticoagulante empleado nocapture losiones Ca y Mg necesarios para la activacioacuten delcomplemento) mdash Aglutinacioacuten los anticuerpos que reaccionan en mediosalino se conocen comoanticuerpos completos o aglutinantes (comuacutenmente tipo

IgM)

OBJETIVO Determinacioacuten de los antigenos del sistema ABORh (D) y su compatibilidad entre un paciente Donador y unPaciente Receptor

MATERIAL5 Tubos de ensaye6 Pipetas Pasteur

1Gradilla1 Bulbo

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EQUIPOMicrocentriacutefugaBantildeo Mariacutea oacute Estufa

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Papel Parafilm

MUESTRA Muestra de sangre con Anticoagulante EDTA

REACTIVOSAntisuero RO-Antiglobulina humana (Poliespeciacutefico Anti IgG C-d) Para prueba de CoombsLABORATORIOS LAFON SA de C VFecha de Caducidad 31-Ene-09Lote 406Hecho en MeacutexicoAspecto TransparenteColor Verde

TEacuteCNICA

Lavar los eritrocitos con solucioacuten salina (3 veces)

SALINA RAacutePIDA1 Agregar una gota de Eritrocitos Lavados2 Diluirlo al 3-5 con solucioacuten salina 093 Agregar 2 gotas de suero4 Centrifugar y observar anotar desprendimiento del botoacuten

SALINA 37deg BANtildeO MARIacuteA

1 Incubar tubos a Bantildeo mariacutea a 37degC durante 1hora (o 20 min)2 Centirfugar despueacutes de haber pasado el

tiempo3 Desprender el botoacuten de eritrocitos y

observarAGLUTINACIOacuteNndash No es compatibleNO AGLUTINACIOacuteN - Lavar 3 veces

SALINA COOMBS

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PRUEBA MAYOR

G Rojos del DONADOR+

Suero del RECEPTOR(paciente)

PRUEBA MENOR

G Rojos del RECEPTOR(paciente)

+Suero del DONADOR

AUTOTESTIGO

G Rojos del RECEPTOR(paciente)

+Suero del RECEPTOR

(paciente)

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1 Con solucioacuten salina 09 lavar loseritrocitos de los tubos q no tuvieronaglutinacioacuten 3 veces

2 Decantar y agregar 2 gotas de reactivode Coombs

AGLUTINACIOacuteN ndash No es compatibleNO AGLUTINACIOacuteN - Lavar 3 veces

RESULTADOS

Paciente Madrigal Meacutendez Luis Eduardo (B+)Folio 009164Fecha301007

Donador 1 Torres Avileacutes Joseacute Ramoacuten (O+)Folio 022604Fecha311007

Donador 2 Rodriacuteguez Nuacutentildeez Joseacute Angel (A+) Folio 022605

Fecha311007

SALINA RAacutePIDA

M1 m1 M2 m2 AutotestigoGR de donador 1+ suero del

paciente

GR del paciente+ suero dedonador 1

GR de donador 2+ suero del

paciente

GR del paciente+ suero dedonador 2

GR del paciente+ suero del

paciente

- 4+ 4+ 4+ -

SALINA 37deg BANtildeO MARIacuteA

M1 m1 M2 m2 Autotestigo- 4+ 4+ 4+ -

Compatible Nocompatible

Nocompatible

Nocompatible

Compatible

SALINA COOMBS

Por lo tanto se puede decir que el donador 1 (O+) puededonar suero al paciente (B+) debido a que en el suero nohay anticuerpos de ninguacuten tipo que reaccionen con losantiacutegenos de los eritrocios del Donador 1 Mientras tantoel Donador 2 no puede donar al Paciente ni suero nieritrocitos

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M1 Autotestigo- -

Compatible

Compatible

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INTERPRETACIOacuteN

PRUEBA POSITIVA Existe una aglutinacioacuten de lasceacutelulas sanguiacuteneas que indica la presencia delantiacutegeno A o B En el suero de Coombs notamos si esta

la precencia de Antiacutegeno D en los eritrocitos Lahemoacutelisis no se debe interpretar como resultadopositivo ya que puede indicar contaminacioacuten delreactivo

PRUEBA NEGATIVA La no aglutinacioacuten indica unresultado negativo e indica que las ceacutelulas sonnegativas para Antiacutegenos del sisitema ABO y D

CONCLUSIOacuteN

He concluido que en las transfusiones de sangre no essuficiente con conocer que la sangre del donante y la delreceptor son del mismo grupo o bien que la del donantepertenezca al grupo O (cero) sino que es necesarioconocer si la compatibilidad es perfecta porque ninguacutenotro fenoacutemeno de inmunizacioacuten interfiera Es en estesentido por lo que son empleadas las pruebas cruzadas

Praacutectica No 7ldquoPrueba de compatibilidad sanguiacutenea (teacutecnica albumina)rdquo

IntroduccioacutenLa tipificacioacuten de sangre identifica el tipo sanguiacuteneo determinandoantiacutegenos presentes en los eritrocitos detecta aloanticuerpos encontra esos antiacutegenos Asiacute los aloanticuerpos pueden aparecernaturalmente o ser inducidos y pueden ser dirigidos contra del grupoconocido o a los antiacutegenos de superficie de los eritrocitos La prueba

de compatibilidad sanguiacutenea o cross matching esta formada por laprueba mayor y menorLa prueba de cruzamiento mayor para losaloanticuerpos consiste en probar el plasma del receptor contra los

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gloacutebulos rojos del donante Es incompatible cuando se genera unareaccioacuten hemoliacutetica los eritrocitos del donante se destruyen por losaloanticuerpos del plasma del receptor La prueba menor es una pruebapara los aloanticuerpos del plasma del donante en contra los gloacutebulosrojos del receptor Una incompatibilidad menor es una causa menosfrecuente para causar una reaccioacuten en contra una transfusioacuten porque

el volumen de plasma del donante es menor y es diluido marcadamente enel receptor Para llevar a cabo dicho procedimiento se utilizandiversos reactivos como potencializadores que mejoran la unioacuten deeritrocitos con alguacuten tipo de anticuerpo Uno de esospotencializadores es la albuacutemina La albumina bovina polimerizada esun reactivo muy utilizado en el laboratorio de inmunohematologia y encentros de bancos de sangre funciona como un potencializador quefacilita la reaccion de aglutinacioacuten de eritrocitos sensibilizados Alfinal de la prueba se prueban los eritrocitos con el reactivo deCoombs El principio de la prueba de Coombs fue descrito por Moreschien 1908 pero Coombs Mourant y Race en 1946 la introdujeron en elestudio de los grupos sanguiacuteneos y anticuerpos cuando una parte desangre (suero) fue usada para la inoculacioacuten de animales para

inmunizarlos con proteiacutena humana utilizando el anticuerpo obtenido enla deteccioacuten de los llamados anticuerpos incompletos Esta prueba seusa para determinar la presencia de anticuerpos no aglutinantes en elsuero de sujetos sensibilizados a uno o mas antiacutegenos sanguiacuteneos Esuacutetil en el estudio del suero de mujeres con isoinmunizacioacuten materno-fetal y se emplea tambieacuten en otro tipo de pruebas como identificacioacutende anticuerpos autoinmunes deteccioacuten de algunos sistemas sanguiacuteneos ypruebas de compatibilidad sanguiacutenea La prueba indirecta se realizacon eritrocitos normales incubados in Vitro con el suero de estudioDurante este periodo si existe un anticuerpo este se fija sobre surespectivo determinante antigeacutenico Una vez fijados los eritrocitosson igualmente lavados y se agrega el reactivo de Coombs produciendoaglutinacioacuten Una prueba de Coombs indirecta positiva significa que

existen anticuerpos libres en el suero de la persona los cualespuedan ser igualmente auto-anticuerpos o isoanticuerpos

Objetivo Determinacioacuten de los antiacutegenos del sistema ABO Rh (D) y sucompatibilidad entre un paciente Donador y un Paciente Receptor

Material y equipo

5 Tubos de ensaye

6 Pipetas Pasteur

1Gradilla

1 Bulbo

Papel Parafilm

Microcentriacutefuga

Bantildeo Mariacutea oacute Estufa

Material bioloacutegico

Muestras de sangre de extraccioacuten reciente recogida conanticoagulante o sin anticoagulante

ReactivosSuero de CoombsAlbuacutemina bovina deg

Suero anti-globulina humana Lafon Lote 406 Cad 310109 Color verde Aspecto

transparentedegAlbumina de bovino polimerizada Interbiol Lote APO107 Cad 150109 Color incoloroAspecto transparente

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Teacutecnica

1 Montar prueba mayor 1 y 2 prueba menor 1 y 2 y autotestigocon el procedimiento ya anteriormente conocido

2 Agregar 2 gotas de albuacutemina al 223 Centrifugar 20 segundos4 observar aglutinacioacuten o hemolisis o no aglutinacioacuten5 A los tubos con lecturas negativas incubar 20 minutos en bantildeo

Mariacutea a 37 degC6 Centrifugar y observar

bull Aglutinacioacuten o hemoacutelisis reportar incompatible

bull No aglutinacioacuten llevar a Coombs

7 Lavar tres veces decantar y quitar el exceso de salina congasa y agregar 2 gotas de reactivo de Coombs y centrifugar 20segundos y observar

bull Aglutinacioacuten o hemoacutelisis reportar incompatible

bull No aglutinacioacuten reportar compatible

Resultados1 PRUEBA MAYOR 1 2 Gotas de suero del paciente + 1 gota de GR al 3-5 del

donador 12 PRUEBA MENOR 1 2 Gotas de suero del donador 1 + 1 gota de GR al 3-5 del

paciente3 PRUEBA MAYOR 2 2 Gotas de suero del paciente + 1 gota de GR al 3-5 del

donador 24 PRUEBA MENOR 2 2 Gotas de suero del donador 2 + 1 gota de GR al 3-5 del

paciente5 AUTOTESTIGO 2 Gotas de suero del paciente + 1 gota de GR al 3-5 del paciente

M1 m1 M2 m2 AutotestigoCon albuacutemina - - - - -Despueacutes de incubacioacuten a 37 degC - - - - -Despueacutes de Coombs - - - - -Despueacutes de validacioacuten con gloacutebulos

positivos+ + + + +

InterpretacioacutenPrueba positiva Alutinacioacuten o hemolisis Indica no compatibilidadPrueba negativaNo aglutinacioacuten Indica compatibilidad

Esquemas

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ConclusioacutenConcluyo que la prueba de compatibilidad sanguiacutenea en su modalidad conalbuacutemina bovina ofrece mucha ventaja al ser al igual que otrosreactivos un potencializador de la reaccioacuten antiacutegeno-anticuerpo Estopermite que el operador o realizador de la prueba tenga mayorconfianza y certeza en los resultados que obtenga

PRACTICA No 8PRUEBA DE COMPATIBILIDAD SANGUINEA PRUEBA DE LISS

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FUNDAMENTO

LISS es utilizado para reducir la fuerza ioacutenica del medio

de reaccioacuten en los procedimientos de deteccioacuten eidentificacioacuten de anticuerpos y en las pruebas decompatibilidad La presencia de este reactivo refuerza lainteraccioacuten antiacutegeno - anticuerpo durante la incubacioacuten

GENERALIDADESEl uso de solucioacuten salina de baja fuerza ioacutenica fuedescrito inicialmente en 1964 por Hughes-Jones y col y

Elliot y col pero en ese tiempo su uso era limitado yaque la concentracioacuten molar obtenida provocaba la hemoacutelisisde los eritrocitos suspendidos

En 1974 Low y Messeter describieron el uso rutinario de lasolucioacuten Liss de 003 M que lograba reducir el tiempo deincubacioacuten y no presentaba tendencia a la hemoacutelisis al sersuspendidos en salina a baja fuerza ioacutenica restableciendola presioacuten osmoacutetica de la solucioacuten mediante la adicioacuten deglicinaLas soluciones de baja fuerza ioacutenica son actualmente lasmaacutes utilizadas en inmunohematologiacutea provocando un aumentoen la velocidad de asociacioacuten entre antiacutegenos y anticuerpospermitiendo asiacute acortar el tiempo de incubacioacuten de 60minutos a 10-15 minutos sin sacrificar la sensibilidad delas mismas y sin costos elevadosSe ha observado que lasreacciones antiacutegeno-anticuerpo se ven potenciadas alreducir la fuerza ioacutenica del medio de reaccioacuten

La fuerza ioacutenica es uno de los factores maacutes importantes quedeterminan la tasa y la cantidad de captacioacuten deanticuerpos por parte de los eritrocitos El uso de mediosde reaccioacuten de baja fuerza ioacutenica permite disminuir eltiempo de incubacioacuten y potenciar las reacciones de losanticuerpos sin incrementar las reacciones inespeciacuteficas

Los iones Na+ y Cl- presentes en la solucioacuten salinafisioloacutegica se agrupan alrededor de las moleacuteculas deantiacutegeno y anticuerpo neutralizando sus cargas opuestas locual dificulta la unioacuten entre ellos Este efecto se reduceutilizando soluciones de baja fuerza ioacutenica y disminuyendode esta manera la incubacioacuten de las pruebas

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En esta etapa de sensibilizacioacuten las posibilidades deasociacioacuten pueden incrementarse mediante agitacioacutencentrifugacioacuten yo variacioacuten de la concentracioacuten delanticuerpo

Despueacutes de que el anticuerpo se ha fijado al antiacutegeno loseritrocitos sensibilizados deben unirse para dar lugar a laaglutinacioacuten visible esta red tambieacuten solidifica yestabiliza la reaccioacuten

En esta etapa la reaccioacuten depende de factores como lascaracteriacutesticas del anticuerpo localizacioacuten en la membranay nuacutemero de sitios antigeacutenicos fuerzas que mantienen ladistancia entre los eritrocitos

Las caracteriacutesticas del anticuerpo que deben considerarse

son el tamantildeo del anticuerpo involucrado y el nuacutemero desitios de combinacioacuten con el antiacutegeno Los anticuerpos IgMpueden establecer puentes entre los eritrocitos yaglutinarlos espontaacuteneamente en solucioacuten salina mientrasque los IgG no ya que las IgM pentameacutericas poseen 10sitios de combinacioacuten con el antiacutegeno y las IgG diacutemerossoacutelo dos sitios

Los eritrocitos tienen una carga neta negativa en susuperficie su interaccioacuten con los iones del medio alteraesta carga y producen una carga neta criacutetica denominada

potencial zeta y la reduccioacuten de dicha carga permite quelos eritrocitos se aproximen lo suficiente para que seanaglutinados por medio de los IgG que los sensibilizaron

Las soluciones de baja fuerza ionica empleadas en banco desangre tienen un pH entre 65 ndash 70 se recomienda unaosmolalidad de 270 ndash 305 mosmkg y una conductividad de 37mmcm El control diario implica el examen de su aparienciafiacutesica ausencia de turbidez particulas o sedimento asiacutecomo corroborar la capacidad para generar hemoacutelisiscrenacion o prueba de coombs positiva en eritrocitos

normales Cada lote nuevo se valora mediante el rastreo deun anticuerpo ya sea un anti- D un anti- jk anti- fy oanti- kell diluido se compara su capacidad de deteccioacutencontra un medio salino normal incubando 10min a 37ordmC enLISS debe poder rastrearse un anticuerpo en tanto que enmedio salino no

MATERIAL Y EQUIPO

Material Cantidad10 Tubos de ensayo de 12 x 75

1 Gradilla10 Pipetas pasteur

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1 Bulbo1 Marcador1 Microcentriacutefuga1 Bantildeo Mariacutea

MATERIAL BIOLOGICO

Gloacutebulos rojos lavados al 3 - 5Suero

REACTIVOS

Reactivo de LISSReactivo de Coombs

TECNICA1- Lavar los eritrocitos

Separar el suero del paquete de gloacutebulos rojos

Agregar cierta cantidad de eritrocitos a un tubo deensayo y agregarle solucioacuten salina

Centrifugar y decantar

Repetir este proceso 3 veces

2- Realizar la Prueba de LISS

Enumerar los tubos Poner dos gotas de LISS en cada tubo agregar una gota

de eritrocitos lavados y al 3 - 5 seguacuten el nuacutemero detubo correspondiente

Mezclar y centrifugar un minuto decantar elsobrenadante y con la ayuda de una gasa limpiar elexceso del reactivo

Poner nuevamente 2 gota de LISS resuspender poragitacioacuten agregar 2 gotas de suero problema mezclarincubar 15 minutos a 37ordm C centrifugar 30 seg A 1000

RPM Anotar los resultados

3- A las pruebas negativas realizar Coombs

Lavar 3 veces las ceacutelulas agregar suero de Coombscentrifugar 30 seg

Leer aglutinaciones y anotar resultados

REACTIVOS UTILIZADOS

REACTIVO MARCA FECHA DECADUCIDAD

ASPECTO COLOR LOTE

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SueroAntiglobuina

humana

Lafon 31 01 2009 Transparente Verde 406

LISS Caserorealizado enCMNSIGLOXXI

1 antildeo Transparente Transparente

----------

PACIENTE ASCANIO MENDEZ JOSUE O (+)DONADOR 1 GARCIA CARBAJAL OSCAR O (+)DONADOR 2 GARCIA SUAREZ ORLANDO A (+)

RESULTADOS

INTERPRETACIOacuteN DE LOS RESULTADOS

La hemoacutelisis o la aglutinacioacuten representan un resultado positivo e indican lapresencia de una reaccioacuten antiacutegeno-anticuerpo Los resultados negativos no severa aglutinacioacuten o hemolisis

ESQUEMAS

CONCLUSIONES

Concluyo que la prueba de compatibilidad sanguiacutenea en su modalidad conliss ofrece mucha ventaja al ser al igual que otros reactivos unpotencializador de la reaccioacuten antiacutegeno-anticuerpo Esto permite queel operador o realizador de la prueba tenga mayor confianza y certezaen los resultados que obtenga

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Tubo Resultado

M1 NEGATIVOm1 NEGATIVO

M2 POSITIVO

M2 NEGATIVO

AUTOTES NEGATIVO

29

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PRACTICA 9INMUNOHEMATOLOGIA

DETERMINACION DE COOMBS DIRECTO

INTRODUCCIONPRUEBA DE COOMBS DIRECTA

El examen de Coombs directo se utiliza para detectar autoanticuerpos contralos propios gloacutebulos rojos (GR) de un individuo Es una prueba que sirve parademostrar el revestimiento de los eritrocitos in vivo (mientras los eritrocitosestaacuten circulando en el individuo) La prueba se realiza agregando directamenteel reactivo de Coombs a los eritrocitos previamente lavados para eliminar otras proteiacutenas no fijadas a el una prueba directa positiva significa que larelacioacuten antiacutegeno-anticuerpo ocurrioacute in vivo es decir que la fijacioacuten del

anticuerpo sobre el antiacutegeno se realizo en el organismo del individuo enestudio

Las indicaciones principales de esta prueba son diagnostico de enfermedadeshemoliacuteticas ictericia o anomaliacuteas en la apariencia de los gloacutebulos rojos bajo elmicroscopio ya que estos anticuerpos algunas veces destruyen los gloacutebulosrojos y causan anemia para investigar reacciones en transfusiones Parainvestigar la induccioacuten de drogas en ceacutelulas rojas sensibilizadas medicamentos(por ejemplo quinidina metildopa procainamida y otros) que pueden llevar a la produccioacuten de estos anticuerpos

OBJETIVO Determinar la presencia de anticuerpos en la superficie de losgloacutebulos rojos del individuo

MATERIAL

bull 10 Tubos de 1275

bull 10 Pipetas Pasteur

bull 1 Gradilla

bull 1 Bulbo

bull Papel Parafilm

bull Microcentriacutefuga

bull Bantildeo Mariacutea a 37degC

MUESTRA BIOLOGICA

Eritrocitos lavados de (3-5) del donador o pacienteREACTIVO

Suero de CoombsSuero anti-globulina humana Lafon Lote 406 Cad 310109 Color verde Aspecto transparente

TECNICA

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Colocar en un tubo de ensaye dos gotas de suero de Coombs mas una gota deglobulos rojos (3-5)Centrifugar a 1000 rpm durante 20 segDesprender el boton suavemente y buscar la presencia de aglutinacionRotular y enumerar 8 tubos de ensayes con las diferentes diluciones

(frac12frac1418)Enumerar 8 tubos mas del 1 al 8Agregar a cada tubo de las diluciones 10 gotas de solucion salina mas 10 gotasde suero de CoombsColocar Al primer tubo de la dilucion 1 gota de globulos rojos (3-5) mezclar completamente y agregar al tubo 1Centrifugar todos los tubos a 1000 rpm durante 20 seg

LECTURA

Aglutina- Prueba de Coombs directa es positiva

No aglutina- Prueba de Coombs directa es negativa

ESQUEMAS y RESULTADOS

CONCLUCION

He concluido que la prueba de Coombs directa es una prueba que se utiliza para medir

la presencia de anticuerpos en la superficie de los gloacutebulos rojos que se encuentran

circulando en el paciente y se realiza para investigar reacciones en transfusiones ademaacutes

sirve para la determinacioacuten de anemia hemoliacutetica autoinmune entre otras afecciones

Practica 10

IDENTIFICACION DE ANTICUERPOS IRREGULARES

Fundamento

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DILUCIONES

frac12 positiva

frac14 positiva

18 positiva

116 negativa

132 negativa

164 negativa

1128 negativa1256 negativa

31

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Los anticuerpos del sistema ABO aparecen una vez que elindividuo entra en contacto con el medio ambiente y en elcual se encuentran microorganismos como algunas bacteriascoliformes que contienen sustancias quiacutemicas en suestructura parecidas a las de este sistema Por anticuerpos

regulares debemos identificar a los que existen en todoslos individuos y que eacutestos tendraacuten durante toda su vida

Los anticuerpos irregulares son los que no estaacuten de esamanera aunque en el caso de los naturales no se conoce aciencia cierta queacute o coacutemo se induce su produccioacuten Losadquiridos se conocen tambieacuten como inmunes y son elresultado de la exposicioacuten a antiacutegenos desconocidos por elindividuo al momento de la transfusioacuten o en las mujerespor el embarazo estos anticuerpos son dirigidos contraantiacutegenos de sistemas diferentes al ABO

Los anticuerpos naturales regulares son preferentementeinmunoglobulinas M las cuales fijan de manera taneficiente el complemento que pueden provocar lisisintravascular y ocasionar insuficiencia renal o incluso lamuerte del paciente Los anticuerpos adquiridos o inmunesson generalmente inmunoglobulinas G las cuales producenhemoacutelisis extravascular en el bazo o en el hiacutegado mediantefagocitosis del complejo eritrocito maacutes anticuerpo

Los aloanticuerpos irregulares (adquiridos) maacutes comunes en

nuestra poblacioacuten son los que involucran a los sistemasMNSs P1 Kidd (Jka Jkb) Duffy (Fya Fyb) Kell Lewis yDiego

OBJETIVO identificacioacuten del anticuerpo irregular a traveacutesde las diferentes teacutecnicas

MATERIAL

bull 10 Tubos de ensaye

bull 10 Pipetas Pasteur

bull

1Gradillabull 1 Bulbo

bull Papel Parafim

MATERIAL BIOLOGICO

bull Gloacutebulos rojos lavados al 3 - 5

bull Suero

bull REACTIVOSReactivos

1 Suero de Coombs2 Albuacutemina bovina

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bull EQUIPO1 Microcentriacutefuga2 Bantildeo Mariacutea oacute Estufa

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3 SOLUCION SALINA4 SOLUCION DE LISS

TEacuteCNICA SOLUCION SALINA

Lavar los eritrocitos con solucioacuten salina (3veces)SALINA RAacutePIDA

Agregar una gota de Eritrocitos LavadosDiluiacuterlo al 3-5 con solucioacuten salina 09Agregar 2 gotas de sueroCentrifugar y observar anotar desprendimientodel botoacuten

SALINA 37deg BANtildeO MARIacuteA1) Incubar tubos a Bantildeo mariacutea a 37degC durante 1

hora (o 20 min)

2) Centirfugar despueacutes de haber pasado eltiempo

3) Desprender el botoacuten de eritrocitos yobservar

AGLUTINACIOacuteNndash No es compatibleNO AGLUTINACIOacuteN - Lavar 3 veces

SALINA COOMBS1) Con solucioacuten salina 09 lavar los

eritrocitos de los tubos q no tuvieronaglutinacioacuten 3 veces

2) Decantar y agregar 2 gotas de reactivode Coombs

AGLUTINACIOacuteN ndash No es compatibleNO AGLUTINACIOacuteN - Lavar 3 veces

TECNICA LISS

1 Poner dos gotas de LISS en cada tubo agregar una gotade eritrocitos lavados y al 3 - 5 seguacuten el nuacutemero detubo correspondiente

2 Mezclar y centrifugar un minuto decantar el

sobrenadante y con la ayuda de una gasa limpiar elexceso del reactivo

3 Poner nuevamente 2 gota de LISS resuspender poragitacioacuten agregar 2 gotas de suero problema mezclarincubar 15 minutos a 37ordm C centrifugar 30 seg A 1000RPM

4 Anotar los resultados

A las pruebas negativas realizar Coombs

1 Lavar 3 veces las ceacutelulas agregar suero de Coombs

centrifugar 30 seg2 Leer aglutinaciones y anotar resultados

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TECNICA ALBUMINA BOVINA 8 Agregar 2 gotas de albuacutemina al 229 Centrifugar 20 segundos10observar aglutinacioacuten o hemolisis o no aglutinacioacuten

11A los tubos con lecturas negativas incubar 20minutos en bantildeo Mariacutea a 37 degC12Centrifugar y observar

bull Aglutinacioacuten o hemoacutelisis reportar incompatible

bull No aglutinacioacuten llevar a Coombs

13Lavar tres veces decantar y quitar el exceso desalina con gasa y agregar 2 gotas de reactivo deCoombs y centrifugar 20 segundos y observar

bull Aglutinacioacuten o hemoacutelisis reportar incompatible

bull No aglutinacioacuten reportar compatible

Resultados ANTICUERPO IRREGULAR Anticuerpo c

InterpretacioacutenEstos anticuerpos son generalmente inmunoglobulinas tipo My ocasionalmente tipo G y debido a esa temperatura dereaccioacuten carecen de importancia cliacutenica salvo que sureaccioacuten ocurra tambieacuten a 37 degC su importancia radica enpacientes que seraacuten intervenido a 22 ordmc como es el caso de

operacioacuten de corazoacuten

Los llamados anticuerpos calientes tienen una temperatura oacuteptima dereaccioacuten a 37 degC a Estos anticuerpos tienen una relevanteimportancia cliacutenica ya que se les asocia con reaccionestransfusionales de intensidad moderada a severa que puedenocasionar la muerte

Esquemas

CONCLUSIONHe concluido que es importante determinar los anticuerposirregulares ya que estos anticuerpos tienen una relevanteimportancia cliacutenica ya que se les asocia con reaccionestransfusionales de intensidad moderada a severa

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1 Dejar atemperar (18-25ordmC) muestras y reactivo2 Inspeccionar el estado de las tarjetas antes de utilizar3 Identificar las tarjetas y muestras a utilizar4 Despegar con precaucioacuten la lamina de metal que cubre los microtubos para prevenir

contaminaciones cruzadas entre ellos

5 Preparar una suspensioacuten con hematiacutees al 1 en DG Gel Sol (10 microl de sedimento oconcentrado de hematiacutees en 1 ml de DG Gel Sol) Utilizar los hematiacutees del donantepara la PC mayor y hematiacutees del receptor para la PC menor Asegurar la suspensioacuten delos hematiacutees antes de utilizar

6 Dispensar en el tubo correspondiente 50 microl de suspensioacuten de los hematiacutees al 1 deldonante (PC mayor) o 50 microl de suspensioacuten de los hematiacutees al 1 del receptor (PCmenor)

7 Antildeadir 25 microl de suero o plasma del receptor (PC mayor) o 25 microl de suero o plasma deldonante (PC menor)

8 Preparar auto control con 50 microl de suspensioacuten de los hematiacutees al 1 del receptor y 25microl de suero o plasma del receptor

9 Incubar 15 minutos a 37 ordmC10 Centrifugar en la centrifuga para tarjetas DG Gel

11 Leer los resultados

InterpretacioacutenNegativo - Banda de hematiacutees en el fondo de la columna resto de la columna sin aglutinados visibles

Positivo +- Escasos aglutinados de pequentildeo tamantildeo en la mitad inferior de la columna

1+ Algunos aglutinados de pequentildeo tamantildeo en la columna

2+ Aglutinados de tamantildeo pequentildeo o mediano a lo largo de la columna

3+ Banda superior de aglutinados de tamantildeo mediano en la mitad superior de la columna

4+ Banda de hematiacutees aglutinados en la parte superior de la columna

DP Doble poblacioacuten (doble banda de hematiacutees en el fondo y en la parte superior de la columna

Resultados

Paciente Lira Cabrera Carlos Alberto (AB+)Donador 1 Orea Valero Erasmo (A+)Donador 2 Moreno Adolfo (O+)

M1 m1 M2 m2 AutocontrolGR de donador 1 +suero del paciente

GR del paciente +suero de donador 1

GR de donador 2 +suero del paciente

GR del paciente +suero de donador 2

GR del paciente +suero del paciente

- + - + -

Por lo antes expuesto se puede deducir que el donador 1 (A+) puede donar eritrocitos al

paciente (AB+) lo mismo que el donador 2 (O+) puede donarle eritrocitos no asiacute plasma por parte de ambos donadores pues la prueba muestra que hubo reaccioacuten en ambas pruebasmenores

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Conclusioacuten

Concluyo que es esencial que toda la sangre sea estudiadaantes de la transfusioacuten para Asegurar que todos losgloacutebulos rojos transfundidos son compatibles con losanticuerpos en el plasma del paciente Evitar estimular laproduccioacuten de nuevos anticuerpos contra los gloacutebulos rojosen el receptor especialmente anti-Rh D

PRAacuteCTICA No 6PRUEBA DE COMPATIBILIDAD SANGIacuteNEA

(Teacutecnica salina)

INTRODUCCIOacuteN

Landsteiner constatoacute que cuando un aglutinoacutegeno se pone

en contacto con la aglutinina homoacuteloga se produce unaaglutinacioacuten

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La compatibilidad sanguiacutenea es la posibilidad de mezclade sangre sin que se produzcan trastornos tales como losfenoacutemenos de la lisis o de la aglutinacioacuten

A causa de este fenoacutemeno bioloacutegico en las transfusiones

de sangre no es suficiente con conocer que la sangre deldonante y la del receptor son del mismo grupo o bien quela del donante pertenezca al grupo O (cero) sino que esnecesario conocer si la compatibilidad es perfecta porqueninguacuten otro fenoacutemeno de inmunizacioacuten interfiera Es eneste sentido por lo que son empleadas las pruebascruzadas

Ademaacutes de los 6 antiacutegenos del sistema ABO en loseritrocitos humanos existen numerosos sistemas deaglutinoacutegenos que contienen muchos antiacutegenos individuales

en los eritrocitos (maacutes de 500000 millones posibles defenotipos de grupos sanguiacuteneos conocidos) Para evitaraccidentes transfusionales es indispensable tener encuenta el sistema Rh ademaacutes del ABO

Del sistema de antiacutegenos Rh es el D el maacutes antigeacutenico yel teacutermino Rh positivo indica que el individuo presentaaglutinoacutegeno D El individuo Rh negativo no tiene antiacutegenoD y forma la aglutinina anti-D en contacto con eacuteste

Las reacciones antiacutegeno-anticuerpo pueden observarse in

vitro por

mdash Hemoacutelisis la unioacuten antiacutegeno-anticuerpo se traduce enlisis de los eritrocitos en presenciadel complemento (siempre que el anticoagulante empleado nocapture losiones Ca y Mg necesarios para la activacioacuten delcomplemento) mdash Aglutinacioacuten los anticuerpos que reaccionan en mediosalino se conocen comoanticuerpos completos o aglutinantes (comuacutenmente tipo

IgM)

OBJETIVO Determinacioacuten de los antigenos del sistema ABORh (D) y su compatibilidad entre un paciente Donador y unPaciente Receptor

MATERIAL5 Tubos de ensaye6 Pipetas Pasteur

1Gradilla1 Bulbo

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EQUIPOMicrocentriacutefugaBantildeo Mariacutea oacute Estufa

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Papel Parafilm

MUESTRA Muestra de sangre con Anticoagulante EDTA

REACTIVOSAntisuero RO-Antiglobulina humana (Poliespeciacutefico Anti IgG C-d) Para prueba de CoombsLABORATORIOS LAFON SA de C VFecha de Caducidad 31-Ene-09Lote 406Hecho en MeacutexicoAspecto TransparenteColor Verde

TEacuteCNICA

Lavar los eritrocitos con solucioacuten salina (3 veces)

SALINA RAacutePIDA1 Agregar una gota de Eritrocitos Lavados2 Diluirlo al 3-5 con solucioacuten salina 093 Agregar 2 gotas de suero4 Centrifugar y observar anotar desprendimiento del botoacuten

SALINA 37deg BANtildeO MARIacuteA

1 Incubar tubos a Bantildeo mariacutea a 37degC durante 1hora (o 20 min)2 Centirfugar despueacutes de haber pasado el

tiempo3 Desprender el botoacuten de eritrocitos y

observarAGLUTINACIOacuteNndash No es compatibleNO AGLUTINACIOacuteN - Lavar 3 veces

SALINA COOMBS

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PRUEBA MAYOR

G Rojos del DONADOR+

Suero del RECEPTOR(paciente)

PRUEBA MENOR

G Rojos del RECEPTOR(paciente)

+Suero del DONADOR

AUTOTESTIGO

G Rojos del RECEPTOR(paciente)

+Suero del RECEPTOR

(paciente)

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1 Con solucioacuten salina 09 lavar loseritrocitos de los tubos q no tuvieronaglutinacioacuten 3 veces

2 Decantar y agregar 2 gotas de reactivode Coombs

AGLUTINACIOacuteN ndash No es compatibleNO AGLUTINACIOacuteN - Lavar 3 veces

RESULTADOS

Paciente Madrigal Meacutendez Luis Eduardo (B+)Folio 009164Fecha301007

Donador 1 Torres Avileacutes Joseacute Ramoacuten (O+)Folio 022604Fecha311007

Donador 2 Rodriacuteguez Nuacutentildeez Joseacute Angel (A+) Folio 022605

Fecha311007

SALINA RAacutePIDA

M1 m1 M2 m2 AutotestigoGR de donador 1+ suero del

paciente

GR del paciente+ suero dedonador 1

GR de donador 2+ suero del

paciente

GR del paciente+ suero dedonador 2

GR del paciente+ suero del

paciente

- 4+ 4+ 4+ -

SALINA 37deg BANtildeO MARIacuteA

M1 m1 M2 m2 Autotestigo- 4+ 4+ 4+ -

Compatible Nocompatible

Nocompatible

Nocompatible

Compatible

SALINA COOMBS

Por lo tanto se puede decir que el donador 1 (O+) puededonar suero al paciente (B+) debido a que en el suero nohay anticuerpos de ninguacuten tipo que reaccionen con losantiacutegenos de los eritrocios del Donador 1 Mientras tantoel Donador 2 no puede donar al Paciente ni suero nieritrocitos

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M1 Autotestigo- -

Compatible

Compatible

21

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INTERPRETACIOacuteN

PRUEBA POSITIVA Existe una aglutinacioacuten de lasceacutelulas sanguiacuteneas que indica la presencia delantiacutegeno A o B En el suero de Coombs notamos si esta

la precencia de Antiacutegeno D en los eritrocitos Lahemoacutelisis no se debe interpretar como resultadopositivo ya que puede indicar contaminacioacuten delreactivo

PRUEBA NEGATIVA La no aglutinacioacuten indica unresultado negativo e indica que las ceacutelulas sonnegativas para Antiacutegenos del sisitema ABO y D

CONCLUSIOacuteN

He concluido que en las transfusiones de sangre no essuficiente con conocer que la sangre del donante y la delreceptor son del mismo grupo o bien que la del donantepertenezca al grupo O (cero) sino que es necesarioconocer si la compatibilidad es perfecta porque ninguacutenotro fenoacutemeno de inmunizacioacuten interfiera Es en estesentido por lo que son empleadas las pruebas cruzadas

Praacutectica No 7ldquoPrueba de compatibilidad sanguiacutenea (teacutecnica albumina)rdquo

IntroduccioacutenLa tipificacioacuten de sangre identifica el tipo sanguiacuteneo determinandoantiacutegenos presentes en los eritrocitos detecta aloanticuerpos encontra esos antiacutegenos Asiacute los aloanticuerpos pueden aparecernaturalmente o ser inducidos y pueden ser dirigidos contra del grupoconocido o a los antiacutegenos de superficie de los eritrocitos La prueba

de compatibilidad sanguiacutenea o cross matching esta formada por laprueba mayor y menorLa prueba de cruzamiento mayor para losaloanticuerpos consiste en probar el plasma del receptor contra los

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gloacutebulos rojos del donante Es incompatible cuando se genera unareaccioacuten hemoliacutetica los eritrocitos del donante se destruyen por losaloanticuerpos del plasma del receptor La prueba menor es una pruebapara los aloanticuerpos del plasma del donante en contra los gloacutebulosrojos del receptor Una incompatibilidad menor es una causa menosfrecuente para causar una reaccioacuten en contra una transfusioacuten porque

el volumen de plasma del donante es menor y es diluido marcadamente enel receptor Para llevar a cabo dicho procedimiento se utilizandiversos reactivos como potencializadores que mejoran la unioacuten deeritrocitos con alguacuten tipo de anticuerpo Uno de esospotencializadores es la albuacutemina La albumina bovina polimerizada esun reactivo muy utilizado en el laboratorio de inmunohematologia y encentros de bancos de sangre funciona como un potencializador quefacilita la reaccion de aglutinacioacuten de eritrocitos sensibilizados Alfinal de la prueba se prueban los eritrocitos con el reactivo deCoombs El principio de la prueba de Coombs fue descrito por Moreschien 1908 pero Coombs Mourant y Race en 1946 la introdujeron en elestudio de los grupos sanguiacuteneos y anticuerpos cuando una parte desangre (suero) fue usada para la inoculacioacuten de animales para

inmunizarlos con proteiacutena humana utilizando el anticuerpo obtenido enla deteccioacuten de los llamados anticuerpos incompletos Esta prueba seusa para determinar la presencia de anticuerpos no aglutinantes en elsuero de sujetos sensibilizados a uno o mas antiacutegenos sanguiacuteneos Esuacutetil en el estudio del suero de mujeres con isoinmunizacioacuten materno-fetal y se emplea tambieacuten en otro tipo de pruebas como identificacioacutende anticuerpos autoinmunes deteccioacuten de algunos sistemas sanguiacuteneos ypruebas de compatibilidad sanguiacutenea La prueba indirecta se realizacon eritrocitos normales incubados in Vitro con el suero de estudioDurante este periodo si existe un anticuerpo este se fija sobre surespectivo determinante antigeacutenico Una vez fijados los eritrocitosson igualmente lavados y se agrega el reactivo de Coombs produciendoaglutinacioacuten Una prueba de Coombs indirecta positiva significa que

existen anticuerpos libres en el suero de la persona los cualespuedan ser igualmente auto-anticuerpos o isoanticuerpos

Objetivo Determinacioacuten de los antiacutegenos del sistema ABO Rh (D) y sucompatibilidad entre un paciente Donador y un Paciente Receptor

Material y equipo

5 Tubos de ensaye

6 Pipetas Pasteur

1Gradilla

1 Bulbo

Papel Parafilm

Microcentriacutefuga

Bantildeo Mariacutea oacute Estufa

Material bioloacutegico

Muestras de sangre de extraccioacuten reciente recogida conanticoagulante o sin anticoagulante

ReactivosSuero de CoombsAlbuacutemina bovina deg

Suero anti-globulina humana Lafon Lote 406 Cad 310109 Color verde Aspecto

transparentedegAlbumina de bovino polimerizada Interbiol Lote APO107 Cad 150109 Color incoloroAspecto transparente

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Teacutecnica

1 Montar prueba mayor 1 y 2 prueba menor 1 y 2 y autotestigocon el procedimiento ya anteriormente conocido

2 Agregar 2 gotas de albuacutemina al 223 Centrifugar 20 segundos4 observar aglutinacioacuten o hemolisis o no aglutinacioacuten5 A los tubos con lecturas negativas incubar 20 minutos en bantildeo

Mariacutea a 37 degC6 Centrifugar y observar

bull Aglutinacioacuten o hemoacutelisis reportar incompatible

bull No aglutinacioacuten llevar a Coombs

7 Lavar tres veces decantar y quitar el exceso de salina congasa y agregar 2 gotas de reactivo de Coombs y centrifugar 20segundos y observar

bull Aglutinacioacuten o hemoacutelisis reportar incompatible

bull No aglutinacioacuten reportar compatible

Resultados1 PRUEBA MAYOR 1 2 Gotas de suero del paciente + 1 gota de GR al 3-5 del

donador 12 PRUEBA MENOR 1 2 Gotas de suero del donador 1 + 1 gota de GR al 3-5 del

paciente3 PRUEBA MAYOR 2 2 Gotas de suero del paciente + 1 gota de GR al 3-5 del

donador 24 PRUEBA MENOR 2 2 Gotas de suero del donador 2 + 1 gota de GR al 3-5 del

paciente5 AUTOTESTIGO 2 Gotas de suero del paciente + 1 gota de GR al 3-5 del paciente

M1 m1 M2 m2 AutotestigoCon albuacutemina - - - - -Despueacutes de incubacioacuten a 37 degC - - - - -Despueacutes de Coombs - - - - -Despueacutes de validacioacuten con gloacutebulos

positivos+ + + + +

InterpretacioacutenPrueba positiva Alutinacioacuten o hemolisis Indica no compatibilidadPrueba negativaNo aglutinacioacuten Indica compatibilidad

Esquemas

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ConclusioacutenConcluyo que la prueba de compatibilidad sanguiacutenea en su modalidad conalbuacutemina bovina ofrece mucha ventaja al ser al igual que otrosreactivos un potencializador de la reaccioacuten antiacutegeno-anticuerpo Estopermite que el operador o realizador de la prueba tenga mayorconfianza y certeza en los resultados que obtenga

PRACTICA No 8PRUEBA DE COMPATIBILIDAD SANGUINEA PRUEBA DE LISS

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FUNDAMENTO

LISS es utilizado para reducir la fuerza ioacutenica del medio

de reaccioacuten en los procedimientos de deteccioacuten eidentificacioacuten de anticuerpos y en las pruebas decompatibilidad La presencia de este reactivo refuerza lainteraccioacuten antiacutegeno - anticuerpo durante la incubacioacuten

GENERALIDADESEl uso de solucioacuten salina de baja fuerza ioacutenica fuedescrito inicialmente en 1964 por Hughes-Jones y col y

Elliot y col pero en ese tiempo su uso era limitado yaque la concentracioacuten molar obtenida provocaba la hemoacutelisisde los eritrocitos suspendidos

En 1974 Low y Messeter describieron el uso rutinario de lasolucioacuten Liss de 003 M que lograba reducir el tiempo deincubacioacuten y no presentaba tendencia a la hemoacutelisis al sersuspendidos en salina a baja fuerza ioacutenica restableciendola presioacuten osmoacutetica de la solucioacuten mediante la adicioacuten deglicinaLas soluciones de baja fuerza ioacutenica son actualmente lasmaacutes utilizadas en inmunohematologiacutea provocando un aumentoen la velocidad de asociacioacuten entre antiacutegenos y anticuerpospermitiendo asiacute acortar el tiempo de incubacioacuten de 60minutos a 10-15 minutos sin sacrificar la sensibilidad delas mismas y sin costos elevadosSe ha observado que lasreacciones antiacutegeno-anticuerpo se ven potenciadas alreducir la fuerza ioacutenica del medio de reaccioacuten

La fuerza ioacutenica es uno de los factores maacutes importantes quedeterminan la tasa y la cantidad de captacioacuten deanticuerpos por parte de los eritrocitos El uso de mediosde reaccioacuten de baja fuerza ioacutenica permite disminuir eltiempo de incubacioacuten y potenciar las reacciones de losanticuerpos sin incrementar las reacciones inespeciacuteficas

Los iones Na+ y Cl- presentes en la solucioacuten salinafisioloacutegica se agrupan alrededor de las moleacuteculas deantiacutegeno y anticuerpo neutralizando sus cargas opuestas locual dificulta la unioacuten entre ellos Este efecto se reduceutilizando soluciones de baja fuerza ioacutenica y disminuyendode esta manera la incubacioacuten de las pruebas

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En esta etapa de sensibilizacioacuten las posibilidades deasociacioacuten pueden incrementarse mediante agitacioacutencentrifugacioacuten yo variacioacuten de la concentracioacuten delanticuerpo

Despueacutes de que el anticuerpo se ha fijado al antiacutegeno loseritrocitos sensibilizados deben unirse para dar lugar a laaglutinacioacuten visible esta red tambieacuten solidifica yestabiliza la reaccioacuten

En esta etapa la reaccioacuten depende de factores como lascaracteriacutesticas del anticuerpo localizacioacuten en la membranay nuacutemero de sitios antigeacutenicos fuerzas que mantienen ladistancia entre los eritrocitos

Las caracteriacutesticas del anticuerpo que deben considerarse

son el tamantildeo del anticuerpo involucrado y el nuacutemero desitios de combinacioacuten con el antiacutegeno Los anticuerpos IgMpueden establecer puentes entre los eritrocitos yaglutinarlos espontaacuteneamente en solucioacuten salina mientrasque los IgG no ya que las IgM pentameacutericas poseen 10sitios de combinacioacuten con el antiacutegeno y las IgG diacutemerossoacutelo dos sitios

Los eritrocitos tienen una carga neta negativa en susuperficie su interaccioacuten con los iones del medio alteraesta carga y producen una carga neta criacutetica denominada

potencial zeta y la reduccioacuten de dicha carga permite quelos eritrocitos se aproximen lo suficiente para que seanaglutinados por medio de los IgG que los sensibilizaron

Las soluciones de baja fuerza ionica empleadas en banco desangre tienen un pH entre 65 ndash 70 se recomienda unaosmolalidad de 270 ndash 305 mosmkg y una conductividad de 37mmcm El control diario implica el examen de su aparienciafiacutesica ausencia de turbidez particulas o sedimento asiacutecomo corroborar la capacidad para generar hemoacutelisiscrenacion o prueba de coombs positiva en eritrocitos

normales Cada lote nuevo se valora mediante el rastreo deun anticuerpo ya sea un anti- D un anti- jk anti- fy oanti- kell diluido se compara su capacidad de deteccioacutencontra un medio salino normal incubando 10min a 37ordmC enLISS debe poder rastrearse un anticuerpo en tanto que enmedio salino no

MATERIAL Y EQUIPO

Material Cantidad10 Tubos de ensayo de 12 x 75

1 Gradilla10 Pipetas pasteur

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1 Bulbo1 Marcador1 Microcentriacutefuga1 Bantildeo Mariacutea

MATERIAL BIOLOGICO

Gloacutebulos rojos lavados al 3 - 5Suero

REACTIVOS

Reactivo de LISSReactivo de Coombs

TECNICA1- Lavar los eritrocitos

Separar el suero del paquete de gloacutebulos rojos

Agregar cierta cantidad de eritrocitos a un tubo deensayo y agregarle solucioacuten salina

Centrifugar y decantar

Repetir este proceso 3 veces

2- Realizar la Prueba de LISS

Enumerar los tubos Poner dos gotas de LISS en cada tubo agregar una gota

de eritrocitos lavados y al 3 - 5 seguacuten el nuacutemero detubo correspondiente

Mezclar y centrifugar un minuto decantar elsobrenadante y con la ayuda de una gasa limpiar elexceso del reactivo

Poner nuevamente 2 gota de LISS resuspender poragitacioacuten agregar 2 gotas de suero problema mezclarincubar 15 minutos a 37ordm C centrifugar 30 seg A 1000

RPM Anotar los resultados

3- A las pruebas negativas realizar Coombs

Lavar 3 veces las ceacutelulas agregar suero de Coombscentrifugar 30 seg

Leer aglutinaciones y anotar resultados

REACTIVOS UTILIZADOS

REACTIVO MARCA FECHA DECADUCIDAD

ASPECTO COLOR LOTE

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SueroAntiglobuina

humana

Lafon 31 01 2009 Transparente Verde 406

LISS Caserorealizado enCMNSIGLOXXI

1 antildeo Transparente Transparente

----------

PACIENTE ASCANIO MENDEZ JOSUE O (+)DONADOR 1 GARCIA CARBAJAL OSCAR O (+)DONADOR 2 GARCIA SUAREZ ORLANDO A (+)

RESULTADOS

INTERPRETACIOacuteN DE LOS RESULTADOS

La hemoacutelisis o la aglutinacioacuten representan un resultado positivo e indican lapresencia de una reaccioacuten antiacutegeno-anticuerpo Los resultados negativos no severa aglutinacioacuten o hemolisis

ESQUEMAS

CONCLUSIONES

Concluyo que la prueba de compatibilidad sanguiacutenea en su modalidad conliss ofrece mucha ventaja al ser al igual que otros reactivos unpotencializador de la reaccioacuten antiacutegeno-anticuerpo Esto permite queel operador o realizador de la prueba tenga mayor confianza y certezaen los resultados que obtenga

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Tubo Resultado

M1 NEGATIVOm1 NEGATIVO

M2 POSITIVO

M2 NEGATIVO

AUTOTES NEGATIVO

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PRACTICA 9INMUNOHEMATOLOGIA

DETERMINACION DE COOMBS DIRECTO

INTRODUCCIONPRUEBA DE COOMBS DIRECTA

El examen de Coombs directo se utiliza para detectar autoanticuerpos contralos propios gloacutebulos rojos (GR) de un individuo Es una prueba que sirve parademostrar el revestimiento de los eritrocitos in vivo (mientras los eritrocitosestaacuten circulando en el individuo) La prueba se realiza agregando directamenteel reactivo de Coombs a los eritrocitos previamente lavados para eliminar otras proteiacutenas no fijadas a el una prueba directa positiva significa que larelacioacuten antiacutegeno-anticuerpo ocurrioacute in vivo es decir que la fijacioacuten del

anticuerpo sobre el antiacutegeno se realizo en el organismo del individuo enestudio

Las indicaciones principales de esta prueba son diagnostico de enfermedadeshemoliacuteticas ictericia o anomaliacuteas en la apariencia de los gloacutebulos rojos bajo elmicroscopio ya que estos anticuerpos algunas veces destruyen los gloacutebulosrojos y causan anemia para investigar reacciones en transfusiones Parainvestigar la induccioacuten de drogas en ceacutelulas rojas sensibilizadas medicamentos(por ejemplo quinidina metildopa procainamida y otros) que pueden llevar a la produccioacuten de estos anticuerpos

OBJETIVO Determinar la presencia de anticuerpos en la superficie de losgloacutebulos rojos del individuo

MATERIAL

bull 10 Tubos de 1275

bull 10 Pipetas Pasteur

bull 1 Gradilla

bull 1 Bulbo

bull Papel Parafilm

bull Microcentriacutefuga

bull Bantildeo Mariacutea a 37degC

MUESTRA BIOLOGICA

Eritrocitos lavados de (3-5) del donador o pacienteREACTIVO

Suero de CoombsSuero anti-globulina humana Lafon Lote 406 Cad 310109 Color verde Aspecto transparente

TECNICA

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Colocar en un tubo de ensaye dos gotas de suero de Coombs mas una gota deglobulos rojos (3-5)Centrifugar a 1000 rpm durante 20 segDesprender el boton suavemente y buscar la presencia de aglutinacionRotular y enumerar 8 tubos de ensayes con las diferentes diluciones

(frac12frac1418)Enumerar 8 tubos mas del 1 al 8Agregar a cada tubo de las diluciones 10 gotas de solucion salina mas 10 gotasde suero de CoombsColocar Al primer tubo de la dilucion 1 gota de globulos rojos (3-5) mezclar completamente y agregar al tubo 1Centrifugar todos los tubos a 1000 rpm durante 20 seg

LECTURA

Aglutina- Prueba de Coombs directa es positiva

No aglutina- Prueba de Coombs directa es negativa

ESQUEMAS y RESULTADOS

CONCLUCION

He concluido que la prueba de Coombs directa es una prueba que se utiliza para medir

la presencia de anticuerpos en la superficie de los gloacutebulos rojos que se encuentran

circulando en el paciente y se realiza para investigar reacciones en transfusiones ademaacutes

sirve para la determinacioacuten de anemia hemoliacutetica autoinmune entre otras afecciones

Practica 10

IDENTIFICACION DE ANTICUERPOS IRREGULARES

Fundamento

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DILUCIONES

frac12 positiva

frac14 positiva

18 positiva

116 negativa

132 negativa

164 negativa

1128 negativa1256 negativa

31

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Los anticuerpos del sistema ABO aparecen una vez que elindividuo entra en contacto con el medio ambiente y en elcual se encuentran microorganismos como algunas bacteriascoliformes que contienen sustancias quiacutemicas en suestructura parecidas a las de este sistema Por anticuerpos

regulares debemos identificar a los que existen en todoslos individuos y que eacutestos tendraacuten durante toda su vida

Los anticuerpos irregulares son los que no estaacuten de esamanera aunque en el caso de los naturales no se conoce aciencia cierta queacute o coacutemo se induce su produccioacuten Losadquiridos se conocen tambieacuten como inmunes y son elresultado de la exposicioacuten a antiacutegenos desconocidos por elindividuo al momento de la transfusioacuten o en las mujerespor el embarazo estos anticuerpos son dirigidos contraantiacutegenos de sistemas diferentes al ABO

Los anticuerpos naturales regulares son preferentementeinmunoglobulinas M las cuales fijan de manera taneficiente el complemento que pueden provocar lisisintravascular y ocasionar insuficiencia renal o incluso lamuerte del paciente Los anticuerpos adquiridos o inmunesson generalmente inmunoglobulinas G las cuales producenhemoacutelisis extravascular en el bazo o en el hiacutegado mediantefagocitosis del complejo eritrocito maacutes anticuerpo

Los aloanticuerpos irregulares (adquiridos) maacutes comunes en

nuestra poblacioacuten son los que involucran a los sistemasMNSs P1 Kidd (Jka Jkb) Duffy (Fya Fyb) Kell Lewis yDiego

OBJETIVO identificacioacuten del anticuerpo irregular a traveacutesde las diferentes teacutecnicas

MATERIAL

bull 10 Tubos de ensaye

bull 10 Pipetas Pasteur

bull

1Gradillabull 1 Bulbo

bull Papel Parafim

MATERIAL BIOLOGICO

bull Gloacutebulos rojos lavados al 3 - 5

bull Suero

bull REACTIVOSReactivos

1 Suero de Coombs2 Albuacutemina bovina

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bull EQUIPO1 Microcentriacutefuga2 Bantildeo Mariacutea oacute Estufa

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3 SOLUCION SALINA4 SOLUCION DE LISS

TEacuteCNICA SOLUCION SALINA

Lavar los eritrocitos con solucioacuten salina (3veces)SALINA RAacutePIDA

Agregar una gota de Eritrocitos LavadosDiluiacuterlo al 3-5 con solucioacuten salina 09Agregar 2 gotas de sueroCentrifugar y observar anotar desprendimientodel botoacuten

SALINA 37deg BANtildeO MARIacuteA1) Incubar tubos a Bantildeo mariacutea a 37degC durante 1

hora (o 20 min)

2) Centirfugar despueacutes de haber pasado eltiempo

3) Desprender el botoacuten de eritrocitos yobservar

AGLUTINACIOacuteNndash No es compatibleNO AGLUTINACIOacuteN - Lavar 3 veces

SALINA COOMBS1) Con solucioacuten salina 09 lavar los

eritrocitos de los tubos q no tuvieronaglutinacioacuten 3 veces

2) Decantar y agregar 2 gotas de reactivode Coombs

AGLUTINACIOacuteN ndash No es compatibleNO AGLUTINACIOacuteN - Lavar 3 veces

TECNICA LISS

1 Poner dos gotas de LISS en cada tubo agregar una gotade eritrocitos lavados y al 3 - 5 seguacuten el nuacutemero detubo correspondiente

2 Mezclar y centrifugar un minuto decantar el

sobrenadante y con la ayuda de una gasa limpiar elexceso del reactivo

3 Poner nuevamente 2 gota de LISS resuspender poragitacioacuten agregar 2 gotas de suero problema mezclarincubar 15 minutos a 37ordm C centrifugar 30 seg A 1000RPM

4 Anotar los resultados

A las pruebas negativas realizar Coombs

1 Lavar 3 veces las ceacutelulas agregar suero de Coombs

centrifugar 30 seg2 Leer aglutinaciones y anotar resultados

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TECNICA ALBUMINA BOVINA 8 Agregar 2 gotas de albuacutemina al 229 Centrifugar 20 segundos10observar aglutinacioacuten o hemolisis o no aglutinacioacuten

11A los tubos con lecturas negativas incubar 20minutos en bantildeo Mariacutea a 37 degC12Centrifugar y observar

bull Aglutinacioacuten o hemoacutelisis reportar incompatible

bull No aglutinacioacuten llevar a Coombs

13Lavar tres veces decantar y quitar el exceso desalina con gasa y agregar 2 gotas de reactivo deCoombs y centrifugar 20 segundos y observar

bull Aglutinacioacuten o hemoacutelisis reportar incompatible

bull No aglutinacioacuten reportar compatible

Resultados ANTICUERPO IRREGULAR Anticuerpo c

InterpretacioacutenEstos anticuerpos son generalmente inmunoglobulinas tipo My ocasionalmente tipo G y debido a esa temperatura dereaccioacuten carecen de importancia cliacutenica salvo que sureaccioacuten ocurra tambieacuten a 37 degC su importancia radica enpacientes que seraacuten intervenido a 22 ordmc como es el caso de

operacioacuten de corazoacuten

Los llamados anticuerpos calientes tienen una temperatura oacuteptima dereaccioacuten a 37 degC a Estos anticuerpos tienen una relevanteimportancia cliacutenica ya que se les asocia con reaccionestransfusionales de intensidad moderada a severa que puedenocasionar la muerte

Esquemas

CONCLUSIONHe concluido que es importante determinar los anticuerposirregulares ya que estos anticuerpos tienen una relevanteimportancia cliacutenica ya que se les asocia con reaccionestransfusionales de intensidad moderada a severa

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Conclusioacuten

Concluyo que es esencial que toda la sangre sea estudiadaantes de la transfusioacuten para Asegurar que todos losgloacutebulos rojos transfundidos son compatibles con losanticuerpos en el plasma del paciente Evitar estimular laproduccioacuten de nuevos anticuerpos contra los gloacutebulos rojosen el receptor especialmente anti-Rh D

PRAacuteCTICA No 6PRUEBA DE COMPATIBILIDAD SANGIacuteNEA

(Teacutecnica salina)

INTRODUCCIOacuteN

Landsteiner constatoacute que cuando un aglutinoacutegeno se pone

en contacto con la aglutinina homoacuteloga se produce unaaglutinacioacuten

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La compatibilidad sanguiacutenea es la posibilidad de mezclade sangre sin que se produzcan trastornos tales como losfenoacutemenos de la lisis o de la aglutinacioacuten

A causa de este fenoacutemeno bioloacutegico en las transfusiones

de sangre no es suficiente con conocer que la sangre deldonante y la del receptor son del mismo grupo o bien quela del donante pertenezca al grupo O (cero) sino que esnecesario conocer si la compatibilidad es perfecta porqueninguacuten otro fenoacutemeno de inmunizacioacuten interfiera Es eneste sentido por lo que son empleadas las pruebascruzadas

Ademaacutes de los 6 antiacutegenos del sistema ABO en loseritrocitos humanos existen numerosos sistemas deaglutinoacutegenos que contienen muchos antiacutegenos individuales

en los eritrocitos (maacutes de 500000 millones posibles defenotipos de grupos sanguiacuteneos conocidos) Para evitaraccidentes transfusionales es indispensable tener encuenta el sistema Rh ademaacutes del ABO

Del sistema de antiacutegenos Rh es el D el maacutes antigeacutenico yel teacutermino Rh positivo indica que el individuo presentaaglutinoacutegeno D El individuo Rh negativo no tiene antiacutegenoD y forma la aglutinina anti-D en contacto con eacuteste

Las reacciones antiacutegeno-anticuerpo pueden observarse in

vitro por

mdash Hemoacutelisis la unioacuten antiacutegeno-anticuerpo se traduce enlisis de los eritrocitos en presenciadel complemento (siempre que el anticoagulante empleado nocapture losiones Ca y Mg necesarios para la activacioacuten delcomplemento) mdash Aglutinacioacuten los anticuerpos que reaccionan en mediosalino se conocen comoanticuerpos completos o aglutinantes (comuacutenmente tipo

IgM)

OBJETIVO Determinacioacuten de los antigenos del sistema ABORh (D) y su compatibilidad entre un paciente Donador y unPaciente Receptor

MATERIAL5 Tubos de ensaye6 Pipetas Pasteur

1Gradilla1 Bulbo

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EQUIPOMicrocentriacutefugaBantildeo Mariacutea oacute Estufa

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Papel Parafilm

MUESTRA Muestra de sangre con Anticoagulante EDTA

REACTIVOSAntisuero RO-Antiglobulina humana (Poliespeciacutefico Anti IgG C-d) Para prueba de CoombsLABORATORIOS LAFON SA de C VFecha de Caducidad 31-Ene-09Lote 406Hecho en MeacutexicoAspecto TransparenteColor Verde

TEacuteCNICA

Lavar los eritrocitos con solucioacuten salina (3 veces)

SALINA RAacutePIDA1 Agregar una gota de Eritrocitos Lavados2 Diluirlo al 3-5 con solucioacuten salina 093 Agregar 2 gotas de suero4 Centrifugar y observar anotar desprendimiento del botoacuten

SALINA 37deg BANtildeO MARIacuteA

1 Incubar tubos a Bantildeo mariacutea a 37degC durante 1hora (o 20 min)2 Centirfugar despueacutes de haber pasado el

tiempo3 Desprender el botoacuten de eritrocitos y

observarAGLUTINACIOacuteNndash No es compatibleNO AGLUTINACIOacuteN - Lavar 3 veces

SALINA COOMBS

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PRUEBA MAYOR

G Rojos del DONADOR+

Suero del RECEPTOR(paciente)

PRUEBA MENOR

G Rojos del RECEPTOR(paciente)

+Suero del DONADOR

AUTOTESTIGO

G Rojos del RECEPTOR(paciente)

+Suero del RECEPTOR

(paciente)

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1 Con solucioacuten salina 09 lavar loseritrocitos de los tubos q no tuvieronaglutinacioacuten 3 veces

2 Decantar y agregar 2 gotas de reactivode Coombs

AGLUTINACIOacuteN ndash No es compatibleNO AGLUTINACIOacuteN - Lavar 3 veces

RESULTADOS

Paciente Madrigal Meacutendez Luis Eduardo (B+)Folio 009164Fecha301007

Donador 1 Torres Avileacutes Joseacute Ramoacuten (O+)Folio 022604Fecha311007

Donador 2 Rodriacuteguez Nuacutentildeez Joseacute Angel (A+) Folio 022605

Fecha311007

SALINA RAacutePIDA

M1 m1 M2 m2 AutotestigoGR de donador 1+ suero del

paciente

GR del paciente+ suero dedonador 1

GR de donador 2+ suero del

paciente

GR del paciente+ suero dedonador 2

GR del paciente+ suero del

paciente

- 4+ 4+ 4+ -

SALINA 37deg BANtildeO MARIacuteA

M1 m1 M2 m2 Autotestigo- 4+ 4+ 4+ -

Compatible Nocompatible

Nocompatible

Nocompatible

Compatible

SALINA COOMBS

Por lo tanto se puede decir que el donador 1 (O+) puededonar suero al paciente (B+) debido a que en el suero nohay anticuerpos de ninguacuten tipo que reaccionen con losantiacutegenos de los eritrocios del Donador 1 Mientras tantoel Donador 2 no puede donar al Paciente ni suero nieritrocitos

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M1 Autotestigo- -

Compatible

Compatible

21

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INTERPRETACIOacuteN

PRUEBA POSITIVA Existe una aglutinacioacuten de lasceacutelulas sanguiacuteneas que indica la presencia delantiacutegeno A o B En el suero de Coombs notamos si esta

la precencia de Antiacutegeno D en los eritrocitos Lahemoacutelisis no se debe interpretar como resultadopositivo ya que puede indicar contaminacioacuten delreactivo

PRUEBA NEGATIVA La no aglutinacioacuten indica unresultado negativo e indica que las ceacutelulas sonnegativas para Antiacutegenos del sisitema ABO y D

CONCLUSIOacuteN

He concluido que en las transfusiones de sangre no essuficiente con conocer que la sangre del donante y la delreceptor son del mismo grupo o bien que la del donantepertenezca al grupo O (cero) sino que es necesarioconocer si la compatibilidad es perfecta porque ninguacutenotro fenoacutemeno de inmunizacioacuten interfiera Es en estesentido por lo que son empleadas las pruebas cruzadas

Praacutectica No 7ldquoPrueba de compatibilidad sanguiacutenea (teacutecnica albumina)rdquo

IntroduccioacutenLa tipificacioacuten de sangre identifica el tipo sanguiacuteneo determinandoantiacutegenos presentes en los eritrocitos detecta aloanticuerpos encontra esos antiacutegenos Asiacute los aloanticuerpos pueden aparecernaturalmente o ser inducidos y pueden ser dirigidos contra del grupoconocido o a los antiacutegenos de superficie de los eritrocitos La prueba

de compatibilidad sanguiacutenea o cross matching esta formada por laprueba mayor y menorLa prueba de cruzamiento mayor para losaloanticuerpos consiste en probar el plasma del receptor contra los

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gloacutebulos rojos del donante Es incompatible cuando se genera unareaccioacuten hemoliacutetica los eritrocitos del donante se destruyen por losaloanticuerpos del plasma del receptor La prueba menor es una pruebapara los aloanticuerpos del plasma del donante en contra los gloacutebulosrojos del receptor Una incompatibilidad menor es una causa menosfrecuente para causar una reaccioacuten en contra una transfusioacuten porque

el volumen de plasma del donante es menor y es diluido marcadamente enel receptor Para llevar a cabo dicho procedimiento se utilizandiversos reactivos como potencializadores que mejoran la unioacuten deeritrocitos con alguacuten tipo de anticuerpo Uno de esospotencializadores es la albuacutemina La albumina bovina polimerizada esun reactivo muy utilizado en el laboratorio de inmunohematologia y encentros de bancos de sangre funciona como un potencializador quefacilita la reaccion de aglutinacioacuten de eritrocitos sensibilizados Alfinal de la prueba se prueban los eritrocitos con el reactivo deCoombs El principio de la prueba de Coombs fue descrito por Moreschien 1908 pero Coombs Mourant y Race en 1946 la introdujeron en elestudio de los grupos sanguiacuteneos y anticuerpos cuando una parte desangre (suero) fue usada para la inoculacioacuten de animales para

inmunizarlos con proteiacutena humana utilizando el anticuerpo obtenido enla deteccioacuten de los llamados anticuerpos incompletos Esta prueba seusa para determinar la presencia de anticuerpos no aglutinantes en elsuero de sujetos sensibilizados a uno o mas antiacutegenos sanguiacuteneos Esuacutetil en el estudio del suero de mujeres con isoinmunizacioacuten materno-fetal y se emplea tambieacuten en otro tipo de pruebas como identificacioacutende anticuerpos autoinmunes deteccioacuten de algunos sistemas sanguiacuteneos ypruebas de compatibilidad sanguiacutenea La prueba indirecta se realizacon eritrocitos normales incubados in Vitro con el suero de estudioDurante este periodo si existe un anticuerpo este se fija sobre surespectivo determinante antigeacutenico Una vez fijados los eritrocitosson igualmente lavados y se agrega el reactivo de Coombs produciendoaglutinacioacuten Una prueba de Coombs indirecta positiva significa que

existen anticuerpos libres en el suero de la persona los cualespuedan ser igualmente auto-anticuerpos o isoanticuerpos

Objetivo Determinacioacuten de los antiacutegenos del sistema ABO Rh (D) y sucompatibilidad entre un paciente Donador y un Paciente Receptor

Material y equipo

5 Tubos de ensaye

6 Pipetas Pasteur

1Gradilla

1 Bulbo

Papel Parafilm

Microcentriacutefuga

Bantildeo Mariacutea oacute Estufa

Material bioloacutegico

Muestras de sangre de extraccioacuten reciente recogida conanticoagulante o sin anticoagulante

ReactivosSuero de CoombsAlbuacutemina bovina deg

Suero anti-globulina humana Lafon Lote 406 Cad 310109 Color verde Aspecto

transparentedegAlbumina de bovino polimerizada Interbiol Lote APO107 Cad 150109 Color incoloroAspecto transparente

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Teacutecnica

1 Montar prueba mayor 1 y 2 prueba menor 1 y 2 y autotestigocon el procedimiento ya anteriormente conocido

2 Agregar 2 gotas de albuacutemina al 223 Centrifugar 20 segundos4 observar aglutinacioacuten o hemolisis o no aglutinacioacuten5 A los tubos con lecturas negativas incubar 20 minutos en bantildeo

Mariacutea a 37 degC6 Centrifugar y observar

bull Aglutinacioacuten o hemoacutelisis reportar incompatible

bull No aglutinacioacuten llevar a Coombs

7 Lavar tres veces decantar y quitar el exceso de salina congasa y agregar 2 gotas de reactivo de Coombs y centrifugar 20segundos y observar

bull Aglutinacioacuten o hemoacutelisis reportar incompatible

bull No aglutinacioacuten reportar compatible

Resultados1 PRUEBA MAYOR 1 2 Gotas de suero del paciente + 1 gota de GR al 3-5 del

donador 12 PRUEBA MENOR 1 2 Gotas de suero del donador 1 + 1 gota de GR al 3-5 del

paciente3 PRUEBA MAYOR 2 2 Gotas de suero del paciente + 1 gota de GR al 3-5 del

donador 24 PRUEBA MENOR 2 2 Gotas de suero del donador 2 + 1 gota de GR al 3-5 del

paciente5 AUTOTESTIGO 2 Gotas de suero del paciente + 1 gota de GR al 3-5 del paciente

M1 m1 M2 m2 AutotestigoCon albuacutemina - - - - -Despueacutes de incubacioacuten a 37 degC - - - - -Despueacutes de Coombs - - - - -Despueacutes de validacioacuten con gloacutebulos

positivos+ + + + +

InterpretacioacutenPrueba positiva Alutinacioacuten o hemolisis Indica no compatibilidadPrueba negativaNo aglutinacioacuten Indica compatibilidad

Esquemas

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ConclusioacutenConcluyo que la prueba de compatibilidad sanguiacutenea en su modalidad conalbuacutemina bovina ofrece mucha ventaja al ser al igual que otrosreactivos un potencializador de la reaccioacuten antiacutegeno-anticuerpo Estopermite que el operador o realizador de la prueba tenga mayorconfianza y certeza en los resultados que obtenga

PRACTICA No 8PRUEBA DE COMPATIBILIDAD SANGUINEA PRUEBA DE LISS

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FUNDAMENTO

LISS es utilizado para reducir la fuerza ioacutenica del medio

de reaccioacuten en los procedimientos de deteccioacuten eidentificacioacuten de anticuerpos y en las pruebas decompatibilidad La presencia de este reactivo refuerza lainteraccioacuten antiacutegeno - anticuerpo durante la incubacioacuten

GENERALIDADESEl uso de solucioacuten salina de baja fuerza ioacutenica fuedescrito inicialmente en 1964 por Hughes-Jones y col y

Elliot y col pero en ese tiempo su uso era limitado yaque la concentracioacuten molar obtenida provocaba la hemoacutelisisde los eritrocitos suspendidos

En 1974 Low y Messeter describieron el uso rutinario de lasolucioacuten Liss de 003 M que lograba reducir el tiempo deincubacioacuten y no presentaba tendencia a la hemoacutelisis al sersuspendidos en salina a baja fuerza ioacutenica restableciendola presioacuten osmoacutetica de la solucioacuten mediante la adicioacuten deglicinaLas soluciones de baja fuerza ioacutenica son actualmente lasmaacutes utilizadas en inmunohematologiacutea provocando un aumentoen la velocidad de asociacioacuten entre antiacutegenos y anticuerpospermitiendo asiacute acortar el tiempo de incubacioacuten de 60minutos a 10-15 minutos sin sacrificar la sensibilidad delas mismas y sin costos elevadosSe ha observado que lasreacciones antiacutegeno-anticuerpo se ven potenciadas alreducir la fuerza ioacutenica del medio de reaccioacuten

La fuerza ioacutenica es uno de los factores maacutes importantes quedeterminan la tasa y la cantidad de captacioacuten deanticuerpos por parte de los eritrocitos El uso de mediosde reaccioacuten de baja fuerza ioacutenica permite disminuir eltiempo de incubacioacuten y potenciar las reacciones de losanticuerpos sin incrementar las reacciones inespeciacuteficas

Los iones Na+ y Cl- presentes en la solucioacuten salinafisioloacutegica se agrupan alrededor de las moleacuteculas deantiacutegeno y anticuerpo neutralizando sus cargas opuestas locual dificulta la unioacuten entre ellos Este efecto se reduceutilizando soluciones de baja fuerza ioacutenica y disminuyendode esta manera la incubacioacuten de las pruebas

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En esta etapa de sensibilizacioacuten las posibilidades deasociacioacuten pueden incrementarse mediante agitacioacutencentrifugacioacuten yo variacioacuten de la concentracioacuten delanticuerpo

Despueacutes de que el anticuerpo se ha fijado al antiacutegeno loseritrocitos sensibilizados deben unirse para dar lugar a laaglutinacioacuten visible esta red tambieacuten solidifica yestabiliza la reaccioacuten

En esta etapa la reaccioacuten depende de factores como lascaracteriacutesticas del anticuerpo localizacioacuten en la membranay nuacutemero de sitios antigeacutenicos fuerzas que mantienen ladistancia entre los eritrocitos

Las caracteriacutesticas del anticuerpo que deben considerarse

son el tamantildeo del anticuerpo involucrado y el nuacutemero desitios de combinacioacuten con el antiacutegeno Los anticuerpos IgMpueden establecer puentes entre los eritrocitos yaglutinarlos espontaacuteneamente en solucioacuten salina mientrasque los IgG no ya que las IgM pentameacutericas poseen 10sitios de combinacioacuten con el antiacutegeno y las IgG diacutemerossoacutelo dos sitios

Los eritrocitos tienen una carga neta negativa en susuperficie su interaccioacuten con los iones del medio alteraesta carga y producen una carga neta criacutetica denominada

potencial zeta y la reduccioacuten de dicha carga permite quelos eritrocitos se aproximen lo suficiente para que seanaglutinados por medio de los IgG que los sensibilizaron

Las soluciones de baja fuerza ionica empleadas en banco desangre tienen un pH entre 65 ndash 70 se recomienda unaosmolalidad de 270 ndash 305 mosmkg y una conductividad de 37mmcm El control diario implica el examen de su aparienciafiacutesica ausencia de turbidez particulas o sedimento asiacutecomo corroborar la capacidad para generar hemoacutelisiscrenacion o prueba de coombs positiva en eritrocitos

normales Cada lote nuevo se valora mediante el rastreo deun anticuerpo ya sea un anti- D un anti- jk anti- fy oanti- kell diluido se compara su capacidad de deteccioacutencontra un medio salino normal incubando 10min a 37ordmC enLISS debe poder rastrearse un anticuerpo en tanto que enmedio salino no

MATERIAL Y EQUIPO

Material Cantidad10 Tubos de ensayo de 12 x 75

1 Gradilla10 Pipetas pasteur

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1 Bulbo1 Marcador1 Microcentriacutefuga1 Bantildeo Mariacutea

MATERIAL BIOLOGICO

Gloacutebulos rojos lavados al 3 - 5Suero

REACTIVOS

Reactivo de LISSReactivo de Coombs

TECNICA1- Lavar los eritrocitos

Separar el suero del paquete de gloacutebulos rojos

Agregar cierta cantidad de eritrocitos a un tubo deensayo y agregarle solucioacuten salina

Centrifugar y decantar

Repetir este proceso 3 veces

2- Realizar la Prueba de LISS

Enumerar los tubos Poner dos gotas de LISS en cada tubo agregar una gota

de eritrocitos lavados y al 3 - 5 seguacuten el nuacutemero detubo correspondiente

Mezclar y centrifugar un minuto decantar elsobrenadante y con la ayuda de una gasa limpiar elexceso del reactivo

Poner nuevamente 2 gota de LISS resuspender poragitacioacuten agregar 2 gotas de suero problema mezclarincubar 15 minutos a 37ordm C centrifugar 30 seg A 1000

RPM Anotar los resultados

3- A las pruebas negativas realizar Coombs

Lavar 3 veces las ceacutelulas agregar suero de Coombscentrifugar 30 seg

Leer aglutinaciones y anotar resultados

REACTIVOS UTILIZADOS

REACTIVO MARCA FECHA DECADUCIDAD

ASPECTO COLOR LOTE

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SueroAntiglobuina

humana

Lafon 31 01 2009 Transparente Verde 406

LISS Caserorealizado enCMNSIGLOXXI

1 antildeo Transparente Transparente

----------

PACIENTE ASCANIO MENDEZ JOSUE O (+)DONADOR 1 GARCIA CARBAJAL OSCAR O (+)DONADOR 2 GARCIA SUAREZ ORLANDO A (+)

RESULTADOS

INTERPRETACIOacuteN DE LOS RESULTADOS

La hemoacutelisis o la aglutinacioacuten representan un resultado positivo e indican lapresencia de una reaccioacuten antiacutegeno-anticuerpo Los resultados negativos no severa aglutinacioacuten o hemolisis

ESQUEMAS

CONCLUSIONES

Concluyo que la prueba de compatibilidad sanguiacutenea en su modalidad conliss ofrece mucha ventaja al ser al igual que otros reactivos unpotencializador de la reaccioacuten antiacutegeno-anticuerpo Esto permite queel operador o realizador de la prueba tenga mayor confianza y certezaen los resultados que obtenga

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Tubo Resultado

M1 NEGATIVOm1 NEGATIVO

M2 POSITIVO

M2 NEGATIVO

AUTOTES NEGATIVO

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PRACTICA 9INMUNOHEMATOLOGIA

DETERMINACION DE COOMBS DIRECTO

INTRODUCCIONPRUEBA DE COOMBS DIRECTA

El examen de Coombs directo se utiliza para detectar autoanticuerpos contralos propios gloacutebulos rojos (GR) de un individuo Es una prueba que sirve parademostrar el revestimiento de los eritrocitos in vivo (mientras los eritrocitosestaacuten circulando en el individuo) La prueba se realiza agregando directamenteel reactivo de Coombs a los eritrocitos previamente lavados para eliminar otras proteiacutenas no fijadas a el una prueba directa positiva significa que larelacioacuten antiacutegeno-anticuerpo ocurrioacute in vivo es decir que la fijacioacuten del

anticuerpo sobre el antiacutegeno se realizo en el organismo del individuo enestudio

Las indicaciones principales de esta prueba son diagnostico de enfermedadeshemoliacuteticas ictericia o anomaliacuteas en la apariencia de los gloacutebulos rojos bajo elmicroscopio ya que estos anticuerpos algunas veces destruyen los gloacutebulosrojos y causan anemia para investigar reacciones en transfusiones Parainvestigar la induccioacuten de drogas en ceacutelulas rojas sensibilizadas medicamentos(por ejemplo quinidina metildopa procainamida y otros) que pueden llevar a la produccioacuten de estos anticuerpos

OBJETIVO Determinar la presencia de anticuerpos en la superficie de losgloacutebulos rojos del individuo

MATERIAL

bull 10 Tubos de 1275

bull 10 Pipetas Pasteur

bull 1 Gradilla

bull 1 Bulbo

bull Papel Parafilm

bull Microcentriacutefuga

bull Bantildeo Mariacutea a 37degC

MUESTRA BIOLOGICA

Eritrocitos lavados de (3-5) del donador o pacienteREACTIVO

Suero de CoombsSuero anti-globulina humana Lafon Lote 406 Cad 310109 Color verde Aspecto transparente

TECNICA

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Colocar en un tubo de ensaye dos gotas de suero de Coombs mas una gota deglobulos rojos (3-5)Centrifugar a 1000 rpm durante 20 segDesprender el boton suavemente y buscar la presencia de aglutinacionRotular y enumerar 8 tubos de ensayes con las diferentes diluciones

(frac12frac1418)Enumerar 8 tubos mas del 1 al 8Agregar a cada tubo de las diluciones 10 gotas de solucion salina mas 10 gotasde suero de CoombsColocar Al primer tubo de la dilucion 1 gota de globulos rojos (3-5) mezclar completamente y agregar al tubo 1Centrifugar todos los tubos a 1000 rpm durante 20 seg

LECTURA

Aglutina- Prueba de Coombs directa es positiva

No aglutina- Prueba de Coombs directa es negativa

ESQUEMAS y RESULTADOS

CONCLUCION

He concluido que la prueba de Coombs directa es una prueba que se utiliza para medir

la presencia de anticuerpos en la superficie de los gloacutebulos rojos que se encuentran

circulando en el paciente y se realiza para investigar reacciones en transfusiones ademaacutes

sirve para la determinacioacuten de anemia hemoliacutetica autoinmune entre otras afecciones

Practica 10

IDENTIFICACION DE ANTICUERPOS IRREGULARES

Fundamento

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DILUCIONES

frac12 positiva

frac14 positiva

18 positiva

116 negativa

132 negativa

164 negativa

1128 negativa1256 negativa

31

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Los anticuerpos del sistema ABO aparecen una vez que elindividuo entra en contacto con el medio ambiente y en elcual se encuentran microorganismos como algunas bacteriascoliformes que contienen sustancias quiacutemicas en suestructura parecidas a las de este sistema Por anticuerpos

regulares debemos identificar a los que existen en todoslos individuos y que eacutestos tendraacuten durante toda su vida

Los anticuerpos irregulares son los que no estaacuten de esamanera aunque en el caso de los naturales no se conoce aciencia cierta queacute o coacutemo se induce su produccioacuten Losadquiridos se conocen tambieacuten como inmunes y son elresultado de la exposicioacuten a antiacutegenos desconocidos por elindividuo al momento de la transfusioacuten o en las mujerespor el embarazo estos anticuerpos son dirigidos contraantiacutegenos de sistemas diferentes al ABO

Los anticuerpos naturales regulares son preferentementeinmunoglobulinas M las cuales fijan de manera taneficiente el complemento que pueden provocar lisisintravascular y ocasionar insuficiencia renal o incluso lamuerte del paciente Los anticuerpos adquiridos o inmunesson generalmente inmunoglobulinas G las cuales producenhemoacutelisis extravascular en el bazo o en el hiacutegado mediantefagocitosis del complejo eritrocito maacutes anticuerpo

Los aloanticuerpos irregulares (adquiridos) maacutes comunes en

nuestra poblacioacuten son los que involucran a los sistemasMNSs P1 Kidd (Jka Jkb) Duffy (Fya Fyb) Kell Lewis yDiego

OBJETIVO identificacioacuten del anticuerpo irregular a traveacutesde las diferentes teacutecnicas

MATERIAL

bull 10 Tubos de ensaye

bull 10 Pipetas Pasteur

bull

1Gradillabull 1 Bulbo

bull Papel Parafim

MATERIAL BIOLOGICO

bull Gloacutebulos rojos lavados al 3 - 5

bull Suero

bull REACTIVOSReactivos

1 Suero de Coombs2 Albuacutemina bovina

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bull EQUIPO1 Microcentriacutefuga2 Bantildeo Mariacutea oacute Estufa

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3 SOLUCION SALINA4 SOLUCION DE LISS

TEacuteCNICA SOLUCION SALINA

Lavar los eritrocitos con solucioacuten salina (3veces)SALINA RAacutePIDA

Agregar una gota de Eritrocitos LavadosDiluiacuterlo al 3-5 con solucioacuten salina 09Agregar 2 gotas de sueroCentrifugar y observar anotar desprendimientodel botoacuten

SALINA 37deg BANtildeO MARIacuteA1) Incubar tubos a Bantildeo mariacutea a 37degC durante 1

hora (o 20 min)

2) Centirfugar despueacutes de haber pasado eltiempo

3) Desprender el botoacuten de eritrocitos yobservar

AGLUTINACIOacuteNndash No es compatibleNO AGLUTINACIOacuteN - Lavar 3 veces

SALINA COOMBS1) Con solucioacuten salina 09 lavar los

eritrocitos de los tubos q no tuvieronaglutinacioacuten 3 veces

2) Decantar y agregar 2 gotas de reactivode Coombs

AGLUTINACIOacuteN ndash No es compatibleNO AGLUTINACIOacuteN - Lavar 3 veces

TECNICA LISS

1 Poner dos gotas de LISS en cada tubo agregar una gotade eritrocitos lavados y al 3 - 5 seguacuten el nuacutemero detubo correspondiente

2 Mezclar y centrifugar un minuto decantar el

sobrenadante y con la ayuda de una gasa limpiar elexceso del reactivo

3 Poner nuevamente 2 gota de LISS resuspender poragitacioacuten agregar 2 gotas de suero problema mezclarincubar 15 minutos a 37ordm C centrifugar 30 seg A 1000RPM

4 Anotar los resultados

A las pruebas negativas realizar Coombs

1 Lavar 3 veces las ceacutelulas agregar suero de Coombs

centrifugar 30 seg2 Leer aglutinaciones y anotar resultados

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TECNICA ALBUMINA BOVINA 8 Agregar 2 gotas de albuacutemina al 229 Centrifugar 20 segundos10observar aglutinacioacuten o hemolisis o no aglutinacioacuten

11A los tubos con lecturas negativas incubar 20minutos en bantildeo Mariacutea a 37 degC12Centrifugar y observar

bull Aglutinacioacuten o hemoacutelisis reportar incompatible

bull No aglutinacioacuten llevar a Coombs

13Lavar tres veces decantar y quitar el exceso desalina con gasa y agregar 2 gotas de reactivo deCoombs y centrifugar 20 segundos y observar

bull Aglutinacioacuten o hemoacutelisis reportar incompatible

bull No aglutinacioacuten reportar compatible

Resultados ANTICUERPO IRREGULAR Anticuerpo c

InterpretacioacutenEstos anticuerpos son generalmente inmunoglobulinas tipo My ocasionalmente tipo G y debido a esa temperatura dereaccioacuten carecen de importancia cliacutenica salvo que sureaccioacuten ocurra tambieacuten a 37 degC su importancia radica enpacientes que seraacuten intervenido a 22 ordmc como es el caso de

operacioacuten de corazoacuten

Los llamados anticuerpos calientes tienen una temperatura oacuteptima dereaccioacuten a 37 degC a Estos anticuerpos tienen una relevanteimportancia cliacutenica ya que se les asocia con reaccionestransfusionales de intensidad moderada a severa que puedenocasionar la muerte

Esquemas

CONCLUSIONHe concluido que es importante determinar los anticuerposirregulares ya que estos anticuerpos tienen una relevanteimportancia cliacutenica ya que se les asocia con reaccionestransfusionales de intensidad moderada a severa

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La compatibilidad sanguiacutenea es la posibilidad de mezclade sangre sin que se produzcan trastornos tales como losfenoacutemenos de la lisis o de la aglutinacioacuten

A causa de este fenoacutemeno bioloacutegico en las transfusiones

de sangre no es suficiente con conocer que la sangre deldonante y la del receptor son del mismo grupo o bien quela del donante pertenezca al grupo O (cero) sino que esnecesario conocer si la compatibilidad es perfecta porqueninguacuten otro fenoacutemeno de inmunizacioacuten interfiera Es eneste sentido por lo que son empleadas las pruebascruzadas

Ademaacutes de los 6 antiacutegenos del sistema ABO en loseritrocitos humanos existen numerosos sistemas deaglutinoacutegenos que contienen muchos antiacutegenos individuales

en los eritrocitos (maacutes de 500000 millones posibles defenotipos de grupos sanguiacuteneos conocidos) Para evitaraccidentes transfusionales es indispensable tener encuenta el sistema Rh ademaacutes del ABO

Del sistema de antiacutegenos Rh es el D el maacutes antigeacutenico yel teacutermino Rh positivo indica que el individuo presentaaglutinoacutegeno D El individuo Rh negativo no tiene antiacutegenoD y forma la aglutinina anti-D en contacto con eacuteste

Las reacciones antiacutegeno-anticuerpo pueden observarse in

vitro por

mdash Hemoacutelisis la unioacuten antiacutegeno-anticuerpo se traduce enlisis de los eritrocitos en presenciadel complemento (siempre que el anticoagulante empleado nocapture losiones Ca y Mg necesarios para la activacioacuten delcomplemento) mdash Aglutinacioacuten los anticuerpos que reaccionan en mediosalino se conocen comoanticuerpos completos o aglutinantes (comuacutenmente tipo

IgM)

OBJETIVO Determinacioacuten de los antigenos del sistema ABORh (D) y su compatibilidad entre un paciente Donador y unPaciente Receptor

MATERIAL5 Tubos de ensaye6 Pipetas Pasteur

1Gradilla1 Bulbo

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EQUIPOMicrocentriacutefugaBantildeo Mariacutea oacute Estufa

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Papel Parafilm

MUESTRA Muestra de sangre con Anticoagulante EDTA

REACTIVOSAntisuero RO-Antiglobulina humana (Poliespeciacutefico Anti IgG C-d) Para prueba de CoombsLABORATORIOS LAFON SA de C VFecha de Caducidad 31-Ene-09Lote 406Hecho en MeacutexicoAspecto TransparenteColor Verde

TEacuteCNICA

Lavar los eritrocitos con solucioacuten salina (3 veces)

SALINA RAacutePIDA1 Agregar una gota de Eritrocitos Lavados2 Diluirlo al 3-5 con solucioacuten salina 093 Agregar 2 gotas de suero4 Centrifugar y observar anotar desprendimiento del botoacuten

SALINA 37deg BANtildeO MARIacuteA

1 Incubar tubos a Bantildeo mariacutea a 37degC durante 1hora (o 20 min)2 Centirfugar despueacutes de haber pasado el

tiempo3 Desprender el botoacuten de eritrocitos y

observarAGLUTINACIOacuteNndash No es compatibleNO AGLUTINACIOacuteN - Lavar 3 veces

SALINA COOMBS

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PRUEBA MAYOR

G Rojos del DONADOR+

Suero del RECEPTOR(paciente)

PRUEBA MENOR

G Rojos del RECEPTOR(paciente)

+Suero del DONADOR

AUTOTESTIGO

G Rojos del RECEPTOR(paciente)

+Suero del RECEPTOR

(paciente)

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1 Con solucioacuten salina 09 lavar loseritrocitos de los tubos q no tuvieronaglutinacioacuten 3 veces

2 Decantar y agregar 2 gotas de reactivode Coombs

AGLUTINACIOacuteN ndash No es compatibleNO AGLUTINACIOacuteN - Lavar 3 veces

RESULTADOS

Paciente Madrigal Meacutendez Luis Eduardo (B+)Folio 009164Fecha301007

Donador 1 Torres Avileacutes Joseacute Ramoacuten (O+)Folio 022604Fecha311007

Donador 2 Rodriacuteguez Nuacutentildeez Joseacute Angel (A+) Folio 022605

Fecha311007

SALINA RAacutePIDA

M1 m1 M2 m2 AutotestigoGR de donador 1+ suero del

paciente

GR del paciente+ suero dedonador 1

GR de donador 2+ suero del

paciente

GR del paciente+ suero dedonador 2

GR del paciente+ suero del

paciente

- 4+ 4+ 4+ -

SALINA 37deg BANtildeO MARIacuteA

M1 m1 M2 m2 Autotestigo- 4+ 4+ 4+ -

Compatible Nocompatible

Nocompatible

Nocompatible

Compatible

SALINA COOMBS

Por lo tanto se puede decir que el donador 1 (O+) puededonar suero al paciente (B+) debido a que en el suero nohay anticuerpos de ninguacuten tipo que reaccionen con losantiacutegenos de los eritrocios del Donador 1 Mientras tantoel Donador 2 no puede donar al Paciente ni suero nieritrocitos

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M1 Autotestigo- -

Compatible

Compatible

21

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INTERPRETACIOacuteN

PRUEBA POSITIVA Existe una aglutinacioacuten de lasceacutelulas sanguiacuteneas que indica la presencia delantiacutegeno A o B En el suero de Coombs notamos si esta

la precencia de Antiacutegeno D en los eritrocitos Lahemoacutelisis no se debe interpretar como resultadopositivo ya que puede indicar contaminacioacuten delreactivo

PRUEBA NEGATIVA La no aglutinacioacuten indica unresultado negativo e indica que las ceacutelulas sonnegativas para Antiacutegenos del sisitema ABO y D

CONCLUSIOacuteN

He concluido que en las transfusiones de sangre no essuficiente con conocer que la sangre del donante y la delreceptor son del mismo grupo o bien que la del donantepertenezca al grupo O (cero) sino que es necesarioconocer si la compatibilidad es perfecta porque ninguacutenotro fenoacutemeno de inmunizacioacuten interfiera Es en estesentido por lo que son empleadas las pruebas cruzadas

Praacutectica No 7ldquoPrueba de compatibilidad sanguiacutenea (teacutecnica albumina)rdquo

IntroduccioacutenLa tipificacioacuten de sangre identifica el tipo sanguiacuteneo determinandoantiacutegenos presentes en los eritrocitos detecta aloanticuerpos encontra esos antiacutegenos Asiacute los aloanticuerpos pueden aparecernaturalmente o ser inducidos y pueden ser dirigidos contra del grupoconocido o a los antiacutegenos de superficie de los eritrocitos La prueba

de compatibilidad sanguiacutenea o cross matching esta formada por laprueba mayor y menorLa prueba de cruzamiento mayor para losaloanticuerpos consiste en probar el plasma del receptor contra los

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gloacutebulos rojos del donante Es incompatible cuando se genera unareaccioacuten hemoliacutetica los eritrocitos del donante se destruyen por losaloanticuerpos del plasma del receptor La prueba menor es una pruebapara los aloanticuerpos del plasma del donante en contra los gloacutebulosrojos del receptor Una incompatibilidad menor es una causa menosfrecuente para causar una reaccioacuten en contra una transfusioacuten porque

el volumen de plasma del donante es menor y es diluido marcadamente enel receptor Para llevar a cabo dicho procedimiento se utilizandiversos reactivos como potencializadores que mejoran la unioacuten deeritrocitos con alguacuten tipo de anticuerpo Uno de esospotencializadores es la albuacutemina La albumina bovina polimerizada esun reactivo muy utilizado en el laboratorio de inmunohematologia y encentros de bancos de sangre funciona como un potencializador quefacilita la reaccion de aglutinacioacuten de eritrocitos sensibilizados Alfinal de la prueba se prueban los eritrocitos con el reactivo deCoombs El principio de la prueba de Coombs fue descrito por Moreschien 1908 pero Coombs Mourant y Race en 1946 la introdujeron en elestudio de los grupos sanguiacuteneos y anticuerpos cuando una parte desangre (suero) fue usada para la inoculacioacuten de animales para

inmunizarlos con proteiacutena humana utilizando el anticuerpo obtenido enla deteccioacuten de los llamados anticuerpos incompletos Esta prueba seusa para determinar la presencia de anticuerpos no aglutinantes en elsuero de sujetos sensibilizados a uno o mas antiacutegenos sanguiacuteneos Esuacutetil en el estudio del suero de mujeres con isoinmunizacioacuten materno-fetal y se emplea tambieacuten en otro tipo de pruebas como identificacioacutende anticuerpos autoinmunes deteccioacuten de algunos sistemas sanguiacuteneos ypruebas de compatibilidad sanguiacutenea La prueba indirecta se realizacon eritrocitos normales incubados in Vitro con el suero de estudioDurante este periodo si existe un anticuerpo este se fija sobre surespectivo determinante antigeacutenico Una vez fijados los eritrocitosson igualmente lavados y se agrega el reactivo de Coombs produciendoaglutinacioacuten Una prueba de Coombs indirecta positiva significa que

existen anticuerpos libres en el suero de la persona los cualespuedan ser igualmente auto-anticuerpos o isoanticuerpos

Objetivo Determinacioacuten de los antiacutegenos del sistema ABO Rh (D) y sucompatibilidad entre un paciente Donador y un Paciente Receptor

Material y equipo

5 Tubos de ensaye

6 Pipetas Pasteur

1Gradilla

1 Bulbo

Papel Parafilm

Microcentriacutefuga

Bantildeo Mariacutea oacute Estufa

Material bioloacutegico

Muestras de sangre de extraccioacuten reciente recogida conanticoagulante o sin anticoagulante

ReactivosSuero de CoombsAlbuacutemina bovina deg

Suero anti-globulina humana Lafon Lote 406 Cad 310109 Color verde Aspecto

transparentedegAlbumina de bovino polimerizada Interbiol Lote APO107 Cad 150109 Color incoloroAspecto transparente

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Teacutecnica

1 Montar prueba mayor 1 y 2 prueba menor 1 y 2 y autotestigocon el procedimiento ya anteriormente conocido

2 Agregar 2 gotas de albuacutemina al 223 Centrifugar 20 segundos4 observar aglutinacioacuten o hemolisis o no aglutinacioacuten5 A los tubos con lecturas negativas incubar 20 minutos en bantildeo

Mariacutea a 37 degC6 Centrifugar y observar

bull Aglutinacioacuten o hemoacutelisis reportar incompatible

bull No aglutinacioacuten llevar a Coombs

7 Lavar tres veces decantar y quitar el exceso de salina congasa y agregar 2 gotas de reactivo de Coombs y centrifugar 20segundos y observar

bull Aglutinacioacuten o hemoacutelisis reportar incompatible

bull No aglutinacioacuten reportar compatible

Resultados1 PRUEBA MAYOR 1 2 Gotas de suero del paciente + 1 gota de GR al 3-5 del

donador 12 PRUEBA MENOR 1 2 Gotas de suero del donador 1 + 1 gota de GR al 3-5 del

paciente3 PRUEBA MAYOR 2 2 Gotas de suero del paciente + 1 gota de GR al 3-5 del

donador 24 PRUEBA MENOR 2 2 Gotas de suero del donador 2 + 1 gota de GR al 3-5 del

paciente5 AUTOTESTIGO 2 Gotas de suero del paciente + 1 gota de GR al 3-5 del paciente

M1 m1 M2 m2 AutotestigoCon albuacutemina - - - - -Despueacutes de incubacioacuten a 37 degC - - - - -Despueacutes de Coombs - - - - -Despueacutes de validacioacuten con gloacutebulos

positivos+ + + + +

InterpretacioacutenPrueba positiva Alutinacioacuten o hemolisis Indica no compatibilidadPrueba negativaNo aglutinacioacuten Indica compatibilidad

Esquemas

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ConclusioacutenConcluyo que la prueba de compatibilidad sanguiacutenea en su modalidad conalbuacutemina bovina ofrece mucha ventaja al ser al igual que otrosreactivos un potencializador de la reaccioacuten antiacutegeno-anticuerpo Estopermite que el operador o realizador de la prueba tenga mayorconfianza y certeza en los resultados que obtenga

PRACTICA No 8PRUEBA DE COMPATIBILIDAD SANGUINEA PRUEBA DE LISS

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FUNDAMENTO

LISS es utilizado para reducir la fuerza ioacutenica del medio

de reaccioacuten en los procedimientos de deteccioacuten eidentificacioacuten de anticuerpos y en las pruebas decompatibilidad La presencia de este reactivo refuerza lainteraccioacuten antiacutegeno - anticuerpo durante la incubacioacuten

GENERALIDADESEl uso de solucioacuten salina de baja fuerza ioacutenica fuedescrito inicialmente en 1964 por Hughes-Jones y col y

Elliot y col pero en ese tiempo su uso era limitado yaque la concentracioacuten molar obtenida provocaba la hemoacutelisisde los eritrocitos suspendidos

En 1974 Low y Messeter describieron el uso rutinario de lasolucioacuten Liss de 003 M que lograba reducir el tiempo deincubacioacuten y no presentaba tendencia a la hemoacutelisis al sersuspendidos en salina a baja fuerza ioacutenica restableciendola presioacuten osmoacutetica de la solucioacuten mediante la adicioacuten deglicinaLas soluciones de baja fuerza ioacutenica son actualmente lasmaacutes utilizadas en inmunohematologiacutea provocando un aumentoen la velocidad de asociacioacuten entre antiacutegenos y anticuerpospermitiendo asiacute acortar el tiempo de incubacioacuten de 60minutos a 10-15 minutos sin sacrificar la sensibilidad delas mismas y sin costos elevadosSe ha observado que lasreacciones antiacutegeno-anticuerpo se ven potenciadas alreducir la fuerza ioacutenica del medio de reaccioacuten

La fuerza ioacutenica es uno de los factores maacutes importantes quedeterminan la tasa y la cantidad de captacioacuten deanticuerpos por parte de los eritrocitos El uso de mediosde reaccioacuten de baja fuerza ioacutenica permite disminuir eltiempo de incubacioacuten y potenciar las reacciones de losanticuerpos sin incrementar las reacciones inespeciacuteficas

Los iones Na+ y Cl- presentes en la solucioacuten salinafisioloacutegica se agrupan alrededor de las moleacuteculas deantiacutegeno y anticuerpo neutralizando sus cargas opuestas locual dificulta la unioacuten entre ellos Este efecto se reduceutilizando soluciones de baja fuerza ioacutenica y disminuyendode esta manera la incubacioacuten de las pruebas

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En esta etapa de sensibilizacioacuten las posibilidades deasociacioacuten pueden incrementarse mediante agitacioacutencentrifugacioacuten yo variacioacuten de la concentracioacuten delanticuerpo

Despueacutes de que el anticuerpo se ha fijado al antiacutegeno loseritrocitos sensibilizados deben unirse para dar lugar a laaglutinacioacuten visible esta red tambieacuten solidifica yestabiliza la reaccioacuten

En esta etapa la reaccioacuten depende de factores como lascaracteriacutesticas del anticuerpo localizacioacuten en la membranay nuacutemero de sitios antigeacutenicos fuerzas que mantienen ladistancia entre los eritrocitos

Las caracteriacutesticas del anticuerpo que deben considerarse

son el tamantildeo del anticuerpo involucrado y el nuacutemero desitios de combinacioacuten con el antiacutegeno Los anticuerpos IgMpueden establecer puentes entre los eritrocitos yaglutinarlos espontaacuteneamente en solucioacuten salina mientrasque los IgG no ya que las IgM pentameacutericas poseen 10sitios de combinacioacuten con el antiacutegeno y las IgG diacutemerossoacutelo dos sitios

Los eritrocitos tienen una carga neta negativa en susuperficie su interaccioacuten con los iones del medio alteraesta carga y producen una carga neta criacutetica denominada

potencial zeta y la reduccioacuten de dicha carga permite quelos eritrocitos se aproximen lo suficiente para que seanaglutinados por medio de los IgG que los sensibilizaron

Las soluciones de baja fuerza ionica empleadas en banco desangre tienen un pH entre 65 ndash 70 se recomienda unaosmolalidad de 270 ndash 305 mosmkg y una conductividad de 37mmcm El control diario implica el examen de su aparienciafiacutesica ausencia de turbidez particulas o sedimento asiacutecomo corroborar la capacidad para generar hemoacutelisiscrenacion o prueba de coombs positiva en eritrocitos

normales Cada lote nuevo se valora mediante el rastreo deun anticuerpo ya sea un anti- D un anti- jk anti- fy oanti- kell diluido se compara su capacidad de deteccioacutencontra un medio salino normal incubando 10min a 37ordmC enLISS debe poder rastrearse un anticuerpo en tanto que enmedio salino no

MATERIAL Y EQUIPO

Material Cantidad10 Tubos de ensayo de 12 x 75

1 Gradilla10 Pipetas pasteur

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1 Bulbo1 Marcador1 Microcentriacutefuga1 Bantildeo Mariacutea

MATERIAL BIOLOGICO

Gloacutebulos rojos lavados al 3 - 5Suero

REACTIVOS

Reactivo de LISSReactivo de Coombs

TECNICA1- Lavar los eritrocitos

Separar el suero del paquete de gloacutebulos rojos

Agregar cierta cantidad de eritrocitos a un tubo deensayo y agregarle solucioacuten salina

Centrifugar y decantar

Repetir este proceso 3 veces

2- Realizar la Prueba de LISS

Enumerar los tubos Poner dos gotas de LISS en cada tubo agregar una gota

de eritrocitos lavados y al 3 - 5 seguacuten el nuacutemero detubo correspondiente

Mezclar y centrifugar un minuto decantar elsobrenadante y con la ayuda de una gasa limpiar elexceso del reactivo

Poner nuevamente 2 gota de LISS resuspender poragitacioacuten agregar 2 gotas de suero problema mezclarincubar 15 minutos a 37ordm C centrifugar 30 seg A 1000

RPM Anotar los resultados

3- A las pruebas negativas realizar Coombs

Lavar 3 veces las ceacutelulas agregar suero de Coombscentrifugar 30 seg

Leer aglutinaciones y anotar resultados

REACTIVOS UTILIZADOS

REACTIVO MARCA FECHA DECADUCIDAD

ASPECTO COLOR LOTE

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SueroAntiglobuina

humana

Lafon 31 01 2009 Transparente Verde 406

LISS Caserorealizado enCMNSIGLOXXI

1 antildeo Transparente Transparente

----------

PACIENTE ASCANIO MENDEZ JOSUE O (+)DONADOR 1 GARCIA CARBAJAL OSCAR O (+)DONADOR 2 GARCIA SUAREZ ORLANDO A (+)

RESULTADOS

INTERPRETACIOacuteN DE LOS RESULTADOS

La hemoacutelisis o la aglutinacioacuten representan un resultado positivo e indican lapresencia de una reaccioacuten antiacutegeno-anticuerpo Los resultados negativos no severa aglutinacioacuten o hemolisis

ESQUEMAS

CONCLUSIONES

Concluyo que la prueba de compatibilidad sanguiacutenea en su modalidad conliss ofrece mucha ventaja al ser al igual que otros reactivos unpotencializador de la reaccioacuten antiacutegeno-anticuerpo Esto permite queel operador o realizador de la prueba tenga mayor confianza y certezaen los resultados que obtenga

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Tubo Resultado

M1 NEGATIVOm1 NEGATIVO

M2 POSITIVO

M2 NEGATIVO

AUTOTES NEGATIVO

29

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PRACTICA 9INMUNOHEMATOLOGIA

DETERMINACION DE COOMBS DIRECTO

INTRODUCCIONPRUEBA DE COOMBS DIRECTA

El examen de Coombs directo se utiliza para detectar autoanticuerpos contralos propios gloacutebulos rojos (GR) de un individuo Es una prueba que sirve parademostrar el revestimiento de los eritrocitos in vivo (mientras los eritrocitosestaacuten circulando en el individuo) La prueba se realiza agregando directamenteel reactivo de Coombs a los eritrocitos previamente lavados para eliminar otras proteiacutenas no fijadas a el una prueba directa positiva significa que larelacioacuten antiacutegeno-anticuerpo ocurrioacute in vivo es decir que la fijacioacuten del

anticuerpo sobre el antiacutegeno se realizo en el organismo del individuo enestudio

Las indicaciones principales de esta prueba son diagnostico de enfermedadeshemoliacuteticas ictericia o anomaliacuteas en la apariencia de los gloacutebulos rojos bajo elmicroscopio ya que estos anticuerpos algunas veces destruyen los gloacutebulosrojos y causan anemia para investigar reacciones en transfusiones Parainvestigar la induccioacuten de drogas en ceacutelulas rojas sensibilizadas medicamentos(por ejemplo quinidina metildopa procainamida y otros) que pueden llevar a la produccioacuten de estos anticuerpos

OBJETIVO Determinar la presencia de anticuerpos en la superficie de losgloacutebulos rojos del individuo

MATERIAL

bull 10 Tubos de 1275

bull 10 Pipetas Pasteur

bull 1 Gradilla

bull 1 Bulbo

bull Papel Parafilm

bull Microcentriacutefuga

bull Bantildeo Mariacutea a 37degC

MUESTRA BIOLOGICA

Eritrocitos lavados de (3-5) del donador o pacienteREACTIVO

Suero de CoombsSuero anti-globulina humana Lafon Lote 406 Cad 310109 Color verde Aspecto transparente

TECNICA

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Colocar en un tubo de ensaye dos gotas de suero de Coombs mas una gota deglobulos rojos (3-5)Centrifugar a 1000 rpm durante 20 segDesprender el boton suavemente y buscar la presencia de aglutinacionRotular y enumerar 8 tubos de ensayes con las diferentes diluciones

(frac12frac1418)Enumerar 8 tubos mas del 1 al 8Agregar a cada tubo de las diluciones 10 gotas de solucion salina mas 10 gotasde suero de CoombsColocar Al primer tubo de la dilucion 1 gota de globulos rojos (3-5) mezclar completamente y agregar al tubo 1Centrifugar todos los tubos a 1000 rpm durante 20 seg

LECTURA

Aglutina- Prueba de Coombs directa es positiva

No aglutina- Prueba de Coombs directa es negativa

ESQUEMAS y RESULTADOS

CONCLUCION

He concluido que la prueba de Coombs directa es una prueba que se utiliza para medir

la presencia de anticuerpos en la superficie de los gloacutebulos rojos que se encuentran

circulando en el paciente y se realiza para investigar reacciones en transfusiones ademaacutes

sirve para la determinacioacuten de anemia hemoliacutetica autoinmune entre otras afecciones

Practica 10

IDENTIFICACION DE ANTICUERPOS IRREGULARES

Fundamento

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DILUCIONES

frac12 positiva

frac14 positiva

18 positiva

116 negativa

132 negativa

164 negativa

1128 negativa1256 negativa

31

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Los anticuerpos del sistema ABO aparecen una vez que elindividuo entra en contacto con el medio ambiente y en elcual se encuentran microorganismos como algunas bacteriascoliformes que contienen sustancias quiacutemicas en suestructura parecidas a las de este sistema Por anticuerpos

regulares debemos identificar a los que existen en todoslos individuos y que eacutestos tendraacuten durante toda su vida

Los anticuerpos irregulares son los que no estaacuten de esamanera aunque en el caso de los naturales no se conoce aciencia cierta queacute o coacutemo se induce su produccioacuten Losadquiridos se conocen tambieacuten como inmunes y son elresultado de la exposicioacuten a antiacutegenos desconocidos por elindividuo al momento de la transfusioacuten o en las mujerespor el embarazo estos anticuerpos son dirigidos contraantiacutegenos de sistemas diferentes al ABO

Los anticuerpos naturales regulares son preferentementeinmunoglobulinas M las cuales fijan de manera taneficiente el complemento que pueden provocar lisisintravascular y ocasionar insuficiencia renal o incluso lamuerte del paciente Los anticuerpos adquiridos o inmunesson generalmente inmunoglobulinas G las cuales producenhemoacutelisis extravascular en el bazo o en el hiacutegado mediantefagocitosis del complejo eritrocito maacutes anticuerpo

Los aloanticuerpos irregulares (adquiridos) maacutes comunes en

nuestra poblacioacuten son los que involucran a los sistemasMNSs P1 Kidd (Jka Jkb) Duffy (Fya Fyb) Kell Lewis yDiego

OBJETIVO identificacioacuten del anticuerpo irregular a traveacutesde las diferentes teacutecnicas

MATERIAL

bull 10 Tubos de ensaye

bull 10 Pipetas Pasteur

bull

1Gradillabull 1 Bulbo

bull Papel Parafim

MATERIAL BIOLOGICO

bull Gloacutebulos rojos lavados al 3 - 5

bull Suero

bull REACTIVOSReactivos

1 Suero de Coombs2 Albuacutemina bovina

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bull EQUIPO1 Microcentriacutefuga2 Bantildeo Mariacutea oacute Estufa

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3 SOLUCION SALINA4 SOLUCION DE LISS

TEacuteCNICA SOLUCION SALINA

Lavar los eritrocitos con solucioacuten salina (3veces)SALINA RAacutePIDA

Agregar una gota de Eritrocitos LavadosDiluiacuterlo al 3-5 con solucioacuten salina 09Agregar 2 gotas de sueroCentrifugar y observar anotar desprendimientodel botoacuten

SALINA 37deg BANtildeO MARIacuteA1) Incubar tubos a Bantildeo mariacutea a 37degC durante 1

hora (o 20 min)

2) Centirfugar despueacutes de haber pasado eltiempo

3) Desprender el botoacuten de eritrocitos yobservar

AGLUTINACIOacuteNndash No es compatibleNO AGLUTINACIOacuteN - Lavar 3 veces

SALINA COOMBS1) Con solucioacuten salina 09 lavar los

eritrocitos de los tubos q no tuvieronaglutinacioacuten 3 veces

2) Decantar y agregar 2 gotas de reactivode Coombs

AGLUTINACIOacuteN ndash No es compatibleNO AGLUTINACIOacuteN - Lavar 3 veces

TECNICA LISS

1 Poner dos gotas de LISS en cada tubo agregar una gotade eritrocitos lavados y al 3 - 5 seguacuten el nuacutemero detubo correspondiente

2 Mezclar y centrifugar un minuto decantar el

sobrenadante y con la ayuda de una gasa limpiar elexceso del reactivo

3 Poner nuevamente 2 gota de LISS resuspender poragitacioacuten agregar 2 gotas de suero problema mezclarincubar 15 minutos a 37ordm C centrifugar 30 seg A 1000RPM

4 Anotar los resultados

A las pruebas negativas realizar Coombs

1 Lavar 3 veces las ceacutelulas agregar suero de Coombs

centrifugar 30 seg2 Leer aglutinaciones y anotar resultados

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TECNICA ALBUMINA BOVINA 8 Agregar 2 gotas de albuacutemina al 229 Centrifugar 20 segundos10observar aglutinacioacuten o hemolisis o no aglutinacioacuten

11A los tubos con lecturas negativas incubar 20minutos en bantildeo Mariacutea a 37 degC12Centrifugar y observar

bull Aglutinacioacuten o hemoacutelisis reportar incompatible

bull No aglutinacioacuten llevar a Coombs

13Lavar tres veces decantar y quitar el exceso desalina con gasa y agregar 2 gotas de reactivo deCoombs y centrifugar 20 segundos y observar

bull Aglutinacioacuten o hemoacutelisis reportar incompatible

bull No aglutinacioacuten reportar compatible

Resultados ANTICUERPO IRREGULAR Anticuerpo c

InterpretacioacutenEstos anticuerpos son generalmente inmunoglobulinas tipo My ocasionalmente tipo G y debido a esa temperatura dereaccioacuten carecen de importancia cliacutenica salvo que sureaccioacuten ocurra tambieacuten a 37 degC su importancia radica enpacientes que seraacuten intervenido a 22 ordmc como es el caso de

operacioacuten de corazoacuten

Los llamados anticuerpos calientes tienen una temperatura oacuteptima dereaccioacuten a 37 degC a Estos anticuerpos tienen una relevanteimportancia cliacutenica ya que se les asocia con reaccionestransfusionales de intensidad moderada a severa que puedenocasionar la muerte

Esquemas

CONCLUSIONHe concluido que es importante determinar los anticuerposirregulares ya que estos anticuerpos tienen una relevanteimportancia cliacutenica ya que se les asocia con reaccionestransfusionales de intensidad moderada a severa

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Papel Parafilm

MUESTRA Muestra de sangre con Anticoagulante EDTA

REACTIVOSAntisuero RO-Antiglobulina humana (Poliespeciacutefico Anti IgG C-d) Para prueba de CoombsLABORATORIOS LAFON SA de C VFecha de Caducidad 31-Ene-09Lote 406Hecho en MeacutexicoAspecto TransparenteColor Verde

TEacuteCNICA

Lavar los eritrocitos con solucioacuten salina (3 veces)

SALINA RAacutePIDA1 Agregar una gota de Eritrocitos Lavados2 Diluirlo al 3-5 con solucioacuten salina 093 Agregar 2 gotas de suero4 Centrifugar y observar anotar desprendimiento del botoacuten

SALINA 37deg BANtildeO MARIacuteA

1 Incubar tubos a Bantildeo mariacutea a 37degC durante 1hora (o 20 min)2 Centirfugar despueacutes de haber pasado el

tiempo3 Desprender el botoacuten de eritrocitos y

observarAGLUTINACIOacuteNndash No es compatibleNO AGLUTINACIOacuteN - Lavar 3 veces

SALINA COOMBS

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PRUEBA MAYOR

G Rojos del DONADOR+

Suero del RECEPTOR(paciente)

PRUEBA MENOR

G Rojos del RECEPTOR(paciente)

+Suero del DONADOR

AUTOTESTIGO

G Rojos del RECEPTOR(paciente)

+Suero del RECEPTOR

(paciente)

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1 Con solucioacuten salina 09 lavar loseritrocitos de los tubos q no tuvieronaglutinacioacuten 3 veces

2 Decantar y agregar 2 gotas de reactivode Coombs

AGLUTINACIOacuteN ndash No es compatibleNO AGLUTINACIOacuteN - Lavar 3 veces

RESULTADOS

Paciente Madrigal Meacutendez Luis Eduardo (B+)Folio 009164Fecha301007

Donador 1 Torres Avileacutes Joseacute Ramoacuten (O+)Folio 022604Fecha311007

Donador 2 Rodriacuteguez Nuacutentildeez Joseacute Angel (A+) Folio 022605

Fecha311007

SALINA RAacutePIDA

M1 m1 M2 m2 AutotestigoGR de donador 1+ suero del

paciente

GR del paciente+ suero dedonador 1

GR de donador 2+ suero del

paciente

GR del paciente+ suero dedonador 2

GR del paciente+ suero del

paciente

- 4+ 4+ 4+ -

SALINA 37deg BANtildeO MARIacuteA

M1 m1 M2 m2 Autotestigo- 4+ 4+ 4+ -

Compatible Nocompatible

Nocompatible

Nocompatible

Compatible

SALINA COOMBS

Por lo tanto se puede decir que el donador 1 (O+) puededonar suero al paciente (B+) debido a que en el suero nohay anticuerpos de ninguacuten tipo que reaccionen con losantiacutegenos de los eritrocios del Donador 1 Mientras tantoel Donador 2 no puede donar al Paciente ni suero nieritrocitos

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M1 Autotestigo- -

Compatible

Compatible

21

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INTERPRETACIOacuteN

PRUEBA POSITIVA Existe una aglutinacioacuten de lasceacutelulas sanguiacuteneas que indica la presencia delantiacutegeno A o B En el suero de Coombs notamos si esta

la precencia de Antiacutegeno D en los eritrocitos Lahemoacutelisis no se debe interpretar como resultadopositivo ya que puede indicar contaminacioacuten delreactivo

PRUEBA NEGATIVA La no aglutinacioacuten indica unresultado negativo e indica que las ceacutelulas sonnegativas para Antiacutegenos del sisitema ABO y D

CONCLUSIOacuteN

He concluido que en las transfusiones de sangre no essuficiente con conocer que la sangre del donante y la delreceptor son del mismo grupo o bien que la del donantepertenezca al grupo O (cero) sino que es necesarioconocer si la compatibilidad es perfecta porque ninguacutenotro fenoacutemeno de inmunizacioacuten interfiera Es en estesentido por lo que son empleadas las pruebas cruzadas

Praacutectica No 7ldquoPrueba de compatibilidad sanguiacutenea (teacutecnica albumina)rdquo

IntroduccioacutenLa tipificacioacuten de sangre identifica el tipo sanguiacuteneo determinandoantiacutegenos presentes en los eritrocitos detecta aloanticuerpos encontra esos antiacutegenos Asiacute los aloanticuerpos pueden aparecernaturalmente o ser inducidos y pueden ser dirigidos contra del grupoconocido o a los antiacutegenos de superficie de los eritrocitos La prueba

de compatibilidad sanguiacutenea o cross matching esta formada por laprueba mayor y menorLa prueba de cruzamiento mayor para losaloanticuerpos consiste en probar el plasma del receptor contra los

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gloacutebulos rojos del donante Es incompatible cuando se genera unareaccioacuten hemoliacutetica los eritrocitos del donante se destruyen por losaloanticuerpos del plasma del receptor La prueba menor es una pruebapara los aloanticuerpos del plasma del donante en contra los gloacutebulosrojos del receptor Una incompatibilidad menor es una causa menosfrecuente para causar una reaccioacuten en contra una transfusioacuten porque

el volumen de plasma del donante es menor y es diluido marcadamente enel receptor Para llevar a cabo dicho procedimiento se utilizandiversos reactivos como potencializadores que mejoran la unioacuten deeritrocitos con alguacuten tipo de anticuerpo Uno de esospotencializadores es la albuacutemina La albumina bovina polimerizada esun reactivo muy utilizado en el laboratorio de inmunohematologia y encentros de bancos de sangre funciona como un potencializador quefacilita la reaccion de aglutinacioacuten de eritrocitos sensibilizados Alfinal de la prueba se prueban los eritrocitos con el reactivo deCoombs El principio de la prueba de Coombs fue descrito por Moreschien 1908 pero Coombs Mourant y Race en 1946 la introdujeron en elestudio de los grupos sanguiacuteneos y anticuerpos cuando una parte desangre (suero) fue usada para la inoculacioacuten de animales para

inmunizarlos con proteiacutena humana utilizando el anticuerpo obtenido enla deteccioacuten de los llamados anticuerpos incompletos Esta prueba seusa para determinar la presencia de anticuerpos no aglutinantes en elsuero de sujetos sensibilizados a uno o mas antiacutegenos sanguiacuteneos Esuacutetil en el estudio del suero de mujeres con isoinmunizacioacuten materno-fetal y se emplea tambieacuten en otro tipo de pruebas como identificacioacutende anticuerpos autoinmunes deteccioacuten de algunos sistemas sanguiacuteneos ypruebas de compatibilidad sanguiacutenea La prueba indirecta se realizacon eritrocitos normales incubados in Vitro con el suero de estudioDurante este periodo si existe un anticuerpo este se fija sobre surespectivo determinante antigeacutenico Una vez fijados los eritrocitosson igualmente lavados y se agrega el reactivo de Coombs produciendoaglutinacioacuten Una prueba de Coombs indirecta positiva significa que

existen anticuerpos libres en el suero de la persona los cualespuedan ser igualmente auto-anticuerpos o isoanticuerpos

Objetivo Determinacioacuten de los antiacutegenos del sistema ABO Rh (D) y sucompatibilidad entre un paciente Donador y un Paciente Receptor

Material y equipo

5 Tubos de ensaye

6 Pipetas Pasteur

1Gradilla

1 Bulbo

Papel Parafilm

Microcentriacutefuga

Bantildeo Mariacutea oacute Estufa

Material bioloacutegico

Muestras de sangre de extraccioacuten reciente recogida conanticoagulante o sin anticoagulante

ReactivosSuero de CoombsAlbuacutemina bovina deg

Suero anti-globulina humana Lafon Lote 406 Cad 310109 Color verde Aspecto

transparentedegAlbumina de bovino polimerizada Interbiol Lote APO107 Cad 150109 Color incoloroAspecto transparente

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Teacutecnica

1 Montar prueba mayor 1 y 2 prueba menor 1 y 2 y autotestigocon el procedimiento ya anteriormente conocido

2 Agregar 2 gotas de albuacutemina al 223 Centrifugar 20 segundos4 observar aglutinacioacuten o hemolisis o no aglutinacioacuten5 A los tubos con lecturas negativas incubar 20 minutos en bantildeo

Mariacutea a 37 degC6 Centrifugar y observar

bull Aglutinacioacuten o hemoacutelisis reportar incompatible

bull No aglutinacioacuten llevar a Coombs

7 Lavar tres veces decantar y quitar el exceso de salina congasa y agregar 2 gotas de reactivo de Coombs y centrifugar 20segundos y observar

bull Aglutinacioacuten o hemoacutelisis reportar incompatible

bull No aglutinacioacuten reportar compatible

Resultados1 PRUEBA MAYOR 1 2 Gotas de suero del paciente + 1 gota de GR al 3-5 del

donador 12 PRUEBA MENOR 1 2 Gotas de suero del donador 1 + 1 gota de GR al 3-5 del

paciente3 PRUEBA MAYOR 2 2 Gotas de suero del paciente + 1 gota de GR al 3-5 del

donador 24 PRUEBA MENOR 2 2 Gotas de suero del donador 2 + 1 gota de GR al 3-5 del

paciente5 AUTOTESTIGO 2 Gotas de suero del paciente + 1 gota de GR al 3-5 del paciente

M1 m1 M2 m2 AutotestigoCon albuacutemina - - - - -Despueacutes de incubacioacuten a 37 degC - - - - -Despueacutes de Coombs - - - - -Despueacutes de validacioacuten con gloacutebulos

positivos+ + + + +

InterpretacioacutenPrueba positiva Alutinacioacuten o hemolisis Indica no compatibilidadPrueba negativaNo aglutinacioacuten Indica compatibilidad

Esquemas

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ConclusioacutenConcluyo que la prueba de compatibilidad sanguiacutenea en su modalidad conalbuacutemina bovina ofrece mucha ventaja al ser al igual que otrosreactivos un potencializador de la reaccioacuten antiacutegeno-anticuerpo Estopermite que el operador o realizador de la prueba tenga mayorconfianza y certeza en los resultados que obtenga

PRACTICA No 8PRUEBA DE COMPATIBILIDAD SANGUINEA PRUEBA DE LISS

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FUNDAMENTO

LISS es utilizado para reducir la fuerza ioacutenica del medio

de reaccioacuten en los procedimientos de deteccioacuten eidentificacioacuten de anticuerpos y en las pruebas decompatibilidad La presencia de este reactivo refuerza lainteraccioacuten antiacutegeno - anticuerpo durante la incubacioacuten

GENERALIDADESEl uso de solucioacuten salina de baja fuerza ioacutenica fuedescrito inicialmente en 1964 por Hughes-Jones y col y

Elliot y col pero en ese tiempo su uso era limitado yaque la concentracioacuten molar obtenida provocaba la hemoacutelisisde los eritrocitos suspendidos

En 1974 Low y Messeter describieron el uso rutinario de lasolucioacuten Liss de 003 M que lograba reducir el tiempo deincubacioacuten y no presentaba tendencia a la hemoacutelisis al sersuspendidos en salina a baja fuerza ioacutenica restableciendola presioacuten osmoacutetica de la solucioacuten mediante la adicioacuten deglicinaLas soluciones de baja fuerza ioacutenica son actualmente lasmaacutes utilizadas en inmunohematologiacutea provocando un aumentoen la velocidad de asociacioacuten entre antiacutegenos y anticuerpospermitiendo asiacute acortar el tiempo de incubacioacuten de 60minutos a 10-15 minutos sin sacrificar la sensibilidad delas mismas y sin costos elevadosSe ha observado que lasreacciones antiacutegeno-anticuerpo se ven potenciadas alreducir la fuerza ioacutenica del medio de reaccioacuten

La fuerza ioacutenica es uno de los factores maacutes importantes quedeterminan la tasa y la cantidad de captacioacuten deanticuerpos por parte de los eritrocitos El uso de mediosde reaccioacuten de baja fuerza ioacutenica permite disminuir eltiempo de incubacioacuten y potenciar las reacciones de losanticuerpos sin incrementar las reacciones inespeciacuteficas

Los iones Na+ y Cl- presentes en la solucioacuten salinafisioloacutegica se agrupan alrededor de las moleacuteculas deantiacutegeno y anticuerpo neutralizando sus cargas opuestas locual dificulta la unioacuten entre ellos Este efecto se reduceutilizando soluciones de baja fuerza ioacutenica y disminuyendode esta manera la incubacioacuten de las pruebas

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En esta etapa de sensibilizacioacuten las posibilidades deasociacioacuten pueden incrementarse mediante agitacioacutencentrifugacioacuten yo variacioacuten de la concentracioacuten delanticuerpo

Despueacutes de que el anticuerpo se ha fijado al antiacutegeno loseritrocitos sensibilizados deben unirse para dar lugar a laaglutinacioacuten visible esta red tambieacuten solidifica yestabiliza la reaccioacuten

En esta etapa la reaccioacuten depende de factores como lascaracteriacutesticas del anticuerpo localizacioacuten en la membranay nuacutemero de sitios antigeacutenicos fuerzas que mantienen ladistancia entre los eritrocitos

Las caracteriacutesticas del anticuerpo que deben considerarse

son el tamantildeo del anticuerpo involucrado y el nuacutemero desitios de combinacioacuten con el antiacutegeno Los anticuerpos IgMpueden establecer puentes entre los eritrocitos yaglutinarlos espontaacuteneamente en solucioacuten salina mientrasque los IgG no ya que las IgM pentameacutericas poseen 10sitios de combinacioacuten con el antiacutegeno y las IgG diacutemerossoacutelo dos sitios

Los eritrocitos tienen una carga neta negativa en susuperficie su interaccioacuten con los iones del medio alteraesta carga y producen una carga neta criacutetica denominada

potencial zeta y la reduccioacuten de dicha carga permite quelos eritrocitos se aproximen lo suficiente para que seanaglutinados por medio de los IgG que los sensibilizaron

Las soluciones de baja fuerza ionica empleadas en banco desangre tienen un pH entre 65 ndash 70 se recomienda unaosmolalidad de 270 ndash 305 mosmkg y una conductividad de 37mmcm El control diario implica el examen de su aparienciafiacutesica ausencia de turbidez particulas o sedimento asiacutecomo corroborar la capacidad para generar hemoacutelisiscrenacion o prueba de coombs positiva en eritrocitos

normales Cada lote nuevo se valora mediante el rastreo deun anticuerpo ya sea un anti- D un anti- jk anti- fy oanti- kell diluido se compara su capacidad de deteccioacutencontra un medio salino normal incubando 10min a 37ordmC enLISS debe poder rastrearse un anticuerpo en tanto que enmedio salino no

MATERIAL Y EQUIPO

Material Cantidad10 Tubos de ensayo de 12 x 75

1 Gradilla10 Pipetas pasteur

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1 Bulbo1 Marcador1 Microcentriacutefuga1 Bantildeo Mariacutea

MATERIAL BIOLOGICO

Gloacutebulos rojos lavados al 3 - 5Suero

REACTIVOS

Reactivo de LISSReactivo de Coombs

TECNICA1- Lavar los eritrocitos

Separar el suero del paquete de gloacutebulos rojos

Agregar cierta cantidad de eritrocitos a un tubo deensayo y agregarle solucioacuten salina

Centrifugar y decantar

Repetir este proceso 3 veces

2- Realizar la Prueba de LISS

Enumerar los tubos Poner dos gotas de LISS en cada tubo agregar una gota

de eritrocitos lavados y al 3 - 5 seguacuten el nuacutemero detubo correspondiente

Mezclar y centrifugar un minuto decantar elsobrenadante y con la ayuda de una gasa limpiar elexceso del reactivo

Poner nuevamente 2 gota de LISS resuspender poragitacioacuten agregar 2 gotas de suero problema mezclarincubar 15 minutos a 37ordm C centrifugar 30 seg A 1000

RPM Anotar los resultados

3- A las pruebas negativas realizar Coombs

Lavar 3 veces las ceacutelulas agregar suero de Coombscentrifugar 30 seg

Leer aglutinaciones y anotar resultados

REACTIVOS UTILIZADOS

REACTIVO MARCA FECHA DECADUCIDAD

ASPECTO COLOR LOTE

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SueroAntiglobuina

humana

Lafon 31 01 2009 Transparente Verde 406

LISS Caserorealizado enCMNSIGLOXXI

1 antildeo Transparente Transparente

----------

PACIENTE ASCANIO MENDEZ JOSUE O (+)DONADOR 1 GARCIA CARBAJAL OSCAR O (+)DONADOR 2 GARCIA SUAREZ ORLANDO A (+)

RESULTADOS

INTERPRETACIOacuteN DE LOS RESULTADOS

La hemoacutelisis o la aglutinacioacuten representan un resultado positivo e indican lapresencia de una reaccioacuten antiacutegeno-anticuerpo Los resultados negativos no severa aglutinacioacuten o hemolisis

ESQUEMAS

CONCLUSIONES

Concluyo que la prueba de compatibilidad sanguiacutenea en su modalidad conliss ofrece mucha ventaja al ser al igual que otros reactivos unpotencializador de la reaccioacuten antiacutegeno-anticuerpo Esto permite queel operador o realizador de la prueba tenga mayor confianza y certezaen los resultados que obtenga

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Tubo Resultado

M1 NEGATIVOm1 NEGATIVO

M2 POSITIVO

M2 NEGATIVO

AUTOTES NEGATIVO

29

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PRACTICA 9INMUNOHEMATOLOGIA

DETERMINACION DE COOMBS DIRECTO

INTRODUCCIONPRUEBA DE COOMBS DIRECTA

El examen de Coombs directo se utiliza para detectar autoanticuerpos contralos propios gloacutebulos rojos (GR) de un individuo Es una prueba que sirve parademostrar el revestimiento de los eritrocitos in vivo (mientras los eritrocitosestaacuten circulando en el individuo) La prueba se realiza agregando directamenteel reactivo de Coombs a los eritrocitos previamente lavados para eliminar otras proteiacutenas no fijadas a el una prueba directa positiva significa que larelacioacuten antiacutegeno-anticuerpo ocurrioacute in vivo es decir que la fijacioacuten del

anticuerpo sobre el antiacutegeno se realizo en el organismo del individuo enestudio

Las indicaciones principales de esta prueba son diagnostico de enfermedadeshemoliacuteticas ictericia o anomaliacuteas en la apariencia de los gloacutebulos rojos bajo elmicroscopio ya que estos anticuerpos algunas veces destruyen los gloacutebulosrojos y causan anemia para investigar reacciones en transfusiones Parainvestigar la induccioacuten de drogas en ceacutelulas rojas sensibilizadas medicamentos(por ejemplo quinidina metildopa procainamida y otros) que pueden llevar a la produccioacuten de estos anticuerpos

OBJETIVO Determinar la presencia de anticuerpos en la superficie de losgloacutebulos rojos del individuo

MATERIAL

bull 10 Tubos de 1275

bull 10 Pipetas Pasteur

bull 1 Gradilla

bull 1 Bulbo

bull Papel Parafilm

bull Microcentriacutefuga

bull Bantildeo Mariacutea a 37degC

MUESTRA BIOLOGICA

Eritrocitos lavados de (3-5) del donador o pacienteREACTIVO

Suero de CoombsSuero anti-globulina humana Lafon Lote 406 Cad 310109 Color verde Aspecto transparente

TECNICA

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Colocar en un tubo de ensaye dos gotas de suero de Coombs mas una gota deglobulos rojos (3-5)Centrifugar a 1000 rpm durante 20 segDesprender el boton suavemente y buscar la presencia de aglutinacionRotular y enumerar 8 tubos de ensayes con las diferentes diluciones

(frac12frac1418)Enumerar 8 tubos mas del 1 al 8Agregar a cada tubo de las diluciones 10 gotas de solucion salina mas 10 gotasde suero de CoombsColocar Al primer tubo de la dilucion 1 gota de globulos rojos (3-5) mezclar completamente y agregar al tubo 1Centrifugar todos los tubos a 1000 rpm durante 20 seg

LECTURA

Aglutina- Prueba de Coombs directa es positiva

No aglutina- Prueba de Coombs directa es negativa

ESQUEMAS y RESULTADOS

CONCLUCION

He concluido que la prueba de Coombs directa es una prueba que se utiliza para medir

la presencia de anticuerpos en la superficie de los gloacutebulos rojos que se encuentran

circulando en el paciente y se realiza para investigar reacciones en transfusiones ademaacutes

sirve para la determinacioacuten de anemia hemoliacutetica autoinmune entre otras afecciones

Practica 10

IDENTIFICACION DE ANTICUERPOS IRREGULARES

Fundamento

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DILUCIONES

frac12 positiva

frac14 positiva

18 positiva

116 negativa

132 negativa

164 negativa

1128 negativa1256 negativa

31

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Los anticuerpos del sistema ABO aparecen una vez que elindividuo entra en contacto con el medio ambiente y en elcual se encuentran microorganismos como algunas bacteriascoliformes que contienen sustancias quiacutemicas en suestructura parecidas a las de este sistema Por anticuerpos

regulares debemos identificar a los que existen en todoslos individuos y que eacutestos tendraacuten durante toda su vida

Los anticuerpos irregulares son los que no estaacuten de esamanera aunque en el caso de los naturales no se conoce aciencia cierta queacute o coacutemo se induce su produccioacuten Losadquiridos se conocen tambieacuten como inmunes y son elresultado de la exposicioacuten a antiacutegenos desconocidos por elindividuo al momento de la transfusioacuten o en las mujerespor el embarazo estos anticuerpos son dirigidos contraantiacutegenos de sistemas diferentes al ABO

Los anticuerpos naturales regulares son preferentementeinmunoglobulinas M las cuales fijan de manera taneficiente el complemento que pueden provocar lisisintravascular y ocasionar insuficiencia renal o incluso lamuerte del paciente Los anticuerpos adquiridos o inmunesson generalmente inmunoglobulinas G las cuales producenhemoacutelisis extravascular en el bazo o en el hiacutegado mediantefagocitosis del complejo eritrocito maacutes anticuerpo

Los aloanticuerpos irregulares (adquiridos) maacutes comunes en

nuestra poblacioacuten son los que involucran a los sistemasMNSs P1 Kidd (Jka Jkb) Duffy (Fya Fyb) Kell Lewis yDiego

OBJETIVO identificacioacuten del anticuerpo irregular a traveacutesde las diferentes teacutecnicas

MATERIAL

bull 10 Tubos de ensaye

bull 10 Pipetas Pasteur

bull

1Gradillabull 1 Bulbo

bull Papel Parafim

MATERIAL BIOLOGICO

bull Gloacutebulos rojos lavados al 3 - 5

bull Suero

bull REACTIVOSReactivos

1 Suero de Coombs2 Albuacutemina bovina

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bull EQUIPO1 Microcentriacutefuga2 Bantildeo Mariacutea oacute Estufa

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3 SOLUCION SALINA4 SOLUCION DE LISS

TEacuteCNICA SOLUCION SALINA

Lavar los eritrocitos con solucioacuten salina (3veces)SALINA RAacutePIDA

Agregar una gota de Eritrocitos LavadosDiluiacuterlo al 3-5 con solucioacuten salina 09Agregar 2 gotas de sueroCentrifugar y observar anotar desprendimientodel botoacuten

SALINA 37deg BANtildeO MARIacuteA1) Incubar tubos a Bantildeo mariacutea a 37degC durante 1

hora (o 20 min)

2) Centirfugar despueacutes de haber pasado eltiempo

3) Desprender el botoacuten de eritrocitos yobservar

AGLUTINACIOacuteNndash No es compatibleNO AGLUTINACIOacuteN - Lavar 3 veces

SALINA COOMBS1) Con solucioacuten salina 09 lavar los

eritrocitos de los tubos q no tuvieronaglutinacioacuten 3 veces

2) Decantar y agregar 2 gotas de reactivode Coombs

AGLUTINACIOacuteN ndash No es compatibleNO AGLUTINACIOacuteN - Lavar 3 veces

TECNICA LISS

1 Poner dos gotas de LISS en cada tubo agregar una gotade eritrocitos lavados y al 3 - 5 seguacuten el nuacutemero detubo correspondiente

2 Mezclar y centrifugar un minuto decantar el

sobrenadante y con la ayuda de una gasa limpiar elexceso del reactivo

3 Poner nuevamente 2 gota de LISS resuspender poragitacioacuten agregar 2 gotas de suero problema mezclarincubar 15 minutos a 37ordm C centrifugar 30 seg A 1000RPM

4 Anotar los resultados

A las pruebas negativas realizar Coombs

1 Lavar 3 veces las ceacutelulas agregar suero de Coombs

centrifugar 30 seg2 Leer aglutinaciones y anotar resultados

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TECNICA ALBUMINA BOVINA 8 Agregar 2 gotas de albuacutemina al 229 Centrifugar 20 segundos10observar aglutinacioacuten o hemolisis o no aglutinacioacuten

11A los tubos con lecturas negativas incubar 20minutos en bantildeo Mariacutea a 37 degC12Centrifugar y observar

bull Aglutinacioacuten o hemoacutelisis reportar incompatible

bull No aglutinacioacuten llevar a Coombs

13Lavar tres veces decantar y quitar el exceso desalina con gasa y agregar 2 gotas de reactivo deCoombs y centrifugar 20 segundos y observar

bull Aglutinacioacuten o hemoacutelisis reportar incompatible

bull No aglutinacioacuten reportar compatible

Resultados ANTICUERPO IRREGULAR Anticuerpo c

InterpretacioacutenEstos anticuerpos son generalmente inmunoglobulinas tipo My ocasionalmente tipo G y debido a esa temperatura dereaccioacuten carecen de importancia cliacutenica salvo que sureaccioacuten ocurra tambieacuten a 37 degC su importancia radica enpacientes que seraacuten intervenido a 22 ordmc como es el caso de

operacioacuten de corazoacuten

Los llamados anticuerpos calientes tienen una temperatura oacuteptima dereaccioacuten a 37 degC a Estos anticuerpos tienen una relevanteimportancia cliacutenica ya que se les asocia con reaccionestransfusionales de intensidad moderada a severa que puedenocasionar la muerte

Esquemas

CONCLUSIONHe concluido que es importante determinar los anticuerposirregulares ya que estos anticuerpos tienen una relevanteimportancia cliacutenica ya que se les asocia con reaccionestransfusionales de intensidad moderada a severa

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1 Con solucioacuten salina 09 lavar loseritrocitos de los tubos q no tuvieronaglutinacioacuten 3 veces

2 Decantar y agregar 2 gotas de reactivode Coombs

AGLUTINACIOacuteN ndash No es compatibleNO AGLUTINACIOacuteN - Lavar 3 veces

RESULTADOS

Paciente Madrigal Meacutendez Luis Eduardo (B+)Folio 009164Fecha301007

Donador 1 Torres Avileacutes Joseacute Ramoacuten (O+)Folio 022604Fecha311007

Donador 2 Rodriacuteguez Nuacutentildeez Joseacute Angel (A+) Folio 022605

Fecha311007

SALINA RAacutePIDA

M1 m1 M2 m2 AutotestigoGR de donador 1+ suero del

paciente

GR del paciente+ suero dedonador 1

GR de donador 2+ suero del

paciente

GR del paciente+ suero dedonador 2

GR del paciente+ suero del

paciente

- 4+ 4+ 4+ -

SALINA 37deg BANtildeO MARIacuteA

M1 m1 M2 m2 Autotestigo- 4+ 4+ 4+ -

Compatible Nocompatible

Nocompatible

Nocompatible

Compatible

SALINA COOMBS

Por lo tanto se puede decir que el donador 1 (O+) puededonar suero al paciente (B+) debido a que en el suero nohay anticuerpos de ninguacuten tipo que reaccionen con losantiacutegenos de los eritrocios del Donador 1 Mientras tantoel Donador 2 no puede donar al Paciente ni suero nieritrocitos

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M1 Autotestigo- -

Compatible

Compatible

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INTERPRETACIOacuteN

PRUEBA POSITIVA Existe una aglutinacioacuten de lasceacutelulas sanguiacuteneas que indica la presencia delantiacutegeno A o B En el suero de Coombs notamos si esta

la precencia de Antiacutegeno D en los eritrocitos Lahemoacutelisis no se debe interpretar como resultadopositivo ya que puede indicar contaminacioacuten delreactivo

PRUEBA NEGATIVA La no aglutinacioacuten indica unresultado negativo e indica que las ceacutelulas sonnegativas para Antiacutegenos del sisitema ABO y D

CONCLUSIOacuteN

He concluido que en las transfusiones de sangre no essuficiente con conocer que la sangre del donante y la delreceptor son del mismo grupo o bien que la del donantepertenezca al grupo O (cero) sino que es necesarioconocer si la compatibilidad es perfecta porque ninguacutenotro fenoacutemeno de inmunizacioacuten interfiera Es en estesentido por lo que son empleadas las pruebas cruzadas

Praacutectica No 7ldquoPrueba de compatibilidad sanguiacutenea (teacutecnica albumina)rdquo

IntroduccioacutenLa tipificacioacuten de sangre identifica el tipo sanguiacuteneo determinandoantiacutegenos presentes en los eritrocitos detecta aloanticuerpos encontra esos antiacutegenos Asiacute los aloanticuerpos pueden aparecernaturalmente o ser inducidos y pueden ser dirigidos contra del grupoconocido o a los antiacutegenos de superficie de los eritrocitos La prueba

de compatibilidad sanguiacutenea o cross matching esta formada por laprueba mayor y menorLa prueba de cruzamiento mayor para losaloanticuerpos consiste en probar el plasma del receptor contra los

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gloacutebulos rojos del donante Es incompatible cuando se genera unareaccioacuten hemoliacutetica los eritrocitos del donante se destruyen por losaloanticuerpos del plasma del receptor La prueba menor es una pruebapara los aloanticuerpos del plasma del donante en contra los gloacutebulosrojos del receptor Una incompatibilidad menor es una causa menosfrecuente para causar una reaccioacuten en contra una transfusioacuten porque

el volumen de plasma del donante es menor y es diluido marcadamente enel receptor Para llevar a cabo dicho procedimiento se utilizandiversos reactivos como potencializadores que mejoran la unioacuten deeritrocitos con alguacuten tipo de anticuerpo Uno de esospotencializadores es la albuacutemina La albumina bovina polimerizada esun reactivo muy utilizado en el laboratorio de inmunohematologia y encentros de bancos de sangre funciona como un potencializador quefacilita la reaccion de aglutinacioacuten de eritrocitos sensibilizados Alfinal de la prueba se prueban los eritrocitos con el reactivo deCoombs El principio de la prueba de Coombs fue descrito por Moreschien 1908 pero Coombs Mourant y Race en 1946 la introdujeron en elestudio de los grupos sanguiacuteneos y anticuerpos cuando una parte desangre (suero) fue usada para la inoculacioacuten de animales para

inmunizarlos con proteiacutena humana utilizando el anticuerpo obtenido enla deteccioacuten de los llamados anticuerpos incompletos Esta prueba seusa para determinar la presencia de anticuerpos no aglutinantes en elsuero de sujetos sensibilizados a uno o mas antiacutegenos sanguiacuteneos Esuacutetil en el estudio del suero de mujeres con isoinmunizacioacuten materno-fetal y se emplea tambieacuten en otro tipo de pruebas como identificacioacutende anticuerpos autoinmunes deteccioacuten de algunos sistemas sanguiacuteneos ypruebas de compatibilidad sanguiacutenea La prueba indirecta se realizacon eritrocitos normales incubados in Vitro con el suero de estudioDurante este periodo si existe un anticuerpo este se fija sobre surespectivo determinante antigeacutenico Una vez fijados los eritrocitosson igualmente lavados y se agrega el reactivo de Coombs produciendoaglutinacioacuten Una prueba de Coombs indirecta positiva significa que

existen anticuerpos libres en el suero de la persona los cualespuedan ser igualmente auto-anticuerpos o isoanticuerpos

Objetivo Determinacioacuten de los antiacutegenos del sistema ABO Rh (D) y sucompatibilidad entre un paciente Donador y un Paciente Receptor

Material y equipo

5 Tubos de ensaye

6 Pipetas Pasteur

1Gradilla

1 Bulbo

Papel Parafilm

Microcentriacutefuga

Bantildeo Mariacutea oacute Estufa

Material bioloacutegico

Muestras de sangre de extraccioacuten reciente recogida conanticoagulante o sin anticoagulante

ReactivosSuero de CoombsAlbuacutemina bovina deg

Suero anti-globulina humana Lafon Lote 406 Cad 310109 Color verde Aspecto

transparentedegAlbumina de bovino polimerizada Interbiol Lote APO107 Cad 150109 Color incoloroAspecto transparente

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Teacutecnica

1 Montar prueba mayor 1 y 2 prueba menor 1 y 2 y autotestigocon el procedimiento ya anteriormente conocido

2 Agregar 2 gotas de albuacutemina al 223 Centrifugar 20 segundos4 observar aglutinacioacuten o hemolisis o no aglutinacioacuten5 A los tubos con lecturas negativas incubar 20 minutos en bantildeo

Mariacutea a 37 degC6 Centrifugar y observar

bull Aglutinacioacuten o hemoacutelisis reportar incompatible

bull No aglutinacioacuten llevar a Coombs

7 Lavar tres veces decantar y quitar el exceso de salina congasa y agregar 2 gotas de reactivo de Coombs y centrifugar 20segundos y observar

bull Aglutinacioacuten o hemoacutelisis reportar incompatible

bull No aglutinacioacuten reportar compatible

Resultados1 PRUEBA MAYOR 1 2 Gotas de suero del paciente + 1 gota de GR al 3-5 del

donador 12 PRUEBA MENOR 1 2 Gotas de suero del donador 1 + 1 gota de GR al 3-5 del

paciente3 PRUEBA MAYOR 2 2 Gotas de suero del paciente + 1 gota de GR al 3-5 del

donador 24 PRUEBA MENOR 2 2 Gotas de suero del donador 2 + 1 gota de GR al 3-5 del

paciente5 AUTOTESTIGO 2 Gotas de suero del paciente + 1 gota de GR al 3-5 del paciente

M1 m1 M2 m2 AutotestigoCon albuacutemina - - - - -Despueacutes de incubacioacuten a 37 degC - - - - -Despueacutes de Coombs - - - - -Despueacutes de validacioacuten con gloacutebulos

positivos+ + + + +

InterpretacioacutenPrueba positiva Alutinacioacuten o hemolisis Indica no compatibilidadPrueba negativaNo aglutinacioacuten Indica compatibilidad

Esquemas

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ConclusioacutenConcluyo que la prueba de compatibilidad sanguiacutenea en su modalidad conalbuacutemina bovina ofrece mucha ventaja al ser al igual que otrosreactivos un potencializador de la reaccioacuten antiacutegeno-anticuerpo Estopermite que el operador o realizador de la prueba tenga mayorconfianza y certeza en los resultados que obtenga

PRACTICA No 8PRUEBA DE COMPATIBILIDAD SANGUINEA PRUEBA DE LISS

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FUNDAMENTO

LISS es utilizado para reducir la fuerza ioacutenica del medio

de reaccioacuten en los procedimientos de deteccioacuten eidentificacioacuten de anticuerpos y en las pruebas decompatibilidad La presencia de este reactivo refuerza lainteraccioacuten antiacutegeno - anticuerpo durante la incubacioacuten

GENERALIDADESEl uso de solucioacuten salina de baja fuerza ioacutenica fuedescrito inicialmente en 1964 por Hughes-Jones y col y

Elliot y col pero en ese tiempo su uso era limitado yaque la concentracioacuten molar obtenida provocaba la hemoacutelisisde los eritrocitos suspendidos

En 1974 Low y Messeter describieron el uso rutinario de lasolucioacuten Liss de 003 M que lograba reducir el tiempo deincubacioacuten y no presentaba tendencia a la hemoacutelisis al sersuspendidos en salina a baja fuerza ioacutenica restableciendola presioacuten osmoacutetica de la solucioacuten mediante la adicioacuten deglicinaLas soluciones de baja fuerza ioacutenica son actualmente lasmaacutes utilizadas en inmunohematologiacutea provocando un aumentoen la velocidad de asociacioacuten entre antiacutegenos y anticuerpospermitiendo asiacute acortar el tiempo de incubacioacuten de 60minutos a 10-15 minutos sin sacrificar la sensibilidad delas mismas y sin costos elevadosSe ha observado que lasreacciones antiacutegeno-anticuerpo se ven potenciadas alreducir la fuerza ioacutenica del medio de reaccioacuten

La fuerza ioacutenica es uno de los factores maacutes importantes quedeterminan la tasa y la cantidad de captacioacuten deanticuerpos por parte de los eritrocitos El uso de mediosde reaccioacuten de baja fuerza ioacutenica permite disminuir eltiempo de incubacioacuten y potenciar las reacciones de losanticuerpos sin incrementar las reacciones inespeciacuteficas

Los iones Na+ y Cl- presentes en la solucioacuten salinafisioloacutegica se agrupan alrededor de las moleacuteculas deantiacutegeno y anticuerpo neutralizando sus cargas opuestas locual dificulta la unioacuten entre ellos Este efecto se reduceutilizando soluciones de baja fuerza ioacutenica y disminuyendode esta manera la incubacioacuten de las pruebas

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En esta etapa de sensibilizacioacuten las posibilidades deasociacioacuten pueden incrementarse mediante agitacioacutencentrifugacioacuten yo variacioacuten de la concentracioacuten delanticuerpo

Despueacutes de que el anticuerpo se ha fijado al antiacutegeno loseritrocitos sensibilizados deben unirse para dar lugar a laaglutinacioacuten visible esta red tambieacuten solidifica yestabiliza la reaccioacuten

En esta etapa la reaccioacuten depende de factores como lascaracteriacutesticas del anticuerpo localizacioacuten en la membranay nuacutemero de sitios antigeacutenicos fuerzas que mantienen ladistancia entre los eritrocitos

Las caracteriacutesticas del anticuerpo que deben considerarse

son el tamantildeo del anticuerpo involucrado y el nuacutemero desitios de combinacioacuten con el antiacutegeno Los anticuerpos IgMpueden establecer puentes entre los eritrocitos yaglutinarlos espontaacuteneamente en solucioacuten salina mientrasque los IgG no ya que las IgM pentameacutericas poseen 10sitios de combinacioacuten con el antiacutegeno y las IgG diacutemerossoacutelo dos sitios

Los eritrocitos tienen una carga neta negativa en susuperficie su interaccioacuten con los iones del medio alteraesta carga y producen una carga neta criacutetica denominada

potencial zeta y la reduccioacuten de dicha carga permite quelos eritrocitos se aproximen lo suficiente para que seanaglutinados por medio de los IgG que los sensibilizaron

Las soluciones de baja fuerza ionica empleadas en banco desangre tienen un pH entre 65 ndash 70 se recomienda unaosmolalidad de 270 ndash 305 mosmkg y una conductividad de 37mmcm El control diario implica el examen de su aparienciafiacutesica ausencia de turbidez particulas o sedimento asiacutecomo corroborar la capacidad para generar hemoacutelisiscrenacion o prueba de coombs positiva en eritrocitos

normales Cada lote nuevo se valora mediante el rastreo deun anticuerpo ya sea un anti- D un anti- jk anti- fy oanti- kell diluido se compara su capacidad de deteccioacutencontra un medio salino normal incubando 10min a 37ordmC enLISS debe poder rastrearse un anticuerpo en tanto que enmedio salino no

MATERIAL Y EQUIPO

Material Cantidad10 Tubos de ensayo de 12 x 75

1 Gradilla10 Pipetas pasteur

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1 Bulbo1 Marcador1 Microcentriacutefuga1 Bantildeo Mariacutea

MATERIAL BIOLOGICO

Gloacutebulos rojos lavados al 3 - 5Suero

REACTIVOS

Reactivo de LISSReactivo de Coombs

TECNICA1- Lavar los eritrocitos

Separar el suero del paquete de gloacutebulos rojos

Agregar cierta cantidad de eritrocitos a un tubo deensayo y agregarle solucioacuten salina

Centrifugar y decantar

Repetir este proceso 3 veces

2- Realizar la Prueba de LISS

Enumerar los tubos Poner dos gotas de LISS en cada tubo agregar una gota

de eritrocitos lavados y al 3 - 5 seguacuten el nuacutemero detubo correspondiente

Mezclar y centrifugar un minuto decantar elsobrenadante y con la ayuda de una gasa limpiar elexceso del reactivo

Poner nuevamente 2 gota de LISS resuspender poragitacioacuten agregar 2 gotas de suero problema mezclarincubar 15 minutos a 37ordm C centrifugar 30 seg A 1000

RPM Anotar los resultados

3- A las pruebas negativas realizar Coombs

Lavar 3 veces las ceacutelulas agregar suero de Coombscentrifugar 30 seg

Leer aglutinaciones y anotar resultados

REACTIVOS UTILIZADOS

REACTIVO MARCA FECHA DECADUCIDAD

ASPECTO COLOR LOTE

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SueroAntiglobuina

humana

Lafon 31 01 2009 Transparente Verde 406

LISS Caserorealizado enCMNSIGLOXXI

1 antildeo Transparente Transparente

----------

PACIENTE ASCANIO MENDEZ JOSUE O (+)DONADOR 1 GARCIA CARBAJAL OSCAR O (+)DONADOR 2 GARCIA SUAREZ ORLANDO A (+)

RESULTADOS

INTERPRETACIOacuteN DE LOS RESULTADOS

La hemoacutelisis o la aglutinacioacuten representan un resultado positivo e indican lapresencia de una reaccioacuten antiacutegeno-anticuerpo Los resultados negativos no severa aglutinacioacuten o hemolisis

ESQUEMAS

CONCLUSIONES

Concluyo que la prueba de compatibilidad sanguiacutenea en su modalidad conliss ofrece mucha ventaja al ser al igual que otros reactivos unpotencializador de la reaccioacuten antiacutegeno-anticuerpo Esto permite queel operador o realizador de la prueba tenga mayor confianza y certezaen los resultados que obtenga

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Tubo Resultado

M1 NEGATIVOm1 NEGATIVO

M2 POSITIVO

M2 NEGATIVO

AUTOTES NEGATIVO

29

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PRACTICA 9INMUNOHEMATOLOGIA

DETERMINACION DE COOMBS DIRECTO

INTRODUCCIONPRUEBA DE COOMBS DIRECTA

El examen de Coombs directo se utiliza para detectar autoanticuerpos contralos propios gloacutebulos rojos (GR) de un individuo Es una prueba que sirve parademostrar el revestimiento de los eritrocitos in vivo (mientras los eritrocitosestaacuten circulando en el individuo) La prueba se realiza agregando directamenteel reactivo de Coombs a los eritrocitos previamente lavados para eliminar otras proteiacutenas no fijadas a el una prueba directa positiva significa que larelacioacuten antiacutegeno-anticuerpo ocurrioacute in vivo es decir que la fijacioacuten del

anticuerpo sobre el antiacutegeno se realizo en el organismo del individuo enestudio

Las indicaciones principales de esta prueba son diagnostico de enfermedadeshemoliacuteticas ictericia o anomaliacuteas en la apariencia de los gloacutebulos rojos bajo elmicroscopio ya que estos anticuerpos algunas veces destruyen los gloacutebulosrojos y causan anemia para investigar reacciones en transfusiones Parainvestigar la induccioacuten de drogas en ceacutelulas rojas sensibilizadas medicamentos(por ejemplo quinidina metildopa procainamida y otros) que pueden llevar a la produccioacuten de estos anticuerpos

OBJETIVO Determinar la presencia de anticuerpos en la superficie de losgloacutebulos rojos del individuo

MATERIAL

bull 10 Tubos de 1275

bull 10 Pipetas Pasteur

bull 1 Gradilla

bull 1 Bulbo

bull Papel Parafilm

bull Microcentriacutefuga

bull Bantildeo Mariacutea a 37degC

MUESTRA BIOLOGICA

Eritrocitos lavados de (3-5) del donador o pacienteREACTIVO

Suero de CoombsSuero anti-globulina humana Lafon Lote 406 Cad 310109 Color verde Aspecto transparente

TECNICA

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Colocar en un tubo de ensaye dos gotas de suero de Coombs mas una gota deglobulos rojos (3-5)Centrifugar a 1000 rpm durante 20 segDesprender el boton suavemente y buscar la presencia de aglutinacionRotular y enumerar 8 tubos de ensayes con las diferentes diluciones

(frac12frac1418)Enumerar 8 tubos mas del 1 al 8Agregar a cada tubo de las diluciones 10 gotas de solucion salina mas 10 gotasde suero de CoombsColocar Al primer tubo de la dilucion 1 gota de globulos rojos (3-5) mezclar completamente y agregar al tubo 1Centrifugar todos los tubos a 1000 rpm durante 20 seg

LECTURA

Aglutina- Prueba de Coombs directa es positiva

No aglutina- Prueba de Coombs directa es negativa

ESQUEMAS y RESULTADOS

CONCLUCION

He concluido que la prueba de Coombs directa es una prueba que se utiliza para medir

la presencia de anticuerpos en la superficie de los gloacutebulos rojos que se encuentran

circulando en el paciente y se realiza para investigar reacciones en transfusiones ademaacutes

sirve para la determinacioacuten de anemia hemoliacutetica autoinmune entre otras afecciones

Practica 10

IDENTIFICACION DE ANTICUERPOS IRREGULARES

Fundamento

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DILUCIONES

frac12 positiva

frac14 positiva

18 positiva

116 negativa

132 negativa

164 negativa

1128 negativa1256 negativa

31

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Los anticuerpos del sistema ABO aparecen una vez que elindividuo entra en contacto con el medio ambiente y en elcual se encuentran microorganismos como algunas bacteriascoliformes que contienen sustancias quiacutemicas en suestructura parecidas a las de este sistema Por anticuerpos

regulares debemos identificar a los que existen en todoslos individuos y que eacutestos tendraacuten durante toda su vida

Los anticuerpos irregulares son los que no estaacuten de esamanera aunque en el caso de los naturales no se conoce aciencia cierta queacute o coacutemo se induce su produccioacuten Losadquiridos se conocen tambieacuten como inmunes y son elresultado de la exposicioacuten a antiacutegenos desconocidos por elindividuo al momento de la transfusioacuten o en las mujerespor el embarazo estos anticuerpos son dirigidos contraantiacutegenos de sistemas diferentes al ABO

Los anticuerpos naturales regulares son preferentementeinmunoglobulinas M las cuales fijan de manera taneficiente el complemento que pueden provocar lisisintravascular y ocasionar insuficiencia renal o incluso lamuerte del paciente Los anticuerpos adquiridos o inmunesson generalmente inmunoglobulinas G las cuales producenhemoacutelisis extravascular en el bazo o en el hiacutegado mediantefagocitosis del complejo eritrocito maacutes anticuerpo

Los aloanticuerpos irregulares (adquiridos) maacutes comunes en

nuestra poblacioacuten son los que involucran a los sistemasMNSs P1 Kidd (Jka Jkb) Duffy (Fya Fyb) Kell Lewis yDiego

OBJETIVO identificacioacuten del anticuerpo irregular a traveacutesde las diferentes teacutecnicas

MATERIAL

bull 10 Tubos de ensaye

bull 10 Pipetas Pasteur

bull

1Gradillabull 1 Bulbo

bull Papel Parafim

MATERIAL BIOLOGICO

bull Gloacutebulos rojos lavados al 3 - 5

bull Suero

bull REACTIVOSReactivos

1 Suero de Coombs2 Albuacutemina bovina

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bull EQUIPO1 Microcentriacutefuga2 Bantildeo Mariacutea oacute Estufa

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3 SOLUCION SALINA4 SOLUCION DE LISS

TEacuteCNICA SOLUCION SALINA

Lavar los eritrocitos con solucioacuten salina (3veces)SALINA RAacutePIDA

Agregar una gota de Eritrocitos LavadosDiluiacuterlo al 3-5 con solucioacuten salina 09Agregar 2 gotas de sueroCentrifugar y observar anotar desprendimientodel botoacuten

SALINA 37deg BANtildeO MARIacuteA1) Incubar tubos a Bantildeo mariacutea a 37degC durante 1

hora (o 20 min)

2) Centirfugar despueacutes de haber pasado eltiempo

3) Desprender el botoacuten de eritrocitos yobservar

AGLUTINACIOacuteNndash No es compatibleNO AGLUTINACIOacuteN - Lavar 3 veces

SALINA COOMBS1) Con solucioacuten salina 09 lavar los

eritrocitos de los tubos q no tuvieronaglutinacioacuten 3 veces

2) Decantar y agregar 2 gotas de reactivode Coombs

AGLUTINACIOacuteN ndash No es compatibleNO AGLUTINACIOacuteN - Lavar 3 veces

TECNICA LISS

1 Poner dos gotas de LISS en cada tubo agregar una gotade eritrocitos lavados y al 3 - 5 seguacuten el nuacutemero detubo correspondiente

2 Mezclar y centrifugar un minuto decantar el

sobrenadante y con la ayuda de una gasa limpiar elexceso del reactivo

3 Poner nuevamente 2 gota de LISS resuspender poragitacioacuten agregar 2 gotas de suero problema mezclarincubar 15 minutos a 37ordm C centrifugar 30 seg A 1000RPM

4 Anotar los resultados

A las pruebas negativas realizar Coombs

1 Lavar 3 veces las ceacutelulas agregar suero de Coombs

centrifugar 30 seg2 Leer aglutinaciones y anotar resultados

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TECNICA ALBUMINA BOVINA 8 Agregar 2 gotas de albuacutemina al 229 Centrifugar 20 segundos10observar aglutinacioacuten o hemolisis o no aglutinacioacuten

11A los tubos con lecturas negativas incubar 20minutos en bantildeo Mariacutea a 37 degC12Centrifugar y observar

bull Aglutinacioacuten o hemoacutelisis reportar incompatible

bull No aglutinacioacuten llevar a Coombs

13Lavar tres veces decantar y quitar el exceso desalina con gasa y agregar 2 gotas de reactivo deCoombs y centrifugar 20 segundos y observar

bull Aglutinacioacuten o hemoacutelisis reportar incompatible

bull No aglutinacioacuten reportar compatible

Resultados ANTICUERPO IRREGULAR Anticuerpo c

InterpretacioacutenEstos anticuerpos son generalmente inmunoglobulinas tipo My ocasionalmente tipo G y debido a esa temperatura dereaccioacuten carecen de importancia cliacutenica salvo que sureaccioacuten ocurra tambieacuten a 37 degC su importancia radica enpacientes que seraacuten intervenido a 22 ordmc como es el caso de

operacioacuten de corazoacuten

Los llamados anticuerpos calientes tienen una temperatura oacuteptima dereaccioacuten a 37 degC a Estos anticuerpos tienen una relevanteimportancia cliacutenica ya que se les asocia con reaccionestransfusionales de intensidad moderada a severa que puedenocasionar la muerte

Esquemas

CONCLUSIONHe concluido que es importante determinar los anticuerposirregulares ya que estos anticuerpos tienen una relevanteimportancia cliacutenica ya que se les asocia con reaccionestransfusionales de intensidad moderada a severa

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INTERPRETACIOacuteN

PRUEBA POSITIVA Existe una aglutinacioacuten de lasceacutelulas sanguiacuteneas que indica la presencia delantiacutegeno A o B En el suero de Coombs notamos si esta

la precencia de Antiacutegeno D en los eritrocitos Lahemoacutelisis no se debe interpretar como resultadopositivo ya que puede indicar contaminacioacuten delreactivo

PRUEBA NEGATIVA La no aglutinacioacuten indica unresultado negativo e indica que las ceacutelulas sonnegativas para Antiacutegenos del sisitema ABO y D

CONCLUSIOacuteN

He concluido que en las transfusiones de sangre no essuficiente con conocer que la sangre del donante y la delreceptor son del mismo grupo o bien que la del donantepertenezca al grupo O (cero) sino que es necesarioconocer si la compatibilidad es perfecta porque ninguacutenotro fenoacutemeno de inmunizacioacuten interfiera Es en estesentido por lo que son empleadas las pruebas cruzadas

Praacutectica No 7ldquoPrueba de compatibilidad sanguiacutenea (teacutecnica albumina)rdquo

IntroduccioacutenLa tipificacioacuten de sangre identifica el tipo sanguiacuteneo determinandoantiacutegenos presentes en los eritrocitos detecta aloanticuerpos encontra esos antiacutegenos Asiacute los aloanticuerpos pueden aparecernaturalmente o ser inducidos y pueden ser dirigidos contra del grupoconocido o a los antiacutegenos de superficie de los eritrocitos La prueba

de compatibilidad sanguiacutenea o cross matching esta formada por laprueba mayor y menorLa prueba de cruzamiento mayor para losaloanticuerpos consiste en probar el plasma del receptor contra los

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gloacutebulos rojos del donante Es incompatible cuando se genera unareaccioacuten hemoliacutetica los eritrocitos del donante se destruyen por losaloanticuerpos del plasma del receptor La prueba menor es una pruebapara los aloanticuerpos del plasma del donante en contra los gloacutebulosrojos del receptor Una incompatibilidad menor es una causa menosfrecuente para causar una reaccioacuten en contra una transfusioacuten porque

el volumen de plasma del donante es menor y es diluido marcadamente enel receptor Para llevar a cabo dicho procedimiento se utilizandiversos reactivos como potencializadores que mejoran la unioacuten deeritrocitos con alguacuten tipo de anticuerpo Uno de esospotencializadores es la albuacutemina La albumina bovina polimerizada esun reactivo muy utilizado en el laboratorio de inmunohematologia y encentros de bancos de sangre funciona como un potencializador quefacilita la reaccion de aglutinacioacuten de eritrocitos sensibilizados Alfinal de la prueba se prueban los eritrocitos con el reactivo deCoombs El principio de la prueba de Coombs fue descrito por Moreschien 1908 pero Coombs Mourant y Race en 1946 la introdujeron en elestudio de los grupos sanguiacuteneos y anticuerpos cuando una parte desangre (suero) fue usada para la inoculacioacuten de animales para

inmunizarlos con proteiacutena humana utilizando el anticuerpo obtenido enla deteccioacuten de los llamados anticuerpos incompletos Esta prueba seusa para determinar la presencia de anticuerpos no aglutinantes en elsuero de sujetos sensibilizados a uno o mas antiacutegenos sanguiacuteneos Esuacutetil en el estudio del suero de mujeres con isoinmunizacioacuten materno-fetal y se emplea tambieacuten en otro tipo de pruebas como identificacioacutende anticuerpos autoinmunes deteccioacuten de algunos sistemas sanguiacuteneos ypruebas de compatibilidad sanguiacutenea La prueba indirecta se realizacon eritrocitos normales incubados in Vitro con el suero de estudioDurante este periodo si existe un anticuerpo este se fija sobre surespectivo determinante antigeacutenico Una vez fijados los eritrocitosson igualmente lavados y se agrega el reactivo de Coombs produciendoaglutinacioacuten Una prueba de Coombs indirecta positiva significa que

existen anticuerpos libres en el suero de la persona los cualespuedan ser igualmente auto-anticuerpos o isoanticuerpos

Objetivo Determinacioacuten de los antiacutegenos del sistema ABO Rh (D) y sucompatibilidad entre un paciente Donador y un Paciente Receptor

Material y equipo

5 Tubos de ensaye

6 Pipetas Pasteur

1Gradilla

1 Bulbo

Papel Parafilm

Microcentriacutefuga

Bantildeo Mariacutea oacute Estufa

Material bioloacutegico

Muestras de sangre de extraccioacuten reciente recogida conanticoagulante o sin anticoagulante

ReactivosSuero de CoombsAlbuacutemina bovina deg

Suero anti-globulina humana Lafon Lote 406 Cad 310109 Color verde Aspecto

transparentedegAlbumina de bovino polimerizada Interbiol Lote APO107 Cad 150109 Color incoloroAspecto transparente

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Teacutecnica

1 Montar prueba mayor 1 y 2 prueba menor 1 y 2 y autotestigocon el procedimiento ya anteriormente conocido

2 Agregar 2 gotas de albuacutemina al 223 Centrifugar 20 segundos4 observar aglutinacioacuten o hemolisis o no aglutinacioacuten5 A los tubos con lecturas negativas incubar 20 minutos en bantildeo

Mariacutea a 37 degC6 Centrifugar y observar

bull Aglutinacioacuten o hemoacutelisis reportar incompatible

bull No aglutinacioacuten llevar a Coombs

7 Lavar tres veces decantar y quitar el exceso de salina congasa y agregar 2 gotas de reactivo de Coombs y centrifugar 20segundos y observar

bull Aglutinacioacuten o hemoacutelisis reportar incompatible

bull No aglutinacioacuten reportar compatible

Resultados1 PRUEBA MAYOR 1 2 Gotas de suero del paciente + 1 gota de GR al 3-5 del

donador 12 PRUEBA MENOR 1 2 Gotas de suero del donador 1 + 1 gota de GR al 3-5 del

paciente3 PRUEBA MAYOR 2 2 Gotas de suero del paciente + 1 gota de GR al 3-5 del

donador 24 PRUEBA MENOR 2 2 Gotas de suero del donador 2 + 1 gota de GR al 3-5 del

paciente5 AUTOTESTIGO 2 Gotas de suero del paciente + 1 gota de GR al 3-5 del paciente

M1 m1 M2 m2 AutotestigoCon albuacutemina - - - - -Despueacutes de incubacioacuten a 37 degC - - - - -Despueacutes de Coombs - - - - -Despueacutes de validacioacuten con gloacutebulos

positivos+ + + + +

InterpretacioacutenPrueba positiva Alutinacioacuten o hemolisis Indica no compatibilidadPrueba negativaNo aglutinacioacuten Indica compatibilidad

Esquemas

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ConclusioacutenConcluyo que la prueba de compatibilidad sanguiacutenea en su modalidad conalbuacutemina bovina ofrece mucha ventaja al ser al igual que otrosreactivos un potencializador de la reaccioacuten antiacutegeno-anticuerpo Estopermite que el operador o realizador de la prueba tenga mayorconfianza y certeza en los resultados que obtenga

PRACTICA No 8PRUEBA DE COMPATIBILIDAD SANGUINEA PRUEBA DE LISS

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FUNDAMENTO

LISS es utilizado para reducir la fuerza ioacutenica del medio

de reaccioacuten en los procedimientos de deteccioacuten eidentificacioacuten de anticuerpos y en las pruebas decompatibilidad La presencia de este reactivo refuerza lainteraccioacuten antiacutegeno - anticuerpo durante la incubacioacuten

GENERALIDADESEl uso de solucioacuten salina de baja fuerza ioacutenica fuedescrito inicialmente en 1964 por Hughes-Jones y col y

Elliot y col pero en ese tiempo su uso era limitado yaque la concentracioacuten molar obtenida provocaba la hemoacutelisisde los eritrocitos suspendidos

En 1974 Low y Messeter describieron el uso rutinario de lasolucioacuten Liss de 003 M que lograba reducir el tiempo deincubacioacuten y no presentaba tendencia a la hemoacutelisis al sersuspendidos en salina a baja fuerza ioacutenica restableciendola presioacuten osmoacutetica de la solucioacuten mediante la adicioacuten deglicinaLas soluciones de baja fuerza ioacutenica son actualmente lasmaacutes utilizadas en inmunohematologiacutea provocando un aumentoen la velocidad de asociacioacuten entre antiacutegenos y anticuerpospermitiendo asiacute acortar el tiempo de incubacioacuten de 60minutos a 10-15 minutos sin sacrificar la sensibilidad delas mismas y sin costos elevadosSe ha observado que lasreacciones antiacutegeno-anticuerpo se ven potenciadas alreducir la fuerza ioacutenica del medio de reaccioacuten

La fuerza ioacutenica es uno de los factores maacutes importantes quedeterminan la tasa y la cantidad de captacioacuten deanticuerpos por parte de los eritrocitos El uso de mediosde reaccioacuten de baja fuerza ioacutenica permite disminuir eltiempo de incubacioacuten y potenciar las reacciones de losanticuerpos sin incrementar las reacciones inespeciacuteficas

Los iones Na+ y Cl- presentes en la solucioacuten salinafisioloacutegica se agrupan alrededor de las moleacuteculas deantiacutegeno y anticuerpo neutralizando sus cargas opuestas locual dificulta la unioacuten entre ellos Este efecto se reduceutilizando soluciones de baja fuerza ioacutenica y disminuyendode esta manera la incubacioacuten de las pruebas

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En esta etapa de sensibilizacioacuten las posibilidades deasociacioacuten pueden incrementarse mediante agitacioacutencentrifugacioacuten yo variacioacuten de la concentracioacuten delanticuerpo

Despueacutes de que el anticuerpo se ha fijado al antiacutegeno loseritrocitos sensibilizados deben unirse para dar lugar a laaglutinacioacuten visible esta red tambieacuten solidifica yestabiliza la reaccioacuten

En esta etapa la reaccioacuten depende de factores como lascaracteriacutesticas del anticuerpo localizacioacuten en la membranay nuacutemero de sitios antigeacutenicos fuerzas que mantienen ladistancia entre los eritrocitos

Las caracteriacutesticas del anticuerpo que deben considerarse

son el tamantildeo del anticuerpo involucrado y el nuacutemero desitios de combinacioacuten con el antiacutegeno Los anticuerpos IgMpueden establecer puentes entre los eritrocitos yaglutinarlos espontaacuteneamente en solucioacuten salina mientrasque los IgG no ya que las IgM pentameacutericas poseen 10sitios de combinacioacuten con el antiacutegeno y las IgG diacutemerossoacutelo dos sitios

Los eritrocitos tienen una carga neta negativa en susuperficie su interaccioacuten con los iones del medio alteraesta carga y producen una carga neta criacutetica denominada

potencial zeta y la reduccioacuten de dicha carga permite quelos eritrocitos se aproximen lo suficiente para que seanaglutinados por medio de los IgG que los sensibilizaron

Las soluciones de baja fuerza ionica empleadas en banco desangre tienen un pH entre 65 ndash 70 se recomienda unaosmolalidad de 270 ndash 305 mosmkg y una conductividad de 37mmcm El control diario implica el examen de su aparienciafiacutesica ausencia de turbidez particulas o sedimento asiacutecomo corroborar la capacidad para generar hemoacutelisiscrenacion o prueba de coombs positiva en eritrocitos

normales Cada lote nuevo se valora mediante el rastreo deun anticuerpo ya sea un anti- D un anti- jk anti- fy oanti- kell diluido se compara su capacidad de deteccioacutencontra un medio salino normal incubando 10min a 37ordmC enLISS debe poder rastrearse un anticuerpo en tanto que enmedio salino no

MATERIAL Y EQUIPO

Material Cantidad10 Tubos de ensayo de 12 x 75

1 Gradilla10 Pipetas pasteur

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1 Bulbo1 Marcador1 Microcentriacutefuga1 Bantildeo Mariacutea

MATERIAL BIOLOGICO

Gloacutebulos rojos lavados al 3 - 5Suero

REACTIVOS

Reactivo de LISSReactivo de Coombs

TECNICA1- Lavar los eritrocitos

Separar el suero del paquete de gloacutebulos rojos

Agregar cierta cantidad de eritrocitos a un tubo deensayo y agregarle solucioacuten salina

Centrifugar y decantar

Repetir este proceso 3 veces

2- Realizar la Prueba de LISS

Enumerar los tubos Poner dos gotas de LISS en cada tubo agregar una gota

de eritrocitos lavados y al 3 - 5 seguacuten el nuacutemero detubo correspondiente

Mezclar y centrifugar un minuto decantar elsobrenadante y con la ayuda de una gasa limpiar elexceso del reactivo

Poner nuevamente 2 gota de LISS resuspender poragitacioacuten agregar 2 gotas de suero problema mezclarincubar 15 minutos a 37ordm C centrifugar 30 seg A 1000

RPM Anotar los resultados

3- A las pruebas negativas realizar Coombs

Lavar 3 veces las ceacutelulas agregar suero de Coombscentrifugar 30 seg

Leer aglutinaciones y anotar resultados

REACTIVOS UTILIZADOS

REACTIVO MARCA FECHA DECADUCIDAD

ASPECTO COLOR LOTE

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SueroAntiglobuina

humana

Lafon 31 01 2009 Transparente Verde 406

LISS Caserorealizado enCMNSIGLOXXI

1 antildeo Transparente Transparente

----------

PACIENTE ASCANIO MENDEZ JOSUE O (+)DONADOR 1 GARCIA CARBAJAL OSCAR O (+)DONADOR 2 GARCIA SUAREZ ORLANDO A (+)

RESULTADOS

INTERPRETACIOacuteN DE LOS RESULTADOS

La hemoacutelisis o la aglutinacioacuten representan un resultado positivo e indican lapresencia de una reaccioacuten antiacutegeno-anticuerpo Los resultados negativos no severa aglutinacioacuten o hemolisis

ESQUEMAS

CONCLUSIONES

Concluyo que la prueba de compatibilidad sanguiacutenea en su modalidad conliss ofrece mucha ventaja al ser al igual que otros reactivos unpotencializador de la reaccioacuten antiacutegeno-anticuerpo Esto permite queel operador o realizador de la prueba tenga mayor confianza y certezaen los resultados que obtenga

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Tubo Resultado

M1 NEGATIVOm1 NEGATIVO

M2 POSITIVO

M2 NEGATIVO

AUTOTES NEGATIVO

29

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PRACTICA 9INMUNOHEMATOLOGIA

DETERMINACION DE COOMBS DIRECTO

INTRODUCCIONPRUEBA DE COOMBS DIRECTA

El examen de Coombs directo se utiliza para detectar autoanticuerpos contralos propios gloacutebulos rojos (GR) de un individuo Es una prueba que sirve parademostrar el revestimiento de los eritrocitos in vivo (mientras los eritrocitosestaacuten circulando en el individuo) La prueba se realiza agregando directamenteel reactivo de Coombs a los eritrocitos previamente lavados para eliminar otras proteiacutenas no fijadas a el una prueba directa positiva significa que larelacioacuten antiacutegeno-anticuerpo ocurrioacute in vivo es decir que la fijacioacuten del

anticuerpo sobre el antiacutegeno se realizo en el organismo del individuo enestudio

Las indicaciones principales de esta prueba son diagnostico de enfermedadeshemoliacuteticas ictericia o anomaliacuteas en la apariencia de los gloacutebulos rojos bajo elmicroscopio ya que estos anticuerpos algunas veces destruyen los gloacutebulosrojos y causan anemia para investigar reacciones en transfusiones Parainvestigar la induccioacuten de drogas en ceacutelulas rojas sensibilizadas medicamentos(por ejemplo quinidina metildopa procainamida y otros) que pueden llevar a la produccioacuten de estos anticuerpos

OBJETIVO Determinar la presencia de anticuerpos en la superficie de losgloacutebulos rojos del individuo

MATERIAL

bull 10 Tubos de 1275

bull 10 Pipetas Pasteur

bull 1 Gradilla

bull 1 Bulbo

bull Papel Parafilm

bull Microcentriacutefuga

bull Bantildeo Mariacutea a 37degC

MUESTRA BIOLOGICA

Eritrocitos lavados de (3-5) del donador o pacienteREACTIVO

Suero de CoombsSuero anti-globulina humana Lafon Lote 406 Cad 310109 Color verde Aspecto transparente

TECNICA

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Colocar en un tubo de ensaye dos gotas de suero de Coombs mas una gota deglobulos rojos (3-5)Centrifugar a 1000 rpm durante 20 segDesprender el boton suavemente y buscar la presencia de aglutinacionRotular y enumerar 8 tubos de ensayes con las diferentes diluciones

(frac12frac1418)Enumerar 8 tubos mas del 1 al 8Agregar a cada tubo de las diluciones 10 gotas de solucion salina mas 10 gotasde suero de CoombsColocar Al primer tubo de la dilucion 1 gota de globulos rojos (3-5) mezclar completamente y agregar al tubo 1Centrifugar todos los tubos a 1000 rpm durante 20 seg

LECTURA

Aglutina- Prueba de Coombs directa es positiva

No aglutina- Prueba de Coombs directa es negativa

ESQUEMAS y RESULTADOS

CONCLUCION

He concluido que la prueba de Coombs directa es una prueba que se utiliza para medir

la presencia de anticuerpos en la superficie de los gloacutebulos rojos que se encuentran

circulando en el paciente y se realiza para investigar reacciones en transfusiones ademaacutes

sirve para la determinacioacuten de anemia hemoliacutetica autoinmune entre otras afecciones

Practica 10

IDENTIFICACION DE ANTICUERPOS IRREGULARES

Fundamento

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DILUCIONES

frac12 positiva

frac14 positiva

18 positiva

116 negativa

132 negativa

164 negativa

1128 negativa1256 negativa

31

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Los anticuerpos del sistema ABO aparecen una vez que elindividuo entra en contacto con el medio ambiente y en elcual se encuentran microorganismos como algunas bacteriascoliformes que contienen sustancias quiacutemicas en suestructura parecidas a las de este sistema Por anticuerpos

regulares debemos identificar a los que existen en todoslos individuos y que eacutestos tendraacuten durante toda su vida

Los anticuerpos irregulares son los que no estaacuten de esamanera aunque en el caso de los naturales no se conoce aciencia cierta queacute o coacutemo se induce su produccioacuten Losadquiridos se conocen tambieacuten como inmunes y son elresultado de la exposicioacuten a antiacutegenos desconocidos por elindividuo al momento de la transfusioacuten o en las mujerespor el embarazo estos anticuerpos son dirigidos contraantiacutegenos de sistemas diferentes al ABO

Los anticuerpos naturales regulares son preferentementeinmunoglobulinas M las cuales fijan de manera taneficiente el complemento que pueden provocar lisisintravascular y ocasionar insuficiencia renal o incluso lamuerte del paciente Los anticuerpos adquiridos o inmunesson generalmente inmunoglobulinas G las cuales producenhemoacutelisis extravascular en el bazo o en el hiacutegado mediantefagocitosis del complejo eritrocito maacutes anticuerpo

Los aloanticuerpos irregulares (adquiridos) maacutes comunes en

nuestra poblacioacuten son los que involucran a los sistemasMNSs P1 Kidd (Jka Jkb) Duffy (Fya Fyb) Kell Lewis yDiego

OBJETIVO identificacioacuten del anticuerpo irregular a traveacutesde las diferentes teacutecnicas

MATERIAL

bull 10 Tubos de ensaye

bull 10 Pipetas Pasteur

bull

1Gradillabull 1 Bulbo

bull Papel Parafim

MATERIAL BIOLOGICO

bull Gloacutebulos rojos lavados al 3 - 5

bull Suero

bull REACTIVOSReactivos

1 Suero de Coombs2 Albuacutemina bovina

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bull EQUIPO1 Microcentriacutefuga2 Bantildeo Mariacutea oacute Estufa

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3 SOLUCION SALINA4 SOLUCION DE LISS

TEacuteCNICA SOLUCION SALINA

Lavar los eritrocitos con solucioacuten salina (3veces)SALINA RAacutePIDA

Agregar una gota de Eritrocitos LavadosDiluiacuterlo al 3-5 con solucioacuten salina 09Agregar 2 gotas de sueroCentrifugar y observar anotar desprendimientodel botoacuten

SALINA 37deg BANtildeO MARIacuteA1) Incubar tubos a Bantildeo mariacutea a 37degC durante 1

hora (o 20 min)

2) Centirfugar despueacutes de haber pasado eltiempo

3) Desprender el botoacuten de eritrocitos yobservar

AGLUTINACIOacuteNndash No es compatibleNO AGLUTINACIOacuteN - Lavar 3 veces

SALINA COOMBS1) Con solucioacuten salina 09 lavar los

eritrocitos de los tubos q no tuvieronaglutinacioacuten 3 veces

2) Decantar y agregar 2 gotas de reactivode Coombs

AGLUTINACIOacuteN ndash No es compatibleNO AGLUTINACIOacuteN - Lavar 3 veces

TECNICA LISS

1 Poner dos gotas de LISS en cada tubo agregar una gotade eritrocitos lavados y al 3 - 5 seguacuten el nuacutemero detubo correspondiente

2 Mezclar y centrifugar un minuto decantar el

sobrenadante y con la ayuda de una gasa limpiar elexceso del reactivo

3 Poner nuevamente 2 gota de LISS resuspender poragitacioacuten agregar 2 gotas de suero problema mezclarincubar 15 minutos a 37ordm C centrifugar 30 seg A 1000RPM

4 Anotar los resultados

A las pruebas negativas realizar Coombs

1 Lavar 3 veces las ceacutelulas agregar suero de Coombs

centrifugar 30 seg2 Leer aglutinaciones y anotar resultados

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TECNICA ALBUMINA BOVINA 8 Agregar 2 gotas de albuacutemina al 229 Centrifugar 20 segundos10observar aglutinacioacuten o hemolisis o no aglutinacioacuten

11A los tubos con lecturas negativas incubar 20minutos en bantildeo Mariacutea a 37 degC12Centrifugar y observar

bull Aglutinacioacuten o hemoacutelisis reportar incompatible

bull No aglutinacioacuten llevar a Coombs

13Lavar tres veces decantar y quitar el exceso desalina con gasa y agregar 2 gotas de reactivo deCoombs y centrifugar 20 segundos y observar

bull Aglutinacioacuten o hemoacutelisis reportar incompatible

bull No aglutinacioacuten reportar compatible

Resultados ANTICUERPO IRREGULAR Anticuerpo c

InterpretacioacutenEstos anticuerpos son generalmente inmunoglobulinas tipo My ocasionalmente tipo G y debido a esa temperatura dereaccioacuten carecen de importancia cliacutenica salvo que sureaccioacuten ocurra tambieacuten a 37 degC su importancia radica enpacientes que seraacuten intervenido a 22 ordmc como es el caso de

operacioacuten de corazoacuten

Los llamados anticuerpos calientes tienen una temperatura oacuteptima dereaccioacuten a 37 degC a Estos anticuerpos tienen una relevanteimportancia cliacutenica ya que se les asocia con reaccionestransfusionales de intensidad moderada a severa que puedenocasionar la muerte

Esquemas

CONCLUSIONHe concluido que es importante determinar los anticuerposirregulares ya que estos anticuerpos tienen una relevanteimportancia cliacutenica ya que se les asocia con reaccionestransfusionales de intensidad moderada a severa

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gloacutebulos rojos del donante Es incompatible cuando se genera unareaccioacuten hemoliacutetica los eritrocitos del donante se destruyen por losaloanticuerpos del plasma del receptor La prueba menor es una pruebapara los aloanticuerpos del plasma del donante en contra los gloacutebulosrojos del receptor Una incompatibilidad menor es una causa menosfrecuente para causar una reaccioacuten en contra una transfusioacuten porque

el volumen de plasma del donante es menor y es diluido marcadamente enel receptor Para llevar a cabo dicho procedimiento se utilizandiversos reactivos como potencializadores que mejoran la unioacuten deeritrocitos con alguacuten tipo de anticuerpo Uno de esospotencializadores es la albuacutemina La albumina bovina polimerizada esun reactivo muy utilizado en el laboratorio de inmunohematologia y encentros de bancos de sangre funciona como un potencializador quefacilita la reaccion de aglutinacioacuten de eritrocitos sensibilizados Alfinal de la prueba se prueban los eritrocitos con el reactivo deCoombs El principio de la prueba de Coombs fue descrito por Moreschien 1908 pero Coombs Mourant y Race en 1946 la introdujeron en elestudio de los grupos sanguiacuteneos y anticuerpos cuando una parte desangre (suero) fue usada para la inoculacioacuten de animales para

inmunizarlos con proteiacutena humana utilizando el anticuerpo obtenido enla deteccioacuten de los llamados anticuerpos incompletos Esta prueba seusa para determinar la presencia de anticuerpos no aglutinantes en elsuero de sujetos sensibilizados a uno o mas antiacutegenos sanguiacuteneos Esuacutetil en el estudio del suero de mujeres con isoinmunizacioacuten materno-fetal y se emplea tambieacuten en otro tipo de pruebas como identificacioacutende anticuerpos autoinmunes deteccioacuten de algunos sistemas sanguiacuteneos ypruebas de compatibilidad sanguiacutenea La prueba indirecta se realizacon eritrocitos normales incubados in Vitro con el suero de estudioDurante este periodo si existe un anticuerpo este se fija sobre surespectivo determinante antigeacutenico Una vez fijados los eritrocitosson igualmente lavados y se agrega el reactivo de Coombs produciendoaglutinacioacuten Una prueba de Coombs indirecta positiva significa que

existen anticuerpos libres en el suero de la persona los cualespuedan ser igualmente auto-anticuerpos o isoanticuerpos

Objetivo Determinacioacuten de los antiacutegenos del sistema ABO Rh (D) y sucompatibilidad entre un paciente Donador y un Paciente Receptor

Material y equipo

5 Tubos de ensaye

6 Pipetas Pasteur

1Gradilla

1 Bulbo

Papel Parafilm

Microcentriacutefuga

Bantildeo Mariacutea oacute Estufa

Material bioloacutegico

Muestras de sangre de extraccioacuten reciente recogida conanticoagulante o sin anticoagulante

ReactivosSuero de CoombsAlbuacutemina bovina deg

Suero anti-globulina humana Lafon Lote 406 Cad 310109 Color verde Aspecto

transparentedegAlbumina de bovino polimerizada Interbiol Lote APO107 Cad 150109 Color incoloroAspecto transparente

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Teacutecnica

1 Montar prueba mayor 1 y 2 prueba menor 1 y 2 y autotestigocon el procedimiento ya anteriormente conocido

2 Agregar 2 gotas de albuacutemina al 223 Centrifugar 20 segundos4 observar aglutinacioacuten o hemolisis o no aglutinacioacuten5 A los tubos con lecturas negativas incubar 20 minutos en bantildeo

Mariacutea a 37 degC6 Centrifugar y observar

bull Aglutinacioacuten o hemoacutelisis reportar incompatible

bull No aglutinacioacuten llevar a Coombs

7 Lavar tres veces decantar y quitar el exceso de salina congasa y agregar 2 gotas de reactivo de Coombs y centrifugar 20segundos y observar

bull Aglutinacioacuten o hemoacutelisis reportar incompatible

bull No aglutinacioacuten reportar compatible

Resultados1 PRUEBA MAYOR 1 2 Gotas de suero del paciente + 1 gota de GR al 3-5 del

donador 12 PRUEBA MENOR 1 2 Gotas de suero del donador 1 + 1 gota de GR al 3-5 del

paciente3 PRUEBA MAYOR 2 2 Gotas de suero del paciente + 1 gota de GR al 3-5 del

donador 24 PRUEBA MENOR 2 2 Gotas de suero del donador 2 + 1 gota de GR al 3-5 del

paciente5 AUTOTESTIGO 2 Gotas de suero del paciente + 1 gota de GR al 3-5 del paciente

M1 m1 M2 m2 AutotestigoCon albuacutemina - - - - -Despueacutes de incubacioacuten a 37 degC - - - - -Despueacutes de Coombs - - - - -Despueacutes de validacioacuten con gloacutebulos

positivos+ + + + +

InterpretacioacutenPrueba positiva Alutinacioacuten o hemolisis Indica no compatibilidadPrueba negativaNo aglutinacioacuten Indica compatibilidad

Esquemas

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ConclusioacutenConcluyo que la prueba de compatibilidad sanguiacutenea en su modalidad conalbuacutemina bovina ofrece mucha ventaja al ser al igual que otrosreactivos un potencializador de la reaccioacuten antiacutegeno-anticuerpo Estopermite que el operador o realizador de la prueba tenga mayorconfianza y certeza en los resultados que obtenga

PRACTICA No 8PRUEBA DE COMPATIBILIDAD SANGUINEA PRUEBA DE LISS

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FUNDAMENTO

LISS es utilizado para reducir la fuerza ioacutenica del medio

de reaccioacuten en los procedimientos de deteccioacuten eidentificacioacuten de anticuerpos y en las pruebas decompatibilidad La presencia de este reactivo refuerza lainteraccioacuten antiacutegeno - anticuerpo durante la incubacioacuten

GENERALIDADESEl uso de solucioacuten salina de baja fuerza ioacutenica fuedescrito inicialmente en 1964 por Hughes-Jones y col y

Elliot y col pero en ese tiempo su uso era limitado yaque la concentracioacuten molar obtenida provocaba la hemoacutelisisde los eritrocitos suspendidos

En 1974 Low y Messeter describieron el uso rutinario de lasolucioacuten Liss de 003 M que lograba reducir el tiempo deincubacioacuten y no presentaba tendencia a la hemoacutelisis al sersuspendidos en salina a baja fuerza ioacutenica restableciendola presioacuten osmoacutetica de la solucioacuten mediante la adicioacuten deglicinaLas soluciones de baja fuerza ioacutenica son actualmente lasmaacutes utilizadas en inmunohematologiacutea provocando un aumentoen la velocidad de asociacioacuten entre antiacutegenos y anticuerpospermitiendo asiacute acortar el tiempo de incubacioacuten de 60minutos a 10-15 minutos sin sacrificar la sensibilidad delas mismas y sin costos elevadosSe ha observado que lasreacciones antiacutegeno-anticuerpo se ven potenciadas alreducir la fuerza ioacutenica del medio de reaccioacuten

La fuerza ioacutenica es uno de los factores maacutes importantes quedeterminan la tasa y la cantidad de captacioacuten deanticuerpos por parte de los eritrocitos El uso de mediosde reaccioacuten de baja fuerza ioacutenica permite disminuir eltiempo de incubacioacuten y potenciar las reacciones de losanticuerpos sin incrementar las reacciones inespeciacuteficas

Los iones Na+ y Cl- presentes en la solucioacuten salinafisioloacutegica se agrupan alrededor de las moleacuteculas deantiacutegeno y anticuerpo neutralizando sus cargas opuestas locual dificulta la unioacuten entre ellos Este efecto se reduceutilizando soluciones de baja fuerza ioacutenica y disminuyendode esta manera la incubacioacuten de las pruebas

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En esta etapa de sensibilizacioacuten las posibilidades deasociacioacuten pueden incrementarse mediante agitacioacutencentrifugacioacuten yo variacioacuten de la concentracioacuten delanticuerpo

Despueacutes de que el anticuerpo se ha fijado al antiacutegeno loseritrocitos sensibilizados deben unirse para dar lugar a laaglutinacioacuten visible esta red tambieacuten solidifica yestabiliza la reaccioacuten

En esta etapa la reaccioacuten depende de factores como lascaracteriacutesticas del anticuerpo localizacioacuten en la membranay nuacutemero de sitios antigeacutenicos fuerzas que mantienen ladistancia entre los eritrocitos

Las caracteriacutesticas del anticuerpo que deben considerarse

son el tamantildeo del anticuerpo involucrado y el nuacutemero desitios de combinacioacuten con el antiacutegeno Los anticuerpos IgMpueden establecer puentes entre los eritrocitos yaglutinarlos espontaacuteneamente en solucioacuten salina mientrasque los IgG no ya que las IgM pentameacutericas poseen 10sitios de combinacioacuten con el antiacutegeno y las IgG diacutemerossoacutelo dos sitios

Los eritrocitos tienen una carga neta negativa en susuperficie su interaccioacuten con los iones del medio alteraesta carga y producen una carga neta criacutetica denominada

potencial zeta y la reduccioacuten de dicha carga permite quelos eritrocitos se aproximen lo suficiente para que seanaglutinados por medio de los IgG que los sensibilizaron

Las soluciones de baja fuerza ionica empleadas en banco desangre tienen un pH entre 65 ndash 70 se recomienda unaosmolalidad de 270 ndash 305 mosmkg y una conductividad de 37mmcm El control diario implica el examen de su aparienciafiacutesica ausencia de turbidez particulas o sedimento asiacutecomo corroborar la capacidad para generar hemoacutelisiscrenacion o prueba de coombs positiva en eritrocitos

normales Cada lote nuevo se valora mediante el rastreo deun anticuerpo ya sea un anti- D un anti- jk anti- fy oanti- kell diluido se compara su capacidad de deteccioacutencontra un medio salino normal incubando 10min a 37ordmC enLISS debe poder rastrearse un anticuerpo en tanto que enmedio salino no

MATERIAL Y EQUIPO

Material Cantidad10 Tubos de ensayo de 12 x 75

1 Gradilla10 Pipetas pasteur

OBTENIDO DE wwwquimicaclinicauvblogspotcom 27

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1 Bulbo1 Marcador1 Microcentriacutefuga1 Bantildeo Mariacutea

MATERIAL BIOLOGICO

Gloacutebulos rojos lavados al 3 - 5Suero

REACTIVOS

Reactivo de LISSReactivo de Coombs

TECNICA1- Lavar los eritrocitos

Separar el suero del paquete de gloacutebulos rojos

Agregar cierta cantidad de eritrocitos a un tubo deensayo y agregarle solucioacuten salina

Centrifugar y decantar

Repetir este proceso 3 veces

2- Realizar la Prueba de LISS

Enumerar los tubos Poner dos gotas de LISS en cada tubo agregar una gota

de eritrocitos lavados y al 3 - 5 seguacuten el nuacutemero detubo correspondiente

Mezclar y centrifugar un minuto decantar elsobrenadante y con la ayuda de una gasa limpiar elexceso del reactivo

Poner nuevamente 2 gota de LISS resuspender poragitacioacuten agregar 2 gotas de suero problema mezclarincubar 15 minutos a 37ordm C centrifugar 30 seg A 1000

RPM Anotar los resultados

3- A las pruebas negativas realizar Coombs

Lavar 3 veces las ceacutelulas agregar suero de Coombscentrifugar 30 seg

Leer aglutinaciones y anotar resultados

REACTIVOS UTILIZADOS

REACTIVO MARCA FECHA DECADUCIDAD

ASPECTO COLOR LOTE

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SueroAntiglobuina

humana

Lafon 31 01 2009 Transparente Verde 406

LISS Caserorealizado enCMNSIGLOXXI

1 antildeo Transparente Transparente

----------

PACIENTE ASCANIO MENDEZ JOSUE O (+)DONADOR 1 GARCIA CARBAJAL OSCAR O (+)DONADOR 2 GARCIA SUAREZ ORLANDO A (+)

RESULTADOS

INTERPRETACIOacuteN DE LOS RESULTADOS

La hemoacutelisis o la aglutinacioacuten representan un resultado positivo e indican lapresencia de una reaccioacuten antiacutegeno-anticuerpo Los resultados negativos no severa aglutinacioacuten o hemolisis

ESQUEMAS

CONCLUSIONES

Concluyo que la prueba de compatibilidad sanguiacutenea en su modalidad conliss ofrece mucha ventaja al ser al igual que otros reactivos unpotencializador de la reaccioacuten antiacutegeno-anticuerpo Esto permite queel operador o realizador de la prueba tenga mayor confianza y certezaen los resultados que obtenga

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Tubo Resultado

M1 NEGATIVOm1 NEGATIVO

M2 POSITIVO

M2 NEGATIVO

AUTOTES NEGATIVO

29

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PRACTICA 9INMUNOHEMATOLOGIA

DETERMINACION DE COOMBS DIRECTO

INTRODUCCIONPRUEBA DE COOMBS DIRECTA

El examen de Coombs directo se utiliza para detectar autoanticuerpos contralos propios gloacutebulos rojos (GR) de un individuo Es una prueba que sirve parademostrar el revestimiento de los eritrocitos in vivo (mientras los eritrocitosestaacuten circulando en el individuo) La prueba se realiza agregando directamenteel reactivo de Coombs a los eritrocitos previamente lavados para eliminar otras proteiacutenas no fijadas a el una prueba directa positiva significa que larelacioacuten antiacutegeno-anticuerpo ocurrioacute in vivo es decir que la fijacioacuten del

anticuerpo sobre el antiacutegeno se realizo en el organismo del individuo enestudio

Las indicaciones principales de esta prueba son diagnostico de enfermedadeshemoliacuteticas ictericia o anomaliacuteas en la apariencia de los gloacutebulos rojos bajo elmicroscopio ya que estos anticuerpos algunas veces destruyen los gloacutebulosrojos y causan anemia para investigar reacciones en transfusiones Parainvestigar la induccioacuten de drogas en ceacutelulas rojas sensibilizadas medicamentos(por ejemplo quinidina metildopa procainamida y otros) que pueden llevar a la produccioacuten de estos anticuerpos

OBJETIVO Determinar la presencia de anticuerpos en la superficie de losgloacutebulos rojos del individuo

MATERIAL

bull 10 Tubos de 1275

bull 10 Pipetas Pasteur

bull 1 Gradilla

bull 1 Bulbo

bull Papel Parafilm

bull Microcentriacutefuga

bull Bantildeo Mariacutea a 37degC

MUESTRA BIOLOGICA

Eritrocitos lavados de (3-5) del donador o pacienteREACTIVO

Suero de CoombsSuero anti-globulina humana Lafon Lote 406 Cad 310109 Color verde Aspecto transparente

TECNICA

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Colocar en un tubo de ensaye dos gotas de suero de Coombs mas una gota deglobulos rojos (3-5)Centrifugar a 1000 rpm durante 20 segDesprender el boton suavemente y buscar la presencia de aglutinacionRotular y enumerar 8 tubos de ensayes con las diferentes diluciones

(frac12frac1418)Enumerar 8 tubos mas del 1 al 8Agregar a cada tubo de las diluciones 10 gotas de solucion salina mas 10 gotasde suero de CoombsColocar Al primer tubo de la dilucion 1 gota de globulos rojos (3-5) mezclar completamente y agregar al tubo 1Centrifugar todos los tubos a 1000 rpm durante 20 seg

LECTURA

Aglutina- Prueba de Coombs directa es positiva

No aglutina- Prueba de Coombs directa es negativa

ESQUEMAS y RESULTADOS

CONCLUCION

He concluido que la prueba de Coombs directa es una prueba que se utiliza para medir

la presencia de anticuerpos en la superficie de los gloacutebulos rojos que se encuentran

circulando en el paciente y se realiza para investigar reacciones en transfusiones ademaacutes

sirve para la determinacioacuten de anemia hemoliacutetica autoinmune entre otras afecciones

Practica 10

IDENTIFICACION DE ANTICUERPOS IRREGULARES

Fundamento

OBTENIDO DE wwwquimicaclinicauvblogspotcom

DILUCIONES

frac12 positiva

frac14 positiva

18 positiva

116 negativa

132 negativa

164 negativa

1128 negativa1256 negativa

31

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Los anticuerpos del sistema ABO aparecen una vez que elindividuo entra en contacto con el medio ambiente y en elcual se encuentran microorganismos como algunas bacteriascoliformes que contienen sustancias quiacutemicas en suestructura parecidas a las de este sistema Por anticuerpos

regulares debemos identificar a los que existen en todoslos individuos y que eacutestos tendraacuten durante toda su vida

Los anticuerpos irregulares son los que no estaacuten de esamanera aunque en el caso de los naturales no se conoce aciencia cierta queacute o coacutemo se induce su produccioacuten Losadquiridos se conocen tambieacuten como inmunes y son elresultado de la exposicioacuten a antiacutegenos desconocidos por elindividuo al momento de la transfusioacuten o en las mujerespor el embarazo estos anticuerpos son dirigidos contraantiacutegenos de sistemas diferentes al ABO

Los anticuerpos naturales regulares son preferentementeinmunoglobulinas M las cuales fijan de manera taneficiente el complemento que pueden provocar lisisintravascular y ocasionar insuficiencia renal o incluso lamuerte del paciente Los anticuerpos adquiridos o inmunesson generalmente inmunoglobulinas G las cuales producenhemoacutelisis extravascular en el bazo o en el hiacutegado mediantefagocitosis del complejo eritrocito maacutes anticuerpo

Los aloanticuerpos irregulares (adquiridos) maacutes comunes en

nuestra poblacioacuten son los que involucran a los sistemasMNSs P1 Kidd (Jka Jkb) Duffy (Fya Fyb) Kell Lewis yDiego

OBJETIVO identificacioacuten del anticuerpo irregular a traveacutesde las diferentes teacutecnicas

MATERIAL

bull 10 Tubos de ensaye

bull 10 Pipetas Pasteur

bull

1Gradillabull 1 Bulbo

bull Papel Parafim

MATERIAL BIOLOGICO

bull Gloacutebulos rojos lavados al 3 - 5

bull Suero

bull REACTIVOSReactivos

1 Suero de Coombs2 Albuacutemina bovina

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bull EQUIPO1 Microcentriacutefuga2 Bantildeo Mariacutea oacute Estufa

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3 SOLUCION SALINA4 SOLUCION DE LISS

TEacuteCNICA SOLUCION SALINA

Lavar los eritrocitos con solucioacuten salina (3veces)SALINA RAacutePIDA

Agregar una gota de Eritrocitos LavadosDiluiacuterlo al 3-5 con solucioacuten salina 09Agregar 2 gotas de sueroCentrifugar y observar anotar desprendimientodel botoacuten

SALINA 37deg BANtildeO MARIacuteA1) Incubar tubos a Bantildeo mariacutea a 37degC durante 1

hora (o 20 min)

2) Centirfugar despueacutes de haber pasado eltiempo

3) Desprender el botoacuten de eritrocitos yobservar

AGLUTINACIOacuteNndash No es compatibleNO AGLUTINACIOacuteN - Lavar 3 veces

SALINA COOMBS1) Con solucioacuten salina 09 lavar los

eritrocitos de los tubos q no tuvieronaglutinacioacuten 3 veces

2) Decantar y agregar 2 gotas de reactivode Coombs

AGLUTINACIOacuteN ndash No es compatibleNO AGLUTINACIOacuteN - Lavar 3 veces

TECNICA LISS

1 Poner dos gotas de LISS en cada tubo agregar una gotade eritrocitos lavados y al 3 - 5 seguacuten el nuacutemero detubo correspondiente

2 Mezclar y centrifugar un minuto decantar el

sobrenadante y con la ayuda de una gasa limpiar elexceso del reactivo

3 Poner nuevamente 2 gota de LISS resuspender poragitacioacuten agregar 2 gotas de suero problema mezclarincubar 15 minutos a 37ordm C centrifugar 30 seg A 1000RPM

4 Anotar los resultados

A las pruebas negativas realizar Coombs

1 Lavar 3 veces las ceacutelulas agregar suero de Coombs

centrifugar 30 seg2 Leer aglutinaciones y anotar resultados

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TECNICA ALBUMINA BOVINA 8 Agregar 2 gotas de albuacutemina al 229 Centrifugar 20 segundos10observar aglutinacioacuten o hemolisis o no aglutinacioacuten

11A los tubos con lecturas negativas incubar 20minutos en bantildeo Mariacutea a 37 degC12Centrifugar y observar

bull Aglutinacioacuten o hemoacutelisis reportar incompatible

bull No aglutinacioacuten llevar a Coombs

13Lavar tres veces decantar y quitar el exceso desalina con gasa y agregar 2 gotas de reactivo deCoombs y centrifugar 20 segundos y observar

bull Aglutinacioacuten o hemoacutelisis reportar incompatible

bull No aglutinacioacuten reportar compatible

Resultados ANTICUERPO IRREGULAR Anticuerpo c

InterpretacioacutenEstos anticuerpos son generalmente inmunoglobulinas tipo My ocasionalmente tipo G y debido a esa temperatura dereaccioacuten carecen de importancia cliacutenica salvo que sureaccioacuten ocurra tambieacuten a 37 degC su importancia radica enpacientes que seraacuten intervenido a 22 ordmc como es el caso de

operacioacuten de corazoacuten

Los llamados anticuerpos calientes tienen una temperatura oacuteptima dereaccioacuten a 37 degC a Estos anticuerpos tienen una relevanteimportancia cliacutenica ya que se les asocia con reaccionestransfusionales de intensidad moderada a severa que puedenocasionar la muerte

Esquemas

CONCLUSIONHe concluido que es importante determinar los anticuerposirregulares ya que estos anticuerpos tienen una relevanteimportancia cliacutenica ya que se les asocia con reaccionestransfusionales de intensidad moderada a severa

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Teacutecnica

1 Montar prueba mayor 1 y 2 prueba menor 1 y 2 y autotestigocon el procedimiento ya anteriormente conocido

2 Agregar 2 gotas de albuacutemina al 223 Centrifugar 20 segundos4 observar aglutinacioacuten o hemolisis o no aglutinacioacuten5 A los tubos con lecturas negativas incubar 20 minutos en bantildeo

Mariacutea a 37 degC6 Centrifugar y observar

bull Aglutinacioacuten o hemoacutelisis reportar incompatible

bull No aglutinacioacuten llevar a Coombs

7 Lavar tres veces decantar y quitar el exceso de salina congasa y agregar 2 gotas de reactivo de Coombs y centrifugar 20segundos y observar

bull Aglutinacioacuten o hemoacutelisis reportar incompatible

bull No aglutinacioacuten reportar compatible

Resultados1 PRUEBA MAYOR 1 2 Gotas de suero del paciente + 1 gota de GR al 3-5 del

donador 12 PRUEBA MENOR 1 2 Gotas de suero del donador 1 + 1 gota de GR al 3-5 del

paciente3 PRUEBA MAYOR 2 2 Gotas de suero del paciente + 1 gota de GR al 3-5 del

donador 24 PRUEBA MENOR 2 2 Gotas de suero del donador 2 + 1 gota de GR al 3-5 del

paciente5 AUTOTESTIGO 2 Gotas de suero del paciente + 1 gota de GR al 3-5 del paciente

M1 m1 M2 m2 AutotestigoCon albuacutemina - - - - -Despueacutes de incubacioacuten a 37 degC - - - - -Despueacutes de Coombs - - - - -Despueacutes de validacioacuten con gloacutebulos

positivos+ + + + +

InterpretacioacutenPrueba positiva Alutinacioacuten o hemolisis Indica no compatibilidadPrueba negativaNo aglutinacioacuten Indica compatibilidad

Esquemas

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ConclusioacutenConcluyo que la prueba de compatibilidad sanguiacutenea en su modalidad conalbuacutemina bovina ofrece mucha ventaja al ser al igual que otrosreactivos un potencializador de la reaccioacuten antiacutegeno-anticuerpo Estopermite que el operador o realizador de la prueba tenga mayorconfianza y certeza en los resultados que obtenga

PRACTICA No 8PRUEBA DE COMPATIBILIDAD SANGUINEA PRUEBA DE LISS

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FUNDAMENTO

LISS es utilizado para reducir la fuerza ioacutenica del medio

de reaccioacuten en los procedimientos de deteccioacuten eidentificacioacuten de anticuerpos y en las pruebas decompatibilidad La presencia de este reactivo refuerza lainteraccioacuten antiacutegeno - anticuerpo durante la incubacioacuten

GENERALIDADESEl uso de solucioacuten salina de baja fuerza ioacutenica fuedescrito inicialmente en 1964 por Hughes-Jones y col y

Elliot y col pero en ese tiempo su uso era limitado yaque la concentracioacuten molar obtenida provocaba la hemoacutelisisde los eritrocitos suspendidos

En 1974 Low y Messeter describieron el uso rutinario de lasolucioacuten Liss de 003 M que lograba reducir el tiempo deincubacioacuten y no presentaba tendencia a la hemoacutelisis al sersuspendidos en salina a baja fuerza ioacutenica restableciendola presioacuten osmoacutetica de la solucioacuten mediante la adicioacuten deglicinaLas soluciones de baja fuerza ioacutenica son actualmente lasmaacutes utilizadas en inmunohematologiacutea provocando un aumentoen la velocidad de asociacioacuten entre antiacutegenos y anticuerpospermitiendo asiacute acortar el tiempo de incubacioacuten de 60minutos a 10-15 minutos sin sacrificar la sensibilidad delas mismas y sin costos elevadosSe ha observado que lasreacciones antiacutegeno-anticuerpo se ven potenciadas alreducir la fuerza ioacutenica del medio de reaccioacuten

La fuerza ioacutenica es uno de los factores maacutes importantes quedeterminan la tasa y la cantidad de captacioacuten deanticuerpos por parte de los eritrocitos El uso de mediosde reaccioacuten de baja fuerza ioacutenica permite disminuir eltiempo de incubacioacuten y potenciar las reacciones de losanticuerpos sin incrementar las reacciones inespeciacuteficas

Los iones Na+ y Cl- presentes en la solucioacuten salinafisioloacutegica se agrupan alrededor de las moleacuteculas deantiacutegeno y anticuerpo neutralizando sus cargas opuestas locual dificulta la unioacuten entre ellos Este efecto se reduceutilizando soluciones de baja fuerza ioacutenica y disminuyendode esta manera la incubacioacuten de las pruebas

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En esta etapa de sensibilizacioacuten las posibilidades deasociacioacuten pueden incrementarse mediante agitacioacutencentrifugacioacuten yo variacioacuten de la concentracioacuten delanticuerpo

Despueacutes de que el anticuerpo se ha fijado al antiacutegeno loseritrocitos sensibilizados deben unirse para dar lugar a laaglutinacioacuten visible esta red tambieacuten solidifica yestabiliza la reaccioacuten

En esta etapa la reaccioacuten depende de factores como lascaracteriacutesticas del anticuerpo localizacioacuten en la membranay nuacutemero de sitios antigeacutenicos fuerzas que mantienen ladistancia entre los eritrocitos

Las caracteriacutesticas del anticuerpo que deben considerarse

son el tamantildeo del anticuerpo involucrado y el nuacutemero desitios de combinacioacuten con el antiacutegeno Los anticuerpos IgMpueden establecer puentes entre los eritrocitos yaglutinarlos espontaacuteneamente en solucioacuten salina mientrasque los IgG no ya que las IgM pentameacutericas poseen 10sitios de combinacioacuten con el antiacutegeno y las IgG diacutemerossoacutelo dos sitios

Los eritrocitos tienen una carga neta negativa en susuperficie su interaccioacuten con los iones del medio alteraesta carga y producen una carga neta criacutetica denominada

potencial zeta y la reduccioacuten de dicha carga permite quelos eritrocitos se aproximen lo suficiente para que seanaglutinados por medio de los IgG que los sensibilizaron

Las soluciones de baja fuerza ionica empleadas en banco desangre tienen un pH entre 65 ndash 70 se recomienda unaosmolalidad de 270 ndash 305 mosmkg y una conductividad de 37mmcm El control diario implica el examen de su aparienciafiacutesica ausencia de turbidez particulas o sedimento asiacutecomo corroborar la capacidad para generar hemoacutelisiscrenacion o prueba de coombs positiva en eritrocitos

normales Cada lote nuevo se valora mediante el rastreo deun anticuerpo ya sea un anti- D un anti- jk anti- fy oanti- kell diluido se compara su capacidad de deteccioacutencontra un medio salino normal incubando 10min a 37ordmC enLISS debe poder rastrearse un anticuerpo en tanto que enmedio salino no

MATERIAL Y EQUIPO

Material Cantidad10 Tubos de ensayo de 12 x 75

1 Gradilla10 Pipetas pasteur

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1 Bulbo1 Marcador1 Microcentriacutefuga1 Bantildeo Mariacutea

MATERIAL BIOLOGICO

Gloacutebulos rojos lavados al 3 - 5Suero

REACTIVOS

Reactivo de LISSReactivo de Coombs

TECNICA1- Lavar los eritrocitos

Separar el suero del paquete de gloacutebulos rojos

Agregar cierta cantidad de eritrocitos a un tubo deensayo y agregarle solucioacuten salina

Centrifugar y decantar

Repetir este proceso 3 veces

2- Realizar la Prueba de LISS

Enumerar los tubos Poner dos gotas de LISS en cada tubo agregar una gota

de eritrocitos lavados y al 3 - 5 seguacuten el nuacutemero detubo correspondiente

Mezclar y centrifugar un minuto decantar elsobrenadante y con la ayuda de una gasa limpiar elexceso del reactivo

Poner nuevamente 2 gota de LISS resuspender poragitacioacuten agregar 2 gotas de suero problema mezclarincubar 15 minutos a 37ordm C centrifugar 30 seg A 1000

RPM Anotar los resultados

3- A las pruebas negativas realizar Coombs

Lavar 3 veces las ceacutelulas agregar suero de Coombscentrifugar 30 seg

Leer aglutinaciones y anotar resultados

REACTIVOS UTILIZADOS

REACTIVO MARCA FECHA DECADUCIDAD

ASPECTO COLOR LOTE

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SueroAntiglobuina

humana

Lafon 31 01 2009 Transparente Verde 406

LISS Caserorealizado enCMNSIGLOXXI

1 antildeo Transparente Transparente

----------

PACIENTE ASCANIO MENDEZ JOSUE O (+)DONADOR 1 GARCIA CARBAJAL OSCAR O (+)DONADOR 2 GARCIA SUAREZ ORLANDO A (+)

RESULTADOS

INTERPRETACIOacuteN DE LOS RESULTADOS

La hemoacutelisis o la aglutinacioacuten representan un resultado positivo e indican lapresencia de una reaccioacuten antiacutegeno-anticuerpo Los resultados negativos no severa aglutinacioacuten o hemolisis

ESQUEMAS

CONCLUSIONES

Concluyo que la prueba de compatibilidad sanguiacutenea en su modalidad conliss ofrece mucha ventaja al ser al igual que otros reactivos unpotencializador de la reaccioacuten antiacutegeno-anticuerpo Esto permite queel operador o realizador de la prueba tenga mayor confianza y certezaen los resultados que obtenga

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Tubo Resultado

M1 NEGATIVOm1 NEGATIVO

M2 POSITIVO

M2 NEGATIVO

AUTOTES NEGATIVO

29

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PRACTICA 9INMUNOHEMATOLOGIA

DETERMINACION DE COOMBS DIRECTO

INTRODUCCIONPRUEBA DE COOMBS DIRECTA

El examen de Coombs directo se utiliza para detectar autoanticuerpos contralos propios gloacutebulos rojos (GR) de un individuo Es una prueba que sirve parademostrar el revestimiento de los eritrocitos in vivo (mientras los eritrocitosestaacuten circulando en el individuo) La prueba se realiza agregando directamenteel reactivo de Coombs a los eritrocitos previamente lavados para eliminar otras proteiacutenas no fijadas a el una prueba directa positiva significa que larelacioacuten antiacutegeno-anticuerpo ocurrioacute in vivo es decir que la fijacioacuten del

anticuerpo sobre el antiacutegeno se realizo en el organismo del individuo enestudio

Las indicaciones principales de esta prueba son diagnostico de enfermedadeshemoliacuteticas ictericia o anomaliacuteas en la apariencia de los gloacutebulos rojos bajo elmicroscopio ya que estos anticuerpos algunas veces destruyen los gloacutebulosrojos y causan anemia para investigar reacciones en transfusiones Parainvestigar la induccioacuten de drogas en ceacutelulas rojas sensibilizadas medicamentos(por ejemplo quinidina metildopa procainamida y otros) que pueden llevar a la produccioacuten de estos anticuerpos

OBJETIVO Determinar la presencia de anticuerpos en la superficie de losgloacutebulos rojos del individuo

MATERIAL

bull 10 Tubos de 1275

bull 10 Pipetas Pasteur

bull 1 Gradilla

bull 1 Bulbo

bull Papel Parafilm

bull Microcentriacutefuga

bull Bantildeo Mariacutea a 37degC

MUESTRA BIOLOGICA

Eritrocitos lavados de (3-5) del donador o pacienteREACTIVO

Suero de CoombsSuero anti-globulina humana Lafon Lote 406 Cad 310109 Color verde Aspecto transparente

TECNICA

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Colocar en un tubo de ensaye dos gotas de suero de Coombs mas una gota deglobulos rojos (3-5)Centrifugar a 1000 rpm durante 20 segDesprender el boton suavemente y buscar la presencia de aglutinacionRotular y enumerar 8 tubos de ensayes con las diferentes diluciones

(frac12frac1418)Enumerar 8 tubos mas del 1 al 8Agregar a cada tubo de las diluciones 10 gotas de solucion salina mas 10 gotasde suero de CoombsColocar Al primer tubo de la dilucion 1 gota de globulos rojos (3-5) mezclar completamente y agregar al tubo 1Centrifugar todos los tubos a 1000 rpm durante 20 seg

LECTURA

Aglutina- Prueba de Coombs directa es positiva

No aglutina- Prueba de Coombs directa es negativa

ESQUEMAS y RESULTADOS

CONCLUCION

He concluido que la prueba de Coombs directa es una prueba que se utiliza para medir

la presencia de anticuerpos en la superficie de los gloacutebulos rojos que se encuentran

circulando en el paciente y se realiza para investigar reacciones en transfusiones ademaacutes

sirve para la determinacioacuten de anemia hemoliacutetica autoinmune entre otras afecciones

Practica 10

IDENTIFICACION DE ANTICUERPOS IRREGULARES

Fundamento

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DILUCIONES

frac12 positiva

frac14 positiva

18 positiva

116 negativa

132 negativa

164 negativa

1128 negativa1256 negativa

31

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Los anticuerpos del sistema ABO aparecen una vez que elindividuo entra en contacto con el medio ambiente y en elcual se encuentran microorganismos como algunas bacteriascoliformes que contienen sustancias quiacutemicas en suestructura parecidas a las de este sistema Por anticuerpos

regulares debemos identificar a los que existen en todoslos individuos y que eacutestos tendraacuten durante toda su vida

Los anticuerpos irregulares son los que no estaacuten de esamanera aunque en el caso de los naturales no se conoce aciencia cierta queacute o coacutemo se induce su produccioacuten Losadquiridos se conocen tambieacuten como inmunes y son elresultado de la exposicioacuten a antiacutegenos desconocidos por elindividuo al momento de la transfusioacuten o en las mujerespor el embarazo estos anticuerpos son dirigidos contraantiacutegenos de sistemas diferentes al ABO

Los anticuerpos naturales regulares son preferentementeinmunoglobulinas M las cuales fijan de manera taneficiente el complemento que pueden provocar lisisintravascular y ocasionar insuficiencia renal o incluso lamuerte del paciente Los anticuerpos adquiridos o inmunesson generalmente inmunoglobulinas G las cuales producenhemoacutelisis extravascular en el bazo o en el hiacutegado mediantefagocitosis del complejo eritrocito maacutes anticuerpo

Los aloanticuerpos irregulares (adquiridos) maacutes comunes en

nuestra poblacioacuten son los que involucran a los sistemasMNSs P1 Kidd (Jka Jkb) Duffy (Fya Fyb) Kell Lewis yDiego

OBJETIVO identificacioacuten del anticuerpo irregular a traveacutesde las diferentes teacutecnicas

MATERIAL

bull 10 Tubos de ensaye

bull 10 Pipetas Pasteur

bull

1Gradillabull 1 Bulbo

bull Papel Parafim

MATERIAL BIOLOGICO

bull Gloacutebulos rojos lavados al 3 - 5

bull Suero

bull REACTIVOSReactivos

1 Suero de Coombs2 Albuacutemina bovina

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bull EQUIPO1 Microcentriacutefuga2 Bantildeo Mariacutea oacute Estufa

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3 SOLUCION SALINA4 SOLUCION DE LISS

TEacuteCNICA SOLUCION SALINA

Lavar los eritrocitos con solucioacuten salina (3veces)SALINA RAacutePIDA

Agregar una gota de Eritrocitos LavadosDiluiacuterlo al 3-5 con solucioacuten salina 09Agregar 2 gotas de sueroCentrifugar y observar anotar desprendimientodel botoacuten

SALINA 37deg BANtildeO MARIacuteA1) Incubar tubos a Bantildeo mariacutea a 37degC durante 1

hora (o 20 min)

2) Centirfugar despueacutes de haber pasado eltiempo

3) Desprender el botoacuten de eritrocitos yobservar

AGLUTINACIOacuteNndash No es compatibleNO AGLUTINACIOacuteN - Lavar 3 veces

SALINA COOMBS1) Con solucioacuten salina 09 lavar los

eritrocitos de los tubos q no tuvieronaglutinacioacuten 3 veces

2) Decantar y agregar 2 gotas de reactivode Coombs

AGLUTINACIOacuteN ndash No es compatibleNO AGLUTINACIOacuteN - Lavar 3 veces

TECNICA LISS

1 Poner dos gotas de LISS en cada tubo agregar una gotade eritrocitos lavados y al 3 - 5 seguacuten el nuacutemero detubo correspondiente

2 Mezclar y centrifugar un minuto decantar el

sobrenadante y con la ayuda de una gasa limpiar elexceso del reactivo

3 Poner nuevamente 2 gota de LISS resuspender poragitacioacuten agregar 2 gotas de suero problema mezclarincubar 15 minutos a 37ordm C centrifugar 30 seg A 1000RPM

4 Anotar los resultados

A las pruebas negativas realizar Coombs

1 Lavar 3 veces las ceacutelulas agregar suero de Coombs

centrifugar 30 seg2 Leer aglutinaciones y anotar resultados

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TECNICA ALBUMINA BOVINA 8 Agregar 2 gotas de albuacutemina al 229 Centrifugar 20 segundos10observar aglutinacioacuten o hemolisis o no aglutinacioacuten

11A los tubos con lecturas negativas incubar 20minutos en bantildeo Mariacutea a 37 degC12Centrifugar y observar

bull Aglutinacioacuten o hemoacutelisis reportar incompatible

bull No aglutinacioacuten llevar a Coombs

13Lavar tres veces decantar y quitar el exceso desalina con gasa y agregar 2 gotas de reactivo deCoombs y centrifugar 20 segundos y observar

bull Aglutinacioacuten o hemoacutelisis reportar incompatible

bull No aglutinacioacuten reportar compatible

Resultados ANTICUERPO IRREGULAR Anticuerpo c

InterpretacioacutenEstos anticuerpos son generalmente inmunoglobulinas tipo My ocasionalmente tipo G y debido a esa temperatura dereaccioacuten carecen de importancia cliacutenica salvo que sureaccioacuten ocurra tambieacuten a 37 degC su importancia radica enpacientes que seraacuten intervenido a 22 ordmc como es el caso de

operacioacuten de corazoacuten

Los llamados anticuerpos calientes tienen una temperatura oacuteptima dereaccioacuten a 37 degC a Estos anticuerpos tienen una relevanteimportancia cliacutenica ya que se les asocia con reaccionestransfusionales de intensidad moderada a severa que puedenocasionar la muerte

Esquemas

CONCLUSIONHe concluido que es importante determinar los anticuerposirregulares ya que estos anticuerpos tienen una relevanteimportancia cliacutenica ya que se les asocia con reaccionestransfusionales de intensidad moderada a severa

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ConclusioacutenConcluyo que la prueba de compatibilidad sanguiacutenea en su modalidad conalbuacutemina bovina ofrece mucha ventaja al ser al igual que otrosreactivos un potencializador de la reaccioacuten antiacutegeno-anticuerpo Estopermite que el operador o realizador de la prueba tenga mayorconfianza y certeza en los resultados que obtenga

PRACTICA No 8PRUEBA DE COMPATIBILIDAD SANGUINEA PRUEBA DE LISS

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FUNDAMENTO

LISS es utilizado para reducir la fuerza ioacutenica del medio

de reaccioacuten en los procedimientos de deteccioacuten eidentificacioacuten de anticuerpos y en las pruebas decompatibilidad La presencia de este reactivo refuerza lainteraccioacuten antiacutegeno - anticuerpo durante la incubacioacuten

GENERALIDADESEl uso de solucioacuten salina de baja fuerza ioacutenica fuedescrito inicialmente en 1964 por Hughes-Jones y col y

Elliot y col pero en ese tiempo su uso era limitado yaque la concentracioacuten molar obtenida provocaba la hemoacutelisisde los eritrocitos suspendidos

En 1974 Low y Messeter describieron el uso rutinario de lasolucioacuten Liss de 003 M que lograba reducir el tiempo deincubacioacuten y no presentaba tendencia a la hemoacutelisis al sersuspendidos en salina a baja fuerza ioacutenica restableciendola presioacuten osmoacutetica de la solucioacuten mediante la adicioacuten deglicinaLas soluciones de baja fuerza ioacutenica son actualmente lasmaacutes utilizadas en inmunohematologiacutea provocando un aumentoen la velocidad de asociacioacuten entre antiacutegenos y anticuerpospermitiendo asiacute acortar el tiempo de incubacioacuten de 60minutos a 10-15 minutos sin sacrificar la sensibilidad delas mismas y sin costos elevadosSe ha observado que lasreacciones antiacutegeno-anticuerpo se ven potenciadas alreducir la fuerza ioacutenica del medio de reaccioacuten

La fuerza ioacutenica es uno de los factores maacutes importantes quedeterminan la tasa y la cantidad de captacioacuten deanticuerpos por parte de los eritrocitos El uso de mediosde reaccioacuten de baja fuerza ioacutenica permite disminuir eltiempo de incubacioacuten y potenciar las reacciones de losanticuerpos sin incrementar las reacciones inespeciacuteficas

Los iones Na+ y Cl- presentes en la solucioacuten salinafisioloacutegica se agrupan alrededor de las moleacuteculas deantiacutegeno y anticuerpo neutralizando sus cargas opuestas locual dificulta la unioacuten entre ellos Este efecto se reduceutilizando soluciones de baja fuerza ioacutenica y disminuyendode esta manera la incubacioacuten de las pruebas

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En esta etapa de sensibilizacioacuten las posibilidades deasociacioacuten pueden incrementarse mediante agitacioacutencentrifugacioacuten yo variacioacuten de la concentracioacuten delanticuerpo

Despueacutes de que el anticuerpo se ha fijado al antiacutegeno loseritrocitos sensibilizados deben unirse para dar lugar a laaglutinacioacuten visible esta red tambieacuten solidifica yestabiliza la reaccioacuten

En esta etapa la reaccioacuten depende de factores como lascaracteriacutesticas del anticuerpo localizacioacuten en la membranay nuacutemero de sitios antigeacutenicos fuerzas que mantienen ladistancia entre los eritrocitos

Las caracteriacutesticas del anticuerpo que deben considerarse

son el tamantildeo del anticuerpo involucrado y el nuacutemero desitios de combinacioacuten con el antiacutegeno Los anticuerpos IgMpueden establecer puentes entre los eritrocitos yaglutinarlos espontaacuteneamente en solucioacuten salina mientrasque los IgG no ya que las IgM pentameacutericas poseen 10sitios de combinacioacuten con el antiacutegeno y las IgG diacutemerossoacutelo dos sitios

Los eritrocitos tienen una carga neta negativa en susuperficie su interaccioacuten con los iones del medio alteraesta carga y producen una carga neta criacutetica denominada

potencial zeta y la reduccioacuten de dicha carga permite quelos eritrocitos se aproximen lo suficiente para que seanaglutinados por medio de los IgG que los sensibilizaron

Las soluciones de baja fuerza ionica empleadas en banco desangre tienen un pH entre 65 ndash 70 se recomienda unaosmolalidad de 270 ndash 305 mosmkg y una conductividad de 37mmcm El control diario implica el examen de su aparienciafiacutesica ausencia de turbidez particulas o sedimento asiacutecomo corroborar la capacidad para generar hemoacutelisiscrenacion o prueba de coombs positiva en eritrocitos

normales Cada lote nuevo se valora mediante el rastreo deun anticuerpo ya sea un anti- D un anti- jk anti- fy oanti- kell diluido se compara su capacidad de deteccioacutencontra un medio salino normal incubando 10min a 37ordmC enLISS debe poder rastrearse un anticuerpo en tanto que enmedio salino no

MATERIAL Y EQUIPO

Material Cantidad10 Tubos de ensayo de 12 x 75

1 Gradilla10 Pipetas pasteur

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1 Bulbo1 Marcador1 Microcentriacutefuga1 Bantildeo Mariacutea

MATERIAL BIOLOGICO

Gloacutebulos rojos lavados al 3 - 5Suero

REACTIVOS

Reactivo de LISSReactivo de Coombs

TECNICA1- Lavar los eritrocitos

Separar el suero del paquete de gloacutebulos rojos

Agregar cierta cantidad de eritrocitos a un tubo deensayo y agregarle solucioacuten salina

Centrifugar y decantar

Repetir este proceso 3 veces

2- Realizar la Prueba de LISS

Enumerar los tubos Poner dos gotas de LISS en cada tubo agregar una gota

de eritrocitos lavados y al 3 - 5 seguacuten el nuacutemero detubo correspondiente

Mezclar y centrifugar un minuto decantar elsobrenadante y con la ayuda de una gasa limpiar elexceso del reactivo

Poner nuevamente 2 gota de LISS resuspender poragitacioacuten agregar 2 gotas de suero problema mezclarincubar 15 minutos a 37ordm C centrifugar 30 seg A 1000

RPM Anotar los resultados

3- A las pruebas negativas realizar Coombs

Lavar 3 veces las ceacutelulas agregar suero de Coombscentrifugar 30 seg

Leer aglutinaciones y anotar resultados

REACTIVOS UTILIZADOS

REACTIVO MARCA FECHA DECADUCIDAD

ASPECTO COLOR LOTE

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SueroAntiglobuina

humana

Lafon 31 01 2009 Transparente Verde 406

LISS Caserorealizado enCMNSIGLOXXI

1 antildeo Transparente Transparente

----------

PACIENTE ASCANIO MENDEZ JOSUE O (+)DONADOR 1 GARCIA CARBAJAL OSCAR O (+)DONADOR 2 GARCIA SUAREZ ORLANDO A (+)

RESULTADOS

INTERPRETACIOacuteN DE LOS RESULTADOS

La hemoacutelisis o la aglutinacioacuten representan un resultado positivo e indican lapresencia de una reaccioacuten antiacutegeno-anticuerpo Los resultados negativos no severa aglutinacioacuten o hemolisis

ESQUEMAS

CONCLUSIONES

Concluyo que la prueba de compatibilidad sanguiacutenea en su modalidad conliss ofrece mucha ventaja al ser al igual que otros reactivos unpotencializador de la reaccioacuten antiacutegeno-anticuerpo Esto permite queel operador o realizador de la prueba tenga mayor confianza y certezaen los resultados que obtenga

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Tubo Resultado

M1 NEGATIVOm1 NEGATIVO

M2 POSITIVO

M2 NEGATIVO

AUTOTES NEGATIVO

29

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PRACTICA 9INMUNOHEMATOLOGIA

DETERMINACION DE COOMBS DIRECTO

INTRODUCCIONPRUEBA DE COOMBS DIRECTA

El examen de Coombs directo se utiliza para detectar autoanticuerpos contralos propios gloacutebulos rojos (GR) de un individuo Es una prueba que sirve parademostrar el revestimiento de los eritrocitos in vivo (mientras los eritrocitosestaacuten circulando en el individuo) La prueba se realiza agregando directamenteel reactivo de Coombs a los eritrocitos previamente lavados para eliminar otras proteiacutenas no fijadas a el una prueba directa positiva significa que larelacioacuten antiacutegeno-anticuerpo ocurrioacute in vivo es decir que la fijacioacuten del

anticuerpo sobre el antiacutegeno se realizo en el organismo del individuo enestudio

Las indicaciones principales de esta prueba son diagnostico de enfermedadeshemoliacuteticas ictericia o anomaliacuteas en la apariencia de los gloacutebulos rojos bajo elmicroscopio ya que estos anticuerpos algunas veces destruyen los gloacutebulosrojos y causan anemia para investigar reacciones en transfusiones Parainvestigar la induccioacuten de drogas en ceacutelulas rojas sensibilizadas medicamentos(por ejemplo quinidina metildopa procainamida y otros) que pueden llevar a la produccioacuten de estos anticuerpos

OBJETIVO Determinar la presencia de anticuerpos en la superficie de losgloacutebulos rojos del individuo

MATERIAL

bull 10 Tubos de 1275

bull 10 Pipetas Pasteur

bull 1 Gradilla

bull 1 Bulbo

bull Papel Parafilm

bull Microcentriacutefuga

bull Bantildeo Mariacutea a 37degC

MUESTRA BIOLOGICA

Eritrocitos lavados de (3-5) del donador o pacienteREACTIVO

Suero de CoombsSuero anti-globulina humana Lafon Lote 406 Cad 310109 Color verde Aspecto transparente

TECNICA

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Colocar en un tubo de ensaye dos gotas de suero de Coombs mas una gota deglobulos rojos (3-5)Centrifugar a 1000 rpm durante 20 segDesprender el boton suavemente y buscar la presencia de aglutinacionRotular y enumerar 8 tubos de ensayes con las diferentes diluciones

(frac12frac1418)Enumerar 8 tubos mas del 1 al 8Agregar a cada tubo de las diluciones 10 gotas de solucion salina mas 10 gotasde suero de CoombsColocar Al primer tubo de la dilucion 1 gota de globulos rojos (3-5) mezclar completamente y agregar al tubo 1Centrifugar todos los tubos a 1000 rpm durante 20 seg

LECTURA

Aglutina- Prueba de Coombs directa es positiva

No aglutina- Prueba de Coombs directa es negativa

ESQUEMAS y RESULTADOS

CONCLUCION

He concluido que la prueba de Coombs directa es una prueba que se utiliza para medir

la presencia de anticuerpos en la superficie de los gloacutebulos rojos que se encuentran

circulando en el paciente y se realiza para investigar reacciones en transfusiones ademaacutes

sirve para la determinacioacuten de anemia hemoliacutetica autoinmune entre otras afecciones

Practica 10

IDENTIFICACION DE ANTICUERPOS IRREGULARES

Fundamento

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DILUCIONES

frac12 positiva

frac14 positiva

18 positiva

116 negativa

132 negativa

164 negativa

1128 negativa1256 negativa

31

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Los anticuerpos del sistema ABO aparecen una vez que elindividuo entra en contacto con el medio ambiente y en elcual se encuentran microorganismos como algunas bacteriascoliformes que contienen sustancias quiacutemicas en suestructura parecidas a las de este sistema Por anticuerpos

regulares debemos identificar a los que existen en todoslos individuos y que eacutestos tendraacuten durante toda su vida

Los anticuerpos irregulares son los que no estaacuten de esamanera aunque en el caso de los naturales no se conoce aciencia cierta queacute o coacutemo se induce su produccioacuten Losadquiridos se conocen tambieacuten como inmunes y son elresultado de la exposicioacuten a antiacutegenos desconocidos por elindividuo al momento de la transfusioacuten o en las mujerespor el embarazo estos anticuerpos son dirigidos contraantiacutegenos de sistemas diferentes al ABO

Los anticuerpos naturales regulares son preferentementeinmunoglobulinas M las cuales fijan de manera taneficiente el complemento que pueden provocar lisisintravascular y ocasionar insuficiencia renal o incluso lamuerte del paciente Los anticuerpos adquiridos o inmunesson generalmente inmunoglobulinas G las cuales producenhemoacutelisis extravascular en el bazo o en el hiacutegado mediantefagocitosis del complejo eritrocito maacutes anticuerpo

Los aloanticuerpos irregulares (adquiridos) maacutes comunes en

nuestra poblacioacuten son los que involucran a los sistemasMNSs P1 Kidd (Jka Jkb) Duffy (Fya Fyb) Kell Lewis yDiego

OBJETIVO identificacioacuten del anticuerpo irregular a traveacutesde las diferentes teacutecnicas

MATERIAL

bull 10 Tubos de ensaye

bull 10 Pipetas Pasteur

bull

1Gradillabull 1 Bulbo

bull Papel Parafim

MATERIAL BIOLOGICO

bull Gloacutebulos rojos lavados al 3 - 5

bull Suero

bull REACTIVOSReactivos

1 Suero de Coombs2 Albuacutemina bovina

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bull EQUIPO1 Microcentriacutefuga2 Bantildeo Mariacutea oacute Estufa

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3 SOLUCION SALINA4 SOLUCION DE LISS

TEacuteCNICA SOLUCION SALINA

Lavar los eritrocitos con solucioacuten salina (3veces)SALINA RAacutePIDA

Agregar una gota de Eritrocitos LavadosDiluiacuterlo al 3-5 con solucioacuten salina 09Agregar 2 gotas de sueroCentrifugar y observar anotar desprendimientodel botoacuten

SALINA 37deg BANtildeO MARIacuteA1) Incubar tubos a Bantildeo mariacutea a 37degC durante 1

hora (o 20 min)

2) Centirfugar despueacutes de haber pasado eltiempo

3) Desprender el botoacuten de eritrocitos yobservar

AGLUTINACIOacuteNndash No es compatibleNO AGLUTINACIOacuteN - Lavar 3 veces

SALINA COOMBS1) Con solucioacuten salina 09 lavar los

eritrocitos de los tubos q no tuvieronaglutinacioacuten 3 veces

2) Decantar y agregar 2 gotas de reactivode Coombs

AGLUTINACIOacuteN ndash No es compatibleNO AGLUTINACIOacuteN - Lavar 3 veces

TECNICA LISS

1 Poner dos gotas de LISS en cada tubo agregar una gotade eritrocitos lavados y al 3 - 5 seguacuten el nuacutemero detubo correspondiente

2 Mezclar y centrifugar un minuto decantar el

sobrenadante y con la ayuda de una gasa limpiar elexceso del reactivo

3 Poner nuevamente 2 gota de LISS resuspender poragitacioacuten agregar 2 gotas de suero problema mezclarincubar 15 minutos a 37ordm C centrifugar 30 seg A 1000RPM

4 Anotar los resultados

A las pruebas negativas realizar Coombs

1 Lavar 3 veces las ceacutelulas agregar suero de Coombs

centrifugar 30 seg2 Leer aglutinaciones y anotar resultados

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TECNICA ALBUMINA BOVINA 8 Agregar 2 gotas de albuacutemina al 229 Centrifugar 20 segundos10observar aglutinacioacuten o hemolisis o no aglutinacioacuten

11A los tubos con lecturas negativas incubar 20minutos en bantildeo Mariacutea a 37 degC12Centrifugar y observar

bull Aglutinacioacuten o hemoacutelisis reportar incompatible

bull No aglutinacioacuten llevar a Coombs

13Lavar tres veces decantar y quitar el exceso desalina con gasa y agregar 2 gotas de reactivo deCoombs y centrifugar 20 segundos y observar

bull Aglutinacioacuten o hemoacutelisis reportar incompatible

bull No aglutinacioacuten reportar compatible

Resultados ANTICUERPO IRREGULAR Anticuerpo c

InterpretacioacutenEstos anticuerpos son generalmente inmunoglobulinas tipo My ocasionalmente tipo G y debido a esa temperatura dereaccioacuten carecen de importancia cliacutenica salvo que sureaccioacuten ocurra tambieacuten a 37 degC su importancia radica enpacientes que seraacuten intervenido a 22 ordmc como es el caso de

operacioacuten de corazoacuten

Los llamados anticuerpos calientes tienen una temperatura oacuteptima dereaccioacuten a 37 degC a Estos anticuerpos tienen una relevanteimportancia cliacutenica ya que se les asocia con reaccionestransfusionales de intensidad moderada a severa que puedenocasionar la muerte

Esquemas

CONCLUSIONHe concluido que es importante determinar los anticuerposirregulares ya que estos anticuerpos tienen una relevanteimportancia cliacutenica ya que se les asocia con reaccionestransfusionales de intensidad moderada a severa

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FUNDAMENTO

LISS es utilizado para reducir la fuerza ioacutenica del medio

de reaccioacuten en los procedimientos de deteccioacuten eidentificacioacuten de anticuerpos y en las pruebas decompatibilidad La presencia de este reactivo refuerza lainteraccioacuten antiacutegeno - anticuerpo durante la incubacioacuten

GENERALIDADESEl uso de solucioacuten salina de baja fuerza ioacutenica fuedescrito inicialmente en 1964 por Hughes-Jones y col y

Elliot y col pero en ese tiempo su uso era limitado yaque la concentracioacuten molar obtenida provocaba la hemoacutelisisde los eritrocitos suspendidos

En 1974 Low y Messeter describieron el uso rutinario de lasolucioacuten Liss de 003 M que lograba reducir el tiempo deincubacioacuten y no presentaba tendencia a la hemoacutelisis al sersuspendidos en salina a baja fuerza ioacutenica restableciendola presioacuten osmoacutetica de la solucioacuten mediante la adicioacuten deglicinaLas soluciones de baja fuerza ioacutenica son actualmente lasmaacutes utilizadas en inmunohematologiacutea provocando un aumentoen la velocidad de asociacioacuten entre antiacutegenos y anticuerpospermitiendo asiacute acortar el tiempo de incubacioacuten de 60minutos a 10-15 minutos sin sacrificar la sensibilidad delas mismas y sin costos elevadosSe ha observado que lasreacciones antiacutegeno-anticuerpo se ven potenciadas alreducir la fuerza ioacutenica del medio de reaccioacuten

La fuerza ioacutenica es uno de los factores maacutes importantes quedeterminan la tasa y la cantidad de captacioacuten deanticuerpos por parte de los eritrocitos El uso de mediosde reaccioacuten de baja fuerza ioacutenica permite disminuir eltiempo de incubacioacuten y potenciar las reacciones de losanticuerpos sin incrementar las reacciones inespeciacuteficas

Los iones Na+ y Cl- presentes en la solucioacuten salinafisioloacutegica se agrupan alrededor de las moleacuteculas deantiacutegeno y anticuerpo neutralizando sus cargas opuestas locual dificulta la unioacuten entre ellos Este efecto se reduceutilizando soluciones de baja fuerza ioacutenica y disminuyendode esta manera la incubacioacuten de las pruebas

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En esta etapa de sensibilizacioacuten las posibilidades deasociacioacuten pueden incrementarse mediante agitacioacutencentrifugacioacuten yo variacioacuten de la concentracioacuten delanticuerpo

Despueacutes de que el anticuerpo se ha fijado al antiacutegeno loseritrocitos sensibilizados deben unirse para dar lugar a laaglutinacioacuten visible esta red tambieacuten solidifica yestabiliza la reaccioacuten

En esta etapa la reaccioacuten depende de factores como lascaracteriacutesticas del anticuerpo localizacioacuten en la membranay nuacutemero de sitios antigeacutenicos fuerzas que mantienen ladistancia entre los eritrocitos

Las caracteriacutesticas del anticuerpo que deben considerarse

son el tamantildeo del anticuerpo involucrado y el nuacutemero desitios de combinacioacuten con el antiacutegeno Los anticuerpos IgMpueden establecer puentes entre los eritrocitos yaglutinarlos espontaacuteneamente en solucioacuten salina mientrasque los IgG no ya que las IgM pentameacutericas poseen 10sitios de combinacioacuten con el antiacutegeno y las IgG diacutemerossoacutelo dos sitios

Los eritrocitos tienen una carga neta negativa en susuperficie su interaccioacuten con los iones del medio alteraesta carga y producen una carga neta criacutetica denominada

potencial zeta y la reduccioacuten de dicha carga permite quelos eritrocitos se aproximen lo suficiente para que seanaglutinados por medio de los IgG que los sensibilizaron

Las soluciones de baja fuerza ionica empleadas en banco desangre tienen un pH entre 65 ndash 70 se recomienda unaosmolalidad de 270 ndash 305 mosmkg y una conductividad de 37mmcm El control diario implica el examen de su aparienciafiacutesica ausencia de turbidez particulas o sedimento asiacutecomo corroborar la capacidad para generar hemoacutelisiscrenacion o prueba de coombs positiva en eritrocitos

normales Cada lote nuevo se valora mediante el rastreo deun anticuerpo ya sea un anti- D un anti- jk anti- fy oanti- kell diluido se compara su capacidad de deteccioacutencontra un medio salino normal incubando 10min a 37ordmC enLISS debe poder rastrearse un anticuerpo en tanto que enmedio salino no

MATERIAL Y EQUIPO

Material Cantidad10 Tubos de ensayo de 12 x 75

1 Gradilla10 Pipetas pasteur

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1 Bulbo1 Marcador1 Microcentriacutefuga1 Bantildeo Mariacutea

MATERIAL BIOLOGICO

Gloacutebulos rojos lavados al 3 - 5Suero

REACTIVOS

Reactivo de LISSReactivo de Coombs

TECNICA1- Lavar los eritrocitos

Separar el suero del paquete de gloacutebulos rojos

Agregar cierta cantidad de eritrocitos a un tubo deensayo y agregarle solucioacuten salina

Centrifugar y decantar

Repetir este proceso 3 veces

2- Realizar la Prueba de LISS

Enumerar los tubos Poner dos gotas de LISS en cada tubo agregar una gota

de eritrocitos lavados y al 3 - 5 seguacuten el nuacutemero detubo correspondiente

Mezclar y centrifugar un minuto decantar elsobrenadante y con la ayuda de una gasa limpiar elexceso del reactivo

Poner nuevamente 2 gota de LISS resuspender poragitacioacuten agregar 2 gotas de suero problema mezclarincubar 15 minutos a 37ordm C centrifugar 30 seg A 1000

RPM Anotar los resultados

3- A las pruebas negativas realizar Coombs

Lavar 3 veces las ceacutelulas agregar suero de Coombscentrifugar 30 seg

Leer aglutinaciones y anotar resultados

REACTIVOS UTILIZADOS

REACTIVO MARCA FECHA DECADUCIDAD

ASPECTO COLOR LOTE

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SueroAntiglobuina

humana

Lafon 31 01 2009 Transparente Verde 406

LISS Caserorealizado enCMNSIGLOXXI

1 antildeo Transparente Transparente

----------

PACIENTE ASCANIO MENDEZ JOSUE O (+)DONADOR 1 GARCIA CARBAJAL OSCAR O (+)DONADOR 2 GARCIA SUAREZ ORLANDO A (+)

RESULTADOS

INTERPRETACIOacuteN DE LOS RESULTADOS

La hemoacutelisis o la aglutinacioacuten representan un resultado positivo e indican lapresencia de una reaccioacuten antiacutegeno-anticuerpo Los resultados negativos no severa aglutinacioacuten o hemolisis

ESQUEMAS

CONCLUSIONES

Concluyo que la prueba de compatibilidad sanguiacutenea en su modalidad conliss ofrece mucha ventaja al ser al igual que otros reactivos unpotencializador de la reaccioacuten antiacutegeno-anticuerpo Esto permite queel operador o realizador de la prueba tenga mayor confianza y certezaen los resultados que obtenga

OBTENIDO DE wwwquimicaclinicauvblogspotcom

Tubo Resultado

M1 NEGATIVOm1 NEGATIVO

M2 POSITIVO

M2 NEGATIVO

AUTOTES NEGATIVO

29

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PRACTICA 9INMUNOHEMATOLOGIA

DETERMINACION DE COOMBS DIRECTO

INTRODUCCIONPRUEBA DE COOMBS DIRECTA

El examen de Coombs directo se utiliza para detectar autoanticuerpos contralos propios gloacutebulos rojos (GR) de un individuo Es una prueba que sirve parademostrar el revestimiento de los eritrocitos in vivo (mientras los eritrocitosestaacuten circulando en el individuo) La prueba se realiza agregando directamenteel reactivo de Coombs a los eritrocitos previamente lavados para eliminar otras proteiacutenas no fijadas a el una prueba directa positiva significa que larelacioacuten antiacutegeno-anticuerpo ocurrioacute in vivo es decir que la fijacioacuten del

anticuerpo sobre el antiacutegeno se realizo en el organismo del individuo enestudio

Las indicaciones principales de esta prueba son diagnostico de enfermedadeshemoliacuteticas ictericia o anomaliacuteas en la apariencia de los gloacutebulos rojos bajo elmicroscopio ya que estos anticuerpos algunas veces destruyen los gloacutebulosrojos y causan anemia para investigar reacciones en transfusiones Parainvestigar la induccioacuten de drogas en ceacutelulas rojas sensibilizadas medicamentos(por ejemplo quinidina metildopa procainamida y otros) que pueden llevar a la produccioacuten de estos anticuerpos

OBJETIVO Determinar la presencia de anticuerpos en la superficie de losgloacutebulos rojos del individuo

MATERIAL

bull 10 Tubos de 1275

bull 10 Pipetas Pasteur

bull 1 Gradilla

bull 1 Bulbo

bull Papel Parafilm

bull Microcentriacutefuga

bull Bantildeo Mariacutea a 37degC

MUESTRA BIOLOGICA

Eritrocitos lavados de (3-5) del donador o pacienteREACTIVO

Suero de CoombsSuero anti-globulina humana Lafon Lote 406 Cad 310109 Color verde Aspecto transparente

TECNICA

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Colocar en un tubo de ensaye dos gotas de suero de Coombs mas una gota deglobulos rojos (3-5)Centrifugar a 1000 rpm durante 20 segDesprender el boton suavemente y buscar la presencia de aglutinacionRotular y enumerar 8 tubos de ensayes con las diferentes diluciones

(frac12frac1418)Enumerar 8 tubos mas del 1 al 8Agregar a cada tubo de las diluciones 10 gotas de solucion salina mas 10 gotasde suero de CoombsColocar Al primer tubo de la dilucion 1 gota de globulos rojos (3-5) mezclar completamente y agregar al tubo 1Centrifugar todos los tubos a 1000 rpm durante 20 seg

LECTURA

Aglutina- Prueba de Coombs directa es positiva

No aglutina- Prueba de Coombs directa es negativa

ESQUEMAS y RESULTADOS

CONCLUCION

He concluido que la prueba de Coombs directa es una prueba que se utiliza para medir

la presencia de anticuerpos en la superficie de los gloacutebulos rojos que se encuentran

circulando en el paciente y se realiza para investigar reacciones en transfusiones ademaacutes

sirve para la determinacioacuten de anemia hemoliacutetica autoinmune entre otras afecciones

Practica 10

IDENTIFICACION DE ANTICUERPOS IRREGULARES

Fundamento

OBTENIDO DE wwwquimicaclinicauvblogspotcom

DILUCIONES

frac12 positiva

frac14 positiva

18 positiva

116 negativa

132 negativa

164 negativa

1128 negativa1256 negativa

31

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Los anticuerpos del sistema ABO aparecen una vez que elindividuo entra en contacto con el medio ambiente y en elcual se encuentran microorganismos como algunas bacteriascoliformes que contienen sustancias quiacutemicas en suestructura parecidas a las de este sistema Por anticuerpos

regulares debemos identificar a los que existen en todoslos individuos y que eacutestos tendraacuten durante toda su vida

Los anticuerpos irregulares son los que no estaacuten de esamanera aunque en el caso de los naturales no se conoce aciencia cierta queacute o coacutemo se induce su produccioacuten Losadquiridos se conocen tambieacuten como inmunes y son elresultado de la exposicioacuten a antiacutegenos desconocidos por elindividuo al momento de la transfusioacuten o en las mujerespor el embarazo estos anticuerpos son dirigidos contraantiacutegenos de sistemas diferentes al ABO

Los anticuerpos naturales regulares son preferentementeinmunoglobulinas M las cuales fijan de manera taneficiente el complemento que pueden provocar lisisintravascular y ocasionar insuficiencia renal o incluso lamuerte del paciente Los anticuerpos adquiridos o inmunesson generalmente inmunoglobulinas G las cuales producenhemoacutelisis extravascular en el bazo o en el hiacutegado mediantefagocitosis del complejo eritrocito maacutes anticuerpo

Los aloanticuerpos irregulares (adquiridos) maacutes comunes en

nuestra poblacioacuten son los que involucran a los sistemasMNSs P1 Kidd (Jka Jkb) Duffy (Fya Fyb) Kell Lewis yDiego

OBJETIVO identificacioacuten del anticuerpo irregular a traveacutesde las diferentes teacutecnicas

MATERIAL

bull 10 Tubos de ensaye

bull 10 Pipetas Pasteur

bull

1Gradillabull 1 Bulbo

bull Papel Parafim

MATERIAL BIOLOGICO

bull Gloacutebulos rojos lavados al 3 - 5

bull Suero

bull REACTIVOSReactivos

1 Suero de Coombs2 Albuacutemina bovina

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bull EQUIPO1 Microcentriacutefuga2 Bantildeo Mariacutea oacute Estufa

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3 SOLUCION SALINA4 SOLUCION DE LISS

TEacuteCNICA SOLUCION SALINA

Lavar los eritrocitos con solucioacuten salina (3veces)SALINA RAacutePIDA

Agregar una gota de Eritrocitos LavadosDiluiacuterlo al 3-5 con solucioacuten salina 09Agregar 2 gotas de sueroCentrifugar y observar anotar desprendimientodel botoacuten

SALINA 37deg BANtildeO MARIacuteA1) Incubar tubos a Bantildeo mariacutea a 37degC durante 1

hora (o 20 min)

2) Centirfugar despueacutes de haber pasado eltiempo

3) Desprender el botoacuten de eritrocitos yobservar

AGLUTINACIOacuteNndash No es compatibleNO AGLUTINACIOacuteN - Lavar 3 veces

SALINA COOMBS1) Con solucioacuten salina 09 lavar los

eritrocitos de los tubos q no tuvieronaglutinacioacuten 3 veces

2) Decantar y agregar 2 gotas de reactivode Coombs

AGLUTINACIOacuteN ndash No es compatibleNO AGLUTINACIOacuteN - Lavar 3 veces

TECNICA LISS

1 Poner dos gotas de LISS en cada tubo agregar una gotade eritrocitos lavados y al 3 - 5 seguacuten el nuacutemero detubo correspondiente

2 Mezclar y centrifugar un minuto decantar el

sobrenadante y con la ayuda de una gasa limpiar elexceso del reactivo

3 Poner nuevamente 2 gota de LISS resuspender poragitacioacuten agregar 2 gotas de suero problema mezclarincubar 15 minutos a 37ordm C centrifugar 30 seg A 1000RPM

4 Anotar los resultados

A las pruebas negativas realizar Coombs

1 Lavar 3 veces las ceacutelulas agregar suero de Coombs

centrifugar 30 seg2 Leer aglutinaciones y anotar resultados

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TECNICA ALBUMINA BOVINA 8 Agregar 2 gotas de albuacutemina al 229 Centrifugar 20 segundos10observar aglutinacioacuten o hemolisis o no aglutinacioacuten

11A los tubos con lecturas negativas incubar 20minutos en bantildeo Mariacutea a 37 degC12Centrifugar y observar

bull Aglutinacioacuten o hemoacutelisis reportar incompatible

bull No aglutinacioacuten llevar a Coombs

13Lavar tres veces decantar y quitar el exceso desalina con gasa y agregar 2 gotas de reactivo deCoombs y centrifugar 20 segundos y observar

bull Aglutinacioacuten o hemoacutelisis reportar incompatible

bull No aglutinacioacuten reportar compatible

Resultados ANTICUERPO IRREGULAR Anticuerpo c

InterpretacioacutenEstos anticuerpos son generalmente inmunoglobulinas tipo My ocasionalmente tipo G y debido a esa temperatura dereaccioacuten carecen de importancia cliacutenica salvo que sureaccioacuten ocurra tambieacuten a 37 degC su importancia radica enpacientes que seraacuten intervenido a 22 ordmc como es el caso de

operacioacuten de corazoacuten

Los llamados anticuerpos calientes tienen una temperatura oacuteptima dereaccioacuten a 37 degC a Estos anticuerpos tienen una relevanteimportancia cliacutenica ya que se les asocia con reaccionestransfusionales de intensidad moderada a severa que puedenocasionar la muerte

Esquemas

CONCLUSIONHe concluido que es importante determinar los anticuerposirregulares ya que estos anticuerpos tienen una relevanteimportancia cliacutenica ya que se les asocia con reaccionestransfusionales de intensidad moderada a severa

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En esta etapa de sensibilizacioacuten las posibilidades deasociacioacuten pueden incrementarse mediante agitacioacutencentrifugacioacuten yo variacioacuten de la concentracioacuten delanticuerpo

Despueacutes de que el anticuerpo se ha fijado al antiacutegeno loseritrocitos sensibilizados deben unirse para dar lugar a laaglutinacioacuten visible esta red tambieacuten solidifica yestabiliza la reaccioacuten

En esta etapa la reaccioacuten depende de factores como lascaracteriacutesticas del anticuerpo localizacioacuten en la membranay nuacutemero de sitios antigeacutenicos fuerzas que mantienen ladistancia entre los eritrocitos

Las caracteriacutesticas del anticuerpo que deben considerarse

son el tamantildeo del anticuerpo involucrado y el nuacutemero desitios de combinacioacuten con el antiacutegeno Los anticuerpos IgMpueden establecer puentes entre los eritrocitos yaglutinarlos espontaacuteneamente en solucioacuten salina mientrasque los IgG no ya que las IgM pentameacutericas poseen 10sitios de combinacioacuten con el antiacutegeno y las IgG diacutemerossoacutelo dos sitios

Los eritrocitos tienen una carga neta negativa en susuperficie su interaccioacuten con los iones del medio alteraesta carga y producen una carga neta criacutetica denominada

potencial zeta y la reduccioacuten de dicha carga permite quelos eritrocitos se aproximen lo suficiente para que seanaglutinados por medio de los IgG que los sensibilizaron

Las soluciones de baja fuerza ionica empleadas en banco desangre tienen un pH entre 65 ndash 70 se recomienda unaosmolalidad de 270 ndash 305 mosmkg y una conductividad de 37mmcm El control diario implica el examen de su aparienciafiacutesica ausencia de turbidez particulas o sedimento asiacutecomo corroborar la capacidad para generar hemoacutelisiscrenacion o prueba de coombs positiva en eritrocitos

normales Cada lote nuevo se valora mediante el rastreo deun anticuerpo ya sea un anti- D un anti- jk anti- fy oanti- kell diluido se compara su capacidad de deteccioacutencontra un medio salino normal incubando 10min a 37ordmC enLISS debe poder rastrearse un anticuerpo en tanto que enmedio salino no

MATERIAL Y EQUIPO

Material Cantidad10 Tubos de ensayo de 12 x 75

1 Gradilla10 Pipetas pasteur

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1 Bulbo1 Marcador1 Microcentriacutefuga1 Bantildeo Mariacutea

MATERIAL BIOLOGICO

Gloacutebulos rojos lavados al 3 - 5Suero

REACTIVOS

Reactivo de LISSReactivo de Coombs

TECNICA1- Lavar los eritrocitos

Separar el suero del paquete de gloacutebulos rojos

Agregar cierta cantidad de eritrocitos a un tubo deensayo y agregarle solucioacuten salina

Centrifugar y decantar

Repetir este proceso 3 veces

2- Realizar la Prueba de LISS

Enumerar los tubos Poner dos gotas de LISS en cada tubo agregar una gota

de eritrocitos lavados y al 3 - 5 seguacuten el nuacutemero detubo correspondiente

Mezclar y centrifugar un minuto decantar elsobrenadante y con la ayuda de una gasa limpiar elexceso del reactivo

Poner nuevamente 2 gota de LISS resuspender poragitacioacuten agregar 2 gotas de suero problema mezclarincubar 15 minutos a 37ordm C centrifugar 30 seg A 1000

RPM Anotar los resultados

3- A las pruebas negativas realizar Coombs

Lavar 3 veces las ceacutelulas agregar suero de Coombscentrifugar 30 seg

Leer aglutinaciones y anotar resultados

REACTIVOS UTILIZADOS

REACTIVO MARCA FECHA DECADUCIDAD

ASPECTO COLOR LOTE

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SueroAntiglobuina

humana

Lafon 31 01 2009 Transparente Verde 406

LISS Caserorealizado enCMNSIGLOXXI

1 antildeo Transparente Transparente

----------

PACIENTE ASCANIO MENDEZ JOSUE O (+)DONADOR 1 GARCIA CARBAJAL OSCAR O (+)DONADOR 2 GARCIA SUAREZ ORLANDO A (+)

RESULTADOS

INTERPRETACIOacuteN DE LOS RESULTADOS

La hemoacutelisis o la aglutinacioacuten representan un resultado positivo e indican lapresencia de una reaccioacuten antiacutegeno-anticuerpo Los resultados negativos no severa aglutinacioacuten o hemolisis

ESQUEMAS

CONCLUSIONES

Concluyo que la prueba de compatibilidad sanguiacutenea en su modalidad conliss ofrece mucha ventaja al ser al igual que otros reactivos unpotencializador de la reaccioacuten antiacutegeno-anticuerpo Esto permite queel operador o realizador de la prueba tenga mayor confianza y certezaen los resultados que obtenga

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Tubo Resultado

M1 NEGATIVOm1 NEGATIVO

M2 POSITIVO

M2 NEGATIVO

AUTOTES NEGATIVO

29

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PRACTICA 9INMUNOHEMATOLOGIA

DETERMINACION DE COOMBS DIRECTO

INTRODUCCIONPRUEBA DE COOMBS DIRECTA

El examen de Coombs directo se utiliza para detectar autoanticuerpos contralos propios gloacutebulos rojos (GR) de un individuo Es una prueba que sirve parademostrar el revestimiento de los eritrocitos in vivo (mientras los eritrocitosestaacuten circulando en el individuo) La prueba se realiza agregando directamenteel reactivo de Coombs a los eritrocitos previamente lavados para eliminar otras proteiacutenas no fijadas a el una prueba directa positiva significa que larelacioacuten antiacutegeno-anticuerpo ocurrioacute in vivo es decir que la fijacioacuten del

anticuerpo sobre el antiacutegeno se realizo en el organismo del individuo enestudio

Las indicaciones principales de esta prueba son diagnostico de enfermedadeshemoliacuteticas ictericia o anomaliacuteas en la apariencia de los gloacutebulos rojos bajo elmicroscopio ya que estos anticuerpos algunas veces destruyen los gloacutebulosrojos y causan anemia para investigar reacciones en transfusiones Parainvestigar la induccioacuten de drogas en ceacutelulas rojas sensibilizadas medicamentos(por ejemplo quinidina metildopa procainamida y otros) que pueden llevar a la produccioacuten de estos anticuerpos

OBJETIVO Determinar la presencia de anticuerpos en la superficie de losgloacutebulos rojos del individuo

MATERIAL

bull 10 Tubos de 1275

bull 10 Pipetas Pasteur

bull 1 Gradilla

bull 1 Bulbo

bull Papel Parafilm

bull Microcentriacutefuga

bull Bantildeo Mariacutea a 37degC

MUESTRA BIOLOGICA

Eritrocitos lavados de (3-5) del donador o pacienteREACTIVO

Suero de CoombsSuero anti-globulina humana Lafon Lote 406 Cad 310109 Color verde Aspecto transparente

TECNICA

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Colocar en un tubo de ensaye dos gotas de suero de Coombs mas una gota deglobulos rojos (3-5)Centrifugar a 1000 rpm durante 20 segDesprender el boton suavemente y buscar la presencia de aglutinacionRotular y enumerar 8 tubos de ensayes con las diferentes diluciones

(frac12frac1418)Enumerar 8 tubos mas del 1 al 8Agregar a cada tubo de las diluciones 10 gotas de solucion salina mas 10 gotasde suero de CoombsColocar Al primer tubo de la dilucion 1 gota de globulos rojos (3-5) mezclar completamente y agregar al tubo 1Centrifugar todos los tubos a 1000 rpm durante 20 seg

LECTURA

Aglutina- Prueba de Coombs directa es positiva

No aglutina- Prueba de Coombs directa es negativa

ESQUEMAS y RESULTADOS

CONCLUCION

He concluido que la prueba de Coombs directa es una prueba que se utiliza para medir

la presencia de anticuerpos en la superficie de los gloacutebulos rojos que se encuentran

circulando en el paciente y se realiza para investigar reacciones en transfusiones ademaacutes

sirve para la determinacioacuten de anemia hemoliacutetica autoinmune entre otras afecciones

Practica 10

IDENTIFICACION DE ANTICUERPOS IRREGULARES

Fundamento

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DILUCIONES

frac12 positiva

frac14 positiva

18 positiva

116 negativa

132 negativa

164 negativa

1128 negativa1256 negativa

31

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Los anticuerpos del sistema ABO aparecen una vez que elindividuo entra en contacto con el medio ambiente y en elcual se encuentran microorganismos como algunas bacteriascoliformes que contienen sustancias quiacutemicas en suestructura parecidas a las de este sistema Por anticuerpos

regulares debemos identificar a los que existen en todoslos individuos y que eacutestos tendraacuten durante toda su vida

Los anticuerpos irregulares son los que no estaacuten de esamanera aunque en el caso de los naturales no se conoce aciencia cierta queacute o coacutemo se induce su produccioacuten Losadquiridos se conocen tambieacuten como inmunes y son elresultado de la exposicioacuten a antiacutegenos desconocidos por elindividuo al momento de la transfusioacuten o en las mujerespor el embarazo estos anticuerpos son dirigidos contraantiacutegenos de sistemas diferentes al ABO

Los anticuerpos naturales regulares son preferentementeinmunoglobulinas M las cuales fijan de manera taneficiente el complemento que pueden provocar lisisintravascular y ocasionar insuficiencia renal o incluso lamuerte del paciente Los anticuerpos adquiridos o inmunesson generalmente inmunoglobulinas G las cuales producenhemoacutelisis extravascular en el bazo o en el hiacutegado mediantefagocitosis del complejo eritrocito maacutes anticuerpo

Los aloanticuerpos irregulares (adquiridos) maacutes comunes en

nuestra poblacioacuten son los que involucran a los sistemasMNSs P1 Kidd (Jka Jkb) Duffy (Fya Fyb) Kell Lewis yDiego

OBJETIVO identificacioacuten del anticuerpo irregular a traveacutesde las diferentes teacutecnicas

MATERIAL

bull 10 Tubos de ensaye

bull 10 Pipetas Pasteur

bull

1Gradillabull 1 Bulbo

bull Papel Parafim

MATERIAL BIOLOGICO

bull Gloacutebulos rojos lavados al 3 - 5

bull Suero

bull REACTIVOSReactivos

1 Suero de Coombs2 Albuacutemina bovina

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bull EQUIPO1 Microcentriacutefuga2 Bantildeo Mariacutea oacute Estufa

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3 SOLUCION SALINA4 SOLUCION DE LISS

TEacuteCNICA SOLUCION SALINA

Lavar los eritrocitos con solucioacuten salina (3veces)SALINA RAacutePIDA

Agregar una gota de Eritrocitos LavadosDiluiacuterlo al 3-5 con solucioacuten salina 09Agregar 2 gotas de sueroCentrifugar y observar anotar desprendimientodel botoacuten

SALINA 37deg BANtildeO MARIacuteA1) Incubar tubos a Bantildeo mariacutea a 37degC durante 1

hora (o 20 min)

2) Centirfugar despueacutes de haber pasado eltiempo

3) Desprender el botoacuten de eritrocitos yobservar

AGLUTINACIOacuteNndash No es compatibleNO AGLUTINACIOacuteN - Lavar 3 veces

SALINA COOMBS1) Con solucioacuten salina 09 lavar los

eritrocitos de los tubos q no tuvieronaglutinacioacuten 3 veces

2) Decantar y agregar 2 gotas de reactivode Coombs

AGLUTINACIOacuteN ndash No es compatibleNO AGLUTINACIOacuteN - Lavar 3 veces

TECNICA LISS

1 Poner dos gotas de LISS en cada tubo agregar una gotade eritrocitos lavados y al 3 - 5 seguacuten el nuacutemero detubo correspondiente

2 Mezclar y centrifugar un minuto decantar el

sobrenadante y con la ayuda de una gasa limpiar elexceso del reactivo

3 Poner nuevamente 2 gota de LISS resuspender poragitacioacuten agregar 2 gotas de suero problema mezclarincubar 15 minutos a 37ordm C centrifugar 30 seg A 1000RPM

4 Anotar los resultados

A las pruebas negativas realizar Coombs

1 Lavar 3 veces las ceacutelulas agregar suero de Coombs

centrifugar 30 seg2 Leer aglutinaciones y anotar resultados

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TECNICA ALBUMINA BOVINA 8 Agregar 2 gotas de albuacutemina al 229 Centrifugar 20 segundos10observar aglutinacioacuten o hemolisis o no aglutinacioacuten

11A los tubos con lecturas negativas incubar 20minutos en bantildeo Mariacutea a 37 degC12Centrifugar y observar

bull Aglutinacioacuten o hemoacutelisis reportar incompatible

bull No aglutinacioacuten llevar a Coombs

13Lavar tres veces decantar y quitar el exceso desalina con gasa y agregar 2 gotas de reactivo deCoombs y centrifugar 20 segundos y observar

bull Aglutinacioacuten o hemoacutelisis reportar incompatible

bull No aglutinacioacuten reportar compatible

Resultados ANTICUERPO IRREGULAR Anticuerpo c

InterpretacioacutenEstos anticuerpos son generalmente inmunoglobulinas tipo My ocasionalmente tipo G y debido a esa temperatura dereaccioacuten carecen de importancia cliacutenica salvo que sureaccioacuten ocurra tambieacuten a 37 degC su importancia radica enpacientes que seraacuten intervenido a 22 ordmc como es el caso de

operacioacuten de corazoacuten

Los llamados anticuerpos calientes tienen una temperatura oacuteptima dereaccioacuten a 37 degC a Estos anticuerpos tienen una relevanteimportancia cliacutenica ya que se les asocia con reaccionestransfusionales de intensidad moderada a severa que puedenocasionar la muerte

Esquemas

CONCLUSIONHe concluido que es importante determinar los anticuerposirregulares ya que estos anticuerpos tienen una relevanteimportancia cliacutenica ya que se les asocia con reaccionestransfusionales de intensidad moderada a severa

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1 Bulbo1 Marcador1 Microcentriacutefuga1 Bantildeo Mariacutea

MATERIAL BIOLOGICO

Gloacutebulos rojos lavados al 3 - 5Suero

REACTIVOS

Reactivo de LISSReactivo de Coombs

TECNICA1- Lavar los eritrocitos

Separar el suero del paquete de gloacutebulos rojos

Agregar cierta cantidad de eritrocitos a un tubo deensayo y agregarle solucioacuten salina

Centrifugar y decantar

Repetir este proceso 3 veces

2- Realizar la Prueba de LISS

Enumerar los tubos Poner dos gotas de LISS en cada tubo agregar una gota

de eritrocitos lavados y al 3 - 5 seguacuten el nuacutemero detubo correspondiente

Mezclar y centrifugar un minuto decantar elsobrenadante y con la ayuda de una gasa limpiar elexceso del reactivo

Poner nuevamente 2 gota de LISS resuspender poragitacioacuten agregar 2 gotas de suero problema mezclarincubar 15 minutos a 37ordm C centrifugar 30 seg A 1000

RPM Anotar los resultados

3- A las pruebas negativas realizar Coombs

Lavar 3 veces las ceacutelulas agregar suero de Coombscentrifugar 30 seg

Leer aglutinaciones y anotar resultados

REACTIVOS UTILIZADOS

REACTIVO MARCA FECHA DECADUCIDAD

ASPECTO COLOR LOTE

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SueroAntiglobuina

humana

Lafon 31 01 2009 Transparente Verde 406

LISS Caserorealizado enCMNSIGLOXXI

1 antildeo Transparente Transparente

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PACIENTE ASCANIO MENDEZ JOSUE O (+)DONADOR 1 GARCIA CARBAJAL OSCAR O (+)DONADOR 2 GARCIA SUAREZ ORLANDO A (+)

RESULTADOS

INTERPRETACIOacuteN DE LOS RESULTADOS

La hemoacutelisis o la aglutinacioacuten representan un resultado positivo e indican lapresencia de una reaccioacuten antiacutegeno-anticuerpo Los resultados negativos no severa aglutinacioacuten o hemolisis

ESQUEMAS

CONCLUSIONES

Concluyo que la prueba de compatibilidad sanguiacutenea en su modalidad conliss ofrece mucha ventaja al ser al igual que otros reactivos unpotencializador de la reaccioacuten antiacutegeno-anticuerpo Esto permite queel operador o realizador de la prueba tenga mayor confianza y certezaen los resultados que obtenga

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Tubo Resultado

M1 NEGATIVOm1 NEGATIVO

M2 POSITIVO

M2 NEGATIVO

AUTOTES NEGATIVO

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DETERMINACION DE COOMBS DIRECTO

INTRODUCCIONPRUEBA DE COOMBS DIRECTA

El examen de Coombs directo se utiliza para detectar autoanticuerpos contralos propios gloacutebulos rojos (GR) de un individuo Es una prueba que sirve parademostrar el revestimiento de los eritrocitos in vivo (mientras los eritrocitosestaacuten circulando en el individuo) La prueba se realiza agregando directamenteel reactivo de Coombs a los eritrocitos previamente lavados para eliminar otras proteiacutenas no fijadas a el una prueba directa positiva significa que larelacioacuten antiacutegeno-anticuerpo ocurrioacute in vivo es decir que la fijacioacuten del

anticuerpo sobre el antiacutegeno se realizo en el organismo del individuo enestudio

Las indicaciones principales de esta prueba son diagnostico de enfermedadeshemoliacuteticas ictericia o anomaliacuteas en la apariencia de los gloacutebulos rojos bajo elmicroscopio ya que estos anticuerpos algunas veces destruyen los gloacutebulosrojos y causan anemia para investigar reacciones en transfusiones Parainvestigar la induccioacuten de drogas en ceacutelulas rojas sensibilizadas medicamentos(por ejemplo quinidina metildopa procainamida y otros) que pueden llevar a la produccioacuten de estos anticuerpos

OBJETIVO Determinar la presencia de anticuerpos en la superficie de losgloacutebulos rojos del individuo

MATERIAL

bull 10 Tubos de 1275

bull 10 Pipetas Pasteur

bull 1 Gradilla

bull 1 Bulbo

bull Papel Parafilm

bull Microcentriacutefuga

bull Bantildeo Mariacutea a 37degC

MUESTRA BIOLOGICA

Eritrocitos lavados de (3-5) del donador o pacienteREACTIVO

Suero de CoombsSuero anti-globulina humana Lafon Lote 406 Cad 310109 Color verde Aspecto transparente

TECNICA

OBTENIDO DE wwwquimicaclinicauvblogspotcom 30

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Colocar en un tubo de ensaye dos gotas de suero de Coombs mas una gota deglobulos rojos (3-5)Centrifugar a 1000 rpm durante 20 segDesprender el boton suavemente y buscar la presencia de aglutinacionRotular y enumerar 8 tubos de ensayes con las diferentes diluciones

(frac12frac1418)Enumerar 8 tubos mas del 1 al 8Agregar a cada tubo de las diluciones 10 gotas de solucion salina mas 10 gotasde suero de CoombsColocar Al primer tubo de la dilucion 1 gota de globulos rojos (3-5) mezclar completamente y agregar al tubo 1Centrifugar todos los tubos a 1000 rpm durante 20 seg

LECTURA

Aglutina- Prueba de Coombs directa es positiva

No aglutina- Prueba de Coombs directa es negativa

ESQUEMAS y RESULTADOS

CONCLUCION

He concluido que la prueba de Coombs directa es una prueba que se utiliza para medir

la presencia de anticuerpos en la superficie de los gloacutebulos rojos que se encuentran

circulando en el paciente y se realiza para investigar reacciones en transfusiones ademaacutes

sirve para la determinacioacuten de anemia hemoliacutetica autoinmune entre otras afecciones

Practica 10

IDENTIFICACION DE ANTICUERPOS IRREGULARES

Fundamento

OBTENIDO DE wwwquimicaclinicauvblogspotcom

DILUCIONES

frac12 positiva

frac14 positiva

18 positiva

116 negativa

132 negativa

164 negativa

1128 negativa1256 negativa

31

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Los anticuerpos del sistema ABO aparecen una vez que elindividuo entra en contacto con el medio ambiente y en elcual se encuentran microorganismos como algunas bacteriascoliformes que contienen sustancias quiacutemicas en suestructura parecidas a las de este sistema Por anticuerpos

regulares debemos identificar a los que existen en todoslos individuos y que eacutestos tendraacuten durante toda su vida

Los anticuerpos irregulares son los que no estaacuten de esamanera aunque en el caso de los naturales no se conoce aciencia cierta queacute o coacutemo se induce su produccioacuten Losadquiridos se conocen tambieacuten como inmunes y son elresultado de la exposicioacuten a antiacutegenos desconocidos por elindividuo al momento de la transfusioacuten o en las mujerespor el embarazo estos anticuerpos son dirigidos contraantiacutegenos de sistemas diferentes al ABO

Los anticuerpos naturales regulares son preferentementeinmunoglobulinas M las cuales fijan de manera taneficiente el complemento que pueden provocar lisisintravascular y ocasionar insuficiencia renal o incluso lamuerte del paciente Los anticuerpos adquiridos o inmunesson generalmente inmunoglobulinas G las cuales producenhemoacutelisis extravascular en el bazo o en el hiacutegado mediantefagocitosis del complejo eritrocito maacutes anticuerpo

Los aloanticuerpos irregulares (adquiridos) maacutes comunes en

nuestra poblacioacuten son los que involucran a los sistemasMNSs P1 Kidd (Jka Jkb) Duffy (Fya Fyb) Kell Lewis yDiego

OBJETIVO identificacioacuten del anticuerpo irregular a traveacutesde las diferentes teacutecnicas

MATERIAL

bull 10 Tubos de ensaye

bull 10 Pipetas Pasteur

bull

1Gradillabull 1 Bulbo

bull Papel Parafim

MATERIAL BIOLOGICO

bull Gloacutebulos rojos lavados al 3 - 5

bull Suero

bull REACTIVOSReactivos

1 Suero de Coombs2 Albuacutemina bovina

OBTENIDO DE wwwquimicaclinicauvblogspotcom 32

bull EQUIPO1 Microcentriacutefuga2 Bantildeo Mariacutea oacute Estufa

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3 SOLUCION SALINA4 SOLUCION DE LISS

TEacuteCNICA SOLUCION SALINA

Lavar los eritrocitos con solucioacuten salina (3veces)SALINA RAacutePIDA

Agregar una gota de Eritrocitos LavadosDiluiacuterlo al 3-5 con solucioacuten salina 09Agregar 2 gotas de sueroCentrifugar y observar anotar desprendimientodel botoacuten

SALINA 37deg BANtildeO MARIacuteA1) Incubar tubos a Bantildeo mariacutea a 37degC durante 1

hora (o 20 min)

2) Centirfugar despueacutes de haber pasado eltiempo

3) Desprender el botoacuten de eritrocitos yobservar

AGLUTINACIOacuteNndash No es compatibleNO AGLUTINACIOacuteN - Lavar 3 veces

SALINA COOMBS1) Con solucioacuten salina 09 lavar los

eritrocitos de los tubos q no tuvieronaglutinacioacuten 3 veces

2) Decantar y agregar 2 gotas de reactivode Coombs

AGLUTINACIOacuteN ndash No es compatibleNO AGLUTINACIOacuteN - Lavar 3 veces

TECNICA LISS

1 Poner dos gotas de LISS en cada tubo agregar una gotade eritrocitos lavados y al 3 - 5 seguacuten el nuacutemero detubo correspondiente

2 Mezclar y centrifugar un minuto decantar el

sobrenadante y con la ayuda de una gasa limpiar elexceso del reactivo

3 Poner nuevamente 2 gota de LISS resuspender poragitacioacuten agregar 2 gotas de suero problema mezclarincubar 15 minutos a 37ordm C centrifugar 30 seg A 1000RPM

4 Anotar los resultados

A las pruebas negativas realizar Coombs

1 Lavar 3 veces las ceacutelulas agregar suero de Coombs

centrifugar 30 seg2 Leer aglutinaciones y anotar resultados

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TECNICA ALBUMINA BOVINA 8 Agregar 2 gotas de albuacutemina al 229 Centrifugar 20 segundos10observar aglutinacioacuten o hemolisis o no aglutinacioacuten

11A los tubos con lecturas negativas incubar 20minutos en bantildeo Mariacutea a 37 degC12Centrifugar y observar

bull Aglutinacioacuten o hemoacutelisis reportar incompatible

bull No aglutinacioacuten llevar a Coombs

13Lavar tres veces decantar y quitar el exceso desalina con gasa y agregar 2 gotas de reactivo deCoombs y centrifugar 20 segundos y observar

bull Aglutinacioacuten o hemoacutelisis reportar incompatible

bull No aglutinacioacuten reportar compatible

Resultados ANTICUERPO IRREGULAR Anticuerpo c

InterpretacioacutenEstos anticuerpos son generalmente inmunoglobulinas tipo My ocasionalmente tipo G y debido a esa temperatura dereaccioacuten carecen de importancia cliacutenica salvo que sureaccioacuten ocurra tambieacuten a 37 degC su importancia radica enpacientes que seraacuten intervenido a 22 ordmc como es el caso de

operacioacuten de corazoacuten

Los llamados anticuerpos calientes tienen una temperatura oacuteptima dereaccioacuten a 37 degC a Estos anticuerpos tienen una relevanteimportancia cliacutenica ya que se les asocia con reaccionestransfusionales de intensidad moderada a severa que puedenocasionar la muerte

Esquemas

CONCLUSIONHe concluido que es importante determinar los anticuerposirregulares ya que estos anticuerpos tienen una relevanteimportancia cliacutenica ya que se les asocia con reaccionestransfusionales de intensidad moderada a severa

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SueroAntiglobuina

humana

Lafon 31 01 2009 Transparente Verde 406

LISS Caserorealizado enCMNSIGLOXXI

1 antildeo Transparente Transparente

----------

PACIENTE ASCANIO MENDEZ JOSUE O (+)DONADOR 1 GARCIA CARBAJAL OSCAR O (+)DONADOR 2 GARCIA SUAREZ ORLANDO A (+)

RESULTADOS

INTERPRETACIOacuteN DE LOS RESULTADOS

La hemoacutelisis o la aglutinacioacuten representan un resultado positivo e indican lapresencia de una reaccioacuten antiacutegeno-anticuerpo Los resultados negativos no severa aglutinacioacuten o hemolisis

ESQUEMAS

CONCLUSIONES

Concluyo que la prueba de compatibilidad sanguiacutenea en su modalidad conliss ofrece mucha ventaja al ser al igual que otros reactivos unpotencializador de la reaccioacuten antiacutegeno-anticuerpo Esto permite queel operador o realizador de la prueba tenga mayor confianza y certezaen los resultados que obtenga

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Tubo Resultado

M1 NEGATIVOm1 NEGATIVO

M2 POSITIVO

M2 NEGATIVO

AUTOTES NEGATIVO

29

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PRACTICA 9INMUNOHEMATOLOGIA

DETERMINACION DE COOMBS DIRECTO

INTRODUCCIONPRUEBA DE COOMBS DIRECTA

El examen de Coombs directo se utiliza para detectar autoanticuerpos contralos propios gloacutebulos rojos (GR) de un individuo Es una prueba que sirve parademostrar el revestimiento de los eritrocitos in vivo (mientras los eritrocitosestaacuten circulando en el individuo) La prueba se realiza agregando directamenteel reactivo de Coombs a los eritrocitos previamente lavados para eliminar otras proteiacutenas no fijadas a el una prueba directa positiva significa que larelacioacuten antiacutegeno-anticuerpo ocurrioacute in vivo es decir que la fijacioacuten del

anticuerpo sobre el antiacutegeno se realizo en el organismo del individuo enestudio

Las indicaciones principales de esta prueba son diagnostico de enfermedadeshemoliacuteticas ictericia o anomaliacuteas en la apariencia de los gloacutebulos rojos bajo elmicroscopio ya que estos anticuerpos algunas veces destruyen los gloacutebulosrojos y causan anemia para investigar reacciones en transfusiones Parainvestigar la induccioacuten de drogas en ceacutelulas rojas sensibilizadas medicamentos(por ejemplo quinidina metildopa procainamida y otros) que pueden llevar a la produccioacuten de estos anticuerpos

OBJETIVO Determinar la presencia de anticuerpos en la superficie de losgloacutebulos rojos del individuo

MATERIAL

bull 10 Tubos de 1275

bull 10 Pipetas Pasteur

bull 1 Gradilla

bull 1 Bulbo

bull Papel Parafilm

bull Microcentriacutefuga

bull Bantildeo Mariacutea a 37degC

MUESTRA BIOLOGICA

Eritrocitos lavados de (3-5) del donador o pacienteREACTIVO

Suero de CoombsSuero anti-globulina humana Lafon Lote 406 Cad 310109 Color verde Aspecto transparente

TECNICA

OBTENIDO DE wwwquimicaclinicauvblogspotcom 30

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Colocar en un tubo de ensaye dos gotas de suero de Coombs mas una gota deglobulos rojos (3-5)Centrifugar a 1000 rpm durante 20 segDesprender el boton suavemente y buscar la presencia de aglutinacionRotular y enumerar 8 tubos de ensayes con las diferentes diluciones

(frac12frac1418)Enumerar 8 tubos mas del 1 al 8Agregar a cada tubo de las diluciones 10 gotas de solucion salina mas 10 gotasde suero de CoombsColocar Al primer tubo de la dilucion 1 gota de globulos rojos (3-5) mezclar completamente y agregar al tubo 1Centrifugar todos los tubos a 1000 rpm durante 20 seg

LECTURA

Aglutina- Prueba de Coombs directa es positiva

No aglutina- Prueba de Coombs directa es negativa

ESQUEMAS y RESULTADOS

CONCLUCION

He concluido que la prueba de Coombs directa es una prueba que se utiliza para medir

la presencia de anticuerpos en la superficie de los gloacutebulos rojos que se encuentran

circulando en el paciente y se realiza para investigar reacciones en transfusiones ademaacutes

sirve para la determinacioacuten de anemia hemoliacutetica autoinmune entre otras afecciones

Practica 10

IDENTIFICACION DE ANTICUERPOS IRREGULARES

Fundamento

OBTENIDO DE wwwquimicaclinicauvblogspotcom

DILUCIONES

frac12 positiva

frac14 positiva

18 positiva

116 negativa

132 negativa

164 negativa

1128 negativa1256 negativa

31

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Los anticuerpos del sistema ABO aparecen una vez que elindividuo entra en contacto con el medio ambiente y en elcual se encuentran microorganismos como algunas bacteriascoliformes que contienen sustancias quiacutemicas en suestructura parecidas a las de este sistema Por anticuerpos

regulares debemos identificar a los que existen en todoslos individuos y que eacutestos tendraacuten durante toda su vida

Los anticuerpos irregulares son los que no estaacuten de esamanera aunque en el caso de los naturales no se conoce aciencia cierta queacute o coacutemo se induce su produccioacuten Losadquiridos se conocen tambieacuten como inmunes y son elresultado de la exposicioacuten a antiacutegenos desconocidos por elindividuo al momento de la transfusioacuten o en las mujerespor el embarazo estos anticuerpos son dirigidos contraantiacutegenos de sistemas diferentes al ABO

Los anticuerpos naturales regulares son preferentementeinmunoglobulinas M las cuales fijan de manera taneficiente el complemento que pueden provocar lisisintravascular y ocasionar insuficiencia renal o incluso lamuerte del paciente Los anticuerpos adquiridos o inmunesson generalmente inmunoglobulinas G las cuales producenhemoacutelisis extravascular en el bazo o en el hiacutegado mediantefagocitosis del complejo eritrocito maacutes anticuerpo

Los aloanticuerpos irregulares (adquiridos) maacutes comunes en

nuestra poblacioacuten son los que involucran a los sistemasMNSs P1 Kidd (Jka Jkb) Duffy (Fya Fyb) Kell Lewis yDiego

OBJETIVO identificacioacuten del anticuerpo irregular a traveacutesde las diferentes teacutecnicas

MATERIAL

bull 10 Tubos de ensaye

bull 10 Pipetas Pasteur

bull

1Gradillabull 1 Bulbo

bull Papel Parafim

MATERIAL BIOLOGICO

bull Gloacutebulos rojos lavados al 3 - 5

bull Suero

bull REACTIVOSReactivos

1 Suero de Coombs2 Albuacutemina bovina

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bull EQUIPO1 Microcentriacutefuga2 Bantildeo Mariacutea oacute Estufa

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3 SOLUCION SALINA4 SOLUCION DE LISS

TEacuteCNICA SOLUCION SALINA

Lavar los eritrocitos con solucioacuten salina (3veces)SALINA RAacutePIDA

Agregar una gota de Eritrocitos LavadosDiluiacuterlo al 3-5 con solucioacuten salina 09Agregar 2 gotas de sueroCentrifugar y observar anotar desprendimientodel botoacuten

SALINA 37deg BANtildeO MARIacuteA1) Incubar tubos a Bantildeo mariacutea a 37degC durante 1

hora (o 20 min)

2) Centirfugar despueacutes de haber pasado eltiempo

3) Desprender el botoacuten de eritrocitos yobservar

AGLUTINACIOacuteNndash No es compatibleNO AGLUTINACIOacuteN - Lavar 3 veces

SALINA COOMBS1) Con solucioacuten salina 09 lavar los

eritrocitos de los tubos q no tuvieronaglutinacioacuten 3 veces

2) Decantar y agregar 2 gotas de reactivode Coombs

AGLUTINACIOacuteN ndash No es compatibleNO AGLUTINACIOacuteN - Lavar 3 veces

TECNICA LISS

1 Poner dos gotas de LISS en cada tubo agregar una gotade eritrocitos lavados y al 3 - 5 seguacuten el nuacutemero detubo correspondiente

2 Mezclar y centrifugar un minuto decantar el

sobrenadante y con la ayuda de una gasa limpiar elexceso del reactivo

3 Poner nuevamente 2 gota de LISS resuspender poragitacioacuten agregar 2 gotas de suero problema mezclarincubar 15 minutos a 37ordm C centrifugar 30 seg A 1000RPM

4 Anotar los resultados

A las pruebas negativas realizar Coombs

1 Lavar 3 veces las ceacutelulas agregar suero de Coombs

centrifugar 30 seg2 Leer aglutinaciones y anotar resultados

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TECNICA ALBUMINA BOVINA 8 Agregar 2 gotas de albuacutemina al 229 Centrifugar 20 segundos10observar aglutinacioacuten o hemolisis o no aglutinacioacuten

11A los tubos con lecturas negativas incubar 20minutos en bantildeo Mariacutea a 37 degC12Centrifugar y observar

bull Aglutinacioacuten o hemoacutelisis reportar incompatible

bull No aglutinacioacuten llevar a Coombs

13Lavar tres veces decantar y quitar el exceso desalina con gasa y agregar 2 gotas de reactivo deCoombs y centrifugar 20 segundos y observar

bull Aglutinacioacuten o hemoacutelisis reportar incompatible

bull No aglutinacioacuten reportar compatible

Resultados ANTICUERPO IRREGULAR Anticuerpo c

InterpretacioacutenEstos anticuerpos son generalmente inmunoglobulinas tipo My ocasionalmente tipo G y debido a esa temperatura dereaccioacuten carecen de importancia cliacutenica salvo que sureaccioacuten ocurra tambieacuten a 37 degC su importancia radica enpacientes que seraacuten intervenido a 22 ordmc como es el caso de

operacioacuten de corazoacuten

Los llamados anticuerpos calientes tienen una temperatura oacuteptima dereaccioacuten a 37 degC a Estos anticuerpos tienen una relevanteimportancia cliacutenica ya que se les asocia con reaccionestransfusionales de intensidad moderada a severa que puedenocasionar la muerte

Esquemas

CONCLUSIONHe concluido que es importante determinar los anticuerposirregulares ya que estos anticuerpos tienen una relevanteimportancia cliacutenica ya que se les asocia con reaccionestransfusionales de intensidad moderada a severa

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PRACTICA 9INMUNOHEMATOLOGIA

DETERMINACION DE COOMBS DIRECTO

INTRODUCCIONPRUEBA DE COOMBS DIRECTA

El examen de Coombs directo se utiliza para detectar autoanticuerpos contralos propios gloacutebulos rojos (GR) de un individuo Es una prueba que sirve parademostrar el revestimiento de los eritrocitos in vivo (mientras los eritrocitosestaacuten circulando en el individuo) La prueba se realiza agregando directamenteel reactivo de Coombs a los eritrocitos previamente lavados para eliminar otras proteiacutenas no fijadas a el una prueba directa positiva significa que larelacioacuten antiacutegeno-anticuerpo ocurrioacute in vivo es decir que la fijacioacuten del

anticuerpo sobre el antiacutegeno se realizo en el organismo del individuo enestudio

Las indicaciones principales de esta prueba son diagnostico de enfermedadeshemoliacuteticas ictericia o anomaliacuteas en la apariencia de los gloacutebulos rojos bajo elmicroscopio ya que estos anticuerpos algunas veces destruyen los gloacutebulosrojos y causan anemia para investigar reacciones en transfusiones Parainvestigar la induccioacuten de drogas en ceacutelulas rojas sensibilizadas medicamentos(por ejemplo quinidina metildopa procainamida y otros) que pueden llevar a la produccioacuten de estos anticuerpos

OBJETIVO Determinar la presencia de anticuerpos en la superficie de losgloacutebulos rojos del individuo

MATERIAL

bull 10 Tubos de 1275

bull 10 Pipetas Pasteur

bull 1 Gradilla

bull 1 Bulbo

bull Papel Parafilm

bull Microcentriacutefuga

bull Bantildeo Mariacutea a 37degC

MUESTRA BIOLOGICA

Eritrocitos lavados de (3-5) del donador o pacienteREACTIVO

Suero de CoombsSuero anti-globulina humana Lafon Lote 406 Cad 310109 Color verde Aspecto transparente

TECNICA

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Colocar en un tubo de ensaye dos gotas de suero de Coombs mas una gota deglobulos rojos (3-5)Centrifugar a 1000 rpm durante 20 segDesprender el boton suavemente y buscar la presencia de aglutinacionRotular y enumerar 8 tubos de ensayes con las diferentes diluciones

(frac12frac1418)Enumerar 8 tubos mas del 1 al 8Agregar a cada tubo de las diluciones 10 gotas de solucion salina mas 10 gotasde suero de CoombsColocar Al primer tubo de la dilucion 1 gota de globulos rojos (3-5) mezclar completamente y agregar al tubo 1Centrifugar todos los tubos a 1000 rpm durante 20 seg

LECTURA

Aglutina- Prueba de Coombs directa es positiva

No aglutina- Prueba de Coombs directa es negativa

ESQUEMAS y RESULTADOS

CONCLUCION

He concluido que la prueba de Coombs directa es una prueba que se utiliza para medir

la presencia de anticuerpos en la superficie de los gloacutebulos rojos que se encuentran

circulando en el paciente y se realiza para investigar reacciones en transfusiones ademaacutes

sirve para la determinacioacuten de anemia hemoliacutetica autoinmune entre otras afecciones

Practica 10

IDENTIFICACION DE ANTICUERPOS IRREGULARES

Fundamento

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DILUCIONES

frac12 positiva

frac14 positiva

18 positiva

116 negativa

132 negativa

164 negativa

1128 negativa1256 negativa

31

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Los anticuerpos del sistema ABO aparecen una vez que elindividuo entra en contacto con el medio ambiente y en elcual se encuentran microorganismos como algunas bacteriascoliformes que contienen sustancias quiacutemicas en suestructura parecidas a las de este sistema Por anticuerpos

regulares debemos identificar a los que existen en todoslos individuos y que eacutestos tendraacuten durante toda su vida

Los anticuerpos irregulares son los que no estaacuten de esamanera aunque en el caso de los naturales no se conoce aciencia cierta queacute o coacutemo se induce su produccioacuten Losadquiridos se conocen tambieacuten como inmunes y son elresultado de la exposicioacuten a antiacutegenos desconocidos por elindividuo al momento de la transfusioacuten o en las mujerespor el embarazo estos anticuerpos son dirigidos contraantiacutegenos de sistemas diferentes al ABO

Los anticuerpos naturales regulares son preferentementeinmunoglobulinas M las cuales fijan de manera taneficiente el complemento que pueden provocar lisisintravascular y ocasionar insuficiencia renal o incluso lamuerte del paciente Los anticuerpos adquiridos o inmunesson generalmente inmunoglobulinas G las cuales producenhemoacutelisis extravascular en el bazo o en el hiacutegado mediantefagocitosis del complejo eritrocito maacutes anticuerpo

Los aloanticuerpos irregulares (adquiridos) maacutes comunes en

nuestra poblacioacuten son los que involucran a los sistemasMNSs P1 Kidd (Jka Jkb) Duffy (Fya Fyb) Kell Lewis yDiego

OBJETIVO identificacioacuten del anticuerpo irregular a traveacutesde las diferentes teacutecnicas

MATERIAL

bull 10 Tubos de ensaye

bull 10 Pipetas Pasteur

bull

1Gradillabull 1 Bulbo

bull Papel Parafim

MATERIAL BIOLOGICO

bull Gloacutebulos rojos lavados al 3 - 5

bull Suero

bull REACTIVOSReactivos

1 Suero de Coombs2 Albuacutemina bovina

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bull EQUIPO1 Microcentriacutefuga2 Bantildeo Mariacutea oacute Estufa

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3 SOLUCION SALINA4 SOLUCION DE LISS

TEacuteCNICA SOLUCION SALINA

Lavar los eritrocitos con solucioacuten salina (3veces)SALINA RAacutePIDA

Agregar una gota de Eritrocitos LavadosDiluiacuterlo al 3-5 con solucioacuten salina 09Agregar 2 gotas de sueroCentrifugar y observar anotar desprendimientodel botoacuten

SALINA 37deg BANtildeO MARIacuteA1) Incubar tubos a Bantildeo mariacutea a 37degC durante 1

hora (o 20 min)

2) Centirfugar despueacutes de haber pasado eltiempo

3) Desprender el botoacuten de eritrocitos yobservar

AGLUTINACIOacuteNndash No es compatibleNO AGLUTINACIOacuteN - Lavar 3 veces

SALINA COOMBS1) Con solucioacuten salina 09 lavar los

eritrocitos de los tubos q no tuvieronaglutinacioacuten 3 veces

2) Decantar y agregar 2 gotas de reactivode Coombs

AGLUTINACIOacuteN ndash No es compatibleNO AGLUTINACIOacuteN - Lavar 3 veces

TECNICA LISS

1 Poner dos gotas de LISS en cada tubo agregar una gotade eritrocitos lavados y al 3 - 5 seguacuten el nuacutemero detubo correspondiente

2 Mezclar y centrifugar un minuto decantar el

sobrenadante y con la ayuda de una gasa limpiar elexceso del reactivo

3 Poner nuevamente 2 gota de LISS resuspender poragitacioacuten agregar 2 gotas de suero problema mezclarincubar 15 minutos a 37ordm C centrifugar 30 seg A 1000RPM

4 Anotar los resultados

A las pruebas negativas realizar Coombs

1 Lavar 3 veces las ceacutelulas agregar suero de Coombs

centrifugar 30 seg2 Leer aglutinaciones y anotar resultados

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TECNICA ALBUMINA BOVINA 8 Agregar 2 gotas de albuacutemina al 229 Centrifugar 20 segundos10observar aglutinacioacuten o hemolisis o no aglutinacioacuten

11A los tubos con lecturas negativas incubar 20minutos en bantildeo Mariacutea a 37 degC12Centrifugar y observar

bull Aglutinacioacuten o hemoacutelisis reportar incompatible

bull No aglutinacioacuten llevar a Coombs

13Lavar tres veces decantar y quitar el exceso desalina con gasa y agregar 2 gotas de reactivo deCoombs y centrifugar 20 segundos y observar

bull Aglutinacioacuten o hemoacutelisis reportar incompatible

bull No aglutinacioacuten reportar compatible

Resultados ANTICUERPO IRREGULAR Anticuerpo c

InterpretacioacutenEstos anticuerpos son generalmente inmunoglobulinas tipo My ocasionalmente tipo G y debido a esa temperatura dereaccioacuten carecen de importancia cliacutenica salvo que sureaccioacuten ocurra tambieacuten a 37 degC su importancia radica enpacientes que seraacuten intervenido a 22 ordmc como es el caso de

operacioacuten de corazoacuten

Los llamados anticuerpos calientes tienen una temperatura oacuteptima dereaccioacuten a 37 degC a Estos anticuerpos tienen una relevanteimportancia cliacutenica ya que se les asocia con reaccionestransfusionales de intensidad moderada a severa que puedenocasionar la muerte

Esquemas

CONCLUSIONHe concluido que es importante determinar los anticuerposirregulares ya que estos anticuerpos tienen una relevanteimportancia cliacutenica ya que se les asocia con reaccionestransfusionales de intensidad moderada a severa

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Colocar en un tubo de ensaye dos gotas de suero de Coombs mas una gota deglobulos rojos (3-5)Centrifugar a 1000 rpm durante 20 segDesprender el boton suavemente y buscar la presencia de aglutinacionRotular y enumerar 8 tubos de ensayes con las diferentes diluciones

(frac12frac1418)Enumerar 8 tubos mas del 1 al 8Agregar a cada tubo de las diluciones 10 gotas de solucion salina mas 10 gotasde suero de CoombsColocar Al primer tubo de la dilucion 1 gota de globulos rojos (3-5) mezclar completamente y agregar al tubo 1Centrifugar todos los tubos a 1000 rpm durante 20 seg

LECTURA

Aglutina- Prueba de Coombs directa es positiva

No aglutina- Prueba de Coombs directa es negativa

ESQUEMAS y RESULTADOS

CONCLUCION

He concluido que la prueba de Coombs directa es una prueba que se utiliza para medir

la presencia de anticuerpos en la superficie de los gloacutebulos rojos que se encuentran

circulando en el paciente y se realiza para investigar reacciones en transfusiones ademaacutes

sirve para la determinacioacuten de anemia hemoliacutetica autoinmune entre otras afecciones

Practica 10

IDENTIFICACION DE ANTICUERPOS IRREGULARES

Fundamento

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DILUCIONES

frac12 positiva

frac14 positiva

18 positiva

116 negativa

132 negativa

164 negativa

1128 negativa1256 negativa

31

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Los anticuerpos del sistema ABO aparecen una vez que elindividuo entra en contacto con el medio ambiente y en elcual se encuentran microorganismos como algunas bacteriascoliformes que contienen sustancias quiacutemicas en suestructura parecidas a las de este sistema Por anticuerpos

regulares debemos identificar a los que existen en todoslos individuos y que eacutestos tendraacuten durante toda su vida

Los anticuerpos irregulares son los que no estaacuten de esamanera aunque en el caso de los naturales no se conoce aciencia cierta queacute o coacutemo se induce su produccioacuten Losadquiridos se conocen tambieacuten como inmunes y son elresultado de la exposicioacuten a antiacutegenos desconocidos por elindividuo al momento de la transfusioacuten o en las mujerespor el embarazo estos anticuerpos son dirigidos contraantiacutegenos de sistemas diferentes al ABO

Los anticuerpos naturales regulares son preferentementeinmunoglobulinas M las cuales fijan de manera taneficiente el complemento que pueden provocar lisisintravascular y ocasionar insuficiencia renal o incluso lamuerte del paciente Los anticuerpos adquiridos o inmunesson generalmente inmunoglobulinas G las cuales producenhemoacutelisis extravascular en el bazo o en el hiacutegado mediantefagocitosis del complejo eritrocito maacutes anticuerpo

Los aloanticuerpos irregulares (adquiridos) maacutes comunes en

nuestra poblacioacuten son los que involucran a los sistemasMNSs P1 Kidd (Jka Jkb) Duffy (Fya Fyb) Kell Lewis yDiego

OBJETIVO identificacioacuten del anticuerpo irregular a traveacutesde las diferentes teacutecnicas

MATERIAL

bull 10 Tubos de ensaye

bull 10 Pipetas Pasteur

bull

1Gradillabull 1 Bulbo

bull Papel Parafim

MATERIAL BIOLOGICO

bull Gloacutebulos rojos lavados al 3 - 5

bull Suero

bull REACTIVOSReactivos

1 Suero de Coombs2 Albuacutemina bovina

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bull EQUIPO1 Microcentriacutefuga2 Bantildeo Mariacutea oacute Estufa

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3 SOLUCION SALINA4 SOLUCION DE LISS

TEacuteCNICA SOLUCION SALINA

Lavar los eritrocitos con solucioacuten salina (3veces)SALINA RAacutePIDA

Agregar una gota de Eritrocitos LavadosDiluiacuterlo al 3-5 con solucioacuten salina 09Agregar 2 gotas de sueroCentrifugar y observar anotar desprendimientodel botoacuten

SALINA 37deg BANtildeO MARIacuteA1) Incubar tubos a Bantildeo mariacutea a 37degC durante 1

hora (o 20 min)

2) Centirfugar despueacutes de haber pasado eltiempo

3) Desprender el botoacuten de eritrocitos yobservar

AGLUTINACIOacuteNndash No es compatibleNO AGLUTINACIOacuteN - Lavar 3 veces

SALINA COOMBS1) Con solucioacuten salina 09 lavar los

eritrocitos de los tubos q no tuvieronaglutinacioacuten 3 veces

2) Decantar y agregar 2 gotas de reactivode Coombs

AGLUTINACIOacuteN ndash No es compatibleNO AGLUTINACIOacuteN - Lavar 3 veces

TECNICA LISS

1 Poner dos gotas de LISS en cada tubo agregar una gotade eritrocitos lavados y al 3 - 5 seguacuten el nuacutemero detubo correspondiente

2 Mezclar y centrifugar un minuto decantar el

sobrenadante y con la ayuda de una gasa limpiar elexceso del reactivo

3 Poner nuevamente 2 gota de LISS resuspender poragitacioacuten agregar 2 gotas de suero problema mezclarincubar 15 minutos a 37ordm C centrifugar 30 seg A 1000RPM

4 Anotar los resultados

A las pruebas negativas realizar Coombs

1 Lavar 3 veces las ceacutelulas agregar suero de Coombs

centrifugar 30 seg2 Leer aglutinaciones y anotar resultados

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TECNICA ALBUMINA BOVINA 8 Agregar 2 gotas de albuacutemina al 229 Centrifugar 20 segundos10observar aglutinacioacuten o hemolisis o no aglutinacioacuten

11A los tubos con lecturas negativas incubar 20minutos en bantildeo Mariacutea a 37 degC12Centrifugar y observar

bull Aglutinacioacuten o hemoacutelisis reportar incompatible

bull No aglutinacioacuten llevar a Coombs

13Lavar tres veces decantar y quitar el exceso desalina con gasa y agregar 2 gotas de reactivo deCoombs y centrifugar 20 segundos y observar

bull Aglutinacioacuten o hemoacutelisis reportar incompatible

bull No aglutinacioacuten reportar compatible

Resultados ANTICUERPO IRREGULAR Anticuerpo c

InterpretacioacutenEstos anticuerpos son generalmente inmunoglobulinas tipo My ocasionalmente tipo G y debido a esa temperatura dereaccioacuten carecen de importancia cliacutenica salvo que sureaccioacuten ocurra tambieacuten a 37 degC su importancia radica enpacientes que seraacuten intervenido a 22 ordmc como es el caso de

operacioacuten de corazoacuten

Los llamados anticuerpos calientes tienen una temperatura oacuteptima dereaccioacuten a 37 degC a Estos anticuerpos tienen una relevanteimportancia cliacutenica ya que se les asocia con reaccionestransfusionales de intensidad moderada a severa que puedenocasionar la muerte

Esquemas

CONCLUSIONHe concluido que es importante determinar los anticuerposirregulares ya que estos anticuerpos tienen una relevanteimportancia cliacutenica ya que se les asocia con reaccionestransfusionales de intensidad moderada a severa

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Los anticuerpos del sistema ABO aparecen una vez que elindividuo entra en contacto con el medio ambiente y en elcual se encuentran microorganismos como algunas bacteriascoliformes que contienen sustancias quiacutemicas en suestructura parecidas a las de este sistema Por anticuerpos

regulares debemos identificar a los que existen en todoslos individuos y que eacutestos tendraacuten durante toda su vida

Los anticuerpos irregulares son los que no estaacuten de esamanera aunque en el caso de los naturales no se conoce aciencia cierta queacute o coacutemo se induce su produccioacuten Losadquiridos se conocen tambieacuten como inmunes y son elresultado de la exposicioacuten a antiacutegenos desconocidos por elindividuo al momento de la transfusioacuten o en las mujerespor el embarazo estos anticuerpos son dirigidos contraantiacutegenos de sistemas diferentes al ABO

Los anticuerpos naturales regulares son preferentementeinmunoglobulinas M las cuales fijan de manera taneficiente el complemento que pueden provocar lisisintravascular y ocasionar insuficiencia renal o incluso lamuerte del paciente Los anticuerpos adquiridos o inmunesson generalmente inmunoglobulinas G las cuales producenhemoacutelisis extravascular en el bazo o en el hiacutegado mediantefagocitosis del complejo eritrocito maacutes anticuerpo

Los aloanticuerpos irregulares (adquiridos) maacutes comunes en

nuestra poblacioacuten son los que involucran a los sistemasMNSs P1 Kidd (Jka Jkb) Duffy (Fya Fyb) Kell Lewis yDiego

OBJETIVO identificacioacuten del anticuerpo irregular a traveacutesde las diferentes teacutecnicas

MATERIAL

bull 10 Tubos de ensaye

bull 10 Pipetas Pasteur

bull

1Gradillabull 1 Bulbo

bull Papel Parafim

MATERIAL BIOLOGICO

bull Gloacutebulos rojos lavados al 3 - 5

bull Suero

bull REACTIVOSReactivos

1 Suero de Coombs2 Albuacutemina bovina

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3 SOLUCION SALINA4 SOLUCION DE LISS

TEacuteCNICA SOLUCION SALINA

Lavar los eritrocitos con solucioacuten salina (3veces)SALINA RAacutePIDA

Agregar una gota de Eritrocitos LavadosDiluiacuterlo al 3-5 con solucioacuten salina 09Agregar 2 gotas de sueroCentrifugar y observar anotar desprendimientodel botoacuten

SALINA 37deg BANtildeO MARIacuteA1) Incubar tubos a Bantildeo mariacutea a 37degC durante 1

hora (o 20 min)

2) Centirfugar despueacutes de haber pasado eltiempo

3) Desprender el botoacuten de eritrocitos yobservar

AGLUTINACIOacuteNndash No es compatibleNO AGLUTINACIOacuteN - Lavar 3 veces

SALINA COOMBS1) Con solucioacuten salina 09 lavar los

eritrocitos de los tubos q no tuvieronaglutinacioacuten 3 veces

2) Decantar y agregar 2 gotas de reactivode Coombs

AGLUTINACIOacuteN ndash No es compatibleNO AGLUTINACIOacuteN - Lavar 3 veces

TECNICA LISS

1 Poner dos gotas de LISS en cada tubo agregar una gotade eritrocitos lavados y al 3 - 5 seguacuten el nuacutemero detubo correspondiente

2 Mezclar y centrifugar un minuto decantar el

sobrenadante y con la ayuda de una gasa limpiar elexceso del reactivo

3 Poner nuevamente 2 gota de LISS resuspender poragitacioacuten agregar 2 gotas de suero problema mezclarincubar 15 minutos a 37ordm C centrifugar 30 seg A 1000RPM

4 Anotar los resultados

A las pruebas negativas realizar Coombs

1 Lavar 3 veces las ceacutelulas agregar suero de Coombs

centrifugar 30 seg2 Leer aglutinaciones y anotar resultados

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TECNICA ALBUMINA BOVINA 8 Agregar 2 gotas de albuacutemina al 229 Centrifugar 20 segundos10observar aglutinacioacuten o hemolisis o no aglutinacioacuten

11A los tubos con lecturas negativas incubar 20minutos en bantildeo Mariacutea a 37 degC12Centrifugar y observar

bull Aglutinacioacuten o hemoacutelisis reportar incompatible

bull No aglutinacioacuten llevar a Coombs

13Lavar tres veces decantar y quitar el exceso desalina con gasa y agregar 2 gotas de reactivo deCoombs y centrifugar 20 segundos y observar

bull Aglutinacioacuten o hemoacutelisis reportar incompatible

bull No aglutinacioacuten reportar compatible

Resultados ANTICUERPO IRREGULAR Anticuerpo c

InterpretacioacutenEstos anticuerpos son generalmente inmunoglobulinas tipo My ocasionalmente tipo G y debido a esa temperatura dereaccioacuten carecen de importancia cliacutenica salvo que sureaccioacuten ocurra tambieacuten a 37 degC su importancia radica enpacientes que seraacuten intervenido a 22 ordmc como es el caso de

operacioacuten de corazoacuten

Los llamados anticuerpos calientes tienen una temperatura oacuteptima dereaccioacuten a 37 degC a Estos anticuerpos tienen una relevanteimportancia cliacutenica ya que se les asocia con reaccionestransfusionales de intensidad moderada a severa que puedenocasionar la muerte

Esquemas

CONCLUSIONHe concluido que es importante determinar los anticuerposirregulares ya que estos anticuerpos tienen una relevanteimportancia cliacutenica ya que se les asocia con reaccionestransfusionales de intensidad moderada a severa

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TEacuteCNICA SOLUCION SALINA

Lavar los eritrocitos con solucioacuten salina (3veces)SALINA RAacutePIDA

Agregar una gota de Eritrocitos LavadosDiluiacuterlo al 3-5 con solucioacuten salina 09Agregar 2 gotas de sueroCentrifugar y observar anotar desprendimientodel botoacuten

SALINA 37deg BANtildeO MARIacuteA1) Incubar tubos a Bantildeo mariacutea a 37degC durante 1

hora (o 20 min)

2) Centirfugar despueacutes de haber pasado eltiempo

3) Desprender el botoacuten de eritrocitos yobservar

AGLUTINACIOacuteNndash No es compatibleNO AGLUTINACIOacuteN - Lavar 3 veces

SALINA COOMBS1) Con solucioacuten salina 09 lavar los

eritrocitos de los tubos q no tuvieronaglutinacioacuten 3 veces

2) Decantar y agregar 2 gotas de reactivode Coombs

AGLUTINACIOacuteN ndash No es compatibleNO AGLUTINACIOacuteN - Lavar 3 veces

TECNICA LISS

1 Poner dos gotas de LISS en cada tubo agregar una gotade eritrocitos lavados y al 3 - 5 seguacuten el nuacutemero detubo correspondiente

2 Mezclar y centrifugar un minuto decantar el

sobrenadante y con la ayuda de una gasa limpiar elexceso del reactivo

3 Poner nuevamente 2 gota de LISS resuspender poragitacioacuten agregar 2 gotas de suero problema mezclarincubar 15 minutos a 37ordm C centrifugar 30 seg A 1000RPM

4 Anotar los resultados

A las pruebas negativas realizar Coombs

1 Lavar 3 veces las ceacutelulas agregar suero de Coombs

centrifugar 30 seg2 Leer aglutinaciones y anotar resultados

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TECNICA ALBUMINA BOVINA 8 Agregar 2 gotas de albuacutemina al 229 Centrifugar 20 segundos10observar aglutinacioacuten o hemolisis o no aglutinacioacuten

11A los tubos con lecturas negativas incubar 20minutos en bantildeo Mariacutea a 37 degC12Centrifugar y observar

bull Aglutinacioacuten o hemoacutelisis reportar incompatible

bull No aglutinacioacuten llevar a Coombs

13Lavar tres veces decantar y quitar el exceso desalina con gasa y agregar 2 gotas de reactivo deCoombs y centrifugar 20 segundos y observar

bull Aglutinacioacuten o hemoacutelisis reportar incompatible

bull No aglutinacioacuten reportar compatible

Resultados ANTICUERPO IRREGULAR Anticuerpo c

InterpretacioacutenEstos anticuerpos son generalmente inmunoglobulinas tipo My ocasionalmente tipo G y debido a esa temperatura dereaccioacuten carecen de importancia cliacutenica salvo que sureaccioacuten ocurra tambieacuten a 37 degC su importancia radica enpacientes que seraacuten intervenido a 22 ordmc como es el caso de

operacioacuten de corazoacuten

Los llamados anticuerpos calientes tienen una temperatura oacuteptima dereaccioacuten a 37 degC a Estos anticuerpos tienen una relevanteimportancia cliacutenica ya que se les asocia con reaccionestransfusionales de intensidad moderada a severa que puedenocasionar la muerte

Esquemas

CONCLUSIONHe concluido que es importante determinar los anticuerposirregulares ya que estos anticuerpos tienen una relevanteimportancia cliacutenica ya que se les asocia con reaccionestransfusionales de intensidad moderada a severa

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TECNICA ALBUMINA BOVINA 8 Agregar 2 gotas de albuacutemina al 229 Centrifugar 20 segundos10observar aglutinacioacuten o hemolisis o no aglutinacioacuten

11A los tubos con lecturas negativas incubar 20minutos en bantildeo Mariacutea a 37 degC12Centrifugar y observar

bull Aglutinacioacuten o hemoacutelisis reportar incompatible

bull No aglutinacioacuten llevar a Coombs

13Lavar tres veces decantar y quitar el exceso desalina con gasa y agregar 2 gotas de reactivo deCoombs y centrifugar 20 segundos y observar

bull Aglutinacioacuten o hemoacutelisis reportar incompatible

bull No aglutinacioacuten reportar compatible

Resultados ANTICUERPO IRREGULAR Anticuerpo c

InterpretacioacutenEstos anticuerpos son generalmente inmunoglobulinas tipo My ocasionalmente tipo G y debido a esa temperatura dereaccioacuten carecen de importancia cliacutenica salvo que sureaccioacuten ocurra tambieacuten a 37 degC su importancia radica enpacientes que seraacuten intervenido a 22 ordmc como es el caso de

operacioacuten de corazoacuten

Los llamados anticuerpos calientes tienen una temperatura oacuteptima dereaccioacuten a 37 degC a Estos anticuerpos tienen una relevanteimportancia cliacutenica ya que se les asocia con reaccionestransfusionales de intensidad moderada a severa que puedenocasionar la muerte

Esquemas

CONCLUSIONHe concluido que es importante determinar los anticuerposirregulares ya que estos anticuerpos tienen una relevanteimportancia cliacutenica ya que se les asocia con reaccionestransfusionales de intensidad moderada a severa

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