AAz Enterococcusok, Staphylococcus z Enterococcusok, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa és aureus, Pseudomonas aeruginosa és

Clostridiumok, Clostridiumok, Listeria monocytogenes és a Listeria monocytogenes és a Campylobacter jejuniCampylobacter jejuni kimutatásakimutatása

4-5. gyakorlat

Enterococcus spp.Enterococcus spp.

Streptococcaceae család, Streptococcus nemzetség, Lancefield D szerológiai csoport

– Enterococcus faecalis (var. liquefaciens, var. zymogenes)

– Enterococcus faecium– Enterococcus durans

Általános jellemzők

Gram +

2-6 tagú láncok

0,5-1 μm

kissé megnyúltak

általában nem mozognak, de ritkán előfordul mozgó törzs is

Anaerob aerotoleráns (tejsavas erjedés)

Általános jellemzők

Indikátor mikrobák (fekál kontamináció).Termorezisztencia (pasztőrözési eljárások

hatékonyságát, lehet vele ellenőrizni) A nem-spórások közül a legellenállóbbak (nem megfelelő fertőtlenítés ellenőrzése),

Ételmérgezés (106) α- vagy β-haemolysis véres agaron

„Sherman kritériumok”

Képesek fejlődni 10 – 45°C között Túlélik a 60°C-os 30 perces hőkezelést Fejlődnek 6,5%-os sókoncentráció

mellett pH 9,6 0,1 % metilénkéket tartalmazó tejben 40% epét tartalmazó véres agaron

jól fejlődnek

Szilárd táptalajokNa-azidos agarNa-azidos véres agar

(Packer-agar, defibrinált steril vér, vizes-kristályibolya, vizes Na-azid)

TTC agar (trifenil-tetrazolium-klorid) (Slanetz-Bartley agar)A Na-azid gátolja a Gram-negatív flórát; az Enterococcusok a TTC-t redukálják vörös formazánná → telepek vörösesbarna színűek

Folyékony tápközegek

Na-azidos tápleves Raj-szerint (Na-azid, brómtimolkék)

Litsky-Mallman- féle Na-azidot tartalmazó dúsító táptalaj (Na-azid, etilibolya)

Biokémiai azonosítás

Gram festés: + Kataláz-próba: -

kataláz enzim

2 H2O2 2 H2O + O2

húsleves tenyészet + 3%-os H2O2 Hőtűrő-képesség vizsgálata:

húsleves tenyészet (37°C, 48 óra) → 60°C, 30 perc vízfürdő → alapos felrázás → oltókacsnyi mennyiséget másik levesbe átoltani → 37°C, 48 órás inkubáció → ha zavaros és kataláz negatív → +

Enterococcusok kimutatása vízből (201/2001.(X.25.)Korm.r.,65/2004.(IV.27.)FVM-ESZCSM-GKM )

Membránszűréses módszer:100, vagy 250 ml víz szűrése 0,45 µm pórusméretű membránon

Tenyésztés Slanetz-Bartley táptalajon, 37 oC, 48 óra

Enterococcus telepek vöröses-barna színűek

S. aureus általános tulajdonságai

Gram +, fak. anaerob, 0,8-1μm, legkisebb coccus, típusosan szőlőfürt elrendeződésű,

Nem mozog Aranysárga pigmentet termel Sótűrő: 7,5%-os sótartalmú talajon is szaporodik 6-47°C is szaporodik pH 4,3-8,0 között is szaporodik 20-45°C-on toxint termel

S. aureus általános tulajdonságai

Szaporodás aw>0,86 Toxintermelés aw>0,92 NO3 → NO2

Bontja: glükóz (aerob és anaerob), laktóz, szacharóz, maltóz, mannit

Mannitot aerob és anaerob módon is bontja (Differenciálás Micrococcustól, S. epidermidis-től: ezek csak aerob viszonyok között bontják a mannitot)

Haemolizál: α, β, γ, δ haemolysint termel

A S. aureus előfordulása

A leggyakoribb gennykeltő baktérium, nyálkahártyán normális esetben is lehet. Az emberek és az állatok az elsődleges hordozói. Jelen vannak az orrüregben és a garatban, valamint egészséges egyéneknél a hajon és a bőrfelületen is.

Nátha esetén számuk megnő, az élelmiszerek könnyen kontaminálódhatnak.

Azért nem okoz túl nagy problémát, mivel borzasztó táp- és vitaminigényes, rossz versengő mikroba.

Tésztagyártás→elszaporodik, jól tűri a beszárítást Mastitis

A S. aureus előfordulása

Hús és hústermékek Baromfi és tojás Tojás-, tonhal-, csirke-, burgonya- és tésztasaláta Sütőipari termékek, krémmel töltött tészták Krémes sütemények Szendvicstöltelékek Gomba Tej és tejipari termékek

A S. aureus által kiváltott ételmérgezés

Entero- és neurotoxikus hatású, tünetek 30 perc (!) alatt kialakulnak.

Enterotoxin: A, B, C, D, E, F hőálló polypeptid (diszulfid hidak), 121,1°C-on 20 perc alatt bomlik.

Nem minden törzs termel enterotoxint (kb. 50%) Infektív dózis: <1.0 μg toxin az élelmiszerben 105/g szükséges, de a szám nem ad megfelelő

felvilágosítást Az enterotoxin-termelés és koaguláz-pozitivitás között

nincs egyértelmű korreláció (is-is)

Táplevesek

Jelenléti/hiánypróba, MPN Giolitti-Cantoni-féle

(Micrococcus szaporodása gátolt)– Mannit: elektív előny a S. aureusnak, – LiCl: Gram-neg.-t gátol, – Tellurit: Gram-poz.-t gátol, K-telluritot

redukálja→fém tellúr→fekete csapadék

Szilárd táptalajok

Baird-Parker-agar, 37°C, 24-48 óra Összetétel: ua. mint leves + tojássárgája emulzió

– tellurit → fémes tellúr – fekete – feltisztulás: lecitináz – opálos zóna: lipolízis, proteolízis

Telep: – 24 órás tenyészet: gombostűfej, koromfekete, sima szélű és

felületű, keskeny átlátszó széllel, feltisztult udvar– 48 órás tenyészet: kölesnyi, feltisztult udvar 3-5 mm, ezen

belül 2 mm opálos zóna

Biokémiai azonosítás

1. Gram +2. Koaguláz próba:

a.) Tárgylemez próba (tájékozódó vizsgálat!): 1 csepp víz + telep (vagy 1 csepp agy-szív inf. leves) +1 csepp 37°C nyúlvérplazma →5 sec múlva csapadékképződés

b.) Kémcső próba: agy-szív levesbe: 37°C, 20-24h↓

0,1 ml + 0,3 ml nyúl vagy emberi vérplazma (ill. 0,9 ml teljes citrátos házinyúl vér)

↓37°C, 2-4-6 óra

↓

Pozitív: alvadás ++,+++,++++ S. aureus: 99% pozitív; S. hyicus, S. delphi néha +Negatív: nincs alvadás: S. epidermidis

Biokémiai azonosítás

3. Termostabil Dezoxi-ribonukleáz próba S. aureusnak hőálló DNS-bontó enzimje van DNS-agar (toluidin kék metakromásan fest)

Agy-szív leves → 15 perc forró vízfürdőbe → majd az agarba vájt 15-20 μl űrtartalmú lyukakba mérünk a hőkezelt tenyészetből → 37°C, 4 órás inkubáció után vizsgáljuk lemezt:

+: lyuk körül 1 mm széles rózsaszínű gyűrű (kék → rózsaszín), 0,005 μg/ml esetén (nyomnyi) a reakció már pozitív+, magából a

hőkezelt élelmiszerből is ki lehet mutatni az enzimet, így 4-5 órán belül eredmény mutatható

Korreláció nem 100% az enterotoxin és temostabil DN-áz termelés között!

Biokémiai azonosítás

4. Enterotoxin kimutatása élelmiszerből: ELISA, RIA, de rutinszerűen sehol nem ezeket végzik, ugyanis az enterotoxin megoszlása egyenetlen, jól kötődhet az élelmiszer egyes anyagaihoz, így nem mindig lesz a próba pozitív, annak ellenére, hogy ott van a toxin

Szabványos vizsgálat

Élelmiszerekből a szabvány nem a Staphylococcus aureus, hanem a koaguláz pozitív Staphylococcusok vizsgálatát írja elő.

Szabványos vizsgálat esetén a gyanús telepekkel csak koaguláz próbát végzünk.

Pseudomonas aeruginosa

Gr-, aerob, 1 csilló, általában a mikrobatest végén,

150-féle szénforrást tud hasznosítani (nyálkás-nyúlós telep, eltömi a fejőgépet)

Legtöbb törzs trimetil-amin termelő → hársfavirág-illat

Fluoreszcein → vízoldható (sárga), minden törzs termeli → táptalajba diffundál → zöld lesz körülötte → idővel oxidálódik, megbarnul → rozsdaszínű (latin: aerugo=rozsda)

Piocianin → kloroformban oldódik (neutrális v. lúgos közegben kék), nem minden törzs termeli (régi név: Bacterium pyocyaneum)

Pseudomonas aeruginosa

glükózt oxidatív úton bontja

oxidáz +

kataláz +

nitrát→nitrogén-gázzá redukálja (!!)

karbamidot, acetamidot bontja

zselatint elfolyósítja

triptofánból indolt NEM termel

Pseudomonas aeruginosa

Előfordulás: talaj, víz, gennyes folyamatok („kékgenny-betegség”)

fakultatív pathogén → állomány-szinten mastitis (1-2%) – fejőrendszerben túlélhet

106/g felett ételmérgezést okoz Ellenálló-képesség:

– beszáradást, hőt nem bírja– antibiotikumoknak viszonylag ellenáll– kvaterner ammónium-sókkal szemben

rezisztensek– egyes amfoter vegyületekben még szaporodnak is

Pseudomonas aeruginosa tenyésztése

Szilárd: Cetrimid-agar: gátlóanyag: N-cetyl-N,N,N-trimethyl-

ammonium bromide (cetrimid)37 oC, 24-48 óra, (növekedés 42 oC-on is)

Véres agar: ß-haemolysis, büdös Z-agar: szintetikus (acetamid az egyetlen szénforrás)

Telepmorfológia: 2-4 mm, kerek-ovális, sima, domború, erősen nyálkás, gyöngyház fényű, hársfavirág-illatú

Folyékony: Nitrofurantoinos leves: zavarosodás Z-leves

Pseudomonas aeruginosa azonosítása

Oxidáz próba: pozitív Nitrátredukció: komplett Indol-próba: negatív Kataláz-próba: pozitív Piocianin-termelés: +kloroform → a kloroformos fázis

kék Karbamid-bontás: karbamid → ammónia

(fenolvörös indikátor: sárga →lila) Glükóz aerob oxidációja: szőlőcukros magas-agar

tetején, hártyaszerűen nő, itt sárga, máshol piros marad

Szulfit-redukáló mezofil ClostridiumokSzulfit-redukáló mezofil Clostridiumok

– Gram-pozitiv, obligát anaerob, kataláz negativ, spórás baktériumok

– Hőmérsékleti optimum 37 oC– Peritrich csillóval mozognak– Tojás-, vagy gömb alakú spórát képeznek, amely centrálisan,

vagy terminálisan helyezkedik el. A spóra átmérője nagyobb, mint a sejté.

– Előfordulásuk talajban, vízben, emlősök bélcsatornájában– Szulfit tartalmú táptalajban fekete, vagy sötétszürke telepet

képeznek– Néhány közülük hemolizál (különböző típusú hemolizis)

Szulfit-redukáló mezofil Clostridiumok

A Cl. botulinum és a Cl. perfringens élelmiszer mérgezést okoz, a többi romlást.

A vizsgálat menete:– Hígítási sor készítése– A félfolyékony, szulfit agart (Takács-Narayan) tartalmazó

csövek beoltása (minden hígításból 2 cső, egyik a vegetatív, másik a spórás alakok kimutatására) a táptalaj vas(III)citrátot és Na-szulfit-ot tartalmaz.

– 80 oC, 20 perc hőkezelés, a vegetatív sejtek elpusztítására és a spórák aktiválására az egyik csőben

Szulfit-redukáló mezofil Clostridiumok

– Tenyésztés 37 oC, 48 óra. A felszín alatt kb. 0,5 cm-re látható feketedés jelzi a lehetséges pozitivitást.

– Minden fekete, vagy sötétszürke csőből át kell oltani tojássárga D-cikloszerin szulfit agarra.

– A lemezeket anaerob körülmények között inkubáljuk 37 oC–on 24 órán át.

A pozitiv telepek feketék, vagy sötétszürkék, 1-2 mm átmérőjűek, néha opálos udvarral (lecitináz aktivitás), vagy fénylő felszinnel (lipáz aktivitás)

Szulfit-redukáló mezofil Clostridiumok megerősítése

1. Gram-festés: +,pálcák, 8-12 μm

2. Metilén-kék, tus festés

(háttér fekete, Clostridium kék, a tok színtelen)

3. Kataláz teszt: negatív