光谱扫描的重要性

Stokes’ 偏移

Stokes 偏移越大 , 越容易测量

演示：一个红色荧光染料的检测波长优化

Ex/Em 大约在 ~650nm 附近，微小的 Stokes 偏移

微孔板的波长优化

一 固定发射波长 Em ，扫描激发光波长 Ex

设定 Em 为高于预期波长 (700 nm).

设定 Ex 的扫描，为了避免灯光的干扰，到离设定的 Em 10nm 处就停止 (600 – 690nm).

设置缓冲液空白对照

Excitation Wavelength (Em = 700 nm)

600 610 620 630 640 650 660 670 680 6900

10

20

30

40

50

60Excitation Scans in Plate

Ex Sample ('!WavelengthRun@PEx600-690' vs '!D3Lm1@PEx600-690')

Ex Blank ('!WavelengthRun@PEx600-690' vs '!B3Lm1@PEx600-690')

激发波长扫描

Blank

Sample

激发峰 ~ 650 nm

灯光干扰

二 固定激发波长 Ex ，扫描发射光波长 Em

设定 Ex 波长比 Em 最高峰低 20-30 nm(630 nm).

为了避免灯光的干扰，设定 Em 扫描从比 Ex 波长 > 10 nm 开始 . (640 – 700nm).

Em Wavelength (Ex = 630 nm)

640 650 660 670 680 690 7000

50

100

150

200Plate Emission Scan #1 - Ex = 630 and no cutoff filter

EmSample ('!WavelengthRun@PEm640-700' vs '!E3Lm1@PEm640-700')

EmBlank ('!WavelengthRun@PEm640-700' vs '!B3Lm1@PEm640-700')

微孔板发射波长扫描

Sample

Blank

发射峰 ~ 665 nm

灯光干扰

微孔板波长优化：最终方案

Ex/Em 最大峰 -- 650/665nm ( 小 Stokes 偏移 )

必须用 cutoff 滤光片遮住入射灯光 Cutoff 滤光片的波长在 Ex 和 Em 波长之间 Cutoff 滤光片可以降低本底信号并能让发射光透过 Cutoff 滤光片可选择的范围区域 630, 665 & 695nm. 665 nm 滤光片最为合理因为它可以遮蔽入射灯光

必须增加 Ex/Em 之间的分离把荧光从入射灯光中区分开来 . 降低 Ex 波长和增加 Em 波长 降低 Ex 波长到最大峰的 ~90% (645 nm) 并用 665nm 的 cutoff 滤光片，扫描 E

m 波长 . 出现最大的信号和最小的背景信号。

Em Wavelength (Ex = 645 nm)

655 660 665 670 675 680 685 6900

20

40

60

80

100

Emission Scan with 665 nm cutoff filter

EmSample ('!WavelengthRun@PEm655-690' vs '!F3Lm1@PEm655-690')

EmBlank ('!WavelengthRun@PEm655-690' vs '!B3Lm1@PEm655-690')

微孔板波长优化：最终扫描

最大发射 ~ 675 nm

背景从 675 nm 开始低于 1RFU

优化 : Ex/Em = 645/675nm cutoff filter = 665 nm

灯光干扰最低