AISLAMIENTO DE AISLAMIENTO DE ENZIMASENZIMAS

Blga. Roxana Mestas ValdiviaBlga. Roxana Mestas ValdiviaArea de Química BiológicaArea de Química BiológicaDepartamento de BiologíaDepartamento de Biología

Universidad Nacional de san AgustínUniversidad Nacional de san Agustín

Involucra la investigación de un gran número de propiedades características que se detallan a continuación, pero de las que generalmente se estudian solo unas pocas:a)a)propiedades fisicoquímicas: propiedades fisicoquímicas: coeficientes de sedimentación y difusión; peso molecular; forma; punto isoeléctrico; estabilidad frente al calor, pH y oxidación; reversibilidad de la reacción y constante de equilibrio; calor, energía libre y entropía de la combinación enzima-sustrato y de su conversión en productos; medida de las constantes de velocidad de la reacción, efecto de activadores e inhibidores.b)b)estructura: estructura: composición en aminoácidos, secuencia, presencia de grupos prostéticos, grupos sulfhidrilos, etc.c)c)propiedades enzimáticas:propiedades enzimáticas: naturaleza de la reacción, coenzimas, especificidad.d)d)propiedades biológicaspropiedades biológicas: significado en el metabolismo, acoplamiento con otras enzimas, localización, genética, efectos de su deficiencia, inmunología.

ESTUDIO DE UNA ENZIMAESTUDIO DE UNA ENZIMA

ASPECTOS TÉCNICOS DEL TRABAJO ASPECTOS TÉCNICOS DEL TRABAJO CON ENZIMASCON ENZIMAS

Deben evitarse altas temperaturas y acidez o alcalinidad extremas. Durante el aislamiento y la purificación conviene, en general, trabajar entre 0 y 4 °C y evitar pH mayor que 9 o menor que 5.

Debe evitarse la formación de espuma, ya que la misma es indicador de desnaturalización proteica.

Los solventes orgánicos inactivan muchas enzimas a temperatura ambiente; de modo que los fraccionamientos con los mismos deben llevarse a cabo a baja temperatura y ésta no debe elevarse hasta que el solvente se haya eliminado o diluido a concentraciones inocuas.

Deben tomarse también varias precauciones en lo que se refiere a las condiciones de la reacción:

a)Elegir pH y temperatura en las zonas de mayor estabilidad de la enzima

b)Llevar a cabo la reacción a temperatura constante.c) Elegir un buffer adecuado para evitar cambios de pHd)Evitar la introducción de trazas de otras enzimas (por

ejemplo saliva).e)Elegir una cantidad de enzima adecuada para obtener

variaciones apropiadas de la magnitud a medir.

Obtener un rendimiento máximo Poseer actividad catalítica máxima Máxima pureza

Objetivos del Aislamiento y Purificación de Enzimas

Las enzimas se encuentran formando parte de mezclas complejas, usualmente en el interior de

células que además poseen cientos de otras enzimas. Pueden formar parte de agregados moleculares, complejos con otras enzimas, proteínas inertes,

ácidos nucleicos, polisacáridos o lípidos. Para estudiar una en particular, se hace indispensable entonces un

proceso de purificación.

Aislamiento y Purificación

Métodos de Estimación - Métodos de Estimación - Unidades Unidades

El primer requerimiento para aislar una enzima es encontrar un ensayo cuantitativo de actividad mediante el cual pueda valorársela convenientemente. Para decidir si un paso de la purificación tiene sentido, es necesario medir la cantidad de enzima y la cantidad de impurezas antes y después de ese paso, y comparar los resultados de varios procedimientos posibles. Sólo en términos cuantitativos se puede saber si se ha producido algún progreso. Puesto que una gran parte del tiempo empleado en el aislamiento de una enzima está dedicado a determinar la actividad de las distintas fracciones, es deseable que ésta sea una operación rápida; es preferible sacrificar precisión por rapidez en las determinaciones.  La naturaleza del ensayo dependerá del tipo de reacción que cataliza la enzima. A veces resultará conveniente la medición de la aparición de un producto y otras la medición de la desaparición de sustrato.

Ensayo

La actividad de una enzima depende de condiciones tales como temperatura, pH, concentración; por lo tanto es necesario especificarlas y usar las mismas condiciones para comparar actividades. La elección del sustrato es muy importante: debe ser barato, de fácil determinación, estable en ausencia de enzima y no sufrir reacciones laterales. Es necesario usarlo en concentración tal que sature la enzima, de modo que la velocidad sea independiente de la concentración de sustrato y proporcional a la cantidad de enzima.

ActividadActividad

Es necesario definir una unidad enzimática arbitraria para poder expresar, en forma cuantitativa, la pureza y la actividad de las diversas fracciones obtenidas durante la purificación. La unidad enzimática se define en forma particular para cada reacción según sea conveniente. Es la cantidad de enzima que cataliza la formación de una determinada cantidad de producto (desaparición de reactivo) en un tiempo dado.

La pureza de la enzima se ve reflejada en la actividad específica que es el cociente de actividad enzimática (expresada en unidades enzimáticas) y la cantidad total de proteínas

Unidad Enzimática

Selección de la fuenteSelección de la fuente

Recuerde la fuente debe ser: Abundante Disponible Se deben hacer estudios comparativos Se debe saber su localización subcelular

La actividad de una enzima varía considerablemente en diferente organismos y aún en los diversos tejidos de un mismo organismo. Para estudios mecanísticos generales, debe seleccionarse aquella fuente que sea rica en la enzima. En estos casos, particularmente en tejidos animales, la fuente debe ser fresca, dado que la mayoría de las enzimas se deterioran rápidamente. Frecuentemente una buena elección de la fuente de enzima permite simplificar la extracción y purificación de la enzima.

Importancia de la localizacion intracelular Importancia de la localizacion intracelular de la enzima de la enzima

Las enzimas pueden localizarse dentro de los siguientes grupos:I.I.Enzimas en solución verdadera en el citoplasma. Enzimas en solución verdadera en el citoplasma. Permanecen en el sobrenadante luego de la eliminación de los componentes particulados. La ruptura de las células en un buffer adecuado libera tales enzimas al medio.II.II.Enzimas asociadas a estructuras celulares Enzimas asociadas a estructuras celulares (membranas, mitocondrias, etc.). Pueden encontrarse a) en “solución” dentro de una membrana y pueden ser extraídas después de la destrucción de la misma; b) asociadas a material lipoproteico insoluble. Para pasarlas a solución debe disociarse el complejo. El conocimiento de la localización intracelular y solubilidad relativa de las enzimas ha permitido desarrollar procedimientos de extracción diferencial que facilitan la purificación

EXTRACCION DE ENZIMAS EXTRACCION DE ENZIMAS

Las condiciones para extraer las enzimas y pasarlas a solución son a menudo críticas y requieren el estudio de muchas variables. Es necesario destruir las células, eventualmente las estructuras subcelulares y disociar las enzimas de otras moléculas. A veces es necesario pasarlas a solución como complejo mucoproteico o nucleoproteico y disociarlo luego durante la purificación.  Aunque la dispersión de agregados moleculares puede frecuentemente lograrse mediante medios mecánicos, en muchos complejos enzimáticos están involucradas fuerzas específicas; de la naturaleza de las mismas depende el método a emplear.

1. Métodos de rotura celular 2. Precipitación fraccionada por cambios

de pH3. Desnaturalización fraccionada por

calentamiento4. Precipitación fraccionada con solventes

orgánicos5. Precipitación fraccionada por sales6. Absorción fraccionada7. Cromatografía en columna8. Electroforesis

MÉTODOS DE PURIFICACIÓNMÉTODOS DE PURIFICACIÓN

Implica la destrucción de la célula y el pasaje de las enzimas a solución o suspensión. Esto puede llevarse a cabo por: a)a)Homogenización mecánica: Homogenización mecánica: puede utilizarse un homogeneizador de vidrio, mortero, licuadora, a veces con la ayuda de abrasivos como alúmina, arena o bolitas de vidrio y con un solvente adecuado, isotónico (sacarosa 0,25 M, NaCl 0,9%, KCl 0,15 M) o ligeramente hipertónico, en un buffer adecuado para controlar el pH.

b)b)Homogeneización sónicaHomogeneización sónica: el choque de ondas sónicas o ultrasónicas provoca cambios de presión de miles de atmósferas, que rompen la pared celular. Se usa generalmente para bacterias y levaduras y, a veces, para determinados tejidos animales (bazo, riñón, eritrocitos).

c)c)Desintegración térmicaDesintegración térmica: El congelamiento y descongelamiento rápidos y repetidos suelen usarse para desintegrar bacterias y eritrocitos. Por congelación se forman cristales de hielo intracelulares, destruyendo la estructura. Al descongelarse, las células se destruyen osmóticamente debido a la presencia de agua pura y se libera su contenido. d) Desintegración químicad) Desintegración química: se utilizan agentes que atacan la pared celular, como el etanol, éter de petróleo, isopentanol, etc.

e) Homogeneización por deshidrataciónHomogeneización por deshidratación: se basa en la precipitación de proteínas por solventes orgánicos. En la preparación del "polvo acetónico" se utiliza acetona en frío.

Métodos de rotura celular Métodos de rotura celular

The solubility of most globular proteins is markedly influenced by pH and ionic strength. This figure shows the solubility of a typical protein as a function of pH and various salt concentrations.

Precipitación por cambios de pH Precipitación por cambios de pH

Desnaturalización por Desnaturalización por calentamientocalentamiento

Sol

ubili

dad

g/L

Temperatura, ºC

00 100

100

Precipitación con solventes orgánicos

Etanol usado para la precipitación de proteínas sanguíneas

Acetona para separar enzimas de extractos de músculo

Precipitación por salesPrecipitación por sales

CROMATOGRAFIA EN COLUMNACROMATOGRAFIA EN COLUMNA

CROMATOGRAFIA DE EXCLUSION CROMATOGRAFIA DE EXCLUSION MOLECULARMOLECULAR

La separación se basa en el tamaño de las partículas- Fase estacionaria: dextrano o agarosa

entrecruzados- Fase móvil: solución tamponada

CROMATOGRAFIA DE CROMATOGRAFIA DE INTERCAMBIO IONICOINTERCAMBIO IONICO

La separación se basa en la carga eléctrica de las partículas- Fase estacionaria: grupos cargados unidos a un soporte

insoluble- Fase móvil: gradiente de sal o de pH

Cromatografía en SP Sephadex C-50. La fracción de la etapa anterior (50ml) del extracto de enzima preparado de tubérculos de Ullucus tuberosus "olluco" fue cromatografiada sobre una columna de SP Sephadex C-50 bajo las condiciones de ensayo de 2.3. La enzima fue eluída con 0.10 M de NaCl se colectaron fracciones de 4ml.

Mansilla B. Juan C. (2004). Purificación Parcial y Caracterización Bioquímica de Fosfatasa Acida de Ullucus tuberosus Loz var. Rosascha lisa. Tesis para optar el Titulo Profesional de Biólogo

Separa según la afinidad de la proteína por un ligando inmovilizado

Fase estacionaria: ligando unido a soporte insoluble

Fase móvil: (1) solución sin ligando (2) solución con ligando libre

CROMATOGRAFIA DE CROMATOGRAFIA DE AFINIDADAFINIDAD

Cromatografía en Concanavalina A-Sepharosa. La fracción de fosfatasa ácida de Ullucus tuberosus "olluco" obtenida de la columna en SP Sephadex C-50 (32ml), fue cromatografiada sobre una columna de Concanavalina A-Sepharosa, bajo las condiciones de 2.4. La enzima fue eluída con 0.15 M de metil α-D manopiranósido. Se colectaron fracciones de 3ml, con un flujo de 1.2 ml por minuto

Mansilla B. Juan C. (2004). Purificación Parcial y Caracterización Bioquímica de Fosfatasa Acida de Ullucus tuberosus Loz var. Rosascha lisa. Tesis para optar el Titulo Profesional de Biólogo

Cromatografía líquida de Cromatografía líquida de separación rápida de proteínasseparación rápida de proteínas

ELECTROFORESISELECTROFORESIS

GEL DE APILAMIENTO

PORO GRANDE

CONCENTRAR Y ALINEAR PROTEINAS

GEL DE SEPARACION

PORO PEQUEÑO

SEPARA PROTEINAS POR TAMAÑO

DIÁLISIS DIÁLISIS

ANÁLISIS DE LOS DATOSANÁLISIS DE LOS DATOS

Tabla de Purificación EstándarTabla de Purificación Estándar

1.Da una breve descripción de la fracción probada2.Volumen3.Concentración de la enzima4.Unidades totales (= columna 3 x columna 2)5.Concentración protéica6.Actividad específica (= columna 3/columna5)7.Rendimiento ( obtenido a partir de la columna 4 tomando el primer valor de esta columna

como 100%)8.Grado de purificación (obtenido a partir de la columna 6 tomando el primer valor de esta

columna como equivalente a 1)

CRITERIOS DE PUREZA DE UNA ENZIMACRITERIOS DE PUREZA DE UNA ENZIMA

Ultracentrífuga Analítica Métodos Electroforéticos Enfoque Isoeléctrico Prueba de Solubilidad

Métodos para determinar Métodos para determinar ProteínasProteínas

Método de KjeldahlMétodo de Kjeldahl

Poco sensible. En desuso. Se sigue empleando para análisis

elemental (p.e., alimentos)

Proteína total= N x 100/16

El método se basa en la destrucción dela materia orgánica con ácido sulfúricoconcentrado, formándose sulfato deamonio que en exceso de hidróxido desodio libera amoníaco, el que se destilarecibiéndolo en:a) Acido sulfúrico donde se forma sulfatode amonio y el exceso de ácido esvalorado con hidróxido de sodio enpresencia de rojo de metilo, o b) Acidobórico formándose borato de amonio elque se valora con ácido clorhídrico.

H2N C

O

NC

O

NH2

H O

C

NH

C

O

HN

HN

-O

C

HN

C-O

NH

NH

Cu++

OHH

OHH

BiuretComplejo cúprico coloreado

Método de BiuretMétodo de Biuret

Se basa en la formación de un complejo coloreado entre el Cu2+ y los grupos NH de los enlaces peptídicos en medio básico dando una coloración violeta. La intensidad de coloración es directamente proporcional a la cantidad de proteínas (enlaces peptídicos) y la reacción es bastante específica, de manera que pocas sustancias interfieren. La sensibilidad del método es muy baja y sólo se recomienda para la cuantificación de proteínas en preparadosmuy concentrados.

Método de BradfordMétodo de Bradford

Se basa en la unión de un colorante, Comassie Blue G-250 (tambiénServa Blue) a las proteínas. El colorante, en solución ácida, existe en dosformas una azul y otra naranja. Las proteínas se unen a la forma azul paraformar un complejo proteína-colorante con un coeficiente de extinción mayorque el colorante libre. Este método es sensible (1-15 µg), simple, rápido, barato y pocas sustancias interfieren en su determinación. Entre las sustancias que interfieren están los detergentes y las soluciones básicas.

Absorción a 280 nmAbsorción a 280 nmSe fundamenta en la absorción a 280 nm producida por los aminoácidos aromáticos Phe, Tyr y Trp

Sensible y fácil de practicarRequiere soluciones puras de proteína; no es aplicable a mezclasDistintas proteínas dan diferente grado de absorción, dependiendo de su contenido en aa. aromáticos