TÜRKĐYE CUMHURĐYETĐ ANKARA ÜNĐVERSĐTESĐ

SAĞLIK BĐLĐMLERĐ ENSTĐTÜSÜ

AKUT LÖSEMĐLERDE SOCS-1 GENĐNĐN

METĐLASYON ANALĐZĐ

Nuray VAROL

TIBBĐ BĐYOLOJĐ ANABĐLĐM DALI

YÜKSEK LĐSANS TEZĐ

DANIŞMAN

Prof. Dr. Asuman SUNGUROĞLU

2007-ANKARA

ii

Kabul ve Onay

iii

ĐÇĐNDEKĐLER

Kabul ve Onay ..............................................................................................ii Đçindekiler ...................................................................................................iii Önsöz ......................................................................................................... iv Simgeler ve Kısaltmalar ................................................................................. v Şekiller Dizini.............................................................................................vii Çizelgeler Dizini ........................................................................................... x 1.GĐRĐŞ..................................................................................................... 1 1.1. DNA Metilasyonu ............................................................................................. 2 1.1.1. DNA Metiltransferazlar ............................................................................. 4 1.1.2. CpG Adacıkları .......................................................................................... 9 1.1.3. DNA Metilasyonu ve Transkripsiyonel Susturulma................................ 10 1.1.4. DNA Metilasyonunun Kanserle Đlişkisi .................................................. 12 1.1.5. DNA Metiltransferaz Đnhibitörleri ........................................................... 15

1.2. Sitokin Sinyalini Baskılayan Proteinler (SOCS)............................................. 17 1.2.1. JAK/STAT Yolağı ................................................................................... 19 1.2.2. SOCS1 Proteini ........................................................................................ 20

1.3. Amaç ............................................................................................................... 24 2. GEREÇ VE YÖNTEM..................................................................... 25 2.1. Çalışma Gurubu .............................................................................................. 25 2.2 Periferal Kandan DNA Đzolasyonu .................................................................. 25 2.3. DNA’nın Kantitasyonu ................................................................................... 26 2.4. Metilasyon Spesifik Polimeraz Zincir Reaksiyonu (MSP) ............................ 26 2.4.1. DNA Modifikasyonu................................................................................ 28 2.4.2. Metilasyon Spesifik Polimeraz Zincir Reaksiyonu (MSP) ..................... 31

2.5. Metilasyon Profilinin Belirlenmesi ................................................................. 32 2.6. Sonuçların Değerlendirilmesi ......................................................................... 33

3. BULGULAR...................................................................................... 34 3.1. AML’de SOCS-1 Geni Metilasyon Durumu .................................................. 34 3.2. ALL’de SOCS-1 Geni Metilasyon Durumu ................................................... 35 3.3. Sağlıklı Bireylerde SOCS-1 Geni Metilasyon Durumu.................................. 37

4.TARTIŞMA ........................................................................................ 38 5.SONUÇ VE ÖNERĐLER................................................................... 44 ÖZET...................................................................................................... 45 SUMMARY ........................................................................................... 46 KAYNAKLAR....................................................................................... 47 EK........................................................................................................... 53 ÖZGEÇMĐŞ........................................................................................... 55

iv

ÖNSÖZ Bu tez çalışamamı hazırlamam esnasında bana verdikleri sonsuz destek, gösterdikleri fedakarlık ve anlayıştan dolayı canım anneme, babama ve kardeşlerime başta olmak üzere her konuda desteğini gördüğüm sayın danışmanım Prof. Dr. Asuman Sunguroğlu’na, bugüne kadar bana gerek bilgi gerekse de tecrübesi ile yol gösteren sayın hocam Prof. Dr. Ahmet Kadıkıran’a, örnekleri titizlikle ve kısa sürede toplanmasında emeği geçen Doç. Dr. Tülin Şaylı, Uzm. Dr. Zekai Avcı ve Uzm. Dr. Barış Malbora’ya, sonuçların değerlendirilmesinde titizlikle ve sabırla emek veren sayın Doç. Dr. Atilla Halil Elhan’a, çalışmalarım süresince yardımını ve desteklerini esirgemeyen Dr. Bio. Güvem Gümüş Akay’a, Dr. Bio. Aydın Rüstemov’a, her konuda bana yardımcı olan sevgili arkadaşlarım Uzm. Bio. Dilara Akçora’a, Bio. Aslı Büyükekmekçi’ye, tez çalışmam süresince bana yardımcı olan Uzm. Bio. Tülin Özkan’a, Uzm. Bio. Aynur Karadağ’a, Uzm. Bio. Buket Altınok’a, Bio. Sibel Arat’a ve diğer çalışma arkadaşlarıma sonsuz teşekkürler ederim.

v

SĐMGELER ve KISALTMALAR

AML Akut Myeloid Lösemi

ALL Akut Lenfoid Lösemi

AP-2 Adaptor protein-2

ATP Adenozin trifosfat

Bcl-2 B-cell CLL/lymphoma 2

bç Baz Çifti

CpG Sitozin-Guanin dinükleotidi

-CH3 Metil grubu

cAMP Siklik Adenozin monofosfat

CREB cAMP response element binding protein

CTF CCAAT-box binding transcription factor

CIS Cytokine-inducible SH2 protein

DNA Deoksiribo Nükleik Asit

DNA-MTaz DNA metiltransferaz

DNMT1 DNA-cytosine5-methyltransferase 1

DNMT2 DNA-cytosine5-methyltransferase 2

DNMT3A DNA-cytosine5-methyltransferase 3A

DNMT3B DNA-cytosine5-methyltransferase 3B

DNMT3L DNA-cytosine5-methyltransferase 3-like

dH2O Distile su

ddH2O Deiyonize su

E3 Elongin 3

EtOH Etanol

HDAC Histone deasetilase

HTP HpaII Tiny Fragment

HMT Histon metiltransferaz

ICF Facial anomalies syndrome

IFNγ Interferon-gama

vi

IL-6 Interleukin-6

L Litre

JAK Janus kinase

JAB JAK-binding protein

JH 1 JAK homolog 1

KIR Kinase inhibitory region

KIT v-kit Hardy-Zuckerman 4 feline sarcoma viral oncogene

homolog

kb Kilobaz

5-MeC 5- Metilsitozin

Myc myc myelocytomatosis viral oncogene homolog

Myn Murine homologue of Max

MDBP Metile DNA’ya bağlanma protein

MeCP Metile CpG binding protein

MBD Metil bağlanma domaini

MHL1 mutL homolog 1

6-MP 6-Mercaptopurine

MTOC Mikrotübül organizasyon kompleksi

MTX Methotrexate

MSP Metilasyon Spesifik PCR

µL Mikro litre

NaOH Sodyum Hidroksit

NF-KB Nuclear localization signals

OD Optik Dansite

PIAS Protein inhibitor of activated STAT

RT-PCR Reverse transcriptase PCR

RB Retinoblastoma

Rpm Revolution per minute

SP1 Specificity protein-1

Sin3A SIN3 homolog A

SH2 Scr-homology-2

SHP Src homology 2-containing phosphatase

SOCS Supressor of cytokine signalling

vii

STAT Signal transducer and activator of transcription

TRD Transkripsiyon baskılama domaini

TEL Ets variant gene 6

TE Tris-EDTA

viii

ŞEKĐLLER DĐZĐNĐ

Şekil 1.1. Sitozin metilasyonu,demetilasyonu, sitozin ve 5-mC’in

mutagenezi için biyokimyasal yolağın şematik gösterimi ..............3 Şekil 1.2. Sitozin bazının 5-metilsitozine dönüşüm mekanizması . ....................4 Şekil 1.3. Memeli DNMT üyelerinin genel yapısı .............................................4 Şekil 1.4. (A) De novo DNA metiltransferazlar (B) maintanence DNA

metiltransferaz.....................................................................................5 Şekil 1.5. Kanserde metilasyon profili ...............................................................7 Şekil 1.6. DNA metilasyonu aracılığıyla transkripsiyonel baskılanma

mekanizması .....................................................................................10 Şekil 1.7. Onkogenezde, sitozin metilasyonunun neden olduğu

mekanizmalar. ...................................................................................13 Şekil 1.8. Azasitidin aracılığıyla hipometilasyon ve gen reaktivasyonu...........15 Şekil 1.9. SOCS ailesi üyelerinin domain yapıları ve alternatif adları .............16 Şekil 1.10. Negatif feedback loop mekanizması .................................................17 Şekil 1.11. JAK/STAT yolağı .............................................................................18 Şekil 1.12. SOCS-1 geninin DNA yapısı ve sahip olduğu CpG bölgeleri

dağılımı.. ...........................................................................................19 Şekil 1.13. JAK kinazın JH1 domaininin aktivasyonu ve SOCS-1

aracılığıyla inhibisyonu.....................................................................19 Şekil 1.14. JAK’ın SOCS box aracılı degradasyonu...........................................20 Şekil 2.1. MSP aşamaları. ................................................................................ 24 Şekil 2.2. Bisülfid modifikasyon aşamaları ......................................................25 Şekil 2.3. Kontrol, AML ve ALL hasta DNA’larının MSP ile hipermetilasyon sonuçlarının örnek bir jel görüntsü………………………………….35

Şekil 3.1 Kontrol, AML, Erişkin AML ve Çocuk AML hasta gruplarının SOCS-1 gen hipermetilasyon durumlarının dağılımı…………………37

ix

Şekil 3.2. Kontrol, ALL, Erişkin ALL ve Çocuk ALL hasta gruplarının SOCS-1 gen hipermetilasyon durumlarının dağılımı………………….38

Şekil 3.3. Akut lösemili hastalarda SOCS-1 geni metilasyon dağılımları………...39

x

ÇĐZELGELER DĐZĐNĐ Çizelge 1.1. Epigenetik inhibitörler ..................................................................14 Çizelge 1.2. SOCS moleküllerinin çeşitli proteinlerle interaksiyonları .............20 Çizelge 2.1. Metilasyon-spesifik PCR’ın avantaj ve dezavantajları ..................24 Çizelge 2.2. SOCS-1 geninin ekzon2’si için primer dizisi. F:forward, R:

reverse ............................................................................................28 Çizelge 2.3. MSP ürünlerinin beklenen büyüklükleri ........................................29 Çizelge 3.1. Yetişkin ve çocuk AML hastalarında SOCS-1 gen metilasyon

dağılımı ..........................................................................................36 Çizelge 3.2. Yetişkin ve çocuk ALL hastalarında SOCS-1 gen metilasyon

dağılımı ..........................................................................................38 Çizelge 4.1. SOCS1geninin primer posizyonlarına göre çeşitli tümör

tiplerinde metilasyon profili ...........................................................42

1

1.GĐRĐŞ

Lösemi, hücre proliferasyonu ve hücre maturasyonu arasındaki dengenin bozulması

sonucunda oluşan kan veya hematopoetik hücrelerin malign hastalığıdır. Hematolojik

kanserler, kanser nedenli ölümler sıralamasında ikinci sırayı almaktadır. Lösemi,

klinik ve patolojik olarak akut ve kronik lösemi olmak üzere ikiye ayrılmaktadır.

Akut lösemiler de kendi içerisinde, akut myeloid ve akut lenfoid lösemiler olmak

üzere ikiye ayrılır. Akut myeloid lösemi (AML), kanda ve kemik iliğinde

olgunlaşmamış myeloblastların kontrolsüz olarak çoğalması ile karakterize olan ve

hızlı seyir gösteren malign bir hastalıktır. Hem çocuklarda hem de erişkinlerde

hastalarda görülmektedir. Akut lenfoid lösemiler (ALL) ise lenfoblastların

maturasyon duraklaması ve kontrolsüz çoğalmasıyla birlikte, fatal seyirli, klonal

hemotopoietik dokunun malign hastalığıdır (Klinik hematoloji;1997).

Genellikle genetik bir hastalık olarak kabul edilen lösemi gelişiminde epigenetik

mekanizmalarında rol oynadığı bilinmektedir (Melki ve Clark, 2002; Takahashi ve

ark., 2004). Epigenetik modifikasyonlar, kanseri de içine alan birçok insan

hastalıklarında oldukça önemlidir (Esteller, 2007)

Epigenetik değişiklikler, DNA sekansında herhangi bir değişiklik olmaksızın söz

konusu bir genin ekspresyonundaki bölgesel ve geçici değişiklikler (Melki ve Clark,

2002) olup kromatin yapısının stabilitesi, genom bütünlüğü, doku spesifik gen

ifadelerinin düzenlenmesi, embriyonik gelişim, intragenomik parazitlerin

baskılanması, genomik imprinting ve X kromozomunun inaktivasyonundan

sorumludur (Bird ve Wolffe, 1999; Momparler ve Bovenzi, 2000; Wade, 2001; Takai

ve Jones, 2002;Turek-Plewa ve Jagodzınskı, 2005). Epigenetik programlanma

memeli gelişimi için oldukça önemlidir ve bunun stabil bir şekilde kalıtılması doku

ve hücre tipine göre spesifik fonksiyonlarını sürdürülebilmesi için oldukça önemlidir

2

(Melki ve Clark, 2002; Lund ve Lohuizen, 2007). Hayvan gelişiminde üç farklı

epigenetik mekanizma söz konusudur;

DNA metilasyonu; kromatin yapısını değiştirmek ve transkripsiyon faktörlerinin

bağlanmasını engellemek suretiyle transkripsiyonel inaktivasyona neden olan

mekanizmadır.

Polycomb-trithorax gen regülasyonu; Polycomb grubu represörler ve Trithorax

grubu aktivatörler bazı anahtar gelişimsel düzenleyicilerin (örneğin; homeotik

genler) doğru bir şekilde ifade edilmesini sağlamaktadırlar.

Histon modifikasyonları; spesifik genomik lokalizasyonlarda ekspresyon

durumunun sürdürülmesinden sorumlu olan bir epigenetik mekanizmadır.

Bu epigenetik mekanizmalar içerisinde en önemlisi DNA metilasyonudur ve bir

diğer epigenetik mekanizma olan histon modifikasyonuyla da ilişki içerisindedir.

Küçük-ölçekli epigenetik işaretlerin çalışılması kanser biyolojisinin anlaşılmasında

oldukça önemlidir. Örneğin tümör baskılayıcı genlerin hipermetilasyonu onların

transkripsiyonel baskılanmasıyla ilişkili olup kanser patogenezinin tanımlanmasında

anahtar öneme sahiptir. Bununla birlikte halen cevaplanmamış önemli sorular

bulunmaktadır. Bunlardan bir tanesi bir kanser tipinde kaç tane genin hipermetile

olduğu sorusudur. Bu nedenle son yıllarda epigenom projesi içerisinde DNA

hipermetilom (DNA hipermetile dizi) çalışmaları önem kazanmıştır (Esteller, 2007).

DNA metilasyonu bir çok bitki ve memeli türlerinde yaygın olarak görülürken

Drosophila ve Saccharomyces cerevisia gibi bazı ökaryotlarda görülmemektedir

(Bird, 2002; Human Molecular Genetics, 2004). Ayrıca, Ascobolus immersus ve

Neurospora crassa’da transkripsiyonel uzamayı tamamen durdurmaz sadece

zayıflatır (Jones ve Laird, 1999).

1.1. DNA Metilasyonu

DNA metilasyonu hem prokaryotlarda hemde ökaryotlarda adenin ve sitozin

bazlarında meydana gelmektedir (Turek-Plewa ve Jagodzınskı, 2005; Klose ve Bird,

3

2006). Memeli genomunda metilasyon yalnızca 5’-CpG dinükleotidlerindeki

guaninin 5’ ucunda lokalize olan sitozin bazında gerçekleşir ve DNA metilasyonu,

sitozin halkasının 5. posizyonundaki karbonuna metil (-CH3) grubunun kovalent

bağla eklenmesiyle meydana gelir (Baylin ve Herman, 2000; Jones ve Baylin, 2002;

Baylin, 2005) (Şekil 1.1.). Đlave olan metil grubu baz çifti oluşumunu etkilemez

ancak DNA’nın major oluğu içerisinde DNA-protein interaksiyonunu etkilemektedir

(Jones ve Lair, 1999; Momparler ve Bovenzi, 2000; Baylin, 2005). Memeli

hücrelerinin genomik DNA’larının yaklaşık olarak %3 ila % 5’inde sitozin

rezidülerinde metilasyon görülmektedir. Sitozin bazında gerçekleşen bu

modifikasyon DNA replikasyonundan sonra meydana gelir ve bu olay DNA

metiltransferaz enzimi tarafından katalizlenir. DNA metiltransferaz enzimi, genomik

DNA’daki CpG dinükleotidlerini (CpG adacıkları) substrat olarak kullanır (Lewis ve

Bird, 1991; Momparler ve Bovenzi, 2000).

Şekil 1.1. Sitozin metilasyonu, demetilasyonu, sitozin ve 5-mC’in mutagenezi için biyokimyasal

yolağın şematik gösterimi (Singal ve Ginder, 1999).

4

Metilasyon miktarı herhangi bir lokusta hücreden hücreye, bir DNA ipliğinden

diğerine, bir CpG adacığından diğerine dinamik olarak sürekli değişmektedir (Jones

ve Baylin, 2002). Ayrıca metilasyon kromozomların replikasyon zamanını

değiştirmektektedir. Đnaktif X kromozomu S fazında geç replike olur. Hücreler 5-

azasitidin ile muamele edildiğinde X kromozomunda demetilasyon meydana gelir ve

S fazında erken replike olur (Lewis ve Bird,1991).

1.1.1. DNA Metiltransferazlar

DNA metiltransferaz enzimi, sitozin halkasına metil (-CH3) grubu transfer eden bir

enzim olup ökaryotlarda, sitozin 5-metiltransferaz olarak da adlandırılır. Bu enzim,

metil vericisi olarak S-adenosil-L-metionin’i kullanır (Şekil 1.2.). DNA

metiltransferaz (DNA-MTaz) enziminin hedef bölgeleri CpG adacıklarıdır. Đlk olarak

insanda karakterize edilen metiltransferaz enzimi DNMT1 (DNA-cytosine5-

methyltransferase 1)’dir. DNMT1, ilk kez kolon kanserlerinde bildirilmiş olup, artan

ekspresyon miktarından dolayı DNA metilasyonu profilini değiştirdiği gösterilmiştir

(Singal ve Ginder, 1999; Jones ve Baylin, 2002; Turek-Plewa ve Jagodzinski, 2005).

Şekil 1.2. Sitozin bazının 5-metilsitozine dönüşüm mekanizması (Turek-Plewa ve Jagodzinski, 2005).

5

Ökaryotlarda DNMT’lerin 5 üyesi tanımlanmıştır; DNMT1, DNMT2, DNMT3A,

DNMT3B ve DNMT3L’dir. Memeli DNMT’leri en az 2 yapısal bölge içerirler,

bunlar;

- N-terminal regülatör domain (nükleusda DNMT’lerin lokalize olmasından

sorumludur)

- C-terminal katalitik domain [de novo ve sürdürme (maintenance)

metiltransferaz aktivitesi için gereklidir] (Şekil 1.3.).

Şekil 1.3. Memeli DNMT üyelerinin genel yapısı.(Villa ve ark.2004)

Memeli sitozin DNA metiltransferaz enzimi, tercih ettikleri DNA substratlarına göre;

- De novo metiltransferazlar ( DNMT 3A ve 3B )

- Sürdürme (maintenance) metiltransferazlar (DNMT1) olmak üzere 2 gruba

ayrılır (Şekil 1.4.) (Esteller, 2005; Turek Plewa ve Jagodzınskı, 2005; Klose

ve Bird,2006).

-

Memeli DNA metilasyon paternleri erken gelişim döneminde de novo

metiltransferaz DNMT3A ve DNMT3B tarafından tayin edilmektedir ve sürdürme

metiltransferaz DNMT1 aracılığıyla somatik hücrelerde kopyalanmaktadır.

6

Şekil 1.4. (A) De novo DNA metiltransferazlar (B) maintanence DNA metiltransferaz (Turek-Plewa ve Jagodzınskı, 2005).

Sürdürme metilasyon; DNA metilasyon paternlerinin hücre jenerasyonları arasında

tekrarlanması işlemi anlamına gelir. Sürdürme metilasyonunda başlıca

mekanizmasının parental iplikcik metilasyon paternlerinin semikonservatif

kopyalarına bağlı olduğu düşünülmektedir. Bu modele göre; metilasyona neden olan

enzim DNMT1, parental iplikçikteki yeni CpG’leri metile etmeyi tercih eder ve bu

iplikçik bir önceki iplikçiğe uygun olarak metile edilir. Böylece metile ve unmetile

CpG paternleri epigenetik bilginin hücre jenerasyonları arasında taşınması için bir

yol sağlar.

De novo metiltransferazlar DNMT3A ve DNMT3B erken embriyonik hücrelerde

yüksek derecede ifade bulmaktadır. DNMT3B özellikle spesifik genom bölgelerinde

de novo metilasyon için gereklidir ve bu gende mutasyon varsa X kromozom

inaktivasyonunda ve perisentromerik tekrar DNA sekanslarında metilasyon defektleri

görülmektedir (Bird, 2002).

DNMT1, DNMT3A ve DNMT3B, HDAC (Histon deasetilaz)’lar ile interaksiyona

girerek ve ayrıca diğer transkripsiyonel baskılama aktivitesi olan proteinlere

bağlanarak direk olarak transkripsiyonun baskılanmasına yol açarlar.

7

DNMT1, HDAC2 ile birlikte geç S fazı süresince replikasyon çatalında birlikte

lokalize olurlar. Yeni asetile histonlar geldiğinde geç replikasyon süresince bu

histonlar deasetile edilir ve transkripsiyonel olarak bu bölgeler baskılanır.

DNMT1’ler S fazı süresince DNA replikasyon çatalında lokalize olmalarına karşın

DNMT3A ve DNMT3B ise yalnızca geç S fazı süresince ko-lokalize olurlar (Jones

ve Baylin, 2002).

Kanserli hücrelerdeki, DNMT1 enziminin ekspresyonu ilk zamanlar 100 kat arttığı

düşünülse de, daha sonraki kantitatif metodlarda aslında 3.7 kat ila 2.5 kat arttığı

gösterilmiştir. Standart kompetitif RT-PCR kullanılarak lösemili hastaların blast

hücrelerinde DNMT1 ekspresyonunun ortalama 4.2 kat arttığı gösterilmiştir (Singal

ve Ginder, 1999; Baylin ve Herman, 2000; Melki ve Clark, 2002;).

Kanserli hücrelerin DNA’sında 5-metilsitozin (5-MeC) miktarında azalma

görülmektedir. Ancak bazı bölgelerde örneğin, tümör baskılayıcı genlerde DNA

hipermetilasyonu saptanmıştır. Buna karşın DNA hipometilasyonu ile de onkogen

aktivasyonu gerçekleşmektedir. Bu değişim solid tümörlerde olduğu gibi lösemilerde

de görülmektedir (Şekil 1.5.).

Akut myeloid lösemi (AML) ve kronik myeloid lösemi (CML)’lerde yapılan son

zamanlardaki çalışmalarda; AML’de DNMT1, DNMT3A ve DNMT3B metil

transferaz enzimlerinin sırasıyla 5.3-, 4.4- ve 11.7- kat arttığı görülmüş ve KML’de

ise DNMT1, DNMT2, DNMT3A ve DNMT4B’nin önemli ölçüde arttığı

görülmüştür (Melki ve Clark, 2002). Bununla birlikte, DNMT1 ve DNMT3B’nin her

ikisinin de delesyona uğraması sonucunda DNMT aktivitesi hücrede total genomda

%95 azalmaktadır (Jones ve Baylin, 2002; Baylin, 2005).

8

Şekil 1.5. Kanserde metilasyon profili (Villa ve ark., 2004)

DNMT2’ler küçük metiltransferazlar olup sadece C terminal domain içerirler.

DNMT2’lerin katalitik domaini de novo ve maintanance metiltransferaz aktivitesi

göstermemesine karşın bu enzim; DNA hasarının tanınması, DNA rekombinasyonu

ve mutasyon onarımı için gereklidir. Ancak yapılan çalışmalarda DNMT2’nin

eksikliğinde embriyonik kök hücrelerde global DNA metilasyonu görülmez.

DNMT3L (DNA-cytosine5-methyltransferase 3 like) proteininin metiltransferaz

aktivite bölge motifi noksandır, bu yüzden de diğer de novo DNMT’ler ile birlikte

çalışmak zorundadır. DNMT3L’ler HDAC1 (Histone deasetilase 1) ile interaksiyona

girerek onları aktive ederler. Buda bize DNMT3L’lerin histon deasetilasyonu,

kromatin “remodeling” ve transkripsiyon baskılanması içinde gerekli olduğunu

gösterir. DNMT3L, DNMT3A ve DNMT3B’nin karboksil terminal kısmına bağlanır

9

ve bu enzimlerin aktivite düzeylerini artırır. Yapılan çalışmalarda,

DNMT3A/DNMT3L kompleksinin DNA’ya bağlanma afinitesi DNMT3A’nın

yalnız başına bağlanma afinitesinden daha yüksektir. Ayrıca, DNMT3L’nin

DNMT3A ve DNMT3B’nin aktivitesini 1.5 ila 3 kat arttırdığı gösterilmiştir (Turek-

Plewa ve Jagodzinski, 2005; Klose ve Bird, 2006).

1.1.2. CpG Adacıkları

CpG adacıkları ilk olarak, restriksiyon enzimi HpaII için kesimlenme bölgesine sahip

kısa genomik DNA bölgeleri olarak tanımlanmış olup, “HpaII Tiny Fragment (HTF)

adacıkları” olarak adlandırılmışlardır.

CpG adacıkları 1-2 kb uzunluğunda kısa DNA bölgelerdir ve genomun yaklaşık

olarak %2’sini oluşturmaktadırlar. Bu bölgeler %60-70 oranında guanin ve sitozince

(GC) zengin dizilere sahiptir (Cross ve Bird, 1995; Jones ve Baylin, 2002; Turek-

Plewa ve Jagodzınskı, 2005).

Memeli genomunda bulunan CpG dinükleotidleri büyük ölçüde metiledir. Bu

kromatinin yeniden düzenlenmesine aracılık etmektedir ve ayrıca tekrar bölgelerinin

(Alu sekansları) transkripsiyonunun engellenmesine aracılık eder. CpG adacıkları

metilasyondan korunmuş bölgeler olup insan genomunda genlerin yaklaşık olarak

%40-50’sinde promotor bölgesinin proksimalinde yer alır. Tam olarak metile CpG

adacıkları yalnızca imprintlenmiş otozomal genlerde ve bayanlardaki X

kromozomunda görülmektedir (Baylin ve Herman, 2000; Takai ve Jones, 2002;

Turek-Plewa ve Jagodzınskı, 2005).

CpG adacıkları, “house keeping” genleri olarak bilinen temel genlerde ve doku

spesifik genlerin 5’ promotor gölgelerinde ve ayrıca genlerin ekzon’larında

bulunmaktadırlar. Đnsan genomunda böyle tanımlanmış 45.000 CpG adacığı

bulunmaktadır ve genellikle normal hücrelerde metile olmayan (unmethylated)

10

durumdadır (Lewis ve Bird, 1991; Jones ve Laird, 1999; Singal ve Ginder, 1999;

Costello ve ark., 2000; Momparler ve Bovenzi, 2000; Nguyen ve ark, 2001; Jones ve

Baylin, 2002; Melki ve Clark, 2002; Turek-Plewa ve Jagodzınskı, 2005). Bununla

birlikte kanserlerde, promotor bölgelerinin hipermetilasyonu en iyi karakterize edilen

epigenetik değişikliktir. Bu hemen hemen bütün tip insan tümörlerinde

bulunmaktadır ve ayrıca transkripsiyonel baskılanma ile ilişkilidir (Jones ve Baylin,

2002). Yapılan çalışmalarda, CpG adacıklarında meydana gelen hipermetilasyonu

rastgele olmadığı ve tümör tipine göre spesifik olarak meydana geldiği gösterilmiştir

(Costello ve ark., 2000; Melki ve Clark, 200; Esteller, 2005).

5-metilsitozinin kendisi mutajeniktir ve spontan olarak hidrolitik deaminasyon

sonucu C→T transisyonu görülür (Jones ve Baylin, 2002). Bu nedenle bu bölgeler

insan DNA’sında “hot spot” (sıcak nokta) bölgeler olarak tanımlanır ve evrim

süresince metile CpG bölgeleri elimine olur (Jones ve Laird, 1999; Takai ve Jones,

2002; Turek-Plewa ve Jagodzınskı, 2005).

1.1.3. DNA Metilasyonu ve Transkripsiyonel Susturulma

DNA metilasyonu, transkripsiyonun negatif regülatörü olarak hareket etmektedir.

DNA metilasyonu aracılığıyla transkripsiyon iki tip mekanizma ile baskılanır;

Transkipsiyon aktivatör faktörünün bağlanmasına direk müdahale; AP-2, c-

myc/myn, cAMP-bağımlı aktivatör CREB, E2F ve NF-kB gibi bazı transkripsiyon

faktörlerinin tanıyıp bağlandığı bölgeler, CpG rezidülerı içermektedir. Bu bölgelerde

meydana gelen metilasyon sayesinde transkripsiyon faktörleri bağlanamadığından

transkripsiyon inhibe olur. Buna karşın, bazı transkripsiyon faktörleri (örneğin,Sp1

ve CTF) bağlanma bölgelerindeki metilasyona duyarlı değildirler ve birçok

faktöründe bağlanma bölgesinde CpG dinükleotid rezidüleri bulunmamaktadır.

Ancak bu bölgelerde metil-CpG bağlanma proteinin olmaması gerekmektedir (Bird

11

ve Wolffe, 1999; Jones ve Laird, 1999; Singal ve Ginder, 1999; Klose ve Bird,

2006).

Spesifik transkripsiyonel represyon; Spesifik transkripsiyonel represörün,

metillenmiş DNA’ya direk bağlanmasıyla meydana gelir. Metile CpG’leri tanıyıp

proteinler sekans spesifitelerine göre; (i) sekans spesifitesi olan MDBP (metile

DNA’ya bağlanma protein), (ii) sekans spesifitesi olmayan MeCP (metile CpG

bağlanma protein)’ler olmak üzere ikiye ayrılır (Lewis ve Bird, 1991).

MeCP’ler, MeCP1 ve MeCP2 olmak üzere ikiye ayrılır. MeCP1 ve MeCP2 ilk

tanımlanan 5 metil-CpG bağlanma aktivitesine sahip proteinlerdir. MeCP1, büyük

multi-protein kompleks olarak tanımlanmıştır ve bu kompleksin histon deasetilaz

aktivitesi bulunmaktadır. MeCP1’in DNA’ya bağlanabilmesi için 12 tane m5CpG

dinükleotidine ihtiyacı varken, MeCP2 ise tek bir polipeptid olup, bağlanabilmesi

için tek bir tane m5CpG adacık yeterlidir (Momparler and Bovenzi, 2000; Esteller,

2005). MeCP2’nin yapısında MBD (metil bağlanma domaini) ve TRD

(transkripsiyon baskılama domaini) olmak üzere 2 domain bulunmaktadır. MBD

domaini sayesinde MeCP2 DNA’ya bağlanırken TRD domaini sayesinde ko-represör

olan Sin3A interaksiyona girer (Razin, 1998). Sin3A’da histon deasetilasyonlarla

interaksiyona girmek suretiyle bu bölgede toplanmalarını sağlar (Bird ve Wolffe,

1999). Histon deasetilasyonu hem transkripsiyon düzeyinin azalmasıyla hemde sıkı

nükleozomal paketlenme ile ilişkilidir (Jones and Laird, 1999; Klose ve Bird, 2006)

(Şekil 1.6.).

Sekans spesifitesi olan MBDP proteinlerinin varlığı, metile promotorlarının genel

özelliğidir. DNMT’ler histon deasetilazları ve histon metiltransferazların

(HMT)’lerin bu bölgeye toplanmasını sağlar.

MeCP ve MBDP proteinleri HDAC, ko-represör (Sin3a) ve ATP bağımlı kromatin

remodelling proteinler ile oluşturduğu kompleks heterokromatin yapısının

stabilizasyonu için gereklidir (Turek-Plewa ve Jagodzınskı;2005).

12

Şekil 1.6. DNA metilasyonu aracılığıyla transkripsiyonel baskılanma mekanizması. HDAC; Histon deasetilaz, TF; Transkripsiyon faktörü, CR; Ko-aktivatör, HAT; Histon asetilaz, MBP; Metil sitozin bağlanma proteini, DNMT; DNA metiltransferaz enzimi, CR; Korepresör (Baylin, 2005). 1.1.4. DNA Metilasyonunun Kanserle Đlişkisi DNA metilasyonunun onkogenezde rol oynadığı bilinmektedir. DNA metilasyonu

profilindeki değişiklikler solid tümörlerde ve ayrıca lösemilerde de görülmektedir.

DNA metilasyonunun kanser gelişimindeki rolü birbirini takip eden bir veya daha

çok mekanizma ile açıklanmaktadır;

1. Kanser hücrelerindeki C → T dönüşümü ; Metile olmamış C’nin

deaminasyonu sonucu U’e dönüşür. Ancak Urasil-DNA glikosilaz enzimi sayesinde

G:U eşleşmesi tanınarak ve onarılır. Bununla birlikte , DNA-MTaz enzimi bu

onarımı bloklamaktadır. DNA-MTaz enzimi ile CpG adacıklarındaki sitozinlere (C)

metil grubu ekler. 5meC’in deaminasyonu sonucunda timin (T) bazı oluşur. Ancak

bu dönüşüm DNA’da tanınarak onarılamaz ve böylece nokta mutasyonları meydana

gelir. Bu olaya tümör baskılayıcı gen olan p53 örnek verilebilmektedir. Đnsan solid

tümörlerinin %50’sinden fazlasında p53 tümör baskılayıcı geninde mutasyon

13

görülmektedir. Ancak,bunların %24’ünde, CpG adacıklarındaki C→T dönüşümü

görülmektedir.

2. DNA hipometilasyonu; Genomik metilasyon düzeyindeki düşüş bir diğer

mekanizmadır. Bu olay sonucunda metilasyon aracılığıyla inaktifleşmiş olan genler,

metilasyonun kalkması ile aktif duruma geçerler. Bunlara kronik lenfoid

lösemilerdeki bcl-2 onkogeninin reaktivasyonunu örnek verebiliriz.

3. Tümör baskılayıcı genlerin hipermetilasyonu; Hücrenin kontrollü bir şekilde

büyümesi için gerekli olan tümör baskılayıcı genlerin ekspresyonlarının azalması

kanser oluşumunda oldukça önemlidir. Diğer kanserlerde olduğu gibi lösemilerde de

bu genlerin ekspresyonunun azalmasında DNA hipermetilasyonunun rol oynadığını

görmekteyiz (Singal ve Ginder, 1999).

Tümör baskılayıcı genlerin bialelik inaktivasyonu ya yalnız DNA metilasyonu

aracılığıyla ya da mutasyonlar veya delesyonlarla birlikte meydana gelmektedir

(Momparler ve Bovenzi, 2000).

DNA-MTaz düzeyindeki artış sonucunda, tümör baskılayıcı genlerin promotor

sekanslarındaki CpG adacıklarında meydana gelen hipermetilasyon sonucunda gen

inaktive olur. Bu durum ilk olarak retinoblastoma (Rb) geninde tanımlanmıştır

(Baylin ve Ohm, 2006).

4. Hatalı DNA metilasyonu nedeniyle oluşan bozulmadan dolayı kromozomal

instabilite; Kanser gelişimi ve ilerleyişinde kromozomal instabilite oldukça

önemlidir. DNA metilasyonu ayrıca DNA’nın sıkı bir şekilde paketlenmesinde rol

oynamaktadır. Bu sıkı paketlenmeden dolayı örneğin transpozonların genom

içerisinde hareket etmeleri engellenmiş olmaktadır. Ancak metilasyon kaybıyla,

DNA sıkı bir şekilde paketlenemeyeceğinden transpozonlar genomda rahatlıkla

14

harekete ederek kromozomal instabiliteye neden olmaktadır. Ayrıca DNA onarım

genlerindeki anomaliler de kromozomal instabiliteye neden olmaktadır (Singal ve

Ginder, 1999) (Şekil 1.7.).

Tekrar sekanslarında DNA metilasyonu görülmektedir. Bu sayede rekombinasyona

benzer olaylara karşı koruma sağlanır ve potansiyel olarak destabilize “transposable”

elementlerini baskılar. Hipometilasyon sonucu genomda mutasyon oranı (delesyon

ve kromozomal kopya sayısında artış) artar (Bayani ve ark., 2007).

MLH1 (mutL homolog 1) geni, DNA “mismatch” onarım komponentlerini kodlar ve

bu gen sporadik tümörlerde büyük bir sıklıkla hipermetiledir bu da mikrosatellit

instabilitesine yol açmaktadır (Baylin ve Herman, 2000; Jones ve Baylin, 2002;

Baylin, 2005).

Non-promotor DNA bölgelerinin ve sentromerik DNA’lar gibi yapısal elementlerin

hipometilasyonu genetik insatabilitenin artmasına neden olur. Örneğin;

DNMT3B’nin germline mutasyonu ICF (immunodeficiency centromeric instability

and facial abnormalities) neden olmaktadır. ICF sendromunda sentromer bölgesinde

metilasyon kaybı görülmektedir buda kromozomal yapısal değişikliklere yol

açmaktadır. Yine, fare embriyonik kök hücrelerde yapılan bir çalışmada DNMT1’de

bir defekt varsa gen delesyon düzeyinde artış olduğu gösterilmiştir (Jones ve Baylin,

2002).

15

Şekil 1.7. Onkogenezde, sitozin metilasyonunun neden olduğu mekanizmalar (Singal ve

Ginder;1999).

1.1.5. DNA Metiltransferaz Đnhibitörleri

DNA metilasyonu, oldukça kuvvetli bir şekilde genlerin ifade bulmasını bloke

etmektedir. DNA metilasyonunun reversible bir olay olmasından dolayı epigenetik

olarak baskılanmış olan tümör baskılayıcı genlerinin reaktivasyonu için yeni kanser

ilaçları kullanılmaktadır. Günümüze kadar epigenetik inhibisyonu hedefleyen

ilaçlarda hedef;

1. DNA metiltransferazlar

2. Histon deasetilazlardır (Çizelge 1.1.) Ancak bu çizelgedeki ilaçların bir çoğu

çoklu etkiye sahiptir.

DNA metiltransferazlar ve histon deasetilazlar inhibe edilerek potansiyel olarak

epigenetik baskılanma bloke edilir. Ancak, DNA metiltransferaz inhibitörleri

16

aracılığıyla transkripsiyonel aktivasyon sağlanırken histon deasetilazlar bu işi tek

başına yapamazlar. Çünkü HDAC inhibisyonu yalnız başına promotorda histon

asetilasyonuna yol açmasına rağmen genin reaktivasyonu promotor demetile

olmadıkça gerçekleşmez, yalnızca bu bölgedeki MeCP2 proteininin azalmasına yol

açmaktadır. Bu nedenden dolayı kombine edilmeleri susturulmuş genlerin

reaktivasyonunda efektif olarak sinerji göstermektedir (Momparler ve Bovenzi,

2000; Jones ve Baylin, 2002; Laird, 2005).

Çizelge 1.1. Epigenetik inhibitörler (Laird, 2005’den modifiye edilmiştir) Đnhibitör Adı Açıklama

DNA Metiltransferaz Đnhibitörleri

5-Azasitidin Vidaza FDA, MDS için onaylanmış

5-Aza-2’-deoksisitidin Decitabine,dacogen Faz I/II

Arabinosil-5-azasitidin Fazarabine Faz I/II

5-6-Dihidro-5-azasitidin DHAC Faz I/II

5-Fluoro-2’-deoksisitidin Gemcitabine Faz I/II

MG98 DNMT 1 antisense Faz II

RNAi

Histon Deasetilaz Đnhibitörleri

FK228 Depsipeptit, FR901228 Faz I/II

Trichostatin A SAHA Yüksek toksisite

RNAi

DNA metiltransferaz inhibitörü olarak 5-azasitidin ve 5-aza-2-deoksisitidin

kullanılmaktadır. 5-azasitidin, DNMT enzimine bağlanır ve aktivitesini inhibe etmek

süretiyle m5CpG dinükleotidlerinin gen ekspresyonu ve hücre farklılaşması

üzerindeki dramatik etkisini inhibe ederler (Santi ve ark., 1984).

5-azasitidin C-6 posizyonundan DNMT1 ile kovalent bağ oluşturmak süretiyle

metiltransferaz aktivitesini inhibe eder (Lengauer ve ark., 1997; Momparler ve

Bovenzi, 2000; Nelson ve ark; 2004; Yang ve ark., 2006) (Şekil 1.8). Ancak bu 5-

aza-2-deoksisitidinin kendisi karsinojeniktir, bu hipometilasyon aracılığıyla

onkogenlerin aktivasyonuna yol açmaktadır. 5-aza-2-deoksisitidin S-fazı spesifik

17

ajanıdır ve in vivo’da dozaj bağımlı olarak DNA metiltransferazları inhibe ederler

(Lengauer ve ark.,1997; Momparler and Bovenzi, 2000).

Şekil 1.8. Azasitidin aracılığıyla hipometilasyon ve gen reaktivasyonu. (Baylin;2005 )

1.2. Sitokin Sinyalini Baskılayan Proteinler (SOCS)

Sitokinler, salgı glikoproteinleri olup çoklu alt birim içeren reseptör kompleksi ile

interaksiyona girmek süretiyle hücre yaşamı, proliferasyonu ve farklılaşması gibi çok

çeşitli biyolojik olaylarda önemli role sahiptir. Bu mediatörlerin uyarımı sonucunda

JAK/STAT yolağı aktif hale geçer ve ilgili hedef genlerin transkripsiyonu

gerçekleşir. Son zamanlardaki çalışmalarda bu yolağın negatif feedback’inin

disregülasyonu hematopoetik hastalıklar, otoimmun hastalıkları ve daha birçok

kanserin oluşumuna neden oldukları gözlenmiştir (Starr ve ark., 1997; Larsen ve

Röpke, 2002; Okochi ve ark, 2003; Watanabe ve ark.; 2004, Valentino ve Pierre,

2006).

JAK/STAT yolağı 3 protein ailesi tarafından negatif olarak regüle edilir; (i) Aktive

olmuş STAT’ların protein inhibitörleri (PIAS), (ii) SH2 (Scr-homology-2) içeren

protein tirozin fosfatazlar (SHP), (iii) Sitokin sinyali baskılayıcı protein ailesi

(SOCS). (Okochi ve ark., 2003; Johan ve ark., 2004).

SOCS ailesinin sekiz farklı üyesi bulunmaktadır; SOCS1-7 ve CIS (cytokine-

inducible SH2 protein). Bu proteinlerin amino terminal bölgelerinde düşük benzerlik

18

gösteren ve 50 ila 380 amino asit uzunluğunda bölgeler mevcut iken bütün bu sekiz

proteinde de ortak olan yaklaşık 95 amino asit uzunluğunda SH2 (src homolog

domain) domaini ve SOCS box (karboksil terminal domain) olarak adlandırılan iki

motif bulunmaktadır. Ayrıca SOCS-1 ve SOCS-3 proteinlerinde KIR adı verilen

kinaz inhibitör bölgesi yer almaktadır (Yoshikawa ve ark., 2001; Oshima ve ark.,

2004, Watanabe ve ark., 2004; Melzner ve ark., 2005; Rakesh ve Agrawal, 2005)

(Şekil 1.9.).

Şekil 1.9. SOCS ailesi üyelerinin domain yapıları ve alternatif adları (Larsen ve Röpke, 2002).

SOCS ailesine ait proteinler sahip oldukları SH2 domainleri sayesinde hem JAK’lar

(SOCS-1) hemde sitokin reseptörleri (SOCS-2, SOCS-3 ve CIS) üzerindeki

fosfotirozin rezidülerine bağlanabilmektedirler (Şekil 1.10.). Bunlar sitokin sinyalini

ya JAK aktivitesini inhibe etmek suretiyle veya reseptör üzerindeki fosforile olmuş

bölge için STAT’lar ile rekabet etmek üzere yada E3 ubiquitin ligazın bir parçası

olan SOCS box’lar aracılığıyla sinyal proteinine bağlanarak onu ubiquitin proteozom

yolağına sokarak degradasyonunu sağlamak suretiyle inhibe ederler. Böylece, SOCS

box’lar SOCS-SH2 interaktif proteinler ile E3 ubiquitin ligaz arasında bir köprü

olarak hareket ederler ve protein turnoverını düzenlerler (Yoshikawa ve ark., 2001;

Sutherland ve ark., 2004; Valentino ve Pierre, 2006).

SOCS proteinleri, hücrede bazal düzeyde bulunmaktadır. Ancak IFNγ veya IL-6 gibi

sitokinler aracılığıyla ekspresyonları hızlı bir şekilde artmaktadır. Normalde hücrede

çok düşük veya hiç tespit edilemeyen SOCS proteinleri, özellikle IL-6 aracılığıyla

19

uyarıldıkları taktirde 20 dakika içerisinde düzeylerinin oldukça arttığı belirlenmiştir.

(Larsen ve Röpke, 2002). SOCS geni aynı zamanda, lipopolisakkaritler gibi diğer

uyarıcılarla da uyarılmaktadır (Rakesh ve Agrawal, 2005).

Şekil 1.10. Negatif feedback loop mekanizması. Sitokinler aracılığıyla JAK/STAT yolağı aktive olur bu da CIS, SOCS-1, SOCS-2 ve SOCS-3’ün indüklenmesine neden olur. SOCS proteinleri sinyal yolağını inhibe ederler. (A) SOCS-1, JAK’a bağlanır ve onun katalitik aktivitesini inhibe eder. (B) SOCS3 aktive olan reseptöre bağlanarak yine JAK’ın katalitik aktivitesini inhibe eder. (C) CIS, STAT’ın reseptöre bağlanmasını engelleyerek STAT aktivasyonunu engeller. Tam olarak bilinmemekle birlikte SOCS-2’de aynı işlevi görür (Larsen ve Röpke, 2002).

1.2.1. JAK/STAT Yolağı

JAK/STAT sinyal yolağı, ekstrasellüler sitokin sinyallerinin nükleusa iletilmesinde

önemli bir yere sahiptir ve bu hücre büyümesi, farklılaşması ve transformasyonunu

içeren hücresel olayları düzenler (Brankensiek ve ark., 2005). Bu yüzden bu yolak,

hematopoez, immün düzenlenme ve onkogenezde kritik öneme sahiptir (Rakesh ve

Agrawal, 2005).

20

Sitokinlerin aynı aileden gelen reseptörlere bağlanması üzerine reseptör

dimerizasyonu meydana gelir ve böylece tirozin fosforilasyonu gerçekleşir bu da

reseptör ilişkili JAK’ların aktivasyonuna neden olur. Bu kinaz bir çok hedef proteini

fosforile eder. Fakat başlangıç olarak reseptörün sitoplazmik domainini fosforile

eder. Bunun üzerine STAT molekülü üzerindeki SH2 domaini reseptör zincirinin

fosfotirozin bölgesi ile interaksiyona girerek STAT moleküllerinin toplanması

sağlanmış olur. JAK bu STAT moleküllerini fosforile ederek reseptörden

ayrılmalarını sağlar. Bu aktive olmuş STAT molekülleri birbirleriyle homodimer

veya heterodimer oluşturarak nükleusa transloke olurlar ve DNA üzerinde spesifik

sekanslara bağlanarak hedef genlerin transkripsiyonuna modüle ederler (Chim ve

ark., 2004; Watanabe ve ark.,2004; Campbell, 2005;) (Şekil 1.11.).

Şekil 1.11. JAK/STAT yolağı (Ilangumaran ve ark., 2004).

1.2.2. SOCS1 Proteini

Sitokin sinyalini baskılayan proteinlerden olan (SOCS)-1/SSI-1/JAB sitokin

sinyalinin negatif regülatörü olarak fonksiyon görür. Đnsan SOCS1 geni kromozom

16p13.3’de protamine gen kümesinde yer almaktadır. Genomik DNA’sı 2 ekzon ve

1 intron içermesine karşılık tek bir ekzondan (ekzon2) 211 amino asitlik bir protein

sentezlenir (Yoshikawa ve ark., 2001). SOCS-1 genindeki CpG adacıklarının

21

uzunluğu 2.5 kb uzunluğunda olup promotor, ekzon 1 ve ekzon2’de yer almaktadır

(Yoshikawa ve ark., 2001; Liu ve ark., 2003; Oshima ve ark., 2004) (Şekil 1.12.).

Yapısındaki merkez SH2 (12 a.a uzunluğunda) çoklu tirozin-fosforile sinyal

proteinlerine bağlanır ve KIR (pre-SH2) (24 a.a uzunluğunda) domaini sayesinde

enzim aktivitesini inhibe ederken SOCS box domaini (12 a.a uzunluğunda) ise

elongin BC içeren komplese bağlanarak ubiquitin bağımlı hedef proteinlerin

degradasyonunu hızlandırır (Ilangumaran ve ark., 2004; Vuong ve ark., 2004;

Watanabe ve ark., 2004).

Şekil 1.12. SOCS-1 geninin DNA yapısı ve sahip olduğu CpG bölgeleri dağılımı (Watanabe ve ark.,

2004).

SOCS-1 iki bağımsız bölge sayesinde JAK2 aktivasyonunu inhibe eder; (i) JAB; N-

terminal kinaz inhibitör bölgesi JH1’in katalitik oluğuna (Şekil 1.13), (ii) SH2

domainide aktivasyon ilmeğindeki fosforile tirozin rezidusu Tyr-1007’e bağlanarak,

yalancı Jak substratı olarak fonkiyon görerek Jak’ın inaktivasyonuna yol açar

(Kamizono ve ark., 2001, Voung ve ark., 2004) ve sonuçta JAK/STAT yolağı

downregüle olur. SOCS-1; IL-6, IL-4, lösemi inhitör faktör, onkostatin M,

interferon-gama, thrombopoietin ve büyüme hormonu gibi sitokinlere verilen

hücresel cevabı baskılar (Yoshikawa ve ark., 2001; Giordanetto ve Kroemer, 2003;

Oshima ve ark., 2004; Watanabe ve ark., 2004; Vuong ve ark., 2004).

22

Şekil 1.13. JAK kinazın JH1 domaininin aktivasyonu ve SOCS-1 aracılığıyla inhibisyonu. (A) Đnaktif

konformasyon substratın girişini engeller (B) Aktif JAK, katalitik bölgeye substratın bağlanmasına

izin verir (C) Aktivasyon ilmeğine SOCS-1’in bağlanması katalitik cebe substratın girişini engeller

(Larsen ve Röpke, 2002).

SOCS proteini SH2 domaini sayesinde interaksiyona girdiği proteini sahip olduğu

SOCS kutusu sayesinde Elongin B ve C kompleksi ile interaksiyona girerek hedef

proteinin degradasyonuna neden olur (Şekil 1.14., Çizelge1.2.). SOCS kutusu

JAK2’nin degradasyonu için gereklidir, SOCS kutusu aracılı JAK2’nin

degradasyonu için JAK2’nin fosforile durumda olması ve SOCS-1 ile kuvvetli bir

interaksiyona girmesi gerekir. Ayrıca SOCS-1’in degradasyon hızı JAK2’nin

aktivasyonuna bağlıdır (Kamizono ve ark., 2001; Kile ve ark., 2002; Giordanetto ve

Kroemer, 2003; Melzner ve ark., 2005; Valentino ve Pierre, 2006)

SOCS-1 protein stabilitesi oldukça sıkı kontrol altındadır. SOCS proteinlerinin

stabilizasyonu, proteozom inhibitörleri aracılığıyla sağlandığından SOCS-1

düzeyinin proteozom yolağı aracığıyla regüle edildiği düşünülmektedir. Ayrıca son

zamanlardaki çalışmalarda, SOCS-1’in mikrotübül organizasyon kompleksi (MTOC)

ile kolokalize ve biyokimyasal olarak kopurifiye olduğu bulunmuştır (Voung ve ark.,

2004; Valentino ve Pierre, 2006).

23

Şekil 1.14. JAK’ın SOCS kutusu aracılı degradasyonu (Kile ve ark., 2002).

Çizelge 1.2. SOCS moleküllerinin çeşitli proteinlerle interaksiyonları (Ilangumaran ve ark., 2004)

SOCS molekülünün çeşitli domainlerinin proteinlerle girdiği interaksiyon SOCS

ailesi

Üyeleri

N-Terminal SH2 domain Box Tanımlanmamış

CIS PKCθ EpoR,GHR,Mpl,IL-2Rβ,IL-3R-βC

SOCS-1 Grb2,PI3K,p85,

Nck,Fyn,Itk,

Pim-1,Tec

JAK1,JAK2,JAK3,TYK2,GHR,Kit,

Flt3,Fms(M-CSFR),IGF-1R

EGFR,Vav,FAK,CD3ζ,,IR,IRS-1,IRS-

2 IRAK1, HPV-E7

Elongin BC PYK2,IL-2Rβ,

TRIM8/GERP,p65/Rel

SOCS-2 GHR,PLR,IGF-1R

SOCS-3 JAK1,epoR,GHR,Leptin R,G-CSFR

gp130 IGF-1R,IR,CD28

Elongin BC

P120RasGAP

FGFR,PYK2,Lck,IL-

2Rβ,IL-12Rβ,

Calcineurin,CXCR4

SOCS-5 IL-4Rα

SOCS-6 IR,IRS-4,PI3Kp85 Kit Elongin BC

SOCS-7 Ash,Nck,PLCγ IRS-4,PI3Kp85

SOCS-1 geninin overekspresyonu, KIT reseptörü veya TEL-JAK2 proteininin

onkogenik formları sayesinde meydana gelen transforme olan hücrelerin büyümesini

baskılamaktadır. Ayrıca SOCS-1 geninin down regülasyonu tümör oluşumuna neden

olduğundan dolayı tümör baskılayıcı gen olarak fonksiyon gördüğü düşünülmektedir

(Kishimoto ve Kikutani, 2001; Rottapel ve ark., 2002).

24

SOCS-1’in inaktivasyonu sonucu JAK/STAT yolağının sürekli aktivasyonuna yol

açar. SOCS-1’in geninin CpG adacıklarından hipermetilasyonu; insan hepatoselüler

karsinoma, hepatoblastoma, multiple myeloma ve AML’de görülmektedir (Oshima

ve ark., 2004).

1.3. Amaç

Bugüne kadar DNA hipermetilasyonunun onkogenezdeki rolüne yönelik pek çok

çalışma bulunmaktadır. Bu çalışmalar sonucunda bir çok kanser tipinde tümör

baskılayıcı genlerin inaktif hale geçmesine yol açarak onkogenezde rol oynadığı

gösterilmiştir. Tümör baskılayıcı genlerindeki CpG adacıklarının hipermetilasyonu,

transkripsiyonel susturulma ile ilişkilidir ve bu olay kanser gelişimi ve

progresyonunda önemli rol oynamaktadır. Tümörlerde metilasyon olayının iyi

anlaşılması erken teşhis, prognozun takibinde ve tedavide önemlidir. (Brakensiek,

2005). Yine bu çalışmalarda, CpG adacıklarında meydana gelen hipermetilasyonun

rastgele olmadığı ve tümör tipine göre spesifik olarak meydana geldiği gösterilmiştir.

Bu çalışmada, lökomogenezde önemli rol oynadığı düşünülen JAK/STAT yolağının

negatif regülatörü olan SOCS1 (suppressor of cytokine signalling-1) geninin akut

lösemi tiplerinde (ALL, AML) DNA metilasyon profillerinin çıkarılması

amaçlanmıştır.

Çalışmadan elde edilecek olan verilerin, akut löseminin patogenezi ve tedavisini

yönlendirilmesi açısından önemli olduğu düşünülmektedir.

25

2. GEREÇ VE YÖNTEM

2.1. Çalışma Gurubu

Bu çalışmaya, akut lösemili hastalarda SOCS-1 geninin DNA hipermetilasyonunun

tespit etmek üzere, Dışkapı Eğitim ve Araştırma Hastanesi Pediatrik Hematoloji

Ünitesi ve Başkent Üniversitesi Tıp Fakültesi Pediatrik Hematoloji B.D’dan akut

lösemi tanısı almış 50 olgu ve 25 sağlıklı birey, aydınlatılmış onamları alındıktan

sonra dahil edilmiştir (Ankara Üniversitesi Tıp Fakültesi Etik Kurul Karar No: 110-

2892). Onam formu örneği EK’te sunulmuştur. Bu amaçla, sağlıklı ve hasta

bireylerden 2 ml periferal kan ve kemik iliği örnekleri alındıktan sonra DNA

izolasyonu gerçekleştirilinceye kadar + 4 0C’de saklanmıştır.

SOCS-1 geninin metilasyon profillerinin tespiti için DNA izolasyonunu takiben

DNA modifikasyonu ve MS-PCR gerçekleştirilmiştir.

2.2 Periferal Kandan DNA Đzolasyonu

Periferal kandan DNA izolasyonu, QIAamp® DNA Kiti (Qiagen, 51306) kullanılarak

aşağıda tanımlanan yöntemle gerçekleştirilmiştir.

• 1.5 mL’lik ependorfa sırasıyla 20 µl proteinaz K, 200 µl kan (örnek 200

µl’den az ise PBS ile 200 µl’ye tamamlanır) ve 200 µl buffer AL konuldu ve

kuvvetlice karıştırıldı,

• 560C’lik su banyosunda 10 dakika beklendi,

• Kısa bir santrifüj edildikten sonra %96’lık EtOH’den 200 µl ilave edildi ve

kuvvetlice karıştırıldı,

• Kısa bir santrifüj yapıldıktan sonra örnekler 2 ml’lik spin kolona aktarıldı,

26

• 6000 xg’de 1 dakika santrifüj edildi ve spin kolon temiz tüpe aktarıldı,

• Üzerine 500 µl buffer AW I konuldu,

• 6000 xg’de1 dakika santrifüj edildi ve spin kolon temiz tüpe aktarıldı

• Üzerine 500 µl buffer AW II konuldu,

• 20.000 xg’de 3 dakika santrifüj edildi,

• Kolon 1.5 mL’lik ependorfa yerleştirildi ve üzerine 200µl buffer AE konuldu

ve oda sıcaklığında 1 dakika bekletildi,

• 6000 xg’de 1 dakika santrifüj edildi ve spin kolon atıldı,

• Örnekler -20’ye kaldırıldı.

2.3. DNA’nın Kantitasyonu

Đzole edilen DNA’ların saflık derecesi ve konsantrasyonu aşağıda belirtildiği gibi

spektrofotometrik olarak tayin edilmiştir.

• Elde edilen DNA örneğinden 20 µl alınıp quartz tüp içinde dH2O ile hacmi

500 µl’ye tamamlandı ve iyice karıştırıldı,

• Spektrofotometrede OD260 ve OD280 değerleri ölçüldü,

• 260 ve 280 nm’deki optik dansite değerlerinin oranı hesaplanarak DNA’nın saflığı belirlendi (OD260/OD280 hesaplanarak).

Aşağıdaki formül kullanılarak elde edilen DNA’nın konsantrasyonu belirlendi. Konsantrasyon (µg/µl) = OD260 x 0.05 x 100 (sulandırma katsayısı)

2.4. Metilasyon Spesifik Polimeraz Zincir Reaksiyonu (MSP)

MSP (Metilasyon Spesifik Polimeraz Zincir Reaksiyonu), Herman ve Baylin

tarafından geliştirilmiş olup, CpG adacıklarındaki metilasyon durumun tespiti için

27

hızlı ve hassas bir yöntemdir (%0.1) (Herman ve ark., 1996; Momparler ve Bovenzi,

2000) (Çizelge 2.1.).

Çizelge 2.1. Metilasyon-spesifik PCR’ın avantaj ve dezavantajları.

Avantajları

Metilasyon tespiti için hızlı bir teknik

Oldukça hassas bir yöntem

Dezavantajları

Kantitatif değildir

PCR problemleri

MSP 3 basamakta gerçekleştirilir; (Şekil 2.1.)

Metilasyon – Spesifik PCR Nasıl Çalışır?

1.Bisülfit Muamelesi

(Đlgilenilen sekans

5’.GCGATACTCGCATCG..)

2. Metilasyon spesifik primer

setleri ile PCR

3. Jel Analizi

(Etidyum bromür ile boyanmış agaroz

jel)

Durum 1: DNA unmetiledir

5’...GCGATACTCGCATCG.... ↓

Bisülfit Muamelesi ↓

5’...GUGATAUTUGUATUG....

Tüp 1

Bisülfit ile muamele edilmiş DNA +

“U” primer (unmetile DNA sekansına bağlanacak)

Durum 1: DNA unmetiledir

Primer ‘U’ Primer ‘M’

kuyucuk PCR ürünü

Durum 2: DNA metiledir

5’...GCmGATACTCmGCATCmG... ↓

Bisülfit Muamelesi ↓

5’...GCmGATAUTCmGUATCmG...

Tüp 2

Bisülfit ile muamele edilmiş DNA +

“M” primer (metile DNA sekansına bağlanacak)

Durum 2: DNA metiledir. Primer ‘U’ Primer ‘M’

kuyucuk PCR Ürünü

Şekil 2.1. MSP aşamaları. (Epigenetics, 2006)

1. Bisülfid DNA modifikasyonu; Sodyum bisüfit ile sitozin bazı reaksiyona girdiği

zaman seçici olarak urasile dönüşürler. Bu reaksiyon 3 temel adımda meydana

gelir; (Şekil 2.3.)

28

i. Sülfonasyon; Düşük sıcaklık ve düşük sıcaklıkta, reversible olarak sitozin

bazının sülfonasyonu sonucu sitozin-6-sülfat oluşur

ii. Deaminasyon; Yüksek sıcaklık ve pH 5.0’da sitozin-6-sülfat’ın

irreversible olarak hidrolitik deaminasyonu gerçekleşir.

iii. Desülfonasyon; Bu basamakta urasil-6-sülfat’ın reversible

desülfonasyonu sonucu urasil bazı oluşur.

Şekil 2.2. Bisülfid modifikasyon aşamaları (I) sitozinin C6 pozisyondan sülfanasyonu (II) hidrolitik deaminasyon sonucu 6-sülfat-urasil (III) alkali şartlar altında desülfanasyon sonucu urasil bazının oluşumu.

Sitozin bazının sodyum bisülfid ile etkin bir şekilde modife edilebil mesi için

DNA önce denatüre edilir (DNA Methylation Protocols; 2002 ).

2. PCR; Đkinci aşama olan PCR’da ise ilgilenilen bölgeye uygun spesifik metile ve

unmetile primerler seçilerek polimeraz zincir reaksiyonu gerçekleştirilir

3. Jelde görüntüleme; PCR sonuçları agaroz jelde değerlendirilir (Understanding

DNA Methylation and Epigenetic Gene Silensing in Cancer 2004; Momparler ve

Bovenzi, 2000) (Şekil 2.3.)

2.4.1. DNA Modifikasyonu

Periferal kandan izole edilen DNA’ların modifikasyonu CpGenomeTM DNA

Modifikasyon Kiti (S7820) kullanılarak üretici firmanın önerdiği yöntemle modifiye

edilerek gerçekleştirilmiştir.

29

1. Adım; Solüsyonların Hazırlanması 3M NaOH stok (taze hazırlanır)

1 g NaOH, 8.3 mL steril dH2O’da çözünür.

20 mM NaOH/%90 EtOH (taze hazırlanır)

940 µL EtOH (%96)

53.4 µL steril dH2O

6.6 µL 3 M NaOH

Ajan I (taze hazırlanır ve ışıktan korunmalıdır)

Kullanmadan önce ajan I’in oda sıcaklığına gelmesi beklendi.

Her bir örnek için;

0,227 g DNA modifikasyon ajan I

0,571 mL steril dH2O içerisinde çözünür,pH 5 olmalıdır.

Ajan II (ışıktan korunmalı)

Kullanmadan önce toz halindeki ajan II’nin oda sıcaklığına gelmesi beklendi.

20 mL ddH2O içerisine1µL β-merkaptoetanol (Amresco, 0534B17) ilave edildi.

Her bir örnek için;

1,35 g DNA modifikasyon reagent II

750 µL β-merkaptoetanol/ ddH2O içerisinde çözündü. 2. Adım; DNA modifikasyon Prosedürü

• 2 µg DNA (100 µL steril dH2O içerisinde 20 ng/ µL)’ya 7,0 µL 3 M NaOH

eklendi.

• DNA’lar 500C’deki su banyısunda (Memmert) 10 dakika inkübe edildi,

30

• 550 µL reagent I ilave edildi ve karıştırıldı,

• Örnekler 500C’de yaklaşık 16 saat inkübe edildi. 3. Adım; Birinci Tuzdan Uzaklaştırma

• DNA modifikasyon ajan III vortekslenerek iyice karıştırıldı. Oda sıcaklığına

gelen örneklere 5 µL reagent III ilave edildi,

• 750 µL DNA modifikasyonu ajan II ilave edildi ve yavaşça karıştırıldı, oda

sıcaklığında örnekler 20 dakika inkübe edildi,

• Örnekler 5000 xg’de 15 saniye santrifüj edildi ve süpernatant atıldı,

• 1 mL soğuk EtOH ilave edildi ve 5000 xg’de 15 saniye santrifüj edildi ve

süpernatant atıldı (bu işlem 3 kez tekrarlanır),

• Son yıkamadan sonra 13.000 xg’de 2 dakika santrifüj edildi ve süpernatant atıldı.

4. Adım; DNA modifikasyonunun Tamamlanması (Desülfonasyon), Đkinci Tuzdan

uzaklaştırma

• Örneklerin üzerine 20 mM NaOH/ %90 EtOH solüsyondan 50 µL konuldu ve

oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edildi,

• 5000 xg’de 15 saniye santrifüj edildi, üzerine 1mL soğuk %96’lık EtOH ilave

edildi,

• 5000 xg’de 15 saniye santrifüj edildi ve süpernatant atıldı (bu işlem 2 kez

tekrarlanır),

• 2. yıkamadan sonra 13.000 xg’de 3 dakika santrifüj edildi ve süpernatant

atıldı,

• Örnekler oda sıcaklığında kurumaya bırakıldı,

• Pelet üzerine 30 µL TE buffer (10 mM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA, pH 5) ilave

edildi ve 550C’de 15 dakika inkübe edildi,

• 13.000 xg’de 3 dakika santrifüj edildi ve süpernatant yeni bir tüpe aktarıldı,

31

• Örnekler -20’de saklandı.

2.4.2. Metilasyon Spesifik Polimeraz Zincir Reaksiyonu (MSP)

Bu çalışma kapsamında öngörülen SOCS-1 geninin metilasyon profilinin MSP

yöntemi ile tespit edilmesi için kullanılan primer dizileri Çizelge 2.2.’de

verilmektedir (Yoshikawa ve ark., 2001)

Çizelge 2.2. SOCS-1 geninin ekzon2’si için primer dizisi. F:forward, R: reverse.

Ekzon-2 için Primer Dizisi (5’ → 3’)

Metile F TTC GCG TGT ATT TTT AGG TCG GTC

R CGA CAC AAC TCC TAC AAC GAC CG

Unmetile F TTA TGA GTA TTT GTT GTA TTT TTA GGT TGG TT

SOCS-1

Geni

R CAC TAA CAA CAC AAC TCC TAC AAC AAC CA

SOCS-1 geninin metilasyon profilinin tespiti Herman ve Baylin (1996)’nin yöntemi

modifiye edilerek kullanılmıştır. Bu amaçla içerisinde 0.5 U Hot-Start Taq Polimeraz

(Fermentas, #EP0602), 1xPCR hot-start buffer (Fermentas, #EP0602) , herbir

dNTP’den 200 µmol/l (Fermentas, #R0181), 2 mM MgCl2 (Fermentas, #Epo602),

herbir primerden 2.5 mM ve 3µl bisülfid DNA içeren toplam 25 µL reaksiyon

karışımında Thermocycler’da (Biometra T1 ThermocyclerTM, 050-901 T1 96) MSP

gerçekleştirilmiştir. Uygulanan PCR protokolü aşağıdaki gibidir.

95ºC - 5 dakika

95ºC - 45 saniye

63 ºC - 45 saniye

72ºC - 30 saniye

720C - 5 dakika

40 döngü

32

2.5. Metilasyon Profilinin Belirlenmesi

Elde edilen MSP ürünleri U ve M kontrol eşliğinde, %2’lik agaroz jelde 130 V’da 15

dakika yürütülmüş (Biometra-Agagek Mini, 020-000) ve UV translüminatör üzerinde

sonuçların değerlendirilmesiyle yapılmıştır. Çizelge 2.3.’de metile ve unmetile

DNA’ların beklenen bç büyüklükleri verilmiştir. %2’lik agaroz jel, 1xTBE (0.089 M

Trizma base (Sigma, T8524), 0.089 M Borik Asit (Ampresco, 2937B005), 0.002 M

EDTA (Sigma, E5134) içinde 0.1 µg/µL Etidyum bromid (Applichem, 5C000913)

içerecek şekilde hazırlanmıştır. Şekil 2.4’de Kontrol, AML ve ALL hasta

DNA’larının MSP ile hipermetilasyon sonuçlarının görüldüğü örnek bir jel görüntüsü

verilmiştir.

Çizelge 2.3. MSP ürünlerinin beklenen büyüklükleri

SOCS-1

U primer / DNA 175 bç

M primer / DNA 160 bç

Şekil 2.4. Kontrol, AML ve ALL hasta DNA’larının MSP ile hipermetilasyon sonuçlarının örnek bir

Jel Görüntsü.

U M MU U M

Unmetile birey Heterezigot birey Metile birey

MU

U kontrol M kontrol

Primer dimerler

33

2.6. Sonuçların Değerlendirilmesi

SOCS-1 geni metilasyonu saptanan ve saptanmayan AML ve ALL’li hastalar ile

yaşları arasındaki ilişkinin istatistiksel değerlendirilmesi ki-kare testinin alt formu

olan Fisher exact testi kullanılmıştır. SOCS-1 geni metilasyonunun AML, ALL, yaş

ve cinsiyetle ilişkisini belirlemek amacıyla çoklu lojistik regresyon analizi

kullanılmıştır.

34

3. BULGULAR

3.1. AML’de SOCS-1 Geni Metilasyon Durumu

21 AML hastasının 10’unda SOCS-1 geni metilasyonu saptanmış olup istatistiksel

olarak anlamlı bulunmuştur (p<0.001). 21 AML hastasına ait SOCS-1 geni

metilasyon durumu çizelge 3.1. ve şekil 3.1’de özetlenmiştir. 21 AML hastasının 15’i

erişkin olup 7’sinde metilasyon saptanmıştır (%46.7) ve bunların 5 tanesinde

heterozigot metile, 2 tanesinde homozigot metile bant görülmüştür. 6 çocuk AML

hastasının 3’ünde metilasyon saptanmıştır (%50) ve bunların 2 tanesinde heterozigot

metile 1 tanesinde de homozigot metile bant saptanmıştır. Heterozigot ve homozigott

bireylerin tümü metile olarak kabul edilmiştir.

Çizelge 3.1. Erişkin ve Çocuk AML hastalarında SOCS-1 gen metilasyon dağılımı

AML

Metile Unmetile Total

Erişkin 7 8 15

Çocuk 3 3 6

21

35

Şekil 3.1 Kontrol, AML, Erişkin AML ve Çocuk AML hasta gruplarının SOCS-1 gen hipermetilasyon durumlarının dağılımı A B

Kontrol Grubu

0%

100%

Metile

Unmetile

AML (Genel)

48%

52%

Metile

Unmetile

n=25 n=24 C D

Pediatrik AML

50%50%

Metile

Unmetile

Erişkin AML

47%

53%

Metile

Unmetile

n=6 n=15

3.2. ALL’de SOCS-1 Geni Metilasyon Durumu

29 ALL hastasının 2 tanesinde SOCS-1 geninde metilasyon saptanmış olup sonuç

istatistiksel olarak anlamlı bulunmamıştır (p>0.05). 29 ALL hastasına ait SOCS-1

gen metilasyon durumu çizelge 3.2. ve şekil 3.2’de özetlenmiştir. 29 ALL hastasının

3’ü erişkin olup 1 tanesinde metilasyon saptanmıştır (%33.3) ve bu hastada

heterozigot metile bant görülmüştür. 26 çocuk ALL hastasının 1 tanesinde

metilasyon saptanmıştır (%3.7) ve bu hastada heterozigot metile bant görülmüştür.

36

Çizelge 3.2. Erişkin ve çocuk ALL hastalarında SOCS-1 gen metilasyon dağılımı ALL

Metile Unmetile Total

Erişkin 1 2 3

Çocuk 1 25 26

29

Şekil 3.2. Kontrol, ALL, Erişkin ALL ve Çocuk ALL hasta gruplarının SOCS-1 gen hipermetilasyon durumlarının dağılımı A B

Kontrol Grubu

0%

100%

Metile

Unmetile

ALL (Genel)

7%

93%

Metile

Unmetile

n=25 n=29 C D

Pediatrik ALL

4%

96%

Metile

Unmetile

Erişkin ALL

33%

67%

Metile

Unmetile

n=26 n=3

37

3.3. Sağlıklı Bireylerde SOCS-1 Geni Metilasyon Durumu

Bu çalışmada akut lösemile hastalarda SOCS-1 geni metilasyonunun etkili olup

olmadığını tespit etmek amacıyla 25 sağlıklı bireyden elde edilen DNA örnekleri

kullanılmış olup 25 hastanın hiçbirinde metilasyon saptanmamıştır. Kontrol

örnekleriyle akut lösemi hastaların metilasyon durumları şekil 3.3.’de özetlenmiştir.

Şekil 3.3. Akut lösemili hastalarda SOCS-1 geni metilasyon dağılımları

0

20

40

60

80

100

120

Kontrol AML ALL

Görülme Sıklığı (%) (%)

Metile

Unmetile

38

4.TARTIŞMA

Sitokinler, kritik salgı proteinleri olup hücresel proliferasyonu ve farklılaşmayı

düzenlerler. Bu aracıların uyarımı başlıca JAK/STAT yolağı aracılığıyla sitokinlerin

indüklediği genlerin transkripsiyonel aktivasyonuna yol açar. Son zamanlarda

yapılan çalışmalarda JAK/STAT yolağının çeşitli tümör tiplerinde rol aldığı

gösterilmiştir (Yoshikawa ve ark., 2001; Chen ve ark., 2003; Depil ve ark., 2003;

Fujitake ve ark.,2003; Nagai ve ark., 2003; Fukushima ve ark., 2003; Chim ve ark.,

2004; Ekmekçi ve ark., 2004; Galm ve ark., 2004; Lin ve ark., 2004; Oshima ve ark.,

2004; Watanabe ve ark., 2004). Diğer taraftan SOCS ailesi, sitokinlerin indüklediği

sinyal yolaklarının negatif geri bildirim proteinleri olarak tanımlanmış olup sitokin

aracılı sinyalizasyonda kritik düzenleyicilerdir. Bu proteinler STAT’lar aracılığıyla

aktive olurlar. Ayrıca, SOCS proteinleri ya direk JAK’lari inhibe etmek suretiyle ya

da STAT’ların reseptöre bağlanmasını engellemek suretiyle JAK/STAT yolağını

negatif olarak düzenlemektedirler (Şekil 1.10.). (Okochi ve ark., 2003; Sutherland ve

ark., 2004) SOCS ailesi üyeleri sitokin aracılı sinyalizasyonu baskılayarak

tümörogenezin negatif regülasyonunda önemli rol oynadığı bildirilmiştir (Sutherland

ve ark., 2004). Sitokin sinyallerinin oluşturduğu büyümeyi düzenleyen sinyallerin

azalması veya kaybı da hematopoetik malignensilerin oluşumuna katkıda bulunduğu

saptanmıştır (Liu ve ark., 2003).

Tümör gelişiminde epigenetik mekanizmaların rolü son yıllarda önem kazanmıştır.

Normal dokularda tümör baskılayıcı genlerin CpG adacıkları metile değilken

lösemileri de içeren malignansilerde bu bölgelerde hipermetilasyon görülmektedir.

CpG adacıklarının hipermetilasyonunun gen inaktivasyonu ile ilişkili olduğu ve

neoplazinin patogenezine katkıda bulunduğu bildirilmektedir. Yoshikawa ve

ark.(2001) hepatoselüler karsinomada SOCS-1 geninin CpG adacıklarının

hipermetilasyonu sonucu transkripsiyonel baskılanmaya uğradığını göstermişlerdir.

Söz konusu çalışmalarda SOCS-1 geninin hipermetilasyon aracılığıyla

baskılanmasının sürekli JAK2 aktivasyonuna neden olarak tümör hücrelerinin

proliferasyonunu indüklediği belirtilmiştir. Chen ve ark. (2003) yaptıkları çalışmada,

39

SOCS-1 hipermetilasyonunun diğer genetik anomalilerle birlikte lösemi gelişimine

aracılık ettiğini bildirilmiştir (Chen ve ark., 2003).

Son zamanlarda yapılan çalışmalarda tümör baskılayıcı genlerin, 5’bölgelerinden

(promotor, tranlasyona uğramayan bölge veya ekzon 1) kanser-spesifik metilasyon

aracılığıyla inaktive olduğu gösterilmiştir. Tümör baskılayıcı genlerdeki bu

modifikasyon amino asit sekansındaki değişliklere göre daha yaygın bir olaydır

(Watanabe ve ark., 2004). Watanabe ve ark., (2004)’nın yaptıkları çalışmada, SOCS-

1 geninin AML’li hastalarda %72 oranında tümör-spesifik hipermetilasyon

aracılığıyla baskılandığı gösterilmiştir.

Yoshikawa ve ark.nın (2001) ilk olarak hepatoselüler karsinomada saptadıkları

SOCS-1 geni hipermetilasyonu daha sonra farklı solid doku tümörlerinde de

gösterilmiştir. Fukushima ve ark., (2003) pankreatik duktal neoplazi; Nagai ve ark.,

(2003) human hepatoblastoma; Fujitake ve ark., (2004) genç kolorektal kanserleri;

Lin ve ark., (2004) kolorektal kanser; Oshimo ve ark., (2004) human gastrik

karsinoma; Sutherland ve ark., (2004) meme kanserinde; To ve ark., (2004) human

gastrik hücre serilerinde SOCS-1 geni hipermetilasyonun varlığı bildirmiştir.

Hematopoetik malingnansiler ve SOCS-1 hipermetilasyonu ile ilişkili yapılan

çalışmalar çizelge 4.1.’de özetlenmiştir (Chen ve ark.,2003; Depil ve ark.,2003;

Galm ve ark., 2004; Liu ve ark., 2003; Chim ve ark., 2004; Ekmekçi ve ark.,2004;

Watanabe ve ark., 2004) (Çizelge 4.1.). Buna ilaveten Rottapel ve ark. tarafından

2002’de yaptıkları çalışmada SOCS1 geninin tümör baskılayıcı fonksiyonu olduğu

göstermişlerdir.

SOCS-1 geni 2 ekzon içerir, 1. ekzon kısa bir sekansa sahiptir. Translasyonu yapılan

yalnızca ekzon 2’dir ve beklendiğinden daha fazla GC’ce zengin sekansa sahiptir

(%70). Bu da göstermektedir ki, SOCS-1 geninin 2.ekzonu 5’ ucu bölgesindeki CpG

adacıklarının devamıdır (Watanabe ve ark., 2004). Bu iki bölgede meydana gelen

metilasyon değişikliği ve SOCS-1 geninin baskılanmasıyla ilişkili bir çok çalışma

vardır (Chim ve Kong; 2004). Nagai ve ark. (2003) , Chim ve ark., (2004), SOCS-1

40

geninin 5’UTR bölgesini çalışmışlardır. SOCS-1 geninin 2. ekzonunun metilasyon

profilinin araştırıldığı başka çalışmalar da bulunmaktadır (Yoshikawa ve ark., 2001,;

Chen ve ark. 2003; Galm ve ark. 2003; Watanabe ve ark., 2004). Watanabe ve

arkadaşlarının 2004’te yaptığı çalışmada metilasyonun 5’UTR bölgesinde değil de

ekzon 2 bölgesinde tespit edilmesi, SOCS-1 geninin 2. ekzonundaki metilasyonunun

gen ekspresyonu ile ilişkili olduğunu göstermektedir. Yine Oshimo ve ark. 2004’te

insan gastrik karsinoma hastalarında yapmış oldukları çalışmada hem ekzon 1’i

hemde ekzon 2 bölgelerini çalışmış ve ekzon 2 bölgesindeki metilasyonun mide

kanserinde anlamlı olduğunu ve ekzon 2 ile SOCS-1 gen ekspresyonunun ilişkili

olduğunu göstermişlerdir. Brankensiek ve ark. 2005’de yaptıkları çalışmada AML

hücre serisi olan KGIa hücrelerinde ekzon 2 demetilasyonunu ile SOCS-1

mRNA’sının artışı arasında bir korelasyon bulunmuştur. Ekzon 2

hipermetilasyonunun kromatin yapısını değiştirerek, gen ifadesinin inaktivasyonuna

yol açtığı belirtilmektedir (Watanabe ve ark., 2004). Bu nedenle bu tez çalışmasında

akut lösemili hastalarda SOCS-1 geni ekzon 2 bölgesinin metilasyon analizi

yapılmıştır.

Çizelge 4.1. SOCS1geninin primer posizyonlarına göre çeşitli tümör tiplerinde metilasyon profili (Chim ve Kwong, 2004’den modifiye edilmiştir)

SOCS1 ekspresyonu MSP

primer

Bölge

Malignansi

SOCS1 Metilasyonu (%)

Tedavi yok

Post-5AC

Referanslar

ekzon2 Hepatoselüler karsinoma

65 CL(-) ND Yoshikawa ve ark. (2001)

ekzon2 MM 62.9 CL(-) CL(+) Galm ve ark. (2003) ekzon2 AML 60 ND ND Chen ve ark. (2003) 5’UTR Hepatoblastoma 46.7 PS(-) ND Nagai ve ark. (2003) 5’UTR Pankreatik duktal

karsinoma 21.7 CL(-) CL(+) Fukushima ve ark. (2003)

5’UTR KML BT:67; CP:46 CL(-) CL(+) Liu ve ark. (2003) 5’UTR MM 0 ND ND Chim ve ark. (2004) ekzon2 AML 72 CL(-) CL(+) Watanabe ve ark. (2004)

Çalışmamıza katılan 21 AML hastasının 10’unda (%47) metilasyon tespit edilmiştir.

Bu sonuçlar kontrol grubu ile karşılaştırıldığında istatistiksel olarak anlamlı

bulunmuştur (p<0.001). Johan ve ark. (2005) AML’li hastalarda SOCS-1 geni

41

metilasyonunu %40, Ekmekçi ve ark. (2004)’ları %39, Chen ve ark. (2003)’da %60

oranında bulmuş olup bizim sonuçlarımız ile uyum göstermektedir.

Chim ve ark. (2003)’de yaptıkları çalışmada ALL’li hastaların yaş, cinsiyet ve

sitogenetik değişikliklerle SOCS-1 gen metilasyonu arasında bir ilişki olmadığını

bildirmişlerdir. Bizim çalışmamıza katılan akut lösemi hastalarda da SOCS-1 geni

metilasyonunun istatistiksel olarak yaş veya cinsiyet ile ilişkisi bulunmamıştır.

Ayrıca akut lösemili hastalardan AML tanısı olanların ALL’li olanlara göre SOCS-1

geninde metilasyon taşıma riski araştırıldığında, AML’li hastaların 8.69 kat daha

fazla risk taşıdığı tespit edilmiştir. 6 AML çocuk hasta ile 15 erişkin AML hasta ayrı

ayrı araştırıldığında her iki grubun kontrol grubu ile kıyaslandığında SOCS-1 gen

metilasyonu arasında istatistiksel olarak anlamlı bir ilişki tespit edilmiştir.

Bu çalışmamızdaki bir diğer grup olan 29 ALL hastasının 2 tanesinde (%6.9)

metilasyon saptanmış olup kontrol grubuyla karşılaştırıldığında istatistiksel olarak

anlamlı fark bulunamamıştır. Şimdiye kadar yapılan çalışmalarda ALL’li hastaların

ekzon 2 bölgesinin metilasyonuna yönelik bir çalışma bulunmamaktadır. Ancak

Chim ve ark., (2004) ALL erişkin hastalarda yaptıkları çalışmada SOCS-1 geninin

5’UTR bölgesinin araştırmışlar ve hastaların %24’ünde metilasyon saptamışlardır

(p=0.02). ALL’li hastalarda SOCS-1 geni ekzon 2 metilasyonu ile yapılan ilk

çalışma olması nedeniyle veri olarak önem taşımaktadır. Bu çalışmanın sonuçlarına

göre akut lenfoblastik lösemi ile SOCS-1 geni ekzon 2 metilasyonu arasında anlamlı

bir ilişki bulunmamaktadır. Ekzon 2 metilasyonunun SOCS-1 ekspresyonunu

düşürdüğüne ait yayınların bulunmasına rağmen, bulgularımızı doğrulamak için,

ekzon 2 metilasyonunun SOCS-1 ekspresyonu üzerine etkisinin saptanması için

mutlaka ekspresyon çalışması gerekmektedir.

Çalışmamıza dahil edilen hastalardan hiçbirisinin Decitabine gibi demetile edici ajan

kullanmadıkları belirlenmiştir. AML ve ALL’li hastalar için rutin kemoterapi

protokolü uygulanmış veya uygulanmaktadır. Ancak Schipper ve ark. (2007)

42

yaptıkları in vitro’da ALL’li hücre serilerinde 6-MP (6-mercaptopurine) ve MTX

(methotrexate)’ın DNA metilasyonunu inhibe ettiği ve malign kan hücrelerini

apoptoza götürdüğünü göstermişlerdir. Bizim çalışmamıza dahil edilen ALL’li

hastalar 6-MP ve MTX’i tedavinin 3. haftasında almaya başlamışlardır. Yine AML’li

hastalar hem 6-MP hemde MTX’i tedavilerinin 14. haftasında almışlardır. Bu

nedenle çalışmamızda ALL’li hastalarda metilasyon oranını düşük bulunmuş olabilir.

Tedavisi tamamlanmış olan AML ve ALL’li hastaların hiçbirinde SOCS-1

metilasyon tespit edilmemiştir. Yine ilaç kullanımı nedeniyle ALL’de ekzon 2’de

anlamlı olmasına rağmen SOCS-1 geninde metilasyon tespit edilememiş olabilir. Bu

bilgiler ışığında yeni tanı almış hastalarda metilasyon analizinin yapılmasının

sonuçların yorumlanmasında daha anlamlı olacağı sonucuna varılmıştır.

AML’li hastalarda DNA MTaz enziminin 2.5 ila 10 kat arttığı saptanmıştır. Ayrıca

DNMT3A ve DNMT3B’deki anormal artış lösemide metilasyon artışında rol

oynadığı düşünülmektedir (Melki ve ark., 1999). Tedavileri devam eden 3 AML

hastası 6-MP ve MTX ilaçlarını kullanmalarına rağmen metilasyon tespit edilmiştir.

Bunun nedeninin DNA MTaz enzim aktivitesinin aşırı derecede artmış olduğu

şeklinde yorumlanmıştır.

Akut lösemili hastalarda SOCS-1 metilasyon paterninin belirlenmesi için yeni tanı

almış ve 6-MP , MTX gibi ilaçların demetilasyona neden olması nedeniyle

kemoterapi tedavisine başlanmamış hastalarda çalışılması gerçek sonucu

yansıtacaktır. Ayrıca bu ilaçları kullanılmasına karşın halen SOCS-1 gen

metilasyonu tespit edilen hastalar bulunmaktadır. Bunun nedeni olarak düşünülen

DNA MTazların ekspresyon seviyelerinin de çalışılmasının uygun olacağı

düşünülmektedir.

SOCS-1 geninin inaktivasyonu lökomogenezde sıklıkla karşılaşılan bir olaydır ve

SOCS-1 metilasyonu primer lösemilerde %72 olarak tespit edilmiştir. (Watanabe ve

ark., 2004). Buna rağmen, CpG adacıklarının metilasyonu ile prognoz arasındaki

43

korelasyon halen tartışma konusudur ve DNA metilasyonun klinik anlamı belki de

gerekli olan diğer genlerin fonksiyonuna bağlıdır (Chen ve ark., 2003).

SOCS-1 metilasyon paterninin tek başına anlamlı çıkmadığı durumlarda diğer tümör

baskılayıcı genlerin metilasyon paternleri ile birlikte çalışıldığında anlamlı

olabileceği ve bu durumun söz konusu genlerde meydana gelen metilasyonların

lösemi oluşumundaki rolü ortaya koymak açısından faydalı olabileceği

düşünülmektedir.

44

5.SONUÇ VE ÖNERĐLER Bu tez çalışması ile;

• AML hastalarında SOCS-1 gen hipermetilasyonu açısından AML hastaları ile

kontrol grubu arasında istatistiksel olarak anlamlı bir ilişki saptanmıştır.

• Bu tez çalışması ile ilk kez, ALL hastalarında SOCS-1 geninin 2. ekzonunun

hipermetilasyonu araştırılmıştır. Ancak ALL ile kontrol grubu

karşılaştırıldığında anlamlı bir ilişki bulunmadığı belirlenmiştir.

• Çalışmamıza katılan akut lösemili hastalar da SOCS-1 geni metilasyonunun

istatistiksel olarak yaş veya cinsiyet ile ilişkisi bulunmamıştır.

• SOCS-1 gen metilasyonu ile ALL ve AML arasındaki korelasyon

araştırıldığında AML’li hastaların ALL tanısı alanlara göre 8.69 kat artmış

risk taşıdığı saptanmıştır.

• Tedavi protokolü tamamlanmış hastaların hiçbirinde metilasyon

saptanmamıştır. Buna bağlı olarak lösemili hastaların tedavi protokolünde yer

alan kematerapötik ilaçların metilasyon paternini değiştirebileceği sonucuna

varılmıştır. Bu nedenle metilasyon çalışmalarında ilk tanı hastalarının

çalışmaya dahil edilmesi gerekliliği ortaya çıkmıştır.

• Ekzon 2 metilasyonunun SOCS-1 gen ekspresyonu üzerine etkisinin

saptanması amacıyla ekspresyon çalışmasının yapılması önerilmektedir.

• Akut lösemili hastalarda SOCS-1 gen hipermetilasyonuna neden olduğu

düşünülen DNA MTaz’ların seviyesine bakılmasının uygun olacağı

düşünülmektedir

45

ÖZET

Akut Lösemilerde SOCS-1 Geninin Metilasyon Analizi

Lösemi, geleneksel olarak genetik bir hastalık olarak kabul edilmekle birlikte epigenetik mekanizmaların da bu hastalığın etiyolojisinde önemli rol oynadığı bilinmektedir. Epigenetik değişiklikler, DNA sekansında herhangi bir değişiklik olmaksızın gen ekspresyonunun kontrolüne olanak sağlayan değişimler olarak tanımlanmaktadır. Çeşitli tiplerde epigenetik mekanizmalar söz konusudur. Bunlar içerisinde en önemli epigenetik mekanizmanın DNA metilasyonu olduğu düşünülmektedir. Uzun yıllardan beri DNA metilasyonunun onkogenezde rol oynadığı öne sürülmektedir. DNA metilasyonu profilindeki değişiklikler solid tümörlerin pek çoğunda ve ayrıca lösemilerde de bildirilmiştir. Ökaryotlarda, DNA metilasyonu, sitozin bazının 5. karbonunda meydana gelir ve bu olay DNA metiltransferaz enzimleri tarafından katalizlenir. DNA metilasyonunun kanser gelişimindeki rolü birbirini takip eden bir veya daha çok farklı mekanizma ile açıklanmaktadır. Bu mekanizmalardan biri de tümör baskılayıcı genlerin hipermetilasyon yoluyla inaktivasyonudur. Diğer birçok kanser tipinde olduğu gibi lösemik fenotiplerin ortaya çıkmasında da bu kritik genlerdeki hipermetilasyon rol oynamaktadır. Sitokin sinyalini baskılayan (SOCS)-1 proteini JAK/STAT yolağının negatif regülatörü olup, bu proteinin lökomogenezde önemli rol oynadığı bildirilmiştir. Bu çalışmada, AML (akut myeloid lösemi) ve ALL (akut lenfoblastik lösemi)’li hastalarda kanser oluşumunda rolü olduğu düşünülen SOCS1 (suppressor of cytokine signalling-1) tümör baskılayıcı geninin metilasyon profilinin çıkarılması amaçlandı. SOCS1 geninin metilasyon durumu MSP(Metilasyon Spesifik PCR) aracılığıyla analiz edildi. Anormal SOCS-1 gen metilasyonu 21 AML hastasının 10’unda tespit edilirken (p<0.001), 29 ALL hastasının 2 tanesinde tespit edildi (p>0.05). 25 sağlıklı kişiden oluşan kontrol grubunun hiçbirinde SOCS-1 geni metilasyonu gözlenmedi. Sonuçlarımız SOCS-1 geninin metilasyonunun AML’de önemli rol oynayabileceğini ancak ALL için bu durumun söz konusu olmadığını düşündürmektedir.

Anahtar Kelimeler: SOCS1, DNA metilasyonu, MSP, AML, ALL.

46

SUMMARY

Methylation Analysis of SOCS-1 Gene in Acute Leukemia

Leukemia has traditionally been accepted as a genetic disease, however it is known that the epigenetic mechanisms also play an important role in the etiology of this disease. Epigenetic changes are described as the control of gene expression without changing the DNA sequence. There are different types of epigenetic mechanisms. DNA methylation is considered as the most important epigenetic mechanism. A role for DNA methylation in oncogenesis has been suggested for many years. Changes in methylation profile have been reported in the most types of solid tumours as well leukemias. DNA methylation in eukaryotes occurs at the carbon 5. position of the cytosine and is catalyzed by DNA methyltransferases. The potential contribution of DNA methylation to oncogenesis appears to be mediated by one or more of different mechanisms. One of mechsnisms is the inactivation of tumour suppressor genes via hypermethylation. Hypermethylation of this critical genes play an important role in leukemogenic phenotypes as other types of cancers. The suppressor of cytokine signalling (SOCS)-1 protein is negative regulator of JAK/STAT pathway, which have been reported to play important role in leukemiogenesis. In this study, it was aimed to analyze the SOCS1 gene methylation profile which has been suggested to have a role in cancer formation in AML (acute myeloid leukemia) and ALL (acute lymphoblastic leukemia) patients. The methylation status of SOCS1 gene was analyzed by MSP(Methylation Spesific PCR). Aberrant methylation of the SOCS-1 gene was detected in 10 of 21 AML patients (p<0.001) and in 2 of 29 ALL patients (p>0.05). Non of 25 healthy control subjects showed SOCS-1 gene methylation. Our result suggest that SOCS-1 gene methylation may play an important role in AML but not in ALL.

Key Words: SOCS1, DNA methylation, MSP, AML, ALL.

47

KAYNAKLAR

BAYANI J., SELVARAJAH S., MAIRE G., VUKOVIC B., AL-ROMAIH K.,

ZIELENSKA M., SQUIRE J. A., (2007). Genomic mechanisms and measurement of structural and numerical instability in cancer cells. Seminars in Cancer Biology. 17:5-18.

BAYLIN S. B., (2005). DNA methylation and gene silencing in cancer. Nature Clinical Practice Onclogy. 2:4-11.

BAYLIN S. B., HERMAN J. G., (2000). DNA hypermethylation in tumorigenesis. TIG. 16:168-174.

BAYLIN S. B., OHM J. E., (2006). Epigenetic gene silencing in cancer– a mechanism for early oncogenic pathway addiction?. Cancer. 6:107-116.

BEKSAÇ M., (1997). Akut Nonlenfoblastik Lösemi. Klinik Hematoloji.

BIRD A., (2002). DNA methylation patterns and epigenetic memory. Genes & Dev. 16:6-21. BIRD A. P., WOLFFE A. P., (1999). Methylation-iduced repression-belts, braces, and chromatin. Cell. 99:451-454.

BRANKENSIEK K., LÄNGER F., SCHLEGELBERGER B., KREIPE H., LEHMANN U., (2005). Hypermethylation of the suppressor of cytokine signalling-1 (SOCS-1) in myelodysplastic syndrome. British Journal of Haematology. 130:209–217.

CAMPBELL I. L., (2005). Cytokine-mediated inflammation, tumorigenesis, and disease

associated JAK/STAT/SOCS signaling circuits in the CNS. Brain Research Reviews. 48:166– 177.

CHEN C. Y., TSAY W., TANG J. L., SHEN H. L., LIN S. E., HUANG S. Y., YAO M.,CHEN Y. C., SHEN M. C., WANG C. H., TIEN H. F., (2003). SOCS-1 methylation in patients with newly diagnosed acute myeloid leukemia. Genes Chromosomes Cancer. 37: 300-305.

CHIM C. S., KWONG Y. L., (2004). How frequent is SOCS1 methylation in acute myeloid leukaemia? Br J Haematol. 127: 609-611.

CHIM C. S., WONG A.S.Y., KWONG Y.L., (2004). Epigenetic dysregulation of the Jak/STAT pathway by frequent aberrant methylation of SHP1 but not SOCS1 in acute leukaemias. Ann Hematol. 83:527–532.

48

COSTELLO J. F., FHUHWALD M. C., SMIRAGLIA D. J., RUSH L. J., ROBERTSON G. P., GAO X.,WRIGHT F. A. FERAMISCO J. D., PELTOMÄKI P., LANG J. C., SCHULLER D. E., YU L., BLOOMFIELD C. D., CALIGIURI M. A., YATES A., NISHIKAWA R., SU HUANGI H.-J., PETRELLI N. J., ZHANG X., O’DORISIO M.S., HELD W. A., CAVENEE W. K., PLASS C., (2000). Aberrant CpG-island methylation has non-random and tumour-type-specific patterns. Nature Genetics. 25:132-138.

CROSS S. H., BIRD A. P., (1995). CpG islands and genes.Current Opinion in Genetics and Development. 5:309-314.

DEPIL S., SAUDEMONT A., QUESNEL B., (2003). SOCS-1 gene methylation is frequent but does not appear to have prognostic value in patients with multiple myeloma. Leukemia. 17: 1678-1679.

EKMEKCI C. G., GUTIÈRREZ M. I., SIRAJ A. K., OZBEK U., BHATIA K., (2004). Aberrant methylation of multiple tumor suppressor genes in acute myeloid leukemia. Am J Hematol. 77: 233-240.

ESTELLER M., (2005). Dormant hypermethylated tumour suppressor genes:questions and answers. Journal of Pathology. 205: 172–180.

ESTELLER M., (2007). Cancer epigenomics: DNA methylomes and histone- modification

maps. Nature. 8: 286-298.

FUJITAKE S., HIBI K., OKOCHI O., KODERA Y., ITO K., AKIYAMA S., NAKAO A., (2004). Aberrant methylation of SOCS-1 was observed in younger colorectal cancer patients. J Gastroenterol. 39: 120-124.

FUKUSHĐMA N., SATO N., SAHĐN F., SU G. H., HRUBAN R. H., GOGGINS M., (2003). Aberrant methylation of suppressor of cytokine signalling-1 (SOCS-1) gene in pancreatic ductal neoplasms. Br J Cancer. 89: 338-343.

GALM O. WILOP S., REICHELT J. JOST E., GEHBAUER G., HERMAN J. G., OSIEKA R., (2004). DNA methylation changes in multiple myeloma. Leukemia. 18: 1687-1692.

GIORDANETTO F., KROEMER R. T., (2003). A three-dimensional model of Suppressor Of Cytokine Signalling 1 (SOCS-1). Protein Engineering. 16:115-124.

HERMAN J.G., GRAFF J.R., MYOHANEN S., NELKIN B.D., BAYLIN S.B., (1996).

Methylation-specific PCR: A novel PCR assay for methylation status of CpG islands (DNA methylation/ tumor suppressor genes/pl6/p15). Proc. Natl. Acad. Sci. 93:9821-9826.

49

ILANGUMARAN S., RAMANATHAN S., ROTTAPEL R., (2004). Regulation of the immune system by SOCS family adaptor proteins. Seminars in Immunology. 16:351–365.

ĐLHAN O., (1997). Akut Lenfoblastik Lösemi. Klinik Hematoloji.

JOHAN M. F., BOWEN T., FREW M. E., GOODEVE A. C., REILLY T., (2005). Aberrant methylation of the negative regulators RASSFIA, SHP-1 and SOCS-1 in myelodysplastic syndromes and acute myeloid leukemia. British Journal of Heamatology. 129:60-65.

JONES P. A. ve BAYLIN S. B., (2002). The Fundamental Role of Epigenetic Events in Cancer. Genetics. 3:415-428.

JONES P. A., LAĐRD P. W., (1999). Cancer epigenetics comes of age. Nature Genetics. 21: 163-167.

KAMIZONO S., HANADA T., YASUKAWA H., MINOGUCHĐ S., KATO R., MINOGUCHI M., HATTORI K., HATAKEYAMA S., YADA M., MORITA S., KITAMURA T., KATO H., NAKAYAMA K., YOSHIMURA A., (2001). The SOCS Box of SOCS-1 Accelerates Ubiquitin-dependent Proteolysis of TEL-JAK2. The Journal of Biological Chemistry. 276:12530-12538.

KILE B. T., SCHULMAN B. A., ALEXANDER W. S., NICOLA N. A., MARTĐN H. M. E., HILTON D. J., (2002). The SOCS box: a tale of destruction and degradation. TRENDS in Biochemical Sciences. 27:235-241.

KISHIMOTO T., KIKUTANI H., (2001). Knocking the SOCS off a tumor suppressor. Nature Genetics. 28:29-35.

KLOSE R. J. Ve BIRD A. P. Genomic DNA methylation: the mark and its mediators. TRENDS in Biochemical Sciences. 31:89-97.

LAIRD P. W., (2005). Cancer epigenetics. Human Molecular Genetics.14:65-76.

LARSEN L., ROPKE C., (2002). Suppressors of cytokine signalling: SOCS. APMIS 110:833–844.

LENGAUER C., KINZLER K. W., VOGELSTEIN B., (1997). DNA methylation and

genetic instability in colorectal cancer cells. Proc. Natl. Acad. Sci. 94:2545-2550.

LEWIS J., BIRD A., (1991). DNA methylation and chromatin structure. FEBS. 285:155-159.

LIN S. Y., YEH K. T., CHEN W. T., CHEN H. C., CHEN S. T., CHIOU H. Y., CHANG J. G., (2004). Promoter CpG methylation of tumor suppressor genes in colorectal cancer and its relationship to clinical features. Oncol Rep. 11:341-348.

50

LIU T-C., LIN S-F., CHANG J-G., YANG M-Y., HUNG S-Y., CHANG C-S., (2003). Epigenetic alteration of the SOCS1 gene in chronic myeloid leukaemia. British Journal of Haematology. 123:654-666.

LUND A. H., LOHUIZEN M. V. (2007) Epigenetics and cancer. Genes and development [Electronic Journal], Erişim: [www.genesdev.org].

MELKI J. R., CLARK S. J., (2002). DNA methylation changes in leukaemia. Cancer Biology. 12:347–357.

MELKI J. R., VINCENT P. C., CLARK S. J., (1999). Concurrent DNA hypermethylation of multiple genes in acute myeloid leukemia. Cancer Res. 59: 3730-3740.

MELZNER I., BUCUR A. J., BRUDERLEIN S., DORSCH K., HASEL C., BARTH T. F. E., (2005). Biallelic mutation of SOCS-1 impairs JAK2 degradation and sustains phospho-JAK2 action in the MedB-1 mediastinal Iymhoma line. Blood. 105:2535-2542.

MILLS K. I., RAMSAHOYE B. H., (2002). DNA-Methylation Analysis by the Bisulfite-assisted Genomic Sequencing Method. DNA Methylation Protocols.

MOMPARLER R. L., BOVENZĐ V., (2000). DNA Methylation and Cancer. Journal of cellular physiology.183:145–154.

NAGAI H., NAKA T., TERADA Y., KOMAZAKĐ T., YABE A., JIN E., KAWANAMI O., KISHIMOTO T., KONISHI N., NAKAMURA M., KOBAYASHI Y. EMI M., (2003). Hypermethylation associated with inactivation of the SOCS-1 gene, a JAK/STAT inhibitor, in human hepatoblastomas. J Hum Genet. 48:65-69.

NELSON S. M., FERGUSON L. R., DENNY W. A., (2004). DNA and the chromosome-varied targets for chemotherapy. Cell &Chromosome. 3:1-26.

NGUYEN C., LIANG G., NGUYEN T. T., TSAO-WEI D., GROSHEN S., LUBBERT M., ZHOU J. H., BENEDICT W. F., JONES P. A., (2001). Susceptibility of nonpromoter CpG islands to de novo methylation in normal and neoplastic cells. J Natl Cancer Inst. 93:1465-72.

OKOCHI O., HIBI K., SAKAI M., INOUE S., TAKEDA S., KANEKO T., NAKAO A.,(2003). Methylation-Mediated Silencing of SOCS-1 Gene in Hepatocellular Carcinoma Derived from Cirrhosis. Clinical Cancer Research. 9:5295–5298.

OSHIMO Y. KURAOKA K., NAKAYAMA H., KITADAI Y., YOSHIDA K., CHAYAMA K.,YASUI W., (2004). Epigenetic inactiviation of SOCS-1 by CpG island hypermethylation in human gastric carsinoma. Int. J. Cancer. 112:1003–1009.

51

RAKESH K., AGRAWAL D. K., (2005). Controlling cytokine signaling by constitutive inhibitors. Biochemical Pharmacology. 70:649–657.

RAZIN A., (1998). CpG methylation, chromatin structure and gene silencing-a three-way connection. The EMBO Journal. 17:4905–4908.

ROTTAPEL R., ILANGUMARAN S., NEALE C., ROSE J. L., HO J., M-Y., NGUYEN M. H-H., BARBER D., DUBREUĐL P., SEPULVED P., (2002). The tumor suppressor activity of SOCS-1. Oncogene. 21:4351-4362.

SANTI D. V., NORMENT A., GARRETT C. E., (1984). Covalent bond formation between a DNA-cytosine methyltransferase and DNA containing 5-azacytosine.Proc. Natl. Acad. Sci. 81:6993-6997.

SCHIPPER R. G., VAN DEN HEUVEL L. P., VERHOFSTAD A. A., DE ABREU R. A., (2007). Polyamines and DNA methylation in childhood leukaemia. Biochem Soc Trans. 35: 331-335.

SINGAL R., GINDER G. D., (1999). DNA Methylation. Blood. 93:4059-4070.

STARR R., WILLSON T. A., VINEY E. E. M., MURRAY L. J. L., RAYNER J. R., JENKINS B. J., GONDA T. J., ALEXANDER W. S., METCALF D., NICOLA N. A., HĐLTON D. J., (1997). A family of cytokine-inducible inhibitors of signalling. Nature. 387: 917-921.

STRACHAN T., READ A. P., (2004). Human Genome Expression. Human Molecular Genetics 3.

SUTHERLAND K. D., LINDEMAN G. J., CHOONG D. Y. H., WITTLIN S., BRENTZELL L., PHILLIPS W., CAMPBELL I. G., VISVADER J. E., (2004). Differential hypermethylation of SOCS genes in ovarian and breast carsinomas. Oncogen. 23:7726-7733.

TAKAHASHI T., SHIVAPURKAR N., REDDY J., SHIGEMATSU H., MIYAJIMA K., SUZUKI M., TOYOOKA S., ZOCHBAUER-MULLER S., DRACH J., PARIKH G., ZHENG Y., FENG Z., KROFT S. H., TIMMONS C., MCKENNA R. W., GAZDAR A. F., (2004). DNA methylation profiles of lymphoid and hematopoietic malgnancies. Clin Cancer Res. 10:2928-2935.

TAKAI D., JONES P. A., (2002). Comprehensive analysis of CpG islands in human chromosomes 21 and 22. PNAS. 99:3740-3745.

TO K. F., CHAN M. W., LEUNG W. K., NG E. K., YU J., BAI A. H., LO A. W., CHU S. H., TONG J. H., LO K. W., SUNG J. J., CHAN F. K., (2004). Constitutional activation of IL-6-mediated JAK/STAT pathway through hypermethylation of SOCS-1 in human gastric cancer cell line. Br J Cancer. 91:1335-1341.

52

TUREK-PLEWA J., JAGODZIŃSKI P. P., (2005). The role of mammalian DNA methyltransferases in the regulation of gene expression. Cellular & Molecular Biology Letters. 10:631–647.

VALENTINO L., PIERRE J., (2006). JAK/STAT signal transduction: Regulators and implication in hematological malignancies. Biochemical pharmacology. 71:713-721.

VILLA R., DE SANTIS F., GUTIERREZ A., MINUCCI S., PELICCI P. G., DI CROCE L., (2004). Epigenetic gene silencing in acute promyelocytic leukemia. Biochemical Pharmacology. 68:1247–1254.

VUONG B. Q., ARENZANA T. L., SHOWALTER B. M., LOSMAN J., CHEN X..P., MOSTECKI J., BANKS A. S., LIMNANDER A., FERNANDEZ N., ROTHMAN P. B., (2004). SOCS-1 localizes to the microtubule organizing complex-associated 20S proteasome. Mol Cell Biol. 24:9092–9101.

WADW P. A., (2001). Methyl CpG-binding proteins and transcriptional repression.

BioEssays. 23:1131-1137.

WATANABE D., EZOE S., FUJIMOTO M., KIMURA A., SAITO Y., NAGAI H., TACHIBANA I., MATSUMURA I., TANAKA T., KANEGANE H., MIYAWAKI T., EMI M., KANAKURA Y., KAWASE I.,NAKAT., KISHIMOTO T., (2004). Suppressor of cytokine signalling-1 gene silencing in acute myeloid leukaemia and human haematopoietic cell lines. British Journal of Haematology. 126:726–735.

WATANABE D., NAKA T., KISHIMOTO T., (2004). Implication of SOCS-1 gene methylation in acute myeloid leukaemia. British Journal of Haematology. 127:607–611.

YOSHIKAWA H., MATSUBARA K., QIAN G-S, JACKSON P., GROOPMAN J. D., MANNING J.E., HARRIS C.C., HERMAN J.G., (2001). SOCS-1, a negative regulator of the JAK/STAT pathway, is silenced by methylation in human hepatocellular carsinoma and show growth-suppression activity. Nature Genetics. 28:29-35.

53

EK

BĐLGĐLENDĐRĐLMĐŞ GÖNÜLLÜ OLUR FORMU Bu form katılmanız önerilen araştırma ile ilgili olarak sizi bilgilendirmek üzere hazırlanmış olup; araştırmaya katılıp katılmama konusunda karar vermenizin kolaylaştırılması hedeflenmiştir. Araştırmanın Adı: Akut Lösemilerde SOCS1 Geninin Metilasyon Analizi Araştırmanın Amacı: Lösemi, kan hücrelerinin kontrolsüz bir şekilde bölünmesi sonucu oluşan bir kan hastalığıdır. Lösemi, klinik ve patolojik olarak akut ve kronik lösemi olmak üzere ikiye ayrılmaktadır. Akut lösemilerde beyaz kan hücreleri olarak bilinen lökositlerin olgunlaşamayıp kontrolsüz bir şekilde çoğalmasıyla karakterize olan bir hastalıktır. Đnsanın DNA’sında var olan şifre vücudumuzda meydana gelen tüm olayları gerçekleştiren ve bu olayları düzenleyen faktörlerin oluşturulması için tüm bilgiyi içermektedir. Löseminin oluşmasında DNA’da var olan şifrede bazı değişiklikler sonucunda bir takım faktörlerin oluşumu engellenir ve hastalık meydana gelir. Bu değişiklerden biri de DNA metilasyonudur. Bu projede, AÜ Tıp Fakültesi Hematoloji Bilim dalından ve Dışkapı Eğitim ve Araştırma Hastanesi Pediatrik Hematoloji Ünitesin’den akut myeloid/lenfoid lösemi tanısı almış 25 hasta ile Serpil Akdağ Kan Merkezine başvuran gönüllü 15 sağlıklı bireylerde kanser oluşumunda rolü olduğu düşünülen tümör oluşumunu engelleyen SOCS1 (suppressor of cytokine signalling-1) geninin metilasyon profilinin çıkarılması amaçlanmaktadır. Çalışmanın Protokolü: Sizden bir defaya mahsus, kol damarınızdan yaklaşık 2 ml (yaklaşık 2 çay kaşığı) kan örneği istenmektedir. Kan alınımı, kolunuzdan ve sizi incitmeden gerçekleşecektir. Ancak kullanılan enjektör nedeniyle hafif derecede bir ağrı hissedebilirsiniz ve kolunuzda enjektörün temas ettiği bölgede lokal bir morarma görülebilir. Ayrıca, kan verirken sizde meydana gelebilecek bir takım rahatsızlıklar(bulantı, yorgunluk) tarafımızdan giderilecektir. Kan alınırken, sağlık ekibi oluşabilecek sorunlara müdahale için yanınızda bulunacaktır. Bu kanlardan genomik DNA elde edilecektir. Bu DNA’lar önce modifikasyona uğratılacak, modifiye olan DNA’lar ise MS-PZR(metilasyon spesifik polimeraz zincir reaksiyonu) denen test sürecine tabii tutularak test sonucu elde edilecektir. Eğer katılmayı kabul ederseniz, çalışmaya katılma süreniz sadece kan verme işleminin alacağı süre kadardır. Size her hangi bir ilaç verilmeyecek ve bu durum yaşamınızı etkilemeyecektir,ayrıca tedavi görüyorsanız tedavinizde değişiklik yapılmayacaktır. Çalışmaya katılıp katılmamakta serbestsiniz. Çalışmadan istediğiniz zaman çıkabilirsiniz, ayrıca teknik nedenlerden dolayı araştırmacı tarafından çalışmadan çıkarılabilirsiniz. Bu çalışma size ve sosyal güvencenizi sağlayan kuruma ekonomik açıdan mali bir yük getirmeyecektir.

54

Bu bilimsel amaçlı çalışma Prof. Dr. Asuman Sunguroğlu tarafından yürütülecektir. Çalışma süresince herhangi soru veya sorununuz olduğunda Prof. Dr. Asuman Sunguroğlu’na 310 30 10/388 numaralı telefondan veya Ankara Üniversitesi Tıp Fakültesi, Tıbbi Biyoloji Anabilim Dalı, Morfoloji Binası Kat:2’den ulaşabilirsiniz. Bu yazının bir kopyası da size verilecektir. Yardımlarınız için çok teşekkür ederiz. Ben/çocuğumun velisi olarak ……………………………………………………….yukarıdaki açıklamaları okudum. Okuduğum bilgiler bana sözlü olarak da iletildi. Bu çalışmaya gönüllü olarak katılmak/çocuğumun katılmasını istiyorum. Bu bilgiler ışığında elde edilen DNA’mın; □ Başka amaçla kullanılmaması □ Kimliğimin gizli tutularak bilimsel amaçlı diğer çalışmalarda da kullanılabilmesi koşulu ile kullanılmasına izin veriyorum. Hasta Adı- Soyadı Đmza Tarih Veli Adı- Soyadı Đmza Tarih Araştırmacı Doktor Adı-Soyadı Đmza Tarih Tanıklık eden kurum yetkilisi Đmza Tarih Adı-Soyadı

55

ÖZGEÇMĐŞ

I.Bireysel Bilgiler

Adı : Nuray Soyadı : Varol Uğruğu : T.C. Doğum Tarihi : 24.12.1979 Doğum Yeri : Ankara Medeni Hali :Bekar Đletişim Adres : Ankara Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Biyoloji A.D. 06100 Sıhhiye/ANKARA Tel : 310 30 10 / 401 e-mail : nurayv@yahoo.com

II. Eğitim Durumu: 2004-2007 :Tıbbi Biyoloji Yüksek Lisansı, Ankara Üniversitesi Tıp Fakültesi,Tıbbi Biyoloji Anabilim Dalı 2002- 2004 :Moleküler Biyoloji Yüksek Lisansı, Ankara Üniversitesi Fen Fakültesi, Biyoloji Bölümü 1997-2002 :Ankara Üniversitesi Fen Fakültesi, Biyoloji Bölümü 1991- 1997 :Ayrancı Lisesi 1986-1991 :Salih Alptekin Đlk Okulu Yabancı dili :Đngilizce III. Ünvanları 2002 : Biyolog IV. Bilimsel Đlgi Alanları Yurt Dışı Kongrelerde Poster Sunumu: S. Celik, T. Ozkan, N. Varol, O. S. Aydos, D. Akcora, A. Karadag, G. Gurman, A. Sunguroglu. The Methylation Analysis of DAP Kinase (DAPK1) Gene in Chronic Myeloid Leukemia.Europen Human Genetics Conference 2007, 16-19 June 2007, Nice, 2007: 154: 540. Asuman Sunguroglu ,Guvem Gümüs Akay, Pinar Ozkal, Nuray Varol, Dilara Akcora, Buket Altinok, Derya Gokmen, ,Aslihan Avci, Imge Berrin Ergüder, Erdinc Devrim, Ilker Durak Antiproliferative and apoptotic effects of garlic on chronic myeloid leukemia cell line . 54th Annual Congress on Medicinal Plant Research, 29 Agust-2 September 2006, Helsinki, Finland. Planta Medica. 2006: 72: 1057.

56

Ilker Durak, Asuman Sunguroglu, Aslihan Avci, Erdinc Devrim, Imge B. Erguder, Guvem Gumus Akay, Pinar Ozkal, Nuray Varol, Dilara Akcora, Buket Altinok, Derya Gokmen. Effects of aqueous garlic extract on oxidant/antioxidant status in 32 D and 32 Dp cell lines. 54th Annual Congress on Medicinal Plant Research, 29 August-2 September 2006, Helsinki, Finland. Planta Medica. 2006: 72: 1058. Yurt Đçi Kongrelerde Poster Sunumu: Gümüş Akay G, Özkal P, Varol N, Akçora D, Altınok B, Durak Đ, Sunguroğlu A. Sarımsağın BCR-ABL pozitif fare myeloid hücre serisi üzerindeki antiproliferatif ve apoptotik etkisi. XI. Ulusal Tıbbi Biyoloji Kongresi; 24-27 Kasım 2005, Manisa, s:72 VII. Bilimsel Etkinlikler Katıldığı Kongre ve Toplantılar 16-19 Nisan 2005 I. Moleküler Tıp Kongresi 24-27 Kasım 2005 XI. Ulusal Tıbbi Biyoloji Kongresi, Manisa/ Türkiye Katıldığı Kurslar 19 Nisan 2005 Proteomiks Kursu, Đstanbul/Türkiye Verdiği Seminerler 2005 : RNAi ve Kanser A.Ü.T.F. Tıbbi Biyoloji 2006 : SOCS proteinleri A.Ü.T.F. Tıbbi Biyoloji