СТАНДАРТИЗАЦИИ МЕТОДА ПРОТОЧНОЙ … - 2012/9.pdfХайдуков С.В....

Хайдуков С.В.

СТАНДАРТИЗАЦИИ МЕТОДА ПРОТОЧНОЙ ЦИТОМЕТРИИ ДЛЯ ИММУНОФЕНОТИПИРОВАНИЯ.

ПРАВИЛА ПОДГОТОВКА ПРОТОКОЛОВ И НАСТРОЙКИ ЦИТОМЕТРОВ ДЛЯ АНАЛИЗА

Хайдуков С.В., д.б.н.

-  ФГБУН Институт биоорганической химии им. акад. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Москва; -  ФГБУ Федеральный Научно-Клинический Центр детской гематологии, онкологии и иммунологии им. Дмитрия Рогачева, Минздравсоцразвития, Москва.

-

Хайдуков С.В.

Хайдуков С.В.

Что может привести к не качественному анализу?

1. Отсутствие правильной настройки проточного цитометра

2. Отсутствие правильной настройки протоколов анализа

3. Некачественные или просроченные регенты

4. Ошибки при подготовке образца для анализа

Хайдуков С.В.

Необходимо для качественного анализа и контроля качества в Проточной Цитометрии.

• 1. Калибровка •  Использование латексных частиц для

проверки оптического выравнивания источника света.

•  Использование латексных частиц для контроля мощности источника света. • Делается как правило один раз в день или в случаях получения не корректных результатов.

Хайдуков С.В.

Необходимо для качественного анализа и контроля качества в Проточной Цитометрии.

•  2. Контроль •  Контроль образца перед началом работы •  Изотипический контроль •  Контроль методологии и процесса анализа

Как правило выполняется каждый день или при изменениях в работе системы. Некоторые лаборатории выполняют с каждой партией, до и после нее. Проверка работы системы.

Хайдуков С.В.

Установки светорассеяния

Низкое напряжение на PMT FS

Низкое напряжение на PMT SS

Высокое напряжение на PMT FS

Высокое напряжение на PMT SS

1

2 3

1.  Лимфоциты

2.  Моноциты

3.  Гранулоциты

Хайдуков С.В.

Дискриминатор

Заниженное значение дискриминатора

Оптимальное значение дискриминатора

Завышенное значение дискриминатора

Хайдуков С.В.

Низкое напряжение на PMT

Высокое напряжение на PMT

Оптимальное напряжение на PMT

Установки напряжения на фотоэлектронных умножителях (PMT)

Хайдуков С.В.

5 цветов FITC/PE/ECD/PC5/PC7

Хайдуков С.В.

Компенсация

Хайдуков С.В.

Компенсация I

Хайдуков С.В.

Компенсация II

Первое правило Компенсация 1 FL1 против FL2 Mean-канал региона D3 = D4 Компенсация 2 FL2 против FL1 Mean-канал региона D1 = D3

FL1

FL2

Хайдуков С.В.

Как себя проверить?

Хайдуков С.В.

Второе правило Если мысленно нарисовать линии из центров областей позитивных клеток, то они должны быть приблизительно параллельны осям X и Y или должен образоваться прямоугольник.

Компенсация III

Хайдуков С.В.

Взаимосвязь между усилением напряжения на PMT и компенсацией

Не достаточное напряжение на PMT –

заниженные результаты анализа

Повышение напряжение на PMT без коррекции компенсации – не

достоверные результаты анализа

Повышение напряжение на PMT и коррекция компенсации

– достоверные результаты анализа

Повышение напряжения на одном из PМТ приводит к дополнительному вкладу интенсивности флуоресценции в

данный канал за счет других флуорохромов.

Хайдуков С.В.

Взаимосвязь между плотностью экспрессии маркеров и компенсацией

Хайдуков С.В.

Аутофлуоресценция A = до B = после антибиотиков

Хайдуков С.В.

Выбор зоны анализа лимфоцитов по морфологическим параметрам

базофилы

Хайдуков С.В.

Второе логическое ограничение В

Алгоритм выбора зоны анализа лимфоцитов при использовании логических ограничений по CD45 и

морфологическим параметрам. Последовательное внесение логических ограничений в

морфологическую гистограмму I. Выделение зоны

лимфоцитов по CD45

Анализ клеток одновременно попадающих в зоны А и В

Лимфоциты CD45bright

дуплеты

разрушенные клетки

Первое логическое ограничение А

Хайдуков С.В.

Алгоритм настройки протокола (ручной вариант) для многоцветного анализа при использовании CD45 для выбора зоны лимфоцитов

ПРИМЕР. Комбинация моноклональных антител и

флуорохромов CD8-FITC, CD38-PE, CD45-ECD, CD3-PC5,

CD4-PC7

Хайдуков С.В.

Алгоритм настройки протокола для многоцветного анализа при использовании CD45 (шаг 1)

Выбор зоны анализа лимфоцитов по алгоритму для CD45.

Хайдуков С.В.

Настройка чувствительности каналов флуоресценции (негативные клетки должны находиться в 1-ой декаде)

Алгоритм настройки протокола для многоцветного анализа при использовании CD45 (шаг 2)

Хайдуков С.В.

Компенсация всех флуорохромов против флуорохрома, связанного с CD45 (негативные клетки должны находиться в 1-

ой декаде)

Алгоритм настройки протокола для многоцветного анализа при использовании CD45 (шаг 3)

Хайдуков С.В.

Алгоритм настройки протокола для многоцветного анализа при использовании CD45 (шаг 3)

Компенсация всех флуорохромов против флуорохрома, связанного с CD45 (негативные клетки должны находиться в 1-

ой декаде)

Хайдуков С.В.

Компенсация остальных флуорохромов друг против друга, используя основные правила компенсации.

Алгоритм настройки протокола для многоцветного анализа при использовании CD45 (шаг 4)

Хайдуков С.В.

Компенсация всех флуорохромов против всех

Алгоритм настройки протокола для многоцветного анализа при использовании CD45 (шаг 4)

Хайдуков С.В.

•  Внутрилабораторная проверка •  Последовательная проверка

•  Количество клеток в гейте, которые являются лимфоцитами либо по морфологическим признакам, либо по CD45. Цель: > 95%

•  % CD3+ клеток в каждой пробирке +/- 3 % •  Процент лимфоцитов в образце, которые попадают в гейт по CD45. Либо по маркеру, который наиболее часто использован в данном анализе, например CD3. Цель: > 95 %

•  Контрольная сумма лимфоцитов •  (% CD3+ клеток + % CD19+ клеток + % CD3-CD16+/CD56+

клеток) в лимфоцитарном гейте = 100 % (+/- 5%) •  % CD3+/CD4+ клеток + % CD3+/CD8+ клеток ≈ % CD3+

клеток

Контроль качества Внутренний контроль качества

Хайдуков С.В.

Контроль качества Внешний контроль качества

18

18

14

32

25

48

32

72

24

90

30

95

29

104

0102030405060708090

100110

2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010

Участие в разделе ФСВОК "Проточная цитофлуориметрия" по годам

не участвовали в предыдущих циклах всего участников

Хайдуков С.В.

Контроль качества Внешний контроль качества

Контрольная сумма = %Т–клеток + %В-клеток + %NK-клеток ≈ 100 ± 5 %

Результат оценки качества цитометрических исследований по материалам ФСВОК (2004 – 2011 г.г.) Доля лабораторий с результатом

в диапазоне допустимых значений по контрольной сумме лимфоцитов (95-105%)

Доля результатов по контрольной сумме в диапазоне допустимых значений

60%

50%56%

59%66%

80% 83%77% 74%

86%78% 76%

86%91% 94%

83%88% 88%

0%10%20%30%40%50%60%70%80%90%

100%

1-04 2-04 1-05 2-05 1-06 2-06 1-07 2-07 1-08 2-08 1-09 2-09 3-09 1-10 2-10 3-10 1-11 2-11

Хайдуков С.В.

СПАСИБО ЗА ВНИМАНИЕ