การพัฒนาและทดสอบความถูกต้องของวิธีวิเคราะห์สาร...
Post on 27-Jun-2020
5 Views
Preview:
TRANSCRIPT
นพนธตนฉบบ วกรมวทยพ2561;60(2):54-68
54วารสารกรมวทยาศาสตรการแพทยปท 60 ฉบบท 2 เมษายน - มถนายน 2561
เฉลมพร ควรหา ทองสข ปายะนนทน และลดดา แกวกลาปญญาเจรญส�ำนกคณภำพและควำมปลอดภยอำหำร กรมวทยำศำสตรกำรแพทย ถนนตวำนนท นนทบร 11000
E-mail: Chalearmphorn.k@dmsc.mail.go.th
Accepted for publication, 24 April 2018
การพฒนาและทดสอบความถกตองของวธวเคราะหสาร
ตกคางกลมฮอรโมนในเนอสตวโดย LC-MS/MS
บทคดยอ ฮอรโมนมบทบาทส�าคญในการควบคมการเจรญเตบโตการเปลยนแปลงทางเพศ ลกษณะทางกายภาพของรางกาย
กระตนหรอยบยงระบบภมคมกนตลอดจนควบคมกระบวนการสรางและสลาย metabolism ของรางกาย ฮอรโมนมทงชนด
ทเกดขนเองตามธรรมชาตและชนดสงเคราะห มการน�าสารกลมฮอรโมนมาใชในการเลยงสตวทใชเปนอาหารอยางไมถกตอง
เพอวตถประสงคในการเรงการเจรญเตบโตและเพมกลามเนอท�าใหเกดการตกคางในเนอสตวสงผลกระทบตอรางกายคน
ซงสารกลมนมแนวโนมเปนสาเหตของการเกดมะเรงเตานม มะเรงมดลก กลมสหภาพยโรป (EU) ประกาศหามใชสารกลมน
เนองจากแนวโนมเปนสารกอมะเรง ผวจยจงไดพฒนาและทดสอบความถกตองของวธวเคราะหสารกลมฮอรโมนจ�านวน 4 สาร
ไดแก Diethylstilbesterol (DES), zeranol, 17 α-estradiol และ 17 β-estradiol ทตกคางในเนอสตว โดยเทคนค
LC-MS/MS ซงสารนถกสกดจากตวอยางดวย methanol แลวน�าไปก�าจดไขมนโดยใชเทคนค liquid-liquid extraction
ดวย hexane และท�าใหบรสทธโดยใชเทคนค solid phase extraction ดวย Oasis HLB วธดงกลาวมคาขดจ�ากด
ของการตรวจพบของทกสารเทากบ 0.1 ไมโครกรมตอกโลกรม คาขดจ�ากดของการวดเชงปรมาณของ DES และ zeranol
เทากบ 2.0 ไมโครกรมตอกโลกรม และเทากบ 6.0 ไมโครกรมตอกโลกรม ส�าหรบ 17 α-estradiol และ 17 β-estradiol
ชวงการวเคราะหทใหความสมพนธเปนเสนตรงของ DES และ zeranol อยในชวง 2.0-10.0 ไมโครกรมตอกโลกรม ขณะท
17 α-estradiol และ 17 β-estradiol อยในชวง 6.0-15.0 ไมโครกรมตอกโลกรม โดยมคาสมประสทธการตดสนใจ (R2)
ของทงสองชวงมากกวา 0.96 คาความแมนแสดงดวยคาเฉลย % recovery อยในชวง 73-105% และคาความเทยงแสดงดวย
คาสมประสทธความแปรปรวน อยในชวง 5.4-26.3% จากการพสจนความถกตองของวธพบวามความเหมาะสมทจะน�ามาใช
ในหองปฏบตการทดสอบ ตามคาก�าหนดของประกาศกระทรวงสาธารณสข ฉบบท 303 (2550) เรองอาหารทมยาสตวตกคาง
และไดท�าการส�ารวจปรมาณการตกคางของสารกลมฮอรโมนดวยวธทพฒนาขนในเนอไกและเนอวว รวมทงสน 50 ตวอยาง
ระหวางตลาคม 2557 ถง กนยายน 2558 ไมพบสารกลมฮอรโมนในทกตวอยาง
Determination of Hormone Residues in Meat by LC-MS/MS Chalearmphorn Kuanha et al.
55 วารสารกรมวทยาศาสตรการแพทยปท 60 ฉบบท 2 เมษายน - มถนายน 2561
บทน�า
สารกลมฮอรโมนทงชนดทเกดขนเองตามธรรมชาตและชนดสงเคราะหเปนสารทน�ามาใชเพอการรกษา
และบ�าบดโรค เชน เปนยาคมก�าเนดในสตร ใชเปนยารกษาโรคทเกดจากความผดปกตของหวใจและหลอดเลอด
ทเกยวกบหวใจ เชน โรคลนหวใจรวหรอลนหวใจตบ โรคกลามเนอหวใจตาย(1) จากการศกษาพบวาสารเคมกลมน
สามารถน�ามาใชในการปรบปรงคณภาพเนอสตวทใชเปนอาหารได โดยมทงการฉดหรอผสมในอาหารใหสตวเลยง
เพอบรโภค เชน วว ควาย ไก เปนตน เพอลดปรมาณไขมนเปนการเพมกลามเนอใหกบสตว(2,3) ซงเปนการน�ามาใช
อยางผดวตถประสงค จากหลกฐานการประเมนความเสยงของการไดรบสารกลมฮอรโมนทงทมาจากธรรมชาต
และฮอรโมนสงเคราะหทระดบความเขมขนต�าๆ แสดงใหเหนวาสามารถสงผลกระทบตอรางกายคนได กลาวคอ
มแนวโนมเปนสาเหตของการเกดมะเรงเตานม (breast cancer) มะเรงมดลก (uterine cancer) และยงอาจเปน
สาเหตของโรคทเกยวของกบตอมไรทอ (endocrine disrupting chemicals)(4,5)
สหภาพยโรป (European Union; EU) ประกาศหามใชสารกลมนในการเลยงสตวทใชเปนอาหาร
และหามน�าเขาผลตภณฑทมสารตกคางกลมฮอรโมนปนเปอน โดยมการตรวจสอบทงสารตงตน (parent drugs)
และสารกลมอนพนธ (metabolites) ในเนอสตวและผลตภณฑกอนน�าเขาไปจ�าหนาย(6) ส�าหรบประเทศไทย
ตามประกาศกระทรวงสาธารณสข ฉบบท 303 (2550) เรองอาหารทมยาสตวตกคาง มการควบคมคณภาพ
และความปลอดภยเนอสตวและผลตภณฑ โดยก�าหนดมาตรฐานของฮอรโมนทเปนสารตงตนและสารกลมอนพนธ
มปรมาณตกคางสงสด (Maximum Residue Limit, MRL) ไดไมเกนปรมาณทก�าหนดไวจ�านวน 2 ชนด
ไดแก zeranol และ trenbolone acetate ในรปของ β-trenbolone และ α-trenbolone ในเนอสตวและตบ
ท 2 และ 10 ไมโครกรมของสารตอ 1 กโลกรมของเนอเยอ อวยวะหรอผลตภณฑของสตว(7) และประกาศกรมปศสตว
พ.ศ. 2549 เรองก�าหนดมาตรฐานสารตกคางส�าหรบสนคาปศสตวก�าหนดไว จ�านวน 2 ชนด ไดแก DES และ estradiol
โดยตองตรวจไมพบในสตวเพอบรโภคทกชนด(8) ส�าหรบประเทศแคนาดาและเกาหลใต ก�าหนดปรมาณตกคางสงสด
ของสาร zeranol ในเนอสตวและตบท 2 และ 10 ไมโครกรมตอกโลกรม ตามล�าดบ(9)
จากขอก�าหนดดงกลาว วธทใชในการตรวจวเคราะหตองมความนาเชอถอและมความถกตอง แมนย�า
มความจ�าเพาะ มความไวสงในการตรวจวดชนดและปรมาณ เพราะเปนการวเคราะหหาปรมาณสารตกคางในระดบต�า
จากงานวจยทผานมามการตรวจวเคราะหดวยเทคนคตางๆ เชน thin-layer chromatography (TLC) ซงเปน
วธการตรวจวเคราะหทงาย ราคาถก แตมความไวต�า (low sensitivity) และความแมนนอย (poor accuracy)
ขณะทวธ enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) สามารถตรวจวเคราะหปรมาณสารตกคางในระดบต�า
ไดแกวธ ELISA เปน semi quantitative analysis ซงหากตรวจพบตองมวธการตรวจยนยนชนดและปรมาณ
(confirmatory method) เพมเตม นอกจากนชดตรวจ ELISA ส�าหรบสารกลมฮอรโมน 1 ชดตรวจได 1 ชนดสาร
เทานน ดงนนถาตองการตรวจสารมากกวา 1 ชนด ตองใชเวลาและสนเปลองคาใชจาย ส�าหรบเทคนค LC-MS/MS
โดยม detector เปนชนด ion trap, time-of-flight หรอ triple quadrupole เปนเทคนคทสามารถวเคราะห
หาปรมาณสารตกคางในระดบต�าได แตทงนกขนอยกบการเลอกใช interface ทท�าหนาทเปนแหลงก�าเนดไอออน
(ion source) ใหเหมาะสมกบสภาพขวของสาร (polar compounds) หรอแมแตวธ GC-MS/MS ซงสามารถ
ตรวจวดสารในระดบต�าได แตวธนตองผานขบวนการ derivatization ซงท�าใหเสยเวลาในการเตรยมตวอยาง(10,11,12)
การศกษานจงไดพฒนาวธโดยมความมงหมายใหไดวธวเคราะหสารกลมฮอรโมนในเนอสตว ทสามารถเตรยม
ตวอยางไดรวดเรว ใชปรมาณสารเคมนอย ประหยดคาใชจาย สามารถวเคราะหสารกลมฮอรโมนได 4 ชนด พรอมกน
ไดแก DES, zeranol, 17 α-estradiol และ 17 β-estradiol โดยใชเทคนค LC-MS/MS ซงเปนเทคนคทมความไว
และความจ�าเพาะสง สามารถตรวจสอบสารทมปรมาณนอยไดอยางแมนย�า โดยวธดงกลาวปรบเปลยนขนตอน
การเตรยมตวอยางจากวธของ Yoshioka และคณะ(13) ในขนตอนการสกดและการท�าใหสารบรสทธและไดท�าการทดสอบ
การวเคราะหสารตกคางกลมฮอรโมนในเนอสตวโดย LC-MS/MS เฉลมพร ควรหา และคณะ
56วารสารกรมวทยาศาสตรการแพทยปท 60 ฉบบท 2 เมษายน - มถนายน 2561
ความถกตองของวธ (method validation) โดยใชเนอไกเปนตวแทน (representative matrix) ตามแนวทาง
EURACHEM Guide 2012(14) เพอยนยนวาวธทไดมความถกตอง เหมาะสม สามารถน�าไปใชตรวจวเคราะหตวอยาง
เพอควบคมคณภาพอาหารตามกฎหมาย นอกจากนเพอใหมขอมลพนฐานของปรมาณฮอรโมนตกคางในเนอสตว
ทจ�าหนายในประเทศ จงไดส�ารวจปรมาณฮอรโมนทตรวจไดโดยวธทพฒนาและทดสอบความถกตองแลว ในตวอยาง
เนอสตวทจ�าหนายในกรงเทพมหานคร
วสดและวธการ
สารเคมและสารมาตรฐาน
สารมาตรฐาน : diethylstilbesterol (DES), zeranol, 17 alpha-estradiol (17 α-estradiol),
17 beta-estradiol (17 β-estradiol) ทงหมดเปนผลตภณฑของ Dr. Ehrenstorfer ความบรสทธ >98% และ
internal standard diethylstilbesterol-D8 (DES-D
8) ผลตภณฑของ Cambridge Isotope Laboratories, Inc.,
ความบรสทธ >98%
สารเคม : methanol (MeOH), acetonitrile (CH3CN), hexane เปน HPLC grade, formic acid,
ammomium acetate (NH4OAc) เปน AR grade
การเตรยมสารละลายมาตรฐาน
เตรยมสารละลายมาตรฐาน stock solution ความเขมขน 1,000 ไมโครกรมตอมลลลตร
โดยชงสารมาตรฐานแตละชนดประมาณ 10 มลลกรม ละลายและปรบปรมาตรเปน 10 มลลลตรดวย MeOH
และเตรยมสารละลายมาตรฐานผสมความเขมขน 10, 1 และ 0.1 ไมโครกรมตอมลลลตรดวย MeOH
เครองมอและอปกรณ
เครองชง ความละเอยด 0.001 กรม และ 0.01 มลลกรม, refrigerated centrifuge, vortex mixer, turbo
nitrogen evaporator temperature controlled, เครองบดเนอ, micro pipette ขนาด 2-20, 10-200, 20-200
และ 100-1,000 ไมโครลตร, screw cap centrifuge tube ขนาด 50 มลลลตร, test tube ขนาด 10 มลลลตร,
micro-spin filter tube 0.45 µm PVDF, solid-phase-extraction (SPE) ชนด Oasis HLB, ปรมาตร
6 มลลลตร และม packing material บรรจอย 200 มลลกรม, solid-phase-extraction (SPE) ชนด C18,
ปรมาตร 3 มลลลตร และม packing material บรรจอย 500 มลลกรม
เครอง LC-MS/MS ประกอบดวย binary pump, auto sampler, micro vacuum degasser, thermostated
column compartment: Agilent 1100 series, detector ชนด triple quadrupole mass spectrometer:
API 4000, column: zorbax SB C-18, atlantis-d C18, mobile phase เปนสารละลายผสมของ H2O: MeOH
(3:1; v/v) และ CH3CN, ใชโปรแกรม gradient ในการแยกสาร flow rate 0.6 มลลลตรตอนาท เวลาทใชในการ
วเคราะหทงหมด 15 นาท โดยมสภาวะของ mass spectrometer ดงน
- ion spray voltage: 5200 volts
- temperature (TEM): 450 องศาเซลเซยส
- collision gas (CAD): nitrogen: 5 psig
- curtain gas (CUR): 13 psig
- ion spray nebulizer gas (GAS-1): 52 psig
- TIS heater gas (GAS-2): 58 psig
- entrance potential (EP): 10 volts
Determination of Hormone Residues in Meat by LC-MS/MS Chalearmphorn Kuanha et al.
57 วารสารกรมวทยาศาสตรการแพทยปท 60 ฉบบท 2 เมษายน - มถนายน 2561
โดยสารจะถกท�าใหเปนไอออนลบดวย electro spray ionization (ESI) ไอออนทไดจะถกวเคราะหดวย
multiple reaction monitoring (MRM) โดยศกษา mass ท m/z ดงตารางท 1
ตารางท 1 สภาวะการวเคราะหสารตกคางกลมฮอรโมน 5 ชนด โดยใชเครอง LC-MS/MS
component MW precursor ion product ion Dwell time DP CE CXP
(m/z) (m/z) (ms) (volts) (volts) (volts)
DES 268.3 267.3 92.9±0.5 150.0 secondary -100.0 -48.0 -29.0
236.8±0.5 150.0 primary -100.0 -40.0 -31.0
zeranol 322.2 321.2 277.0±0.5 150.0 secondary -95.0 -30.0 -5.0
303.0±0.5 150.0 primary -95.0 -30.0 -4.0
17 α-estradiol 272.2 271.2 144.9±0.5 150.0 secondary -123.0 -54.0 -6.0
182.9±0.5 150.0 primary -123.0 -55.0 -10.0
17 β-estradiol 272.2 271.2 144.9±0.5 150.0 secondary -123.0 -54.0 -6.0
182.9±0.5 150.0 primary -123.0 -55.0 -10.0
DES-D8 276.0 275.0 245.0±0.5 150.0 -110.7 -41.0 -14.6
ตวอยาง
ตวอยางทใชในการพฒนาและตรวจสอบความถกตองของวธใชเนอไกเปนตวแทน (representative matrix)
ตวอยางทใชในการส�ารวจปรมาณการตกคางสารกลมฮอรโมนในเนอสตว ตงแตตลาคม 2557 ถง กนยายน
2558 รวมทงสน 50 ตวอยาง ไดแก ตวอยางเนอวว 25 ตวอยาง โดยแบงเปน เนอววน�าเขาจากตางประเทศจ�านวน 11 ตวอยาง
น�าเขาจากประเทศออสเตรเลย นวซแลนด สหรฐอเมรกา เนอววภายในประเทศ 14 ตวอยาง โดยทงหมดเปนตวอยาง
ทส�านกงานคณะกรรมการอาหารและยา เกบจากตลาดในเขตกรงเทพมหานครและจากดานอาหารและยา สงวเคราะห
ทส�านกคณภาพและความปลอดภยอาหาร และตวอยางเนอไกจ�านวน 25 ตวอยาง เกบจากตลาดในเขตกรงเทพมหานคร
ครอบคลมทงหมด 11 เขต ไดแก วงทองหลาง คลองเตย สวนหลวง ลาดพราว บางเขน สายไหม บางกะป จอมทอง
คลองสาน บางขนเทยน และบางบอน
วธการ
1. การพฒนาวธวเคราะห
น�าเนอสตวบดละเอยดมาเตมน�า จากนนสกดสารกลมฮอรโมนตกคางออกจากตวอยางดวย MeOH
น�าไปก�าจดไขมนและสารรบกวนซงอยในตวอยางออกดวยเทคนค liquid-liquid extraction โดยใช hexane
ทอมตวดวย CH3CN แลวน�าสารทสกดไดไปท�าใหบรสทธดวยเทคนค solid-phase extraction (SPE) จากนน
ตรวจหาปรมาณโดยเทคนค LC-MS/MS ค�านวณปรมาณจาก calibration curve ท plot ระหวาง concentration
ratio ของสารมาตรฐาน และ internal standard กบ peak area ratio ของสารมาตรฐาน และ internal standard
ท�าการศกษาทดลองในการพฒนาวธ 2 ขนตอน คอ ไดศกษาทดลองชนดของ SPE ในการท�าใหบรสทธ
และชนดของ column ในการตรวจวดโดย HPLC มรายละเอยดดงน
การวเคราะหสารตกคางกลมฮอรโมนในเนอสตวโดย LC-MS/MS เฉลมพร ควรหา และคณะ
58วารสารกรมวทยาศาสตรการแพทยปท 60 ฉบบท 2 เมษายน - มถนายน 2561
1. ทดลองชนด SPE Oasis HLB เปรยบเทยบกบ C18 โดยชงตวอยางเนอไกทตรวจไมพบสารกลมฮอรโมน
ทบดละเอยด (matrix blank) 2 กรม ใสหลอด screw cap centrifuge tube เตมสารมาตรฐานทง 4 ชนด
ทระดบความเขมขน 10.0 ไมโครกรมตอกโลกรม เตม internal standard ทความเขมขน 6.0 ไมโครกรมตอกโลกรม
และเตมน�า 500 ไมโครลตร ปนดวย vortex mixer ครงละ 1 นาท ทกๆ 15 นาท เปนเวลา 1 ชวโมง จากนนเตม MeOH
10 มลลลตร เขยาดวยเครองเขยา นาน 10 นาท แลวน�าไปปนตกตะกอนท 6,000 รอบตอนาท อณหภม 4 องศาเซลเซยส
นาน 10 นาท ดดชน MeOH ใสในหลอด centrifuge tube ท�าการสกดซ�าดวย MeOH 5 มลลลตร น�าชน MeOH
ทไดจากการสกดทง 2 ครง เตม hexane ทอมตวดวย CH3CN 10 มลลลตร ปนดวย vortex mixer และ
น�าไปปนตกตะกอนโดยใชโปรแกรมทตงคาไวครงแรก ดดชน hexane ทอมตวดวย CH3CN ทง ดดชน MeOH
7.5 มลลลตร ใสใน test tube ระเหยจนเหลอประมาณ 500 ไมโครลตร เตมน�า 5 มลลลตร ปนดวย vortex mixer
น�าสารสกด load ผาน SPE cartridge ทงสองชนดท activated ดวย MeOH 5 มลลลตร น�า 10 มลลลตร จากนน
ลาง SPE cartridge โดยใช 20% CH3CN 2 มลลลตร และ elute ดวย CH
3CN 10 มลลลตร ระเหยแหงดวย
เครอง turbo nitrogen evaporator ละลายสวนทเหลออยดวยสารละลายผสมของ 0.1% formic acid: MeOH
(65:35, v/v) 1 มลลลตร ไดสารสกดตวอยางความเขมขน 1 กรมตอมลลลตร กรองสารละลายตวอยางผาน micro-spin
filters ชนด PVDF 0.45 µm เกบในขวดแกวสชา ขนาด 2 มลลลตร น�าไปวเคราะหชนดและปรมาณดวยเทคนค
LC-MS/MS
2. ทดลองชนด LC column zorbax SB C-18 เปรยบเทยบกบ atlantis-d C18 โดยใช mobile phase
สารละลายผสมของ H2O: MeOH (3:1; v/v) และ CH
3CN
2. การทดสอบความถกตองของวธวเคราะห (method validation)
2.1 การสรางกราฟมาตรฐาน (calibration curve)
เตรยม matrix-matched calibration curve โดยชง matrix blank จ�านวน 6 หลอด แลว
เตมสารมาตรฐาน ทระดบความเขมขน 2.0, 4.0, 6.0, 8.0, 10.0 และ 15.0 ไมโครกรมตอกโลกรม และเตม internal
standard ทระดบความเขมขน 6.0 ไมโครกรมตอกโลกรม ในทกหลอด จากนนท�าการสกดและท�าใหบรสทธ
เหมอนการสกดตวอยาง สรางกราฟมาตรฐานระหวาง (แกน x) อตราสวนความเขมขนของสารมาตรฐาน และความเขมขน
ของ internal standard (concentration ratio) กบ (แกน y) อตราสวนของ peak area ของสารมาตรฐาน
และ peak area ของ internal standard (peak area ratio) ค�านวณหาสมประสทธสหสมพนธของเพยรสน
(pearson correlation coefficient, r) สมประสทธการตดสนใจ (coefficient of determination, R2)
2.2 วเคราะห method blank และ matrix blank
method blank: สกดและวเคราะหตามวธทพฒนาโดยใชสารเคมทงหมด แตไมมตวอยางเตม internal
standard ทระดบความเขมขน 6.0 ไมโครกรมตอกโลกรม
matrix blank: สกดเนอไกและวเคราะหตามวธทพฒนา เตม internal standard ทระดบ
ความเขมขน 6.0 ไมโครกรมตอกโลกรม
ฉดสารสกด method blank และ matrix blank เขาเครอง LC-MS/MS เพอตรวจสอบดวา
ม mass หรอ peak รบกวนตรงสารมาตรฐานหรอไม
Determination of Hormone Residues in Meat by LC-MS/MS Chalearmphorn Kuanha et al.
59 วารสารกรมวทยาศาสตรการแพทยปท 60 ฉบบท 2 เมษายน - มถนายน 2561
2.3 การหาขดจ�ากดของการตรวจพบ (limit of detection, LOD) และขดจ�ากดของการวด
เชงปรมาณ (limit of quantitation, LOQ)
ทดสอบโดยเตมสารมาตรฐานทง 4 ชนด ทระดบความเขมขนใกลเคยงคาต�าสดของกราฟมาตรฐาน
และเตม internal standard ทระดบความเขมขน 6.0 ไมโครกรมตอกโลกรม ลงใน matrix blank วเคราะห 10 ซ�า
ค�านวณคาเฉลย, Standard Deviation (SD) แลวน�ามาค�านวณตามสตรดงน
LOD = 3 SD
LOQ = 10 SD
ยนยนความแมนและความเทยงของคา LOQ โดยเตมสารมาตรฐานทมความเขมขนตามทค�านวณไดจากสตร 10 ซ�า
แลวค�านวณ % recovery และ % Relative Standard Deviation (RSD)
2.4 การทดสอบความเปนเสนตรง และชวงการวเคราะห (linearity and working range)
เตมสารมาตรฐานทง 4 ชนดลงใน matrix blank ทระดบความเขมขน 2.0, 4.0, 6.0, 8.0, 10.0
และ 15.0 ไมโครกรมตอกโลกรม และเตม internal standard ทระดบความเขมขน 6.0 ไมโครกรมตอกโลกรม
วเคราะหระดบละ 3 ซ�า สรางกราฟความสมพนธระหวาง concentration ratio กบ peak area ratio ของสารมาตรฐาน
ทง 4 ชนด ค�านวณหาคาสมประสทธสหสมพนธ (r) โดยเกณฑการยอมรบของคาสมประสทธสหสมพนธส�าหรบกราฟ
มาตรฐานทจ�านวนของระดบความเขมขน 6 ระดบ ตองไมนอยกวา 0.95(15)
2.5 การทดสอบ % recovery และความเทยง (recovery and precision)
ทดสอบโดยเตมสารมาตรฐานทง 4 ชนด ทระดบความเขมขน 2.0, 6.0, 10.0 และ 15.0 ไมโครกรม
ตอกโลกรม ลงใน matrix blank และเตม internal standard ทความเขมขน 6.0 ไมโครกรมตอกโลกรม วเคราะห
ระดบละ 10 ซ�า ค�านวณปรมาณเทยบกบสารมาตรฐาน แลวค�านวณคาเฉลย % recovery และ % RSD ประเมนผล
ตามเกณฑก�าหนดดงน คา % recovery 60-120 คา % RSD ทระดบความเขมขนของสาร 1 ถง 10 ไมโครกรม
ตอกโลกรม ท 30%(14)
2.6 การประมาณคาความไมแนนอนของการวเคราะห (uncertainty)
การประมาณคาความไมแนนอนของการวด(16) โดยค�านงถงแหลงของความไมแนนอนทกแหลง
รวมคาความไมแนนอนทงหมด แลวค�านวณคาความไมแนนอนขยายทระดบความเชอมน 95% (k = 2) ในการประเมน
คาความไมแนนอนของการวเคราะหตามวธทไดทดสอบ
ปรมาณสารทพบหนวยเปนไมโครกรมตอกโลกรม (µg/kg) โดยค�านวณความเขมขนของสารท
ตรวจพบจาก calibration curve โดยใชสมการเสนตรง
ผล
การพฒนาวธวเคราะห
ผลการเปรยบเทยบขนตอนการ clean up โดยเปรยบเทยบโดยใช Oasis HLB กบ SPE-C18
โดยเปรยบเทยบ chromatogram ของสารมาตรฐานทง 4 ชนด พบวาการ clean up ของ SPE ทง 2 ชนด
ใหประสทธภาพทใกลเคยงกน ไมพบ peak รบกวนท RT ใกลเคยงกบสารมาตรฐาน แตเมอพจารณาคา % recovery
พบวา SPE-C18 ใหคาต�ากวาการ clean up ดวย Oasis HLB (ภาพท 1)
การวเคราะหสารตกคางกลมฮอรโมนในเนอสตวโดย LC-MS/MS เฉลมพร ควรหา และคณะ
60วารสารกรมวทยาศาสตรการแพทยปท 60 ฉบบท 2 เมษายน - มถนายน 2561
ภาพท 1 chromatogram เปรยบเทยบ SPE cartridge ในการท�าใหสารบรสทธระหวาง Oasis HLB กบ
SPE-C18
Oasis HLB SPE - C18
และการเปรยบเทยบ LC column ระหวาง zorbax SB C-18 และ atlantis-d C18 พบวา column
ชนด zorbax SB C-18 สามารถให sensitivity, peak shape, peak symmetry ของสารกลมฮอรโมน
ในสารละลายตวอยางไดดกวา column ชนด atlantis-d C18 (ภาพท 2)
Determination of Hormone Residues in Meat by LC-MS/MS Chalearmphorn Kuanha et al.
61 วารสารกรมวทยาศาสตรการแพทยปท 60 ฉบบท 2 เมษายน - มถนายน 2561
ภาพท 2 chromatogram เปรยบเทยบ column ระหวาง zorbax SB C-18 และ atlantis-d C18 โดยใช
mobile phase สารละลายผสมของ H2O: MeOH (3:1; v/v) และ CH
3CN
column zorbax SB C-18 column atlantis-d C18
การวเคราะหสารตกคางกลมฮอรโมนในเนอสตวโดย LC-MS/MS เฉลมพร ควรหา และคณะ
62วารสารกรมวทยาศาสตรการแพทยปท 60 ฉบบท 2 เมษายน - มถนายน 2561
ผลการทดสอบความถกตองของวธวเคราะห (method validation)
จากการศกษาการวเคราะหสารกลมฮอรโมนทง 4 ชนด ไดแก DES, zeranol, 17 α-estradiol และ
17 β-estradiol ภายใตสภาวะทเหมาะสม พบวาสามารถสรางกราฟมาตรฐานความสมพนธระหวาง concentration ratio
กบ peak area ratio ของสารมาตรฐานดงกลาวไดในชวงความเขมขน 2.0-15.0 ไมโครกรมตอกโลกรม ไดกราฟ
ทเปนเสนตรงมคา r ในชวง 0.9808-0.9879 และ R2 ในชวง 0.9620-0.9760
เมอวเคราะห method blank ของสารเคมทใชทงหมด และ matrix blank ของตวอยางเนอไก
ไมพบ peak รบกวนในชวงของการตรวจวดสารเปาหมาย
ผลการทดสอบขดจ�ากดของการตรวจพบ (LOD) เทากบ 1.0 ไมโครกรมตอกโลกรม ในทกชนดสาร
โดยใหสญญาณพคมคาสงกวา 3 เทาของ signal to noise สวนคาขดจ�ากดของการวดเชงปรมาณ (LOQ) เทากบ 2.0
ไมโครกรมตอกโลกรม ส�าหรบ DES และ zeranol และเทากบ 6.0 ไมโครกรมตอกโลกรม ส�าหรบ 17 α-estradiol
และ 17 β-estradiol ผลการพสจนคา LOQ โดยการเตมสารมาตรฐานวเคราะห 10 ซ�า ไดคา % recovery เฉลย
ในชวง 73-105%, % RSD ในชวง 5.4-26.3 (ตารางท 2)
ตารางท 2 ผลการทดสอบคา signal/noise ทระดบ LOD % recovery และความเทยงทระดบ LOQ ของ DES,
zeranol, 17 α-estradiol และ 17 β-estradiol ของเนอไก
Hormone signal/noise Spiked (LOQ level) % Recovery % RSD HORRAT
(LOD level) (µg/kg)
DES 20.54 2.0 81.8 13.4 0.9
Zeranol 35.20 2.0 104.8 5.4 0.4
17 α-estradiol 15.70 6.0 77.3 23.5 1.5
17 β-estradiol 16.20 6.0 73.2 26.3 1.7
การทดสอบคา % recovery และความเทยงของวธวเคราะหทระดบความเขมขน 2.0, 6.0 และ 10.0
ไมโครกรมตอกโลกรม ส�าหรบ DES และ zeranol ทระดบความเขมขน 6.0, 10.0 และ 15.0 ไมโครกรมตอกโลกรม
ส�าหรบ 17 α-estradiol และ 17 β-estradiol วเคราะหระดบละ 10 ซ�า พบวา % recovery เฉลยอยในชวง
61-120% และความเทยง (precision) ทประเมนดวย % RSD อยในชวง 3.4-26.3 (ตารางท 3)
จากการประมาณคาความไมแนนอนของการวเคราะหตามวธทไดทดสอบ โดยน�าการวเคราะหสาร DES
ในเนอไก พบแหลงทมาของความไมแนนอน ไดแก การชงน�าหนกของตวอยาง คา concentration ratio, Co
ทอานไดจาก calibration curve สารมาตรฐาน เครองแกววดปรมาตรทใช bias และ precision ไดคา relative
standard uncertainty, u(x)/x เมอน�าคาความไมแนนอนจากทกแหลงมารวมกนจะไดคา combined relative
standard uncertainty เทากบ ± 0.8% และน�ามาขยายใหเปน Expanded uncertainty, U ไดคาความไมแนนอน
เทากบ ± 1.6% ทระดบความเชอมน 95% เมอเปรยบเทยบสดสวนคาความไมแนนอนจากแหลงความไมแนนอน
ทสงผลตอปรมาณสารจากมากไปหานอย ไดแก ความเทยงของวธวเคราะห (method precision 60.8%), ความเบยงเบน
จากคาจรง (bias, 19.2%), สารมาตรฐาน (12.0%), calibration curve (6.4%), final volume (1.1%),
การชงน�าหนกของตวอยาง (sample weight, 0.5%) (ภาพท 3)
Determination of Hormone Residues in Meat by LC-MS/MS Chalearmphorn Kuanha et al.
63 วารสารกรมวทยาศาสตรการแพทยปท 60 ฉบบท 2 เมษายน - มถนายน 2561
ภาพท 3 สดสวนขององคประกอบแหลงความไมแนนอนของการวเคราะหสารกลมฮอรโมนในเนอไก
ตารางท 3 ผลการทดสอบ % recovery และความเทยงในการวเคราะห DES, zeranol, 17 α-estradiol และ
17 β-estradiol ของเนอไก
สารมาตรฐาน Spiked level % Recovery (n=10) Mean ± SD % RSD HORRAT
(µg/kg) Min - Max
DES 2.0 61.5 - 97.0 81.8 ± 11.0 13.4 0.9
6.0 92.3 - 101.3 98.1 ± 3.4 3.4 0.2
10.0 83.0 - 120.0 94.3 ± 11.5 12.2 0.8
zeranol 2.0 95.5 - 111.5 104.8 ± 5.7 5.4 0.4
6.0 66.5 – 101.4 94.7 ± 10.1 10.7 0.7
10.0 93.4 – 120.0 11.3 ± 10.9 9.6 0.7
17 α-estradiol 6.0 63.3 – 117.3 77.3 ± 18.2 23.6 1.5
10.0 87.3 – 119.0 105.1 ± 10.5 10.0 0.7
15.0 66.7 – 100.0 85.1 ± 12.4 14.6 0.9
17 β-estradiol 6.0 61.3 – 120.0 73.2 ± 19.3 26.3 1.7
10.0 77.3 – 120.0 103.9 ± 15.6 15.0 1.0
15.0 72.7 – 100.0 83.1 ± 7.8 9.4 0.6
ไดน�าวธการตรวจวเคราะหทไดทดสอบความถกตองของวธแลวมาตรวจวเคราะหตวอยางในการส�ารวจ
ปรมาณการปนเปอนของสารกลมฮอรโมนตวอยางเนอสตวรวม 50 ตวอยาง โดยแบงเปนเนอววน�าเขา 11 ตวอยาง
เนอววภายในประเทศ 14 ตวอยาง และเนอไก 25 ตวอยาง ตรวจไมพบสารกลมฮอรโมนทง 4 ชนด ในทกตวอยาง
การวเคราะหสารตกคางกลมฮอรโมนในเนอสตวโดย LC-MS/MS เฉลมพร ควรหา และคณะ
64วารสารกรมวทยาศาสตรการแพทยปท 60 ฉบบท 2 เมษายน - มถนายน 2561
วจารณ
วธทศกษานสามารถทดสอบสารกลมฮอรโมนไดทงหมด 4 ชนด ไดแก DES มคา molecular mass เทากบ
268.3 g.mol-1, zeranol มคา molecular mass เทากบ 322.2 g.mol-1, 17 α-estradiol และ 17 β-estradiol
มคา molecular mass เทากบ 272.2 g.mol-1 โดยใชเครอง liquid chromatograph (LC) ซงม tandem mass
spectrometer (MS/MS) เปนตวตรวจวด และมการน�าสาร DES-D8 เปน internal standard ในการตรวจวเคราะห
การใช internal standard มขอดคอเพอเปนการควบคมและลดความผดพลาดในกระบวนการทดสอบ เพมความนาเชอถอ
ของผลการทดสอบทได เนองจากการวเคราะหแบบ internal standard ตองเตมสารทเลอกใชเปน internal standard
ลงไปทงในตวอยาง และ standard ดวยความเขมขนทเทากนโดย calibration curve ทใชเปรยบเทยบสดสวน
โดย plot ระหวาง concentration ratio กบ peak area ratio ดงนน internal standard จงเปนตวเปรยบเทยบ
ชวยควบคมความผดพลาดทเกดขนจากวธวเคราะหหรอผวเคราะห การวเคราะหดวยเทคนคนจะให precision
และ accuracy ทด(17) แตทงนขนอยกบการเลอกใช internal standard โดยสารทจะใชเปน internal standard
ตองมคณสมบตคลายคลงกบสารทจะวเคราะห เนองจากสารทใชเปน internal standard สวนมากเปนสาร isotope
ซงหาไดยากและบางชนดมขนตอนในการสงซอยาก ท�าใหไมสามารถหา internal standard ไดครบทกชนดสาร
จงใช DES-D8 เปน internal standard เพยงชนดเดยวในการค�านวณปรมาณทตรวจพบกบสารกลมฮอรโมนทกสาร
ซงท�าใหคาความไมแนนอนของ method precision มคาสงคอ 60.8%
จากการตรวจวเคราะหดวยเครองมอ LC-MS/MS ซงเปนเทคนคทมความไว (sensitivity) และความจ�าเพาะ
(selectivity) ใชหลกการ mass spectrometry ตรวจวดไอออนของสารทแยกกนดวยคามวลตอประจ (mass-to-charge
ratio, m/z) ทแตกตางกน ในการวเคราะหนเลอก interface ทท�าหนาทเปนแหลงก�าเนดไอออน (ion source) ชนด
electro spray ionization (ESI) ไอออนทไดถกวเคราะหดวย selected reaction monitoring (SRM) หรอ multiple
reaction monitoring (MRM) mode ใชตรวจสอบมวลของไอออนทแตกออกมา (fragment ion, transition ion)
จากไอออนตงตน (parent ion) ตวใดตวหนง SRM หรอ MRM สามารถแยกความแตกตางของสารทมมวลเทากนได
เนองจาก fragment ion ทแตกออกมาเปนชนสวนทจ�าเพาะของไอออนแตละชนด mode นปรากฏพคเพยงแคพคเดยว
ทเกดจากมวลของ fragment ion ทเลอก จงมประโยชนมากในการวเคราะหปรมาณและใช detector ชนด tandem
mass spectrometer ตรวจวดโดยเลอก mass ถง 2 ครง ครงแรกเลอก precursor ion หรอ parent ion
จากนนเกดการ fragmentation ได product ion หรอ daughter ion เลอก product ion 2 ion ทมคา response
สงและไมมสารอนรบกวน การตรวจวเคราะหสารกลมฮอรโมนทง 4 ชนด นถก ionized ในรปของไอออนลบ [M-H]-
(negative ions)(3,4,18) โดยสาร DES เลอก m/z 267.3 เปน precursor ion และเลอก product ion ท m/z 236.8
กบ 92.9 zeranol เลอก m/z 321.0 เปน precursor ion และเลอก product ion ท m/z 303.0 กบ 277.0
ส�าหรบ 17 α-estradiol และ 17 β-estradiol เลอก m/z 271.2 เปน precursor ion และเลอก product ion
ท m/z 182.9 กบ 144.9
ในการวเคราะหยงไดก�าหนดการควบคมคณภาพเพอใหไดผลทถกตอง ไดแก การเลอก identification
point ซงเปนระบบการคดคะแนนเพอการยนยนชนดสารในการแปลผลขอมลโดยใชจ�านวน parent ion เรมตน และ
daughter ion และก�าหนดความแตกตางสงสดทยอมรบได (maximum permitted tolerance) ของ relative ion
intensities ตามท European Communities, EC ก�าหนด(19) นอกจากนคา precision ทไดมคาสมประสทธ
ความแปรปรวน (% RSD) อยในชวง 3.4-26.3 โดยมคา HORRAT นอยกวา 2 ซงเปนไปตามเกณฑของท Codex
ก�าหนดไว(20) นอกจากนยงไดมการวางแผนการควบคมคณภาพภายใน (internal quality control) เพอความมนใจ
ในผลการวเคราะหตวอยางทก batch โดยก�าหนดไวไมเกน 10 ตวอยาง โดยท�าการทดสอบ method blank, matrix
Determination of Hormone Residues in Meat by LC-MS/MS Chalearmphorn Kuanha et al.
65 วารสารกรมวทยาศาสตรการแพทยปท 60 ฉบบท 2 เมษายน - มถนายน 2561
blank, duplicate analysis และ spiked sample(14) ส�าหรบตวอยางเนอววคณะผวจยไดมการควบคมคณภาพ
ผลการตรวจวเคราะหทก batch โดยผล % recovery อยในชวง 93-120% อยางไรกตามในการทดสอบความถกตอง
ของวธวเคราะหทพฒนาขนนไมไดใชวสดอางองรบรอง (certified reference materials; CRM) ในการประกน
คณภาพของผลการทดสอบและตรวจสอบถกตองของวธทดสอบแตใชการเตม (spiking) สารมาตรฐานลงใน
matrix blank แทน
คณะผวจยเลอกสารกลมฮอรโมนทตรวจวเคราะหประกอบดวย zeranol, DES เปนฮอรโมนชนด
สงเคราะห(21) โดย zeranol เปนสารทมคาก�าหนด MRL ตามประกาศกระทรวงสาธารณสข DES เปนสารหามใชทงใน
กลมสหภาพยโรป สหรฐอเมรกา และประกาศกรมปศสตว เพราะเปนสารทอาจท�าใหเกดมะเรง ส�าหรบ 17 α-estradiol
และ 17 β-estradiol เปนฮอรโมนธรรมชาตทมในเพศหญงจดเปนฮอรโมน estrogen ซงมบทบาทส�าคญตอกลไก
การท�างานของสตรเพศ(22) ขนตอนตอไปคณะผวจยจะเพมชนดสารใหครอบคลมตามประกาศกระทรวงสาธารณสข
ซงไดแก trenbolone acetate ส�าหรบฮอรโมนชนดอนๆ ทผวจยไมไดตรวจวเคราะหคอ progesterone ซงเปน
ฮอรโมนทรางกายตองสรางขนมาเพอใชในการเจรญเตบโตตามปกต พบวาไมเกดอนตรายตอรางกายเพราะปรมาณ
ทรบประทานเขาไปจากเนอสตวถอวานอยมาก คอนอยกวารอยละ 1 ของฮอรโมนทรางกายผลตตามปกต และฮอรโมน
ทรบประทานเขาไปนนรางกายดดซมไดเพยงรอยละ 10 นอกจากนยงพบวาในอาหารบางชนดมฮอรโมนเอสโตรเจน
อยในปรมาณมากกวาเนอวว(2)
ผลจากการตรวจวเคราะหเนอวว เนอไก ทผลตในประเทศและเนอววทน�าเขาจากออสเตรเลย นวซแลนด
และสหรฐอเมรกา รวมทงสน 50 ตวอยางนน พบวาไมมการตกคางของสารกลมฮอรโมนทงสชนด แสดงไดวาผผลต
ทงจ�าหนายภายในประเทศและสงออกมความตนตวในการทจะยกระดบมาตรฐานสนคาใหเปนไปตามกฎระเบยบ
และขอก�าหนดตางๆ ทสอดคลองกบขอก�าหนดขององคการการคาโลกและองคกรโรคระบาดสตวระหวางประเทศ
(World Organization for Animal Health หรอ Office International des Epizooties, OIE) ซงถอวา
เปนมาตรฐานการผลตสนคาทางการเกษตร (Good Agriculture Practices: GAP) ดานการผลตปศสตวทส�าคญ
ซงครอบคลมมาตรฐานฟารมเลยงสตว การควบคมการใชยาในมาตรฐานฟารมปศสตว ตลอดจนมการน�าระบบคณภาพ
Hazard Analysis and Critical Control Point (HACCP), ISO 9000 มาใช(23) ดงนนจากผลการส�ารวจ
เบองตนสะทอนใหเหนวาจากขอก�าหนดและกฎเกณฑตางๆ เหลาน สามารถสรางความมนใจในคณภาพของเนอสตววา
มความปลอดภยทจะน�ามาบรโภคได
สรป
วธวเคราะหทพฒนาขนสามารถใชในการตรวจสารกลมฮอรโมน ทง 4 ชนด ไดแก DES, zeranol,
17 α-estradiol, 17 β-estradiol สกดดวย MeOH ปรมาตรทงสน 15 มลลลตร น�าสารทสกดไดไปท�าใหบรสทธ
ดวย Oasis HLB cartridge จากนนน�าสารละลายทไดฉดเขาสระบบเครอง LC-MS/MS ซงใช column ชนด
zorbax SB C-18 และใชสารละลายผสมของ H2O: MeOH (3:1; v/v) กบ CH
3CN เปน mobile phase
ผลการทดสอบความใชไดของวธดงกลาว พบวา calibration curve มความเปนเสนตรงในชวง 2.0 -10.0 ไมโครกรม
ตอกโลกรม และ 6.0 -15.0 ไมโครกรมตอกโลกรม โดยมคา coefficient of determination ของทงสองชวงมากกวา
0.96 คาเฉลย % recovery อยในชวง 73-105% คาสมประสทธความแปรปรวนอยในชวง 5.4-26.3 มคา LOD
ของทกสารเทากบ 0.1 ไมโครกรมตอกโลกรม โดยคา LOQ ของ DES กบ zeranol เทากบ 2.0 ไมโครกรมตอกโลกรม
และคา LOQ ของ 17 α-estradiol กบ 17 β-estradiol เทากบ 6.0 ไมโครกรมตอกโลกรม จากขอมลขางตน
แสดงใหเหนวาวธวเคราะหทพฒนาขนน มคณลกษณะเฉพาะแสดงสมรรถนะทผานเกณฑการยอมรบและเหมาะสม
การวเคราะหสารตกคางกลมฮอรโมนในเนอสตวโดย LC-MS/MS เฉลมพร ควรหา และคณะ
66วารสารกรมวทยาศาสตรการแพทยปท 60 ฉบบท 2 เมษายน - มถนายน 2561
มความถกตอง แมนย�า มความไวและความจ�าเพาะตอสารทตองการทดสอบ เหมาะกบการใชงาน (fitness for
intended use) และใหผลทกพารามเตอรผานเกณฑยอมรบของสากล ท�าใหผลการทดสอบถกตอง เชอถอได
จากการพสจนความถกตองของวธทดสอบ (method validation) โดยใชเนอไกเปนตวแทน สามารถน�าวธนไปใชใน
การตรวจวเคราะหเพอเปนการควบคมคณภาพอาหารตามกฎหมาย เพอความยตธรรมทงแกผประกอบการและคมครอง
ผบรโภคตอไปได
กตตกรรมประกาศ
ขอขอบคณเจาหนาทฝายสารก�าจดศตรพชและยาสตวตกคางทกทานทชวยเตรยมและสกดตวอยาง ใหค�าแนะน�า
ขอเสนอแนะ ตลอดจนสนบสนนการศกษาวจยจนบรรลผลส�าเรจในครงน
เอกสารอางอง
1. Matic I, Grujic S, Jaukovic Z, Lausevic M. Trace analysis of selected hormones and sterols in river
sediments by liquid chromatography-atmospheric pressure chemical ionization-tandem masss
spectrometry. J Chromatogr A 2014; 1364: 117-27.
2. มหาวทยาลยราชภฏนครสวรรค. บทท 12 : การปนเปอนและการเสอมเสยของเนอสตวและผลตภณฑ. [ออนไลน]. [สบคน
18 ก.พ. 2561]; [6 หนา]. เขาถงไดท : URL: http://elearning.nsru.ac.th/web_elearning/meattech/lesson/
less12_7.html.
3. Shao B, Zhao R, Meng J, Xue Y, Wu G, Hu J, et al. Simultaneous determination of residue hormoneal
chemicals in meat, kidney, liver tissues and milk by liquid chromatography-tandem mass spectrometry.
Anal Chim Acta 2005; 548: 41-50.
4. Blasco C, Van Poucke C, Van Peteghem C. Analysis of meat samples for anabolic steroids residues
by liquid chromatography/tandem mass spectrometry. J Chromatogr A 2007; 1154: 230-9.
5. Schúz J, Espina C, Villan P, Herrero R, Leon ME, Minozzi S, et al. European code against cancer
4th edition: 12 ways to reduce your cancer risk. Cancer Epidemiol 2015; 39(Suppl 1): S1-10.
6. Council Directive 96/22/EC of 29 April 1996. Concerning the prohibition on the use in stockfarming
of certain substances having a hormonal or thyrostatic action and of beta-agonists, and repealing
Directs 81/602/EEC, 88/146/EEC and 88/299/EEC. Official Journal of the European Communities,
No L 125.
7. พระราชบญญตอาหาร พ.ศ. 2552 ประกาศกระทรวงสาธารณสข ฉบบท 303 (พ.ศ. 2550) เรอง อาหารทมยาสตวตกคาง.
ราชกจจานเบกษา เลม 124 ตอนพเศษ 108ง (ลงวนท 4 กนยายน 2550).
8. ประกาศกรมปศสตว เรอง ก�าหนดมาตรฐานสารตกคางส�าหรบสนคาปศสตว. (ลงวนท 12 กรกฎาคม 2549). [ออนไลน].
[สบคน 18 ก.พ. 2561]; [10 หนา]. เขาถงไดท : URL: http://readgur.com/download/2099998.
9. Korea's veterinary drug MRL situation. [Online]. 2011; [cited 2018 Feb 18]; [29 screens]. Available
from: URL: https://gain.fas.usda.gov/Recent%20GAIN%20Publications/Korea's%20Veterinary%
20Drug%20MRL%20Situation_Seoul_Korea%20-%20Republic%20of_11-16-2011.pdf.
10. Anfossi L, Tozzi C, Giovannoli C, Baggiani C, Giraudi G. Development of a non-competitive
immunoassay for cortisol and its application to the analysis of saliva. Anal Chim Acta 2002; 468: 315-21.
Determination of Hormone Residues in Meat by LC-MS/MS Chalearmphorn Kuanha et al.
67 วารสารกรมวทยาศาสตรการแพทยปท 60 ฉบบท 2 เมษายน - มถนายน 2561
11. Regal P, Vazquez BI, Franco CM, Cepeda A, Fente C. Quantitative LC-MS/MS method for the
sensitive and simultaneous determination of natural hormones in bovine serum. J Chromatogr B
2009; 877: 2457-64.
12. Yang Y, Shao B, Zhang J, Wu Y, Duan H. Determination of the residues of 50 anabolic hormones
in muscle, milk and liver by very-high-pressure liquid chromatography-electronspray ionization
tandem mass spectrometry. J Chromatogr B 2009; 877: 489-96.
13. Yoshioka N, Akiyama Y, Takeda N. Determination of α-and β-trenbolone in bovine muscle and liver
by liquid chromatography with fluorescence detection. J Chromatogr B 2000; 739: 363-7.
14. The fitness for purpose of analytical method: A laboratory guide to method validation and related
topics. 2nd ed. United Kingdom: Eurachem Guide; 2014. p. 5-24.
15. สจตตรา พงศววฒน. คมอการพสจนความใชไดของวธทดสอบ ตามแนวมตคณะกรรมาธการยโรป 2002/657/EC
ส�าหรบหองปฏบตการทดสอบดานสารตกคางยาสตว วธยนยนผลและวธคดกรอง. ปทมธาน : ส�านกตรวจสอบคณภาพ
สนคาปศสตว กรมปศสตว; 2555.
16. EURACHEM/CITAC Guide. Quantifying uncertainty in analytical measurement. 3rd ed. United
Kingdom: Eurachem; 2012.
17. Niessen WM, Manini P, Andreoli R. Matrix effects in quantitative pesticide analysis using liquid
chromatography-mass spectrometry. Mass Spectrom Rev 2006; 25: 881-99.
18. Balizs G, Hewitt A. Determination of veterinary drug residue by liquid chromatography and tandem
mass spectrometry. Anal Chim Acta 2003; 492: 105-31.
19. Commission Decision of 12 August 2002. Implementing council directive 96/23/EC concerning
the performance of analytical methods and the interpretation of results. Official Journal of the
European Communities, No L221/8.
20. กรมวทยาศาสตรการแพทย กระทรวงสาธารณสข. แนวปฏบตการทดสอบความถกตองของวธวเคราะหทางเคม
โดยหองปฏบตการเดยว. นนทบร : กรมวทยาศาสตรการแพทย กระทรวงสาธารณสข; 2549.
21. Noppe H, Le Bizec B, Verheyden K, De Brabander HF. Novel analytical methods for the determination
of steroid hormones in edible matrices. Anal Chem Acta 2008; 611: 1-16.
22. ฮอรโมนอสโทรเจน (estrogen hormone). [ออนไลน]. [สบคน 18 ก.พ. 2561]; [3 หนา]. เขาถงไดท : URL:
http://www.il.mahidol.ac.th/e-media/hormone/chapter5/estrogen_hormone.htm
23. มาตรฐานบางประการส�าหรบการเลยงสตวในประเทศไทย. [ออนไลน]. 2557; [สบคน 18 ก.พ. 2561]; [2 หนา].
เขาถงไดท : URL: http://www.animals-farm.com/มาตรฐานบางประการส�าหรบ.
การวเคราะหสารตกคางกลมฮอรโมนในเนอสตวโดย LC-MS/MS เฉลมพร ควรหา และคณะ
68วารสารกรมวทยาศาสตรการแพทยปท 60 ฉบบท 2 เมษายน - มถนายน 2561
Abstract Hormones, both natural and synthetic, play an important role in controlling growth, sex, physical characteristics and stimulating or inhibiting an immune system as well as controlling formation and decomposition of metabolisms of the body. Incorrect usage of hormones for purposes of growth promoting agents and increasing muscles in food-producing animals may result in having hormone residues in edible tissues. The residues can possibly induce breast cancer and uterine cancer, therefore, those compounds are prohibited to use in the European Union (EU) to protect consumers from the exposure to carcinogenic residues in animal products. In this study, a method for determination of 4 hormone substances, namely, Diethylstilbesterol (DES), zeranol, 17 α-estradiol and 17 β-estradiol by LC-MS/MS techniques was developed and validated. The compounds were extracted from meat samples with methanol and fat was further removed by liquid-liquid extraction technique with hexane and then cleaned up by solid phase extraction with Oasis HLB. As a result of method validation, limit of detection (LOD) was 0.1 µg/kg for all substances. In addition, our study demonstrated that limits of quantitation (LOQ) for DES and zeranol were 2.0 µg/kg, while those for 17 α-estradiol, 17 β-estradiol were 6.0 µg/kg. A linearity of working range of DES and zeranol was between 2.0-10.0 µg/kg, while that of 17 α-estradiol and 17 β-estradiol was between 6.0-15.0 µg/kg with coefficient of determination, R2, at more than 0.96. An accuracy of the method expressed as mean of % recovery was in a range of 73-105% and its precision as shown by % Relative Standard Deviation (RSD) was 5.4-26.3%. The study concluded that characteristics of this method were suitable for application testing laboratory as required by the notification of The Ministry of Public Health Regulation No. 303 (B.E. 2550) on Establishment of Maximum Residue Levels of Veterinary Medical Products in Foodstuffs of Animal Origin. Moreover, a survey of hormone residues, conducted from October 2014 to September 2015, in 50 samples of chicken and beef using the developed method indicated that no four hormone residues were detected in any samples.
Keywords: Hormone residues, meat, LC-MS/MS
Method Development and Validation
of Hormone Residues Determination
in Meat by LC-MS/MS
Chalearmphorn Kuanha Thongsuk Payanan and Ladda KaewklapanyacharoenBureau of Quality and Safety of Food Department of Medical Sciences Tiwanond Road. Nonthaburi 11000
Thailand.
top related