analysering av hba1c med kromatografisk metode · 2015. 9. 25. · 4 7 prinsipp – kromatografi...
Post on 15-Dec-2020
9 Views
Preview:
TRANSCRIPT
1
Analysering av HbA1c med kromatografisk metodeBFI 03. februar 2015 v/ Gro Nielsen (AHUS)
2
Hva er HbA1c?
• Normalt hemoglobin består av 2 alfakjeder og 2 bettakjeder
• Glykosylert hemoglobin (HbA1c) er et glykoprotein dannet ved en irreversibel reaksjon mellom glukose og betakjeden i hemoglobinet.
• Verdien reflekterer det gjennomsnittlige blodglukosenivået de siste 6-10 ukene før prøvetaking.
• HbA1c avhenger av normal levetid for erytrocyttene. Nedsatt levetid gir falsk for lave resultater.
2
3
Changes in globin expression during embryonic, fetal and adult life
0 -6 months Birth 6 months
α-chain
γ-chain β-chain
δ-chain
22 HbA122 HbA222 HbF
4
HbA1c – diagnostisk test
Kriterier:
• HbA1c > 6,5 %
• Fastende glukose >7,0 mmol/L (hvis ikke HbA1c kan benyttes)
• 2 timers venøs glukose etter 75 g oral glukose >11,1 mmol/L.
3
5
Instrument - TOSOH G8
6
HbA1c på AHUS
• Antall prøver pr. døgn: ca 250 (PHT + interne).
• Analysetid: 1,6 min. pr prøve.Analysering fra kl 08:00 til ca 16:00
• Prøvemateriale: 1 mL EDTA-blod (primærrør)70µL EDTA-blod i analysekopp
• Holdbarhet: 7 dager (2-8 °C)5 dager (romtemp.)
• Referanseområde: 4,0 – 6,0 % (oppgitt av leverandør, verifisert)
4
7
Prinsipp – Kromatografi (HPLC)
HPLC (high performance liquid chromatography)
• Høyt trykks væskekromatografi med ionebytting.
• Stasjonær fase – kolonne ”pakket” med kationer.
• Mobil fase - 3 elueringsbuffere, med ulik pH og ionestyrke.
• Gode separasjonsegenskaper oppnås med kolonne pakket med svært små partikler og en høytrykkspumpe som pumper den mobile fasen gjennom systemet.
8
Analysering av prøver
Prøvemengde4µL blod fortynnes automatisk med hemolyse/ vaskeløsning (1:200) og hemolysatet sendes inn i kolonnen (via forfilteret).
Mobil faseElueringsbufferne sendes deretter inn i kolonnen, en etter en, slik at de ulikehemoglobinfraksjonene separeres.
5
9
Normalt HbA1c- kromatogram
økende bindingsstyrke
10
Når byttes kolonnene?
Kolonnene lever ikke evig og må byttes ved behov:
• For høyt kolonnetrykk
• QC problemer
• For lav teoretisk plateverdi (TP-verdi<250), dvs butte topper.
6
11
Rutiner ved kolonnebytter
• Kalibrerer ny kolonne
• Analyserer kvalitetskontroll
• Analyserer minst 10 pasientprøver med gammel og ny kolonne(korrelasjon). Passing & Bablok regresjon.
• Evt reanalyse av nedfrosset materiale fra tidligere ekstern kvalitetsvurdering eller andre nedfrosne ”arkivprøver”
12
Analysekvalitet - presisjon
• CVa (langtidsCV):
HbA1c nivå ca 6 %: CVa= 0,7 %. Kontrollmateriale, EDTA-blod
HbA1c nivå ca 9 %: CVa= 1,0 %. Kommersiell kontroll, liquid.
Kontrollmaterialene er uavhengige, dvs ikke fra instrumentleverandør.
• Tillatt total feil: TEa = 3 - 4 %
7
13
Analysekvalitet - riktighet
Ekstern kvalitetsvurdering (Noklus)
• Små avvik med ny kalibrator. Bias ca +2 %.Ingen faktorisering på AHUS.
• Biaskrav +/- 2,3 % ved kolonnebytter.
• Små kolonnelot-variasjoner.
14
Ekstern kvalitetsvurdering
Eget resultat:5,85% Avvik fra tillagt verdi: +2,5 %.
Akseptgrense: +/- 7%.
%
antall
Eget resultat
Noklus, 4-2014
8
15
Atypiske kromatogram
• Gammel prøve
Ny prøve ønskes
16
Hemoglobinopatier
• SyntesesviktThalassemier (β og α)
• Mutasjoner i kjedeneUlike varianter (D, S, C og E)
9
17
β - globinkjede
β-thalassemi
α - globinkjede
α-thalassemiNormal Hb-variant
Thalassemi vs hemoglobinvariant
18
Forekomst av hemoglobinopatier(Etnisk norske har ingen)
HbC
HbS
HbD
Talassemier
HbE
10
19
Hemoglobinopatier- varianter
Sannsynlig D-variant
Svar kan gis ut med tillegg:
Funn av variant
20
Hemoglobinopatier- varianter
Sannsynlig S- variant
Svar kan gis ut med tillegg:
Funn av variant
11
21
Hemoglobinopatier- varianter
Sannsynlig E- variant
Tillegg til svaret:
Utført på alternativ metode.Funn av variant.
22
Hemoglobinopatier- føtalt hemoglobin (↑)
Økt mengde HbF (lite barn)
Svar kan gis ut.
HbF=<15 %
12
23
Hemoglobinopatier- Thalassemi
β- Thalassemi minor:
Svar kan ikke rapporteres
Diabetes. Nedsatt levetid på RBC?
Hb,MCV, MCH, RDW ??
24
Hb-typing. Normalt kromatogram
HbFHbA2
HbA0
13
25
Oppsummering:
Brukervennlig instrument. Stabilt Ujevn levetid på kolonnene
Lite vedlikehold Positiv bias over tid (jmfr ERL).Noe mindre med ny kalibrator.
God presisjon. Liten lot til lot variasjon på kolonnene
Mindre kapasitet enn immunologiske metoder (?)
”Ser” hva vi analyserer.Usikkert resultat?
En del kommunikasjonsproblemer mellom TOSOH G8 og LIS
Oppdager hemoglobinopatier.Videre analyse, med kolonne for dette, gjøres ved behov.
top related