enzyme and cofactor(complete) - kasetsart university · 2007-07-24 · 2 enzyme definition:...
Post on 23-Jan-2020
3 Views
Preview:
TRANSCRIPT
1
Enzyme and cofactor
ดร.พริมา พิริยางกูรhttp://cyberlab.lh1.ku.ac.th/
Enzyme and cofactor
วัตถุประสงค เพื่อทราบถึงคุณสมบัติและการทํางานของ
เอนไซม ตลอดจนรายละเอียดที่เกี่ยวของและจลนศาสตรของเอนไซม
Enzyme and cofactor1. ชีวเคมี. โดยคณาจารยภาควิชาชีวเคมี คณะวิทยาศาสตร
มหาวิทยาลัยมหิดล 25422. ชีวเคมี . โดยดาวัลย ฉิมภู สํานักพิมพแหงจุฬาลงกรณ
มหาวิทยาลัย 25483. E-Biochem. โดยอุษณีย วินิจเขตคํานวณ คณะแพทยศาสตร
มหาวิทยาลัยเชียงใหม 25484. Biochemistry (2ndedition). Mathews and van Holde.
1996
Enzyme and cofactor(4 ช่ัวโมง)
1. บทนําและคุณสมบัติ2. การเรียกช่ือและการแบงกลุมของเอนไซม3. หลักการทํางานของเอนไซม4. ปจจัยท่ีมีผลตอการทํางานของเอนไซม5. จลนศาสตรของเอนไซม
Enzyme and cofactor(ตอ)
6. การยับย้ังเอนไซม7. เอนไซมแอลโลสเตอริคและไอโซไซม8. โคแฟคเตอรและโคเอนไซม9. ประโยชนของเอนไซม
ตัวเรงปฏิกิริยา (Catalyst)
สารที่ เพิ่มอัตราหรือความเ ร็วของป ฏิ กิ ริ ย า ท า ง เ ค มี โ ด ย ที่ ตั ว เ อ ง ไ มเปลี่ยนแปลงเมื่อปฏิกิริยาสิ้นสุด
2
EnzymeDefinition:
ตัวเรงปฏิกิริยาจําเพาะซ่ึงจําเปนในการควบคุมปฏิกิริยาทางชีวเคมีที่สําคัญใหมีอัตราเร็วที่เหมาะสมภายใตสภาวะแวดลอมทางสรีระของสิ่งมีชีวิต โดยที่ตัวเองไปเปลี่ยนแปลง
Biological Catalyst/Biocatalyst
Thermodynamics
G = H – T S
G = Gibbs free energy changeH = Enthalpy (พลังงานภายใน)S = Entropy (ความไรระเบียบ)T = Absolute temperature
Thermodynamics
A B
G = GB – GA
G : ผลตางพลังงานอิสระกิบสG : พลังงานอิสระ
Thermodynamics
G
- 0 +
=
Spontaneous Rx ChemicalEquilibrium
+ Energy
A B
ThermodynamicsG° : ผลตางของพลังงานอิสระมาตราฐาน( G ของปฏิกิริยาในสภาพมาตรฐาน)
Standard state:ปฏิกิริยาที่ 25°C ความดัน 1 บรรยากาศและ
ความเขมขนของตัวทําปฏิกิริยาอยางละ 1 M
ThermodynamicsG = G° + RT ln[B]/[A]
At equilibrium ( G = 0)0 = G° + RT ln[B]eq/[A]eqG° = - RT ln[B]eq/[A]eq
= - RT lnKeq
Keq = Equilibrium Constant
3
Transition state
www.uic.edu/
EA = Activation Energy, ∆G = ผลตางของพลังงานอิสระมาตราฐาน
Transition state
www.pickens.k12.sc.us
Transition state
reactants
products
energy
Intermediate – formed between
enzyme and reactant
molecules
Uncatalysedreaction
Enzyme-catalysed reaction
Reaction profiles: uncatalysed and enzyme-catalysed
Course of reaction
exergonicreaction
www.chemsoc.org
การทํางานของเอนไซม• เรงปฏิกิริยาไดเสร็จสิ้นโดยที่ตัวเองไมเปลี่ยนแปลง• เอนไซมเขารวมในปฏิกิริยาโดยตรง เกิด ES complex(Transition state)
• ณ บริเวณเรงจะเกิดการเรงปฏิกิริยาดวยกลไกตาง ๆ ตามชนิดของเอนไซม (เรงการสรางหรือทําลายพันธะโควาเลนต รวมทั้งเพิ่มความใกลชิดและความเขมขนของสารที่ทําปฏิกิริยา ทําใหปฏิกิริยาเกิดไดงายขึ้น)
หลักการทํางานของเอนไซม
• Induced fit hypothesis (Koshland, 1958)
• Lock and key hypothesis (Fischer, 1894)
www.steve.gb.com
Induced fit hypothesis
www.pickens.k12.sc.us/
4
คุณสมบัติเอนไซม1. โปรตีนกอนกลม
(globular protein)
2. เปนตัวเรงทางชีวภาพ (Biocatalyst)3. ความจําเพาะเจาะจง (Specificity)
คุณสมบัตเิอนไซม1. โปรตีนกอนกลม (globular protein)
Active form
Inactive form
pH, T
pH, T
Active form
http://www.geocities.com/
Ribozymeribonucleic acid enzyme/RNA enzyme
เรงการตัดแตง (cleavage) ตัวเอง หรือตัดแตง RNA
ชนิดอื่น ๆ
เรงปฏิกิริยาการโยกยายหมูอะมิโน
(aminotransferase) ของไรโบโซม (ribosome)
มีมี enzyme enzyme อ่ืนอีกไหมที่อ่ืนอีกไหมที่ไมไดเปนไมไดเปน Protein Protein enzyme enzyme ????????
คุณสมบัตเิอนไซม2. เปนตวัเรงทางชีวภาพ (Biocatalyst)
Activation state/ Transition state
Activation state/ Transition state
http://en.wikipedia.org/
5
คุณสมบัตเิอนไซม3. ความจําเพาะเจาะจง (Specificity)
–ซับสเตรท (Substrate)
Lactate Pyruvate–Reaction
–Stereochemical (D-/L-form)
Lactate dehydrogenase
Active site
www.phschool.com
การตั้งชื่อของเอนไซม1. ช่ือแบบทั่วไป (Common name)
ปฏิกิริยาที่เรงและลงทายดวย -ase
2. ช่ือตามระบบ EC (Enzyme commission)
ตัวแรกบอก class name (ชนิดของปฏิกิริยา)ตัวสองบอก subclass (รายละเอียดของปฏิกิริยา)ตัวสามบอก functional grตัวสี่บอกลําดับของเอนไซม
International ClassificationAccording to International Enzyme
Commission (EC)EC 1: Oxidoreductases
EC 2: TransferasesEC 3: Hydrolases
EC 4: Lyases or synthase
EC 5: IsomerasesEC 6: Ligases or synthetases
http://dbs.umt.edu
1. Oxidoreductases (oxidation-reduction Rx)
2. Transferases (transfer of a group from onemolecule to another)
Oxidized form Reduced form
6
3. Hydrolases (cleavage of a bond by water)
4. Lyases (addition/removal of a double bond)
5. Isomerases (intramolecular rearrangement)
6. Ligases (joining of substrates using ATP)
ตัวอยางการตั้งชื่อของเอนไซมATP + creatin
ADP + phosphocreatine
Common name : kinaseตามระบบ EC : E.C. 2.7.3.2(2: transferase, 7: phosphoryl, nitrogenous gr, creatinkinase)
enzyme
ปจจัยที่มีผลตอการทํางานของเอนไซม1. อุณหภูมิ (Temperature)
2. pH
3. ความเขมขนของซับสเตรท
(Concentration of substrate)
4. ความเขมขนของเอนไซม (Concentration of enzyme)
ปจจัยที่มีผลตอการทํางานของเอนไซม1. อุณหภูมิ
http://www.chemsoc.org
7
1. อุณหภูมิ
www.uic.edu
ปจจัยที่มีผลตอการทํางานของเอนไซม2. pH
http://www.chemsoc.org
5-9
pH เพิ่มขึน้- COOH กลายเปน - COO-
pH ลดลง- NH2 กลายเปน - NH3
+
2. pH
www.uic.edu
ปจจัยที่มีผลตอการทํางานของเอนไซม3. Concentration of substrate
www.steve.gb.com
V 0
(Vmax)
Km = Vmax/2
Vmax =ความเขมขน (อิ่มตัว) ของ substrate ท่ีทําใหมีอัตราเร็วสูงสุด
ปจจัยที่มีผลตอการทํางานของเอนไซม4. Concentration of enzyme
(ที่ความเขมขนอ่ิมตัวของ substrate)
http://www.chemsoc.org
V0 α [E]
Enzyme Activity : Unit (U)คือ ปริมาณ (µmole or µg) ของสับสเตรทที่
เปล่ียนแปลงโดยปฏิกิริยาเฉพาะของเอ็นไซมจํานวนหนึ่งภายในหนึ่งหนวยเวลา (min or sec)
Ex: 1 U = 1 µg substrate/min
Enzyme Activity Unit
8
Enzyme Activity Unit• 1 หนวยสากล (International unit, I.U.)
ปริมาณเอนไซมท่ีสามารถเปลี่ยนใหซับสเตรท 1 µmole ไปเปนผลิตผลในเวลา 1 นาที ท่ี 25°C
• 1 หนวยคาทาล (katal)ปริมาณเอนไซมท่ีสามารถเรงใหซับสเตรท 1 mole
เปล่ียนเปนผลิตผล 1 mole ในเวลา 1 วินาที
Enzyme Specific Activity
จํานวนหนวยการทํางานของเอนไซม (enzyme activity unit) ตอมิลลิกรัมโปรตีน
บงบอกความบริสุทธิ์ของเอนไซมปริมาณโปรตีนนอย activity สูง แสดงวา enzyme น้ีมีความบริสุทธิ์มาก
Turn Over Number, kcat
จํ า น วน โ ม เ ล กุ ล ข อ ง สั บ ส เ ต รทที่ ถู กเปลี่ยนเปนผลิตผลโดยเอนไซม 1 โมเลกุลในเวลา 1 นาที
บงบอกประสิทธิภาพของเอนไซม
จลนศาสตรของเอนไซม (Enzyme Kinetics)การศึกษาอัตราเร็วของปฏิกิริยาและการ
เปลี่ยนแปลงอัตราเร็วของปฏิกิริยาเมื่อมีปจจัยบางอยางเปลี่ยนแปลงไป
ชวยใหเขาใจกลไกการทํางานของเอนไซมนั้นไดดีย่ิงข้ึน
จลนศาสตรของเอนไซม
www.steve.gb.com
จลนศาสตรของเอนไซมReaction Velocity = จํานวนของผลิตผลตอเวลา
Initial Velocity (V0)
http://dbs.umt.edu
The initial velocity can measured from the slope at the beginning of a reaction progress curve.
9
จลนศาสตรของเอนไซม
www.steve.gb.com
Hyperbolar curveFirst-order kinetics = rate depend on conc. of one substrate.Zero-order kinetics = rate does not depend on conc. of substrate.
Michaelis-Menten equation
V0 = initial velocityVmax = maximum velocity[S] = concentration of substrateKM = Vmax/2
= Michaelis-Menten constant
0
http://dbs.umt.edu
Michaelis-Menten equation
www.steve.gb.com
Lineweaver-Burkจากสมการ Michaelis-Menten:
กลับเศษเปนสวน
0
0
Lineweaver-Burk
www.steve.gb.com
Y = aX + b
EadieEadie--HofsteeHofstee• จากสมการ Michaelis-Menten:
• กลับเศษเปนสวน:
• คูณดวย Vmax
0
0
10
Eadie-Hofstee
• คูณดวย V0
• จัดเรียงสมการ
Eadie-Hofstee
www.science.siu.edu
Kinetic parameters:• Km (a constant):
[S] at ½Vmax (mol L−1)
Km ต่ํา เอนไซมจับกับ substrate ไดดี
• Vmax (not a constant): depend on mass of enzyme
(mol L−1 s−1 or mol s−1)
Km : Hexokinase- Glucose 0.5 mM
- Fructose 3 mM
Which one is better???
Kinetic parameters:
Kinetic parameters:• The specific activity:
จํานวนหนวยการทํางานของเอนไซมตอมิลลิกรัมโปรตีนspecific activity บริสุทธิ์สูง
• The turnover number (kcat):จํานวนโมเลกุลของซับสเตรทที่ถูกเปล่ียนเปนผลิตผลโดย
เอนไซม 1 โมเลกุลภายในเวลา 1 นาที kcat สูง เอนไซมมีประสิทธิภาพดี
Kinetic parameters
A good enzyme,
Km low
Vmax
turnover numberhigh
11
การยับย้ังเอนไซม (Enzyme Inhibition)
การยับยั้งเอนไซม การลดความสามารถหรือลดการทํางานของเอนไซม
โดยใชสารยับยั้งสารยับยั้ง (Inhibitor)
สารที่ทําใหเอนไซมเปลี่ยนโครงรูปหรือทําใหบริเวณเรงเกิดความผิดปกติ
การยับยั้งเอนไซมมี 2 แบบ1. การยับย้ังแบบทวนกลับได
(Reversible inhibition)
2. การยับย้ังแบบถาวร (Irreversible inhibition)
1. การยับย้ังเอนไซมแบบทวนกลับได
1.1 การยับยั้งแบบแขงขัน (Competitive inhibition)
1.2 การยับยั้งแบบไมแขงขัน (non-competitive inhibition)
http://people.uis.edu/
1. การยับย้ังเอนไซมแบบทวนกลับได 1.1 การยับย้ังแบบแขงขัน
www.biochem.arizona.edu
1.1 การยับยั้งแบบแขงขัน• substrate analogues• จับแบบสามารถผันกลับไดท่ี active site• Km เพิ่ม• เชน Krebs cycle: malonate inhibits
succinate dehydrogenase
Succinic acid Malonic acid.
1.1 การยับยั้งแบบแขงขัน
www.biochem.arizona.edu
12
1.2 การยับยั้งแบบไมแขงขัน (non-competitive inhibition)
• ตัวยับยั้งชนิดนี้ไมมีลักษณะเหมือนซับสเตรท • เขาไปจับที่บริเวณอื่นบนโมเลกุลของเอนไซมที่ไมใชบริเวณเรงแต
ทําใหบริเวณเรงเปลี่ยนไปจึงทํางานไดนอยลง (EI, ESI)• แมเพ่ิมปริมาณซับสเตรทก็ยังคงมีการยับยั้งอยู • คา Vmax เปลี่ยนแปลงแต Km คงที่
non-competitive inhibition
www.biochem.arizona.edu
2. การยับย้ังแบบถาวร (Irreversible inhibition)
• ตัวยับยั้งจะจับกับเอนไซมที ่active site ดวยพันธะโควาเลนต • เชน ยาฆาแมลง (Parathion) ยับยั้ง Acetylcholinesterase
Cyanide (CN-) จับเอนไซมที่ไออนโลหะ (Fe, Zn, Cu)
Penicillin ยับยั้งเอนไซมที่ใชในการสังเคราะหผนังเซลลของแบคทีเรีย
2. การยับยั้งแบบถาวร (Irreversible inhibition)
ไดไอโซโพรพิลฟอสโฟฟลูออริเดต ยับย้ังเอนไซมที่มีเซรีนเปนหนวยจําเปนตอการทํางาน เชน ไคโมทริปซิน (Chymotrypsin) ทริปซิน (Trypsin) เอสเทอเรส (Esterase)
Enz-CH2OH + Enz-CH2O + HF
Diisopropylphosphofluoridate
(DIPF)
เอนไซมแอลโลสเตอริค (Allosteric enzyme)
• ประกอบดวยหลายหนวยยอย (≥ 2 subunits)
• มี catalytic site สําหรับจับกับ substrate• มี regulatory site สําหรับจับกับตัวแปลง (modifiers/effecters) เชน inhibitor activator
เอนไซมแอลโลสเตอริค (Allosteric enzyme)
• Cooperativity• โครงสรางจตุรภูมิจะอยูในสภาพสมดุลระหวางโครงสรางที่ตึงเครียด
(tense, T) และสภาพที่ผอนคลาย (relax,R) โดย R จะมี affinity ตอซับสเตรทสูงกวา T
• Sigmoid Curve ไมใช hyperbolar
เปนเอนไซมท่ีสําคญัในการควบคุมเมแทบอลิซึม (Regulatory enzyme)
13
Cooperativity
www.steve.gb.com
Cooperativity
www.steve.gb.com
เอนไซมแอลโลสเตอริค (Allosteric enzyme)
www.steve.gb.comSigmoid Curve
phosphofructokinase (PFK)
citrate
AMP
ไอโซไซม (Isozyme)
เอนไซมท่ีทําหนาท่ีเรงปฏิกิริยาเดียวกันแตมีโครงสรางตางกัน และสามารถแยกออกจากกันไดโดยวิ ธี อิ เ ล็กโทรโฟรีซีส (Electrophoresis)
เชน LDH (Lactate dehydrogenase)
LDH มี 4 subunits
5 isoform (H4, H3M, H2M2, HM3, M4)H4 หัวใจ เปล่ียน lactate เปน pyruvate ในเนื้อเยื่อท่ีมี O2
M4 กลามเนื้อ เปล่ียน pyruvate เปน lactate ในเนื้อเยื่อท่ีขาด O2
ไอโซไซม (Isozyme) เอนไซมHoloenzyme =
Apoenzyme + Cofactor
โคแฟคเตอร (Cofactor)เปนสารโมเลกุลขนาดเล็กมีสวนรวมในการทําปฏิกิริยาชวยการทํางานของเอนไซมในการเรงปฏิกิริยา ทางเคมี
14
โคแฟคเตอร (Cofactor):1. ไอออนโลหะ (Metal ions)
ไมถูกเปลี่ยนแปลงไปในปฏิกิริยา ชวยให ES cpx คงตัวมากข้ึน เชน
Zn2 CarboxypeptidaseMg2+ Phosphatase, KinaseK+ Pyruvate kinase
2.Prosthetic group3. โคเอนไซม (Coenzyme)
2. Prosthetic group• จับดวยพันธะโควาเลนท • ถาแยกออกจากโมเลกุลเอนไซมจะทําใหเอนไซมเสียสภาพ
Haem
www.steve.gb.com
ใน haemoglobin,cytochromes
3. โค เอนไซม (Coenzyme)• สารประกอบอินทรีย
ซ่ึงมักเปนอนุพันธของวิตามินที่ละลายน้ําหรือมวีิตามินเปนสวนประกอบ อาจเปลี่ยนแปลงโครงสรางไดระหวางที่เกิดปฏิกิริยาแตมักจะกลับสูสภาพเดิมได
• ทําหนาที่โยกยายหมูเคมี อะตอมหรืออิเลคตรอนโดยการทําปฏิกิริยากับซับสเตรทเอง
ดังนั้นโครงสรางอาจเปลี่ยนแปลงไดระหวางที่เกิดปฏิกิริยาแตจะเปลี่ยนกลับสูสภาพเดิมได
• จับแบบหลวมทําใหแยกโคเอนไซมออกได แตจะทําใหเอนไซมขาดความสามารถในการเรงปฏิกิริยา
Vitamin
วิตามิน คือ อินทรียท่ีรางกายตองการปริมาณเล็กนอย
ไมใหพลังงาน ไมไดเปนสวนประกอบของรางกายแตจําเปนในการควบคุมปฏิกิรยิาเคมีท่ีเกิดข้ึนในรางกาย รางกายสังเคราะหข้ึนเองไมไดหรือไดแตไมเพียงพอตองไดรับจากอาหาร
ประเภทของโคเอนไซมแบงตามหมูเคมีที่เกี่ยวของในการเคลื่อนยาย ได 2 ประเภท1. เคลื่อนยายอะตอมไฮโดรเจน
Oxidoreductaseไดแก FAD, FMN, NAD+, NADP+, Lipoic acid,
2. เคลื่อนยายหมูสารเกือบทุกชนิดยกเวนไฮโดรเจน Transferaseไดแก Coenzyme A, Thiamine pyrophosphate , Pyridoxal phosphate, Tetrahydrofolic acid, Biotin, Lipoic acid
โคเอนไซม
CO2transferBiotinBiotin (B7)
Methyl group transferTetrahydrofolic acidFolic acid
TransaminationPyridoxal phosphatePyridoxine (B6)
Ketoaciddecarboxylation
Thiamine pyrophosphateThiamine (B1)
Acyl transferCoenzyme A (CoA)Pantothenic acid (B3)
Acyl + H transferLipoic acidLipoic acid
H transfer (oxidoreduction)NAD+, NADP+,Nicotinic acid (B5)
H transfer (oxidoreduction)FAD, FMNRiboflavin (B2)
Metabolic FunctionsCoenzymesVitamins
15
FAD
http://www.uky.edu/
Riboflavin (B2) = prosthetic gr
Flavin adenine dinucleotide
Adenine
sugar
FADFlavin adenine dinucleotide
Oxidized flavoprotein Reduced flavoprotein
FMNFlavin mononucleotide
www.biopsicologia.net
FMN
FAD
Riboflavin
Nicotinic acid (vitamin B5)
Nicotinamide Niacin (Nicotinic acid)
NAD+ = Nicotinamide adenine dinucleotideNADP+ = Nicotinamide adenine dinucleotide
phosphate
NAD+ and NADP+
http://fig.cox.miami.edu
Reactive gr.
R
= H (NAD+)
= -P=O (NADP+)
O-
O-
Lipoic acid
16
Coenzyme A
http://library.med.utah.eduwww.homepages.hetnet.nl
B3
Adenine
Ribose 3 P
Reactive gr.
Pantothenic acid
Thiamine (B1)
Thiamine Thiamine Pyrophosphate (TPP)
วงแหวนไทอาโซลThiazole ring
วงแหวนไพริมิดีนPyrimidine ring
C
Thiamine (B1)
www.rpi.edu
Reactive carbon
Pyridoxal phosphate (B6)
Pyridoxine Pyridoxal Pyridoxamine
Pyridoxal Phosphate (PLP)
Reactive gr.
Folic acid
Folate (F)
(FH2) (THF, FH4)
8 7
65
Biotin (B7)
Biotin (Carboxylate)
Biotin
+ CO2
อิมมิดาโซล (imidazole ring)
ไทโอฟน (Thiophene ring)biotin-avedin cpx รางกายไมสามารถดูดซึมได
17
Biotin (B7)
The biotinyllysine (biocytin) cpx
from apoenzyme
Biotin (B7)
PyruvateCarboxy-biotinyl cpx
Pyruvate carboxylase
Holoenzyme
www.worthington-biochem.com
-Metalloenzyme-Ion activator
ประโยชนของเอนไซม1. ใชในการตรวจวินิฉัยในหองปฏิบติการ เชน การวิเคราะห
ยูเรียไนโตรเจนในเลือดโดยอาศัยเอนไซม urease และ glutamate dehydrogenase (GDH)
Urea + H2O ammonia + CO2
Ammonia + α ketoglutarate + NADH (340 nm)
glutamate + H2O + NAD+
2. ใชเปนตัวบงชี้โรค เชน creatine phosphokinase(PK) ในเลือดระดับสูง บงชี้วาเปนโรคกลามเนื้อหัวใจตาย
3. ใชเปนยารักษาโรค เชน protease เปนยาลดอาการอักเสบบวมเนื่องจากชวยยอยสลายไฟบรินไปบริโนเจนและโปรตีนบริเวณที่มีอาการอักเสบติดเชื้อ
4. ใชในอุสาหกรรม เชน lipase ในผงซักฟอก Naringinase เพ่ือลดสารขมในน้ําผลไม
ประโยชนของเอนไซม
The end
top related