marcadores moleculares em plantas

Aplicação dos marcadores moleculares Aplicação dos marcadores moleculares em plantasem plantas

Profa. Adriana Cibele de Mesquita Dantas

Biotecnologias em plantasBiotecnologias em plantas

• Biologia Celular

•Micropropagação

•Embriogenese somática

•Resgate de embriões

•Semente sintética

•Fusão de protoplasto

•Haplodiploidização

•Variação somaclonal

• Biologia Molecular

• Marcadores moleculares

• Análise da diversidade genética

• Mapeamento genético de ligação

•Seleção assistida

•Genômica funcional

• Transformação genética

•Proteoma

Marcadores genéticos

Melhoramento tradicional

Genética mendeliana

Genética de populações

Genética molecular

Organização do genoma

Sequenciamento

Transferência gênica

Métodos de melhoramento

Germoplasma

Seleção e avaliação agronômica

Seleção Indução à mutação

Variação somaclonal Hibridação convencional

Transformação genéticaHibridação somática

(Fusão de protoplastos)

Variedade comercial

Métodos aplicados ao melhoramento Métodos aplicados ao melhoramento genético de plantasgenético de plantas

Melhoramento tradicionalMelhoramento tradicional

• Seleção de genótipos em plantas são necessários vários ciclos de seleções e recombinações;

• Características de interesse são geralmente poligênicas,

• Herança complexa, difícil identificação;• Grande número de cruzamentos;• Muito esforço e planejamento;• Polimorfismo limitado para ligação gênica

Melhoramento TradicionalMelhoramento Tradicional

Receptividade do estigma estádio balão Emasculação

Estoque de pólen -20C Polinização manual

Até 1960 – Marcadores morfológicos

1.Primeira versões dos mapas genéticos;

2.Associação das marcas com características fenotípicas;

3.Restrito a poucas plantas (tomate, ervilha, milho);

4.Número reduzido de marcadores para um enorme espectro de espécies vegetais;

5.Influência do ambiente e ação gênica;

6.Identificados a nivel de planta inteira ou adulta.

DETECÇÃO DO DOGMA CENTRALDETECÇÃO DO DOGMA CENTRAL

DNA armazenaa informação

RNA transferea informação

Proteína executaa função

DNA armazenaa informação

RNA transferea informação

Proteína executaa função

genes ambiente FENÓTIPO

Ampliação dos marcadores molecularesAmpliação dos marcadores moleculares

MARCADORES

Morfológicos Bioquímicos

Marcadores moleculares

DNA RNA

deve ser capaz de diferenciar progenitores

deve ser reproduzido com precisão na progênie

Do ponto de vista molecular, um marcador genético (ou loco marcador) serve para identificar um local ou uma região de um cromossomo.

Um marcador genético ideal deve apresentar uma série de atributos:Um marcador genético ideal deve apresentar uma série de atributos:

alto nível de polimorfismo

estabilidade em diferentes ambientes

detectar grande número de locos não ligado

Marcador genético é uma característica que é capaz de Marcador genético é uma característica que é capaz de detectar diferenças entre dois ou mais indivíduos ou detectar diferenças entre dois ou mais indivíduos ou organismos. organismos.

CCTGATGGATCGCGTACGTTGTACGCACAGTGTCGAAAAAGCATACGGGGACTGCACGTACACGTAGCACGGCGTCGATTTTGACGTGCACGTGTCAGTGCGATGAGTGAGTGACACACAGTGCAGCGTGTGTACCCATGCGCGAAGTATGT

CTGGACT

Marcadores molecularesMarcadores moleculares

• São neutros em relação a efeitos epistáticos ou pleitrópicos;

• Identificação de genótipos em estádios iniciais da planta;

• Acelera o processo de seleção e de recombinações desejáveis.

• Todo e qualquer fenótipo molecular proveniente de um gene expresso (isoenzimas, proteínas, RNAm);

• ou ou de um segmento específico de DNA (regiões expressas ou nãoou não do genoma).

Três grandes aplicaçõesTrês grandes aplicações

• Análise da diversidade genética entre indivíduos

• Construção de mapas genéticos de ligação

• Seleção assistida por marcadores moleculares (SAM)

Classes dos marcadores Classes dos marcadores

Isoenzimas Isoenzimas

Proteinas de sementes Proteinas de sementes

RFLP, minissatélites RFLP, minissatélites (VNTR)(VNTR)

RAPD, SSR, rDNA - ITSRAPD, SSR, rDNA - ITS

AFLP; cDNA+AFLPAFLP; cDNA+AFLP

bioquímicos

restrição e hibridação de sequências de dna

reação polimerase em cadeia (PCR)

PCR + restrição + DNA recombinante

PCR específicos em organelasMitDNA, cpSSRMitDNA, cpSSR

FerramentasFerramentas

PCR Termociclador

PCR TermocicladorEletroforese

•O termo eletroforese foi criado por Michaelis em 1909, descreve migração de moléculas sob a influência de um campo elétrico;

•Separação dos fragmentos da molécula de DNA, RNA e proteínas em gel

•Separação em função de suas cargas elétricas, de seus pesos moleculares e de suas conformações.

EletroforeseEletroforese

Carregando o gel com as amostras

Revelando gel de agarose em U.V. – brometo de etídeo

Eletroforese de isoenzimasEletroforese de isoenzimas* Isoenzimas - diferentes formas moleculares (variantes) de uma mesma enzima, apresentando função idêntica ou similar, presente num mesmo indivíduo (Markert & Moller, 1959).

Gel de Araucaria angustifolia

6PGDH -CM

MANTOVANI, 2003

Co-dominância

IsoenzimasIsoenzimas

• Distintas formas de uma mesma enzima, as isoenzimas, codificadas por diferentes alelos, podem ser detectadas em diferentes regiões do gel, caso apresentem diferentes mobilidades eletroforéticas

• Cada banda revelada no gel se constitui num marcador genético, pois entende-se por marcador genético a constituição genotípica de um loco num determinado indivíduo

Aplicações das isoenzimasAplicações das isoenzimas

• Kessel e Milchemore (1986) e Falcão e Contel (1991) - abordam que as variações isoenzimáticas são de grande importância nos estudos genéticos:

• Indicadores dos níveis de polimorfismo• Relacionamento filogenético• Identificação de raças, espécies e populações• Valiosa ferramenta para estudos evolutivos e

taxonômicos.

Fosfoglucomutase (PGM)

monoméricaalelo 1

alelo 2alelo 3

Fosfoglucomutase (PGM)

monoméricaalelo 1

alelo 2alelo 3

Fosfoglucomutase (PGM)

monoméricaalelo 1

alelo 2alelo 3

MANTOVANI, 2003

Resultado da presença de mais de um gene codificando cada uma das enzimas

Fosfoglucomutase (PGM)

monoméricaalelo 1

alelo 2alelo 3

Fosfoglucomutase (PGM)

monoméricaalelo 1

alelo 2alelo 3

Fosfoglucomutase (PGM)

monoméricaalelo 1

alelo 2alelo 3

Fosfoglucomutase (PGM)

monoméricaalelo 1

alelo 2alelo 3

Fosfoglucomutase (PGM)

monoméricaalelo 1

alelo 2alelo 3

Fosfoglucomutase (PGM)

monoméricaalelo 1

alelo 2alelo 3

MANTOVANI, 2003

Resultado da presença de mais de um gene codificando cada uma das enzimas

Estrutura genética de populaçõesEstrutura genética de populações

Genética de PopulaçõesGenética de Populações

Teorema de Hardy-WeinbergTeorema de Hardy-WeinbergEm populações infinitamente grandes,

com cruzamentos ao acaso (panmítica), que não estiverem sofrendo influência dos fatores evolutivos (mutações, seleção natural, migrações), não haverá alteração do pool gênico, isto é, as freqüências gênicas e genotípicas se manterão constantes.

ORGANIZAÇÃO DA VARIABILIDADE GENÉTICAORGANIZAÇÃO DA VARIABILIDADE GENÉTICA

• Base para um programa pré-melhoramento

• Caracterização morfológica e molecular

• Caracterização de bancos de germoplasma

• Coleções e seleções disponíveis em programas de melhoramento

• Cultivares comerciais

Análise da variabilidade genéticaAnálise da variabilidade genética

Reação de polimerase em cadeia (PCR)Reação de polimerase em cadeia (PCR)

Amplificação do DNA

Técnica usada para amplificar uma região específica de

DNA visando produzir quantidade de DNA suficiente

Extração de DNA Extração de DNA (Doyle e Doyle, 1987)(Doyle e Doyle, 1987)

Amostra

Sol. extratora

pellet

1.5

1.0

0.5

0.1

1.5

1.0

0.5

0.1

1.5

1.0

0.5

0.1

1.5

1.0

0.5

Adição de CIA

1.5

1.0

0.5

Adição de CIA

1.5

1.0

0.5

Adição de CIA

1.5

1.0

0.5

0.1

Adição de etanol

1.5

1.0

0.5

0.1

Adição de etanol

Centrifugação

RNAse

ConstataçõesConstatações• Logo após Kary Mullis ter descoberto a Polymerase Cadeia

Reação (PCR) ele percebeu que primers curtos ligariam a vários locais em um genoma e assim poderiam produzir fragmentos múltiplos.

• Welsh & McClelland (1990) e Williams et al. (1990) desenvolveram Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) - técnica que utiliza primer com 10 bases,

• O uso da reação da polimerização em cadeia (PCR) proporciona a amplificação de um segmento de DNA, delimitado por dois iniciadores (primers) com 10 pares de bases, que são complementares a dois sítios, um em cada fita do DNA, posicionados inversamente a uma distância geralmente não superior a 4kb.

DNA

Primers encontram-se na mesma direção, amplificação NÃO acontecerá

Primer se anela a muitos locais no DNA

Quando primer se anela em direção oposta – amplificação

DNA

Primers são separados em pouca distância, fragmento É AMPLIFICADO

100 - 1,500 bases

RAPDDominante

RAPD RAPD ((Random Amplified Polymorphic DNA)Random Amplified Polymorphic DNA)

A

A B

B

A1A1 A1A2 A2A2

Marcadores Marcadores “dominantes”“dominantes”

Ind. L1 L2 L3 L4 L5 L6 L7 L8

01020304050607080910

0100100010

1001101101

0011011010

1011000101

1110111001

0101100100

1000000000

1111110111

01 02 03 04 05 06 07 08 09 10

L2L1

L3

L5

L6

L4

L7

L8

Marcadores Marcadores “dominantes”“dominantes”

QUAIS AS POLIMÓRFICAS?QUAIS AS (CO)SEGREGANTES?

Análise em gel de RAPDAnálise em gel de RAPD

TransposonsSequências de

inserçãoSatélites

Microssatélites

Minissatélites

Genoma

Repetições em tandem

Repetições dispersas

Onde estão localizados no genoma os Onde estão localizados no genoma os marcadores?marcadores?

IntronsFragmentos

de genes

RAPDs

AFLPs

outros

Genes e sequências

relacionadas

DNA extragênico

DNA repetitivoDNA codificante

DNA não codificante

DNA repetitivo

MicrosatélitesMicrosatélites• SSR – Simple Sequence RepeatsSSR – Simple Sequence Repeats

– Pequenas sequências (“sequence motif”) com 1 a 4 nucleotídeos

repetidos em tandem - Amplificados via PCR

– Classe de marcadores moleculares mais polimórficos

SinonímiasSinonímias

SSR (Simple Sequence Repeats);SSR (Simple Sequence Repeats);

STMS (Sequence Tagged Microsatellites);STMS (Sequence Tagged Microsatellites);

SSLP (Single Sequence Length Polymorphisms);SSLP (Single Sequence Length Polymorphisms);

Onde são encontrados ???

Mamíferos: (CA)n ( 50.000 a 100.000 vezes no genoma)

Plantas: (AT)n

Mitocôndrias

Cloroplastos

M

homozigotoheterozigoto

M

homozigotoheterozigoto

Marcador co-dominante

Marcador multialélico

A1A1 A1A2 A2A2

Marcadores “co-dominantes”Marcadores “co-dominantes”

Ind. L1

01020304050607080910

1/33/42/33/31/31/11/31/43/31/2

1

2

3

4

01 02 03 04 05 06 07 08 09 10

Marcadores “co-dominantes”Marcadores “co-dominantes”

Sequenciamento de regiões microssatélitesSequenciamento de regiões microssatélites

Mapeamento genético de ligaçãoMapeamento genético de ligação• Identificar marcadores genéticos ligados aos genes Identificar marcadores genéticos ligados aos genes de interesse, nos respectivos cromossomos;de interesse, nos respectivos cromossomos;

•Disponibilizados para as principais espécies de Disponibilizados para as principais espécies de importância agronômica;importância agronômica;

•QTLs e/ou QRLs rastreados e etiquetados, QTLs e/ou QRLs rastreados e etiquetados,

visando uma melhoria na eficiência da seleção.visando uma melhoria na eficiência da seleção.

Xu & Korban, 2000Xu & Korban, 2000

Gene Vf (Sarna)

AFLP

CARACTERIZAÇÃO BIOLÓGICACARACTERIZAÇÃO BIOLÓGICAFenotipagem (Fenotipagem (Locos de resistênciaLocos de resistência))

A) Melrose x Gala – 86 plantasB) M13/91 x Gala - 129 plantas C) M13/91 x M46/94 -185 plantas

M9 x Marubakaido - 85 FM9 x Marubakaido - 85 F1 1 ((QTLs - loci quantitativosQTLs - loci quantitativos))

A BA B

pulgão espinhosPerfilhos uniformes

tipo spur Perfilhos uniformes

S C M

Progênie F1 (Santa Rosa x Chatard)

Marcas segregantes

840 marcadores:

475 AFLPs

235 RAPDs

129 SSRs

Caracterização molecular Caracterização molecular

Identificação de marcas candidatasIdentificação de marcas candidatas

Desenvolvimento de um SCAR Desenvolvimento de um SCAR

((Sequence characterized amplified RAPDSequence characterized amplified RAPD))

1) identificação de um iniciador que confere polimorfismo a dois bulks de DNA com fenótipos contrastantes,

2) o isolamento e a clonagem do fragmento amplificado em um vetor (plasmideo),

3) sequenciamento do fragmento isolado,

4) desenho dos iniciadores de tamanho maior que os decâmeros,

5) teste final em plantas.

Validação das Marcas – Desenvolvimentos de Validação das Marcas – Desenvolvimentos de marcadores específicos (marcadores específicos (Clonagem por mapeamentoClonagem por mapeamento))

Seleção assistida por marcadoresSeleção assistida por marcadores (SAM) (SAM)

Atributos

Isoenzimas

Proteínas de sementes

RFLPs

RAPDs

Microssatélites

AFLPs

Nível de Polimorfismo

baixo alto baixo-alto baixo-alto muito alto muito alto

Estabilidade ambiental

moderada alta alta alta alta alta

Número de locos moderado (<50) baixo (<10) alto alto alto alto Expressão genética co-dominate co-dominante co-dominante dominante co-dominante dominante Número de alelos por loco

2-5 multialélico multialélico 2 multialélico 2

Distribuição no genoma

regiões de cópia única

regiões de cópia única

várias ao acaso ao acaso ao acaso

Acessibilidade tecnológica

muito alta muito alta média muito alta muito baixa média

Aplicabilidade no melhoramento

rápido, baixo custo

rápido, baixo custo

lento, custo médio

rápido, baixo custo

lento, custo alto rápido, custo baixo

Identificação de genótipos

baixa baixa alta muito alta muito alta muito alta

Avaliação de germoplasma

média baixa alta alta alta muito alta

Mapeamento genético

baixa muito baixa alta alta muito alta alta

Mapeamento de regiões específicas

baixa inadequado média muito alta média muito alta

Mapeamento comparativo

baixa inadequado muito alta baixa alta baixa

Genética de Autógamas

baixa baixa média alta muito alta muito alta

Genética de Alógamas

média baixa média alta muito alta muito alta

Análise Filogenética média baixa muito alta média alta média Adaptado de Gepts (1993) e Ferreira & Grattapaglia (1995).

Marcador molecular

Populações segregantes

Mapeamento de QRL/ QTL

Polimorfismo

SeleSeleçção assistidaão assistida

Marcador molecular

Populações segregantes

Mapeamento de QRL/ QTL

Polimorfismo

SeleSeleçção assistidaão assistida

Melhoramento molecular(molecular breeding)

Bibliotecas cDNA

Expressão gênica - RNAm

Bibliotecas cDNA

Expressão gênica - RNAm

Proteôma

Banco de dados