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FACOLTÀ DI MEDICINA E CHIRURGIA
DOTTORATO DI RICERCA IN TECNOLOGIE
AVANZATE IN CHIRURGIA
CURRICULUM C CHIRURGIA
RESPONSABILE PROF A. BOLOGNESE
XXIII CICLO
SIGNIFICATO PROGNOSTICO DELLE CELLULE TUMORALI CIRCOLANTI (CTC) NELLE NEOPLASIE SOLIDE DI
COLON E MAMMELLA
Dottorando Relatore
Dott.ssa Francesca Ricci Prof. P.L. Mingazzini
Anno accademico 2010/2011
INDICE
CAPITOLO UNO 4
1 INTRODUZIONE SULLE CELLULE TUMORALI CIRCOLANTI 4
1.1 IDENTIFICAZIONE DELLE CELLULE TUMORALI CIRCOLANTI BASATA SU ACIDI NUCLEICI (DNA E RNA) 7
1.2 IDENTIFICAZIONE DELLE CELLULE TUMORALI CIRCOLANTI SULLA BASE DELLE CARATTERISTICHE FISICHE 9
1.3 IDENTIFICAZIONE DELLE CELLULE TUMORALI CIRCOLANTI TRAMITE ANTICORPI CONTRO ANTIGENI DI SUPERFICIE 10
2 LE CELLULE TUMORALI CIRCOLANTI NEL CARCINOMA DELLA MAMMELLA 13
3 LE CELLULE TUMORALI CIRCOLANTI NELL’ADENOCARCINOMA DEL COLON-RETTO 16
CAPITOLO DUE 20
SCOPO DELLA RICERCA
CAPITOLO TRE 22
MATERIALI E METODI
2
CAPITOLO QUATTRO 30
RISULTATI
CAPITOLO CINQUE 33
FIGURE E TABELLE
CAPITOLO SEI 38
DISCUSSIONE
CAPITOLO SETTE 44
BIBLIOGRAFIA
3
CAPITOLO UNO
1 INTRODUZIONE SULLE CELLULE TUMORALI CIRCOLANTI
Le metastasi sono la prima causa di morte nei pazienti
oncologici.
Bloccare l’invasione tumorale e prevenire le metastasi è lo
scopo delle nuove terapie antitumorali, ma per raggiungere
questo obiettivo è fondamentale comprendere il meccanismo
tramite cui le cellule tumorali escono dalla localizzazione
primaria, entrano nella circolazione sanguigna e si stabiliscono
come lesioni a distanza in organi come polmoni, fegato, cervello
e midollo osseo.
Le cellule tumorali identificate in transito nella circolazione
sanguigna sono definite Cellule Tumorali Circolanti (Circulating
Tumor Cells). Sebbene la loro natura non sia ben conosciuta,
si ritiene che una frazione di queste cellule siano cellule
tumorali in grado di iniziare una lesione clonale metastatica.
La rilevazione di queste Cellule Tumorali Circolanti nella
circolazione sanguigna dei pazienti anni prima dell’inizio della
malattia metastatica potrebbe portare all’uso delle Cellule
Tumorali Circolanti come monitoraggio non invasivo di
sensibilità o resistenza alla terapia, oltre a consentire una
selezione dei pazienti che necessitano una precoce terapia
antitumorale sistemica.
4
Inoltre la caratterizzazione morfologica delle Cellule Tumorali
Circolanti potrebbe aiutare ad identificare nuovi target
terapeutici per bloccare il processo metastatico.
La disseminazione delle Cellule Tumorali Circolanti, però, non è
rilevata neanche dalle tecniche d’imaging più avanzate.
Le CTC sono estremamente rare: si considera circa una CTC
per miliardo di cellule nucleate del sangue (polimorfonucleate,
linfociti, etc) nei pazienti con neoplasia avanzata (1).
La nostra conoscenza delle loro proprietà biologiche è stata
quindi limitata dalla difficoltà di sviluppare tecniche in grado di
isolarle in numero sufficiente e in condizioni compatibili con
l’effettuazione di successivi studi molecolari e funzionali.
Una migliore comprensione dell’identità precisa delle Cellule
Tumorali Circolanti e dei fattori che le rendono capaci di entrare
nel circolo sanguigno sarebbe fondamentale per capire la
chiave del processo metastatico e creare nuovi approcci
terapeutici mirati a bloccarlo.
Per molto tempo le nostre conoscenze sul processo metastatico
delle neoplasie si sono basate su modelli murini, alcuni dei quali
ci hanno fornito importanti dati sulle Cellule Tumorali Circolanti.
Numerosi studi hanno per esempio messo in luce la capacità
delle Cellule Tumorali Circolanti, identificate in modelli di
trapianto di carcinoma prostatico, di attivare un pathway in
grado di dar loro resistenza all’apoptosi (2,3,4).
Nonostante questi studi murini offrano dati interessanti sul
meccanismo metastatico, hanno purtroppo alcune limitazioni: i
modelli murini con l’utilizzo di linee cellulari neoplastiche umane
infatti non riescono a ricapitolare la complessa relazione con la
5
vascolatura ed il microambiente circostante presente nelle
neoplasie endogene, né vi riesce l’iniezione di linee cellulari
tumorali nella vena della coda dei topi.
D’altra parte molti esperimenti effettuati su linee cellulari di
neoplasie endogene murine hanno messo in luce come queste
metastatizzano tardi, se metastatizzano.
Per questo motivo, seppur istruttivi, i dati forniti da questi
modelli sperimentali devono essere validati da studi effettuati su
neoplasie umane.
Sebbene la prima scoperta di Cellule Tumorali Circolanti in un
paziente con neoplasia avanzata risalga al 1869, quando
Ashworth descrisse la presenza di Cellule Tumorali Circolanti
durante l’autopsia di un paziente deceduto per malattia
metastatica, ancora oggi le nostre conoscenze sono limitate
(14).
In assenza di una tecnica riconosciuta come gold standard per
identificarle, lo scopo ultimo della ricerca sulle Cellule Tumorali
Circolanti negli ultimi anni è stato quello di isolarle
efficacemente, vitali ed intatte, dal sangue periferico, con una
specificità tale da distinguerle facilmente dal vasto numero di
cellule del sangue che le circondano.
6
1.1 Identificazione delle Cellule Tumorali Circolanti basata su acidi nucleici (DNA e RNA)
In letteratura è stato descritto come nel sangue di pazienti
neoplastici siano presenti DNA libero e, in minor misura, RNA
libero (15,16,17,18).
Alcuni autori hanno suggerito un legame tra la presenza di
Cellule Tumorali Circolanti e la rilevazione di DNA libero di
derivazione tumorale nel siero-plasma di pazienti con
carcinoma prostatico (19,20).
L’origine di questi acidi nucleici però può anche essere legata
alla presenza di cellule necrotiche eliminate dalla neoplasia, di
frammenti cellulari o alla lisi di Cellule Tumorali Circolanti.
Alcuni studi hanno isolato acidi nucleici direttamente dal plasma
(15,18), mentre altri hanno prima purificato dal sangue cellule
nucleate per poi lisarle ed estrarne gli acidi nucleici. L’analisi
molecolare del DNA così estratto ha mostrato punti di
traslocazione tumore-specifici in seguito sequenziati (21,22).
Purtroppo però studi di questo tipo necessitano di grandi
quantità di sangue.
Inoltre in caso di esito negativo di questi test in pazienti
oncologici la negatività può essere legata sia ad una quantità
insufficiente di DNA di derivazione tumorale rilevato nel sangue
sia alla mancanza della specifica anormalità molecolare presa
in considerazione nel singolo paziente.
A livello di RNA sono state utilizzate tecniche di RT-PCR sia su
acidi nucleici non purificati liberi nel plasma sia su RNA estratto
7
da Cellule Tumorali Circolanti identificate nel sangue dopo
tecniche di enrichment.
Noti markers tumorali sono stati identificati da numerosi autori
(23,24,25,26,27,28), quali PSA, HER-2, CEA; tuttavia l’ alta
frequenza di falsi positivi e falsi negativi nei risultati della RT-
PCR e la difficoltà nel quantificare i livelli di espressione di
questi markers senza una precedente purificazione delle rare
Cellule Tumorali Circolanti rendono queste tecniche non
adeguate per un uso diagnostico routinario (29,30).
8
1.2 Identificazione delle Cellule Tumorali Circolanti sulla base delle caratteristiche fisiche
Le Cellule Tumorali Circolanti presentano numerose
caratteristiche fisiche differenti dalle cellule nucleate del
sangue: sono più grandi dei polimorfonucleati (almeno 4x4
μm2), e sono diverse per densità, carica, proprietà di migrazione
ed altre specifiche proprietà ( es presenza di granuli
melanocitari nelle Cellule Tumorali Circolanti di pazienti affetti
da melanoma).
Le importanti differenze nella densità cellulare sono state usate
per separarle dalle emazie nel sangue periferico tramite
gradiente di densità, anche se le Cellule Tumorali Circolanti
sono una minima frazione delle cellule mononucleate in
circolazione (31,32,33,34).
Le differenze nella taglia sono invece state usate in tecniche di
selezione tramite filtrazione (35,36) ma, nonostante le Cellule
Tumorali Circolanti siano più grandi dei leucociti, presentano
variazioni notevoli di taglia le une dalle altre (37).
Metodi basati sul passaggio di sangue attraverso filtri e
membrane porose sono stati testati (38,39), ma solo su
campioni di linee cellulari diluite nel sangue, non su campioni di
sangue periferico prelevato da pazienti neoplastici.
9
1.3 Identificazione delle Cellule Tumorali Circolanti tramite anticorpi contro antigeni di superficie
Il metodo più validato sino ad oggi si basa su tecniche di
isolamento cellulare basate sulla cattura tramite anticorpi per
specifici antigeni di superficie epiteliali delle Cellule Tumorali
Circolanti, usando antigeni normalmente non espressi nei
leucociti.
Tra questi EpCAM ( Epithelial Cell Adhesion Molecule) è
l’anticorpo più usato per la sua universale espressione nelle
cellule di origine epiteliale e la sua assenza nelle cellule
nucleate del sangue di origine leucocitaria.
L’utilizzo di anticorpi anti EpCAM coniugati con biglie
magnetiche seguito da una purificazione delle cellule catturate
attraverso un campo magnetico è alla base del CellSearch
System (Veridex). Questo strumento, approvato dalla FDA e
utilizzato in USA, utilizza biglie ferrose caricate con anticorpo
anti EpCAM per catturare le Cellule Tumorali Circolanti, che
vengono in seguito colorate con un cocktail di anticorpi
anticitocheratine quali CK8, CK18, CK19 (40).
La colorazione per il marker leucocitario comune CD45 viene
usato come controllo per escludere i leucociti .
Nonostante CellSearch sia il metodo più standardizzato tra
quelli proposti negli ultimi anni e sia attualmente impiegato in
diversi studi clinici sul ruolo delle Cellule Tumorali Circolanti
come marker prognostico nelle neoplasie solide, solo una
porzione dei pazienti con neoplasia metastatica presenta
10
positività per CTC con un valore di circa di 1 CTC per ml di
sangue e una bassa purezza delle CTC identificate (41,42).
Le Cellule Tumorali Circolanti sono state riscontrate nella
maggior parte delle neoplasie epiteliali, come quelle di
mammella, colon, prostata e polmone.
Secondo la tecnica utilizzata, diversi autori hanno dimostrato
che nel 50-100% dei pazienti con neoplasia metastatica di
prostata e mammella si possono identificare Cellule Tumorali
Circolanti nel sangue periferico, anche se la percentuale, negli
stessi pazienti, di malattia metastatica clinicamente evidente va
dal 10 al 60%.
Nonostante ciò la rilevanza prognostica della presenza delle
Cellule Tumorali Circolanti nel sangue periferico di pazienti in
stadio precoce, senza malattia clinicamente metastatica è
ancora da definirsi.
Diversi lavori hanno evidenziato che la presenza di 5 o più
Cellule Tumorali Circolanti per 7.5 ml di sangue prima
dell’inizio di una terapia antitumorale sistemica si associa ad un
minore intervallo libero da malattia e ad una peggiore
sopravvivenza ( 43,44,45) .
Prendendo in considerazione l’utilizzo delle Cellule Tumorali
Circolanti come indicazione alla terapia antitumorale, va
sottolineato come l’eterogeneità delle Cellule Tumorali
Circolanti sia marcata, sia nell’espressione di recettori per fattori
di crescita, proteasi, molecole di adesione e HLA, sia per la
presenza di specifiche aberrazioni citogenetiche; alcuni studi
hanno dimostrato addirittura una differente espressione di
11
alcune molecole tra tumore primitivo e Cellule Tumorali
Circolanti,come ad esempio p53.
Nonostante la significativa percentuale di pazienti metastatici
con Cellule Tumorali Circolanti nel sangue in realtà queste sono
state identificate anche nel sangue periferico di pazienti con
neoplasia localizzata.
Il ruolo delle Cellule Tumorali Circolanti nella fase precoce della
malattia neoplastica è obiettivo principale del nostro studio.
12
2 LE CELLULE TUMORALI CIRCOLANTI NEL CARCINOMA DELLA MAMMELLA
Le neoplasie solide della mammella sono la causa più
frequente di morte per le donne nei paesi sviluppati. Nonostante
negli anni la diagnosi precoce, la chirurgia precisa con margini
di exeresi ampi negativi e la terapia adiuvante abbiano
migliorato la prognosi di queste patologie, le recidive sono
frequenti, con esito fatale nel caso di malattia metastatica. Fino
a questo momento nessuno strumento è in grado di monitorare
l’effetto della terapia adiuvante nel carcinoma della mammella,
ad eccezione di studi statistici sulla frequenza delle recidive. La
capacità predittiva di questi studi purtroppo applicata al singolo
paziente è inefficace.
È da tempo noto che le neoplasie solide possono disseminare
cellule nel sangue periferico, che, anche dopo resezione
completa della neoplasia, possono portare a metastasi.
L’identificazione di queste Cellule Tumorali Circolanti in pazienti
con neoplasia localizzata o metastatica della mammella è
oggetto di numerosi studi in letteratura.
Studi sperimentali su modelli murini di carcinoma mammario
hanno dimostrato che cellule tumorali disseminate al midollo
osseo (DTC) possono essere identificate nelle fasi premaligne
del carcinoma mammario, suggerendo una diffusione precoce
ad organi distanti (9).
Studi clinici hanno dimostrato una correlazione significativa fra
la presenza di DTC nel midollo osseo e l’insorgenza di
13
metastasi, suggerendo che le cellule da cui originano le
metastasi (metastatic stem cells) siano tra le DTC (7).
Per il carcinoma della mammella, in cui molti dati sono stati
raccolti , tuttavia solo la metà delle pazienti neoplastiche con
positività per DTC o CTC vanno incontro a metastasi, mentre le
altre presentano un intervallo libero da malattia metastatica per
oltre 10 anni di follow up (8).
Questi dati sono congruenti con i dati forniti da modelli animali e
suggeriscono che una parte significativa delle pazienti positive
per Cellule Tumorali Circolanti non svilupperà mai una
metastasi.
L’ipotesi formulata è stata quella della latenza o “quiescienza”
delle Cellule Tumorali Circolanti nel carcinoma mammario, ma
fino a questo momento poco si sa sulle condizioni richieste per
la progressione da “dormiente” o latente, sull’equilibrio tra
replicazione tumorale e morte cellulare. Alcuni studiosi
ritengono che mutazioni ulteriori o stimoli dal microambiente
circostante possano modificare questo equilibrio, portando le
Cellule Tumorali Circolanti dormienti ad attivarsi e dare inizio al
processo metastatico.
La maggior parte dei pazienti affetti da neoplasia mammaria
presentano Cellule Tumorali Circolanti che esprimono e
secernono CK19, marker da poco considerato come putativo
delle cellule staminali. Questo ha fatto ipotizzare che una parte
delle Cellule Tumorali Circolanti presenti nei pazienti in fase
precoce di neoplasia possano considerarsi cellule staminali
putative, non replicanti in situ, e resistenti alla chemioterapia; da
14
queste constatazioni si è sviluppata la teoria delle “cancer stem
cells” o cellule tumorali staminali.
Oltre a studi sulla loro effettiva presenza negli ultimi anni la
ricerca si è soffermata sulle indicazioni terapeutiche che si
possono trarre dalle Cellule Tumorali Circolanti.
Diversi studi evidenziano come nel carcinoma mammario
metastatico un alto numero di Cellule Tumorali Circolanti nel
sangue comporti una prognosi peggiore (43,44).
Nonostante si consideri che una terapia adiuvante aggressiva
possa comportare una sopravvivenza maggiore in queste
pazienti, in realtà mancano statistiche adeguate. Nell’utilizzo
della terapia adiuvante la terapia viene somministrata allo
scopo di eliminare la malattia minima residua a livello sistemico,
ma nonostante si ritenga che questo tipo di protocollo migliori la
sopravvivenza, fino ad oggi non è possibile per una singola
paziente predire se trarrà beneficio dalla terapia o no.
Diversi studi hanno valutato lo stato di HER-2/neu nelle pazienti
con neoplasia mammaria localmente avanzata in corso di
terapia neoadiuvante (33,46); nonostante siano stati processati
fino a 50 ml di sangue Cellule Tumorali Circolanti sono state
identificate solo in metà delle pazienti, con un numero di
CTC/HER-2/neu + variabile da 1 a 8 per 50 ml.
Altri studi hanno evidenziato come il numero di Cellule Tumorali
Circolanti pretrattamento (baseline) in differenti pazienti non
correla bene con fattori prognostici già standardizzati quali la
massa tumorale o la presenza di marker specifici sierici (48).
15
3 LE CELLULE TUMORALI CIRCOLANTI NELL’ADENOCARCINOMA DEL COLON-RETTO
L’adenocarcinoma del colon retto è una delle patologie
neoplastiche più diffuse; ogni anno nel mondo vengono
diagnosticati un milione di nuovi casi e circa 500.000 decessi
per questa patologia. Sebbene siano stati fatti notevoli passi
avanti nella terapia dell’ adenocarcinoma del colon-retto, nel
caso della malattia metastatica la prognosi rimane pessima, con
una sopravvivenza a 5 anni minore del 10%.
L’identificazione di Cellule Tumorali Circolanti nel sangue
periferico di pazienti affetti da adenocarcinoma del colon-retto è
stata riportata per la prima volta circa 40 anni fa (49).
Recenti studi hanno utilizzato la RT-PCR per identificare mRNA
codificante per proteine associate alla neoplasia come CEA
(Carcinoembryonic Antigen), CK 20 e CD44 ( 50,51,52).
Questi studi hanno permesso di isolare Cellule Tumorali
Circolanti con una sensibilità in vitro di circa 1 CTC per 107
polimorfonucleati del sangue.
Studi clinici basati sulla RT-PCR suggeriscono che le Cellule
Tumorali Circolanti sono presenti nella circolazione della
maggior parte dei pazienti affetti da adenocarcinoma del colon-
retto (53,54).
Le Cellule Tumorali Circolanti possono fornire una fonte
relativamente non invasiva e ripetibile di informazioni
genotipiche che possono influenzare il trattamento e la prognosi
per questi pazienti.
16
La gestione del paziente oncologico con malattia metastatica
del colon-retto è cambiata significativamente negli ultimi 5 anni,
con una sopravvivenza totale passata da 12 a 24 mesi.
Questo cambiamento notevole è dovuto principalmente
all’introduzione di nuovi farmaci chemioterapici, quali il
Cetuximab, che presenta un’ attività antitumorale sinergica
quando utilizzato in un protocollo chemioterapico a base di
irinotecan-oxaliplatin.
Il Cetuximab è un anticorpo ricombinante umano/murino (mAb)
che si lega al dominio extracellulare di EGFR (Epidermal
Growth Factor Receptor), ma ad oggi, a differenza di altre
molecole (es C-KIT nei Tumori Stromali Gastrointestinali) la
valutazione della sensibilità alla terapia tramite reazione
immunoistochimica con anticorpo anti EGFR manca di valore
predittivo.
Diversi studi hanno messo in luce come la mutazione di K-RAS
sia un evento comune in molte neoplasie solide umane,
soprattutto nel carcinoma del colon-retto.
Proprio la presenza di una mutazione di KRAS nei pazienti
affetti da adenocarcinoma del colon-retto si è ipotizzato essere
alla base della non risposta alla terapia con cetuximab.
Studi precedenti hanno mostrato che i pazienti con malattia
metastastica del colon-retto che presentano mutazione di KRAS
non traggono beneficio alla terapia con mAb anti EGFR, mentre
pazienti che presentano KRAS wild type traggono beneficio
dalla terapia a base di cetuximab .
17
Considerando gli effetti collaterali ed il costo di queste terapie
sarebbe opportuno selezionare i pazienti prima di iniziare un
trattamento con questi farmaci.
Attualmente la sensibilità alla terapia viene testata con
sequenziamento del gene effettuato dopo amplificazione di
DNA tumorale estratto dalla inclusione in paraffina, metodica
non accessibile a tutti i centri diagnostici e di complessa
esecuzione .
La letteratura però riporta che pazienti con KRAS wild type
presentano una risposta obiettiva alla terapia in circa il 59-61%
dei casi contro un 43-33% di risposta obiettiva nei pazienti non
selezionati.
Alcuni studi hanno dimostrato come alcuni pazienti possano
mostrare discordanza tra tumore primitivo e metastasi a
distanza nella mutazione di KRAS (62,63); in questi studi la
concordanza dello status di KRAS tra tumore primitivo e
metastasi è circa del 77% .
Se la valutazione dello stato di KRAS può quindi essere fatta
sia su tumore primitivo che su metastasi a distanza nei pazienti
giunti alla diagnosi già in malattia avanzata, questa discordanza
non rende possibile una selezione dei pazienti quando ancora
in stadio localizzato o localmente avanzato.
Per questo motivo la valutazione dello stato di KRAS nelle
Cellule Tumorali Circolanti dei pazienti con adenocarcinoma del
colon-retto potrebbe avere un importante applicazione clinica
nella selezione dei pazienti da avviare alla terapia con
cetuximab.
18
Altre mutazioni note legate all’adenocarcinoma del colon-retto
sono state prese in considerazione, come la presenza della
proteina p53, la cui perdita si associa ad una ridotta sensibilità
alla chemioterapia e alla radioterapia ed ad una sopravvivenza
minore per i pazienti (55,56,57,58).
La perdita di funzione della proteina p53 wild type dipende da
mutazioni collocate nei domini più conservati del gene (59), che
vengono identificate con tecniche di sequenziamento del gene.
Questi studi hanno dimostrato una congruenza di mutazioni
della proteina p53 tra tumore primitivo, metastasi e CTC ,
indicando come un clone selezionato di cellule tumorali sia in
grado di disseminarsi e metastatizzare a distanza (60).
Una correlazione tra numero delle Cellule Tumorali Circolanti
(baseline) e prognosi clinica peggiore è stata inoltre riportata in
letteratura per pazienti affetti da adenocarcinoma del colon-retto
(47).
19
CAPITOLO DUE
SCOPO DELLA RICERCA
La caratterizzazione delle Cellule Tumorali Circolanti potrebbe
fornire importanti informazioni sul potenziale metastatico di una
neoplasia e sulla sensibilità alla terapia.
Conoscere il fenotipo di queste cellule e le loro proprietà
potrebbe rendere possibile una stratificazione in gruppi dei
pazienti sulla base del beneficio di terapie particolari in un
momento in cui la terapia oncologica si avvale di farmaci nuovi
e specifici ( es Herceptin nel carcinoma mammario e Cetuximab
nell’adenocarcinoma del colon-retto).
L’identificazione delle Cellule Tumorali Circolanti nei pazienti
neoplastici come esame routinario potrebbe essere un fattore
prognostico indipendente dal sistema TNM, in grado di
selezionare pazienti con maggior rischio di recidive e metastasi.
La valutazione di alcuni markers specifici sulle Cellule Tumorali
Circolanti potrebbe inoltre rendere possibile un monitoraggio
dell’efficienza della terapia oncologica.
Le esistenti tecnologie per l’isolamento delle Cellule Tumorali
Circolanti, basate su varie proprietà delle Cellule Tumorali
Circolanti e ciascuna con una specifica limitazione, non
consentono al momento una ricerca routinaria nel sangue dei
pazienti neoplastici.
L’elevata quantità di sangue richiesta utilizzando alcune
tecniche per l’isolamento delle Cellule Tumorali Circolanti prima
20
dell’intervento chirurgico mal si coniuga infatti con le condizioni
generali di pazienti oncologici spesso in età avanzata e con
problemi clinici coesistenti.
Il nostro studio si propone di individuare una metodica
accessibile per costo e ripetibile per individuare Cellule
Tumorali Circolanti nel sangue periferico di pazienti affetti da
carcinoma mammario ed adenocarcinoma del colon-retto in
stadio localizzato ed avere contemporaneamente a
disposizione informazioni prognostiche utili per il trattamento dei
pazienti stessi come lo stato di HER-2/neu nel carcinoma
mammario ed EGFR nell’ adenocarcinoma del colon-retto.
Nel nostro studio abbiamo inoltre preso in considerazione la
correlazione tra presenza di CTC nel sangue periferico e fattori
prognostici noti come stadio (TNM), invasione vascolare ed
interessamento linfonodale.
21
CAPITOLO TRE
MATERIALI E METODI
Campioni di sangue periferico, da 3 a 7 ml, di pazienti in attesa
di essere operati per neoplasie solide di colon e mammella nel
Reparto di Chirurgia Oncologica presso il Dipartimento di
Chirurgia Pietro Valdoni, Università di Roma “La Sapienza”
sono stati raccolti in provetta con sodio-EDTA.
Pazienti in attesa di essere operati per patologie non
neoplastiche sono stati arruolati come controllo negativo per il
nostro studio.
Il sangue così ottenuto è stato trasportato presso il Gene
Expression Laboratory dell’Istituto Nazionale per le Malattie
Infettive “Lazzaro Spallanzani”.
Presso questo Laboratorio la frazione di cellule mononucleate
dei campioni di sangue è stata isolata mediante gradiente di
separazione Ficoll: ogni campione di sangue è stato aggiunto
ad una provetta con filtro contenente Ficoll in rapporto 1:1 e le
provette così preparate sono state centrifugate a 1800 rpm a 25
°C senza freno per 10 minuti .
Dopo la centrifugazione le cellule mononucleate, racchiuse in
un anello ben evidente sopra il filtro (Figura 1), sono state
aspirate con pipetta sterile e successivamente lavate con PBS
in rapporto 1:1 tramite due successivi cicli di centrifugazione
(1500 rpm per 5 minuti) eliminando ogni volta il sovranatante.
22
Il pellet di cellule così ottenuto è stato poi congelato a -80°C in
2 provette contenenti soluzione di congelamento (90% siero
bovino + 10%DMSO), in modo da ottenere circa 10 milioni di
cellule per provetta.
Le cellule sono state successivamente contate al microscopio
mediante soluzione Tripan Blue per escludere cellule morte.
Mediamente, come nel caso del paziente 11, sono state ottenuti
8-10 milioni di cellule a campione.
Allo scopo di testare la metodica di cell sorting tramite beads
magnetiche le cellule mononucleate sono state sottoposte ad
arricchimento della componente epiteliale mediante selezione
positiva con l’anticorpo anti EpCAM (MACS CD326(EpCAM)
Microbeads, Miltenyi).
Dopo la conta le cellule sono state sospese in 300 microlitri di
MACS buffer, a cui abbiamo aggiunto una quantità di biglie
magnetiche marcate con EpCAM adeguate alle cellule presenti
nella provetta (16 microlitri di biglie) ed incubate a 4°C al buio
insieme al Fcr Blocking Buffer.
Finita l’incubazione abbiamo aggiunto 0,5 ml di buffer e
centrifugato il campione a 1500 rpm per 10 minuti a 4°C.
23
Eliminato il sovranatante il pellet è stato risospeso in 1 ml di
buffer in modo da ottenere una quantità di 3 ml totali.
Nel frattempo la colonna di separazione è stata montata nel
campo magnetico MACS Separator e lavata per tre volte con
buffer (3 ml).
Finiti i lavaggi della colonna il nostro campione è stato caricato
sulla colonna.
Le cellule non marcate con EpCAM in questo modo sono state
lavate via dalla colonna tramite lavaggio ripetuto 3 volte con
buffer ed eliminate.
Le cellule marcate con EpCAM sono rimaste attaccate alla
colonna, che è stata a questo punto staccata dal campo
magnetico e posizionata in una provetta apposita in cui le
cellule sono cadute dopo un lavaggio con buffer.
Le cellule così ottenute sono state nuovamente contate con
metodica Tripan Blue.
La metodica di arricchimento ha selezionato in 5 ml 140.000
cellule circa. A questo punto le cellule selezionate sono state
marcate con anticorpo antiEpCAM tramite incubazione per 15
minuti in frigo al buio.
Successivamente il campione è stato lavato con PBS,
centrifugato a 1700 rpm per 5 minuti, risospeso in FACSflow e
valutato tramite FACS ( Fluorescence Activated Cell Sorting)
(Figura 2).
24
FIGURA 2
Quadrant Statistics
File: Data.003Sample ID: graziani EpCam positivePanel: Acquisition Date: 27-Mar-04Gate: G1Gated Events: 4678Total Events: 10000
Quad Events % Gated % TotalUL 3 0.06 0.03UR 3 0.06 0.03LL 4070 87.00 40.70LR 602 12.87 6.02
25
PZ 11
La valutazione della elevata sensibilità della metodica FACS
testata, di fronte al relativo beneficio della tecnica di cell
enrichment ed all’allungamento dei tempi necessari per questo
ulteriore step, ha portato ad una modifica del progetto originale
della ricerca.
Abbiamo pertanto individuato nella sola metodica FACS , di uso
comune nei laboratori analisi e di rapida effettuazione, una
rapida soluzione non solo per la determinazione delle Cellule
Tumorali Circolanti, ma anche per la loro caratterizzazione,
tramite l’uso contemporaneo di marcatori epiteliali, quale
EpCAM e marcatori di importanza terapeutica e prognostica
quali EGFR nell’ adenocarcinoma del colon e HER-2/neu nel
carcinoma mammario.
I campioni successivi pertanto sono stati tutti separati tramite
Ficoll e congelati a -80°C così da effettuare in seguito tutte le
determinazioni.
Dai pazienti inizialmente arruolati nello studio sono stati studiati
22 campioni; molti sono stati esclusi per problemi nella raccolta
del sangue o per patologie ematologiche concomitanti che ne
limitavano l’utilizzo (es paziente 16).
In un secondo momento i campioni sono stati scongelati a T
ambiente in terreno di coltura (IMDM con 10% FBS e
antibiotico).
Sono state preparate per ogni campione le marcature per
analisi citofluorimetrica con anticorpi coniugati anti EpCAM-PE
(BD Biosciences), anti-HER-2/neu-FITC (BD Biosciences), anti
26
EGFR (Purified Mouse Anti-Human EGF Receptor ,BD
Biosciences) e anti CD45-PerCP(BD Biosciences).
Per ogni campione è stato preparato un controllo negativo (non
marcato) in modo da eliminare l’auto fluorescenza delle cellule
stesse.
Per assicurare un alta specificità degli anticorpi abbiamo
utilizzato solo anticorpi monoclonali.
Sono state quindi preparate 6 provette da 1 ml del paziente 2
(controllo inviato come negativo) e 3 tube da 1 ml per gli altri
pazienti: un’ auto fluorescenza, EpCAM, marker prognostico
specifico (HER-2/neu o EGFR) e tripla marcatura, secondo lo
schema sottostante.
auto fluorescenza Per tutti i campioni
HER-2/neu-FITC Per campioni K mammario
EpCAM-PE Per tutti i campioni
EGFR/Ig-FITC Per campioni K colon
EpCAM/HER-2/neu/CD45 Per campioni K mammario
EpCAM/EGFR/CD45 Per campioni K colon
Dopo un lavaggio con PBS 1X le cellule vengono marcate con
una miscela di anticorpi in una soluzione di PBS/BSA/NaN3 per
15 minuti al buio a 4°C.
27
Le concentrazioni utilizzate sono state le seguenti:
Anticorpo Diluizione
EpCAM 1:20
EGFR 1:20
HER-2/neu 1:20
CD45 1:20
Per EGFR, unico anticorpo non coniugato, dopo una prima
incubazione con il primario , i campioni sono stati posti in
incubazione con il secondario IgG-FITC in diluizione 1:50 per
15 minuti al buio a 4°C.
Dopo l’incubazione i campioni sono stati lavati in centrifuga con
PBS 1X a 1500 rpm per 5 minuti a 4°C; eliminato il
sovranatante alle provette sono stati aggiunti 500 microlitri di
soluzione FACSFlow.
I campioni così marcati sono stati analizzati con FACS Calibur,
considerando un range di analisi di 200.000 eventi per
consentire l’individuazione di una popolazione cellulare così
rara.
Abbiamo allestito il campione dell’auto fluorescenza come
ulteriore controllo negativo; facendo passare un campione non
marcato nel citofluorimetro la percentuale di eventi rilevata è
dovuta alla fluorescenza intrinseca delle cellule che viene
esclusa dalle analisi successive con i campioni marcati. Così
facendo, le letture seguenti sono effettivamente dovute alla
positività all’antigene analizzato (EpCAM, etc) e non al
background.
28
CAPITOLO QUATTRO
RISULTATI
Dal campione inizialmente selezionato di 50 pazienti affetti da
adenocarcinoma del colon-retto e carcinoma della mammella
sono stati studiati 15 pazienti affetti da adenocarcinoma del
colon-retto e 6 pazienti affette da carcinoma mammario.
La restante parte dei campioni raccolti sono stati esclusi dallo
studio per problemi relativi alla raccolta o all’erronea
conservazione del campione prima degli esperimenti.
Tutti i campioni sono stati mantenuti a temperatura ambiente
prima di procedere con la determinazione delle CTC e
comunque processati possibilmente sempre entro le 4 ore dal
prelievo.
Tra le neoplasie coliche 2 erano G1(13%), 12 G2 (80%) e 1 GX
(7%).
Tra le neoplasie mammarie 5 casi erano carcinomi duttali , 1
solo lobulare infiltrante. Di questi 3 erano G2 (50%) , 1 G1
(25%) ed 1 G3 (25%).
Non abbiamo inserito nello studio casi di patologia benigna e
preneoplastica mammaria né colica.
I dati clinici ed i risultati della citofluorimetria sono elencati in
Tabella 1.
Il controllo negativo inserito nello studio (paziente 2) ha
mostrato una elevata percentuale di Cellule Tumorali Circolanti
EpCAM+. Di fronte a questo dato discordante lo studio accurato
30
della storia clinica della paziente ha evidenziato che la paziente
un anno prima di essere inserita nello studio aveva subito un
intervento di colecistectomia per adenocarcinoma della
colecisti.
La determinazione di EGFR non è stata inclusa nei dati presi in
considerazione perché l’anticorpo non è risultato specifico,
marcando sia popolazione marcata per HER-2/neu che EpCAM
che CD45, come mostrato in Figura 4 ( 0,69 per EGFR/CD45,
0,02 per EpCAM/EGFR e 0,02 per EGFR/HER2/neu).
Inoltre tutti i pazienti affetti da adenocarcinoma del colon, dopo
un iniziale valutazione della reazione immunoistochimica per
EGFR, sono stati in seguito valutati per la presenza di
mutazione di KRAS; anche per questo motivo abbiamo escluso
la valutazione citofluorimetrica per EGFR dal nostro studio.
Vista la rarità delle cellule cercate abbiamo considerato nel
totale EpCAM tutte le popolazioni EpCAM+ e per HER-2/neu
tutte le popolazioni HER-2/neu+ ( Figura 3 ).
Da una prima osservazione si nota come la popolazione
EpCAM+/CD45+ sia sempre presente, in tutti i pazienti, con
percentuali variabili ma importanti.
La storia clinica dei pazienti è stata valutata, con particolare
attenzione ad eventuali terapie neoadiuvanti somministrate
prima dell’intervento e alle recidive note di malattia.
La correlazione tra marcatura per HER-2/neu e carcinoma della
mammella è mostrata in Tabella 2, insieme al dato
immunoistochimico per HER-2/neu.
Nel caso della paziente 16 la separazione tramite Ficoll è
risultata difficoltosa per la persistenza di globuli rossi nell’anello
31
di cellule anche dopo centrifugazione; nonostante diversi
tentativi per lisare la componente rossa il campione è rimasto
contaminato per cui è stato eliminato dallo studio .
Lo studio della cartella clinica della paziente ha evidenziato una
effettiva anomalia dell’emocromo, possibilmente causa
del’esclusione del campione dallo studio.
In Tabella 3 abbiamo mostrato la correlazione tra grado
istologico, TNM e percentuale di CTC EpCAM+ e recidive di
malattia.
In Figura 5 abbiamo correlato la dimensione della neoplasia,
espressa con il T del sistema TNM, e la percentuale di CTC
EpCAM+.
In Figura 6 abbiamo evidenziato l’effetto delle terapie
neoadiuvanti chemioterapiche effettuate dai pazienti sulla
percentuale di CTC EpCAM+.
32
CAPITOLO CINQUE
FIGURE E TABELLE
PZ SEDE DIAGNOSI G TNM INV. VASC EpCAMtotali
Her2/neu totali
EpCAM+CD45+
1 SI RETTO ADENOK G2 T3N1 NO 0,05 0 0.052 LA COLECI
STIADENOK G2 T2N0 SI 0,39 0 0,33
3 CE.A COLON ADENOK G2 T3N0 NO 0,04 0,03 0,024 NA COLON ADENOK G2 T3N0 NO 0,09 0,02 0,025 SE COLON ADENOK G1 T1N0 NO 0,02 0,10 0,056 CA MAMM LOBULAR
EG2 T2N0 NO 0,18 0,02 0,05
7 MA COLON ADENOK G2 YT2N0 NO 0,02 0 0,028 TR COLON ADENOK G2 YT3N0 NO 0,02 0,01 0,019 MA.A COLON ADENOK G2 T3N0 SI 0,02 0,01 0,0110 GF COLON ADENOK G2 T4N1M
1SI 0,04 0,08 0,02
11 GA COLON ADENOK G2 T3N0 NO 0,95 0 0,0612 IA MAMM DUTTALE G1 T1AN0 NO 0,04 0,03 0,0213 PMV MAMM DUTTALE G2 T1CN0 NO 0,05 0,02 0,0214 LOV COLON ADENOK G2 T3N0 NO 0,02 0 0,0115 GG COLON ADENOK G2 T3N0 NO 0,09 0,08 0,0416 B MAMM DUTTALE G2 T2N0 NO - -0 -17 RNS COLON ADENOK G2 T2N0 SI 0,21 0 0,118 SG MAMM DUTTALe G2 T1bN0 NO 0,42 0,01 0,219 BL COLON ADENOK GX YT0Nx NO 0,2 0 0,0720 AE COLON ADENOK G1 TISN0 NO 0,25 0 0,1521 GG COLON ADENOK G2 T2NX NO 0,23 0 0,0822 PN MAMM DUTTALE G3 T3N3B SI 0,06 0,02 0,03
Tabella 1
33
Figura 3
1 SI 3 CE.A
4 NA 5 SE 7 MA 8 TR 9 MA.A
10 GF 14 LO 15 G 17 RNS
19 BL 20 AE 21 GG0
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
colon
% ce
llule
pos
itive
6 CA 12 IA 13 P 18 SG 22 PN0
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
0.35
0.4
0.45
mammella
% ce
llule
pos
itive
34
Tabella 2 Correlazione HER-2/neu
PZ HER-2/neu
+
HER-2 HIC
6 0,02 NEGATIVO
12 0,03 POS 2+
13 0,02 NEGATIVO
18 0,01 NEGATIVO
22 0,02 NEGATIVO
Figura 4
35
PAZIENTE 1
PAZIENTE 1
PAZIENTE 1
Tabella 3 Correlazione tra percentuale CTC e recidiva di
malattia
PZ
G TNM EpCAM+
SEDE INTERVALLO
6 G2
T2N0 0,18 cute 12 mesi
17 G2
T2N0 0,21 omento 12 mesi
10 G2
T4N1M1
0,04 Fegato,uretere milza, stomaco duodeno
14 mesi
18 G2
T1bN0 0,42 fegato 36 mesi
12 G1
T1aN0 0,04 Mamm omolat
36 mesi
Figura 5 Correlazione T e % CTC
T0T0T1T1T1T1T2T2T2T2T3T3T3T3T3T3T3T3T4TX
1920
512
1318
26
721
13
48
914
1522
1017
0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 0.4 0.45
36
% cellule positive
Figura 6 Rapporto tra Terapia Neoadiuvante e % EpCAM+
YT2N0 YT3N0 YT0NX7 MA 8 TR 19 BL
00.020.040.060.08
0.10.120.140.160.18
0.2
% CTC EpCAM+
EpCAM
37
CAPITOLO SEI
DISCUSSIONE
Bloccare l’invasione tumorale e prevenire le metastasi è lo
scopo delle nuove terapie antitumorali, ma per raggiungere
questo obiettivo diventa fondamentale comprendere il
meccanismo tramite cui le cellule tumorali escono dalla
localizzazione primaria, entrano nella circolazione sanguigna e
si stabiliscono come lesioni a distanza in organi come polmoni,
fegato, cervello e midollo osseo.
Le cellule tumorali identificate in transito nella circolazione
sanguigna sono definite Cellule Tumorali Circolanti (Circulating
Tumor Cells); si ritiene che una frazione di queste cellule siano
cellule tumorali in grado di iniziare una lesione clonale
metastatica. Le CTC sono estremamente rare: si considera
circa una CTC per miliardo di cellule nucleate del sangue
(polimorfonucleate, linfociti, etc) nei pazienti con neoplasia
avanzata .
Queste Cellule Tumorali Circolanti potrebbero essere utilizzate
come monitoraggio non invasivo di sensibilità o resistenza alla
terapia, oltre a consentire una selezione dei pazienti che
necessitano una precoce terapia antitumorale sistemica.
L’dentificazione delle Cellule Tumorali Circolanti nei pazienti
neoplastici potrebbe inoltre essere un fattore prognostico
indipendente dal sistema TNM, in grado di selezionare pazienti
con maggior rischio di recidive e metastasi.
38
L’obiettivo del nostro studio è stato individuare una metodica
accessibile per costo e ripetibile per individuare Cellule
Tumorali Circolanti nel sangue periferico di pazienti affetti da
carcinoma mammario ed adenocarcinoma del colon-retto in
stadio localizzato ed avere contemporaneamente a
disposizione informazioni prognostiche utili per il trattamento dei
pazienti stessi come lo stato di HER-2/neu nel carcinoma
mammario ed EGFR nell’adenocarcinoma colico.
Nel nostro studio inoltre abbiamo preso in considerazione le
correlazioni tra presenza di CTC nel sangue periferico e fattori
prognostici noti come stadio (TNM), invasione vascolare ed
interessamento linfonodale.
Il nostro studio ha dimostrato che le Cellule Tumorali Circolanti
sono individuabili tramite FACS (Fluorescence Activated Cell
Sorting), una tecnica di facile utilizzo ed accesso, nel sangue
periferico di pazienti affetti da neoplasie di colon e mammella.
Questo tipo di analisi può essere effettuata anche su residuo
ematico, cioè con lo stesso campione prelevato per i normali
esami ematochimici nei pazienti prima di essere operati, con un
quantitativo minimo di 3 ml.
Questo consentirebbe anche di effettuare controlli nei pazienti
oncologici a distanza dall’intervento, in contemporanea con la
valutazione dei markers tumorali già codificati.
I pazienti oncologici arruolati nel nostro studio presentavano
tutti percentuali di CTC EpCAM+ variabile da 0,02 e 0,95.
Il notevole incremento della positività alle Cellule Tumorali
Circolanti rilevata è spiegabile con i notevoli aggiustamenti
tecnici apportati durante gli esperimenti; da un primo
39
congelamento in due provette nel corso dello studio abbiamo
deciso di congelare una sola provetta dopo Ficoll, cosi’ da
concentrare le cellule tumorali circolanti eventualmente
presenti, vista la loro rarità (pazienti 17-18-19-20 e 21).
Nonostante la limitazione legata al basso numero di casi nel
nostro studio pazienti con valori elevati di Cellule Tumorali
Circolanti sono andati incontro a recidiva di malattia durante il
follow up.
In questi casi altri fattori prognostici già affermati quali grado
istologico, interessamento linfonodale e stadio di malattia non
indicavano una maggior possibilità di recidiva di malattia.
Solo in due pazienti (paziente 10 e paziente 17) l’esame
istologico indicava la presenza di invasione linfovascolare
seppure in assenza di metastasi linfonodali.
Il dato che la presenza di Cellule Tumorali Circolanti nel sangue
periferico dei pazienti non correla con la massa tumorale (T nel
TNM evidenziato in Figura 5) potrebbe indicare che la loro
presenza non dipende dalla grandezza della neoplasia bensì da
alcune peculiari caratteristiche della specifica neoplasia quali
invasività e vascolarizzazione tumorale, che sono fattori
prognostici a sè stanti.
Nella nostra casistica inoltre si è evidenziato come pazienti
sottoposti a chemioterapia neoadiuvante preoperatoria
presentavano percentuale di Cellule Tumorali Circolanti bassa,
tra 0,02 e 0,2, valori più bassi dell’intera popolazione studiata.
Questo dato concorda con quanto riportato in letteratura, come
cioè la quantificazione delle Cellule Tumorali Circolanti sia utile
nel monitoraggio della terapia adiuvante, in quanto le Cellule
40
Tumorali Circolanti rispondono alla terapia quanto il tumore
primitivo (64).
Nessuno dei pazienti sottoposti a terapia neoadiuvante ha
sviluppato recidive nel periodo di follow up.
Questo conferma il risultato di alcuni studi analitici in cui
comparando stato linfonodale, espressione dei recettori
ormonali , valori iniziali di CTC e valori di CTC dopo terapia, la
percentuale delle Cellule Tumorali Circolanti dopo il trattamento
terapeutico è risultato essere il fattore predittivo indipendente
più importante di recidiva precoce di malattia.
Per quanto riguarda i markers prognostici presi in esame EGFR
non è stata incluso nei dati presi in considerazione perché
l’anticorpo non è risultato specifico ed inoltre tutti i pazienti
affetti da adenocarcinoma del colon, dopo un iniziale
valutazione della reazione immunoistochimica per EGFR, sono
stati in seguito valutati per la presenza di mutazione di KRAS
per essere indirizzati alla terapia con Cetuximab.
Non sono al momento disponibili anticorpi per KRAS utilizzabili
in tecnica FACS né per immunoistochimica.
HER2 è una proteina transmenbrana , con funzioni di ligando
per fattori di crescita tirosinchinasici, codificata da un
protoncogene localizzato sul cromosoma 17q21. Questo
protoncogene è amplificato o iperespresso in circa il 20-25% dei
carcinomi della mammella. Una positività per HER-2/neu è stata
correlata con un comportamento più aggressivo della neoplasia
e maggiore resistenza alla terapia citotossica ed endocrina.
Le pazienti con positività alla proteina cerbB2 (prodotto del
gene HER-2/neu) sono eleggibili al trattamento con un
41
anticorpo monoclonale trastuzumab (Herceptin), che inibisce la
proliferazione neoplastica e aumenta la chemio sensibilità.
L’anticorpo anti HER-2/neu nel nostro studio è risultato positivo
nel 40% (6 su 15) dei casi di adenocarcinoma del colon e nel
100% (5 su 5)dei casi di carcinoma mammario.
In 4 dei 5 casi studiati la valutazione immunoistochimica per
HER-2/neu è risultata negativa.
Questo dato potrebbe indicare come durante la progressione di
malattia lo status di HER-2/neu nelle Cellule Tumorali Circolanti
cambi da negativo a positivo; è stato già dimostrato in
letteratura come tra localizzazione primaria e metastasi lo
status di HER-2/neu cambi (65,66,67).
Considerato inoltre il lungo intervallo di latenza del carcinoma
della mammella la determinazione dello status di HER-2/neu
nelle Cellule Tumorali Circolanti nelle pazienti in corso di
trattamento o di recidiva potrebbe aiutare ad identificare le
pazienti da indirizzare alla terapia con Trastuzumab, anche nei
casi in cui non è possibile valutare l’eventuale positività tramite
immunoistochimica.
Come nei lavori effettuati con altre metodiche di cell sorting
(CellSearch system) presenti in letteratura, si è evidenziata una
popolazione EpCAM+/CD45+, che potrebbe spiegare come le
CTC sfuggono alla risposta immunitaria del paziente.
Questa popolazione, nel nostro studio come in altri, potrebbe
essere legata ad un meccanismo, studiato ampiamente sui
modelli murini ma non ancora nei modelli umani, definito
trasformazione epiteliale - mesenchimale delle Cellule Tumorali
Circolanti.
42
La capacità delle Cellule Tumorali Circolanti di acquisire
caratteristiche del tipo “stem cell” potrebbe spiegare la loro
capacità di migrazione e la loro resistenza alla terapia
oncologica (10,11).
Alcuni studi incentrati sulla relazione tra Cellule Tumorali
Circolanti e metastasi a distanza suggeriscono che la
trasformazione mesenchimale aumenti la capacità di queste
cellule di entrare nel circolo sanguigno ma riduce la loro
capacità di iniziare metastasi (12,13).
L’utilizzo della tecnica FACS consente di studiare diversi fattori
contemporaneamente, quindi permettendo una marcatura
specifica della popolazione EpCAM+/CD45+ con markers
staminali noti quali CD34, CD133 e CK19
Uno studio più accurato di questa popolazione potrebbe
mettere in chiaro come le Cellule Tumorali Circolanti non
vengono riconosciute dal sistema immunitario dei pazienti e
acquisiscono particolari affinità per i tessuti, aiutandoci ad
individuare nuovi target terapeutici per bloccare il processo
metastatico.
43
CAPITOLO SETTE
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