FACOLTÀ DI MEDICINA E CHIRURGIA

DOTTORATO DI RICERCA IN TECNOLOGIE

AVANZATE IN CHIRURGIA

CURRICULUM C CHIRURGIA

RESPONSABILE PROF A. BOLOGNESE

XXIII CICLO

SIGNIFICATO PROGNOSTICO DELLE CELLULE TUMORALI CIRCOLANTI (CTC) NELLE NEOPLASIE SOLIDE DI

COLON E MAMMELLA

Dottorando Relatore

Dott.ssa Francesca Ricci Prof. P.L. Mingazzini

Anno accademico 2010/2011

INDICE

CAPITOLO UNO 4

1 INTRODUZIONE SULLE CELLULE TUMORALI CIRCOLANTI 4

1.1 IDENTIFICAZIONE DELLE CELLULE TUMORALI CIRCOLANTI BASATA SU ACIDI NUCLEICI (DNA E RNA) 7

1.2 IDENTIFICAZIONE DELLE CELLULE TUMORALI CIRCOLANTI SULLA BASE DELLE CARATTERISTICHE FISICHE 9

1.3 IDENTIFICAZIONE DELLE CELLULE TUMORALI CIRCOLANTI TRAMITE ANTICORPI CONTRO ANTIGENI DI SUPERFICIE 10

2 LE CELLULE TUMORALI CIRCOLANTI NEL CARCINOMA DELLA MAMMELLA 13

3 LE CELLULE TUMORALI CIRCOLANTI NELL’ADENOCARCINOMA DEL COLON-RETTO 16

CAPITOLO DUE 20

SCOPO DELLA RICERCA

CAPITOLO TRE 22

MATERIALI E METODI

2

CAPITOLO QUATTRO 30

RISULTATI

CAPITOLO CINQUE 33

FIGURE E TABELLE

CAPITOLO SEI 38

DISCUSSIONE

CAPITOLO SETTE 44

BIBLIOGRAFIA

3

CAPITOLO UNO

1 INTRODUZIONE SULLE CELLULE TUMORALI CIRCOLANTI

Le metastasi sono la prima causa di morte nei pazienti

oncologici.

Bloccare l’invasione tumorale e prevenire le metastasi è lo

scopo delle nuove terapie antitumorali, ma per raggiungere

questo obiettivo è fondamentale comprendere il meccanismo

tramite cui le cellule tumorali escono dalla localizzazione

primaria, entrano nella circolazione sanguigna e si stabiliscono

come lesioni a distanza in organi come polmoni, fegato, cervello

e midollo osseo.

Le cellule tumorali identificate in transito nella circolazione

sanguigna sono definite Cellule Tumorali Circolanti (Circulating

Tumor Cells). Sebbene la loro natura non sia ben conosciuta,

si ritiene che una frazione di queste cellule siano cellule

tumorali in grado di iniziare una lesione clonale metastatica.

La rilevazione di queste Cellule Tumorali Circolanti nella

circolazione sanguigna dei pazienti anni prima dell’inizio della

malattia metastatica potrebbe portare all’uso delle Cellule

Tumorali Circolanti come monitoraggio non invasivo di

sensibilità o resistenza alla terapia, oltre a consentire una

selezione dei pazienti che necessitano una precoce terapia

antitumorale sistemica.

4

Inoltre la caratterizzazione morfologica delle Cellule Tumorali

Circolanti potrebbe aiutare ad identificare nuovi target

terapeutici per bloccare il processo metastatico.

La disseminazione delle Cellule Tumorali Circolanti, però, non è

rilevata neanche dalle tecniche d’imaging più avanzate.

Le CTC sono estremamente rare: si considera circa una CTC

per miliardo di cellule nucleate del sangue (polimorfonucleate,

linfociti, etc) nei pazienti con neoplasia avanzata (1).

La nostra conoscenza delle loro proprietà biologiche è stata

quindi limitata dalla difficoltà di sviluppare tecniche in grado di

isolarle in numero sufficiente e in condizioni compatibili con

l’effettuazione di successivi studi molecolari e funzionali.

Una migliore comprensione dell’identità precisa delle Cellule

Tumorali Circolanti e dei fattori che le rendono capaci di entrare

nel circolo sanguigno sarebbe fondamentale per capire la

chiave del processo metastatico e creare nuovi approcci

terapeutici mirati a bloccarlo.

Per molto tempo le nostre conoscenze sul processo metastatico

delle neoplasie si sono basate su modelli murini, alcuni dei quali

ci hanno fornito importanti dati sulle Cellule Tumorali Circolanti.

Numerosi studi hanno per esempio messo in luce la capacità

delle Cellule Tumorali Circolanti, identificate in modelli di

trapianto di carcinoma prostatico, di attivare un pathway in

grado di dar loro resistenza all’apoptosi (2,3,4).

Nonostante questi studi murini offrano dati interessanti sul

meccanismo metastatico, hanno purtroppo alcune limitazioni: i

modelli murini con l’utilizzo di linee cellulari neoplastiche umane

infatti non riescono a ricapitolare la complessa relazione con la

5

vascolatura ed il microambiente circostante presente nelle

neoplasie endogene, né vi riesce l’iniezione di linee cellulari

tumorali nella vena della coda dei topi.

D’altra parte molti esperimenti effettuati su linee cellulari di

neoplasie endogene murine hanno messo in luce come queste

metastatizzano tardi, se metastatizzano.

Per questo motivo, seppur istruttivi, i dati forniti da questi

modelli sperimentali devono essere validati da studi effettuati su

neoplasie umane.

Sebbene la prima scoperta di Cellule Tumorali Circolanti in un

paziente con neoplasia avanzata risalga al 1869, quando

Ashworth descrisse la presenza di Cellule Tumorali Circolanti

durante l’autopsia di un paziente deceduto per malattia

metastatica, ancora oggi le nostre conoscenze sono limitate

(14).

In assenza di una tecnica riconosciuta come gold standard per

identificarle, lo scopo ultimo della ricerca sulle Cellule Tumorali

Circolanti negli ultimi anni è stato quello di isolarle

efficacemente, vitali ed intatte, dal sangue periferico, con una

specificità tale da distinguerle facilmente dal vasto numero di

cellule del sangue che le circondano.

6

1.1 Identificazione delle Cellule Tumorali Circolanti basata su acidi nucleici (DNA e RNA)

In letteratura è stato descritto come nel sangue di pazienti

neoplastici siano presenti DNA libero e, in minor misura, RNA

libero (15,16,17,18).

Alcuni autori hanno suggerito un legame tra la presenza di

Cellule Tumorali Circolanti e la rilevazione di DNA libero di

derivazione tumorale nel siero-plasma di pazienti con

carcinoma prostatico (19,20).

L’origine di questi acidi nucleici però può anche essere legata

alla presenza di cellule necrotiche eliminate dalla neoplasia, di

frammenti cellulari o alla lisi di Cellule Tumorali Circolanti.

Alcuni studi hanno isolato acidi nucleici direttamente dal plasma

(15,18), mentre altri hanno prima purificato dal sangue cellule

nucleate per poi lisarle ed estrarne gli acidi nucleici. L’analisi

molecolare del DNA così estratto ha mostrato punti di

traslocazione tumore-specifici in seguito sequenziati (21,22).

Purtroppo però studi di questo tipo necessitano di grandi

quantità di sangue.

Inoltre in caso di esito negativo di questi test in pazienti

oncologici la negatività può essere legata sia ad una quantità

insufficiente di DNA di derivazione tumorale rilevato nel sangue

sia alla mancanza della specifica anormalità molecolare presa

in considerazione nel singolo paziente.

A livello di RNA sono state utilizzate tecniche di RT-PCR sia su

acidi nucleici non purificati liberi nel plasma sia su RNA estratto

7

da Cellule Tumorali Circolanti identificate nel sangue dopo

tecniche di enrichment.

Noti markers tumorali sono stati identificati da numerosi autori

(23,24,25,26,27,28), quali PSA, HER-2, CEA; tuttavia l’ alta

frequenza di falsi positivi e falsi negativi nei risultati della RT-

PCR e la difficoltà nel quantificare i livelli di espressione di

questi markers senza una precedente purificazione delle rare

Cellule Tumorali Circolanti rendono queste tecniche non

adeguate per un uso diagnostico routinario (29,30).

8

1.2 Identificazione delle Cellule Tumorali Circolanti sulla base delle caratteristiche fisiche

Le Cellule Tumorali Circolanti presentano numerose

caratteristiche fisiche differenti dalle cellule nucleate del

sangue: sono più grandi dei polimorfonucleati (almeno 4x4

μm2), e sono diverse per densità, carica, proprietà di migrazione

ed altre specifiche proprietà ( es presenza di granuli

melanocitari nelle Cellule Tumorali Circolanti di pazienti affetti

da melanoma).

Le importanti differenze nella densità cellulare sono state usate

per separarle dalle emazie nel sangue periferico tramite

gradiente di densità, anche se le Cellule Tumorali Circolanti

sono una minima frazione delle cellule mononucleate in

circolazione (31,32,33,34).

Le differenze nella taglia sono invece state usate in tecniche di

selezione tramite filtrazione (35,36) ma, nonostante le Cellule

Tumorali Circolanti siano più grandi dei leucociti, presentano

variazioni notevoli di taglia le une dalle altre (37).

Metodi basati sul passaggio di sangue attraverso filtri e

membrane porose sono stati testati (38,39), ma solo su

campioni di linee cellulari diluite nel sangue, non su campioni di

sangue periferico prelevato da pazienti neoplastici.

9

1.3 Identificazione delle Cellule Tumorali Circolanti tramite anticorpi contro antigeni di superficie

Il metodo più validato sino ad oggi si basa su tecniche di

isolamento cellulare basate sulla cattura tramite anticorpi per

specifici antigeni di superficie epiteliali delle Cellule Tumorali

Circolanti, usando antigeni normalmente non espressi nei

leucociti.

Tra questi EpCAM ( Epithelial Cell Adhesion Molecule) è

l’anticorpo più usato per la sua universale espressione nelle

cellule di origine epiteliale e la sua assenza nelle cellule

nucleate del sangue di origine leucocitaria.

L’utilizzo di anticorpi anti EpCAM coniugati con biglie

magnetiche seguito da una purificazione delle cellule catturate

attraverso un campo magnetico è alla base del CellSearch

System (Veridex). Questo strumento, approvato dalla FDA e

utilizzato in USA, utilizza biglie ferrose caricate con anticorpo

anti EpCAM per catturare le Cellule Tumorali Circolanti, che

vengono in seguito colorate con un cocktail di anticorpi

anticitocheratine quali CK8, CK18, CK19 (40).

La colorazione per il marker leucocitario comune CD45 viene

usato come controllo per escludere i leucociti .

Nonostante CellSearch sia il metodo più standardizzato tra

quelli proposti negli ultimi anni e sia attualmente impiegato in

diversi studi clinici sul ruolo delle Cellule Tumorali Circolanti

come marker prognostico nelle neoplasie solide, solo una

porzione dei pazienti con neoplasia metastatica presenta

10

positività per CTC con un valore di circa di 1 CTC per ml di

sangue e una bassa purezza delle CTC identificate (41,42).

Le Cellule Tumorali Circolanti sono state riscontrate nella

maggior parte delle neoplasie epiteliali, come quelle di

mammella, colon, prostata e polmone.

Secondo la tecnica utilizzata, diversi autori hanno dimostrato

che nel 50-100% dei pazienti con neoplasia metastatica di

prostata e mammella si possono identificare Cellule Tumorali

Circolanti nel sangue periferico, anche se la percentuale, negli

stessi pazienti, di malattia metastatica clinicamente evidente va

dal 10 al 60%.

Nonostante ciò la rilevanza prognostica della presenza delle

Cellule Tumorali Circolanti nel sangue periferico di pazienti in

stadio precoce, senza malattia clinicamente metastatica è

ancora da definirsi.

Diversi lavori hanno evidenziato che la presenza di 5 o più

Cellule Tumorali Circolanti per 7.5 ml di sangue prima

dell’inizio di una terapia antitumorale sistemica si associa ad un

minore intervallo libero da malattia e ad una peggiore

sopravvivenza ( 43,44,45) .

Prendendo in considerazione l’utilizzo delle Cellule Tumorali

Circolanti come indicazione alla terapia antitumorale, va

sottolineato come l’eterogeneità delle Cellule Tumorali

Circolanti sia marcata, sia nell’espressione di recettori per fattori

di crescita, proteasi, molecole di adesione e HLA, sia per la

presenza di specifiche aberrazioni citogenetiche; alcuni studi

hanno dimostrato addirittura una differente espressione di

11

alcune molecole tra tumore primitivo e Cellule Tumorali

Circolanti,come ad esempio p53.

Nonostante la significativa percentuale di pazienti metastatici

con Cellule Tumorali Circolanti nel sangue in realtà queste sono

state identificate anche nel sangue periferico di pazienti con

neoplasia localizzata.

Il ruolo delle Cellule Tumorali Circolanti nella fase precoce della

malattia neoplastica è obiettivo principale del nostro studio.

12

2 LE CELLULE TUMORALI CIRCOLANTI NEL CARCINOMA DELLA MAMMELLA

Le neoplasie solide della mammella sono la causa più

frequente di morte per le donne nei paesi sviluppati. Nonostante

negli anni la diagnosi precoce, la chirurgia precisa con margini

di exeresi ampi negativi e la terapia adiuvante abbiano

migliorato la prognosi di queste patologie, le recidive sono

frequenti, con esito fatale nel caso di malattia metastatica. Fino

a questo momento nessuno strumento è in grado di monitorare

l’effetto della terapia adiuvante nel carcinoma della mammella,

ad eccezione di studi statistici sulla frequenza delle recidive. La

capacità predittiva di questi studi purtroppo applicata al singolo

paziente è inefficace.

È da tempo noto che le neoplasie solide possono disseminare

cellule nel sangue periferico, che, anche dopo resezione

completa della neoplasia, possono portare a metastasi.

L’identificazione di queste Cellule Tumorali Circolanti in pazienti

con neoplasia localizzata o metastatica della mammella è

oggetto di numerosi studi in letteratura.

Studi sperimentali su modelli murini di carcinoma mammario

hanno dimostrato che cellule tumorali disseminate al midollo

osseo (DTC) possono essere identificate nelle fasi premaligne

del carcinoma mammario, suggerendo una diffusione precoce

ad organi distanti (9).

Studi clinici hanno dimostrato una correlazione significativa fra

la presenza di DTC nel midollo osseo e l’insorgenza di

13

metastasi, suggerendo che le cellule da cui originano le

metastasi (metastatic stem cells) siano tra le DTC (7).

Per il carcinoma della mammella, in cui molti dati sono stati

raccolti , tuttavia solo la metà delle pazienti neoplastiche con

positività per DTC o CTC vanno incontro a metastasi, mentre le

altre presentano un intervallo libero da malattia metastatica per

oltre 10 anni di follow up (8).

Questi dati sono congruenti con i dati forniti da modelli animali e

suggeriscono che una parte significativa delle pazienti positive

per Cellule Tumorali Circolanti non svilupperà mai una

metastasi.

L’ipotesi formulata è stata quella della latenza o “quiescienza”

delle Cellule Tumorali Circolanti nel carcinoma mammario, ma

fino a questo momento poco si sa sulle condizioni richieste per

la progressione da “dormiente” o latente, sull’equilibrio tra

replicazione tumorale e morte cellulare. Alcuni studiosi

ritengono che mutazioni ulteriori o stimoli dal microambiente

circostante possano modificare questo equilibrio, portando le

Cellule Tumorali Circolanti dormienti ad attivarsi e dare inizio al

processo metastatico.

La maggior parte dei pazienti affetti da neoplasia mammaria

presentano Cellule Tumorali Circolanti che esprimono e

secernono CK19, marker da poco considerato come putativo

delle cellule staminali. Questo ha fatto ipotizzare che una parte

delle Cellule Tumorali Circolanti presenti nei pazienti in fase

precoce di neoplasia possano considerarsi cellule staminali

putative, non replicanti in situ, e resistenti alla chemioterapia; da

14

queste constatazioni si è sviluppata la teoria delle “cancer stem

cells” o cellule tumorali staminali.

Oltre a studi sulla loro effettiva presenza negli ultimi anni la

ricerca si è soffermata sulle indicazioni terapeutiche che si

possono trarre dalle Cellule Tumorali Circolanti.

Diversi studi evidenziano come nel carcinoma mammario

metastatico un alto numero di Cellule Tumorali Circolanti nel

sangue comporti una prognosi peggiore (43,44).

Nonostante si consideri che una terapia adiuvante aggressiva

possa comportare una sopravvivenza maggiore in queste

pazienti, in realtà mancano statistiche adeguate. Nell’utilizzo

della terapia adiuvante la terapia viene somministrata allo

scopo di eliminare la malattia minima residua a livello sistemico,

ma nonostante si ritenga che questo tipo di protocollo migliori la

sopravvivenza, fino ad oggi non è possibile per una singola

paziente predire se trarrà beneficio dalla terapia o no.

Diversi studi hanno valutato lo stato di HER-2/neu nelle pazienti

con neoplasia mammaria localmente avanzata in corso di

terapia neoadiuvante (33,46); nonostante siano stati processati

fino a 50 ml di sangue Cellule Tumorali Circolanti sono state

identificate solo in metà delle pazienti, con un numero di

CTC/HER-2/neu + variabile da 1 a 8 per 50 ml.

Altri studi hanno evidenziato come il numero di Cellule Tumorali

Circolanti pretrattamento (baseline) in differenti pazienti non

correla bene con fattori prognostici già standardizzati quali la

massa tumorale o la presenza di marker specifici sierici (48).

15

3 LE CELLULE TUMORALI CIRCOLANTI NELL’ADENOCARCINOMA DEL COLON-RETTO

L’adenocarcinoma del colon retto è una delle patologie

neoplastiche più diffuse; ogni anno nel mondo vengono

diagnosticati un milione di nuovi casi e circa 500.000 decessi

per questa patologia. Sebbene siano stati fatti notevoli passi

avanti nella terapia dell’ adenocarcinoma del colon-retto, nel

caso della malattia metastatica la prognosi rimane pessima, con

una sopravvivenza a 5 anni minore del 10%.

L’identificazione di Cellule Tumorali Circolanti nel sangue

periferico di pazienti affetti da adenocarcinoma del colon-retto è

stata riportata per la prima volta circa 40 anni fa (49).

Recenti studi hanno utilizzato la RT-PCR per identificare mRNA

codificante per proteine associate alla neoplasia come CEA

(Carcinoembryonic Antigen), CK 20 e CD44 ( 50,51,52).

Questi studi hanno permesso di isolare Cellule Tumorali

Circolanti con una sensibilità in vitro di circa 1 CTC per 107

polimorfonucleati del sangue.

Studi clinici basati sulla RT-PCR suggeriscono che le Cellule

Tumorali Circolanti sono presenti nella circolazione della

maggior parte dei pazienti affetti da adenocarcinoma del colon-

retto (53,54).

Le Cellule Tumorali Circolanti possono fornire una fonte

relativamente non invasiva e ripetibile di informazioni

genotipiche che possono influenzare il trattamento e la prognosi

per questi pazienti.

16

La gestione del paziente oncologico con malattia metastatica

del colon-retto è cambiata significativamente negli ultimi 5 anni,

con una sopravvivenza totale passata da 12 a 24 mesi.

Questo cambiamento notevole è dovuto principalmente

all’introduzione di nuovi farmaci chemioterapici, quali il

Cetuximab, che presenta un’ attività antitumorale sinergica

quando utilizzato in un protocollo chemioterapico a base di

irinotecan-oxaliplatin.

Il Cetuximab è un anticorpo ricombinante umano/murino (mAb)

che si lega al dominio extracellulare di EGFR (Epidermal

Growth Factor Receptor), ma ad oggi, a differenza di altre

molecole (es C-KIT nei Tumori Stromali Gastrointestinali) la

valutazione della sensibilità alla terapia tramite reazione

immunoistochimica con anticorpo anti EGFR manca di valore

predittivo.

Diversi studi hanno messo in luce come la mutazione di K-RAS

sia un evento comune in molte neoplasie solide umane,

soprattutto nel carcinoma del colon-retto.

Proprio la presenza di una mutazione di KRAS nei pazienti

affetti da adenocarcinoma del colon-retto si è ipotizzato essere

alla base della non risposta alla terapia con cetuximab.

Studi precedenti hanno mostrato che i pazienti con malattia

metastastica del colon-retto che presentano mutazione di KRAS

non traggono beneficio alla terapia con mAb anti EGFR, mentre

pazienti che presentano KRAS wild type traggono beneficio

dalla terapia a base di cetuximab .

17

Considerando gli effetti collaterali ed il costo di queste terapie

sarebbe opportuno selezionare i pazienti prima di iniziare un

trattamento con questi farmaci.

Attualmente la sensibilità alla terapia viene testata con

sequenziamento del gene effettuato dopo amplificazione di

DNA tumorale estratto dalla inclusione in paraffina, metodica

non accessibile a tutti i centri diagnostici e di complessa

esecuzione .

La letteratura però riporta che pazienti con KRAS wild type

presentano una risposta obiettiva alla terapia in circa il 59-61%

dei casi contro un 43-33% di risposta obiettiva nei pazienti non

selezionati.

Alcuni studi hanno dimostrato come alcuni pazienti possano

mostrare discordanza tra tumore primitivo e metastasi a

distanza nella mutazione di KRAS (62,63); in questi studi la

concordanza dello status di KRAS tra tumore primitivo e

metastasi è circa del 77% .

Se la valutazione dello stato di KRAS può quindi essere fatta

sia su tumore primitivo che su metastasi a distanza nei pazienti

giunti alla diagnosi già in malattia avanzata, questa discordanza

non rende possibile una selezione dei pazienti quando ancora

in stadio localizzato o localmente avanzato.

Per questo motivo la valutazione dello stato di KRAS nelle

Cellule Tumorali Circolanti dei pazienti con adenocarcinoma del

colon-retto potrebbe avere un importante applicazione clinica

nella selezione dei pazienti da avviare alla terapia con

cetuximab.

18

Altre mutazioni note legate all’adenocarcinoma del colon-retto

sono state prese in considerazione, come la presenza della

proteina p53, la cui perdita si associa ad una ridotta sensibilità

alla chemioterapia e alla radioterapia ed ad una sopravvivenza

minore per i pazienti (55,56,57,58).

La perdita di funzione della proteina p53 wild type dipende da

mutazioni collocate nei domini più conservati del gene (59), che

vengono identificate con tecniche di sequenziamento del gene.

Questi studi hanno dimostrato una congruenza di mutazioni

della proteina p53 tra tumore primitivo, metastasi e CTC ,

indicando come un clone selezionato di cellule tumorali sia in

grado di disseminarsi e metastatizzare a distanza (60).

Una correlazione tra numero delle Cellule Tumorali Circolanti

(baseline) e prognosi clinica peggiore è stata inoltre riportata in

letteratura per pazienti affetti da adenocarcinoma del colon-retto

(47).

19

CAPITOLO DUE

SCOPO DELLA RICERCA

La caratterizzazione delle Cellule Tumorali Circolanti potrebbe

fornire importanti informazioni sul potenziale metastatico di una

neoplasia e sulla sensibilità alla terapia.

Conoscere il fenotipo di queste cellule e le loro proprietà

potrebbe rendere possibile una stratificazione in gruppi dei

pazienti sulla base del beneficio di terapie particolari in un

momento in cui la terapia oncologica si avvale di farmaci nuovi

e specifici ( es Herceptin nel carcinoma mammario e Cetuximab

nell’adenocarcinoma del colon-retto).

L’identificazione delle Cellule Tumorali Circolanti nei pazienti

neoplastici come esame routinario potrebbe essere un fattore

prognostico indipendente dal sistema TNM, in grado di

selezionare pazienti con maggior rischio di recidive e metastasi.

La valutazione di alcuni markers specifici sulle Cellule Tumorali

Circolanti potrebbe inoltre rendere possibile un monitoraggio

dell’efficienza della terapia oncologica.

Le esistenti tecnologie per l’isolamento delle Cellule Tumorali

Circolanti, basate su varie proprietà delle Cellule Tumorali

Circolanti e ciascuna con una specifica limitazione, non

consentono al momento una ricerca routinaria nel sangue dei

pazienti neoplastici.

L’elevata quantità di sangue richiesta utilizzando alcune

tecniche per l’isolamento delle Cellule Tumorali Circolanti prima

20

dell’intervento chirurgico mal si coniuga infatti con le condizioni

generali di pazienti oncologici spesso in età avanzata e con

problemi clinici coesistenti.

Il nostro studio si propone di individuare una metodica

accessibile per costo e ripetibile per individuare Cellule

Tumorali Circolanti nel sangue periferico di pazienti affetti da

carcinoma mammario ed adenocarcinoma del colon-retto in

stadio localizzato ed avere contemporaneamente a

disposizione informazioni prognostiche utili per il trattamento dei

pazienti stessi come lo stato di HER-2/neu nel carcinoma

mammario ed EGFR nell’ adenocarcinoma del colon-retto.

Nel nostro studio abbiamo inoltre preso in considerazione la

correlazione tra presenza di CTC nel sangue periferico e fattori

prognostici noti come stadio (TNM), invasione vascolare ed

interessamento linfonodale.

21

CAPITOLO TRE

MATERIALI E METODI

Campioni di sangue periferico, da 3 a 7 ml, di pazienti in attesa

di essere operati per neoplasie solide di colon e mammella nel

Reparto di Chirurgia Oncologica presso il Dipartimento di

Chirurgia Pietro Valdoni, Università di Roma “La Sapienza”

sono stati raccolti in provetta con sodio-EDTA.

Pazienti in attesa di essere operati per patologie non

neoplastiche sono stati arruolati come controllo negativo per il

nostro studio.

Il sangue così ottenuto è stato trasportato presso il Gene

Expression Laboratory dell’Istituto Nazionale per le Malattie

Infettive “Lazzaro Spallanzani”.

Presso questo Laboratorio la frazione di cellule mononucleate

dei campioni di sangue è stata isolata mediante gradiente di

separazione Ficoll: ogni campione di sangue è stato aggiunto

ad una provetta con filtro contenente Ficoll in rapporto 1:1 e le

provette così preparate sono state centrifugate a 1800 rpm a 25

°C senza freno per 10 minuti .

Dopo la centrifugazione le cellule mononucleate, racchiuse in

un anello ben evidente sopra il filtro (Figura 1), sono state

aspirate con pipetta sterile e successivamente lavate con PBS

in rapporto 1:1 tramite due successivi cicli di centrifugazione

(1500 rpm per 5 minuti) eliminando ogni volta il sovranatante.

22

Il pellet di cellule così ottenuto è stato poi congelato a -80°C in

2 provette contenenti soluzione di congelamento (90% siero

bovino + 10%DMSO), in modo da ottenere circa 10 milioni di

cellule per provetta.

Le cellule sono state successivamente contate al microscopio

mediante soluzione Tripan Blue per escludere cellule morte.

Mediamente, come nel caso del paziente 11, sono state ottenuti

8-10 milioni di cellule a campione.

Allo scopo di testare la metodica di cell sorting tramite beads

magnetiche le cellule mononucleate sono state sottoposte ad

arricchimento della componente epiteliale mediante selezione

positiva con l’anticorpo anti EpCAM (MACS CD326(EpCAM)

Microbeads, Miltenyi).

Dopo la conta le cellule sono state sospese in 300 microlitri di

MACS buffer, a cui abbiamo aggiunto una quantità di biglie

magnetiche marcate con EpCAM adeguate alle cellule presenti

nella provetta (16 microlitri di biglie) ed incubate a 4°C al buio

insieme al Fcr Blocking Buffer.

Finita l’incubazione abbiamo aggiunto 0,5 ml di buffer e

centrifugato il campione a 1500 rpm per 10 minuti a 4°C.

23

Eliminato il sovranatante il pellet è stato risospeso in 1 ml di

buffer in modo da ottenere una quantità di 3 ml totali.

Nel frattempo la colonna di separazione è stata montata nel

campo magnetico MACS Separator e lavata per tre volte con

buffer (3 ml).

Finiti i lavaggi della colonna il nostro campione è stato caricato

sulla colonna.

Le cellule non marcate con EpCAM in questo modo sono state

lavate via dalla colonna tramite lavaggio ripetuto 3 volte con

buffer ed eliminate.

Le cellule marcate con EpCAM sono rimaste attaccate alla

colonna, che è stata a questo punto staccata dal campo

magnetico e posizionata in una provetta apposita in cui le

cellule sono cadute dopo un lavaggio con buffer.

Le cellule così ottenute sono state nuovamente contate con

metodica Tripan Blue.

La metodica di arricchimento ha selezionato in 5 ml 140.000

cellule circa. A questo punto le cellule selezionate sono state

marcate con anticorpo antiEpCAM tramite incubazione per 15

minuti in frigo al buio.

Successivamente il campione è stato lavato con PBS,

centrifugato a 1700 rpm per 5 minuti, risospeso in FACSflow e

valutato tramite FACS ( Fluorescence Activated Cell Sorting)

(Figura 2).

24

FIGURA 2

Quadrant Statistics

File: Data.003Sample ID: graziani EpCam positivePanel: Acquisition Date: 27-Mar-04Gate: G1Gated Events: 4678Total Events: 10000

Quad Events % Gated % TotalUL 3 0.06 0.03UR 3 0.06 0.03LL 4070 87.00 40.70LR 602 12.87 6.02

25

PZ 11

La valutazione della elevata sensibilità della metodica FACS

testata, di fronte al relativo beneficio della tecnica di cell

enrichment ed all’allungamento dei tempi necessari per questo

ulteriore step, ha portato ad una modifica del progetto originale

della ricerca.

Abbiamo pertanto individuato nella sola metodica FACS , di uso

comune nei laboratori analisi e di rapida effettuazione, una

rapida soluzione non solo per la determinazione delle Cellule

Tumorali Circolanti, ma anche per la loro caratterizzazione,

tramite l’uso contemporaneo di marcatori epiteliali, quale

EpCAM e marcatori di importanza terapeutica e prognostica

quali EGFR nell’ adenocarcinoma del colon e HER-2/neu nel

carcinoma mammario.

I campioni successivi pertanto sono stati tutti separati tramite

Ficoll e congelati a -80°C così da effettuare in seguito tutte le

determinazioni.

Dai pazienti inizialmente arruolati nello studio sono stati studiati

22 campioni; molti sono stati esclusi per problemi nella raccolta

del sangue o per patologie ematologiche concomitanti che ne

limitavano l’utilizzo (es paziente 16).

In un secondo momento i campioni sono stati scongelati a T

ambiente in terreno di coltura (IMDM con 10% FBS e

antibiotico).

Sono state preparate per ogni campione le marcature per

analisi citofluorimetrica con anticorpi coniugati anti EpCAM-PE

(BD Biosciences), anti-HER-2/neu-FITC (BD Biosciences), anti

26

EGFR (Purified Mouse Anti-Human EGF Receptor ,BD

Biosciences) e anti CD45-PerCP(BD Biosciences).

Per ogni campione è stato preparato un controllo negativo (non

marcato) in modo da eliminare l’auto fluorescenza delle cellule

stesse.

Per assicurare un alta specificità degli anticorpi abbiamo

utilizzato solo anticorpi monoclonali.

Sono state quindi preparate 6 provette da 1 ml del paziente 2

(controllo inviato come negativo) e 3 tube da 1 ml per gli altri

pazienti: un’ auto fluorescenza, EpCAM, marker prognostico

specifico (HER-2/neu o EGFR) e tripla marcatura, secondo lo

schema sottostante.

auto fluorescenza Per tutti i campioni

HER-2/neu-FITC Per campioni K mammario

EpCAM-PE Per tutti i campioni

EGFR/Ig-FITC Per campioni K colon

EpCAM/HER-2/neu/CD45 Per campioni K mammario

EpCAM/EGFR/CD45 Per campioni K colon

Dopo un lavaggio con PBS 1X le cellule vengono marcate con

una miscela di anticorpi in una soluzione di PBS/BSA/NaN3 per

15 minuti al buio a 4°C.

27

Le concentrazioni utilizzate sono state le seguenti:

Anticorpo Diluizione

EpCAM 1:20

EGFR 1:20

HER-2/neu 1:20

CD45 1:20

Per EGFR, unico anticorpo non coniugato, dopo una prima

incubazione con il primario , i campioni sono stati posti in

incubazione con il secondario IgG-FITC in diluizione 1:50 per

15 minuti al buio a 4°C.

Dopo l’incubazione i campioni sono stati lavati in centrifuga con

PBS 1X a 1500 rpm per 5 minuti a 4°C; eliminato il

sovranatante alle provette sono stati aggiunti 500 microlitri di

soluzione FACSFlow.

I campioni così marcati sono stati analizzati con FACS Calibur,

considerando un range di analisi di 200.000 eventi per

consentire l’individuazione di una popolazione cellulare così

rara.

Abbiamo allestito il campione dell’auto fluorescenza come

ulteriore controllo negativo; facendo passare un campione non

marcato nel citofluorimetro la percentuale di eventi rilevata è

dovuta alla fluorescenza intrinseca delle cellule che viene

esclusa dalle analisi successive con i campioni marcati. Così

facendo, le letture seguenti sono effettivamente dovute alla

positività all’antigene analizzato (EpCAM, etc) e non al

background.

28

I risultati della lettura sono presentati nella Tabella 1 in Capitolo

5.

29

CAPITOLO QUATTRO

RISULTATI

Dal campione inizialmente selezionato di 50 pazienti affetti da

adenocarcinoma del colon-retto e carcinoma della mammella

sono stati studiati 15 pazienti affetti da adenocarcinoma del

colon-retto e 6 pazienti affette da carcinoma mammario.

La restante parte dei campioni raccolti sono stati esclusi dallo

studio per problemi relativi alla raccolta o all’erronea

conservazione del campione prima degli esperimenti.

Tutti i campioni sono stati mantenuti a temperatura ambiente

prima di procedere con la determinazione delle CTC e

comunque processati possibilmente sempre entro le 4 ore dal

prelievo.

Tra le neoplasie coliche 2 erano G1(13%), 12 G2 (80%) e 1 GX

(7%).

Tra le neoplasie mammarie 5 casi erano carcinomi duttali , 1

solo lobulare infiltrante. Di questi 3 erano G2 (50%) , 1 G1

(25%) ed 1 G3 (25%).

Non abbiamo inserito nello studio casi di patologia benigna e

preneoplastica mammaria né colica.

I dati clinici ed i risultati della citofluorimetria sono elencati in

Tabella 1.

Il controllo negativo inserito nello studio (paziente 2) ha

mostrato una elevata percentuale di Cellule Tumorali Circolanti

EpCAM+. Di fronte a questo dato discordante lo studio accurato

30

della storia clinica della paziente ha evidenziato che la paziente

un anno prima di essere inserita nello studio aveva subito un

intervento di colecistectomia per adenocarcinoma della

colecisti.

La determinazione di EGFR non è stata inclusa nei dati presi in

considerazione perché l’anticorpo non è risultato specifico,

marcando sia popolazione marcata per HER-2/neu che EpCAM

che CD45, come mostrato in Figura 4 ( 0,69 per EGFR/CD45,

0,02 per EpCAM/EGFR e 0,02 per EGFR/HER2/neu).

Inoltre tutti i pazienti affetti da adenocarcinoma del colon, dopo

un iniziale valutazione della reazione immunoistochimica per

EGFR, sono stati in seguito valutati per la presenza di

mutazione di KRAS; anche per questo motivo abbiamo escluso

la valutazione citofluorimetrica per EGFR dal nostro studio.

Vista la rarità delle cellule cercate abbiamo considerato nel

totale EpCAM tutte le popolazioni EpCAM+ e per HER-2/neu

tutte le popolazioni HER-2/neu+ ( Figura 3 ).

Da una prima osservazione si nota come la popolazione

EpCAM+/CD45+ sia sempre presente, in tutti i pazienti, con

percentuali variabili ma importanti.

La storia clinica dei pazienti è stata valutata, con particolare

attenzione ad eventuali terapie neoadiuvanti somministrate

prima dell’intervento e alle recidive note di malattia.

La correlazione tra marcatura per HER-2/neu e carcinoma della

mammella è mostrata in Tabella 2, insieme al dato

immunoistochimico per HER-2/neu.

Nel caso della paziente 16 la separazione tramite Ficoll è

risultata difficoltosa per la persistenza di globuli rossi nell’anello

31

di cellule anche dopo centrifugazione; nonostante diversi

tentativi per lisare la componente rossa il campione è rimasto

contaminato per cui è stato eliminato dallo studio .

Lo studio della cartella clinica della paziente ha evidenziato una

effettiva anomalia dell’emocromo, possibilmente causa

del’esclusione del campione dallo studio.

In Tabella 3 abbiamo mostrato la correlazione tra grado

istologico, TNM e percentuale di CTC EpCAM+ e recidive di

malattia.

In Figura 5 abbiamo correlato la dimensione della neoplasia,

espressa con il T del sistema TNM, e la percentuale di CTC

EpCAM+.

In Figura 6 abbiamo evidenziato l’effetto delle terapie

neoadiuvanti chemioterapiche effettuate dai pazienti sulla

percentuale di CTC EpCAM+.

32

CAPITOLO CINQUE

FIGURE E TABELLE

PZ SEDE DIAGNOSI G TNM INV. VASC EpCAMtotali

Her2/neu totali

EpCAM+CD45+

1 SI RETTO ADENOK G2 T3N1 NO 0,05  0 0.052 LA COLECI

STIADENOK G2   T2N0 SI  0,39  0 0,33

3 CE.A COLON ADENOK G2 T3N0 NO 0,04 0,03 0,024 NA COLON ADENOK G2 T3N0 NO 0,09 0,02 0,025 SE COLON ADENOK G1 T1N0 NO 0,02 0,10 0,056 CA MAMM LOBULAR

EG2 T2N0 NO 0,18 0,02 0,05

7 MA COLON ADENOK G2 YT2N0 NO 0,02  0 0,028 TR COLON ADENOK G2 YT3N0 NO 0,02 0,01 0,019 MA.A COLON ADENOK G2 T3N0 SI 0,02 0,01 0,0110 GF COLON ADENOK G2 T4N1M

1SI 0,04 0,08 0,02

11 GA COLON ADENOK G2 T3N0 NO 0,95  0 0,0612 IA MAMM DUTTALE G1 T1AN0 NO 0,04 0,03 0,0213 PMV MAMM  DUTTALE G2  T1CN0  NO  0,05 0,02 0,0214 LOV COLON ADENOK G2  T3N0  NO  0,02 0 0,0115 GG COLON ADENOK G2  T3N0  NO  0,09 0,08 0,0416 B MAMM  DUTTALE G2  T2N0  NO  - -0 -17 RNS COLON ADENOK G2 T2N0 SI 0,21 0 0,118 SG MAMM DUTTALe G2 T1bN0 NO 0,42 0,01 0,219 BL COLON ADENOK GX YT0Nx NO 0,2 0 0,0720 AE COLON ADENOK G1 TISN0 NO 0,25 0 0,1521 GG COLON ADENOK G2 T2NX NO 0,23 0 0,0822 PN MAMM DUTTALE G3  T3N3B  SI  0,06 0,02 0,03

Tabella 1

33

Figura 3

1 SI 3 CE.A

4 NA 5 SE 7 MA 8 TR 9 MA.A

10 GF 14 LO 15 G 17 RNS

19 BL 20 AE 21 GG0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

colon

% ce

llule

pos

itive

6 CA 12 IA 13 P 18 SG 22 PN0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0.35

0.4

0.45

mammella

% ce

llule

pos

itive

34

Tabella 2 Correlazione HER-2/neu

PZ HER-2/neu

+

HER-2 HIC

6 0,02 NEGATIVO

12 0,03 POS 2+

13 0,02 NEGATIVO

18 0,01 NEGATIVO

22 0,02 NEGATIVO

Figura 4

35

PAZIENTE 1

PAZIENTE 1

PAZIENTE 1

Tabella 3 Correlazione tra percentuale CTC e recidiva di

malattia

PZ

G TNM EpCAM+

SEDE INTERVALLO

6 G2

T2N0 0,18 cute 12 mesi

17 G2

T2N0 0,21 omento 12 mesi

10 G2

T4N1M1

0,04 Fegato,uretere milza, stomaco duodeno

14 mesi

18 G2

T1bN0 0,42 fegato 36 mesi

12 G1

T1aN0 0,04 Mamm omolat

36 mesi

Figura 5 Correlazione T e % CTC

T0T0T1T1T1T1T2T2T2T2T3T3T3T3T3T3T3T3T4TX

1920

512

1318

26

721

13

48

914

1522

1017

0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 0.4 0.45

36

% cellule positive

Figura 6 Rapporto tra Terapia Neoadiuvante e % EpCAM+

YT2N0 YT3N0 YT0NX7 MA 8 TR 19 BL

00.020.040.060.08

0.10.120.140.160.18

0.2

% CTC EpCAM+

EpCAM

37

CAPITOLO SEI

DISCUSSIONE

Bloccare l’invasione tumorale e prevenire le metastasi è lo

scopo delle nuove terapie antitumorali, ma per raggiungere

questo obiettivo diventa fondamentale comprendere il

meccanismo tramite cui le cellule tumorali escono dalla

localizzazione primaria, entrano nella circolazione sanguigna e

si stabiliscono come lesioni a distanza in organi come polmoni,

fegato, cervello e midollo osseo.

Le cellule tumorali identificate in transito nella circolazione

sanguigna sono definite Cellule Tumorali Circolanti (Circulating

Tumor Cells); si ritiene che una frazione di queste cellule siano

cellule tumorali in grado di iniziare una lesione clonale

metastatica. Le CTC sono estremamente rare: si considera

circa una CTC per miliardo di cellule nucleate del sangue

(polimorfonucleate, linfociti, etc) nei pazienti con neoplasia

avanzata .

Queste Cellule Tumorali Circolanti potrebbero essere utilizzate

come monitoraggio non invasivo di sensibilità o resistenza alla

terapia, oltre a consentire una selezione dei pazienti che

necessitano una precoce terapia antitumorale sistemica.

L’dentificazione delle Cellule Tumorali Circolanti nei pazienti

neoplastici potrebbe inoltre essere un fattore prognostico

indipendente dal sistema TNM, in grado di selezionare pazienti

con maggior rischio di recidive e metastasi.

38

L’obiettivo del nostro studio è stato individuare una metodica

accessibile per costo e ripetibile per individuare Cellule

Tumorali Circolanti nel sangue periferico di pazienti affetti da

carcinoma mammario ed adenocarcinoma del colon-retto in

stadio localizzato ed avere contemporaneamente a

disposizione informazioni prognostiche utili per il trattamento dei

pazienti stessi come lo stato di HER-2/neu nel carcinoma

mammario ed EGFR nell’adenocarcinoma colico.

Nel nostro studio inoltre abbiamo preso in considerazione le

correlazioni tra presenza di CTC nel sangue periferico e fattori

prognostici noti come stadio (TNM), invasione vascolare ed

interessamento linfonodale.

Il nostro studio ha dimostrato che le Cellule Tumorali Circolanti

sono individuabili tramite FACS (Fluorescence Activated Cell

Sorting), una tecnica di facile utilizzo ed accesso, nel sangue

periferico di pazienti affetti da neoplasie di colon e mammella.

Questo tipo di analisi può essere effettuata anche su residuo

ematico, cioè con lo stesso campione prelevato per i normali

esami ematochimici nei pazienti prima di essere operati, con un

quantitativo minimo di 3 ml.

Questo consentirebbe anche di effettuare controlli nei pazienti

oncologici a distanza dall’intervento, in contemporanea con la

valutazione dei markers tumorali già codificati.

I pazienti oncologici arruolati nel nostro studio presentavano

tutti percentuali di CTC EpCAM+ variabile da 0,02 e 0,95.

Il notevole incremento della positività alle Cellule Tumorali

Circolanti rilevata è spiegabile con i notevoli aggiustamenti

tecnici apportati durante gli esperimenti; da un primo

39

congelamento in due provette nel corso dello studio abbiamo

deciso di congelare una sola provetta dopo Ficoll, cosi’ da

concentrare le cellule tumorali circolanti eventualmente

presenti, vista la loro rarità (pazienti 17-18-19-20 e 21).

Nonostante la limitazione legata al basso numero di casi nel

nostro studio pazienti con valori elevati di Cellule Tumorali

Circolanti sono andati incontro a recidiva di malattia durante il

follow up.

In questi casi altri fattori prognostici già affermati quali grado

istologico, interessamento linfonodale e stadio di malattia non

indicavano una maggior possibilità di recidiva di malattia.

Solo in due pazienti (paziente 10 e paziente 17) l’esame

istologico indicava la presenza di invasione linfovascolare

seppure in assenza di metastasi linfonodali.

Il dato che la presenza di Cellule Tumorali Circolanti nel sangue

periferico dei pazienti non correla con la massa tumorale (T nel

TNM evidenziato in Figura 5) potrebbe indicare che la loro

presenza non dipende dalla grandezza della neoplasia bensì da

alcune peculiari caratteristiche della specifica neoplasia quali

invasività e vascolarizzazione tumorale, che sono fattori

prognostici a sè stanti.

Nella nostra casistica inoltre si è evidenziato come pazienti

sottoposti a chemioterapia neoadiuvante preoperatoria

presentavano percentuale di Cellule Tumorali Circolanti bassa,

tra 0,02 e 0,2, valori più bassi dell’intera popolazione studiata.

Questo dato concorda con quanto riportato in letteratura, come

cioè la quantificazione delle Cellule Tumorali Circolanti sia utile

nel monitoraggio della terapia adiuvante, in quanto le Cellule

40

Tumorali Circolanti rispondono alla terapia quanto il tumore

primitivo (64).

Nessuno dei pazienti sottoposti a terapia neoadiuvante ha

sviluppato recidive nel periodo di follow up.

Questo conferma il risultato di alcuni studi analitici in cui

comparando stato linfonodale, espressione dei recettori

ormonali , valori iniziali di CTC e valori di CTC dopo terapia, la

percentuale delle Cellule Tumorali Circolanti dopo il trattamento

terapeutico è risultato essere il fattore predittivo indipendente

più importante di recidiva precoce di malattia.

Per quanto riguarda i markers prognostici presi in esame EGFR

non è stata incluso nei dati presi in considerazione perché

l’anticorpo non è risultato specifico ed inoltre tutti i pazienti

affetti da adenocarcinoma del colon, dopo un iniziale

valutazione della reazione immunoistochimica per EGFR, sono

stati in seguito valutati per la presenza di mutazione di KRAS

per essere indirizzati alla terapia con Cetuximab.

Non sono al momento disponibili anticorpi per KRAS utilizzabili

in tecnica FACS né per immunoistochimica.

HER2 è una proteina transmenbrana , con funzioni di ligando

per fattori di crescita tirosinchinasici, codificata da un

protoncogene localizzato sul cromosoma 17q21. Questo

protoncogene è amplificato o iperespresso in circa il 20-25% dei

carcinomi della mammella. Una positività per HER-2/neu è stata

correlata con un comportamento più aggressivo della neoplasia

e maggiore resistenza alla terapia citotossica ed endocrina.

Le pazienti con positività alla proteina cerbB2 (prodotto del

gene HER-2/neu) sono eleggibili al trattamento con un

41

anticorpo monoclonale trastuzumab (Herceptin), che inibisce la

proliferazione neoplastica e aumenta la chemio sensibilità.

L’anticorpo anti HER-2/neu nel nostro studio è risultato positivo

nel 40% (6 su 15) dei casi di adenocarcinoma del colon e nel

100% (5 su 5)dei casi di carcinoma mammario.

In 4 dei 5 casi studiati la valutazione immunoistochimica per

HER-2/neu è risultata negativa.

Questo dato potrebbe indicare come durante la progressione di

malattia lo status di HER-2/neu nelle Cellule Tumorali Circolanti

cambi da negativo a positivo; è stato già dimostrato in

letteratura come tra localizzazione primaria e metastasi lo

status di HER-2/neu cambi (65,66,67).

Considerato inoltre il lungo intervallo di latenza del carcinoma

della mammella la determinazione dello status di HER-2/neu

nelle Cellule Tumorali Circolanti nelle pazienti in corso di

trattamento o di recidiva potrebbe aiutare ad identificare le

pazienti da indirizzare alla terapia con Trastuzumab, anche nei

casi in cui non è possibile valutare l’eventuale positività tramite

immunoistochimica.

Come nei lavori effettuati con altre metodiche di cell sorting

(CellSearch system) presenti in letteratura, si è evidenziata una

popolazione EpCAM+/CD45+, che potrebbe spiegare come le

CTC sfuggono alla risposta immunitaria del paziente.

Questa popolazione, nel nostro studio come in altri, potrebbe

essere legata ad un meccanismo, studiato ampiamente sui

modelli murini ma non ancora nei modelli umani, definito

trasformazione epiteliale - mesenchimale delle Cellule Tumorali

Circolanti.

42

La capacità delle Cellule Tumorali Circolanti di acquisire

caratteristiche del tipo “stem cell” potrebbe spiegare la loro

capacità di migrazione e la loro resistenza alla terapia

oncologica (10,11).

Alcuni studi incentrati sulla relazione tra Cellule Tumorali

Circolanti e metastasi a distanza suggeriscono che la

trasformazione mesenchimale aumenti la capacità di queste

cellule di entrare nel circolo sanguigno ma riduce la loro

capacità di iniziare metastasi (12,13).

L’utilizzo della tecnica FACS consente di studiare diversi fattori

contemporaneamente, quindi permettendo una marcatura

specifica della popolazione EpCAM+/CD45+ con markers

staminali noti quali CD34, CD133 e CK19

Uno studio più accurato di questa popolazione potrebbe

mettere in chiaro come le Cellule Tumorali Circolanti non

vengono riconosciute dal sistema immunitario dei pazienti e

acquisiscono particolari affinità per i tessuti, aiutandoci ad

individuare nuovi target terapeutici per bloccare il processo

metastatico.

43

CAPITOLO SETTE

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