sítio de seqüência dirigida (sequence-tagged sites) sequence-tagged microssatélites (stms) ou...

Sítio de Seqüência Dirigida(Sequence-tagged sites)

• Sequence-Tagged Microssatélites (STMS) ou SSR ou Microssatélites

• Microssatélites ancorados– Inter-Simple Sequence Repeat (ISSR)

• Sequence-characterized amplified regions (SCARs)

• Cleaved amplified polymorphic sequence (CAPS)

Fonte: IPGRI

Microssatélites (SSR)

• Sequence-Tagged Microsatélites (STMS)– também conhecido como microssatélite

ou Simple Sequence Repeat (SSR)

• Normalmente locus simples e multi-alélico

• Co-dominante• Altamente reprodutível

Microssatélites (SSR)

• altamente informativo - vários alelos por locos

• detecção por PCR• facilmente transferível entre labs.• distribuição homogênea no genoma

Microssatélites (SSR)ACTTCATTAA TGTCTTAGGT GGCAGAATAC TTTGATGCAA CAATTTCAAG GGGTGCTGAC ATTAAGTTGG CTGCCAATTG

GATAATGGGT GATATTGCTG CCTATATGAA AAATGAAAAG CTTTCTATTA ATGAGATCAA ACTTATGCCA GAAGAGCTAG

TAGAGCTGAT AGCTTCCATT AAAGGTGGGA CTATCAGTGG AAAGATTGGA AAGGAGGTAA GCATTTGCTT CTTTNACTGA

TGCCACTTTC ATGTTCAAAC ATTTGTTAGT AATCCTGTCT ATTTATTTTC ATGGAAGAAT TTTACTAGCT ATTATTCTCC

ACTGTGTAGA TGTGATTTTA TAGTTTGTTT GGATATATAA TTATTGTTCG TGTTTTTTTT TTTAATCCAA ACTTTATAAT

CTTTCCAAGT GCTTTTCTCC TCCCTGTCTT TTTCCTCTAC CACACACACA CACACACACA CACACTCATA CAGAAAAAGG

AAAAAGGAAA GAAAGAGAAC AGGAGATATA AAAACCTTTT TTCTTTATCA ATTAGATAAT TAGTTATAAA AGTTTTTCTC

CTGCTTCTTA TCCCTCCGCT AAATGCCTGA TTAACTTTCT GCTGGTAAAG ATTTAAAATA ACTTGTTAAT TTTGGACATG

NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN CACACACACACACACACAC NNNNNNNNN NNNNN

NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN GTGTGTGTGTGTGTGTGTG NNNNNNNNNNNNNN

Primer REV

Primer FOR

Repetição CA

MicrossatélitesBananeira 3x e 4x

Ma 1.27Ma 1.17

MicrossatélitesBananeira 3x e 4x

Cir 24.25

MicrossatélitesBananeira 2x

Cir 24.25

SCARs• SCARs - sequence-characterised

amplified regions– proposto por Paran & Michelmore (1993)– marcador locus-único derivado de

fragmentos sequenciados de RAPD, ISSR, AFLP

– maior estabilidade - primers específicos– analisado para presença/ausência– possibilidade de simplificação de análise e

automação

SCARsR

*

S

clonar

ACTTCATTAA TGTCTTAGGT GGCAGAATAC TTTGATGCAA CAATTTCAAG GGGTGCTGAC ATTAAGTTGG CTGCCAATTG

GATAATGGGT GATATTGCTG CCTATATGAA AAATGAAAAG CTTTCTATTA ATGAGATCAA ACTTATGCCA GAAGAGCTAG

TAGAGCTGAT AGCTTCCATT AAAGGTGGGA CTATCAGTGG AAAGATTGGA AAGGAGGTAA GCATTTGCTT CTTTNACTGA

TGCCACTTTC ATGTTCAAAC ATTTGTTAGT AATCCTGTCT ATTTATTTTC ATGGAAGAAT TTTACTAGCT ATTATTCTCC

ACTGTGTAGA TGTGATTTTA TAGTTTGTTT GGATATATAA TTATTGTTCG TGTTTTTTTT TTTAATCCAA ACTTTATAAT

CTTTCCAAGT GCTTTTCTCC TCCCTGTCTT TTTCCTCTAC CACACACACA CACACACACA CACACTCATA CAGAAAAAGG

AAAAAGGAAA GAAAGAGAAC AGGAGATATA AAAACCTTTT TTCTTTATCA ATTAGATAAT TAGTTATAAA AGTTTTTCTC

CTGCTTCTTA TCCCTCCGCT AAATGCCTGA TTAACTTTCT GCTGGTAAAG ATTTAAAATA ACTTGTTAAT TTTGGACATG

Primer específico Seqüenciar

SCAR - FeijoeiroROC20460

SCAR - FeijoeiroSCF3

Amplified Fragment Length Polymorphism -

AFLP

• Combinação de RFLP e PCR• Resulta em padrões muito

informativos• Marcador dominante

DNA genômico digestão com duas enzimas

adaptadores

EcoRIMseI

pré-amplificação

amplificação seletiva

ligação

MseI

EcoRI

GAATTCCNCTTAAGCN

NTTAANAATT

ATTCCNGCN

NTNAAT

DNA

digestãoEcoRI MseI

ATTCCNGCN

NTN ATTAAligação

TA

ATTCCNTAAGCN

NTTANAAT

pré-amplificaçãoprimer +1

A

C

amplificaçãoprimer +3

ATTCCATAAGCT

GTTACAAT

AAC

AAC

Exemplo - Gel de AFLP

AFLP de cana com 33P

AFLP de cana com 33P

AFLP de feijãogel desnaturante corado com

prata

AFLP de feijãogel não desnaturante e prata

Primers E- ACA x M- CAA

PBN N

Primers E- AGC x M- CTC

PBN N

AFLP

COMPARAÇÃO ENTRE MARCADORES MOLECULARES

Escolha de MarcadoresCaracterística RFLP RAPD SSR AFLP ISSR CAPS Polimorfismo Pontual Pontual # Pontual Pontual Pontual

InDel InDel Rep. InDel InDel InDel Nível dePolimorfismo médio médio alto médio médio baixo

Abundância alta m.alta média m.alta média alta

Dominância CoDom Dom CoDom Dom Dom CoDom

[DNA] 10 g 25 ng 50 ng 500 ng 25 ng 25 ng

Seqüência não não sim não não sim

Marcação sim/não não não sim/não não não Repetibilidade alta baixa alta média baixa alta

Escolha de MarcadoresCaracterística RFLP RAPD SSR AFLP ISSR CAPS

Informação/Corrida 0-3 0-4 0-2 0-30 0-20 0-2

Patenteado não sim não sim não não

Investimento alto baixo alto médio baixo alto

Custo médio baixo alto médio baixo médio

Karp 96 US$ 2,00 1,00 1,00 1,50 nd. nd. Risterucci 97 FF/100 ind. 3,14 1,71 3,21 1,10 nd. nd.