Anlise do Smen para Reproduo AssistidaA anlise do smen constitui-se na pedra bsica da avaliao do fator masculino em reproduo assistida. O espermograma convencional inclui o estudo de aspectos particulares da funo espermtica como a concentrao, motilidade e morfologia, assim como, na quantificao e identificao de clulas no espermticas, anticorpos antiespermatozides e testes de penetrao. A amostra de smen deve ser coletada atravs de masturbao, em frasco estril, de plstico ou vidro, aps abstinncia sexual mnima de 48 horas. A amostra ser colhida em sala prxima ao laboratrio de anlise. No sendo possvel, a coleta poder ser realizada em outro local, porm o tempo de entrega do material para estudo, no deve ser superior a 30 minutos. Assim como, a temperatura ideal para transportar o material estaria entre 20 C e 37 C. Rotineiramente, a amostra ser identificada com o nome do paciente, data e horrio da coleta. Por outro lado, o paciente deve relatar qualquer perda de material durante o ato de coleta, ou quadro febril recente (ltimos 3 meses). Uma avaliao ideal da funo espermtica baseia-se na anlise de trs amostras de smen. Anlise Macroscpica Aparncia, cor e liquefao A amostra de smen normal possui cor branca opalescente, sendo homognea e se liquefaz `a temperatura ambiente em menos de 60 minutos. A amostra pode conter grnulos gelatinosos, os quais no se liquefazem, e neste caso, ser considerada heterognea. Um aumento da viscosidade ou consistncia poderia interferir no processo de determinao da concentrao dos espermatozides. A amostra que possui uma colorao marrom indicaria a presena de glbulos vermelhos. Em geral, as amostras com filamentos de muco que comumente acarretam uma incompleta liquefao, devem ser submetidas a um processo mecnico de liquefao pela passagem atravs de uma agulha de 19 G ou por processo qumico pelo uso da bromelina (concentrao de 1g por litro). pH. Uma vez liquefeita a amostra de smen, coloca-se uma aliquota sobre o papel de pH (faixa de pH 6.1 a 10), e observa-se aps 30 segundos a cor obtida, que ser comparada com a fita de calibrao colorimtica de pH. O pH determinado pelas secrees da prstata (cida) e vescula seminal (bsica). A medida do pH ser executada dentro do perodo de 1 hora da coleta do smen, e normalmente, varia entre 7.2 e 7.8. Obrigatoriamente, as amostras com pH superior a 7.8 devem ser avaliadas quanto a presena de infeco. Em caso de pH menor que 6.5, pode se levantar a suspeita de agenesia, ou ocluso das vesculas seminais. Viscosidade A viscosidade ou consistncia da amostra liquefeita pode ser estimada por gentil aspirao do smen em pipetas de 5 ml, seguida de fcil gotejamento. Dessa forma, a amostra ser classificada como normal quando gotas so formadas. No caso de viscosidade anormal verifica-se no processo de gotejamento a formao de um filamento de mais de 2 cm. O aumento da consistncia pode estar relacionado com disfuno prosttica por inflamao crnica. A consistncia anormal tambm pode intervir na avaliao de vrias caractersticas do smen, tais como a motilidade, concentrao ou determinao de anticorpos antiespermatozides. Volume O volume do ejaculado ser medido em cilindros, pipetas ou seringas graduadas, considera-se um volume normal de 2.0 a 5.0 ml. A maior parte do volume secretada pela vescula seminal, sendo que a prstata produz entre 0.5 a 1 ml. Um volume acima de 5 ml suspeito de infeco aguda nas glndulas anexas e quando inferior a 1.5 ml sugestivo de processo inflamatrio crnico ou ejaculao retrgada. Anlise Microscpica A anlise microscpica inicial da amostra de smen consta do estudo da concentrao, motilidade, morfologia, vitalidade, citologia geral, e dos testes de penetrao espermtica e hiposmtico. Concentrao Atualmente, a concentrao dos espermatozides medida atravs de cmaras de contagem (Makler, Horwell, Neubauer, etc). A cmara de Makler possui uma profundidade de 0.01 mm e uma marcao graduada de 100 quadrados (rea total de 1 mm2) cada um com 0.1 mm x 0.1 mm. Assim sendo, o volume compreendido na rea de 10 quadrados aps a colocao da lamnula de 0.001 mm3 ou 1 milho por ml (Figura 3.1). Tal fato, facilita a leitura direta da concentrao da amostra de smen (milhes por ml) pela simples contagem dos espermatozides presentes na rea de 10 quadrados. Em geral, coloca-se um volume de 10u l de esperma liquefeito no centro da cmara de Makler, adapta-se a lamnula e realiza-se a contagem em microscopia de fase em aumento de 200 vezes (Figura 3.2). Habitualmente, a concentrao dos espermatozides definida segundo as normas da Organizao Mundial de Sade (WHO, 1992) : A. Normozoospermia : > 20 x 106 espermatozides/ml. B. Oligozoospermia: < 20 x 106 espermatozides/ml. C. Polizoospermia : > 200 x 106 espermatozides / ml. D. Azoospermia : nenhum espermatozide no ejaculado.

Motilidade A motilidade tambm realizada em cmara de contagem com microscopia de fase e aumento de 200 vezes . Uma alquota de smen de 10u l dever ser depositada na cmara, executando-se uma contagem de 100 espermatozides, o processo ser sempre em duplicata. Caso ocorra uma diferena > 10% entre as duas avaliaes ser executada uma mdia das 3 observaes que ser relatada como a motilidade final. A motilidade dos espermatozides ser classificada segundo os padres da Organizao Mundial de Sade (WHO, 1992) : Tipo A espermatozides mveis com progresso rpida. Tipo B - espermatozides mveis com progresso lenta. Tipo C espermatozides mveis porm sem progresso. Tipo D - espermatozides imveis. Finalmente, a amostra de smen ser considerada normal ou anormal segundo o critrio : Normal : >50% do tipo A e B. Anormal : < 50% do tipo A e B. Morfologia A morfologia realizada atravs da colorao de Shorr e sua avaliao executada aps a anlise de dois esfregaos de 10u l de smen fresco. Um mnimo de 200 espermatozides so estudados no aumento de 1000 vezes (Figura 3.3). Os espermatozides so classificados quanto aos aspectos morfolgico em dois grupos : A- Normal : A cabea ser levemente ovalada, nica, lisa, sem gotas citoplasmticas e com o acrossoma ocupando cerca de 40% a 70% da cabea. O dimetro varia de 3 a 5 um, podendo apresentar at 2 vacolos citoplasmticos. A pea intermediria deve medir de 6 a 10 um, alinhar-se com o eixo longitudinal da cabea, e no apresentar expanses laterais. A cauda ser nica e desenrolada, com um tamanho de 45 um (Figura 3.4). B - Anormal : 1. Defeitos no acrossoma : a. acrossoma pequeno (< 40%). b. acrossoma grande (> 70%). 2. Defeitos do corpo e pea intermediria : c. pea intermediria larga. d. gota intracitoplasmtica. e. pea intermediria separada. 3. Defeitos estruturais : f. piriforme. g. achatado. h. forma de ampulheta. i. superfcie irregular. j. mais que dois vacolos k. achatado no stio de implantao da cauda. l. no ovalada de um lado m. redonda. 4. Defeitos da cauda : n. insero. 0. espiralada. p. ngulo > 90 . (Figura 3.5 - A a C) Alm disso, deve-se analisar as chamadas formas imaturas que so definidas como clulas esfricas que apresentam dimetro nuclear entre 4 e 9 um e ausncia de cauda. A morfologia espermtica normal segundo a Organizao Mundial de Sade (WHO, 1992) definida pela presena de formas normais em 30% ou mais dos espermatozides examinados. Todavia, usando-se os critrios de Kruger (1986)

baseado na avaliao morfolgica e subsequente performance em fertilizao "in vitro" (FIV), define-se como morfologicamente normais os pacientes que mostraram formas normais em >14% dos espermatozides analisados. A colorao de Shorr usada de rotina para avaliao da morfologia espermtica. Em geral dois esfregaos de smen so preparados e aps sua secagem na temperatura ambiente, realiza-se a passagem nos seguintes reagentes : 1. lcool 70 por 15 minutos; 2.gua corrente; 3. Corante de hematoxilina por 45 segundos; 4. gua corrente; 5. lcool 90 ; 6. Corante de Shorr por 5 minutos; 7. lcool 95 (3 passagens sucessivas); 8. lcool absoluto (3 passagens sucessivas); 9. Alcool xilol (1:1); 10. Xilol (2 passagens sucessivas).

Vitalidade

A vitalidade ser avaliada atravs da combinao dos corantes eosina e nigrosina em esfregao de smen fresco. Esta tcnica baseia-se no fato de que as clulas mortas apresentam membranas lesadas que permitem a penetrao de corantes. Uma contagem de 100 espermatozides dever ser realizada em microscpio comum com aumento de 1000 vezes de forma a diferenciar as clulas vivas (no coradas) das mortas (coradas). Inicialmente, pipeta-se num tubo o volume de 100 ul de smen, adicionando-se duas gotas de eosina, e homogeiniza-se a soluo por 30 segundos. Em seguida, adiciona-se 4 gotas de nigrosina, homogeiniza-se por 45 segundos e executa-se um esfregao que aps a secagem submetido a uma anlise microscpica em aumento de 1000 vezes. O resultado apresentado na porcentagem total dos espermatozides vivos (no se coram). Lembrar que os espermatozides mortos coram-se de vermelho. As substncias usadas para a determinao da vitalidade so as seguintes : 1. Eosina amarela (Merck) na concentrao de 3% em soluo fisiolgica. Estocar na temperatura ambiente; 2. Nigrosina hidrossolvel (Merck) na concentrao de 8% em soluo fisiolgica. Filtrar e estocar na temperatura ambiente. Teste hiposmtico

A finalidade deste teste avaliar a integridade funcional da membrana celular dos espermatozides quando estes so colocados em uma soluo hiposmtica. Inicialmente, ocorre uma entrada de lquido para o interior da clula com a finalidade de se estabelecer o equilbrio osmtico. Como resposta a esse fato, a membrana dos espermatozides incha-se formando espaos lquidos na cauda dos espermatozides. A presena de inchao indicar que o transporte de fluidos atravs da membrana ocorreu normalmente, sendo esta, considerada ntegra do ponto de vista funcional. Assim sendo, uma soluo de 150 mOsm/l obtida com um meio de cultura (Menezo B2, GPM, IVF-50, etc) diluido em gua destilada (1/1). Em seguida, coloca-se 1.0 ml da soluo hiposmtica num tubo, e incuba-se na temperatura de 37 C por 10 minutos. O smen liquefeito num volume de 100 ul depositado no tubo, e o conjunto incubado por 30 minutos na temperatura de 37 C. Finalmente, retira-se uma alquota de 10 ul da suspenso de esperma, e observa-se um mnimo de 200 espermatozides em microscpio de fase com aumento de

200 vezes. O clculo da porcentagem de espermatozides que apresentam inchao na cauda determinado pela relao : THO (%) = Nmero de espermatozides com inchao x 100/Total de espermatozides contados A amostra de smen ser considerada normal quando mais que 60% dos espermatozides apresentarem inchao de cauda (Figura 3.6). O significado do teste hiposmtico na previso da fertilidade masculina ainda controvertido. Alguns grupos relatam uma pobre correlao entre o teste hiposmtico e os resultados posteriores em FIV (Barrat e cols., 1989, Jager e cols., 1991). Entretanto, Uchida e cols. (1992) mostraram que o teste hiposmtico efetivo na avaliao da capacidade de fertilizao dos espermatozides quando usada a tcnica de sedimentao-migrao ("swim-up") como mtodo de capacitao dos espermatozides. Em 1988, Liu e cols. selecionaram espermatozides mveis e utilizaram uma anlise de regresso, no achando correlao entre os escores do teste hiposmtico no smen (ou aps "swim-up") e a fertilizao de ocitos "in vitro". Franco Jr. e cols. (1995a) apesar de empregarem o mtodo de "swim-up" verificaram que o teste hiposmtico no foi eficaz na identificao de uma populao masculina com posterior falha total de fertilizao ou em diferenciar aquela com taxas de clivagem 50% daquela com valores < 50%. Alm disso, coeficiente de correlao "pi" entre os valores do teste hiposmtico e a taxa de clivagem embrionria foi fraco ( = 0.19).

Exame citolgico

O smen tambm possui outras clulas alm dos espermatozides, tais como as clulas epiteliais poligonais do trato uretral, clulas espermatognicas, leuccitos e hemcias. A concentrao destas clulas na amostra, pode ser estimada na cmara de Makler, por ocasio da contagem dos espermatozides. Nos casos em que a amostra de smen apresentar uma concentrao de leuccitos superior a 1 x 106 por ml, deve-se avaliar a possibilidade de o paciente possuir qualquer infeco nas glndulas sexuais acessrias. Em seguida, afastar a presena de protozorios (Trichomonas vaginalis) ou fungos (Candida albicans). Teste de penetrao espermtica O teste de penetrao espermtica tem como finalidade medir a habilidade dos espermatozides penetrarem no muco cervical, ou qualquer fluido substitutivo, como o muco bovino, clara de ovo, etc. Em virtude da dificuldade da obteno rotineira do muco cervical humano, executa-se em nosso laboratrio o chamado teste de penetrao na clara do ovo. Inicialmente, um volume da clara do ovo aspirado atravs de uma seringa e avaliado quanto ao pH, ajustando-se o mesmo entre 7.0 e 7.5 atravs de uma soluo tampo com Hepes (0.119 g/10ml, Sigma H6147). O teste de penetrao na clara do ovo realizado em capilar plano (Microslides, Vitro Dynamics Inc., USA), preenchido com clara de ovo, vedado na extremidade superior e colocado verticalmente em contato com smen liquefeito (200 ul). Em seguida, incuba-se na temperatura de 37 C por 90 minutos. A penetrao dos espermatozides avaliada por um sistema graduado em milmetros utilizando-se um microscpio de contraste de fase com um aumento de 400 vezes. O teste de penetrao considerado normal quando o espermatozide vanguardeiro atingiu ou ultrapassou, o valor de 30mm (Figura 3.7). Franco Jr. e cols. (1995b) testaram a hiptese de que o teste de penetrao dos espermatozides na clara do ovo (TPECO) poderia identificar uma populao masculina com maior probabilidade de fertilizar ocitos em cultura. O TPECO foi executado num total de 70 amostras de esperma durante a investigao prvia ao programa de FIV; posteriormente os 70 pacientes e suas esposas participaram do programa de FIV. O nvel mdio de clivagem embrionria foi de 68 33.6%. A sensibilidade do TPECO foi de 0.62, a especificidade de 0.85, o valor preditivo do teste anormal de 0.35, e o valor preditivo do teste normal de 0.95 quando usado para avaliar a habilidade da populao masculina formar embries. A eficcia (0.73) foi prxima da obtida com a anlise morfolgica dos espermatozides (0.79). Por outro lado, quando diferentes parmetros do smen (concentrao, morfologia e motilidade) e o TPECO foram comparados em termos de poder identificar populaes com >50% ou