UNIVERSIDADE DE FRANCA

UNIFRAN

REFRIGERAÇÃO DE SÊMEN CANINO EM CAIXA TÉRMICA

COMERCIAL

ORIENTADORA: Profa. Dra. Fabiana Ferreira de Souza

PÓS-GRADUANDA: Samanta Maria Faleiros Corrêa

Franca 2009

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SAMANTA MARIA FALEIROS CORRÊA

REFRIGERAÇÃO DE SÊMEN CANINO EM CAIXA TÉRMICA

COMERCIAL

Dissertação apresentada à Universidade de Franca, UNIFRAN, como exigência parcial, para a obtenção do título de Mestre em Cirurgia e Anestesiologia Veterinária Orientadora: Profa. Dra. Fabiana Ferreira de Souza

FRANCA

2009

Catalogação na fonte – Biblioteca Central da Universidade de Franca

Faleiros, Samanta Maria

F177r Refrigeração de sêmen canino em caixa térmica comercial / Samanta Maria Faleiros ; orientador: Fabiana Ferreira de Souza. – 2009

43 f. : 30 cm.

Dissertação de Mestrado – Universidade de Franca Curso de Pós-Graduação Stricto Sensu – Mestre em Cirurgia e

Anestesiologia Veterinária

1. Inseminação artificial – Sêmem canino. 2. Inseminação artificial – Refrigeração. 3. Inseminação artificial – Espermatozóide. 4. Inseminação artificial – Botutainer (caixa-térmica). 5. Cirurgia veterinária – Reprodução animal (biotecnologia). I. Universidade de Franca. II. Título.

CDU – 636.082.453.5:636.7

SAMANTA MARIA FALEIROS CORRÊA

REFRIGERAÇÃO DO SÊMEN CANINO EM CAIXA TÉRMICA COMERCIAL

COMISSÃO JULGADORA DO PROGRAMA DE MESTRADO EM CIRURGIA E ANESTESIOLOGIA VETERINÁRIA

Presidente: Profa. Dra. Fabiana Ferreira de Souza Universidade de Franca – UNIFRAN

Titular 1: Profa. Dra. Aline Adriana Bolzan Universidade de Franca - UNIFRAN

Titular 2: Profa. Dra. Maria Isabel Mello Martins Universidade Estadual de Londrina - UEL

Franca, 10/06/2009

DEDICO este estudo aos meus pais, Hortêncio e Marialda

pela educação que foi a base necessária para vencer esta e

todas as etapas de minha vida.

Ao Cássio e Maria Leonor, pelo apoio e amizade.

Em especial ao meu esposo Luiz Gustavo e ao meu filho Luiz

Arthur, pelo amor sem medida e incentivo para que pudesse

chegar até aqui...

AGRADECIMENTOS

Primeiramente a Deus;

à minha orientadora e amiga Profa. Fabiana Ferreira Souza, que me

apoiou e auxiliou com seu imenso conhecimento;

aos alunos Murillo Mansano Moscardini, Tarcísio Torre Lourenço e

Diego Souza Moura, pela contribuição na realização deste trabalho.

ao Canil e Hotel Bandog de adestramento, por gentilmente fornecer

os animais para realização da colheita do sêmen; e

à Universidade de Franca pela estrutura física disponibilizada para o

estudo.

Enquanto estivermos tentando, estaremos felizes, lutando

pela definição do indefinido, pela conquista do impossível,

pelo limite do ilimitado, pela ilusão de viver.

Quando o impossível tornar-se um desafio, a satisfação

estará no esforço e não apenas na realização final...

Gandhi

RESUMO

CORRÊA, Samanta Maria Faleiros. Refrigeração de sêmen canino em caixa

térmica comercial . 2009. 38 f. Dissertação (Mestrado em Cirurgia e

Anestesiologia Veterinária) – Universidade de Franca, Franca.

Muitos criadores têm encontrado no transporte do sêmen refrigerado, uma

alternativa para substituir o transporte dos animais. Porém, no Brasil, ainda não se

comercializam caixas térmicas específicas para esta finalidade. Desta forma, o

objetivo deste estudo foi avaliar a qualidade espermática do sêmen refrigerado de

cães, em caixa térmica disponível no mercado nacional, para a conservação do

sêmen em outras espécies. Para tanto, foram colhidos 16 ejaculados de seis cães

adultos saudáveis. Os ejaculados foram analisados quanto à motilidade, ao vigor,

à concentração, à morfologia espermática, ao teste hiposmótico e à coloração

supra-vital com eosina. Após a análise, o sêmen foi dividido em quatro alíquotas,

centrifugado e o sobrenadante retirado. Duas amostras foram rediluídas com o

plasma seminal (controle) e duas com meio Kenney. Após a diluição, as amostras

foram mantidas na caixa térmica Botutainer (Biotech, Botucatu, SP, Brasil), a qual

preserva a temperatura em torno de 5°C, por até 35 horas. De acordo com os

resultados, a caixa térmica foi capaz de manter alta viabilidade espermática, nas

amostras conservadas em meio diluente e no plasma seminal. Contudo, o meio

diluente foi superior ao plasma seminal, especialmente na manutenção da

motilidade espermática. Concluiu-se que a caixa Botutainer pode ser empregada

para o envio do sêmen canino, por meios de transporte convencionais.

Palavras-chave : canino; refrigeração; espermatozóide; Botutainer; caixa-térmica.

ABSTRACT

CORRÊA, Samanta Maria Faleiros. Canine chilled semen in commercial

container . 2009. 38 f. Dissertação (Mestrado em Cirurgia e Anestesiologia

Veterinária) – Universidade de Franca, Franca.

Many breeders have found in chilled semen transport, an alternative to replace the

animal transport. However, specific box to carry canine semen is not selling in

Brazil. Thus, the purpose of this study was to evaluate canine sperm viability after

to cool in a thermal box available on market, used to other species. Sixteen

ejaculated from six healthy adult dogs were collected. The ejaculated were

analyzed for motility, vigor, concentration, sperm morphology, swelling test and

eosin stain. After analysis, the semen was divided into 4 aliquots, centrifuged and

the supernatant was removed. Two samples were rediluted with seminal plasma

and two with Kenney. These samples were kept in Botutainer (Biotech, Botucatu,

SP, Brazil) thermal box, which maintains temperature around 5°C for 35 hours.

According to our results, the box was capable to maintain increased sperm viability

in samples either stored in extender or seminal plasma. However, the extender

was superior to seminal plasma, particularly to preserve the sperm motility. It was

concluded that Botutainer thermal box can be used to carry canine semen by

conventional means.

Key-words : dog; chilled; sperm, Botutainer; thermal-box.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - Caixa térmica para o transporte do sêmen, Botutainer®

(Biotech, Botucatu, SP, Brasil) para o transporte de sêmen a

5°C. A- Caixa Botutainer fechada; B- Caixa Botutainer aberta

e preenchida por dois gelos eutéticos, no centro três amostras

de sêmen e um frasco com água; C- Caixa Botutainer aberta

com a tampa 22

Figura 2 - Média e erro padrão da motilidade espermática de 16 ejaculados

de seis cães, diluídos em plasma seminal ou meio Kenney,

imediatamente após a colheita (fresco), 24 e 48 horas após a

refrigeração 25

Figura 3 - Resultados da coloração com eosina (A) e do teste hiposmótico

(B). A. A seta preta indica espermatozóide sem coloração

(membrana íntegra) e a vermelha corado com eosina

(membrana lesada). B. A seta preta indica o espermatozóide

com a cauda reta (membrana lesada) e a vermelha o

espermatozóide com a cauda enrolada (membrana íntegra) 25

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Cães utilizados no experimento, de acordo com a raça e número

de ejaculados 20

Tabela 2 - Média do volume, concentração de espermatozóides/ml,

motilidade, vigor espermático, testes hiposmótico, coloração com

eosina e porcentagem de espermatozóides morfologicamente

normais de 16 ejaculados de seis cães, diluídos em plasma

seminal ou meio Kenney, imediatamente após a colheita

(fresco), 24 e 48 horas após a refrigeração. 24

SUMÁRIO

INTRODUÇÃO .......................................................................................................... 12

1 REVISÃO DA LITERATURA ................................................................................. 13

2 OBJETIVO ............................................................................................................. 19

3 MATERIAIS E MÉTODOS ..................................................................................... 20

3.1 ANIMAIS .............................................................................................................. 20

3.2 COLHEITA DO SÊMEN ...................................................................................... 20

3.3 AVALIAÇÃO DO SÊMEN .................................................................................... 21

3.4 REFRIGERAÇÃO DO SÊMEN ............................................................................ 22

3.5 ANÁLISE ESTATÍSTICA ..................................................................................... 23

4 RESULTADOS ....................................................................................................... 24

DISCUSSÃO......................................................................................................26

CONCLUSÃO ........................................................................................................... 31

REFERÊNCIAS ......................................................................................................... 32

INTRODUÇÃO

Em muitos países as técnicas de inseminação artificial (IA) com

sêmen refrigerado e congelado são rotineiras, bem como o conhecimento das

doenças que afetam a função reprodutiva dos cães, mas no Brasil esta realidade

ainda longe.

Tendo em vista o transporte de sêmen para IA, dois métodos podem

ser utilizados a refrigeração a 4 e 5ºC e a congelação à -196ºC porque as baixas

temperaturas diminuem as taxas metabólicas dos espermatozóides e prolongam

sua longevidade.

Taxas de concepção semelhantes têm sido relatadas na IA com

sêmen fresco e refrigerado e a qualidade do sêmen refrigerado é superior ao

congelado. Desta forma, para o transporte de sêmen dentro do país, deve ser

dada preferência à refrigeração.

A existência de poucos estudos relacionados à refrigeração do

sêmen de cão motivou esta pesquisa para avaliar a viabilidade do sêmen durante

48 horas, tempo suficiente para o envio por meios de transporte convencionais,

utilizando-se a caixa térmica Botutainer® (Biotech, Botucatu, SP, Brasil), a qual

mantém a temperatura em torno de 5°C, durante 35 horas de acordo com as

orientações do fabricante.

1 REVISÃO DA LITERATURA

Atualmente, as técnicas que visam melhorar a eficiência reprodutiva

em cães ainda são pouco difundidas no Brasil. Porém, a reprodução canina no

país vem crescendo expressivamente (VALLE, 2009).

Muitos pesquisadores estão utilizando as biotécnicas visando o

melhoramento genético e com isso têm surgido reprodutores de alto valor (LINDE-

FORSBERG; FORSBERG,1993).

Biotécnicas, que há muito tempo eram utilizadas em animais de

produção, como inseminação artificial (IA) com sêmen refrigerado e sêmen

congelado, hoje são procuradas por criadores de cães brasileiros. Contudo, seu

sucesso pode ser ameaçado pelo desconhecimento dos clínicos de pequenos

animais e também pela utilização errônea por leigos (VALLE, 2009).

Os primeiros estudos relacionados a IA e conservação do sêmen de

cães foram feitos por Lázaro Spallanzani, no final do século XVIII (ENGLAND,

1993). Embora os árabes tenham usado a IA em equinos, no século XIV (1332),

antes de Spallanzani, acredita-se que seus estudos foram os primeiros dos

tempos modernos a obter uma gestação por IA, utilizando o cão como modelo. Em

1780, este pesquisador colheu o sêmen por sifonagem da vagina de uma cadela,

acasalada naturalmente, para inseminar outra cadela no cio, da qual nasceram

três filhotes. Foi também Spallanzani, em 1776, o primeiro a observar que a

diminuição na temperatura reduzia reversivelmente, a atividade metabólica dos

espermatozóides, permitindo dessa forma sua estocagem (JOHNSTON, 2000).

Em 1949, a descoberta da ação crioprotetora do glicerol, por Polge et

al. (1949), proporcionou um impacto significante na metodologia da

criopreservação dos espermatozóides. Rowson, em 1954, descreveu a técnica de

congelação na espécie canina. E, em 1956, Harrop descreveu uma gestação de

cão obtida por inseminação com sêmen refrigerado (JOHNSTON, 2000).

Em 1969, Seager obteve a primeira gestação canina com sêmen

criopreservado (SILVA, 2007). Durante as últimas décadas, o interesse pela

inseminação artificial (IA), em cães, cresceu substancialmente. No Brasil, os

primeiros relatos de IA com sêmen refrigerado, em cães, foi o de Silva et al., em

2004, seguido por Apparício et al. (2007) e Uchoa et al. (2007).

O principal objetivo da IA, em cães, é viabilizar a gestação quando a

monta natural não é possível, seja por incompatibilidade do casal, assim como por

distância geográfica. A técnica também reduz o risco de transmissão de doenças

entre machos e fêmeas, além de minimizar os riscos com o transporte do animal.

Nestes casos, o sêmen pode ser refrigerado ou congelado. Embora o sêmen

refrigerado sofra menores danos pela temperatura, as taxas de concepção, de

cadelas inseminadas com sêmen refrigerado, são menores do que aquelas

inseminadas com sêmen fresco ou monta natural (ENGLAND; PONZIO, 1996;

JOHNSTON et al., 2001; RIJSSELAERE et al., 2002; SILVA et al., 2004).

Quando o sêmen necessita ser transportado para proposta de IA,

dois métodos podem ser utilizados: o sêmen congelado (-196°C) e o refrigerado

(5°C) (ENGLAND; PONZIO, 1996). As baixas temperatur as diminuem as taxas

metabólicas do espermatozóide e prolongam sua longevidade (WATSON, 1995).

A despeito do curto período de armazenamento da técnica de refrigeração, a

vantagem é que a qualidade do sêmen refrigerado é superior à do congelado

(ENGLAND; PONZIO, 1996), sendo uma técnica viável para curtos períodos de

armazenamento. Ademais, a técnica de refrigeração apresenta menor custo, outra

vantagem do sêmen refrigerado, em relação ao congelado, é o menor dano às

células espermáticas, com taxas de gestação superiores (STORNELLI et al.,

2001). Contudo, com longos períodos de estocagem, o sêmen refrigerado se

deteriora (ENGLAND; PONZIO, 1996). Quanto ao sêmen congelado, embora

possa ser armazenado por longos períodos (anos), a viabilidade e longevidade

espermática são prejudicadas e, conseqüentemente, a fertilidade (OETTLÉ, 1986;

ENGLAND, 1993; ENGLAND; PONZIO, 1996).

Pinto et al. (1999) estudaram a fertilidade de cadelas inseminadas

com sêmen refrigerado. Estes pesquisadores não encontraram diferença

significativa na taxa de gestação e tamanho da ninhada, entre os grupos de

cadelas inseminadas com sêmen fresco (94%, média tamanho da ninhada = 7,2) e

as inseminadas com sêmen refrigerado por 24 horas (90%, média tamanho da

ninhada = 7,2) ou 48 horas (100%, média tamanho da ninhada = 7,0). Neste

estudo de Pinto et al. (1999) o sêmen foi mantido sob refrigeração durante 48

horas e as cadelas foram inseminadas três vezes durante 1 semana, durante o

estro citológico.

Segundo Gunzel-Apel e Krause (1986), a fertilidade do sêmen

refrigerado é de, no máximo 72 horas. Contudo, Feldman e Nelson (1996),

afirmaram que, se o sêmen for adequadamente diluído e refrigerado, os

espermatozóides podem manter-se vivos e viáveis por até cinco dias.

Experimentos recentes comprovam a permanência de viabilidade espermática por

tempo mais prolongado.

A despeito da existência de diversos estudos sobre a congelação do

sêmen do cão, a literatura é escassa quanto à refrigeração. Raros relatos sobre

refrigeração dos espermatozóides caninos em temperaturas superiores a 5°C têm

sido encontrados.

England e Ponzio (1996) verificaram uma alta qualidade do sêmen

após 48 horas de refrigeração a 5°C. Contudo, a tax a de declínio da qualidade

espermática foi diferente para cada parâmetro motilidade, vigor, teste hiposmótico

e coloração com eosina, de acordo com o tempo, sendo a morfologia espermática

o que se deteriorou mais rapidamente. Aproximadamente, com cinco dias de

refrigeração, a qualidade do sêmen refrigerado foi equivalente à qualidade de um

sêmen descongelado.

A refrigeração do sêmen, durante 24 a 48 horas, pode ser um passo

inicial para a congelação, quando há impossibilidade do congelamento logo após

a colheita. Para esta proposta, Hermansson e Linde-Forsberg (2006) congelaram

o sêmen de cão, após um ou dois dias de refrigeração a 4°C. Nenhuma diferença

foi verificada na motilidade e integridade da membrana espermática e acrossomal,

quando comparado àquele congelado logo após a colheita.

As características de um bom sêmen, para a espécie canina, de

acordo com o Colégio Brasileiro de Reprodução Animal (CBRA) são: volume

variável, motilidade maior que 70%, vigor maior que três e concentração

espermática total acima de 200x106 de espermatozóides.

É difícil, também, determinar a fertilidade dos machos caninos devido

às variações inerentes aos ejaculados, variações no ciclo estral da cadela, sua

duração a falta de protocolos efetivos para sincronização do cio, tudo isso

utilizando testes in vitro esporádicos dificultam a análise dos resultados sobre a

capacidade fecundante das amostras (EILTS, 2005; MINTER; DELIBERTO, 2005)

Ademais, os bons resultados obtidos com refrigeração se devem á boa qualidade

do sêmen, a qual deve ser avaliada no momento da sua preparação e antes de

sua utilização, bem como o controle da ovulação da fêmea (VALLE, 2009).

A refrigeração e a congelação do sêmen só são possíveis com o uso

de meios diluentes capazes de conservar uma boa motilidade e integridade da

membrana espermática (BOUCHARD et al., 1990). O diluente é capaz de proteger

a membrana espermática dos danos causados pela modificação de temperatura.

Além disso, o diluente é fonte de energia e mantém estáveis o pH e a

osmolaridade (LARDY; PHILIPS, 1939, MARSHALL; HUGH, 1990) e contêm

antibióticos que evitam a contaminação bacteriana (ROTA et al., 1995). O meio

diluente mantém a pressão osmótica e a concentração de eletrólitos dentro dos

padrões fisiológicos e possue crioprotetores que protegem as células de lesões

provocadas pelo choque térmico, oriundo do processo de resfriamento

(CONCANNON; BATTISTA, 1989). A melhor maneira de avaliar o diluente é

através da taxa de concepção apresentada pela cadela após a IA, porém esta

avaliação muitas vezes torna-se inviável na experimentação (LOPES et al., 2005)

Vários diluentes para conservação de sêmen já foram estudados. Na

maioria dos trabalhos realizados utilizou-se o meio TRIS/gema de ovo, contendo

frutose ou glicose, meio citrato/gema de ovo e meios comerciais (FOOTE, 1964;

FOOTE; LEONARD, 1964; GILL et al., 1970; SEAGER; FLETCHER, 1972;

FARSTAD, 1984; PROVINCE et al., 1984; MORTON; BRUCE, 1989; BOUCHARD

et al., 1990; LINDE-FORSBERG, 1995, FELDMAN; NELSON, 1996; SCHAFER et

al., 1997; PINTO et al., 1999; IGUER-OUADA; VERSTEGEN, 2001a; 2001b;

TSUTSUI et al., 2003). A frutose, numa concentração de 1 a 10 mM, indica maior

linearidade e menor oscilação nos parâmetros de motilidade quando comparada à

glicose (RIGAU et al., 2001). Contudo, o meio mais popular e simples é o Kenney,

composto de leite desnatado (0,5% de gordura) (KENNEY et al., 1975).

Verstegen et al. (2005) avaliaram a troca de meio, nos parâmetros de

motilidade do sêmen refrigerado em diluente TRIS-glicose-gema de ovo, por um

período de 27 dias. Nas amostras sem a troca de meio, foi observada ausência de

motilidade, aos 16 dias. Com a troca de meios, a motilidade foi ausente somente

com 27 dias. A fertilidade foi avaliada e cinco entre dez cadelas apresentaram-se

gestantes quando a IA foi realizada apenas uma vez, por via vaginal, com sêmen

refrigerado, por nove dias. Ademais, sete entre dez cadelas foram gestantes,

quando a inseminação foi realizada duas vezes. Concluíram que é possível a

conservação do sêmen a 4°C, por no mínimo, três sem anas com boa fertilidade

por até 10 dias.

Bouchard et al. (1990) estudaram as características do sêmen de

cães mantido a 4°C, utilizando dois meios: leite de snatado/glicose ou citrato gema

de ovo. O sêmen diluído foi submetido a três diferentes temperaturas de

estocagem (35°C, 22°C e 4°C); e três taxas de refri geração (4°C) foram

investigadas (-1,0, -0,3 e -0,1°C/min). O sêmen foi avaliado a cada seis horas, até

120 horas. O meio contendo leite desnatado foi superior ao citrato/gema, na

maioria das observações, na manutenção da motilidade espermática. Além disso,

a motilidade espermática foi significantemente maior quando o sêmen foi

conservado a 4°C. A motilidade foi maior quando for am utilizadas taxas médias ou

rápidas de refrigeração.

Segundo Messias (2000), o sêmen canino refrigerado (4°C) diluído

em TRIS-gema mostrou-se superior ao diluente leite desnatado. Os diluentes

TRIS-gema e leite desnatado, quando acrescidos de secreção prostática,

mostraram-se inferiores nos parâmetros motilidade progressiva e integridade do

acrossomo (p < 0,05). O tempo de viabilidade do sêmen, que apresentou mínimo

de 50% de motilidade progressiva, com os referidos diluentes foi: TRIS-gema: 82,5

horas; leite desnatado: 60,7 horas; TRIS – gema acrescida de secreção prostática:

60,3 horas; leite desnatado acrescido de secreção prostática: 38,4 horas. Os

diluentes acrescidos de secreção prostática não apresentaram resultados

satisfatórios na conservação do sêmen canino a 5°C.

Iguer-Ouada e Verstegen (2001a) encontraram uma média de 86,3%

de motilidade, para o meio Byladil acrescido de gema de ovo, sete dias após a

refrigeração do sêmen a 4°C. A motilidade foi manti da até em média, 9,7 e 13 dias

para os diluentes TRIS-frutose e TRIS-glicose, respectivamente. Os meios

contendo gema de ovo preservaram a qualidade espermática e preveniram a

precoce reação do acrossomo, podendo preservar uma boa viabilidade até 10 dias

de refrigeração, desde que a temperatura seja mantida.

O uso de caixas isotérmicas para o envio de amostra de sêmen,

entre regiões distantes, permite uma melhor programação para o destino das

amostras e evita a perda do material (MOTA-FILHO et al., 2007).

Para o transporte, existem sistemas de resfriamento passivos e

ativos. Os passivos apresentam menor custo, porém sua eficiência depende de

alguns fatores, tais como: temperatura ambiente; da amostra; do produto

refrigerado e da massa da amostra. Já os sistemas ativos, apesar de mais caros,

permitem melhores taxas de resfriamento, pois a temperatura é pré-estabelecida

(VALLE, 1999). Exemplo de um sistema passivo são as caixas térmicas de isopor

e de um sistema ativo, o refrigerador doméstico.

A conservação do sêmen do cão já foi descrita em salas climatizadas

(IGUER-OUADA; VERSTEGEN, 2001a; 2001b; VERTEGEN et al., 2005),

refrigeradores convencionais (ROTA et al., 1995; STROM-HOLST et al., 2000;

PONGLOWHAPAN et al., 2004), garrafas térmicas, recipientes térmicos

comerciais tais como Lane STS System (PINTO et al., 1999), Botutainer

(NAGAO et al., 2007) e caixas isotérmicas de poliestireno expandido (SILVA et al.,

2004, MOTA-FILHO et al., 2007). Sistemas utilizando caixas de poliestireno

expandido (isopor), como o Max Semen Express são os mais simples,

disponíveis comercialmente, porém não possuem controle algum de temperatura.

Nenhuma das caixas produzidas no Brasil é própria para o transporte do sêmen

canino (comunicação pessoal, SOUZA, 2009).

Quando se compara os containeres para o sêmen congelado (botijão

de nitrogênio líquido) e refrigerado (caixa térmica), pode-se afirmar que as caixas

térmicas são mais leves e por este motivo, o transporte de custo menor, o que

pode ser outra vantagem.

Segundo o fabricante a caixa Botutainer é um container

desenvolvido para a refrigeração de sêmen, demonstrando alta eficiência na

manutenção da temperatura interna, mesmo sobre estresse calórico ambiental.

Sua taxa de refrigeração é de 0,05ºC/min, mantendo a temperatura de 5ºC, por

até 35 horas.

Mota-Filho et al. (2007) comentam a necessidade de mais estudos

para determinar o período máximo de conservação do sêmen, em caixas

isotérmicas. Tais estudos podem contribuir para determinação de uma caixa e

meio diluente ideal para refrigeração do sêmen canino, com fins de aplicação

comercial, além de servir como modelo para o transporte de sêmen de espécies

ameaçadas de extinção (LOPES et al., 2005).

2 OBJETIVO

O objetivo do presente estudo foi determinar a viabilidade das células

espermáticas de cães mantidas a 5°C, durante 24 e 48 horas, de acordo com suas

características morfológicas e funcionais, utilizando: volume, cor, motilidade e

vigor, concentração espermática, morfologia espermática, teste hiposmótico e

coloração supra-vital, em caixa térmica Botutainer para sua aplicação comercial.

3 MATERIAIS E MÉTODOS

3.1 ANIMAIS

Utilizaram-se 16 ejaculados de seis (n = 6) cães adultos, de

diferentes raças ou sem raça definida (tabela 1) com idades entre dois e cinco

anos, saudáveis, avaliados pelo exame clínico e histórico de saúde, provenientes

de criatórios particulares e treinados para colheita. Os machos foram alimentados

com ração comercial e água à vontade.

Tabela 1 – Cães utilizados no experimento, de acordo com a raça e número de

ejaculados.

Cão Raça Número de ejaculados Peso

1 Border Collie 4 19,3 Kg

2 Rottweiler 4 35,1 Kg

3 Labrador 2 25 Kg

4 Labrador 3 21 Kg

5 SRD 2 15 Kg

6 SRD 1 18 Kg

3.2 COLHEITA DO SÊMEN

Após o período de adaptação e condicionamento (três semanas), os

cães foram submetidos a duas colheitas de sêmen, com intervalo médio de sete

dias entre cada uma. O ejaculado foi colhido por manipulação digital, em tubo

plástico graduado e funil acoplado, sem auxílio de fêmea no cio (SEAGER;

PLATZ, 1977).

3.3 AVALIAÇÃO DO SÊMEN

O sêmen foi avaliado, imediatamente após a colheita, e com 24

horas e 48 horas de refrigeração.

Após a colheita, o sêmen foi avaliado, no prazo máximo de 15

minutos, segundo as suas características morfológicas e funcionais. Foram

avaliados os seguintes parâmetros:

Volume: determinado pela graduação do tubo plástico utilizado na

colheita em ml.

Cor: determinada pela visualização direta, considerando a cor branca

opalescente como normal.

Motilidade e vigor: determinados com uma gota de sêmen colocada

sobre lâmina aquecida (38–40ºC) e recoberta por lamínula, sendo os parâmetros

de 0 a 100% para motilidade e um escore de 0 a cinco para o vigor, de acordo

com a qualidade do movimento dos espermatozóides.

Concentração espermática: foi realizada em câmara hematimétrica

de “Neubauer” após a diluição do sêmen total na proporção de 1: 20 em água

destilada. Os espermatozóides foram contados sob microscópio de contraste de

fase, em aumento de 20X e o número de células foi expresso em ml.

Morfologia espermática: foi avaliada em uma única oportunidade,

após a colheita de todas as amostras e após 24 e 48 horas pelo método de Karras

modificado (PAPA et al; 1986).

Teste hiposmótico: realizado segundo a técnica descrita por

JEYENDRAN et al. (1984), considerando que espermatozóides com cauda

enrolada mantinham a membrana íntegra e os espermatozóides com cauda lisa

tinham a membrana lesada.

Coloração supra-vital: avaliada pelo método da eosina (eosina

amarela 3% em solução fisiológica - HAFEZ, 1995, PEÑA, 2000), considerando

que espermatozóides sem coloração tinham a membrana íntegra e

espermatozóides que coravam-se em vermelho tinham a membrana lesada.

3.4 REFRIGERAÇÃO DO SÊMEN

Após a análise, o sêmen foi dividido em quatro alíquotas e colocado em

tubos plásticos de 5 ml. As amostras foram centrifugadas a 700xg, durante 10

minutos. O sobrenadante plasma seminal, foi eliminado dos tubos, sendo duas

amostras diluídas em 1,0 ml de meio Kenney 1:1 (KENNEY et al., 1975) e os dois

tubos restantes rediluídos no plasma seminal provenientes da centrifugação.

Os tubos contendo o sêmen diluído (Kenney ou plasma seminal) foram

fechados com tampa e acondicionados na caixa térmica Botutainer. No momento

da avaliação, uma alíquota de cada tubo (sêmen diluído em plasma seminal ou em

Kenney) foi retirada.

A alíquota retirada da caixa térmica foi colocada, em estante para

tubos sobre placa aquecedora a 38ºC, durante 10 minutos, e após este período foi

avaliada quanto à motilidade, ao vigor, à morfologia, à coloração supra-vital com

eosina e ao teste hiposmótico.

Figura 1 - Caixa térmica, Botutainer (Biotech, Botucatu, SP, Brasil) para o

transporte de sêmen a 5°C. A - Caixa Botutainer fechada; B - Caixa Botutainer aberta e preenchida por dois gelos eutéticos; no centro três amostras de sêmen e

um frasco com água ( seguindo a orientação do fabricante); C- Caixa Botutainer

aberta com a tampa.

3.5 ANÁLISE ESTATÍSTICA

Os resultados foram expressos na forma de média e erro padrão. As

análises dos resultados, referentes às características seminais, foram realizadas

pelo Mann-Whitney Rank Sum Test, utilizando o programa SigmaStat for

Windows, v.3.0.1 (2003). A diferença mínima significativa considerada foi p<0,05.

A

B

C

4 RESULTADOS

A análise do sêmen fresco encontrou-se dentro dos parâmetros

normais para a espécie (Tabela 1).

Os resultados da análise do sêmen fresco, e após 24 e 48 horas de

refrigeração a 5°C, diluído em plasma seminal (cont role) ou meio Kenney estão

apresentados na Tabela 1.

Todos os parâmetros avaliados no sêmen fresco foram superiores

(p<0,05) aos do sêmen refrigerado, seja em plasma seminal ou meio Kenney. Na

Figura 2, é possível observar que o sêmen mantido em meio Kenney apresentou

maior motilidade (p<0,05) do que o mantido em plasma seminal, utilizado como

controle, quando comparados em qualquer situação. A qualidade do movimento

(vigor espermático) foi mantida tanto no sêmen diluído no plasma seminal

(p>0,05), assim como no meio Kenney.

Estatisticamente, maior lesão da membrana espermática foi

observada no sêmen refrigerado em plasma seminal e meio Kenney, durante 48

horas, avaliado pelo teste hiposmótico, e do sêmen refrigerado em meio Kenney,

durante 48 horas, avaliado pela coloração com eosina (Figura 3).

Tabela 2 - Médias e erros padrão do volume (VOL), concentração de

espermatozóides/ml (CONC/ml), motilidade espermática (MOT), vigor espermático

(VIG), teste hiposmótico (HIPOSM), coloração com eosina (EOS) e porcentagem

de espermatozóides morfologicamente normais (NORM) de 16 ejaculados de seis

cães, diluídos em plasma seminal ou meio Kenney, imediatamente após a colheita

(fresco), e 24 e 48 horas após a refrigeração.

TRAT VOL

(ml)

CONC/ml

(x106)

MOT

(%)

VIG

(0 a 5)

HIPOSM

(%)

EOS

(%)

NORM

(%)

FRESCO 2,3 150,4 96,8a 4,1a 89,9a 88,0a,b,c 73

Plasma

seminal

24 h -- -- 60,0b 2,8b 84,7a,b 85,3a --

48 h -- -- 47,5c 2,8b 81,3b 80,7a,b,c --

Kenney 24 h -- -- 79,7d 3,3b 84,5a,b 80,0a,b,c --

48 h -- -- 65,8b 2,8b 79,2b 77,9c --

Letras diferentes nas colunas indicam diferença estatística significativa (p<0,05).

Figura 2 - Média e erro padrão da motilidade espermática de 16 ejaculados de

seis cães, diluídos em plasma seminal ou meio Kenney, imediatamente após a

colheita (fresco), 24 e 48 horas após a refrigeração.

Mot

ilida

de (

%)

30

40

50

60

70

80

90

100

110

Plasma seminalKenney

Fresco 24 horas 48 horas

Figura 3 – Resultados da coloração com eosina (A) e do teste hiposmótico (B). A.

A seta preta indica espermatozóide sem coloração (membrana íntegra) e a

vermelha corado com eosina (membrana lesada). B. A seta preta indica o

espermatozóide com a cauda reta (membrana lesada) e a vermelha o

espermatozóide com a cauda enrolada (membrana íntegra).

A B

DISCUSSÃO

O armazenamento de germoplasma abre fronteiras para o estudo

da preservação de espécies de canídeos silvestres, sendo uma das principais

formas de aumentar a variabilidade genética (JOHNSTON ;LACY, 1995). Neste

contexto, novos métodos têm sido desenvolvidos no intuito de viabilizar a

criopreservação e técnicas de avaliação da função espermática, no cão.

Em vista da dificuldade de se realizar testes in vivo, para avaliação

da fertilidade no cão, e sabendo que os ensaios in vitro são capazes de mostrar

quais os aspectos da função espermática estão alterados (AMANN, 1989; ZHANG

et al., 1999) nesse estudo foram utilizadas técnicas convencionais (motilidade,

vigor, concentração e morfologia espermática) e complementares para avaliar

(teste hiposmótico e coloração com eosina). Desta forma, acreditou-se que a

união desses testes seria capaz de predizer a fertilidade in vivo.

A principal forma de se avaliar a célula espermática in vitro é

determinar suas características morfofuncionais (EILTS, 2005). A avaliação da

motilidade espermática é a mais comum e informa sobre uma das características

necessárias ao espermatozóide para a fertilização. Apesar disto, a correlação

entre a motilidade e a capacidade fertilizante da célula espermática ainda não é

totalmente esclarecida e os achados são conflitantes (ENGLAND & ALLEN, 1989,

SÖDERQUIST et al., 1991, KJAESTAD et al., 1993, IVANOVA-KICHEVA et al.,

1997, SANCHEZ-PARTIDA et al., 1999, TARDIF et al., 1999). No estudo aqui

apresentado, a motilidade do sêmen mantido a 5°C, durante 48 horas, manteve-se

próxima (65,8%) daquela recomendada como mínima (70%), para o sêmen fresco,

pelo Colégio Brasileiro de Reprodução Animal (CBRA). Já que a motilidade tem

sido correlacionada positivamente à fertilidade in vitro, determinada pelo teste de

penetração em zona pelúcida (HOLT et al., 1985, FETTEROLF & ROGERS,

1990), acredita-se que esse sêmen poderia ser capaz de promover a fertilização.

Comparando-se os resultados deste estudo, com os descritos na

literatura, os aqui apresentados foram inferiores aos encontrados por Verstegen et

al. (2005), que refrigeram a 4°C, o sêmen canino por longos períodos (até 27 dias)

com meio TRIS- gema- glicose. Nos dias 11, 21 e 27 o meio foi trocado e a

motilidade espermática recuperada, parcialmente. A motilidade total média,

avaliada por análise computadorizada (CASA), manteve-se em 68% até o 11° dia.

Contudo, o meio descrito nos estudos de Verstegen et al. (2005) foi diferente do

utilizado neste estudo (Kenney). Além disso, as condições dos estudos não são

semelhantes. Nesse estudo, utilizou-se uma caixa térmica, na qual a temperatura

não é constante e é mantida por tempo limitado, sendo possível a refrigeração por

poucos dias. Já no estudo de Verstegen et al. (2005), utilizaram-se refrigeradores.

De acordo com Iguer-Ouada e Verstegen (2001), meios contendo

gema de ovo preservam a qualidade espermática e previnem a precoce reação do

acrossomo, podendo preservar uma boa viabilidade até 10 dias de refrigeração,

desde que a temperatura seja mantida. Em eqüinos, Melo et al. (2005) também

descrevem a melhor qualidade do sêmen refrigerado em meio contendo gema de

ovo. Tais observações não foram confirmadas aqui anteriormente em um estudo

piloto, pois a proposta inicial foi utilizar o meio TRIS-gema-glicose, mas a

qualidade do sêmen foi inferior e optou-se por utilizar o meio Kenney, o qual

mostrou resultados superiores.

Contrariamente, o estudo de Bouchard et al. (1990) descreveu

superioridade do meio contendo leite desnatado quando comparado ao

citrato/gema, na maioria das observações, para manter a motilidade espermática.

Messias (2000) relatou que o sêmen canino refrigerado (4°C) diluído em TRIS-

gema mostrou-se superior ao diluente leite desnatado, sendo que a motilidade

mínima de 50% foi observada até 60,7 horas, quando se usou o meio à base de

leite desnatado. De acordo com os resultados desse estudo, a motilidade

espermática foi superior a 60%, até 48 horas de manutenção na caixa térmica.

A avaliação da funcionalidade da membrana pode ser usada como

um indicador da capacidade de fertilizar do espermatozóide (JEYENDRAN et al.,

1984). Neste estudo a integridade da membrana avaliada pelo teste hiposmótico

foi menor no sêmen refrigerado, contudo manteve-se nas 48 horas de

refrigeração, próximo aos 80%. A integridade da membrana é um método

complementar para avaliação morfofuncional da célula espermática, sendo

importante para o metabolismo espermático e, consequentemente, para o sucesso

da fertilização (JEYENDRAN et al., 1984).

O uso do teste hiposmótico têm sido descrito em diversas

espécies, principalmente em humanos. É baseado no comportamento do

espermatozóide frente a um meio hiposmótico. Na tentativa de equilibrar os meios

extra e intracelular, ocorre um influxo de água através da membrana, provocando

um edema. Com o edema, a cauda “enrola-se” e esta alteração é facilmente vista

em microscópio de contraste de fase. A capacidade da cauda espermática em

enrolar-se, devido ao edema provocado pela solução hiposmótica, é um sinal que

o transporte de água através da membrana está ocorrendo normalmente, e que a

mesma está íntegra e funcional. Acredita-se que a membrana da cabeça tenha o

mesmo comportamento que a da cauda, porém estas alterações não são

observadas (JEYENDRAN et al., 1984).

A capacitação e a fusão entre os gametas estão positivamente

correlacionadas aos resultados do teste hiposmótico; assim, estes processos não

ocorreriam se a membrana da cabeça não estivesse íntegra. A avaliação da

funcionalidade da membrana pode ser usada como um indicador da capacidade

de fertilizar do espermatozóide (JEYENDRAN et al., 1984), o que no estudo

apresentado indicaria sêmen com capacidade fertilizante.

A sensibilidade do teste hiposmótico tem gerado grande discussão

em virtude da sua correlação ou não com a motilidade espermática; isto porque a

motilidade dos espermatozóides não é dependente somente do transporte de

elementos pela membrana, mas de inúmeros fatores bioquímicos

(MOHANACHANDRAN NAIR et al., 1998). Contudo, estudos têm demonstrado a

correlação do teste hiposmótico com a reação do acrossomo (JEYENDRAN et al.,

1984), fertilidade in vitro (JEYENDRAN et al., 1984) e in vivo (REVELL & MRODE,

1994), podendo aumentar, de forma significativa, a previsão da capacidade de

fertilização do sêmen (FRASER, 1984).

A coloração com eosina é utilizada para determinar os

espermatozóides vivos e mortos e pode estar associada ou não à nigrosina.

Quando associada à nigrosina, o fundo da lâmina cora-se em preto, aumentando o

contraste e facilitando a visibilização (BJOÈRNDAHL et al., 2003). Esta coloração

é bem conhecida e amplamente usada em diferentes espécies (BLOM, 1950;

ELIASSON; TREICHL, 1971; DOTT; FOSTER, 1972; MORTIMER et al., 1990).

Quando as duas técnicas são comparadas, a eosina (ELIASSON; TREICHL,

1971) apresenta resultados da somatória entre a motilidade espermática e a

porcentagem de espermatozóides mortos, abaixo de 100%, o que não é o

esperado. Segundo a literatura, tal fato não foi elucidado (BJOÈRNDAHL et al.,

2003), e, provavelmente, ocorra devido a uma superestimação da motilidade ou da

porcentagem de espermatozóides vivos. Claramente pode ser observado tal fato

neste estudo, no qual a motilidade espermática diminuiu de acordo com o tempo

de refrigeração, contudo a porcentagem de espermatozóides corados pela eosina

(mortos) se manteve-se, praticamente, inalterada.

Segundo Walles e White (1963) e England (1993), as altas taxas de

diluição causam um decréscimo significativo na motilidade do sêmen de cães.

Neste estudo, o sêmen foi diluído, em média a 150x106/ml, ou seja, a diluição não

foi excessiva e permitiu a manutenção da motilidade, pois segundo Mann (1964), a

diluição excessiva leva à perda da motilidade, da atividade metabólica e

capacidade fertilizante da célula espermática.

De acordo com Pinto et al. (1999) não há diferença significativa na

taxa de gestação e tamanho da ninhada entre cadelas inseminadas com sêmen

fresco (94%, média tamanho da ninhada = 7,2) e as inseminadas com sêmen

refrigerado por 24 horas (90%, média tamanho da ninhada = 7,2) ou 48 horas

(100%, média tamanho da ninhada = 7,0). A motilidade espermática média no

estudo de Pinto et al. (1999) foi de 49,6 a 51,6% com 48 horas de refrigeração.

Estes autores também utilizaram o meio Kenney e nossos resultados foram

semelhantes, com os quais poderíamos concluir que o sêmen manteve a

viabilidade por até 48 horas de refrigeração e poderia ser utilizado para a

inseminação artificial.

De acordo com Tsutsui et al. (2003), o sêmen pode ser estocado a

4ºC e utilizado para IA por até dois dias, sem a utilização de meio diluente, o que

está de acordo com os resultados deste estudos, sendo que o sêmen, diluído em

plasma seminal, manteve a motilidade próxima a 50% com 48 horas de

refrigeração. Nos estudos de Tsutsui et al. (2003), o sêmen foi mantido em

refrigerador com temperatura controlada, por até 6 dias, com alta motilidade

(60,7%). Porém, cinco cadelas foram inseminadas e nenhuma tornou-se gestante.

Contrariamente, o sêmen refrigerado por dois dias manteve uma alta motilidade e

fertilidade, sendo a taxa de concepção de 70%. Este estudo de Tsuitsui comprova

que, embora o sêmen possa ser refrigerado por longos períodos, para a

manutenção da motilidade, é necessário um refrigerador com temperatura

controlada e constante, podendo haver contudo, o comprometimento da

fertilidade.

Mota-Filho et al. (2007) estudaram a refrigeração do sêmen em

caixas térmicas de poliestireno, utilizando leite desnatado, gema de ovo e

antibióticos. O sêmen foi avaliado durante 30 horas e a motilidade, neste período,

variou entre 55% e 63,8%, para as respectivas caixas de 3l e 5l. A temperatura

interna foi mais estável na caixa de 5l, sendo próxima a 5ºC, durante as 30 horas

de refrigeração. Embora, neste estudo os parâmetros não tenham sido avaliados

com 30 horas de refrigeração, os resultados são semelhantes aos de Mota-Filho et

al.(2007). Apesar de serem caixas térmicas diferentes, a manutenção da

temperatura foi semelhante a da Botutainer, que mantém a temperatura estável

por um tempo superior a 30 horas (35 horas). No estudo, o sêmen foi avaliado até

as 48 horas de refrigeração e a motilidade média foi superior (65,8%) aos

resultados de Mota-Filho et al. (2007). Estudos de Nagao et al, 2007 com

ejaculados três cães rerodutores e epidídimos de três cães submetidos a

orquiectomia utilizando o diluente Botu-Sêmen, mantidos em containers Botu-

Box e Botutainer de transporte de sêmen por 10 e 18 horas respectivamente e

posteriormente por 72 horas em geladeira a 4ºC, não encontraram diferença

significativa nos valores espermáticos resultantes nos dois containers, em relação

aos espermatozóides obtidos do epidídimo, houve uma queda significativa da

qualidade logo após a refrigeração, ou seja, o meio utilizado no estudo não

promoveu proteção suficiente ao estresse térmico da refrigeração.

CONCLUSÃO

A caixa Botutainer pode ser utilizada comercialmente para o envio

do sêmen canino refrigerado, por meios de transporte convencionais, pois mantém

a viabilidade espermática por até 48 horas.

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