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HS 2008 Xiangyang Zhang 1

Analytische Chemie für Biologie Pharmazie Bewegungs-

wissenschaften und Sport

Teil Chromatographische und Elektrophoretische Trennverfahren

Zusammenfassung


Überblick Trennmethoden

Beweblichkeit

in Einzelphase Gleichgewicht

Beweblichkeit

1 2 + + +

1

2 m

S

Verteilung

Adsorption/Desorption

Beruht auf

Unterschied in Gleichgewicht / Kinetische Eigenschaften


Ein Chromatogramm

norm

iert

e S

ignalh

öhe h

tM

tA

tB

ZeitwA wB

B

A


Klassische Grundlage

!

K =A[ ]

S

A[ ]M

!

v =L

tR

!

u =L

tM

!

k = KVs

VM

!

k =tR" t

M

tM

=tR

'

tM

!

" =K

B

KA

!

" =kB

kA

!

" =(tR

')B

(tR

')A

!

N = Neff "k +1

k

#

$ %

&

' (

2

=tR'

)

#

$ %

&

' (

2

"k +1

k

#

$ %

&

' (

2!

N =L

H=tR

2

" 2=16

tR

w

#

$ %

&

' (

2

!

tR

'= t

R" t

M

Trennfaktor / Selektivätsfaktor

Retentionsfaktor / Kapazitätsfaktor

Retentionszeit / Geschwindigkeit

Verteilungskoeffizient

Auflösung !

H =L

16

w

tR

"

# $

%

& '

2

Bodenzahl und Bodenhöhe

!

R =tB" t

A

wB

+ wA

2

=2(t

B" t

A)

wB

+ wA

!

R =" #1

"

$

% &

'

( ) *

kB

1+ kB

*N

4


Kinetischer Bodenhöhe

Minimaler H-Wert

Theore

tische B

odenhöhe H

!

H = 2" # dp +2kD #DM

u+ u #

f (dp2,dc

2)

DM

+q # k # d f

2

(1+ k)2DS

oder2td # k

(1+ k)2

$

% &

'

( )

optimale u

Minimum H

1.! Kapillarsäulen A = 0

2.! Optimale u => minimum

von Terme B und C

3.! Dünne L-Filmdicke


Gaschromatographie (GC) Mobile Phase: He, N2 und H2 als Träger Stationäre Phase: entweder feste Adsorbentien oder flüssige Film

Analyten: •! ausreichenden Dampfdruck und •! stabil bei Arbeitstemperatur •! Kleine, neutral und nicht-zu polare Moleküle

Gekoppelt: •! mit MS zur qualitativen Analysen (Strukturaufklärung) •! mit FID (und TCD, unselektiv) und ECD (Cl-), FPD (P-/S-)

(selektiv) zur quantitativen Analysen

Zur Anwendungen: •! Säulenparameter, T–Gradient und u •! Derivatisierung


Flüssige Stationäre Phase in GC

Physikalisch adsorbiert auf poröse Kieselgur (diatomite) mit grossen Oberfläche

Chemikalische Modifizierung von OH-gruppen durch organische Seitengruppen

Si

CH3

CH3

O

n

Si

CH3

CH3

O

n

Si

Ph

Ph

O

m

Si

CH3

CH3

O

n

Si

Ph

O

m

CN

Si O

n O

O

COOH

OO

OOC

n

Polysiloxan

unpolar polar

mit Phenylgruppe mit Cyanogruppe

Ethyleneglycol Ethyleneglycol, Phenyl, und Ester-gruppen

Polare Flüssigkeitsfilm


k N Säulenparameter

und Bedingung Kapazität Geschwindigkeit

R

! ! ! L ! ! "

!

" ! " ID ! ! "

"

! ! " df ! ! "

! "

" ! ! T ! ! !

" !

! ! opt u ! ! !

opt

Optimierung zur GC

Polarität und Flimdicke der SP, u der MP, T und Säulenparameter


HPLC: Apparatur, Typen und MP

300 – 400 bar

LM 10 ml/min

He/Ar

LM Behälter

Detektor

Vorsäule

Pumpe

Injektorvalve

LM Aufteilungsvalve

Trennsäule

!! Adsorptions-Chromatographie

!! Verteilungs-Chromatographie

!! Umkehrphasen-Chromatographie

"! Ionenaustausch-Chromatographie (IEC)

"! Ionenpaaren-Chromatographie

"! Grössenausschluss-Chromatographie (GPC)

#! Affinitäts-Chromatographie

#! Komplexierungschromatographie

#! Chirale Chromatographie

Mobile Phase:

Reinheit, Siedepunkt, Preis, Inert,

Korrosions-beständigkeit,

Toxizität, UV–Durchlässigkeit,

Brechungsindex, Mischbarkeit,

Puffer, Haltbarkeit

"! Viskosität

"! Elutionsstärke

"! Selektivität


Normalphase (NP) und Umkehrphase (RP)

Si

O

OH

O Si

Si

O

OH

O Si

O

OH

OH

SiSi O OO Si

OH

OH

OH

single silanol group

two silanol group

three silanol group

Si

OH

Si

R2

ClR

R1Modifikation:

Si

R1

R2

R

Si

O

NP: SiO2, Al2O3 und modifizierte

polare Gruppen

O Si

R1

R2

CNO Si

R1

R2

NH2

O Si

R1

R2

O OH

OH

RP: unpolare straight-chain hydrocarbons (C18, C12, C8, C6, C4, C3, C2, C1) und

cyclohexyl, phenyl, alkylphenyl

O Si

R1

R2

R

R = C1 – C18 O Si

R1

R2

O Si

R1

R2

O Si

R1

R2


HPLC: Ionenchromatographie Ionenaustauschchromatographie: um ionische Verbindunen zu trennen

•! SO3–H+ (Sulfonsäure): stark saurer Kationenaustauscher, pH 2 – 14

•! COO–H+ (Carbonsäure): schwach saurer Kationenaustauscher, pH 8 – 14

•! NR3+OH– (quaternäres Amin): stark basischer Anionenaustauscher, pH 0 – 10

•! NR2 (tertiäres Amin): schwach basischer Anionenaustauscher, nur bei niedrigem, pH 0 – 6.

Ionenpaar: um die organische

grösse Ionen zu trennen

ein Ionenpaarbildner (sogenanntes

Gegenion) als Hilfskomponente wird der

mobilen Phase zugesetzt, um neutral

Ionenpaar zu bilden, dann kann man die

Umkehrphasen-Säule benutzen.

$! das Anion der Heptansulfonsäure für

kationische Proben

$! das Tetrabutylammoniumion

(Phosphat) für anionische Proben


HPLC: Größenausschlusschromatographie

!

tR"

1

log10 MW

CH3(CH2)nCOOH

SP: 5 nm – 0.1 mm Ausschluss-/Eindringen-grenze, Kein Wechselwirkung Geeignet für 10% Unterschied in MW; Biopolymer, Polymer, Organische Moleküle

Mechanismus: Grösse / Mol Radius

Ausschluss Eindringen


Dünnschichtchromatographie (HP–TLC)

Normal Silica / Alumina TLC, HPTLC plates

C18-50 (50% silanization) and C18-100 (100%

silanization) with fluorescent indicator

!

Rf =Sx

S f

Selektivität und Trennleistung

Wahl des Laufmittels (Rein oder Gemisch)

für HPLC und Reaktionsablauf


Elektrophorese (EP): Apparatur

•! L: 10-100 cm

•! ID 10-100 !m

Probenaufgabe (1-10 nl) durch •! Hydrostatische Injektion (Siphoneffekt)

•! Druck/Vakuum Injektion (Druckdifferenz)

•! Elektrokinetische Injektion (!EOF, !EP)

•! UV – 10–6 mol/L

•! Fluoreszenz – Attomol

•! Kopplung an MS

On-column (durchsichtlich)

Fused silica mit

Polyimidbeschichtung

bis 30 kV


Grundlage zur Elektrophorese

!

!

N =µ "V

2 "D

!

µ = µEP

± µEOF

!

µEO

=" # $

4% #&

!

µEP =vi

E=

zi " e06# "$ " r

=q

6# "$ " r

Elektrophoretische Mobilität

Elektroosmotische Mobilität

+ – N

Kapillare

Kathode

–

Stempelförmig

elektrochemische

Doppelschicht

Totalmobilität:


Elektrophoretische Trennverfahren

"! keine oder geringe Bandenverbreiterung (flaches EOF Strömungsprofil)

"! keine feste stationäre Phase, extrem wenig Lösungsmittelverbrauch

"! nur kleine Probenmengen nötig schnelles Verfahren (10 - 20 Minuten)

"! hohe Trennleistung


Zusammenfassung

Zusammenfassung


GC LC EP

MP He, H2, N2 LM (elutionsmittel) Pufferlösung

SP Film-df/Polarität NP, RP, IC, SEC, … –––––(Mizelle/RP)

Säule (Kapillar) ID, L, Kapizität ID, L, df (kompakt) ID, L

Parameters Flussrate (u), T Flussrate (u) pH, Spannung (V)

Gradient- T- Elutions-, (T-) pH-, V-

Prinzip G/L Verteilung L/L Verteilung EP und EOF

Detektor FID (ECD) / MS UV, RI, ELSD / MS UV, Fl / MS

Anwendungen Klein, neutral, thermostabil, nicht-zu-polare

Alle (auch polare bei RP, Polymere bei SEC)

Ionische (auch Neutrale bei MEKC)


Aufgabe der Analytischen Chemie

Die Art (qualitativ) und Anzahl (quantitativ) der Atome allein

(Elementanalytik) oder zusammen mit ihrer Anordnung oder

Verbindung untereinander als Molekül (Molekülanalytik) im 3-

dimensionalen Raum (Strukturanalytik), die alle die Eigenschaften

eines Stoffes bestimmen"

Was liegt vor?"

Wieviel davon liegt vor?"

Welche Anordnung oder Form liegt vor?"

Wo befindet sich der Analyt?" Verteilungs- oder "

Oberflächenanalyse"

Qualitative Analyse!

Quantitative Analyse!

Strukturanalyse"


Trennstrategie

Qualitativ Quantitativ

Strukturaufklärung Identifizierung mit

Bekanntem Stoff

Kalibrieren Kopplung mit IR,

UV/Vis, NMR, MS

Peakzuordnung

Fragmentierung

Spektrendatenbank

Retentionszeiten

Retentionsindizes

Selektiv Detektor

mit externem Standard

mit internem Standard

Standardaddition

Mengenbestimmung

Analysenzweck

Frage-

stellung

Probe-

nahme

Probe-

Vorbe-

reitung

Aus-

wertung Statistik Report Messung


Probenaufbereitung

Feststoff

Aerosol

Emulsion

Suspension

Flüssigkeitstropfen

feste Teilchen

Gas

Flüssigkeit

(unlöslich Feststoff)

Homo- und Heterogenes Stoffgemisch

(2 unmischbar Flüssigkeiten)

LLE, SPE,

SPM, SPME

Extraktion

Batch-E

Soxhlet-E Soxtec-E

Ultraschall-E MAE, ASE

SPE, SWE

Adsorption

Filtration GC

HPLC EP

mit

MS NMR

IR UV

Löslich oder unlöslich

Aufkonzentrierung

Aufreinigung Vortrennung und Anreicherung Probenarten

Messung


Analytmoleküle

!! Analysenzweck: Qualitativ / Quantitativ

!! Kleine, neutral, und thermostabil => GC

!! Kleine, ionische => IC und EP

!! GC nicht-geeignet => HPLC

!! Thermoempfindlich

!! zu polar und zu hohe Siedpunkt (wenig flüchtig)

"! derivatisieren

!! Grosse Biopolymere: HPLC, EP und IC

!! Polymere: SEC


Auswahl einer Flüssig-chromatographie

$! Polarität

$! Löslichkeit

$! Ionenisch

$! Molekulare Masse

NP RP

Ausschluss

•! Geeignet für Sehr polare und

thermisch labile Substanzen

•! Geeignet für Ionische

Verbindungen, Biopolymere

und Polymere

•! Analytische, Präparative und

Produktive

•! Grosse Auswahl und Hohe

Trennleistung Selektivität


Optimierungsfaktoren

•! System – Säule (stationäre Phase) und mobile Phase (Polarität)

•! Analyteneigenschaften •! Operationsbedingungen (Fliessrate, Temperatur und LM-Gradientenelution)

!

" =K

B

KA

!

k = KVs

VM !

N =L

H

!

H = A +B

u+ C " uSP und Analyten

Ideal: k = 5 - 10

Analyten

SP und MP

Temperatur

Säulenlänge

Bodenhöhe

stark beinflusst

durch u, D, df

und dp

!

R =" #1

"

$

% &

'

( ) *

k2

1+ k2

*N

4

!

tR

=16R

S

2H

u"

#

# $1

%

& '

(

) * "1+ k

2( )3

k2

2

Kurze Retentionszeit tR’ genuge Auflösung R

idealer Peakform (schmal wb und symmetrisch)


Derivatisierung

$! Online: Vor- (für höhe Trennleistung) und Nach- (mit UV/Fl Marker für selektive und empfindliche Detektion )

$! Offline: bei der GC für flüchtig und zu schwer

$! Schnell, sauber, Reagenzien mischbar mit MP, Produkte löslich in MP

-NH2 (Amine, Aminosäuren) ! "5-(N,N-Dimethylamino)- "

! ! ! ! naphthalin-1-sulphonylchlorid "

! ! ! ! 2,4-dinitrofluorbenzol "

-OH (Alkohole) ! ! !3,5-Dinitrobenzochlorid "

! ! ! ! Silylierungsreagenzien "

-CHO (Aldehyde) ! ! !2,4-Dinitrophenylhydrazin (DNPH) "

-C(O)R (Ketone) ! ! !4-Hydroazino-7-nitrobenzofurazan "

-COOH (Säuren) ! ! !4-Brommethyl-7-methoxycoumarin "

-SH (Thiole) ! ! !Dansylaziridin !

analytische chemie - analytik.ethz.ch€¦ · silanol group two silanol group three silanol group...

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