Antibacterial and Antioxidant Properties of N-Carboxyethyl Chitosan

Xue-qiong Yin, Chang-jiang Yu, Qiang Lin, Wen Yuan, Fang Liu

Ministry of Education Key Laboratory of Application Technology of Hainan Superior Resources Chemical Materials, Hainan university,

Haikou 570228, PR China

Email: yinxq7584@yahoo.com.cn

Abstract: chitosan is the only alkaline natural polysaccharide, which expresses good bioactivities. In this pa-per, chitosan was modified with pyruvic acid to get N-carboxyethyl chitosan (N-CE-CTS) which was sup-posed to have better solubility and bioactivities than chitosan. N-CE-CTS with DS 40.1% dissolves in water. Antioxidant activity was measured with electron spinning resonance (ESR). The results show that N-CE-CTS has better antioxidant activity than chitosan. The antioxidant activity of 2 mg/mL N-CE-CTS and chitosan is 35.0% and 30.1%, respectively. N-CE-CTS has good antibacterial activity against Staphylococcus aureus and Escherichia coli. However antibacterial activity of N-CE-CTS is a little lower than that of chitosan. Antioxi-dant and antibacterial activity of N-CE-CTS and chitosan increase with the increase of concentration of N-CE-CTS and chitosan.

Keywords: chitosan, N-carboxyethyl chitosan, antioxidant activity, antibacterial activity

N-羧乙基壳聚糖的抗菌及抗氧化活性研究

尹学琼, 于长江, 林强, 袁文, 刘芳

海南大学海南优势资源化工材料应用技术教育部重点实验室，海口，海南，570228

Email: yinxq7584@yahoo.com.cn

摘 要：壳聚糖是唯一碱性天然高分子多糖，其具有良好的生物活性，本文以丙酮酸对壳聚糖进行 N-羧乙基化改性以提高其溶解性和生物活性。DS 40.1%的 N-羧乙基壳聚糖钠可溶于水。电子自旋共振法测试发现 N-羧乙基壳聚糖具有比壳聚糖更好的抗氧化活性，2 mg/mL N-羧乙基壳聚糖和壳聚糖对·OH的清除率分别达 35.0%、30.1%。N-羧乙基壳聚糖对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌均有良好抑制作用，但活性略低于相同浓度的壳聚糖。N-羧乙基壳聚糖和壳聚糖的抗氧化和抑菌活性均随其浓度增加而增强。

关键词：壳聚糖；N-羧乙基壳聚糖；抗氧化；抗菌

1 引言

壳聚糖（chitosan，聚-2-氨基-2-脱氧-β（1，4）

-D-葡萄糖）是甲壳素（chitin，聚-2-乙酰氨基-β（1，

4--D-葡萄糖）的脱乙酰基产物，甲壳素是唯一的碱性

天然多糖，年生物产量达百亿吨，仅次于纤维素。壳

聚糖具有良好的生物相容性、生物可降解性、细胞亲

和性和生物活性等独特性质，已在废水处理、食品工

业、日用化学品、环保、生物医药、生物工程等方面

显示出独特的应用前景[1]，但壳聚糖不溶于水和普通

有机溶剂，使得其应用受到了大大限制。壳聚糖重复

单元 C-2 位为氨基，通过化学改性可引入亲水基团，

破坏壳聚糖分子氢键，提高其溶解性，而且还有望进

一步提高壳聚糖的生理活性。本文通过壳聚糖与丙酮

酸 Schiff 反应、NaBH4 还原制备了 N-羧乙基壳聚糖

(N-CE-CTS)，并对 N-羧乙基壳聚糖和壳聚糖的抗菌和

抗氧化活性进行了对比研究。

2 实验部分

2.1 试剂与仪器

基金项目：国家自然基金资助项目（50863002）；海南省自然基金资助项目（20803） 壳聚糖（DD85%，浙江玉环海洋生物化学有限公

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司），丙酮酸、硼氢化钠（BR，国药集团化学试剂有

限公司），二甲基吡咯氮酮（DMPO，Sigma，美国），

牛肉膏（上海化学试剂采购供应站），蛋白胨（OXOID，

英国），琼脂（上海化学试剂公司），实验用革兰阳

性菌金黄色葡萄球菌（ Staphylococcus aureus ）

ATCC25923 和革兰阴性菌大肠杆菌（Escherichia coli）

菌种由海南大学食品学院李从发教授提供。

全自动电位滴定仪（799 GPT Titrino Metrohm，

瑞士），电子顺磁共振波谱仪（ESR，Bruker A320，

德国），红外光谱仪（Bruker T27，德国），元素分

析仪（PE2400，美国），用 Bruker-AXS X-射线衍射

仪（德国）对样品粉末进行 X-射线衍射测试，CuKα

辐射，管压 40kV，管流 100mA，扫描范围 2-70o，扫

描速率 8°/min。SPX-150B-Z 型生化培养箱（上海博迅

实业有限公司医疗设备厂），超静工作台（上海博迅

实业有限公司医疗设备厂）

2.2 N-羧乙基壳聚糖的制备

将 1 g 壳聚糖悬浮于 50 mL 去离子水中，磁力搅

拌 0.5h；滴加一定量的丙酮酸，搅拌，壳聚糖溶解，

得透明溶液，过滤；用 4 mol/L 的氢氧化钠调 pH 值至

3.5，再改用 1 mol/L 的氢氧化钠调 pH 值至 4.5，反

应一定时间后硼氢化钠（配成 5％的水溶液）还原剂

缓慢加入，继续搅拌 2 h。用浓盐酸调节 pH 值至 6.5，

95%乙醇沉降，抽滤，得白色絮状沉淀。固体物溶于

0.1 mol/L 的盐酸中，去离子水透析三天，冷冻干燥，

得白色纤维状固体。

2.3 抗氧化性能测试

采用电子顺磁共振(ESR)技术测定 N-羧乙基壳聚

糖和壳聚糖对·OH 的去除能力，具体操作如下：各取

5μL 0.05mol/L PBS(pH=7.4)溶液、1.0mmol/L FeSO4

和(NH4)2SO4溶液、0.9mol/L DMPO溶液和6%H2O2溶液依

次打入 EP 管中，再加入 5μL 双蒸水，混匀后立即装

入石英毛细管内。然后外加样品保护测试管，一并放

入 ESR 波谱仪的谐振腔中进行测定，作为对照样品。

测样品时用样品液代替双蒸水，其余同上。ESR 测试

参数（中心磁场（CF）：3480G，扫描宽度（SW）：500G，

扫描时间（ST）：5.12S，调制幅度（MA）：1.0G，调

制频率（MF）：100KHz，微波频率：（MF）9.858GHz，

微波功率（MP）：20.1mW，测试温度（T）：室温）

清除率的计算公式：

1000

0 hhh x＝

其中：h0——空白体系中 ESR 谱信号强度测量的

平均值；

hx——样品体系中ESR谱信号强度测量的平均值。

2.4 抗菌性能测试[2]

准确称取一定量的 N-羧乙基壳聚糖（或壳聚糖）

溶解于 1%的醋酸溶液中，用 NaOH 溶液调节 pH 至 5.5，

得 N-羧乙基壳聚糖（或壳聚糖）抗菌液。取一定数量

离心管，每管中加入肉膏蛋白胨液体培养基 4 mL，然

后加入 100μL 不同浓度的抗菌剂，对照组试管只加入

100μL 去离子水，混匀。向各管加 100 μL 菌悬液（测

试 菌 分 别 为 革 兰 阳 性 菌 金 黄 色 葡 萄 球 菌

（Staphylococcus aureus）ATCC25923 和革兰阴性菌

大肠杆菌（Escherichia coli）），摇匀，置恒温摇

床中 37℃下，转速 130 转/分下培养 20 h 后，用紫外

-可见分光光度计测定 600 nm 下的吸光度 A。

3 结果与讨论

3.1 N-羧乙基壳聚糖的结构表征

以 FTIR、NMR、电位滴定仪、元素分析仪对 N-

羧乙基壳聚糖物进行了结构表征，反应条件（反应温

度、时间、pH、壳聚糖分子量）对 N-羧乙基壳聚糖取

代度的影响和 NMR 图已在前文中有报道[3]，N-羧乙基

壳聚糖（取代度 40.1%）和壳聚糖的 FTIR 如图 1 所示。

由图 1 可见，3445.63cm-1 处的吸收峰归属为氨基和

羟基的伸缩振动峰，1643.79cm-1 处的吸收峰归属为

中-C=O(酰胺Ⅰ谱带)伸缩振动峰和 C-N 伸缩振动峰的

重叠峰。N-羧乙基壳聚糖的氨基和羟基峰位移至

3421.01cm-1 处，在 1745.73cm-1 处出现的新吸收峰

归属为 -COOH 中 -C=O 的伸缩振动峰，同时在

1577.56cm-1，1407.03cm-1 处出现了-COO-的对称伸

缩与反对称伸缩峰，这些峰与 Muzzarelli R A A 等[4]

和 Shigemasa Y 等[5]用乙醛酸改性壳聚糖所得的 N-羧

甲基壳聚糖的红外图谱相似，表明产物中成功的引入

了羧酸基团。

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4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500

Wavenumber cm-1

CTS

N-CE-CTS

3445

.63

2924

.08

1745

.73

1577

.56

1407

.03

1072

.70

1643

.79

Figure 1 FTIR spectra of N-CE-CTS and chitosan

图 1 N-羧乙基壳聚糖(N-CE-CTS)与壳聚糖(CTS)的红外图

10 20 30 40 50 60 700

100

200

300

400

500

Lin

(Cou

nts)

2-Theta-Scale

CTS

N-CE-CTS

Figure 2 The XRD profiles of N-CE-CTS and chitosan

图 2 N-羧乙基壳聚糖(N-CE-CTS)与(CTS)壳聚糖的 XRD 图

Table 1 Solubility of N-carboxyethyl chitosan (N-CE-CTS) and chitosan (CTS)

表 1 N-羧乙基壳聚糖(N-CE-CTS, DS 40.1%)和壳聚糖(CTS)的溶解性

样品 水 乙醇 1％盐酸 1%醋酸 2%氢氧化钠 二甲基甲酰胺 二甲亚砜

N-CE-CTS 溶 不溶 溶 溶 溶 微溶 微溶

CTS 不溶 不溶 溶 溶 不溶 不溶 不溶

3.2 N-羧乙基壳聚糖溶解性

表 1 为 N-羧乙基壳聚糖(N-CE-CTS, DS 40.1%)和

壳聚糖(CTS)在不同溶剂中溶解性能。从表中可以发

现 N-羧乙基壳聚糖的溶解性优于壳聚糖本身，这是

因为在壳聚糖的-NH2 上引入了-CH(CH3)-COOH 后作用

的结果。新基团的引入，较大地削弱了壳聚糖分子间

氢键，衍生物结晶度降低（如图 2 所示）；壳聚糖在

10o、20o存在结晶峰，N-羧乙基壳聚糖仅在 20o有一弱

峰，几乎呈现无定形态，故 N-羧乙基壳聚糖溶解性能

增强。N-羧乙基壳聚糖能完全溶于水，且能溶解于碱

性水溶液中，在有机溶剂中如二甲基甲酰胺和二甲亚

砜中溶解性也有所改善。

3.3 N-羧乙基壳聚糖的抗氧化性能

图 3 为 N-羧乙基壳聚糖、壳聚糖浓度为 4 mg/mL

下清除羟自由基的 ESR 图，与空白样相比，N-羧乙基

壳聚糖、壳聚糖的·OH 峰均有所下降低，表明部分·OH

已被清除。图 3 为不同浓度下 N-羧乙基壳聚糖、壳聚

糖清除·OH 情况，由图 3 可见 N-羧乙基壳聚糖、壳聚

糖的清除能力均随着试样浓度的增加而增强。当样品

浓度为 0-2 mg/mL 时，清除率随样品浓度的增加呈较

快的递增，0.1 mg/mL 的 N-羧乙基壳聚糖和壳聚糖对

羟自由基的清除率分别为 8.5%、6.0%，2 mg/mL N-羧

乙基壳聚糖和壳聚糖对·OH 的清除率分别达 35.0%、

Figure 3 ESR spectra of N-CE-CTS and CTS as .OH scavenger

图 3 羧乙基壳聚糖(N-CE-CTS)、壳聚糖(CTS)对·OH 抑制作用的

ESR(4mg/mL)

30.1%；样品浓度达到 2 mg/mL 后，样品浓度的变化对

羟自由基的清除率影响不大，4 mg/mL 的 N-羧乙基壳

聚糖对羟自由基的清除率为 40.1%。

N-羧乙基壳聚糖比壳聚糖具有更好的抗氧化活

性，其原因可能是：壳聚糖中存在大量含有活泼氢的

羟基，这些活泼氢原子可与羟自由基形成相当稳定的

大分子自由基而达到清除·OH 的目的[6]。改性后的产物

引入了羧基基团，相比壳聚糖原料更易溶于水，这可

使得壳聚糖高分子链缠结程度降低，从而增大了壳聚

糖链上活性基团与羟自由基结合的概率，其原理与低

聚壳聚糖比高分子壳聚糖具有较好的抗氧化活性相似

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0 1 2 3 40

5

10

15

20

25

30

35

40

45羟

自由基的清除

率(％)

样品浓度(mg/mL)

N-CE-CTS CTS

-●- N-CE-CTS-■- CTS

0 1 2 3 40

5

10

15

20

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45羟

自由基的清除

率(％)

样品浓度(mg/mL)

N-CE-CTS CTS

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45羟

自由基的清除

率(％)

样品浓度(mg/mL)

N-CE-CTS CTS

-●- N-CE-CTS-■- CTS

Figure 4 Effects of concentration on .OH scavenging activity of

N-CE-CTS and chitosan

图 4 不同浓度下羧乙基壳聚糖(N-CE-CTS)、壳聚糖(CTS)对·OH

的清除能力

[7]；同时引入的羧基基团一样可能具有去除羟自由基的活性。因而与原料相比，产物具有更大的清除羟自由基的能力。

3.4 N-羧乙基壳聚糖的抗菌性能

图 5、图 6 为不同浓度下 N-羧乙基壳聚糖、壳聚

糖对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌活性图，N-羧

乙基壳聚糖和壳聚糖对两种细菌均有较好的抑制效

果，而且随着抑菌剂浓度增加，细菌生长被抑制效果

越明显。相同浓度下，对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌，

壳聚糖均表现更好的抑菌活性。据目前被广泛认可的

高分子壳聚糖的抑菌机理[8-9]，在 2-NH2上引入羟乙基，

将降低游离 NH2 含量及壳聚糖的荷正电性，从而降低

了-NH3+与细胞表面上带负电荷分子的相互作用，抑菌

活性下降。

0.25 0.50 0.75 1.000.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

OD值

样品浓度(％)

空白 N-CE-CTS CTS

Figure 5 Effects of concentration on Escherichia coli inhibiting ability

of N-carboxyethyl chitosan and chitosan

图 5 N-羧乙基壳聚糖(N-CE-CTS)、壳聚糖(CTS)对大肠杆菌的抑制

能力

0.25 0.50 0.75 1.000.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

OD值

样品浓度(％)

空白 N-CE-CTS CTS

Figure 6 Effects of concentration on Staphylococcus aureus inhibiting

ability of N-carboxyethyl chitosan and chitosan

图 6 N-羧乙基壳聚糖(N-CE-CTS)、壳聚糖(CTS)对金黄色葡萄

球菌的抑制能力

本文以丙酮酸对壳聚糖进行 N-羧乙基化改性，制

备了 DS 40.1%的 N-羧乙基壳聚糖，XRD 显示衍生物结

晶度明显下降，溶解性明显改善，改性后壳聚的生物

活性发生变化，抗氧化活性增加，抗菌性能有所下降。

壳聚糖是一种具有广泛生物来源且生物活性优良的天

然高分子多糖，通过化学改性改善其物理化学及生物

活性是壳聚糖研究及应用的重要研究领域，有助于促

进壳聚糖更广泛的应用。

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