aula virtual 2013- tecnicas histol gicas

Lic. SUSI DAVOLIO- Cátedra Histología- FM

UNIVERSIDAD NACIONAL DE TUCUMÁN UNIVERSIDAD NACIONAL DE TUCUMÁN FACULTAD DE MEDICINA FACULTAD DE MEDICINA CÁTEDRA DE HISTOLOGÍACÁTEDRA DE HISTOLOGÍA

TÉCNICAS HISTOLÓGICASTÉCNICAS HISTOLÓGICAS-2013--2013-

Bióloga Susi DavolioBióloga Susi Davolio


Las Técnicas Histológicas abarcan diferentes procedimientos a los cuales son sometidos los tejidos para obtener preparados histológicos, y poder estudiarlos por medio de la microscopía

óptica o electrónica. Para la obtención de estos preparados, hay que

seguir un protocolo que incluye la obtención de la muestra, su corte y montaje

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Técnica HistológicaTécnica Histológica

DEFINICIÓN Es un conjunto de pasos a seguir para la obtención de preparados histológicos aptospara su estudio mediante el microscopio, posibilitando la observación de estructuras no visibles al ojo humano.

PASOS 1- Obtención del material2- Fijación3- Deshidratación4- Aclaración5- Imbibición6- Inclusión en parafina, bloque y taco7- Corte8- Tinción9- Montaje y observación



1- Obtención del material

Biopsia: consiste en tomar un trozo de tejido de un ser vivo. Este procedimiento de uso frecuente en medicina requiere el mismo cuidado de asepsia, antisepsia, etc., que se utiliza en todo acto quirúrgico menor o mayor.

Necropsia: es el procedimiento en el cual se extrae material de un cadáver.

Autopsia: consiste en el estudio analítico y sistemático completo, macroscópico y microscópico delos órganos, aparatos y sistemas de un cadáver. Se realiza para establecer causas de muerte.

Citología: consiste en estudios de sangre, recolección de orina y raspado de mucosas.



2- Fijación

La fijación es el proceso mediante el cual:

# Se evitan los procesos de putrefacción o lisis # Se conservan las estructuras del tejido a estudiar, lo más semejante posible al estado vivo. # Confiere a los tejidos una consistencia adecuada para su ulterior sección o corte.La fijación se realiza, sumergiendo el material en un líquido fijador. En cualquier caso, la fijación debe ser inmediata, ya que al detenerse los procesos vitales o privarse de circulación al tejido se produce una serie de cambios post-mortem o autolíticos (degradación por factores endógenos).

Fijación de la muestra.



Fundamentos de la fijación

Evitar los procesos de lisis y putrefacción post- mortem. Evitar la proliferación bacteriana.

Conservar las estructuras lo más parecido posible al estado vivo.

Preparar las estructuras para los tratamientos próximos (inclusión, coloración, etc).

La fijación detiene los procesos vitales pero en ciertas condiciones

mantiene las actividades de algunos componentes moleculares, por ejemplo la actividad de algunas enzimas.

Las sustancias solubles se insolubilizan.

Dar cierta solidez o dureza al tejido o material.



Se llaman fijadores a las sustancias químicas o a los agentes físicos que se utilizan para fijar una muestra orgánica.

¿A que llamamos fijador?

Cualidades que debe tener un fijador

1. Actuar con rapidez, matando y fijando a las células antes de que aparezcan los fenómenos agónicos o post-mortem (autólisis, desintegración, etc.).

2. Poseer alto poder de penetración.

3. Conservar, los detalles estructurales que presentaban in vivo.

4. Permitir o favorecer los procedimientos necesarios para su observación ulterior (ejecución de cortes, coloración, etc.).

5. Impedir la desaparición de los elementos solubles durante la fijación o después de ella.

6. No retraer excesivamente los tejidos ni volverlos friables o quebradizos.



Clasificación de los fijadoresLos fijadores se clasifican de la siguiente manera:

FijadoreFijadores Físicoss Físicos

Calor

Se usa en extendidos hemáticos, colpocitología, urocitología, etc.Las muestras se fijan con una mezcla de alcohol y éter en partes iguales

Frío Se somete el preparado a congelamiento con aire líquido a -170°C.

FijadoreFijadores s QuímicoQuímicoss(son líquidos)

Simples Son soluciones de una sola sustancia en diluciones acuosas.

Compuestos o mezclas

Combinación de varias sustancias simples.



Ejemplo de soluciones fijadoras:

Simples Mezclas o compuestas

•Formol•Alcohol etílico•Acido acético•Ácido pícrico•Tetroxido de osmio•Glutaraldehido

•Formol tamponado según Backer•Formol tamponado según Lillie•Bouin Gendree•Zenker



Para la elección de un fijador se debe tener en cuenta:

A- Velocidad de difusión

La velocidad de difusión es un fenómeno físico y la velocidad de fijación es un fenómeno químico y equivale al tiempo y al tamaño de la pieza al que se debe someter las piezas en el fijador. Ejemplo: el formol difunde rápidamente pero fija lentamente, por lo que las piezas pueden permanecer en el fijador mucho tiempo. El glutaraldehído tiene velocidad de difusión lenta, pero fija muy rápido, por lo tanto las piezas deberán ser de tamaño pequeño y permanecerán poco tiempo en el fijador.

B- El coeficiente de endurecimiento

Los fijadores, endurecen los tejidos, esto es conveniente, pero no deben sobrepasar el límite compatible con la obtención de cortes.

C- Variaciones del volúmen y presión osmótica

Es necesario elegir un fijador cuya presión osmótica sea cercana a la de la muestra, para evitar distorsiones de las estructuras celulares.

D- Efecto mordiente

Los organoides de las células no pueden teñirse, en este caso hay fijadores que facilitan el proceso de tinción de esas estructuras que, de otra forma, no se tiñen.



3- Deshidratación

Es el paso a través del cual se elimina toda el agua contenida en los tejidos, ya que el agua impide la difusión de la parafina al interior del tejido. Este proceso consiste en pasar el material fijado, por una serie de alcoholes de concentracionescrecientes (50%, 70%, 80%, 96%y dos baños en alcohol 100% oabsoluto). La duración de la deshidratación está condicionada por el tamaño de las muestras y la naturaleza del material.

Introducción en cassette de deshidratación

Deshidratación en alcoholes sucesivos



Consiste en someter el material ya deshidratado, a dos baños consecutivos en solventes orgánicos como el xilol, toluol, benceno, etc, con el objetivo de favorecer la difusión de la parafina en el interior del tejido, ya que la misma es poco soluble en el alcohol.

4- Aclaramiento o diafanización

Deshidratación y Aclaramiento



El material aclarado, se colocaen un recipiente con parafinalíquida, la cual se mantendráen ese estado dentro de unaestufa de cultivos a 56°- 58°C,efectuándose dos bañosconsecutivos, uno de 12 horasy otro de 4 horas depermanencia del material dentro la parafina. Esto permitirá que la parafinadifunda dentro del tejido.

5- Imbibición


Imbibición en parafina a 59-60ºC


6- Inclusión en parafina, bloque y taco

El material ya imbibido, secoloca en el fondo de unrecipiente, con parafinalíquida hasta el borde y sedeja solidificar a temperaturaambiente. De esta manerase forma un bloque, donde elmaterial se encuentra incluidoen un soporte de parafina.

El bloque, luego se pegarásobre un taco de madera conlos datos correspondientes,que servirán de registro delmaterial.

Barras de Leuckart

Pegado del bloque al taco de madera



Proceso de inclusión ilustrado



7- CortePara cortar el material histológico, se utilizan los

micrótomos. Estos son dispositivos mecánicos que enfrentan el taco con el material a la cuchilla, de tal modo que se produce un avance regular y controlado, para obtener cortes sucesivos de grosor fino y uniforme, generalmente de 3 a 8 micras una micra es la milésima parte de 1 mm, es decir 1= 10-3 mm o 10-6 m.

Estructuralmente los micrótomos, constan de:*Un dispositivo llamado platina o porta-

espécimen, con pinzas para sujetar el taco de madera con el preparado.

*Un soporte donde se inserta la cuchilla, rígidamente sostenida por medio de pinzas o tornillos.

*Un tornillo micrométrico, con el que se ajusta el espesor al que se desee cortar (en ), y cuyo avance actúa sobre la platina con el material.

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Tipos de micrótomos

i- Micrótomos para parafina ii- Micrótomo de congelacióniii- Crióstato

i- Micrótomos para cortes en bloques de parafina:

a- El micrótomo de deslizamiento, que presenta cuchilla móvil y platina fija

b- El micrótomo de rotación o tipoMinot, que presenta cuchilla fija y platina móvil.

Micrótomo tipo Minot

Micrótomo de deslizamiento

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Microtomo de congelación.

ii- Micrótomo de congelación: presentauna platina fija y una cuchilla móvil, además de un sistema de congelación del material, mediante un tubo con CO2, que llega al micrótomo por una manguera hasta la platina. Esta técnica es muy útil para el diagnóstico durante el acto quirúrgico, permitiéndole al cirujano tomar decisiones.

iii- Crióstato: es un dispositivo con las mismas características del micrótomo de congelamiento, pero en este aparato se trabaja dentro de una cámara con temperaturas de hasta –30°C.

Crióstato.Biol.SUSI DAVOLIO-Cátedra Histología-FM


Correlación Clínica: Biopsias por congelaciónSirven para: • Evaluar de inmediato la pieza obtenida durante el acto quirúrgico y el diagnóstico instantáneo determinará el paso siguiente en la cirugía• Para identificar hallazgos intraoperatorios inesperados• Para saber si se ha extirpado toda la masa patológica y si el borde de la resección quirúrgica está libre de tejido enfermo.

Procedimiento: Una vez extraído el material, se congelan fragmentos de tejido en un

criótomo o en un micrótomo de congelación.Se realizan los cortes y se montan los mismos en portaobjetos

albuminizados. Se tiñen los cortes y se observan al microscopio óptico.Todo el proceso puede tardar 10 minutos y el resultado se comunica

al cirujano inmediatamenteBiol. SUSI DAVOLIO- Cátedra Histología-FM


Tipos 8- Tinción o Coloración

Cuando se observan al microscopio, los preparados frescos o los post-mortem, solo se diferencian los elementos que poseen distintos índices de refracción, mientras que los elementos con índice de refracción semejante, se verán iguales, lo que puede confundir al observador. Por lo tanto, para poder ver los distintos tipos de células y reconocer su organización y su relación con sustancias y fibras extracelulares, es necesario el uso de colorantes.

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Definición de coloranteDefinición de colorante

Colorante es toda sustancia capaz de ceder su coloración a otros cuerpos

En los colorantes hay grupos químicos que le confieren color (grupos cromóforos) y otros que reaccionan con loscomponentes del tejido y células, fijando el color a estas estructuras. Estos grupos pueden ser: básicos (grupo amino) o ácidos (grupo carboxilo).



1-Colorantes naturales: 1-Colorantes naturales: cuando son obtenidos de organismos vivos, los que pueden ser de : a) animales: a) animales: carmín. b) vegetales: b) vegetales: hematoxilina, orceína. 2-Colorantes artificiales o sintéticos (colorantes de anilina):2-Colorantes artificiales o sintéticos (colorantes de anilina): a) ácidos: a) ácidos: poseen una carga global negativa (aniónicos), reaccionan con los componentes catiónicos de las células. Son los colorantes citoplasmáticos. Ejemplo: eosina, fucsina ácida. b) básicos: b) básicos: poseen una carga global positiva (catiónicos), reaccionan con los componentes aniónicos de las células. Son los colorantes nucleares. Ejemplo: fucsina básica, azul de Toluidina, azul de Metileno. c) neutros: c) neutros: son colorantes que presentan sus sales ácidas y básicas coloreadas. Tienen la ppropiedad de colorear juntas o separadamente diversas estructuras. Ejemplo: Giemsa, rojo neutro, safranina. d) indiferentes: d) indiferentes: son insolubles en agua, pero se solubilizan en alcohol o en grasas. No forman sales. Ejemplo: rojo escarlata, Sudanes.

Clasificación de los Clasificación de los colorantescolorantes



Concepto de Acidofilia y Basofilia

La célula, es una estructura heterogénea compuesta por diferentes organoides, tales como núcleo, mitocondrias, ribosomas, retículo endoplásmico rugoso, etc, todos ellos con una composición química definida.

La variabilidad en la apetencia tintorial por parte de las células, estará determinada por la predominancia de determinados organoides o componentes químicos, lo que influirá en el pH interno que dicha célula presente.


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AcidofiliaAcidofilia• Los colorantes ácidos o aniónicos, tienen carga eléctrica

negativa. A estos también se les conoce como colorantes citoplasmáticos, pues tiñen al grupo químico, cargado eléctricamente, localizado en un extremo de la cadena de aminoácidos que integran las proteínas citoplasmáticas.

Conclusión: las sustancias que atraen eléctricamente a las sustancias que atraen eléctricamente a los colorantes ácidos se denominan “acidófilas” y los colorantes ácidos se denominan “acidófilas” y químicamente están constituidas por componentes químicamente están constituidas por componentes básicos o alcalinos básicos o alcalinos ..

Ejemplos de colorantes ácidos: la eosina, la fucsina ácida, el ácido pícrico, el naranja G, la safranina, el azul de anilina, etc.

• En las células con una gran actividad energética, como las células En las células con una gran actividad energética, como las células musculares que presentan un alto contenido en mitocondrias, musculares que presentan un alto contenido en mitocondrias, REL, proteínas básicas, membranas celulares, el citoplasma de REL, proteínas básicas, membranas celulares, el citoplasma de estas células, se tiñen con un colorante ácido, por lo tanto será estas células, se tiñen con un colorante ácido, por lo tanto será acidófilo.acidófilo.


BasofiliaBasofilia• Los colorantes básicos o catiónicos, poseen una carga eléctrica

positiva. Se les denomina también colorantes nucleares, pues tienen afinidad por estructuras celulares ácidas.

• Conclusión: Las sustancias teñidas por colorantes básicos Las sustancias teñidas por colorantes básicos se denominan “basófilos” y están constituidas por se denominan “basófilos” y están constituidas por componentes ácidos.componentes ácidos.

Ejemplos de colorantes básicos: la hematoxilina, el rojo nuclear, el azul de metileno, la tionina, el azul de toluidina, la fucsina básica.

• LLos núcleos de las células vivas, presentan un alto contenido de os núcleos de las células vivas, presentan un alto contenido de ácidos nucleicos (ADN, ARN), lo que les confiere un pH ácido, por ácidos nucleicos (ADN, ARN), lo que les confiere un pH ácido, por lo tanto tendrán afinidad por un colorante básico, de modo que lo tanto tendrán afinidad por un colorante básico, de modo que los núcleos serán siempre basófilos los núcleos serán siempre basófilos (figura 4)(figura 4), y el citoplasma , y el citoplasma celular será basófilo, cuando haya un predominio de organelas celular será basófilo, cuando haya un predominio de organelas ácidas (ej: RER, ribosomas, proteínas ácidas).ácidas (ej: RER, ribosomas, proteínas ácidas).


Las coloraciones se pueden diferenciar en dos grandes grupos:

Coloraciones por precipitación: se producen al utilizar colorantes básicos y se evidencian sólo cuando determinadas estructuras se encuentran en presencia de coloides ácidos, como las coloraciones de núcleos, gránulos de células cebadas, mucus, etc. Coloraciones por impregnación: las estructuras son penetradas por el colorante disuelto, lo que depende del grado de dispersión de los líquidos colorantes y de la densidad de las estructuras coloreadas. Ej. coloración del citoplasma celular.

Tipos de Coloraciones



Técnica general de la coloración

Los pasos para proceder a la obtención del preparado terminado son los siguientes:

• Desparafinización

• Hidratación

• Coloración.

• Deshidratación

• Aclaración

• Montaje o colocación del cubreobjetos



TÉCNICAS CITOQUÍMICAS E HISTOQUÍMICAS

Estas técnicas proporcionan información química sobre las células o tejido en estudio. No son coloraciones, sino reacciones físico-químicas cuyo producto final es coloreado, permitiendo identificar y localizar una sustancia en la célula o tejido observado.

Las técnicas más comunes son:

A- Reacción para demostrar la presencia de mucopolisacáridosB- Coloración para fibras elásticasC- Coloración para lípidos C- Técnicas para localizar enzimas D- Reacciones para localizar sustancias inorgánicas. E- Impregnaciones metálicas



A- Reacción para demostrar la presencia de mucopolisacáridos Reacción de PAS (ácido peródico- Schiff): las sustancias coloreadas con PAS, son moléculas con gran contenido de carbohidratos como: glucógeno, mucopolisacáridos neutros, glucoproteínas y sialomucinas.

Reacción de Azul de Alcian (Alcian Blue): se usa a diferentes pH y caracteriza a los distintos mucoplisacáridos ácidos, tiñéndolos de color azul.



B- Coloración para fibras elásticas: para detectar selectivamente las fibras elásticas, se utiliza la técnica de orceína.

C- Coloración para lípidos: la técnica más usada para lípidos, es la de los Sudanes, debido a que son liposolubles



C- Técnicas para localizar enzimas: sirven para visualizar sitios donde existe alguna actividad enzimática, de modo que no se observa una enzima coloreada, sino el producto coloreado que resultó de la actividad catalítica de la enzima estudiada

D- Reacciones para localizar sustancias inorgánicas:

las más usadas son:

*Azul de Prusia: para localizar elementos que contienen hierro o depósitos de hierro dándole unacoloración azul brillante.*Von Kossa: para detectar calcio,dándole una coloración negra.

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E- Impregnaciones metálicas:producen sobre determinados elementos deltejido, una precipitación del metal reducido.El metal entra en contacto con el tejido enforma de una sal en solución y la precipitación es producida por acción del mismo tejido.Los metales más usados son la plata (impregnaciones argénticas), el oro(impregnaciones áuricas) y el osmio(impregnaciones ósmicas).Las Impregnaciones argénticas reaccionan con el tejido y le otorga una coloración en lagama del marrón con un fondo amarillento.Si luego de la impregnación se someten loscortes a un baño de cloruro de oro, se Produce un cambio en la coloración de Fondo que pasará a un color sepia (rosado).Este paso se conoce como virado en oro.Hay diferentes tipos de impregnaciones argénticas como: Técnica de Golgi-Hortega-Laviña,Doble impregnación argéntica de Del Río Hortega, Técnica de Cajal, etc.


Microscopía Tipos de microscopios más utilizados:

A- Microscopio óptico, de luz o de campo claroB- Microscopio electrónico de transmisión (MET)C- Microscopio electrónico de barrido (MEB)

A- Microscopio óptico: es adecuado para observar y estudiar células y tejidos previamente fijados y coloreados, con las diferentes técnicas detalladas anteriormente. El límite de resolución del MO es de 0,2 m (= 10-6 m).



B- Microcopio electrónico de transmisión (MET):

Posee un tubo emisor de electrones que luego de atravesar la muestra, se concentran y proyectan sobre una pantalla fluorescente, donde se efectúa el estudio. Este mecanismo permite observar la ultraestructura de las organelas celulares, a grandes aumentos (30.000 a 1.000.000 de aumento) las que no se visualizan con el microscopio óptico. El límite de resolución del MET es 2 a 10 Å (Å= 10-10 m).



C- Microscopio electrónico de barrido (MEB):

Permite observar la superficie de especímenes gruesos y de organismos enteros, que no podrían ser estudiados con el MET. En este caso el haz de electrones no atraviesa la muestra sino que realiza un barrido por toda la superficie del material en estudio, el cual emite electrones que son captados por un detector e integrados a una pantalla de un monitor de TV, resultando una imagen tridimensional con alto grado de resolución. El límite de resolución del MEB es 10 nm (nm = 10-9 m).



TECNICA COLORANTE pH Elementos que tiñe COLOR

Hematoxilina- Eosina

Hematoxilina Básico Núcleos, citoplasmas basófilos Violeta

Eosina Ácido Citoplasmas acidófilos, fibras colágenas, fibras musculares y eritrocitos

Rosa pálido a rosa intenso

Tricrómica de Van Gieson

Hematoxilina Férrica

Básico Núcleos, citoplasmas basófilos Pardo oscuro a negro

Fucsina ácida Acido + Fibras colágenas Rojo fucsia

Acido pícrico Acido ++ Eritrocitos, citoplasmas acidófilos, fibras musculares

Amarillo a amarillo verdoso

Tricrómica de Gallego

Fucsina de Ziehl Básico Núcleos, citoplasmas basófilos, gránulos de las células cebadas

Rojo fucsia

Índigo carmín Acido + Fibras colágenas Azul verdoso

Acido pícrico Acido ++ Eritrocitos, citoplasmas acidófilos, fibras musculares

Amarillo a amarillo verdoso

Tricrómica de Mallory AZAN

Azocarmín G Básico Núcleos, citoplasmas basófilos Rojo

Azul de anilina Acido+ Fibras colágenas, mucopolisacáridos ácidos

Azul

Orange G Ácido ++ Eritrocitos, citoplasmas acidófilos, fibras musculares

Naranja intenso a naranja amarillento

Tetracrómica de Goldner

Hematoxilina férrica Básica Núcleos, citoplasmas básófilos Pardo oscuro a negro

Verde luz Acido + Fibras colágenas Verde

Orange G Acido ++ Eritrocitos Naranja

Punzó-fucsina ácida Acido +++ Fibras musculares, citoplasmas acidófilos

Rojo fucsia


*TÉCNICA HISTOLOGICA: J.F.A. McManus, R.W. Mowry; ATIKA S.A. Editor, 1968, Madrid.*MANUAL DE TÉCNICAS HISTOLÓGICAS: E. Estrada Flores, L. Peralta Zamora, P. Rivas Manzano; AGT Editor S:A:, 1982, México.*TÉCNICA HISTOLOGICA: Apuntes de la Cátedra de Histología, Facultad de Medicina, Universidad Nacional de Tucumán, Tucumán, Argentina.*HISTOLOGÍA (Texto y Atlas): L.P. Gartner, J.L. Hiatt. Edit. Mc Graw- Hill. Interamericana, 2007, México.*HISTOLOGÍA HUMANA; A Stevens, J:S: Lowe. Edit. Elsevier Mosby, 2006, España.*HISTOLOGÍA Y EMBRIOLOGÍA DEL SER HUMANO- Bases Celulares y Moleculares (Texto y Atlas); A.R. Eynard, M.A. Valentich, R.A. Rovasio. Edit. Médica Panamericana, 2008, Córdoba, Argentina.

Bibliografía


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