BAB I

PENDAHULUAN

A. Latar Belakang

Mikroorganisme dapat berkembang biak dengan alami atau dengan

bantuan manusia. Mikroorganisme yang dikembangkan oleh manusia

diantaranya melalui substrat yang disebut media. Media adalah suatu

substrat dimana mikroorganisme dapat tumbuh yang disesuaikan dengan

lingkungan hidupnya.

Mikroorganisme yang kita isolasi harus kita ketahui jenis media

yang disukai sehingga dapat tumbuh dengan baik pada media. Medium ini

akan digunakan oleh mikroorganisme sebagai sumber energi untuk

melakukan pertumbuhan dan perkembangbiakan maka hendaknya harus

sesuai dengan komposisi bahan media.

Isolasi bakteri merupakan suatu cara untuk memisahkan atau

memindahkan mikroba tertentu dari lingkungan sehingga diperoleh kultur

murni atau biakan murni. Beberapa cara yang dapat dilakukan yaitu

dengan cara goresan (streak plate), cara tuang (pour plate), cara sebar

(spread plate), dan mikromanipulator ( Buckle, 1998).

B. Tujuan

Tujuan dari praktikum setilisasi alat ini adalah untuk mempelajari

prosedur umum serta memahami pembuatan media dan mempelajari cara-

cara mengisolasi bakteri, kapang, khamir, dan yeast.

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

A. Pembuatan Media

Mikroorganisme dapat ditumbuhkan dan dikembangkan pada suatu

substrat yang disebut media. Media yang digunakan untuk menumbuhkan

dan mengembangbiakkan mikroorganisme tersebut harus sesuai susunanya

dengan kebutuhan jenis-jenis mikroorganisme yang bersangkutan.

Beberapa mikroorganisme dapat hidup baik pada media yang sangat

sederhana yang hanya mengandung garam anargonik di tambah sumber

karbon organik seperti gula. Mikroorganime lainnya memerlukan suatu

media yang sangat kompleks yaitu berupa media ditambahkan darah atau

bahan-bahan kompleks lainnya. (Volk, 1993).

Hal pertama yang harus dilakukan untuk menelaah bakteri di dalam

laboratorium adalah kita harus dapat menumbuhkan bakteri tersebut di

dalam suatu biakan murni. Melakukannya haruslah dimengerti jenis- jenis

nutrient yang disyaratkan oleh bakteri dan juga macam lingkungan fisik

yang mana dapat menyebabkan kondisi yang optimum bagi

pertumbuhannya tersebut (Pelczar, 1986).

Biakan murni bakteri adalah biakan yang terdiri atas satu spesies

bakteri yang ditumbuhkan dalam media buatan. Media buatan tersebut

berfungsi sebagai media pertumbuhan dan pada media ini bakteri dapat

tumbuh dan berkembang biak. Bahan dasar yang digunakan untuk media

pertumbuhan ini adalah agar-agar. (Syamsir, 2008).

B. Isolasi Mikroorganisme

Mikroorganisme merupakan kelompok makhluk hidup yang sangat

beragam dan dapat ditemukan di berbagai tempat secara mudah. Kita tidak

dapat secara langsung melihat keberadaan mereka yang sebenarnya sangat

banyak. Hal itulah yang menyebabkan isolasi mikroorganisme perlu

3

dilakukan, karena diperkirakan hampir 99% dari mikroorganisme di

sekitar kita tidak berbahaya dan cenderung menguntungkan.

Isolasi mikroorganisme merupakan tahapan dasar untuk

mempelajari mikroorganisme. Sampel dapat diambil dari mana saja, bisa

dari udara, tanah, pohon, bagian makhluk hidup, perairan, dan juga

habitat-habitat ekstrem seperti kolam air panas.

Beberapa hal yang penting untuk diperhatikan dalam isolasi

mikroorganisme.

1) Spesies Mikroorganisme

Spesies mikroorganisme sangat menentukan bagaimana kita akan

melakukan isolasi. Setiap mikroorganisme memiliki sifat-sifat yang sangat

spesifik. Salah satu faktor yang sangat penting untuk diperhatikan adalah

nutrien. Nutrien tiap mikroorganisme tidaklah sama.

2) Habitat (lingkungan)

Lingkungan harus dipertimbangkan dalam isolasi, karena setiap

kehidupan mikroorganisme sangat dipengaruhi faktor lingkungan.

Beberapa faktor lingkungan yang penting bagi pertumbuhan

mikroorganisme, yaitu.

a) Suhu

Suhu merupakan faktor penting karena mikroorganisme memiliki

toleransi terhadap suhu pada tingkat berbeda. Suhu mikroorganisme

dibedakan menjadi mikroorganisme psikrofilik, mesofilik, dan thermofilik

serta mikroorganisme ekstrem (suhu sangat tinggi > 850Celcius). Suhu

berpengaruh pada kerja dan konformasi enzim.

b) Ketersediaan air

Air merupakan pelarut biologis sekaligus medium untuk reaksi

biokimiawi dalam tubuh. Air mutlak diperlukan, sehingga medium harus

mengandung air yang cukup. Ketersediaan air disebut juga dengan Aw

(availability of water), yang kisarannya antara 0-1.

c) pH

4

Kadar keasaman sangat penting, ada mikroorganisme berhabitat pH

rendah (asam) atau asidofilik, netral atau netrofilik, dan basa atau

alkalofilik. Kemampuan tersebut juga terkait dengan kerja enzim.

d) Tipe medium

Habitat mikroorganisme sangat menentukan kondisi yang akan

disesuaikan dalam laboratorium. Mikroorganisme dengan substrat asli

padatan juga diisolasikan dalam medium padat, begitu juga dengan

mikroorganisme dengan substrat cair diisolasikan dengan medium cair.

Tata cara pelaksanaan dalam proses isolasi sangat sederhana. Pada

intinya, tahapan yang harus dilakukan adalah pembuatan medium,

inokulasi secara aseptis, dan identifikasi hasil mikroorganisme yang

tumbuh. Perlu diperhatikan bahwa substrat dan medium memiliki

perbedaan. Substrat merupakan habitat atau medium yang tidak diketahui

komponen penyusunnya secara pasti. Contoh substrat adalah kedelai pada

proses pembuatan tempe. Medium merupakan bahan isolasi yang

komposisinya diketahui secara jelas. Salah satu contoh medium adalah

nutrient agar.

BAB III

METODE PRAKTIKUM

A. Alat dan Bahan

1. Alat

Alat yang digunakan dalam praktikum ini adalah :

a. Gelas Ukur 2 buah

b. Gelas Piala 2 buah

c. Neraca Analitik 1 buah

d. Hot Plate 1 buah

e. Spatula 1 buah

f. Batang pengaduk dari kaca 1 buah

g. Bunsen 3 buah

h. Pipet 3 buah

i. Tabung Reaksi 5 buah

j. Cawan Petri 6 buah

k. Rak tabung reaksi 1 buah

l. Ose 1 buah

m. Korek api 1 buah

n. Kertas label secukupnya

o. Botol kaca secukupnya

p. Sumbu secukupnya

2. Bahan

Bahan-bahan yang digunakan adalah :

a. Nutrient Agar secukupnya

b. Kapas secukupnya

c. Alumunium foil secukupnya

d. Tanah secukupnya

e. Tempe 1 buah

f. Kue basi secukupnya

g. Ragi secukupnya

6

h. Media Nutrient Agar (NA) secukupnya

i. Spiritus 2 botol

j. Fermipan 1 bungkus

k. Es 4 buah

B. Tempat dan Waktu

Praktikum ini dilaksanakan di laboratorium Mikrobiologi Fakultas

Pertanian Universitas Lambung Mangkurat pada hari Kamis pukul 16.00-

18.00 WITA.

C. Cara Kerja

a. Pembuatan Media

Ditimbang media nutrient agar sesuai untuk volume yang dibutuhkan yaitu 125 ml media.

Diukur aquadest sebanyak 125 ml menggunakan gelas ukur.

Dituangkan aquadest ke dalam gelas piala.

Ditambahkan media yang sudah ditimbang tadi.

Dipanaskan diatas hot plate hingga homogen dan mendidih.

Dituang ke dalam tabung reaksi dan cawan petri

7

b. Isolasi mikroorganisme (bakteri, kapang, khamir dan yeast)

Ditulis kelompok dan tanggal pada kertas label kemudian ditempelkan pada tutup cawan petri.

Di kocok tabung berisi biakan dengan gerakan ke samping sehingga suspense tampak rata dan menjaga agar sumbatnya tidak terbasahi.

Dipindahkan secara aspetic satu ose penuh sampel dan goreskanlah jarum bolak balik beberapa kali di satu permukaan agar.

Di lingkaran pada ujung ose harus terletak datar dan sehorisontal mungkin terhadap permukaan agar. Kemudian ose dipijarkan dan dibiarkan mendingin.

Digoreskan dengan ose sejajar pada salah satu tepi media dengan salah satu sisinya.

Diletakkan cawan petri dalam posisi terbalik untuk diinkubasikan pada suhu 370C selama 24 jam.

Dilakukan pengamatan dan melingkari koloi-koloni yang terpisah dan berlainan warna pada permukaan luar cawan petri.

Digambarkan penyebaran koloni yang diamati dan menggunakan warna yang brbeda sesuai dengan koloni yang tampak.

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Hasil

Hasil yang dapat diperoleh dari praktikum kali ini adalah sebagai

berikut.

No Mikroorganisme

Teknik Menggores

Kuadran Sebar

1. Bakteri Tanah Tumbuh sedikit dan tidak menyebar

Tumbuh sedikit dan tidak menyebar

2. Bakteri Kapang (Tempe) Tidak tumbuh Tumbuh sedikit dan tidak menyebar

3. Bakteri Khamir (Kue basi) Tumbuh menyebar Tumbuh

menyebar

4. Bakteri Ragi (Tempe busuk) Tumbuh menyebar

5. Fermipan Tumbuh sedikit dan tidak menyebar

Tumbuh sedikit dan tidak menyebar

Tabel 1. Hasil Praktikum

B. Pembahasan

Medium pertumbuhan mikrobia adalah suatu bahan yang terdiri dari

campuran nutrien yang diperlukan mikrobia untuk pertumbuhannya.

Aktivitas mikrobia dapat dipelajari dengan menggunakan bahan media

pertumbuhan dan dengan menggunakan media tumbuh dapat dilakukan

isolasi mikrobia menjadi biakan murni.

Praktikum kali ini dilakukan percobaan dalam pembuatan media

Nutrient Agar (NA) yang berfungsi sebagai pertumbuhan bakteri. Syarat-

syarat membuat media yang perlu diperhatikan dalam membuat media

ialah.

9

- Media harus mengandung semua unsur makanan yang diperlukan

untuk pertumbuhan dan perkembangbiakkan mikroorganisme.

- Media harus mempunyai tekanan osmosa, tegangan permukaan dan

pH yang sesuai dengan kebutuhan mikroorganisme.

- Media harus dalam keadaan steril sebelum ditanami mikroorganisme

yang dimaksud, jadi tidak ditumbuhi oleh mikroorganisme lain yang

tidak diharapkan.

Macam-Macam Media Pertumbuhan

1. Medium berdasarkan sifat fisik (bentuk)

Medium padat yaitu media yang mengandung agar 15% sehingga setelah

dingin media menjadi padat. Umumnya dipergunakan untuk bakteri, ragi,

jamur dan kadang mikroalge.

Medium setengah padat yaitu media yang mengandung agar 0,3-0,4%

sehingga menjadi sedikit kenyal, tidak padat, tidak begitu cair. Media

semi solid dibuat dengan tujuan supaya pertumbuhan mikroba dapat

menyebar ke seluruh media tetapi tidak mengalami percampuran

sempurna jika tergoyang. Biasanya untuk mikroba yang banyak

memerlukan kandungan air dan hidup anaerobik.

Medium cair yaitu media yang tidak mengandung agar/tidak ditambah

zat pemadat, contohnya adalah NB (Nutrient Broth), LB (Lactose Broth).

Biasa dipergunakan untuk kiroglae dan bakteri seperti bakteri dan ragi.

2. Medium berdasarkan komposisi (susunan)

Medium sintesis yaitu media yang komposisi zat kimianya diketahui

jenis dan takarannya secara pasti, misalnya Glucose Agar, Mac Conkey

Agar.

Medium semi sintesis yaitu media yang sebagian komposisinya diketahui

secara pasti, misanya PDA (Potato Dextrose Agar) yang mengandung

agar, dekstrosa dan ekstrak kentang.

Medium non sintesis/alami yaitu media yang dibuat dengan komposisi

yang tidak dapat diketahui secara pasti dan biasanya langsung diekstrak

10

dari bahan dasarnya, misalnya Tomato Juice Agar, Brain Heart Infusion

Agar, Pancreatic Extract.

3. Medium berdasarkan tujuan penggunaan

Media untuk isolasi

Media ini mengandung semua senyawa esensial untuk pertumbuhan

mikroba, misalnya Nutrient Broth, Blood Agar.

Media selektif/penghambat

Media selektif yaitu media yang dibuat untuk menekan pertumbuhan

bakteri yang tidak diinginkan dan meningkatkan pertumbuhan bakteri

yang diinginkan. Media yang hanya cocok untuk species-species

tertentu dan tidak cocok untuk species yang lain. Contohnya adalah

Luria Bertani medium yang ditambah Amphisilin untuk merangsang

E.coli resisten antibotik dan menghambat kontaminan yang peka,

Ampiciline. Salt broth yang ditambah NaCl 4% untuk membunuh

Streptococcus agalactiae yang toleran terhadap garam.

Media diperkaya (enrichment)

Media diperkaya adalah media yang mengandung komponen dasar

untuk pertumbuhan mikroba dan ditambah komponen kompleks seperti

darah, serum, kuning telur. Media diperkaya juga bersifat selektif untuk

mikroba tertentu. Bakteri yang ditumbuhkan dalam media ini tidak

hanya membutuhkan nutrisi sederhana untuk berkembang biak, tetapi

membutuhkan komponen kompleks, misalnya Blood Tellurite Agar,

Bile Agar, Serum Agar, dll.

Media untuk peremajaan kultur

Media umum atau spesifik yang digunakan untuk peremajaan kultur.

Media untuk menentukan kebutuhan nutrisi spesifik.

Media ini digunakan unutk mendiagnosis atau menganalisis

metabolisme suatu mikroba. Contohnya adalah Koser’s Citrate

medium, yang digunakan untuk menguji kemampuan menggunakan

asam sitrat sebagai sumber karbon.

Media untuk karakterisasi bakteri

11

Media yang digunakan untuk mengetahui kemampuan spesifik suatu

mikroba. Kadang-kadang indikator ditambahkan untuk menunjukkan

adanya perubahan kimia. Contohnya adalah Nitrate Broth, Lactose

Broth, Arginine Agar.

Media diferensial

Media diferensial yaitu media yang dibuat untuk memudahkan

mengenali koloni organisme yang diinginkan. Media ini bertujuan

untuk mengidentifikasi mikroba dari campurannya berdasar karakter

spesifik yang ditunjukkan pada media diferensial, misalnya TSIA

(Triple Sugar Iron Agar) yang mampu memilih Enterobacteria

berdasarkan bentuk, warna, ukuran koloni dan perubahan warna media

di sekeliling koloni.

Komponen anorganik maupun organic merupakan substrat ataupun

medium yang baik bagi kehidupan mikroorganisme. Mikroorganisme

penghuni tanah merupakan campuran populasi dari protozoa (amoeba,

flagllata, cilliata), bakteri (clostridium, rhizobium), alga (ganggang)

seperti alga biru, hijau dan jamur terutama jamur bertingkat rendah

seperti jamur lender, berbagai ragi, dan berbagai phyromycetes dan

ascomycetes (Suriawiria, 1986).

Teknik isolasi dilakukan dengan kondisi alat – alat yang digunakan

sudah dalam keadaan steril dan di setiap perlakuan harus dilakukan

secara aseptic.

Pengambilan bakteri oleh jarum ose pada tabung reaksi dengan agar

sebagai medianya harus dilakukan dengan menggores bakteri secara

perlahan – lahan sehingga media agar tidak rusak.

Jarum inokulum berfungsi untuk memindahkan biakan untuk

ditanam/ditumbuhkan ke media baru. Jarum inokulum biasanya terbuat

dari kawat nichrome atau platinum sehingga dapat berpijar jika terkena

panas. Bentuk ujung jarum dapat berbentuk lingkaran (loop) dan

disebut ose atau inoculating loop/transfer loop, dan yang berbentuk

lurus disebut inoculating needle/Transfer needle. Inoculating loop

cocok untuk melakukan streak di permukaan agar, sedangkan

12

inoculating needle cocok digunakan untuk inokulasi secara tusukan

pada agar tegak (stab inoculating).

Teknik Penanaman

a) Teknik Penanaman dengan Goresan (Streak)

Bertujuan untuk mengisolasi mikroorganisme dari campurannya atau

meremajakan kultur ke dalam media baru.

1. Goresan Sinambung

Cara kerja.

Sentuhkan inokulum loop pada koloni dan gores secara

kontinyu sampai setengah permukaan agar. Jangan pijarkan loop,

lalu putar cawan 180oC lanjutkan goresan sampai habis. Goresan

sinambung umumnya digunakan bukan untuk mendapatkan

koloni tunggal, melainkan untuk peremajaan ke cawan atau

medium baru.

2. Goresan T

Cara kerja.

Bagi cawan menjadi 3 bagian menggunakan spidol marker.

Inokulasi daerah 1 dengan streak zig-zag. Panaskan jarum

inokulan dan tunggu dingin, kemudian lanjutkan streak zig-zag

pada daerah 2 (streak pada gambar). Cawan diputar untuk

memperoleh goresan yang sempurna. Lakukan hal yang sama

pada daerah 3.

3. Goresan Kuadran (Streak quadrant)

13

Cara kerja.

Hampir sama dengan goresan T, namun berpola goresan yang

berbeda yaitu dibagi empat. Daerah 1 merupakan goresan awal

sehingga masih mengandung banyak sel mikroorganisma.

Goresan selanjutnya dipotongkan atau disilangkan dari goresan

pertama sehingga jumlah semakin sedikit dan akhirnya terpisah-

pisah menjadi koloni tunggal.

b) Teknik penanaman dari suspense

Teknik penanaman ini merupakan lajutan dari pengenceran bertingkat.

Pengambilan suspensi dapat diambil dari pengenceran mana saja tapi

biasanya untuk tujuan isolasi (mendapatkan koloni tunggal) diambil

beberapa tabung pengenceran terakhir.

1. Spread Plate (agar tabur ulas)

Spread plate adalah teknik menanam dengan menyebarkan

suspensi bakteri di permukaan agar diperoleh kultur murni.

Prosedur kerja dapat dilakukan adalah sebagai berikut.

- Ambil suspensi cairan sebanyak 0,1 ml dengan pipet ukur

kemudian teteskan diatas permukaan agar yang telah memadat.

- Batang L atau batang drugal diambil kemudian disemprot

alkohol dan dibakar diatas bunsen beberapa saat, kemudian

didinginkan dan ditunggu beberapa detik.

- Disebarkan dengan menggosokannya pada permukaan agar

supaya tetesan suspensi merata, penyebaran akan lebih efektif

bila cawan ikut diputar.

- Hal yang perlu diingat bahwa batang L yang terlalu panas

dapat menyebabkan sel-sel mikroorganisme dapat mati karena

panas.

14

2. Pour Plate (agar tuang)

Teknik ini memerlukan agar yang belum padat (>45oC) untuk

dituang bersama suspensi bakteri ke dalam cawan petri lalu

kemudian dihomogenkan dan dibiarkan memadat. Hal ini akan

menyebarkan sel-sel bakteri tidak hanya pada permukaan agar saja

melainkan sel terendam agar (di dalam agar) sehingga terdapat sel

yang tumbuh dipermukaan agar yang kaya O2 dan ada yang tumbuh

di dalam agar yang tidak banyak begitu banyak mengandung

oksigen. Prosedur kerja yang dilakukan adalah sebagai berikut.

- Siapkan cawan steril, tabung pengenceran yang akan ditanam

dan media padat yang masih cair (>45oC)

- Teteskan 1 ml secara aseptis suspensi sel kedalam cawan

kosong

- Tuangkan media yang masih cair ke cawan kemudian putar

cawan untuk menghomogenkan suspensi bakteri dan media,

kemudian diinkubasi.

Alasan diteteskannya bakteri sebanyak 0,1 ml untuk spread

plate dan 1 ml untuk pour plate karena spread plate ditujukan

untuk menumbuhkan dipermukaanya saja, sedangkan pour plate

15

membutuhkan ruang yang lebih luas untuk penyebarannya

sehingga diberikan lebih banyak dari pada spread plate (Pradhika,

2011).

BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN

A. Kesimpulan

Berdasarkan uraian di atas kita dapat mengambil beberapa kesimpulan

antara lain.

1. Dalam suatu substrat atau media dapat tumbuh dari satu jenis

mikroorganisme, dengan demikian lalu dikembangkan suatu teknik

pemisahan yang disebut teknik isolasi, sehingga diperoleh atau biakan

yang hanya terdiri dari satu jenis mikroorganisme saja yang disebut

biakan murni.

2. Ada dua macam teknik isolasi yaitu. Teknik Penanaman dengan

Goresan (Streak) dan Teknik penanaman dari suspense.

3. Teknik isolasi dibutuhkan keterampilan terutama saat menggoreskan

bakteri dengan menggunakan jarum ose di dalam tabung reaksi dengan

Nutient Agar sebagai medianya.

4. Mikroorganisme terdapat dimana-mana, harus sangat berhati-hati

untuk mencegah masuknya mikroorganisme yang tidak dikehendaki

kedalam biakan murni. Mikroorganisme luar yang tidak dikehendaki

itu dapat masuk melalui kontak langsung dengan permukaan atau

tangan yang tercemar, tersentuhnya media atau permukaan tabung

bagian dalam yang belum tersterilkan, ataupun melalui aliran udara.

B. Saran

Saran dari praktikum kali ini adalah :

1. Diharapkan pada praktikan agar tidak memakai kaos kaki yang

berbau tidak sedap, demi kenyamanan bersama.

2. Diharapkan kepada semua praktikan agar tidak tidak pulang lebih

dahulu sebelum praktikum selesai dilaksanakan.