carte lucrari bm 24.11.09 (1).pdf
TRANSCRIPT
-
8/16/2019 Carte Lucrari BM 24.11.09 (1).pdf
1/142
See discussions, stats, and author profiles for this publication at: https://www.researchgate.net/publication/274083742
Lucrari practice de Biochimia acizilor nucleici sibiologie moleculara
Book · January 2010
READS
696
2 authors:
Sergiu Emil Georgescu
University of Bucharest
78 PUBLICATIONS 108 CITATIONS
SEE PROFILE
Marieta Costache
University of Bucharest
231 PUBLICATIONS 941 CITATIONS
SEE PROFILE
All in-text references underlined in blue are linked to publications on ResearchGate,
letting you access and read them immediately.
Available from: Marieta Costache
Retrieved on: 17 May 2016
https://www.researchgate.net/profile/Sergiu_Georgescu?enrichId=rgreq-54aff301-440c-4dec-838d-221b83f15607&enrichSource=Y292ZXJQYWdlOzI3NDA4Mzc0MjtBUzoyMTE3MjI4MjE0NzYzNTNAMTQyNzQ5MDA2MjU4Nw%3D%3D&el=1_x_4https://www.researchgate.net/profile/Sergiu_Georgescu?enrichId=rgreq-54aff301-440c-4dec-838d-221b83f15607&enrichSource=Y292ZXJQYWdlOzI3NDA4Mzc0MjtBUzoyMTE3MjI4MjE0NzYzNTNAMTQyNzQ5MDA2MjU4Nw%3D%3D&el=1_x_5https://www.researchgate.net/profile/Marieta_Costache?enrichId=rgreq-54aff301-440c-4dec-838d-221b83f15607&enrichSource=Y292ZXJQYWdlOzI3NDA4Mzc0MjtBUzoyMTE3MjI4MjE0NzYzNTNAMTQyNzQ5MDA2MjU4Nw%3D%3D&el=1_x_5https://www.researchgate.net/?enrichId=rgreq-54aff301-440c-4dec-838d-221b83f15607&enrichSource=Y292ZXJQYWdlOzI3NDA4Mzc0MjtBUzoyMTE3MjI4MjE0NzYzNTNAMTQyNzQ5MDA2MjU4Nw%3D%3D&el=1_x_1https://www.researchgate.net/profile/Marieta_Costache?enrichId=rgreq-54aff301-440c-4dec-838d-221b83f15607&enrichSource=Y292ZXJQYWdlOzI3NDA4Mzc0MjtBUzoyMTE3MjI4MjE0NzYzNTNAMTQyNzQ5MDA2MjU4Nw%3D%3D&el=1_x_7https://www.researchgate.net/institution/University_of_Bucharest?enrichId=rgreq-54aff301-440c-4dec-838d-221b83f15607&enrichSource=Y292ZXJQYWdlOzI3NDA4Mzc0MjtBUzoyMTE3MjI4MjE0NzYzNTNAMTQyNzQ5MDA2MjU4Nw%3D%3D&el=1_x_6https://www.researchgate.net/profile/Marieta_Costache?enrichId=rgreq-54aff301-440c-4dec-838d-221b83f15607&enrichSource=Y292ZXJQYWdlOzI3NDA4Mzc0MjtBUzoyMTE3MjI4MjE0NzYzNTNAMTQyNzQ5MDA2MjU4Nw%3D%3D&el=1_x_5https://www.researchgate.net/profile/Marieta_Costache?enrichId=rgreq-54aff301-440c-4dec-838d-221b83f15607&enrichSource=Y292ZXJQYWdlOzI3NDA4Mzc0MjtBUzoyMTE3MjI4MjE0NzYzNTNAMTQyNzQ5MDA2MjU4Nw%3D%3D&el=1_x_4https://www.researchgate.net/profile/Sergiu_Georgescu?enrichId=rgreq-54aff301-440c-4dec-838d-221b83f15607&enrichSource=Y292ZXJQYWdlOzI3NDA4Mzc0MjtBUzoyMTE3MjI4MjE0NzYzNTNAMTQyNzQ5MDA2MjU4Nw%3D%3D&el=1_x_7https://www.researchgate.net/institution/University_of_Bucharest?enrichId=rgreq-54aff301-440c-4dec-838d-221b83f15607&enrichSource=Y292ZXJQYWdlOzI3NDA4Mzc0MjtBUzoyMTE3MjI4MjE0NzYzNTNAMTQyNzQ5MDA2MjU4Nw%3D%3D&el=1_x_6https://www.researchgate.net/profile/Sergiu_Georgescu?enrichId=rgreq-54aff301-440c-4dec-838d-221b83f15607&enrichSource=Y292ZXJQYWdlOzI3NDA4Mzc0MjtBUzoyMTE3MjI4MjE0NzYzNTNAMTQyNzQ5MDA2MjU4Nw%3D%3D&el=1_x_5https://www.researchgate.net/profile/Sergiu_Georgescu?enrichId=rgreq-54aff301-440c-4dec-838d-221b83f15607&enrichSource=Y292ZXJQYWdlOzI3NDA4Mzc0MjtBUzoyMTE3MjI4MjE0NzYzNTNAMTQyNzQ5MDA2MjU4Nw%3D%3D&el=1_x_4https://www.researchgate.net/?enrichId=rgreq-54aff301-440c-4dec-838d-221b83f15607&enrichSource=Y292ZXJQYWdlOzI3NDA4Mzc0MjtBUzoyMTE3MjI4MjE0NzYzNTNAMTQyNzQ5MDA2MjU4Nw%3D%3D&el=1_x_1https://www.researchgate.net/publication/274083742_Lucrari_practice_de_Biochimia_acizilor_nucleici_si_biologie_moleculara?enrichId=rgreq-54aff301-440c-4dec-838d-221b83f15607&enrichSource=Y292ZXJQYWdlOzI3NDA4Mzc0MjtBUzoyMTE3MjI4MjE0NzYzNTNAMTQyNzQ5MDA2MjU4Nw%3D%3D&el=1_x_3https://www.researchgate.net/publication/274083742_Lucrari_practice_de_Biochimia_acizilor_nucleici_si_biologie_moleculara?enrichId=rgreq-54aff301-440c-4dec-838d-221b83f15607&enrichSource=Y292ZXJQYWdlOzI3NDA4Mzc0MjtBUzoyMTE3MjI4MjE0NzYzNTNAMTQyNzQ5MDA2MjU4Nw%3D%3D&el=1_x_2
-
8/16/2019 Carte Lucrari BM 24.11.09 (1).pdf
2/142
UNIVERSITATEA DIN BUCURE!TI
FACULTATEA DE BIOLOGIE
DEPARTAMENTUL DE BIOCHIMIE !I BIOLOGIE MOLECULAR "
LUCR "RI PRACTICE
BIOCHIMIA ACIZILOR NUCLEICI !I
BIOLOGIE MOLECULAR "
Sergiu Emil GEORGESCU Marieta COSTACHE
BUCURE!TI 2009
-
8/16/2019 Carte Lucrari BM 24.11.09 (1).pdf
3/142
CUPRINS
LISTA ABREVIERILOR
CAPITOLUL I: ACIZII NUCLEICI – STRUCTUR ", PROPRIET"#I,
TRANSMITEREA !I EXPRIMAREA INFORMA#IEI GENETICE
I.1. Structura !i compozi"ia acizilor nucleici
I.2. Parametrii de m#rime ai moleculelor de acizi nucleici
I.3. Hidroliza acizilor nucleici
I.4. Purificarea !i evaluarea cantitativ# a acizilor nucleici
I.5. Propriet#"ile fizico-chimice ale acizilor nucleiciI.6. Transmiterea informa"iei genetice – procesul de replicare
I.7. Exprimarea informa"iei genetice - transcrip"ia
CAPITOLUL II: METODE DE IZOLARE !I PURIFICARE ALE ACIZILOR
NUCLEICI
II.1. Izolarea ADN genomic total din "esut vegetal folosind metoda cu
SDS/Acetat de potasiu
II.2. Izolarea ADN genomic total din "esut vegetal folosind metoda cu CTAB
II.3. Izolarea ADN din "esut animal cu fenol-cloroform (metoda Taggart)
II.4. Izolarea ADN din suspensii de culturi celulare
II.5. Izolarea ADN genomic din sânge
II.6. Izolarea ADN din material seminal
II.7. Izolarea ADN din "esuturi împarafinate
II.8. Izolarea ADN din plasm# sau ser
II.9. Izolarea ADN de la nivelul celulelor somatice din lapte
II.10. Izolarea ARN total cu guanidin-tiocianat (metoda Chomczynski)
II.11. Izolarea ARN din sânge
-
8/16/2019 Carte Lucrari BM 24.11.09 (1).pdf
4/142
CAPITOLUL III: METODE DE ANALIZ" ALE BAZELOR AZOTATE !I
ACIZILOR NUCLEICI
III.1. Spectrele de absorb"ie ale bazelor azotate
III.2. Spectrul de absorb"ie al ADN. Determinarea spectrofotometric# a purit#"ii!i concentra"iei ADN.
III.3. Efectele hipocromic !i hipercromic ale ADN
III.4. Verificarea integrit#"ii ADN prin electroforez# în gel de agaroz#
III.5. Electroforez# ADN în gel de poliacrilamid#
III.6. Verificarea integrit#"ii ARN prin electroforez# în gel denaturant de
agaroz#
CAPITOLUL IV: REAC#IA PCR – VARIANTE !I TEHNICI DERIVATE
IV.1. Realizarea reac"iei PCR în gradient de temperatur # pentru optimizarea
hibridiz#rii primerilor
IV.2. Touch-Down PCR cu ad#ugare de adjuvant
IV.3. Tehnica RFLP (Restriction Fragment Lenght Polymorphism)
IV.3.1 Diagnosticarea unor maladii genetice prin tehnica RFLP
A. Diagnosticarea deficien"ei de adeziune leucocitar # bovin# B. Diagnosticarea deficien"ei în uridin-monofosfat sintaz# bovin#
IV.3.2 Eviden"ierea unor polimorfisme la nivelul ADN prin tehnica RFLP
A. Eviden"ierea polimorfismului genei care codific# pentru !-
lactoglobulin# la bovine
B. Analiza polimorfismului locusului Extension la cabaline
IV.3.3 Identificarea speciei utilizând tehnica RFLP
A. Identificarea speciilor de sturioni din genurile Acipenser !i Huso
IV. 4. Tehnica de analiz# a fragmentelor marcate fluorescent
IV.4.1 Identificarea dele"iilor folosind tehnica analizei fragmentelor
marcate fluorescent (diagnosticarea Imunodeficien"ei severe combinate la cabaline)
-
8/16/2019 Carte Lucrari BM 24.11.09 (1).pdf
5/142
IV.4.2 Identificarea inser "iilor folosind tehnica analizei fragmentelor
marcate fluorescent (diagnosticarea Epidermolizei jonc"ionale severe la cabaline)
IV.4.3 Identificarea muta"iilor punctiforme utilizând tehnicile RFLP !i
de analiz# a fragmentelor marcate fluorescent (diagnosticarea Paraliziei hiperkalemice periodice la cabaline)
IV.5. Tehnica PCR multiplex
IV.5.1 Analiza prin PCR multiplex a microsateli"ilor la sturioni
IV.5.2 Analiza prin PCR multiplex a microsateli"ilor la suine
IV.5.3 Aplica"ii ale tehnicii PCR multiplex - Genotiparea la cabaline
în vederea test#rii paternit#"ii
IV.6. Tehnica RT-PCR (PCR revers transcris)IV.7 Tehnica Real-Time PCR
IV.7.1 Cuantificarea relativ# a expresiei genei leptinei la suine
Capitolul V: SECVEN#IALIZAREA ADN
V.1 Secven"ializarea prin metoda „Dye-terminator”
BIBLIOGRAFIE SELECTIV"
-
8/16/2019 Carte Lucrari BM 24.11.09 (1).pdf
6/142
LISTA ABREVIERILOR
2-ME – 2-mercaptoetanol.
6-FAM, ROX, VIC, NED, PET, LIZ – coloran"i fluorescen"i.ADN – acid deoxiribonucleic.
ADNc – acid deoxiribonucleic complementar.
ARN – acid ribonucleic.
ARNr – acid ribonucleic ribozomal.
ARNt – acid ribonucleic de transfer.
ASIP – proteina de semnalizare Agouti (Agouti Signaling Protein).
BLAD – deficien"a de adeziune leucocitar # bovin#.BSA - albumin# seric# bovin#.
CTAB – bromura de cetil-trimetil-amoniu.
ddNTP – dideoxinucleotid trifosfat.
DEPC – dietilpirocarbonat.
DMSO - dimetil sulfoxid.
dNTP – deoxinucleotid trifosfat.
DTT – ditiotreitol.
DUMPS – deficien"a în uridin 5’monofosfat sintaz#.
EDTA – acid etilen-diamino-tetraacetic.
GAPDH – gliceraldehid fosfat dehidrogenaz#.
HYPP – paralizia periodic# hiperkalemic# (Hyperkalemic Periodic Paralysis).
JEB – epidermoliza jonc"ional# sever # (Junctional Epidermolysis Bullosa).
Kpb – kiloperechi de baze.
MC1R - receptorul pentru melanocortin#.
MOPS – acid 3-[N-Morfolino]-propan-sulfonic.
Pb – perechi de baze.
PBS – tampon fosfat salin.
PCR – reac"ie de polimerizare în lan" (Polymerase Chain Reaction).
-
8/16/2019 Carte Lucrari BM 24.11.09 (1).pdf
7/142
RFLP – polimorfismul lungimii fragmentelor de restric"ie (Restriction Fragment Lenght
Polymorphism).
rpm – rota"ii pe minut.
RT-PCR – revers-transcris PCR.SCID – imunodeficien"a sever # combinat# (Severe Combined Immunodeficiency).
SDS – sodiu dodecil-sulfat.
TAE – TRIS-Acid acetic-EDTA.
TBE – TRIS-Acid boric-EDTA.
TE – tampon TRIS-EDTA.
TEMED - N,N,N’,N’- tetrametiletilendiamin#.
TRIS – tris(hidroximetil)aminometan.UMP – uridin 5’monofosfat sintaz#.
UV – ultraviolet.
VIS – vizibil.
-
8/16/2019 Carte Lucrari BM 24.11.09 (1).pdf
8/142
CAPITOLUL I
ACIZII NUCLEICI – STRUCTUR ", PROPRIET"#I, TRANSMITEREA !I
EXPRIMAREA INFORMA#IEI GENETICE
I.1. Structura $i compozi%ia acizilor nucleici
Acizii nucleici sunt substan"e care au fost pentru prima dat# izolate din nucleii
celulelor. Ulterior, s-a eviden"iat existen"a acizilor nucleici atât în nucleu cât !i în
citoplasma celulelor dar denumirea a fost p#strat# din considerente istorice.
Exist# dou# tipuri de acizi nucleici:
a) ADN (acid deoxiribonucleic) localizat în principal în nucleul celulelor dac#
acesta este individualizat, cum este cazul eucariotelor;
b) ARN (acid ribonucleic), prezent în principal în citoplasma celulelor dar !i în
nucleu.
În celul#, acizi nucleici se g#sesc asocia"i cu proteinele în complexe numite
nucleoproteine. Prin tratare, în anumite condi"ii, cu acizi sau cu s#ruri, acizii nucleici se
pot separa de proteinele respective. Odat# separa"i, acizii nucleici sub forma lor de
polimeri pot fi hidroliza"i, în condi"ii adecvate pân# la nucleotide, unit#"ile de baz# ale
alc#tuirii acizilor nucleici. Mai departe, nucleotidele pot fi hidrolizate pân# la fosfat !i
nucleozide sau pân# la fosfat, pentoze !i baze purinice !i pirimidinice. Pentozele sunt
glucide. În ADN pentoza se nume!te deoxiriboz#, iar în ARN poart# numele de riboz#.
Figura 1: Pentozele din structura acizilor nucleici.
-
8/16/2019 Carte Lucrari BM 24.11.09 (1).pdf
9/142
Acizii nucleici au rol esen"ial în conservarea !i transmiterea informa"iei genetice
necesar # func"ion#rii „programului” sintezei proteinelor celulare, suportul marii majorit#"i
a activit#"ilor biologice. Acestia sunt responsabili de dictarea ordinii în care aminoacizii
se leag# între ei pentru a da na!tere unei proteine adecvate.ADN este un element permanent al celulei, informa"iile con"inute în structura sa
fiind transmise descenden"ilor. Din acest motiv se afirm# c# ADN este suportul eredit#"ii.
Acizii ribonucleici, ARNr, ARNt !i ARNm, sunt moleculele implicate în realizarea
direct# a sintezei proteice.
Din punct de vedere structural, acizii nucleici sunt molecule polinucleotidice foarte
mari formate din repeti"ia unor subunit#"i numite nucleotide. Unit#"ile nucleotidice sunt
formate din acid fosforic, un monozaharid cu cinci atomi de carbon (riboza în ARN !ideoxiriboza în ADN) !i o baz# purinic# (adenina sau guanina) sau pirimidinic# (citozina
!i timina în ADN, respectiv citozina !i uracilul în ARN).
Figura 2: Bazele azotate din structura acizilor nucleici.
Unitatea structural# format# prin legarea unei pentoze de o baz# azotat# prin
intermediul leg#turii N-glicozidice se nume!te nucleozid. Prin legarea unei grup#ri fosfat
la o nucleozid# se va ob"ine o nucleotid# (Figura 3). În structura acizilor nucleici, unit#"ile
-
8/16/2019 Carte Lucrari BM 24.11.09 (1).pdf
10/142
nucleotidice sunt înl#n"uite prin leg#turi fosfo-diesterice stabilite între hidroxilul din
pozi"ia 3’ al unei nucleotide !i gruparea fosfat din pozi"ie 5’ a nucleotidei urm#toare.
Figura 3: Structura unei nucleotide.
Figura 4: Legatura fosfodiesteric#.
Acizii nucleici sunt, asemeni proteinelor, polimeri neramifica"i care pot fi liniari
sau circulari. Demonstrat# de Levene în 1925 !i confirmat# dup# 1950 de c#tre Todd,
înl#n"uirea covalent# a nucleotidelor este de tip ester. Depolimerizarea se poate realiza
prin hidroliz# de diferite tipuri (acid#, bazic#, enzimatic#) !i este destul de folosit# în
tehnicile de biologie molecular #.
-
8/16/2019 Carte Lucrari BM 24.11.09 (1).pdf
11/142
Indiferent de tipul de acid nucleic (ribonucleic sau deoxiribonucleic), reac"ia de
asamblare polinucleotidic# este aceea!i: hidroxilul din pozi"ia 3’ al unui nucleozid
monofosfat este esterificat de c#tre 5’-fosfatul din structura nucleozid trifosfatului care
particip# la formarea leg#turii. Faptul c# acizii nucleici sunt polimeri fosfodiesterici ainucleozid-monofosfa"ilor (NMP) are urm#toarele consecin"e directe:
a) asemeni polipeptidelor, catena este orientat# (vectorizat#). Sensul conven"ional
5’-3’ a fost adoptat pentru lectura !i scrierea polinucleotidelor ca !i pentru reprezent#rile
prescurtate sau simbolice.
b) bazele fixate regulat în func"ie de o secven"# specific# speciei moleculare, sunt
purtate de un schelet covalent pentozo-fosfat. Cu toate c# imaginea este asem#n#toare cu
cea a scheletului polipeptidic purt#tor al catenelor laterale ale aminoacizilor, exist# o seriede diferen"e fa"# de acesta: - scheletul acizilor nucleici este un polianion cu o sarcin# pe
unitate care are o densitate total# de sarcin# negativ# foarte mare; - varietatea bazelor este
mult mai redus# (patru baze azotate fa"# de 20 de aminoacizi).
Consecin"ele acestor diferen"e sunt foarte importante pentru sistemele de
informa"ie genetic#. În"elegem astfel, de ce pentru codificarea aminoacizilor de c#tre
secven"ele nucleotidice nu este nevoie numai de o simpl# echivalen"# baz#/aminoacid, ci
de un limbaj ternar format din ansambluri de trei baze adiacente a c#ror asocieredetermin# existen"a a 64 de combina"ii posibile, care stau la baza codului genetic.
I.2. Parametrii de m&rime ai moleculelor de acizi nucleici
M#rimea acizilor nucleici se exprim# prin trei tipuri de unit#"i:
- lungime;
- mas# molecular # exprimat# în Daltoni (Da);
- num#r de nucleotide sau de baze ale acestora pentru monocatene (b) !i în perechi
de baze (pb) dac# molecula este constituit# din dou# catene asociate. Multiplul cel mai
folosit este cel de kilobaze sau kilo-perechi de baze (1000 b sau 1000 pb).
-
8/16/2019 Carte Lucrari BM 24.11.09 (1).pdf
12/142
Num#rul nucleotidelor din structura ARN variaz# de la mai multe zeci de baze la
mai multe mii de baze.
ARN ribozomal (ARNr) 100 - 5000 b
ARN de transfer (ARNt) 75 - 90 bARN mesager (ARNm) num#rul de baze depinde de m#rimea genei copiate
M#rimea ADN variaz# în func"ie de regn !i specie. Aceasta acoper # toat# gama de
la 5000 la mai mult de un milion de perechi de baze.
Metode de determinare a m&rimii acizilor nucleici
Metodele de determinare a m#rimii acestor macromolecule se bazeaz# pe diferite
caracteristici !i poate fi determinat# prin mai multe metode:
1. Microscopie electronic#: datorit# dimensiunilor lor acizii nucleici pot vizualiza"i prin aceast# tehnic#. Metoda se potrive!te foarte bine moleculelor de ADN de m#rime
medie (câteva mii la 200000 pb).
2. Electroforez#: este o tehnic# de separare a moleculelor în func"ie de masa lor
molecular #. Condi"iile de densitate de sarcin# asem#n#toare, caracteristice pentru
electroforeza în SDS a proteinelor, sunt realizate în mod natural, de c#tre scheletul
pentozo-fosfat. De asemenea, dependen"a logaritmic#, distan"# de migrare în func"ie de
m#rime, este bine respectat#.Pentru separarea moleculelor de acizi nucleici de diferite dimensiuni sunt folosite
geluri de agaroz# cu porozit#"i variate. Pentru facilitarea estim#rilor cantitative exist#
colec"ii de polimeri „marcheri de mas# molecular #” utiliza"i pentru etalonarea separ #rilor.
De altfel, aceast# metod# de separare este omniprezent# în manipul#rile de biologie
molecular #. Electroforeza se poate realiza !i în geluri de poliacrilamid# pentru situa"iile în
care este necesar # separarea moleculelor polinucleotidice mici sau oligonucleotidelor.
Prin electroforeza în gel de poliacrilamid# este posibil# identificarea unor fragmente care
difer # numai printr-un singur nucleotid. Din acest motiv tehnica este foarte util# în
secven"ializarea acizilor nucleici !i în determinarea regiunilor de polimorfism normal sau
patologic determinat de existen"a unor muta"ii.
Moleculele ADN de m#rime mare sunt analizate !i prin:
-
8/16/2019 Carte Lucrari BM 24.11.09 (1).pdf
13/142
a) ultracentrifugare: for "ele de frecare existente între aceste molecule limiteaz#
câmpul aplica"iilor molecule de pân# la 1,5 x 106 pb. Prin aceast# tehnic# pot fi separate
fragmente de ADN care au un con"inut diferit în guanin# !i citozin#; ADN genomic
bacterian; ADN plasmidial; ARN total, diferite tipuri de ARN ribozomal, etc. b) electroforeza în câmp pulsatoriu (sau alternant). Prin aceast# tehnic# care a fost
imaginat# la începutul anilor 1980, dou# câmpuri electrice se aplic# alternativ pe dou#
direc"ii diferite. Principul de separare se bazeaz# pe viteza diferit# de reorientare a
moleculelor în momentul altern#rii celor dou# câmpuri electrice. Ele impun moleculelor
de ADN etape de reorientare diferite înainte de migrarea lor efectiv#. Aceste etape de
reorientare sunt dependente de m#rimea moleculelor.
Hidroliza acizilor nucleiciDegradarea unui polinucleotid poate s# se refere la: i) leg#tura fosfodiester atunci
când se produce o depolimerizare; ii) unit#"ile nucleotidice dac# se rupe leg#tura
glicozidic# !i se degradeaz# componentele. În ambele cazuri hidroliza poate fi de natur #
chimic# sau enzimatic#.
I.3. Hidroliza acizilor nucleici
Hidroliza chimic&
De!i sunt printre cele mai stabile molecule, în condi"ii fiziologice celulare, acizii
nucleici prezint# totu!i, in vitro, rezisten"e diferite la condi"iile de pH !i de temperatur #.
Tratamentul acid afecteaz# în mod similar cele dou# tipuri de acizi nucleici. Astfel
sunt necesare condi"ii drastice pentru a degrada scheletul pentozo-fosfat (înc#lzire, acizi
concentra"i). În aceste condi"ii celelalte leg#turi din structur # nu rezist# !i ob"inem un
amestec de fosfa"i, pentoze !i baze azotate. Acest protocol, urmat de o frac"ionare
cromatografic#, a fost una dintre tehnicile care au permis analiza compozi"iei acizilor
nucleici. În condi"ii relativ blânde (pH 4,0), se vor rupe numai leg#turile N-glicozidice cu
purinele care sunt cele mai fragile. În acest caz, se ob"ine un derivat de acid nucleic
apurinic care prezint# interes pentru anumite analize.
-
8/16/2019 Carte Lucrari BM 24.11.09 (1).pdf
14/142
Comportamentul ARN !i ADN la hidroliz# bazic# este foarte diferit. ADN rezist#
la valori extreme de pH bazic. La pH 13,0 !i 370C se înregistreaz# aproximativ zece
scind#ri pe or # !i pentru milion de pun"i fosfo-diester. Cu toate acestea, pun"ile
fosfodiester din ADN devin sensibile la hidroliz# alcalin# dac# bazele sunt înl#turate saudegradate. Aceast# proprietate este utilizat# în tehnica de secven"ializare chimic#.
ARN este total hidrolizat în ribonucleotidele componente în câteva minute, la 370C
!i pH 11. Înc# de la pH 8, se constat# începerea unei degrad#ri semnificative.
Diferen"a dintre reactivitatea ARN !i iner "ia ADN este dat# de existen"a grup#rii
hidroxil din pozi"ia 2’. Deprotonarea sa în condi"ii alcaline produce un anion alcoxid,
puternic nucleofil care atac# gruparea fosfo-diester adiacent#. Absen"a hidroxilului în 2’
din scheletul ADN este un factor determinant al stabilit#"ii sale chimice în condi"iicelulare, normale sau agresive.
Hidroliza enzimatic&
Enzimele care catalizeaz# hidroliza leg#turii fosfodiester din structura acizilor
nucleici, fosfodiesterazele, sunt numite !i nucleaze. Acestea sunt prezente în toate celulele
!i sunt foarte utile în metabolismul acizilor nucleici !i proteinelor. O parte dintre a ceste
nucleaze sunt secretate de c#tre pancreasul exocrin, în intestin, !i particip# direct la
digestie hranei. Aceste enzime prezint# niveluri de specificitate comparabile cu cele ale peptidazelor !i proteazelor. Ele se pot clasifica în func"ie de:
a) modul lor de atac al catenei: - exonucleaze, enzimele care ac"ioneaz# la nivelul
extremit#"ii catenelor; - endonucleaze, enzimele care atac# în interiorul catenelor.
b) specificitatea lor fa"# de substrat: - pentru tipul de acid nucleic: ribonucleaze
pentru ARN, deoxiribonucleaze pentru ADN !i nucleaze pentru ambele; - pentru tipul de
structur #: mono- sau dublu catenar #.
c) specificitatea lor de recunoa!tere a situsurilor de ac"iune: - specificitate pentru
baze; - specificitate pentru secven"e.
d) tipul de rupere a leg#turii fosfodiester: - exonucleazele !i endonucleazele de tip
d scindeaz# extremitatea 5’ !i duc la formarea de 3’NMP; - exonucleazele !i
endonucleazele de tip p scindeaz# extremitatea 3’ !i determin# formarea 5’NMP.
-
8/16/2019 Carte Lucrari BM 24.11.09 (1).pdf
15/142
-
8/16/2019 Carte Lucrari BM 24.11.09 (1).pdf
16/142
eliminate printr-un nou tratament cu cloroform/alcool izopropilic. Dac# acizii nucleici
provin din extracte celulare, proteinele sunt în prealabil hidrolizate cu ajutorul unei
enzime proteolitice numit# proteinaza K.
În ultimii ani au fost puse la punct procedee de purificare pe baz# de r #!ini.Reactivii sunt livra"i sub form# de „kituri” gata de întrebuin"are simplificând mult
procesul de purificare !i crescând adesea randamentul acestuia.
Metode spectrofotometrice
Determinarea absorb"iei în ultraviolet cu ajutorul unui spectrofotometru permite
verificarea purit#"ii unei solu"ii de ADN sau ARN. În urma determin#rii densit#"ii optice
se va ob"ine un semnal la 260 nm. Pentru estimarea purit#"ii este necesar # calcularea
raportului densit#"ilor optice la 260 nm/280 nm care, în mod normal, trebuie s# fie cuprinsîn intervalul 1,8-2,0. În cazul ADN, un raport mai ridicat indic# o contaminare cu ARN.
Dac# exist# o contaminare cu proteine (280 nm), raportul va fi net inferior valorii de 1,8.
Concentra"ia acizilor nucleici poate fi apreciat# astfel:
unitatea DO (260 nm) = 50 ng/µl pentru ADN dublu-catenar
unitatea DO (260 nm) = 40 ng/µl pentru ADN monocatenar
unitatea DO (260 nm) = 30 ng/µl pentru ARN
Determinarea secven%ei primare a acizilor nucleici
Strategia curent# de secven"ializare a acizilor nucleici este format# din trei etape,
conforme cu principiile comune de analiz# a polimerilor:
a) acidul nucleic este întotdeauna prea lung pentru a fi secven"ializat direct !i
trebuie frac"ionat în fragmente repetabile de m#rime adecvat#. Acestea sunt separate,
fiecare fiind apoi supus secven"ializ#rii;
b) prin scindarea diferit# a fragmentului de secven"ializat, se produc amestecuri de
segmente de oligonucleotide, de diferite lungimi care se suprapun;
c) separarea !i identificarea componentelor fiec#ruia dintre aceste amestecuri !i
apoi compararea lor în scopul reconstituirii secven"ei ini"iale a fragmentului.
Începuturile în secven"ializarea acizilor nucleici au fost tributare modalit#"ilor de
scindare !i de frac"ionare a oligonucleotidelor. Înainte de 1970 cercet#torii nu dispuneau
-
8/16/2019 Carte Lucrari BM 24.11.09 (1).pdf
17/142
nici de endonucleaze !i nici de modalit#"i de scindare echivalente degrad#rii Edman.
Secven"ializarea realizat# pentru ARNtAla a constat în scindarea par "ial# cu ajutorul
ribonucleazelor T1 !i A, suprapunerea fragmentelor ob"inute în urma ac"iunii secven"iale
a unei exonucleaze !i analiza produ!ilor ob"inu"i prin cromatografie.Anii 1970 marcheaz# descoperirea endonucleazelor de restric"ie !i primele realiz#ri
ale tehnicilor de biologie molecular #, printre care !i clonarea care permitea multiplicarea
moleculelor de ADN disponibile.
La baza evolu"iei ulterioare a secven"ializ#rii ADN au stat dou# metode. Diferen"a
dintre cele dou# const# în modul de ob"inere a ansamblurilor de fragmente: una din
metode se bazeaz# pe scindarea chimic# (metoda introdus# de A. Maxam !i W. Gilbert),
cealalt# se inspir # din procesul de replicare !i se bazeaz# pe tehnologia sintezeienzimatice (metoda Sanger).
Cu toate c# metoda Maxam !i Gilbert a cedat de mult locul metodei Sanger, pentru
care la ora actual# exist# numeroase variante, confruntarea dintre cele dou# concep"ii
r #mâne interesant#.
Metoda „dideoxi” a lui F. Sanger
Sanger, pionierul secven"ializ#rii insulinei, a conceput o metod# genial# de
secven"ializare care se bazeaz# pe principiul replic#rii. Analiza structurii ADN !i a roluluis#u în exprimarea genelor a fost u!urat enorm de punerea la punct a acestei tehnici de
secven"ializare. Esen"a tehnicii de secven"ializare a ADN, propus# F. Sanger !i
colaboratorii, a constituit-o generarea de fragmente a c#ror lungime era dependent# de
ultima baz# din structura secven"ei. Colec"ii de astfel de fragmente au fost generate prin
întreruperea controlat# a sintezei enzimatice. Aceast# tehnic# s-a impus în fa"a celorlalte
tehnici de secven"ializare datorit# simplit#"ii sale.
Ini"ial, fragmentul care urmeaz# a fi secven"ializat (matri"#), este denaturat, pentru
ob"inerea de monocatene, !i adus în contact cu un primer. Hibridizarea primerului cu
matri"a monocatenar # permite ini"ierea ac"iunii ADN polimerazei, în prezen"a substratelor
nucleotidice dNTP. În fiecare dintre cele în patru loturi se ad#ug# o mic# cantitate dintr-
un 2’-3’dideoxinucleotid trifosfat (ddNTP) diferit, analog cu una dintre nucleotide.
-
8/16/2019 Carte Lucrari BM 24.11.09 (1).pdf
18/142
Încorporarea acestui analog, în locul unei nucleotide normale, blocheaz# alungirea
datorit# lipsei hidroxilului din pozi"ia 3’ terminal#. Din acest considerent ddNTP au fost
denumite molecule terminatoare de caten# (Figura 6). Concentra"ia lor este destul de mic#
pentru a opri sinteza numai ocazional.
Figura 6: Structurile deoxi- !i dideoxinucleotidelor.
Ulterior, prin electroforez# în gel de poliacrilamid# sau prin electroforez# capilar #,
se realizeaz# separarea fragmentelor din cele patru loturi. M#rimea diferit# a fragmentelor
este datorat# opririi copierii catenei matri"# la un anumit nivel, corespunz#tor fiec#ruia
dintre cele patru tipuri de ddNTP (ddATP, ddCTP, ddGTP !i ddTTP).
Aceast# metod# ingenioas# i-a permis lui F. Sanger, în 1977, s# stabileasc# prima
secven"a complet# de 5386 baze a bacteriofagului "X174. Total automatizat# ulterior,
tehnica a permis descifrarea complet# a genoamelor multor organisme procariote !i
eucariote !i a fost folosit# cu succes în amplul proiect de secven"ializare a genomului
uman. Secven"ializarea clasic# a acizilor nucleici inventat# de Sanger are la ora actual# o
serie de variante care au f #cut-o s# se impun# ca singura alternativ# viabil# de determinare
a secven"ei acizilor nucleici.
La ora actual# se folosesc primeri sau dideoxinucleotid trifosfa"i marca"i
fluorescent ce conduc la ob"inerea unor fragmente a c#ror separare se realizeaz# prinelectroforez# în gel de acrilamid# sau prin electroforez# capilar #. Marcarea fluorescent#
ofer # posibilitatea combin#rii amestecurilor de reac"iei urmat# de separarea electroforetic#
a ansamblului. Benzile ob"inute pot fi detectate independent în func"ie de reactivul
fluorescent cu care au fost marcate. Folosirea marc#rii fluorescente !i evolu"ia interesant#
-
8/16/2019 Carte Lucrari BM 24.11.09 (1).pdf
19/142
a sistemelor de detectare !i a programelor de interpretare a rezultatelor a permis
automatizarea tehnicii !i extinderea aplica"iilor acesteia.
I.5. Propriet&%ile fizico-chimice ale acizilor nucleici
Pentru a extrage acizii nucleici !i pentru a le evalua masa molecular #, sunt utilizate
anumite propriet#"i determinate de natura fibroas# !i de m#rimea ADN !i anume:
a) s#rurile de sodiu ale acizilor nucleici sunt solubile în ap# !i dau solu"ii cu
vâscozitate ridicat#;
b) alcoolii, dintre ace!tia cel mai folosit este etanolul, sunt utiliza"i pentru
precipitarea acizilor nucleici din solu"ie;c) densitatea acizilor nucleici este destul de mare pentru a permite separarea lor
prin ultracentrifugare. Centrifugarea în gradient de densitate la echilibru permite
determinarea masei moleculare !i evaluarea con"inutului în G/C.
Dintre propriet#"ile datorate compozi"iei re"inem:
a) Caracterizarea !i dozarea ADN pentru con"inutul în deoxiriboz#. Hidroliza acid#
par "ial# la cald înl#tur # purinele demascând resturile de 2-dezoxiriboz#. O frac"iune
suficient# dintre deoxiriboze ata!ate pe schelet, sub forma lor furanozic#, sunt convertite
în forma aldehidic# care poate reac"iona cu reactivul Schiff !i îl recoloreaz#. Produsul
ob"inut precipit# pe scheletul macromoleculei !i poate fi cuantificat spectrofotometric.
b) Absorb"ia în UV a ADN la 260 nm datorit# con"inutului lui în baze. Aceast#
absorb"ie este de aproximativ 30 de ori mai important# decât a proteinelor cu o
concentra"ie egal#, dar totu!i inferioar # bazelor libere.
Denaturarea acizilor nucleici
Procesul denaturarea reprezint# o alterare a structurii spa"iale a unei
macromolecule f #r # ruperea leg#turilor covalente. Denaturarea !i renaturarea termic# a
ADN sunt pe de o parte modalit#"i de studiu ale acestor molecule dar !i unelte necesare în
manipularea acestora.
-
8/16/2019 Carte Lucrari BM 24.11.09 (1).pdf
20/142
Fenomenul de denaturare se manifest# la înc#lzirea unei solu"ii de ADN. Acest
fenomen este înso"it de modific#ri spectaculoase ale propriet#"ilor fizice cum ar fi
pierderea vâscozit#"ii !i amplificarea absorb"iei în UV. Efectul de hipercromicitate este o
modificare foarte important# !i informativ# pentru studiul fenomenului de denaturare. Dinstare nativ#, dublu catenar #, molecula trece în stare denaturat# prin ruperea leg#turilor de
hidrogen !i a contactelor Van der Waals care asigur # stivuirea. Temperatura separ #
complet sau incomplet cele dou# catene care î!i pierd forma elicoidal# !i adopt# o
conforma"ie statistic# aleatoare. În aceste condi"ii cre!te absorb"ia în UV a bazelor care
pân# în acel moment erau mascate.
Un factor important este concentra"ia în s#ruri a mediului, un factor extrinsec care
are efect protector spectacular. Ionii minerali neutralizeaz# sarcinile scheletului fosfat !ianuleaz# repulsiile electrostatice care destabilizeaz# dublul helix. De re"inut c# în ap#
pur # ADN se poate denatura la temperatura ambiant#.
Fenomenul de renaturarea se refer # la restaurarea st#rii ini"iale de dubl# caten#,
plecând de la ADN denaturat. Succesul acestei renatur #ri depinde de condi"iile de mediu
(pH, t#rie ionic#), de starea mai mult sau mai pu"in avansat# a denatur #rii; de protocolul
adoptat pentru revenirea la temperatura nedenaturant#.
Procesul de denaturare/renaturare parcurge diferite etape în func"ie protocolulutilizat:
a) dac# solu"ia este r #cit# prea repede, timpul de c#utare al catenelor
complementare este prea scurt, iar moleculele sunt „înghe"ate” în starea imperfect# de
cupluri inter- !i intramoleculare;
b) dac# solu"ia este r #cit# treptat s-a observat, din contr #, o revenire gradat# la
propriet#"ile caracteristice structurii bicatenare. Acest fenomen are loc deoarece este
asigurat# durata necesar # pentru explorarea bazelor prezente pe cele dou# catene. Aceste
condi"ii au fost denumite „de anelare” sau „annealing”.
Dac# se porne!te de la o solu"ie complet denaturat#, reîmperecherea se realizeaz#
în dou# etape de cinetic# diferite: în prima catenele separate se întâlnesc la întâmplare !i o
scurt# regiune se poate împerechea pe baz# de complementaritate !i forma începutul unei
-
8/16/2019 Carte Lucrari BM 24.11.09 (1).pdf
21/142
duble elice. În a doua etap#, plecând de la aceste puncte de ini"iere a procesului,
împerecherile se vor efectua foarte rapid, dup# modelul închiderii unui fermoar,
impunând structura de dublu helix pe toat# lungimea moleculei.
Denatur #rile !i renatur #rile sunt etape cheie pentru numeroase tehnici de biologiemolecular #. Hibridizarea, etap# tehnic# foarte important#, presupune formarea de
duplexuri artificiale între ADN din diferite surse sau între ADN !i ARN.
Regiunile de ARN al c#ror lan" monocatenar se repliaz# pentru a forma o structur #
de dublu helix prezint# acela!i fenomen de denaturare, dar aceste duplexuri ARN sunt
mult mai stabile.
Exist# o serie de al"i factori care au ac"iune denaturant# asupra ADN. Astfel,
valorile extreme de pH dezorganizeaz# împerecherile modificând ionizarea grupelor de baze.
Tratamentul alcalin este o metod# important# care este folosit# în tehnicile de
biologie molecular # pentru denaturarea ADN. Prin aceasta se separ # rapid catenele f #r # a
se produce degradare. Este o modalitate reversibil# de a ob"ine molecule de ADN
monocatenare care sunt foarte utile etapelor de hibridizare din tehnicile Southern !i
Northern blotting.
Compu!ii organici ca aldehida formic#, formamida, ureea, au capacitatea de astabili leg#turi de hidrogen !i sunt utiliza"i în ca agen"i denaturan"i în tehnicile de separare
a ADN. Faptul c# ac"iunea lor necesit# accesibilitatea grupelor de baze implicate în
împerecheri a condus la concep"ia unei structuri dinamice pentru ADN, în care exist#
regiuni care se desfac tranzitoriu !i monocatene care se reîmperecheaz#. În ADN linear,
desfacerea spontan# a bazelor este totu!i rar # la temperaturi fiziologice.
Trebuie s# re"inem c# in vivo probabilitatea de denaturare a ADN în condi"ii de pH,
for "# ionic# !i temperatur # celular # este minim#. Cu toate acestea existen"a procesului
activ de împerechere par "ial# este obligatoriu pentru replicare !i transcrip"ie. De
asemenea, proteinele care se leag# la ADN inhib#, pentru cea mai mare parte,
denaturarea. Cu toate acestea, în func"ie de starea fiziologic# a celulei, numeroase
proteine destabilizeaz# dubla elice.
-
8/16/2019 Carte Lucrari BM 24.11.09 (1).pdf
22/142
I.6. Transmiterea informa%iei genetice – procesul de replicare
ADN este supus unor procese celulare esen"iale (replic#ri, repar #ri, rearanj#ri !i
recombin#ri) catalizate de enzime !i care asigur # transmiterea corect#, conservarea !iunicitatea informa"iei genetice a fiec#rui individ.
Replicarea ADN, un proces fundamental care are loc în celulele organismelor vii !i
st# la baza eredit#"ii biologice. Prin acesta se realizeaz# copierea, mai precis duplicarea,
moleculelor de ADN. Replicarea este semiconservativ#, deoarece o molecul# de ADN
este duplicat# (replicat#) prin polimerizarea unei noi catene complementare pe fiecare
dintre vechile catene ale dublei helice de ADN. Fiecare din acestea devine un model
pentru sinteza unei noi catene complementare, rezultând dou# molecule ADN identice.Replicarea este bidirec"ional#. Practic, în momentul replic#rii unei molecule de
ADN, catenele sale sunt dep#rtate pentru a forma una sau mai multe furci de replicare în
form# literei Y. Enzima ADN polimeraza, care se pozi"ioneaz# la nivelul fiec#rei furci,
este responsabil# de sinteza noii catene de ADN complementare cu fiecare din catenele
parentale. Replicarea ADN începe la nivelul mai multor situsuri cromozomiale specifice
numite origini de replicare. În func"ie de organism, originile de replicare sunt segmente de
ADN unice care contin mai multe unit#"i repetitive scurte care sunt recunoscute de
proteine multimere denumite “Origin Binding Proteins”.
Polimerazele care realizeaz# sinteza unor noi molecule ADN necesit# asocierea cu
un complex multiproteic de ini"iere a reac"iei de polimerizare nucleotidic#. Toate ADN
polimerazele cunoscute au numai capacitatea de a elonga o caten# preexistent# de ADN
sau de ARN !i sunt incapabile s# ini"ieze sinteza de novo a unei noi catene. Din acest
motiv în complexul multiproteic de ini"iere exist# enzime, numite primaze care realizeaz#
sinteza unui primer complementar la nivelul fiecarei origini de replicare. De asemenea,
polimerazele pot cataliza numai reac"ia de ad#ugare de nucleotide la cap#tul 3#-hidroxil al
catenei în formare determinând cre!terea lan"ului numai în direc"ia 5#-3#.
În acest context, numai una dintre catenele furcii de replicare, cea direct#, poate fi
sintetizat# continuu. Sinteza celeilalte catene, denumit# întârziat#, necesit# mai mul"i
-
8/16/2019 Carte Lucrari BM 24.11.09 (1).pdf
23/142
primeri !i este sintetizat# discontinuu de polimeraz#, sub forma unor fragmente scurte de
ADN, numite fragmente Okasaki, care sunt ulterior conectate cu ajutorul ADN ligazei
pentru a ob"ine o singur # caten# continu#.
Replicarea ADN necesit# cooperarea mai multor proteine, care constituie o ma!in# de replicare multienzimatic# la nivelul furcii de replicare, responsabila de sinteza ADN.
ADN polimeraza realizeaz# replicarea unei matri"e ADN cu o remarcabil# fidelitate,
înregistrând mai pu"in de o eroare pentru fiecare 109 baze parcurse. Acest lucru este
posibil deoarece enzima elimin# propriile sale erori de polimerizare deplasându-se în
lungul ADN (etap# de “proofreading” sau de autocorectare a gre!elilor).
Activitatea de corectare/editare pe care o realizeaz# ADN polimeraza face ca
enzima s# fie incapabil# s# realizeze sinteza de novo a unei noi catene ADN. SintezaADN este amorsat# de c#tre o ARN polimeraz#, numit# primaz#, care sintetizeaz#
fragmente scurte de ARN numite primeri care sunt apoi (la sfîr !itul procesului) înl#turate
!i înlocuite cu fragmentele similare de ADN.
Rarele erori de copiere care scap# ma!in#riei de replicare !i editare a ADN !i
leziunile determinate de catre reac"iile chimice care modific# nucleotidele în ADN sunt
identificate !i corectate de sistemele proteice de reparare a neîmperecherilor. Acestea
controleaz# secven"ele de ADN nou sintetizate sau pe cele afectate de modificari !i repar # erorile de copiere. Leziunile ADN datorate reac"iilor chimice !i radia"iilor UV sunt
corectate de diferite enzime care recunosc ADN modificat !i excizeaz# un fragment scurt
din catena care îl con"ine. Secven"a de ADN înl#turat# este resintetizat# de c#tre o ADN
polimeraz# de reparare, care folose!te drept matri"# catena f #r # leziuni. ADN ligaza
sudeaz# fragmentele de ADN pentru a completa procesul de reparare.
I.7. Exprimarea informa%iei genetice – transcrip%ia
Procesul prin care o gen# conduce producerea unei gene este numit expresie
genic#. Genele sunt exprimate prin transcriere din ADN în ARNm !i prin traducerea
-
8/16/2019 Carte Lucrari BM 24.11.09 (1).pdf
24/142
acestuia în proteine. Nivelul de expresie al unei gene este fin acordat de o serie de
mecanisme de control corelate permanent cu nevoile temporale ale fiecarei celule.
Atât celulele procariote cât !i cele eucariote posed# mecanisme, pe de o parte
comune !i pe de alt# parte distincte, pentru reglarea expresiei genelor !i a fluxului deinforma"ie de la ADN la proteine. Transcrip"ia ADN realizat# de ARN polimeraze
constituie prima etap#, comun# la toate organismele.
La celulele procariote, ribozomii se fixeaz# pe molecula de ARNm, în curs de
sintez# !i realizeaz# traducerea imediat# a informa"iei în proteine, la nivelul citoplasmei.
Din contr #, la eucariote, membrana nuclear # separ # locul în care se realizeaz#
transcrip"ia de cel în care are loc traducerea. Transcriptul primar, ARNm imatur, con"ine o
succesiune de secven"e netraduse, numite introni, care vor fi eliminate prin procedeul descindare a intronilor !i sudare a exonilor („splicing”) în procesul de maturare a ARNm. În
urma acestei etape, localizat# în nucleu, ARNm trece în citoplasm# unde este tradus.
Maturarea ARNm prin „splicing” confer # celulei eucariote posibilitatea diversific#rii
informa"iei prin combinarea alternativ# a exonilor.
Genele procariote !i eucariote sunt structurate dup# aceea!i logic# de baz#, dar cu
diferen"e importante în detaliile moleculare. O defini"ie sintetic# a unei gene eucariote
poate fi util# pentru a rezuma esen"a acestor diferen"e. Este general admis c# o singur # defini"ie dat# genei eucariote nu poate satisface pe toat# lumea sau nu poate corespunde
tuturor exemplelor practice. Defini"ia adoptat# de noi este rezultatul structurii moleculare
a genelor !i "ine cont de diferen"ele de localizare !i de tipurile de secven"e care
influen"eaz# expresia genelor.
Astfel, definim gena ca fiind o combina"ie de segmente de ADN care, împreun#,
constituie o unitate de expresie, o unitate care determin# formarea unui produs specific !i
func"ional care poate fi o molecul# de ARN sau un polipeptid. Segmentele de ADN care
definesc gena includ:
1. Unitatea de transcrip"ie care este constituit# dintr-un segment ADN continuu
care codific# pentru secven"a transcriptului primar. Acesta con"ine secven"a codant# a
ARN matur sau a proteinei produse, intronii !i secven"ele început 5’ !i coad# 3’ prezente
-
8/16/2019 Carte Lucrari BM 24.11.09 (1).pdf
25/142
la nivelul ARNm matur ca !i secven"ele de separare care sunt eliminate în timpul
matur #rii transcrip"ilor primari care codific# pentru molecule de ARN.
2. Secven"ele minimale necesare pentru ini"ierea corect# a transcrip"iei
(promotorul) !i pentru a da na!tere extremit#"ii 3’ particulare din structura ARN matur.3. Elementele secven"ei care determin# frecven"a de ini"iere a transcrip"iei. Acestea
cuprind secven"ele responsabile de inducerea !i represia transcrip"iei !i de specificitatea
celular #, tisular # !i temporal# a transcrip"iei. Aceste regiuni sunt foarte variate structural,
ca pozi"ie !i ca func"ie pentru a putea purta un singur nume. Dintre acestea enumer #m
elementele activatoare (enhancers) !i elementele moderatoare (silencers), care sunt
secven"e ce influen"eaz# ini"ierea transcrip"iei la distan"#, independent de localizarea lor în
raport cu situsul de ini"iere.În aceast# defini"ie a genei nu sunt incluse secven"ele ADN care influen"eaz#
configura"ia unei gene în cromatin# !i nici cele care codific# proteine sau ARN care
moduleaz# expresia unei anumite unit#"i de transcrip"ie.
Controlul vitezei de transcrip"ie la eucariote nu este complet în"eles. Datorit#
m#rimii genomului eucariotelor, este necesar # o selectivitate crescut# a utiliz#rii ARN
polimerazei la transcrierea genelor decât la ADN necodant (non-coding DNA). O
transcrip"ie eficient# necesit#, de regul#, ca dou# sau mai multe proteine diferite s# se legeîn pozi"ii apropiate începutului transcrip"iei. Anumite pozi"ii de leg#tur # numite
intensificatori pot fi pot fi localizate la aproximativ 3kb de la începutul transcrip"ie !i
activarea lor poate cre!te viteza de transcrip"ie de o sut# de ori (transcrierea este un proces
rapid de ordinul 60 nucleotide pe secund#). Intensificatorii se pot întinde atât înainte cât !i
dup# startul transcrierii !i pot exista mai mul"i intensificatori care s# afecteze o singur #
gen#.
-
8/16/2019 Carte Lucrari BM 24.11.09 (1).pdf
26/142
-
8/16/2019 Carte Lucrari BM 24.11.09 (1).pdf
27/142
ob"inerea unei paste omogene.
2. Într-un tub de centrifug# de 2 ml se adaug#: 300 mg omogenat, 900 µl tampon
de extrac"ie (la care se adaug# extemporaneum %-mercaptoetanol pân# se ajunge la o
concentra"ie de 2% -v/v- a acestuia) !i 80 µl SDS (20%).3. Amestecul se agit# puternic !i se incubeaz# 10 minute la 65°C.
4. Dupa adaugarea a 300 µl acetat de potasiu 5 M, amestecul este plasat 20 minute
pe ghea"#.
5. Centrifugare la 8000-11000 rpm, 10 minute, la 4°C.
6. Supernatantul este transferat într-un tub de centrifug# nou !i se adaug# un volum
egal de alcool izopropilic. Se amestec# u!or prin înclinarea tubului !i se plaseaz#
amestecul 30 de minute pe ghea"#.7. Centrifugare la 8000-11000 rpm,10 minute, la 4°C.
8. Supernatantul se arunc# !i peste sediment se adaug# 100 µl solu"ie TE înc#lzit#
la 65°C. Se amestec# puternic pân# când sedimentul se dizolv# complet.
9. Dup# ad#ugarea a 10 µl solu"ie ribonucleaz# se incubeaz# 60 de minute la 37°C.
10. Se adaug# un volum egal de amestec de cloroform:alcool izoamilic 24:1 !i se
omogenizeaz# prin inversia tubului timp de 5 minute.
11. Centrifugare la 8000-11000 rpm, 5 minute, la 4°C.12. Se adaug# 10 µl proteinaz# K !i se incubeaz# 60 de minute la 37°C.
13. Se adaug# un volum egal de amestec cloroform:alcool izoamilic 24:1 !i se
omogenizeaz# prin inversia tubului timp de 5 minute.
14. Centrifugare la 8000-11000 rpm, 5 minute, la 4°C.
15. Supernatanul se transfer # într-un tub de microcentrifug# nou !i se adaug# peste
acesta dou# volume de etanol 100% !i & volume de solu"ie NaCl 5 M. Se omogenizeaz#
energic timp de 20-30 de secunde.
16. Centrifugare la 8000-11000 rpm, 5 minute, la 4°C.
17. Supernatantul este înl#turat prin inversia tubului, iar peste sediment se adaug#
etanol 70%. Se spal# prin agitare u!oar #, timp de 30-60 minute.
18. Centrifugare la 8000-11000 rpm, 5 minute, la 4°C.
-
8/16/2019 Carte Lucrari BM 24.11.09 (1).pdf
28/142
19. Etanolul este îndep#rtat prin înclinarea tubului. Sedimentul se las# la uscat timp
de 15-20 minute la 370C în curent de aer.
20. Sedimentul uscat este resuspendat într-un volum adecvat de ap# ultrapur # sau
de tampon TRIS-EDTA.
II.2. Izolarea ADN genomic total din %esut vegetal folosind metoda cu CTAB
Principiul metodei
Acest procedeu este folosit pe scar # larg# pentru realizarea extrac"iei de ADN din
diverse surse vegetale. Ini"ial, protocolul de extrac"ie a fost folosit la bacterii (Jones,
1953), ulterior el fiind adaptat la plante (Murray and Thonpson, 1980).Bromura de cetil-trimetil-amoniu (CTAB), care este un detergent neionic, este
utilizat în acest caz pentru a elibera acizii nucleici din celul# !i, ulterior, pentru a forma un
complex insolubil cu ace!tia, la concentra"ii de NaCl sub 0,5 M. În acest timp,
polizaharidele, compu!ii fenolici !i al"ii contaminan"i specifici plantelor vor precipita !i
vor putea fi îndep#rta"i. Complexul acizi nucleici-CTAB este solubil numai în solu"ii
saline concentrate. Prin cre!terea treptata a concentra"iei de NaCl, complexul disociaza !i
CTAB poate fi îndep#rtat.
Precipitarea ADN se realizeaza utilizând izopropanol, iar îndep#rtarea total# a
CTAB se face dup# etapa de sp#lare a ADN cu etanol. Cantitatea de ADN care poate fi
ob"inut# variaz# între 100 !i 500 µg per gram de "esut vegetal ini"ial. Cele mai mari
cantit#"i se ob"in în cazul "esuturilor proaspete care au fost în prealabil înghe"ate pe azot
lichid. Realizarea practic# a metodei este relativ simpl# !i se poate adapta pentru cantit#"i
variate de material vegetal.
Material biologic: diferite tipuri de "esut vegetal cum ar fi frunze, semin"e,
cotiledoane, polen. Probele pot fi proaspete, liofilizate, deshidratate sau înghe"ate pe azot
lichid.
Reactivi $i aparatur&: i) solu"ie de extrac"ie CTAB: 2% CTAB, 100 Mm TRIS-
-
8/16/2019 Carte Lucrari BM 24.11.09 (1).pdf
29/142
HCl (Ph 8), 20 Mm EDTA (pH 8), 1,4 M NaCl. Reactivul se stocheaz# la temperatura
camerei !i este stabil pe o perioad# îndelungat#; ii) solu"ie de precipitare CTAB: 1%
CTAB, 50 Mm TRIS-HCl (pH 8), 10 Mm EDTA (pH 8). Reactivul se stocheaz# la
temperatura camerei !i este stabil o perioad# îndelungat#; iii) tampon salin TRIS-EDTA(TE): 10 Mm TRIS-HCl (Ph 8), 0,1 Mm EDTA (pH 8), 1 M NaCl. Reactivul se stocheaz#
la temperatura camerei !i este stabil pe o perioad# lung#; iv) 2% (v/v) 2-mercaptoetanol
(2-ME); v) solu"ie CTAB/NaCl: 10% CTAB în solu"ie 0,7 M NaCl; vi) amestec 24:1 (v/v)
cloroform:octanol sau cloroform alcool izoamilic; vii) etanol 80%; viii) izopropanol
100%; ix) ap# ultrapur #; x) agitator; xi) microcentrifug#; xii) omogenizator sau mojar
steril.
Mod de lucru
1. $esutul vegetal înghe"at pe azot lichid este omogenizat sau mojarat pân# la
transformarea în pulbere fin# !i apoi este transferat într-un tub de microcentrifug#.
2. La solu"ia de extrac"ie CTAB se adaug# 2-mercaptoetanol într-un volum adecvat
astfel încât concentar "ia final# a acestuia s# fie de 2%. Solu"ia proasp#t ob"inut# este
înc#lzit# la 650C. De asemenea se înc#lze!te !i solu"ia CTAB/NaCl.
3. Peste "esutul vegetal proasp#t pulverizat se adaug# tampon de extrac"ie 2-ME/CTAB !i solu"ie CTAB/NaCl. Amestecul se vortexeaz# foarte puternic pân# la
omogenizarea complet#. Se incubeaz# între 10 !i 60 de minute la 650C. Pentru ob"inerea
unei cantit#"i crescute de ADN este necesar un timp de 60 de minute. Pentru fiecare 100 mg
de "esut vegetal proasp#t se adaug# câte 400 µl de tampon 2-ME/CTAB !i câte 50 µl de
solu"ie CTAB/NaCl. În cazul folosirii unor "esuturi deshidratate, liofilizate sau uscate (ex.
semin"e), tamponul de extrac"ie 2-ME/CTAB trebuie diluat 1:1 cu ap# ultrapur #.
4. Se adaug# un volum egal de amestec cloroform: octanol sau cloroform: alcool
izoamilic 24:1 !i se vortexeaz# puternic.
5. Centrifugare la 8000-11000 rpm, 5 minute, la 40C. Se recupereaz# faza apoas#
superioar # !i se transfer # într-un tub curat.
-
8/16/2019 Carte Lucrari BM 24.11.09 (1).pdf
30/142
6. Se adaug# un volum de 1/10 solu"ie CTAB/NaCl din cantitatea total# recuperat#
peste faza apoas#. Se amestec# energic prin inversia tubului.
7. Dup# adaugarea unui volum egal de amestec cloroform:octanol sau
cloroform:alcool izoamilic 24:1 se vortexeaz# puternic.8. Centrifugare la 8000-11000 rpm, 5 minute, la 40C. Se recupereaz# faza apoas#
superioar # !i se transfer # într-un tub curat. Aceasta poate avea o culoare galben-maronie.
9. Se adaug# exact un volum de solu"ie de precipitare CTAB !i se amestec# energic
prin inversie. ADN precipitat trebuie s# devin# vizibil în solu"ie. Dac# acest lucru nu se
observ# se incubeaza amestecul 30 minute la 650C.
10. Centrifugare la 2000-3000 rpm, 5 minute, la 40C. Viteza de centrifugare nu
trebuie crescut# foarte mult deoarece sedimentul va fi foarte greu de resuspendat. Dac# sedimentul nu este vizibil se adaug# înc# 1/10 solu"ie de precipitare CTAB din volumul
total !i se incubeaza între 1 !i 12 ore, la 370C. Ulterior se repet# etapa de centrifugare.
11. Supernatantul se reia într-un tub curat de microcentrifug# !i este p#strat.
Sedimentul este resuspendat în tampon salin TRIS-EDTA (se adaug# între 0,5 !i 1 ml de
tampon salin pentru fiecare gram de material vegetal supus extrac"iei). Dac# sedimentul nu
se resuspend# se trece la o incubare timp de 30 de minute la 650C !i se reia opera"ia pân# la
resuspendarea total#. ATEN ! IE: Este posibil ca ADN s! se reg ! seasc! în supernatant. În acest caz
etapele ulterioare se vor continua folosind supernatantul. Pentru a verifica prezen " a ADN
în supernatant este recomandat ! citirea absorban " ei acestuia la 260 nm.
12. ADN este precipitat prin ad#ugarea unui volum egal de izopropanol rece. Se
omogenizeaz# bine con"inutul prin agitarea tubului.
13. Centrifugare la 8000-11000 rpm, 15 minute, la 40C. Izopropanolul este
îndep#rtat prin înclinarea tubului.
14. Sedimentul ob"inut se spal# cu 1 ml etanol 80%, 60 de minute prin agitare.
15. Centrifugare la 8000-11000 rpm, 15 minute, la 40C. Etanolul este îndep#rtat prin
înclinarea tubului. Sedimentul se las# la uscat timp de 15-20 minute, la 370C, în curent de
aer.
-
8/16/2019 Carte Lucrari BM 24.11.09 (1).pdf
31/142
OP ! IONAL: Pentru o mai bun! sp!lare a ADN #i pentru îndep!rtarea total ! a
CTAB se repet ! etapele 14-15.
16. Sedimentul uscat este resuspendat într-un volum adecvat de ap# ultrapur # sau de
tampon TRIS-EDTA.
II.3. Izolarea ADN din %esut animal cu fenol-cloroform (metoda Taggart)
Principiul metodei
Acest protocol descrie una dintre cele mai simple metode de extrac"ie !i purificare
de ADN genomic.
Izolarea ADN se realizeaz# având la baz# un proces de extrac"ie în trei etape. În prima etap# are loc liza celulelor !i a nucleelor acestora într-o solu"ie con"inând detergent
!i EDTA. Concomitent are loc clivarea enzimatic# a proteinelor folosind proteinaz# K sau
amestecuri de enzime proteolitice. Eliminarea ARN din extractul de acizi nucleici se
realizeaz# cu ajutorul unei solu"ii de ribonucleaz#.
În etapa urm#toare sunt precipitate proteinele folosind un amestec de solven"i
organici (fenol/cloroform/alcool izoamilic), în timp ce ADN genomic este extras în
solu"ie. Fenolul realizeaz# o denaturare foarte eficient# a proteinelor, solubilizându-le
ulterior în faza organic#. De asemnea, cloroformul este un agent denaturant al proteinelor
destul de eficient. Totodat# el are !i proprietatea de a stabiliza interfa"a instabil# dintre
faza apoas# !i cea fenolic#, separate prin centrifugare. Amestecul fenol-cloroform are !i
rolul de a reduce cantitatea de solu"ie apoas# re"inut# la nivelul fazei organice, realizând
astfel concentrare a ADN !i deci o cre!tere a randamentului de extrac"ie. Alcoolul
izoamilic previne amestecarea celor dou# faze, organic# !i apoas#.
În ultima etap#, ADN este concentrat !i desalifiat prin precipitare cu etanol absolut.
În pezen"a unei concentra"ii relativ crescute de cationi monovalen"i (între 0,1 !i 0,5 M),
etanolul induce o modificare conforma"ional# a ADN, aceasta cauzând agregarea !i
precipitarea ADN din solu"ie. Precipitarea cu etanol absolut este extrem de eficient#
-
8/16/2019 Carte Lucrari BM 24.11.09 (1).pdf
32/142
-
8/16/2019 Carte Lucrari BM 24.11.09 (1).pdf
33/142
2. În fiecare tub se adaug# 400 'l fenol redistilat (pH 8), se agit# puternic
aproximativ 20 secunde !i mult mai u!or timp de 10 minute (prin inversia repetat# a
tubului sau prin vortexare la vitez# mic#).
3. Se adaug# 400 'l cloroform:alcool izoamilic (24:1) în fiecare tub. Se agit# puternic timp de 20 secunde !i mult mai u!or timp de 10 minute.
4. Se centrifugheaz# tuburile la 13400 rpm timp de 3 minute.
5. Cu o pipet# automat#, se îndep#rteaz#, cu aten"ie, stratul apos superior !i
con"inutul se transfer # într-un tub nou.
6. OP ! IONAL: Se repet ! etapele 3, 4, 5 pe faza superioar ! nou transferat !.
Pentru a extrage ADN de calitate superioar ! #i pentru a asigura o deproteinizare
eficient ! este recomandat ! repetarea, cel pu " in o dat ! , a celor trei etape. În caz contrar, se va ob " ine un ADN par " ial impurificat cu proteine.
7. Dupa ad#ugarea a dou# volume de etanol 100% rece peste faza apoas#
transferat# în tub, se realizeaz# amestecarea prin inversia rapid# a tubului de 5-6 ori.
8. Se centrifugheaz# 3 minute la 13400 rpm !i se îndeparteaz# etanolul prin
inversia tubului.
9. Se adaug# 1 ml de etanol 70% !i se spal# pentru cel pu"in o or # prin agitare
u!oar #, urmat# de centrifugare 3 minute la 13400 rpm !i îndepartarea etanolului 70% prinînclinarea tubului.
10. ADN se usuc# la 37˚C timp de 10-15 minute !i se resuspend# în ap# ultrapur #.
Se las# cel pu"in 24 de ore pentru solubilizarea complet# la 4˚C. Se stocheaz# la 40C, pe
termen scurt, sau la -200C, pe termen lung.
II.4. Izolarea ADN din suspensii de culturi celulare
Principiul metodei
Metoda descris# în continuare este simpl# !i conduce la ob"inerea unei cantit#"i
relativ mari de ADN. Sedimentul de celule aflate în cultur # este plasat într-o solu"ie care
con"ine SDS !i proteinaz# K !i este incubat pân# când membranele celulare sunt lizate iar
-
8/16/2019 Carte Lucrari BM 24.11.09 (1).pdf
34/142
proteinele sunt degradate. Solu"ia este tratat# cu fenol/cloroform/alcool izoamilic în
vederea deproteiniz#rii, iar ADN este precipitat cu etanol. În final, ADN precipitat este
sp#lat cu etanol, uscat !i resuspendat în tampon specific sau în ap# ultrapur #.
Material biologic: diferite tipuri de celule animale în cultur #.
Reactivi: i) tampon fosfat salin (PBS) 10X: 1,37 M NaCl, 27 Mm KCl, 43 Mm
Na2HPO4 x 7 H2O, 14 mM KH2PO4. Se prepar # sub forma unei solu"ii 10X !i se dilueaz#
înainte de folosire. Solu"ia diluat# are un pH de aproximativ 7,3. Se stocheaz# la
temperatura camerei pe termen nelimitat; ii) tampon de digestie: 100 Mm NaCl, 10 Mm
TRIS-HCl (Ph 8), 25 Mm EDTA (pH 8), 0,5% SDS, 0,1 mg/ml proteinaz# K. Reactivul
se poate stoca la temperatura camerei. Proteinaza K este instabil# la temperaturi ridicate !itrebuie ad#ugat# proasp#t# înainte de fiecare folosire; iii) ribonucleaz# 2 mg/ml; iv)
amestec fenol: cloroform:alcool izoamilic 25:24:1; v) acetat de amoniu 7,5 M; vi) etanol
100% !i 70%; vii) ap# ultrapur #; viii) agitator; ix) microcentrifug#; x) termobloc.
Mod de lucru
1. Flascurile cu celule în cultur # sunt tratate cu tripsin# iar con"inutul este reluat în
tuburi de centrifug# de 15 sau 50 ml care sunt centrifugate 5 minute la 800 rpm !i 40C.2. Supernatantul se arunc# !i sedimentul se resuspend# într-un volum de 1 pân# la
10 ml de PBS rece.
3. Se repet# etapele de centrifugare-resuspendare de dou#-trei ori, pân# când
sedimentul de celule este bine sp#lat.
4. Sedimentul de celule se resuspend# într-un volum adecvat de tampon de
digestie. Acest volum poate varia între 300 !i 1000 µl, în func"ie de cantitatea de celule.
5. Celulele sunt incubate în tamponul de digestie timp de 12-16 ore, la 50 0C, cu
agitare u!oar #.
6. Se adaug# 10 µl de ribonucleaz# !i se las# la incubat o or # la 370C, dup# care se
adaug# un volum egal de amestec fenol/cloroform/alcool izoamilic !i se vortexeaz#
puternic circa 20-30 de secunde.
-
8/16/2019 Carte Lucrari BM 24.11.09 (1).pdf
35/142
7. Centrifugare la 10000 rpm timp de 4 minute. Dac# dup# centrifugare se observ#
un strat sub"ire de material alb la interfa"a dintre faza apoas# superioar # !i cea organic#
inferioar # se va repeta etapa 6.
8. Faza apoas# este transferat# într-un tub nou, evitându-se impurificarea acesteiacu faz# inferioar #. Se adaug# & volum acetat de amoniu !i 2 volume de etanol absolut !i
se agit# prin inversia tubului. ADN trebuie s# înceap# imediat s# precipite din solu"ie.
9. Centrifugare 3 minute la 10000 rpm. Supernatantul este aruncat prin înclinarea
tubului, iar sedimentul este sp#lat cu etanol 70% timp de 30-40 minute, cu agitare u!oar #.
10. Centrifugare 3 minute la 10000 rpm. Supernatantul este decantat prin
înclinarea tubului. Sedimentul este uscat la 370C timp de 15-20 de minute.
11. ADN se resuspend# în ap# ultrapur #. Se las# cel pu"in 24 de ore pentrudizolvare complet# la 4˚C. Se stocheaz# la 40C, pe termen scurt !i la -200C, pe termen
lung.
II.5. Izolarea ADN genomic din sânge
Principiul metodei
Protocolul de fa"# asigur # izolarea ADN genomic din sânge în dou# etape. În prima
etap# se face o izolare a limfocitelor din probele proaspete de sânge. În a doua etap# se
realizeaz# practic izolarea ADN din limfocite. Deproteinizarea se face folosind o solu"ie
salin# saturat# iar ADN este precipitat cu etanol.
Etapa I: Izolarea limfocitelor
Material biologic: probe proaspete de sânge recoltate în recipiente speciale vidate
având drept anticoagulant EDTA, heparin# sau citrat de sodiu.
Reactivi $i aparatur&: i) tampon clorur # de amoniu: clorur # de amoniu 140 mM,
TRIS 17 mM (pH 7,5); ii) tampon fosfat salin (PBS) 10X: 1,37 M NaCl, 27 mM KCl, 43
mM Na2HPO4 x 7 H2O, 14 mM KH2PO4. Se prepar # sub forma unei solu"ii concentrate
-
8/16/2019 Carte Lucrari BM 24.11.09 (1).pdf
36/142
10X !i se dilueaz# înainte de folosire. Solu"ia diluat# are un pH de aproximativ 7,3 !i se
stocheaz# la temperatura camerei pe termen nelimitat; iii) microcentrifug#; iv) agitator.
Mod de lucru
1. Într-un tub de centrifug# de 50 ml se amestec# 10 ml sânge cu 40 ml tamponclorur # de amoniu.
2. Amestecul se plaseaz# pe ghea"# timpde între 30 de minute !i o or #, pân# când
solu"ia devine închis# la culoare. Se centrifugheaz# 10 minute, la 800 rpm !i la
temperatura camerei.
3. Se îndep#rteaz# supernatantul !i sedimentul se usuc# pe hârtie de filtru. Se spal#
prin agitare cu 20 ml PBS.
4. Centrifugare 10 minute la 700 rpm !i la temperatura camerei. Se îndep#rteaz# supernatantul !i sedimentul se usuc# pe hârtie de filtru. Se spal# prin agitare cu 5 ml PBS.
5. Centrifugare 10 minute, la 700 rpm !i la temperatura camerei.
6. Se îndep#rteaz# supernatantul, iar sedimentul de limfocite este folosit imediat la
extrac"ia ADN.
7. OP ! IONAL: Dac! dorim s! realiz!m extrac " ia în alt ! zi limfocitele trebuie
p! strate la -20°C. Sedimentul este resuspendat într-un volum de 1 ml PBS #i limfocitele se
transfer ! într-un tub nou de centrifug ! de 2 ml. Se realizeaz! o a doua sp!lare cu 1 ml PBS a tubului în care s-a realizat izolarea #i con " inutul se transfer ! în acela #i tub.
8. Centrifugare 10 minute la 700 rpm. Supernatantul este îndep!rtat #i sedimentul
se stocheaz! la -200C.
Etapa II: Extrac%ia ADN
Material biologic: sediment de limfocite proasp#t sau înghe"at.
Reactivi $i aparatur&: i) tampon de liz#: 10 mM TRIS-HCl (pH 8), 10 mM EDTA
(pH 8), 0,5% SDS. Reactivul se poate stoca la temperatura camerei; ii) solu"ie salin#
saturat#: NaCl 18%; iii) proteinaz# K 10 mg/ml; iv) tampon de resuspendare TRIS-EDTA
(pH 8): 10 mM TRIS-HCl, 1 mM EDTA; v) ribonucleaz# 2 mg/ml; vi) ap# ultrapur #; vii)
etanol 100% !i 70%; viii) microcentrifug#; ix) agitator.
-
8/16/2019 Carte Lucrari BM 24.11.09 (1).pdf
37/142
Mod de lucru
1. Peste sedimentul de limfocite proasp#t sau înghe"at se adaug# 1 ml PBS !i se
vortexeaz# pân# se aduc toate celulele în suspensie.
2. Se adaug# 10 ml tampon de liz# !i 100 'l proteinaz# K. Se amestec# u!or.3. Amestecul este incubat o or # la 65°C sau peste noapte la 37°C. Pentru un
randament mai bun al extrac"iei !i pentru o mai bun# calitate a ADN extras este de
preferat incubarea peste noapte a amestecului.
4. Se adaug# 10 µl solu"ie ribonucleaz#, se amestec# prin inversia tubului !i se
incubeaz# o or # la 370C.
5. Se adaug# 4,3 ml solu"ie salin# saturat# !i se amestec# puternic 30 de secunde.
6. Centrifugare 10 minute, la 5000 rpm !i 4°C. Supernatantul se transfer # într-untub nou de 50 ml.
7. Peste supernatant se adaug# încet, pe pere"i !i prin rotirea constant# a tubului, 30
ml de etanol absolut. Se amestec# u!or, prin inversia tubului pân# când ADN precipit#.
8. Se centrifugheaz# 3 minute la 10000 rpm. Supernatantul se înl#tur # prin
înclinarea tubului, iar sedimentul este sp#lat cu etanol 70%, 30-40 minute, cu agitare
u!oar #.
9. Centrifugare 3 minute la 10000 rpm. Supernatantul este înl#turat prin înclinareatubului. Sedimentul este uscat la 370C timp de 15-20 de minute.
10. ADN se resuspend# în 2 ml tampon TE. Se las# cel pu"in 24 de ore pentru
dizolvare complet# la 4˚C. Se stocheaz# la 40C pe termen scurt !i la -200C pe termen lung.
II.6. Izolarea ADN din material seminal
Principiul metodei
Izolarea ADN genomic din material seminal se realizeaz# printr-un proces de
extrac"ie salin#. În prima etap# are loc liza celulelor seminale într-un tampon de liz#,
urmat# de precipitarea proteinelor cu o solu"ie de NaCl 6M. ADN genomic cu mas#
-
8/16/2019 Carte Lucrari BM 24.11.09 (1).pdf
38/142
molecular # mare r #mâne în solu"ie fiind apoi concentrat !i desalifiat prin precipitare cu
izopropanol.
Material biologic: paiete cu material seminal proaspete sau crioconservate. Reactivi $i aparatur&: i) solu"ie de precipitare a proteinelor: NaCl 6 M; ii) tampon
de liz#: 10 mM EDTA (pH 8), 1% Sodium dodecil sulfat (SDS) !i 100 Mm NaCl; iii)
solu"ie ditiotreitol (DTT) 500 Mm; iv) solu"ie proteinaz# K 20 mg/ml; v) ser fiziologic:
NaCl 0,9%; vi) izopropanol 100%; vii) etanol 70%; viii) ap# ultrapur #; ix) agitator; x)
microcentrifug#; xi) termobloc.
Mod de lucruZiua I
1. Con"inutul unei paiete de material seminal (aproximativ 25 µl) este introdus într-
un tub de microcentrifug# steril de 1,5 ml, peste care se ad#ug# 0,5 ml ser fiziologic.
2. Se omogenizeaz# probele dup# care se centrifugheaz# 3 minute la 6500 rpm.
3. Supernatantul este îndep#rtat iar sedimentul de celule seminale este resuspendat
din nou cu 1 ml de ser fiziologic.
4. Se centrifugheaz# probele 3 minute la 6500 rpm !i se îndep#rteaz# supernatantul.
5. Peste sedimentul de celule seminale se ad#ug# 450 µl tampon de liz# dup# care
acesta este resuspendat în supernatant prin aspirare u!oar # cu ajutorul unei micropipete.
6. Se adaug# 50 µl DTT, se omogenizeaz# !i apoi se adaug# 10 µl proteinaz# K.
7. Probele se omogenizeaz# printr-o inversie u!oar # dup# care se incubeaz# 12-14
ore la 600C.
Ziua II
1. Se adaug# 160 µl NaCl !i se amestec# viguros timp de 1-2 minute prin
vortexare. La sfâr !it vor ap#rea vizibile agregatele de resturi proteice.
-
8/16/2019 Carte Lucrari BM 24.11.09 (1).pdf
39/142
2. Centrifugare 10 minute la 13000 rpm. Supernatantul se transfer # în alt tub de
microcentrifug# con"inând 500 µl izopropanol 100% la temperatura camerei !i se agit#
u!or prin inversarea tubului pân# la precipitarea ADN din solu"ie.
3. Centrifugare 1 minut la 13000 rpm. Se îndep#rteaz# supernatantul prin inversiatubului !i se adaug# 500 µl etanol 70% la temperatura camerei. Se inverseaz# u!or tubul
timp de câteva minute pentru a sp#la sedimentul de ADN !i se centrifugeaz# 1 minut la
13000 rpm.
4. Etanolul se înl#tur # complet prin inversia tubului pe o hârtie de filtru. Se usuc#
precipitatul, 15 - 20 minute, la 37oC.
5. Precipitatul de ADN se rehidrateaz# într-un volum adecvat de ap# ultrapur #.
ADN astfel ob"inut se p#streaz# la 40
C pe termen scurt sau la –200
C pe termen mai lung.
II.7. Izolarea ADN din %esuturi împarafinate
Principiul metodei
$esuturile împarafinate sunt folosite la ora actual# în multe metode de diagnostic !i
de analiz# a bolilor. Ca atare apare necesitatea dezvolt#rii unor tehnici de extrac"ie a ADN
din aceste tipuri de probe. Principalul impediment care apare în acest caz este eliminarea
total# a urmelor de parafin# de la nivelul sec"iunilor, aceasta putând bloca procedeele de
extrac"ie a ADN. În cazul tehnicii prezentate mai jos se va realiza o deparafinare cu xilen
a probelor, urmat# de o extrac"ie a ADN prin metoda clasic# care utilizeaz#
fenol/cloroform. Precipitarea materialului genetic se face utilizând izopropanol.
Material biologic: sec"iuni împarafinate.
Reactivi $i aparatur&: i) tampon de liz#: proteinaz# K 20 mg/ml, 50 µl, solu"ie
Tris-HCl 1 M, 10 µl, EDTA 0,5 M 2 µl, SDS 10%, 100 µl, ap# distilat# 838 ml; ii)
amestec fenol/ cloroform/ izopropanol 25:24:1; iii) acetat de sodiu 3 M; iv) ap# ultrapur #;
v) xilen; vi) etanol absolut !i etanol 75%; vii) izopropanol; viii) agitator; ix)
microcentrifug#; x) termobloc.
-
8/16/2019 Carte Lucrari BM 24.11.09 (1).pdf
40/142
Mod de lucru
1. La început se realizeaz# deparafinarea "esuturilor. Pentru aceasta, într-un tub de
2 ml con"inând câteva sec"iuni împarafinate, se adaug# 1 ml de xilen !i se las# 30 minute
la 37°C.2. Se înl#tura xilenul !i se adaug# din nou 1 ml peste "esuturile împarafinate. Se
incubeaz# 30 minute la 37°C. Etapa poate fi repetat# înc# de o dat# pentru asigurarea unei
bune deparafin#ri.
3. Se înl#tura xilenul !i se fac alte dou# sp#lari de câte 30 de minute folosind etanol
absolut. Etanolul absolut este îndep#rtat !i se fac alte dou# sp#lari de câte 30 de minute
folosind etanol 75%.
4. Etanolul 75% este înl#turat !i se fac alte dou# sp#lari de câte 15 minute folosindtampon fosfat salin.
5. Se adaug# 500 µl de tampon de liz# !i se incubeaz# la 52°C peste noapte. Liza
trebuie s# se desf #!oare pân# când sec"iunile deparafinate sunt total dizolvate în tampon.
6. Se adaug# 500 µl amestec cloroform/alcool izoamilic/izopropanol. Se agit#
puternic !i se centrifugheaz# 10 minute la 12000 g.
7. Supernatantul este transferat într-un tub nou de centrifug#. Peste acesta se
adaug# un volum egal de cloroform. Se agit# puternic !i se centrifugheaz# 5 minute la12000 g.
8. Faza apoas# superioar # este transferat# cu aten"ie în alt tub de centrifug#. Peste
acesta se adaug# 1/10 volume de acetat de sodiu 3 M. Se agit# puternic.
9. Se adaug# 1 volum de izopropanol, se agit# !i se incubeaz# la –20°C peste
noapte.
10. Centrifugare 4 minute, la 4°C !i 12000 g. Supernatantul se arunc#, iar
precipitatul este sp#lat cu 1 ml de etanol 75% prin agitare u!oar #.
11. Centrifugare 4 minute la 12000 g. Etanolul este îndep#rtat prin înclinarea
tubului !i sedimentul ADN este uscat prin centrifugare la vid 3 minute sau prin plasare la
37°C timp de 15 minute.
-
8/16/2019 Carte Lucrari BM 24.11.09 (1).pdf
41/142
12. ADN se resuspend# în ap# ultrapur # iar apoi se las# cel pu"in 24 de ore pentru
solubilizarea complet# la 4˚C. Se stocheaz# la 40C, pe termen scurt, sau la -200C, pe
termen lung.
II.8. Izolarea ADN din plasm& sau ser
Principiul metodei
La indivizii normali, cantit#"ile de ADN din astfel de probe sunt foarte sc#zute dar
suficiente pentru a servi drept matri"e la o reac"ie de amplificare în lan" (PCR –
Polimerase Chain R eaction). De asemenea, o cantitate sporit# de ADN în ser sau plasm#
este întâlnit# în cazul unor afec"iuni precum cancerul, bolile autoimune sau infec"ioase.Protocolul urm#tor reprezint# o metod# simpl# !i eficient# de izolarea ADN din astfel de
probe.
Material biologic: plasm# sau ser.
Reactivi $i aparatur&: i) tampon de liz# 10X: SDS 10%, proteinaz# K 0,5%. Se
prepar # sub form# concentrat# !i se dilueaz# înainte de folosire; ii) tampon Tris-EDTA
(TE): 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8; iii) amestec fenol/cloroform 1:1; iv) glicogen
10 mg/l; v) acetat de amoniu 7,5 M; vi) etanol absolut !i etanol 70%; vii) agitator; viii)
microcentrifug#; ix) termobloc.
Mod de lucru
1. Într-un tub de centrifug# de 15 ml se adaug# 1,5 ml ser sau plasm#, 1,5 ml
tampon de liz# 1X !i se agit# energic. Se las# la incubat peste noapte la 55°C.
2. Peste amestecul incubat se adaug# 3 ml de amestec fenol/cloroform. Se agit#
puternic timp de 30 de secunde !i se centrifugheaz# 10 minute la 1000 g folosind rotor
„swing-out”.
3. Faza superioar # apoas# se transfer # într-un tub centrifug# !i se repet# etapa 2.
-
8/16/2019 Carte Lucrari BM 24.11.09 (1).pdf
42/142
4. Faza superioar # apoas# este transferat# într-un tub nou !i peste aceasta se adaug#
5 µl glicogen, 1 ml solu"ie acetat de amoniu !i 8 ml de etanol absolut. Se amestec# prin
inversarea tubului de mai multe ori !i se centrifugheaz# 40 de minute la 2500 g.
5. Supernatantul este îndep#rtat prin înclinarea tubului iar sedimentul este sp#lat în10 ml de etanol 70% prin agitare u!oar #.
6. Se centrifugheaz# 10 minute la 2500 g. Se îndep#rteaz# etanolul prin înclinarea
tubului. Sedimentul se usuc# în curent de aer sau prin incubare 15 minute la 37°C.
9. Sedimentul uscat este reluat într-un volum adecvat de tampon TE sau de ap#
ultrapur #.
II.9. Izolarea ADN de la nivelul celulelor somatice din lapte
Principiul metodei
Laptele poate reprezenta un material biologic bun pentru izolarea de material
genetic. Astfel, în lapte se g#sesc mai multe tipuri de celule somatice reprezentate în
principal de celule epiteliale, limfocite, macrofage !i polimorfonucleare. Aceste celule pot
servi drept surs# pentru extrac"ia ADN.
Protocolul dezvoltat de d’Angelo et al. (2007) necesit# în prealabil realizarea unei
degres#ri a laptelui prin centrifugare. Ulterior are loc o liz# a celulelor somatice, o
deproteinizare, iar precipitarea ADN se realizeaz# utilizând izopropanolul. Metoda poate
fi folosit# cu succes în locul extrac"iei ADN din sânge deoarece laptele poate fi procurat
mult mai u!or, prin metode neinvazive.
Material biologic: probe de lapte.
Reactivi: i) tampon fosfat salin (PBS) 10X: 1,37 M NaCl, 27 Mm KCl, 43 Mm
Na2HPO4 x 7 H2O, 14 Mm KH2PO4. Se prepar # sub forma unei solu"ii 10X !i se dilueaz#
înainte de folosire. Solu"ia diluat# are un pH de aproximativ 7,3. Se stocheaz# la
temperatura camerei pe termen nelimitat; ii) tampon de liz#: 0,32 M sucroz#; 10 mM Tris-
HCl pH 7,5; 5 mM MgCl2; 1% Triton X-100; iii) SDS 10%; iv) proteinaz# K 10 mg/ml;
-
8/16/2019 Carte Lucrari BM 24.11.09 (1).pdf
43/142
v) tampon de extrac"ie: 10 mM Tris-HCl, pH 8 !i 2 mM EDTA; vi) tampon Tris-EDTA
(TE): Tris 10 mM, 1 mM EDTA, pH 7,5; vii) NaCl 5 M; viii) izopropanol; ix) ap#
ultrapur #; x) microcentrifug#; xi) agitator; xii) termobloc.
Mod de lucru1. O cantitate de 40 ml de lapte este centrifugat# timp de 30 de minute la 2000 g !i
4°C. Ulterior, stratul superior de gr #sime !i supernatantul sunt îndep#rtate.
2. Sedimentul este resuspendat în 1 ml tampon fosfat salin !i apoi centrifugat 10
minute la 400 g !i 4°C.
3. Sedimentul este resuspendat în 49 ml de tampon de liz#, este agitat puternic !i
apoi este centrifugat la 2500 g, timp de 10 minute, la 4°C.
4. Supernatantul este îndep#rtat prin înclinarea tubului iar sedimentul esteresuspendat în solu"ie de sp#lare. Se agit# u!or !i se centrifugheaz# la 2500 g, timp de 10
minute, la 4°C. Etapa de sp#lare poate fi repetat#.
5. Sedimentul sp#lat este resuspendat în 3 ml tampon de extrac"ie la care se adaug#
100 µl de SDS 10% !i 40 µl de proteinaz# K. Amestecul este incubat o or # la 65°C.
6. Se adaug# 500 µl solu"ie clorur # de sodiu !i se agit# energic timp de 20-30 de
secunde. Se centrifugheaz# 10 minute la 3500 g.
7. Supernatantul este transferat într-un tub nou de centrifug# !i peste acesta seadaug# 6 ml de izopropanol rece. Se agit# tubul prin înclinare pentru a precipita ADN.
8. Centrifugare la 3500 g, 10 minute. Supernatantul este îndep#rtat, iar sedimentul
ADN este resuspendat într-un volum adecvat de tampon TE sau ap# ultrapur #.
I.10. Izolarea ARN total cu guanidin-tiocianat (metoda Chomczynski)
Principiul metodei
Celulele în cultur # sau fragmentele de "esut sunt bine omogenizate într-o solu"ie
denaturant# care con"ine guanidin-tiocianat. Acesta este unul dintre cei mai eficien"i
agen"i denaturan"i ai proteinelor. Omogenatul este ulterior amestecat în mai multe etape
cu solu"ii de acetat de sodiu, fenol !i cloroform/ alcool izoamilic. În urma centrifug#rii, în
-
8/16/2019 Carte Lucrari BM 24.11.09 (1).pdf
44/142
faza superioar # apoas# separat#, se va reg#si ARN total, iar în faza inferioar #, organic#, se
vor g#si proteinele !i ADN. ARN astfel separat va fi precipitat cu izopropanol !i ulterior,
sp#lat cu etanol 75%.
La baza metodei st# proprietatea ARN de a r #mâne solubilizat într-o solu"ie apoas# care con"ine guanidin-tiocianat !i amestec de fenol/ cloroform/ alcool izoamilic, in jurul
valorii de pH 4,0. În acelea!i condi"ii proteinele !i fragmentele mici de ADN (cu m#rimi
între 50 pb !i 10 Kpb) trec în faza organic#, iar fragmentele mai mari de ADN se reg#sesc
la interfa"a celor dou# faze.
Se recomand# ca extrac"ia ARN prin aceasta metod# s# se realizeze din "esuturi !i
celule proaspete. Dac# acest lucru nu este posibil apare necesitatea crioconserv#rii în azot
lichid imediat dup# prelevare. Toate solu"iile sunt preparate cu ap# tratat# cu DEPC(dietil-pirocarbonat), inhibitor specific al ribonucleazelor. De asemenea, recipientele de
lucru sunt sp#late cu acela!i tip de ap#.
Material biologic: probe din diferite tipuri de "esuturi, celule animale în cultur #.
Reactivi $i aparatur&: i) solu"ie denaturant#: Guanidin-tiocianat 4 M, Citrat de
sodiu 25 mM, 0,5% N-lauroilsarcozin#, 2-mercaptoetanol 0,1 M. Pentru prepararea
solu"iei stoc se amestec# 293 ml de ap# cu 17,6 ml solu"ie citrat de sodiu 0,75 M (pH 7) !icu 26,4 ml solu"ie N-lauroilsarcozin# 10%. Se adaug# apoi 250 g guanidin-tiocianat !i se
înc#lze!te sub agitare continu# la 650C, pentru dizolvare. Solu"ia se poate stoca timp de
maxim 3 luni la temperatura camerei. Solu"ia de lucru se prepar # prin ad#ugarea a 0,35 ml
2-mercaptoetanol la 50 ml de solu"ie stoc. Se poate stoca maxim o lun# la temperatura
camerei; ii) izopropanol 100%; iii) etanol 75% (preparat cu ap# tratat# cu DEPC); iii)
solu"ie acetat de sodiu 2 M (pH 4). Se adaug# 16,42 g acetat de sodiu anhidru în 40 ml
ap# !i apoi se mai adaug# 35 ml acid acetic glacial. Se aduce la pH 4 cu acid acetic
glacial, iar apoi se completeaza la 100 ml cu ap#; iv) solu"ie de fenol saturat# în ap#: se
dizolv# 100 g fenol în 100 ml ap# la 650C. La final se înl#tur # faza apoas# superioar #. Se
poate stoca la 40C !i întuneric timp de o lun#; v) amestec cloroform/ alcool izoamilic 49:1
(v/v); vi) ap# tratat# cu DEPC: se adaug# 0,2 ml DEPC la 100 ml ap#. Se amestec#
-
8/16/2019 Carte Lucrari BM 24.11.09 (1).pdf
45/142
puternic câteva minute, iar solutia ob"inuta se autoclaveaz# pentru a inactiva eventualele
urme de DEPC; vii) minicentrifug#; viii) agitator; ix) termobloc.
ATEN ! IE: Fenolul este toxic #i cauzeaz! arsuri sau irita " ii în zonele de contact.
Mod de lucru
1a. Pentru " esuturi: se adaug# 500 µl de solu"ie de denaturare la 50 mg de "esut !i
se omogenizeaz# energic.
1b. Pentru culturi de celule: se centrifugheaz# suspensia celular # !i se înl#tur #
supernatantul. Se adaug# 500 µl de solu"ie de denaturare la 104 celule !i se agit#
aproximativ 10 minute cu pipeta automat# prin aspersie-dispersie.
2. Omogenatul se transfer # într-un tub steril de 2 ml. Se adaug# 50 µl de solu"ie deacetat de sodiu si 500 µl fenol !i se vortexeaz# puternic timp de 20-30 de secunde.
3. Se adaug# 100 µl de amestec cloroform/ alcool izoamilic !i se vortexeaz#
puternic timp de 20-30 de secunde. Tuburile se incubeaz# 15 minute pe ghea"#.
5. Centrifugare 20 minute la 10000 g !i 40C. Faza apoas# superioar # se transfer #
într-un tub nou.
6. Se realizeaz# precipitarea ARN ad#ugând un volum egal de izopropanol 100%.
Tuburile se incubeaz# 30 de minute la -200C.7. Centrifugare 10 minute la 10000 g !i 40C. Supernatantul este înl#turat.
Sedimentul este resuspendat !i dizolvat în 200 µl de solu"ie de denaturare !i este transferat
într-un tub nou.
8. Se realizeaz# precipitarea ARN ad#ugând 300 µl izopropanol 100%. Tuburile se
incubeaz# 30 de minute la -200C.
10. Centrifugare 10 minute la 10000 g !i 40C. Supernatantul este înl#turat.
Sedimentul ARN este resuspendat în 900 µl etanol 75%, vortexat !i incubat 10 - 15
minute la temperatura camerei.
11. Centrifugare 5 minute la 10000 g !i 40C. Supernatantul este înl#turat.
Sedimentul ARN este uscat la 370C, 10 – 15 minute. Acesta nu trebuie uscat total
deoarece aceasta va duce la sc#derea solubilit#"ii ARN.
-
8/16/2019 Carte Lucrari BM 24.11.09 (1).pdf
46/142
12. Sedimentul ARN este solubilizat în 100-200 µl ap# tratat# cu DEPC. Se
incubeaz# 10-15 minute la 550C. ARN astfel ob"inut este p#strat la -800C.
I.11. Izolarea ARN din sânge
Principiul metodei
Tehnica se bazeaz# pe extrac"ia ARN dup# metoda adaptat# de Chomczynski !i
Sacchi în 1987. La baza metodei st# proprietatea ARN de a r #mâne solubilizat într-o
solu"ie apoas# care con"ine guanidin-tiocianat !i amestec de fenol/ cloroform/ alcool
izoamilic, la pH acid. În acelea!i condi"ii proteinele !i fragmentele mici de ADN trec în
faza organic#, iar fragmentele mai mari de ADN se reg#sesc la interfa"a celor dou# faze.În cadrul metodei este recomandat# folosirea sângelui proasp#t, recoltat pe
anticoagulant. De asemenea, este necesar # tratarea tuturor solu"iilor de lucru !i a
recipientelor cu ap# care con"ine DEPC (dietil-pirocarbonat).
Material biologic: probe proaspete de sânge recoltate pe anticoagulant.
Reactivi $i aparatur&: i) tampon de liz# al eritrocitelor: sucroz# 1,6 M, Triton X-
100 5%, MgCl2 25 mM, Tris-HCl 60 mM (pH 7,5). Se p#streaz# la 4°C !i se utilizeaz#
rece; ii) tampon de extrac"ie: guanidin tiocianat 5,25 M, Tris-HCl 50 mM (pH 6,4), EDTA
20 mM, Triton X-100 1%, 2-mercaptoetanol 0,1% (se adaug# extemporaneum); iii) acetat
de sodiu 2 M (pH 4); iv) fenol (saturat cu solu"ie Tris-HCl 1 M, EDTA 0,1 M), pH 8; v)
amestec cloroform/ alcool izoamilic 24:1; vi) izopropanol; vii) etanol 70%; viii) ap#
ultrapur #; vii) microcentrifug#; viii) agitator; ix) termobloc.
Mod de lucru
1. Într-un tub de microcentrifug# se amestec# 100 µl de sânge cu 1 ml de tampon
de liz# al eritrocitelor. Se las# la temperatura camerei timp de 5-10 minute, cu agitare
ocazional#, pân# când eritrocitele sunt lizate în totalitate.
-
8/16/2019 Carte Lucrari BM 24.11.09 (1).pdf
47/142
2. Centrifugare 45 de secunde la 13000 rpm. Se înl#tur # supernatantul prin
înclinarea tubului. Sedimentul de celule este reluat prin agitare în lichidul rezidual r #mas
în tub.
3. Se adaug# 200 µl tampon de extrac"ie peste celulele resuspendate !i se amestec# cu vârful pipetei. Peste celulele resuspendate se adaug# 20 µl acetat de sodiu 2 M !i se
agit# u!or.
4. Se adaug# 220 µl fenol !i se agit# u!or prin inversie. Peste amestec se adaug# 60
µl de amestec cloroform/ alcool izoamilic !i se agit# puternic timp de 20