UNIVERSIDAD NACIONAL INTERCULTURAL DE LA AMAZONIAFACULTAD DE INGENIERA Y CIENCIAS AMBIENTALESCARRERA PROFESIONAL DE INGENIERA AGROINDUSTRIAL

INFORME: 03 CURSO : BIOTECNOLOGA AGROINDUSTRIAL. TEMA : CULTIVO EN VITRO DE MACROHONGOS EN MEDIO DE CULTIVO PDA.

DOCENTE : ING. MANUEL RICARDO GUERRERO OCHOA M.SC.

ALUMNO : VELAYARCE INGA CHARLISS.CICLO : VIGRUPO : AFECHA : 20 07 2015YARINACOCHA - PER2015

I. INTRODUCCIN

En pocas recientes, se ha presentado en nuestro pas un marcado inters por la produccin comercial de hongos comestibles, en particular de Pleurotus spp., favorecido por las diversas ventajas que presenta, en especial por la posibilidad de producir alimentos de alto valor nutrimental empleando residuos agrcolas como sustrato.De las aproximadamente 70 especies de Pleurotus que han sido registradas a nivel mundial, Pleurotus ostreatus es la especie ms importante, de la cual muchas cepas comerciales son desarrolladas y cultivadas.Actualmente esta especie de Pleurotus ha comenzado a ser popular en mercados tradicionales o supermercados de estos pases.En nuestro pas, dos especies de Pleurotus son producidas mayoritariamente por los cultivadores, P. ostreatus y P. pulmonarius. stas, tienen una relativa vida corta de anaquel (1 semana) y por su consistencia, el periodo para P. eryngii pdra ser mayor. La introduccin y desarrollo del cultivo de especies con una vida anaquel larga puede permitir el incremento del inters por su produccin y consumo. En el presente estudio se evaluaron in vitro dos cepas del hongo comestible P. eryngii y auricularia en diferentes medios de cultivo, para determinar su adaptacin a distintos suplementos. As mismo, se realizaron pruebas de fructificacin para observar las caractersticas morfolgicas de los mismos y evaluar su productividad. El objetivo de esta prctica con estas especies, es buscar y encontrar las mejores condiciones para incrementar el rendimiento y calidad de estos hongos para su produccin.

II. OBJETIVO

Conocer y aplicar la tcnica del cultivo in vitro utilizando tejidos de macrohongos. Preparar medio de cultivo PDA (Agar papa dextrosa). Conocer los cuidados que se deben tener para llevar a cabo el cultivo in vitro Manipular correctamente los materiales del laboratorio. Encontrar las mejores condiciones para incrementar el rendimiento y calidad de estos hongos (encontrar los sustratos idneos).

III. MARCO TERICO

1. Hongos. Los hongos son definidos como macrofungos con un cuerpo fructfero distintivo que puede ser tanto epigeo como hipgeo. Constituyen un grupo diverso de organismos unicelulares o pluricelulares que se alimentan mediante la absorcin directa de nutrientes. Los alimentos se disuelven mediante enzimas que secretan los hongos; despus se absorben a travs de la fina pared de la clula y se distribuyen por difusin simple en el protoplasma. Los hongos, junto con las bacterias hetertrofas y un reducido grupo de otros organismos, constituyen los descomponedores de la bisfera, y su actividad es esencial para el continuo funcionamiento de la naturaleza. (LPEZ R, A. 1995).

Los hongos, equipados con un poderoso arsenal de enzimas que degradan los compuestos orgnicos, muchas veces constituyen organismos dainos para el hombre. Atacan madera, ropa, pintura, plumas, pelos, y de hecho casi cualquier sustancia. Pueden crecer sobre pan, vegetales, carne y otros productos. Algunos producen toxinas altamente venenosas. (SOTO VELAZCO, C. 2004).

Los hongos son clasificados en el reino Fungi. La parte del hongo que se ve es solamente el fruto del organismo. La parte viviente del hongo es un micelio constituido por un tejido de filamentos delgados llamados hifas. El micelio est oculto debajo del suelo, en madera, o en otras fuentes de alimento. Estos tejidos crecen hasta que aparecen los cuerpos fructferos. Si el micelio produjera frutos microscpicos, la gente quizs nunca se fijara en el hongo. Los hongos se alimentan absorbiendo nutrimentos del material orgnico en que viven, por lo que stos secretan cidos y enzimas que simplifican el material orgnico en partculas ms fciles de digerir y luego atraviesan la pared celular de la hifa. Algunos descomponen material orgnico como hojas muertas (saprofitos), otros se alimentan de clulas vivas causando enfermedades (parsitos). Los hongos infectan a plantas, animales y hasta a otros hongos (GAITN-H. 2005).

Los hongos micorrcicos viven como compaero con las plantas formando una asociacin simbitica llamada micorriza, estableciendo con ellas una relacin de dependencia o colaboracin nutricional. En dicha asociacin, el micelio envuelve y a veces penetra las clulas de los pices radicales de la planta. Ellos le proveen nutrientes minerales a las plantas a cambio de otros alimentos que el hongo no puede producir, los carbohidratos por ejemplo (BRAN M, ET AL, 2002)

Estn ampliamente distribuidos en todo el planeta y prosperan en casi todos los climas: tropicales, subtropicales, templados, fros, es decir en todos aquellos mbitos de temperaturas comprendidas entre 4 a 60 grados centgrados, donde concurran los elementos indispensables para su existencia: material orgnico y agua (PINEDA, 1998).

1.1 Hongos(Pleurotusspp).Se reconoce por la forma del sombrero a manera de abanico o de esptula, por su crecimiento en grandes matas sobre madera y por las caractersticas laminillas decurrentes, as como tambin por la situacin del pie, excntrico o incluso lateral, comn a casi todas las especies de Pleurotus.

Se presenta con un sombrero que, en realidad, es muy variable tanto en la forma como en el color.

El sombrerillo de esta seta es redondeado, con la superficie lisa, abombada y convexa cuando es joven, aplanndose luego poco a poco.

Su dimetro oscila entre 5 y 15 cm, dependiendo de la edad del hongo.

El color es variable, desde gris claro o gris pizarra hasta pardo, tomando una coloracin ms amarillenta con el tiempo.

En la parte inferior del sombrero hay unas laminillas dispuestas radialmente como las varillas de un paraguas, que van desde el pie o tallo que lo sostiene, hasta el borde.

Son anchas, espaciadas unas de otras, blancas o crema, a veces bifurcadas, y en ellas se producen las esporas destinadas a la reproduccin de la especie.

El pie suele ser corto, algo lateral u oblicuo, ligeramente duro, blanco, con el principio de las laminillas en la parte de arriba y algo peloso en la base.

Pueden crecer de forma aislada sobre una superficie horizontal o en grupo formando repisas laterales superpuestas sobre un costado de los rboles.Hongos Pleurotus spp.

La carne de la seta es blanca, de olor algo fuerte, tierno al principio y despus correosa (SNCHEZ, J; ET AL. 2007).

1.2 Hongos Auricularia Auricula

Auricularia auricula-judae, comnmente conocido como oreja de Judas, es un hongo basidiomiceto comestible, del orden Auriculariales. El epteto especfico auricula-judae, en latn, significa "oreja de Judas".

Nace en forma de concha de color pardo oscuro, con la cara externa un poco ms plida que la interna y, a medida que va creciendo, toma la forma de una oreja con el margen arrugado. El esporocarpo, o cuerpo fructfero, es de consistencia gelatinosa, se deshidrata en ambiente seco y recobra la elasticidad con la humedad.

Por la parte de encima es ms plido que por la de abajo, que est recorrida por una especie de pliegues muy irregulares.

Crece habitualmente en grupos, sobre ramas muertas de alcornoques, pltanos, sacos y otros rboles de hoja plana.Hongos Auricularia Auricula spp

El cuerpo fructfero suele aparecer en otoo en lugares hmedos, despus de las lluvias, pero ocasionalmente se le puede encontrar en primavera (SCHIESS, M. 2006).

2. Medios De Cultivo.

El medio de cultivo es una sustancia o solucin que permite el desarrollo de microorganismos, mientras que el cultivo es el producto del crecimiento de un organismo. Los medios utilizados en micologa deben contener los nutrientes suficientes para asegurar el desarrollo y reproduccin de los hongos (carbono, nitrgeno, vitaminas, oligoelementos, etc.) y un pH ligeramente cido (6 6.3) para facilitar su crecimiento e inhibir al mismo tiempo el desarrollo de otros microorganismos. Se puede aadir antibiticos antibacterianos para inhibir el crecimiento de bacterias saprofitas que suelen contaminar las muestras (CAEDO V., AMES T. 2004)

Los medios pueden ser slidos o lquidos. Para conseguir un medio slido se debe agregar una sustancia solidificante como el agar (gelatina vegetal) o el agar agar (polisacridos provenientes de algas), el cual no tiene valor nutritivo sino que sirve simplemente para mantener la humedad por un tiempo ms o menos prolongado. La humedad es fundamental para el desarrollo de los hongos, porque cuando sta comienza a disminuir, la formacin de micelio tambin disminuye y el hongo tiene que asegurar su perpetuidad formando estructuras propagativas (esporas, conidias) y de conservacin (clamidosporas). El agar empieza a derretirse a partir de 80 C. Y soporta temperaturas altas sin descomponerse, solidificndose entre los35 y 50 C.Los medios de cultivo se vierten en placas Petri o en tubos inclinados. Los primeros ofrecen la ventaja de tener mayor superficie para el desarrollo del hongo y se utilizan para trabajos rutinarios de aislamientos, aspecto del cultivo, velocidad de crecimiento, etc. sin embargo, son ms fciles de contaminarse. Los tubos, a pesar de tener una superficie mucho ms reducida, ofrecen seguridad en su manipulacin y buena resistencia a la deshidratacin y a la contaminacin. Se utilizan para conservar cultivos por tiempo ms o menos prolongado. Los medios se seleccionan en base al tipo de muestra que queremos reproducir.El pH recomendado para el cultivo de hongos en el laboratorio es de alrededor de 7, un pH neutro o ligeramente cido (6.8).Para seguridad del que opera y evitar contaminaciones, los medios de cultivo se deben manipular en campanas de flujo laminar.A continuacin se describen los medios de cultivo mayormente utilizados y su composicin.

2.1 Papa Dextrosa Agar (PDA).

Es un medio muy usado que sirve para aislar todo tipo de hongos. Beauveria, Paecilomyces, Lecanicillium (Verticillium) y Metarhizium, los ms importantes hongos parsitos de insectos, al igual que los parsitos de plantas y los hongos saprofitos crecen muy bien y esporulan en este medio.Cuando se aslan hongos a partir de insectos colectados del suelo, es recomendable acidificar el medio con cido lctico al 25%. Se agregan 3 4 gotas sobre el agar solidificado de la placa con el objeto de evitar el desarrollo de bacterias.Con los mismos ingredientes, excluyendo el agar, se obtiene el medio lquido de Papa Dextrosa (PD), muy utilizado para la preparacin del inculo en forma masiva.

Papa sin pelar 200 g Dextrosa 10 g Agar 18 g Agua destilada 1 litro

Lavar las papas, cortarlas y hacerlas hervir en un litro de agua destilada por 20 minutos, colar y disolver en el lquido la dextrosa y el agar. Esterilizar en autoclave durante 15 minutos a 15 libras de presin. (CAEDO V., AMES T. 2004).

3. Asepsia.

Mantener el mayor cuidado en la limpieza del material y del laboratorio mismo es fundamental para realizar trabajos confiables. El medio ambiente se encuentra, por lo general, cargado de microorganismos diversos que pueden contaminar el mbito de trabajo, por ello es conveniente no descuidar la limpieza de los materiales, instrumentos y equipo necesario para el trabajo. Los materiales de vidrio y cualquier otro elemento deben estar profundamente limpios antes de comenzar el trabajo (BOTELHO Y RAMOS, 1985).

3.1 Lavado.

Durante los trabajos con microorganismos, especficamente hongos, necesario y fundamental trabajar con mucha asepsia, debido a que es indispensable el mantenimiento de los cultivos puros. Por lo tanto, es conveniente que luego de lavar todo el material de vidrio, ste sea enjuagado dos veces con agua destilada, para eliminar todo residuo de detergente antes de ser esterilizado (CAEDO V., AMES T. 2004) 3.2 EsterilizacinLa esterilizacin de los materiales de vidrio y medios de cultivo nos asegura un estado de asepsia que permite trabajar sin dificultades cuando se ejecuta en forma eficiente. La forma ms comn de esterilizacin es por medio del calor seco o hmedo.La esterilizacin por calor seco se consigue con el uso de un horno o estufa y es til en el caso de esterilizar placas petri y otros materiales de vidrio. La temperatura a la que se somete el material durante 90 a 120 minutos debe fluctuar entre 160 y 180 oC. Es eficaz, siempre y cuando se deje espacio libre para que el aire caliente circule alrededor de los materiales. La esterilizacin por calor hmedo o a presin de vapor de agua se consigue con el uso de una autoclave. Se encuentran de varios modelos y tamaos, pero todas tienen el mismo principio de funcionamiento. A mayor presin, mayor es la temperatura de ebullicin del agua; cuando la presin aumenta a 15 libras (dos atmsferas), la temperatura llega a 121.6 C. No existe microorganismo que tolere esta temperatura durante 15 minutos. El tiempo es el factor que permite que el calor penetre en la masa de esterilizacin y se absorba. Cuando se esterilizan medios de cultivo en frascos de vidrio, se debe asegurar que stos ocupen no ms de las tres cuartas partes del frasco para permitir una ligera ebullicin sin derramarse, por lo mismo, las tapas deben colocarse ligeramente sueltas. Los frascos Erlenmeyer se deben taponar con algodn para permitir la circulacin del vapor. Los tubos de ensayo conteniendo medio, se deben colocar en una gradilla o rejilla.

El uso de los rayos de luz ultravioleta (U.V.) es eficaz para eliminar organismos que se encuentran sobre superficies, ya que este tipo de luz tiene poca penetracin (CAEDO V., AMES T. 2004).

3.3 Desinfeccin Del Ambiente (Laboratorio Y Almacenamiento)

Como ya se ha dicho, cuando se trabaja con hongos entomopatgenos es necesario tener los ambientes de trabajo as como los utensilios, materiales de vidrio, etc. en completo estado de asepsia. Existe un conjunto de procedimientos para eliminar o reducir la contaminacin por microorganismos ya sean hongos entomopatgenos, fitopatgenos, patgenos del hombre, saprofitos, etc. que puedan interferir con el trabajo que se desea realizar. stos pueden estar flotando en el aire, depositados sobre las superficies de trabajo y del ambiente como paredes, techos, estantes, entre otros.

El alcohol es muy utilizado en trabajos de laboratorio para desinfectar la superficie de la cmara de flujo laminar as como las superficies de trabajo.Los alcoholes actan desnaturalizando las protenas, disolviendo las capas lipdicas y como agentes deshidratantes.Para reducir la contaminacin en el ambiente de trabajo, se pueden realizar aplicaciones de sustancias antispticas (ECHEANDI. E, 1967)

IV. MATERIALES

4. MATERIALES

4.1 Materiales para el cultivo in vitro de macrohongos. Hongos macroscpicos de la regin (pleurotus y auricularias) en buen estado. Agua destilada. Hipoclorito de sodio. Alcohol Mandil, guantes y mascarilla.

4.2 Materiales para el medio de cultivo PDA. 100 gr de papa blanca. 500 ml de agua destilada. 10 gr de glucosa. 10 gr de Agar. Gasa Tetraciclina.

4.3 Sustratos utilizados. 400 gr de trigo. 500 gr de cascarilla de arroz. Agua destilada. Bolsas.

V. PROCEDIMIENTO.

5.1 Ubicacin Del Experimento Y Recoleccin Del Hongo. El estudio se realiz en el Laboratorio de aguas de la Universidad nacional Intercultural de la Amazonia (UNIA) Yarinacocha; Dentro de la clasificacin de Holdridge est ubicado como formacin vegetal de bosques muy hmedo tropical. La muestra del hongo se recolecto de los bosques adyacentes de la UNIA, observando con sumo cuidado sus caractersticas: sabor, olor, forma, tamao, sustrato donde desarrolla, hbitat, disposicin de sus lminas, etc. Con el hongo se procedi a su identificacin tratamiento.

5.2 Preparacin del medio de Cultivo.

Poner a hervir la papa cortada en rodajas con cascara en 500 ml de agua destilada durante 30 minutos. Enfriar y filtrar en vaso de precipitado. Aforar a 500 ml con agua destilada. Pesar colocar la glucosa y el agar al matraz conteniendo el extracto. Agitar hasta diluir. En un matraz aparte diluir 500 mg de tetraciclina en 10 ml de agua destilada. Agregamos 1ml de la tetraciclina en el extracto y autoclavar en 121C * 40 minutos. Dejar enfriar.

El cultivo in vitro se realizara de la siguiente manera:Seleccin

Trozos de 0.5x 0.5Sol 50: 50 hipoclorito de sodio y agua destilada estril T=10 min.Agua destilada estril.Dentro de la campana de flujo laminar.Placas Petri y medios de cultivo.T = 25- 28CIncubado.InoculadoAislamiento por medio de cultivos.EnjuagueDesinfectado

5.3 Aislamiento Y Purificacin.

Despus del inoculado en cajas Petri de 24 a 48 horas se not en el fondo de la placa una esporada en forma de polvillo blanco. Las esporas, diluidas en hipoclorito de sodio, se inocularon con una gota de dilucin en el medio de cultivo de trigo autoclavado. En el cultivo de tejidos, se procedi a lavar el hongo cuidadosamente en agua corriente, enseguida se cort en pequeos fragmentos del pletnquima del cuerpo fructificante y stos fueron sumergidos en una solucin de hipoclorito de sodio y luego sembrados una bolsa conteniendo trigo autoclavado, siempre junto a la llama de un mechero de una cmara de cultivo de flujo laminar.

5.4 Preparacin de los sustratos.Para el cultivo de estos dos hongos se utilizaron varios sustratos diferentes (cascara de pltano, cascarilla de arroz, maderitas de bolaina y bagazo de caa.)

Los sustratos se autoclavaron con la finalidad de eliminar otros tipos de microorganismos presentes en el sustrato. Posteriormente se pas al sembro, se una bolsa de polietileno en el cual se agregaba una capa de sustrato, luego aadimos el cultivo luego otra capa de sustrato y el cultivo de la misma forma hasta formar tres capas del cultivo.

Y finalmente de cerro la bolsa colocando en la entrada un tapn de algodn; para luego ser colocados en una caja donde se controlara su desarrollo.

VI. RESULTADOS

5.1 Resultados fotogrficos

Fig. N1. Crecimiento del hongo pleurotos en la placa previamente desinfectada.

Fig.N02. Crecimiento del hongo pleurotus y auricularia en sustrato de bagazo de caa

Fig.N03. En el sustrato de cascarilla de arroz y torta de camu camu El crecimiento fue minimo,

Fig.N04. Crecimiento del hongo auricularia en la mezcla de Sustratos (bagazo, madera y cascara de platano)

Fig.N04. en la izq. Pleurotus en sustrato de bagazo, en el centro Auricularia en sustrato de trocitos de madera con residuos de bagazo, en la der. Euricularia en una mezcla de sustratos (bagazo, madera y cascara de Platano)

6 DISCUSIONESLos resultados sobre la tcnica de aislamiento y cultivo de micelio, a partir de tejidos del hongo con inculo desinfectado, se presenta en el imagen N1.Se observa mejor crecimiento micelial cuando se asla los tejidos debidamente desinfectados. BOTELHO Y RAMOS (1985), recomienda hacer aislamientos y cultivos a partir de tejidos de los hongos previamente desinfectados, por ser un mtodo ms eficiente. Asimismo, no es posible obtener cultivos puros a partir de tejidos sin antes lograr una tcnica adecuada de desinfeccin, ya que al recolectar los hongos del campo, stos vienen contaminados de otros microorganismos, especialmente de bacterias que desarrollan con mayor rapidez en el medio inhibiendo el desarrollo del hongo, esta recomendacin lo confirma CAEDO V., AMES T (2004). Donde menciona que durante los trabajos con microorganismos, especficamente hongos, necesario y fundamental trabajar con mucha asepsia, debido a que es indispensable el mantenimiento de los cultivos puros, para ello recomienda el lavado y esterilizado de los materiales a utilizar. ECHEANDI. E (1967). De igual manera menciona que los M.O pueden estar flotando en el aire, depositados sobre las superficies de trabajo y del ambiente como paredes, techos, estantes, entre otros, para ello es necesario desinfectar no solo los materiales a utilizar sino todo el ambiente a trabajar, desinfectar la superficie de la cmara de flujo laminar y para ello se deben utilizar alcoholes que actan desnaturalizando las protenas, disolviendo las capas lipdicas y como agentes deshidratantes adems se pueden realizar aplicaciones de sustancias antispticas

Existe alta diferencia entre los medios de cultivo estudiados Los medios de cultivo de bagazo de caa son ms eficientes con respecto a los dems, entretanto, stas presentaron un crecimiento micelial muy superficial. En cambio los medios de cascara de pltano, trocitos de madera, y la cascarilla de arroz, tuvieron un crecimiento micelial semejante entre s, apreciable por la colonizacin interna del medio,

Ello se debe a que el bagazo de caa contiene alto porcentaje de carbohidratos de los que puede disponer con facilidad el micelio del hongo BRAN M, ET AL, (2002). Por otro lado, los medios de cascara de pltano no han tenido capacidad de producir primordios y menos basidiocarpos por la consistencia de los medios y de su colonizacin.Referente a los medios de cultivos cascarilla de arroz y trocitos de madera, a pesar de tener un desarrollo micelial regular no brotaron primordios, debido posiblemente a que dichos sustratos no estuvieron descompuestos totalmente como refiere la literatura (GAITN-H. 2005 y. SOTO VELAZCO, C. 2004)

7 CONCLUSIONES

Con esta prctica pudimos conocer las tcnicas y mtodos para cultivar hongos comestibles, utilizando los tejidos de los hongos. Adems se aprendi a preparar los medios de cultivo, tanto los sintticos como la papa dextrosa y otros medios de cultivo naturales utilizando sustratos que no tienen valor comercial. Una parte muy importante fue conocer los cuidados que se debe tener para llevar cabo un cultivo en vitro, desde la recoleccin hasta el sembro. Con esta prctica se busc encontrar los medios de cultivo que nos proporcionen mayores productividades y rendimientos, pudimos encontrar que el bagazo de caa es el medio de cultivo que nos proporciona estos parmetros.

8 BIBLIOGRAFA

GAITN-H. 2005. Evaluacin in vitro del hongo comestible Pleurotus eryngii: Efecto de diferentes suplementos orgnicos en el crecimiento micelial y produccin de cuerpos fructferos. Revista Mexicana de Micologa, nm. 21, diciembre, 2005, pp. 77-84. Disponible: http://www.redalyc.org/pdf/883/88302113.pdf

BOTELHO, T.S. y RAMOS, B.V. 1985. Cogumelos comestiveis Sao Paulo Brasil, Ed. Icome. .

BRAN M, ET AL. 2002. Hongos comestibles de Guatemala: Diversidad, cultivo y nomenclatura verncula (Fase I). Cuadernos de Investigacin, Direccin General de Investigacin (DIGI), USAC. Guatemala.

ECHEANDI. E. 1967. Manual de Laboratorio para Fitopatologa General. Instituto Interamericano de Ciencias Agrcolas de la O.E.A. Lima Per. 51p.

CAEDO V., AMES T. 2004. Manual de Laboratorio para el Manejo de Hongos Entomopatgenos. Lima, Per; Centro Internacional de la Papa (CIP), 62 p. Disponible: cip@cgiar.org www.cipotato.org.

LPEZ R, A. 1995. Cultivo de setas: alternativa alimenticia de la economa familiar (en lnea). Veracruz, Mxico, Universidad Veracruzana, Centro de Gentica Forestal. Consultado 4 jul. 2007. Disponible: http://www.uv.mx/institutos/forest/hongos/setas.ht ml.

SOTO VELAZCO, C. 2004. Artculos tips para productores de seta: Inculo y suplementos (en lnea). Setas cultivadas, Mxico. 4 p. Consultado 24 abr. 2007. Disponible en http://setascultivadas.com/2004articulooctubre.html

SCHIESS, M. 2006. Hongos comestibles (en lnea). Universidad de Chile, Facultad de Ciencias Agronmicas. La Pintana, Santiago de Chile. Consultado 23 de abr. 2007. Disponible en http://agronomia.uchile.cl/webcursos/cmd/12003/Macarena%20Schiess /DHCExport/default.htm.

SNCHEZ, J; ET AL. 2007. El cultivo de setas Pleurotus spp en Mxico: Cultivo de Pleurotus spp y buenas prcticas de manejo para la produccin de cuerpos fructferos inocuos (en lnea). Colegio de la Frontera Sur (ECOSUR), Chiapas, Mxico, D. F. Consultado 26 junio. 2007. Disponible en http://www.ecosur.mx/ElCultivodelasSetas 1.pdf

FLORES, R. 2004. Identificacin de hongos ectomicorrcicos, con potencial de inoculo, para proyectos de reforestacin con pino (Pinus sp) Y encino (Quercus sp), en diferentes reas del pas (en lnea). Instituto Nacional de Bosques (INAB), Guatemala. Consultado 26 jul. 2007. Disponible en: http://www.inab.gob.gt/espanol/inab/proyecto s/investigacion/documentos/doc8.doc