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Autores: Sofía Simeto1

Gustavo Balmelli2

Nora Altier3

Beatriz Dini4

Zohra Bennadji5

1 Lic. Biol. Programa Nacional Producción Forestal. INIA Tacuarembó.2 Ing. Agr. (M.Sc.). Programa Nacional Producción Forestal. INIA Tacuarembó.3 Ing. Agr. (M.Sc., Ph.D.). Protección Vegetal. INIA Las Brujas.4 Auxiliar de Investigación. Protección Vegetal. INIA Las Brujas.5 Ing. Agr. (Ph.D.). Directora del Programa Nacional Producción Forestal. INIA Tacuarembó.

DESARROLLO DE PROTOCOLOSDE INOCULACIÓN ARTIFICIALPARA LA CARACTERIZACIÓNSANITARIA DEEucalyptus globulus

Título: DESARROLLO DE PROTOCOLOS DE INOCULACIÓN ARTIFICIAL PARA LACARACTERIZACIÓN SANITARIA DE Eucalyptus globulus

Autores: Sofía SimetoGustavo BalmelliNora AltierBeatriz DiniZohra Bennadji

Serie Técnica N° 169

© 2007, INIA

ISBN: 978-9974-38-242-8

Editado por la Unidad de Comunicación y Transferencia de Tecnología del INIAAndes 1365, Piso 12. Montevideo - Uruguayhttp://www.inia.org.uy

Quedan reservados todos los derechos de la presente edición. Esta publicación no se podráreproducir total o parcialmente sin expreso consentimiento del INIA.

Instituto Nacional de Investigación Agropecuaria

Integración de la Junta Directiva

Ing. Agr., Ph. D. Pablo Chilibroste - Presidente

Ing. Agr., Dr. Mario García - Vicepresidente

Ing. Agr. Eduardo Urioste

Ing. Aparicio Hirschy

Ing. Agr. Juan Daniel Vago

Ing. Agr. Mario Costa

CONTENIDO

Página

I. INTRODUCCIÓN ....................................................................................... 1

II. ANTECEDENTES BIBLIOGRÁFICOS ...................................................... 2

II.1. Roya del eucalipto causada por Puccinia psidii .............................. 2

II.2. Manchas foliares causadas por Mycosphaerella spp ..................... 4

II.3. Cancros en el fuste asociados a Botryosphaeriaceae ................... 6

III. DESARROLLO DE LA METODOLOGÍA DE INOCULACIÓN.................. 8

III.1. Puccinia psidii .................................................................................. 8

III.2. Mycosphaerella spp ....................................................................... 11

III.3. Botryosphaeriaceae ....................................................................... 12

IV. IMPLICANCIAS PARA EL MEJORAMIENTO GENÉTICO.................... 19

V. CONCLUSIONES Y PERSPECTIVAS .................................................. 20

VI. AGRADECIMIENTOS.............................................................................. 21

VII.BIBLIOGRAFÍA ....................................................................................... 21

INIA TACUAREMBÓ

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INOCULACIÓN ARTIFICIAL PARA LA CARACTERIZACIÓN SANITARIA DE E. globulus

I. INTRODUCCIÓN

La madera de Eucalyptus globulus pre-senta excelentes propiedades, tanto para laproducción de celulosa como para la fabri-cación de papel. Estas características seven reflejadas en el precio de la madera yen la seguridad del mercado, lo cual ha lle-vado a que esta especie sea la más planta-da en Uruguay, existiendo actualmente másde 250 mil hectáreas (Boletín EstadísticoMGAP, 2005).

Sin embargo, la productividad deEucalyptus globulus en nuestro país se velimitada por el efecto combinado de diver-sos factores, como falta de adaptación acondiciones climáticas (principalmente enzonas con escasa influencia marítima), sue-los mal drenados y susceptibilidad a variasenfermedades y plagas. Los problemas deadaptación, especialmente cuando se com-binan con la utilización de fuentes de semi-lla inadecuadas, se visualizan en la reduc-ción del crecimiento y en la muerte de ár-boles, lo que finalmente se traduce en me-nor productividad.

Para contribuir a superar las limitacio-nes productivas que presenta E. globulusen algunas zonas, el INIA ha desarrolladodiferentes acciones. Desde 1990 se vieneevaluando el comportamiento productivo denumerosas fuentes de semilla en ensayosinstalados en diferentes sitios (la informa-ción generada hasta el momento puedeconsultarse en la Serie Técnica N° 40, 68,103, 123, 143 y 149 y en la Serie Activida-des de Difusión N° 289, 462 y 491).

Para avanzar en esta línea de investi-gación, entre 2003 y 2004 se implementóun proyecto con financiamiento del Progra-ma de Desarrollo Tecnológico (PDT-MEC)titulado “Desarrollo de una raza local de

Eucalyptus globulus tolerante a las princi-pales enfermedades y plagas”. Este proyec-to permitió identificar las principales enfer-medades de E. globulus, conocer su inci-dencia relativa en las diferentes zonas fo-restales, evaluar la susceptibilidad a cadaenfermedad de diferentes fuentes de semi-lla y conocer la factibilidad de mejorar porselección la resistencia a cada enfermedad(los resultados y la información generada eneste proyecto puede consultarse en laSerie Técnica N° 143).

Posteriormente, mediante evaluacionesperiódicas del comportamiento sanitario, sehan comenzado a cuantificar los efectosprovocados por diferentes enfermedadessobre el crecimiento, sobre la sobrevivienciay sobre la calidad de la madera para pro-ducción de celulosa (esta información sepuede consultar en la Serie Técnica Nº 152,en la Serie Actividades de Difusión N° 462y 491, en la Revista de la Sociedad deProductores Forestales N° 27 y en las ac-tas del IX Congreso de Ingenieros Agróno-mos del Uruguay).

La evaluación periódica del nivel de sín-tomas en los tests genéticos (pruebas deprogenie) ha permitido además la estima-ción de valores de cría parentales, el ran-king de progenitores y el manejo genéticode los huertos semilleros. En otras palabras,ha permitido incluir la sanidad como objeti-vo de selección en el Plan de MejoramientoGenético de esta especie y comenzar a pro-ducir semilla mejorada por resistencia aenfermedades.

Sin embargo, en los ensayos de campono siempre se encuentran presentes todaslas enfermedades que se pretende evaluaro no siempre las mismas tienen la severi-dad necesaria para que se manifiesten da-ños cuantificables. Además, y aún en con-

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Eucalyptus globulus

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diciones favorables para el desarrollo deenfermedad, la evaluación se realiza engeneral sobre grupos de síntomas (porejemplo “manchas foliares” o “cancros”) yno sobre cada una de las enfermedades enforma aislada.

Por tal motivo y para avanzar en la in-corporación de resistencia a enfermedadesen el Plan de Mejora Genética se implemen-tó un nuevo proyecto, titulado “Desarrollode tests estándar de inoculación artificialpara la caracterización sanitaria de germo-plasma de Eucalyptus globulus”. Este pro-yecto, también financiado por PDT-MEC, sedesarrolló entre 2005 y 2007. El objetivogeneral fue desarrollar y validar la metodo-logía de inoculación artificial para tres en-fermedades: roya del eucalipto (Pucciniapsidii), manchas foliares (Mycosphaerellaspp.) y cancros en el fuste (Botryosphae-riaceae). La meta planteada para este pro-yecto es la implementación de un Servicio deEvaluación Sanitaria que permita conocer laresistencia/susceptibilidad de materiales depropagación (semillas o clones) previo a serutilizados a nivel comercial, contribuyendo deesta forma a disminuir el riesgo sanitario delas inversiones forestales con E. globulus.

En esta publicación se presentan los re-sultados obtenidos en dicho proyecto. En laprimera parte se realiza la descripción y re-copilación de antecedentes para las tresenfermedades. Luego se describen breve-mente las metodologías utilizadas para cadaenfermedad y se presentan los resultadosobtenidos en las sucesivas etapas: colecta,producción y conservación de inóculo, ino-culación de germoplasma y condiciones deincubación, y caracterización de la reaccióna través de una escala de evaluación. Porúltimo, se discuten las implicancias de lasmetodologías desarrolladas para el mejora-miento genético por resistencia a enferme-dades y se consideran las acciones futuraspara consolidar la implementación de unservicio de evaluación sanitaria.

II. ANTECEDENTESBIBLIOGRÁFICOS

II.1. Roya del eucalipto causadapor Puccinia psidii

El hongo Puccinia psidii Winter es elagente causal de la enfermedad conocidacomo “roya del eucalipto”. Fue originalmen-te descripta por Winter (1884) en hojas deguayabo (Psidium guajava) en Brasil, don-de también fue reportada por primera vezen Eucalyptus en 1944 (Joffily, 1944). Seconsidera originaria de América Central yde América del Sur pero hoy en día su dis-tribución abarca también el sur de los Esta-dos Unidos, el Caribe y Hawaii.

P. psidii es capaz de infectar numerosasespecies de la familia Myrtaceae, familia ala que pertenece el Eucalyptus. Reciente-mente se ha reportado la infección de P.psidii en una especie no perteneciente a lafamil ia de las mirtáceas, Heteropyxisnataliensis (Alfenas et al., 2005).

Debido a su gran capacidad de disper-sión (a través del viento, de insectos, deanimales y de la lluvia) y su amplio rangode hospedantes, esta enfermedad es con-siderada importante y es causa de gran pre-ocupación, particularmente en Australia,donde podría causar gran daño en las po-blaciones de Eucalyptus nativos.

Existe poca información sobre la infec-ción de P. psidii en especies nativas en loslugares de origen de la enfermedad (Glenet al., 2007). Esto se debe a que en generalno se observan ataques severos en la mis-ma, con excepción de eventuales epidemiasen plantaciones comerciales de guayaba enBrasil (Ribeiro & Pommer 2004).

Cuando una especie es trasladada fuerade su rango de distribución natural existe elriesgo de exposición a nuevos patógenos,no presentes en el área de origen. Es pro-bable que este haya sido el caso del

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Eucalyptus con P. psidii y que nuestrasmirtáceas nativas hayan servido como fuen-te de inóculo de cepas con capacidad deinfectar Eucalyptus.

En Uruguay, el primer reporte de la pre-sencia de P. psidii en Eucalyptus globulusfue realizado en el 2003 (Telechea et al.,2003) aunque el patógeno había sido repor-tado con anterioridad en Psidium brasiliensisen 1981 (Koch de Brotos et al., 1981).

Síntomas

Puccinia psidii infecta tejidos jóvenes enplantas de vivero y en plantas de hasta 2años en el campo. Sobre huéspedes sus-ceptibles el síntoma más característico dela enfermedad es la presencia de pústulasamari l lo intenso, donde se da unaesporulación pulverulenta sobre hojas juve-niles, pecíolos y brotes (Figura 1). Las le-siones sobre los órganos afectados comien-zan tomando una coloración castaño grisá-ceo que luego se verá recubierta por lasuredosporas.

En materiales altamente susceptibles laenfermedad causa deformaciones, hipertro-fia y necrosis de las porciones afectadas,pudiendo, en caso de ataques severos,matar los ápices con la consiguiente pérdi-da de dominancia apical y propiciando há-bitos arbustivos. Sobre huéspedes resisten-tes, el patógeno induce una reacción de hi-persensibilidad, expresada por pequeñaslesiones necróticas (“flecks”) que general-mente no presentan esporulación (Junghanset al., 2003).

Ciclo de vida

Puccinia psidii es considerada una royaautoica, es decir que todas sus fases se pro-ducen sobre el mismo huésped. A su vezse la considera hemicíclica ya que no todassus fases han sido observadas en la natu-raleza (Figueredo, 2001; Alfenas & Zauza,datos sin publ icar). Contrar iamente,Simpson et al. (2006) sugieren que podríatratarse de una especie heteroica con unafase aecial en un huésped desconocido,pero resulta dudoso dadas las múltiples ob-servaciones realizadas en laboratorios in-dependientes a partir de infecciones causa-das por basidiosporas sobre el huéspedtelial (Figueredo, 2001; Alfenas & Zauza,datos sin publicar).

La germinación de las uredosporas y lainfección se encuentran fuertemente afec-tadas por la temperatura, la presencia deagua libre sobre los tejidos (debido al rocío,etc) la intensidad de luz y el fotoperíodo(Ruiz et al., 1989b). Numerosos estudiosconcuerdan en que un alto nivel de agua li-bre sobre el tejido y oscuridad por un perío-do de 6 a 8 horas son necesarios para unagerminación e infección exitosas (Piza &Ribeiro, 1988; Ruiz et al., 1989a; 1989c;Coutinho et al., 1998). El rango de tempe-ratura óptimo es entre 15º C y 25º C (Ruizet al., 1989a; Carvalho et al., 1994). Si bienexisten diferencias en cuanto al rango detemperatura entre distintos estudios, éstasse deben probablemente a variaciones enla metodología de inoculación y a diferen-cias en los biotipos de roya utilizados.

Figura 1. Infección natural de Eucalyptus globulus por Puccinia psidii. a) Árbol severamente afec-tado con ápices secos. b) Hojas y brotes apicales con pústulas amarillas características. c) Detallede hoja infectada.

a b c

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A través de inoculaciones cruzadas so-bre diferentes huéspedes, diversos estudiossugieren la existencia especialización fi-siológica y por tanto reportan razas obiotipos de P. psidii (Coelho et al., 2001;Xavier, 2002; Aparecido et al., 2003). Se-gún Coelho et al. (2001) se pueden separartres grupos: un grupo capaz de infectarEucalyptus spp. y Syzygium jambos, un se-gundo grupo capaz de infectar Eucalyptusspp. y Psidium guajava y un tercer grupoque sólo infecta P. guajava.

Impacto en Uruguay

La roya del Eucalyptus es una enferme-dad con gran potencial destructivo, especial-mente en especies o clones muy suscepti-bles. Es considerada además una enferme-dad cuarentenaria en países donde no seencuentra presente (Coutinho et al., 1998;Alfenas et al., 2004).

Desde el punto de vista productivo laenfermedad puede tener efectos directosdebidos a la pérdida de crecimiento o, encasos severos, a la muerte de la planta, yefectos indirectos debidos al estrés provo-cado en la planta, lo cual la hace más sus-ceptible a factores abióticos y bióticos(Balmelli et al., 2004).

En ensayos de E. globulus de un año,llevados a cabo en Rocha y Maldonado,se observó presencia de P. psidii en el44 y 47 % de las hojas muestreadas, res-pectivamente (Balmelli et al., 2004).

Control

Para la roya del Eucalyptus diversos au-tores reportan la existencia de variabilidadgenética en cuanto a la resistencia a la en-fermedad (Balmelli et al., 2004; Coutinho etal., 1998). En la Figura 2 se observa evi-dencia de variabilidad genética en condicio-nes de campo. Por lo tanto, la utilización degenotipos resistentes es una estrategia dis-ponible para la reducción del impacto de laenfermedad.

En cuanto a la estrategia de aplicaciónde fungicidas es sólo viable en viveros, enjardines clonales y ocasionalmente en elcampo, para materiales de gran valorgenético. Los beneficios de la aplicación de

fungicidas deben ser evaluados teniendo encuenta los costos económicos y ambienta-les (Glen et al., 2007).

II.2. Manchas foliares causadaspor Mycosphaerella spp.

El género Mycosphaerella cuenta connumerosas especies patógenas deEucalyptus y es una de las enfermedadesfoliares más comunes. Más de 30 especieshan sido descriptas a partir de distintasmanchas y lesiones en hojas juveniles yadultas. Muchas veces se ha observado quemás de una especie de Mycosphaerella seencuentra colonizando una sola hoja deEucalyptus y se han observado hasta cua-tro especies asociadas a una única lesión(Crous, 1998).

Si bien las enfermedades foliares cau-sadas por Mycosphaerella spp. y susanamorfos rara vez provocan ataques se-veros en poblaciones de Eucalyptus nativos,en viveros y en plantaciones comercialeshan llegado a causar grandes daños, por loque son consideradas las enfermedadesfoliares más importantes en Australia (Park& Keane, 1982b; Carnegie & Keane, 1998),en Nueva Zelanda (Dick, 1982) y enSudáfrica (Crous & Wingfield, 1996).

De las especies reportadas enEucalyptus fuera de Australia, es probableque algunas se hayan dispersado a partir

Figura 2. Infección natural de Eucalyptusglobulus por Puccinia psidii. Diferencias en re-sistencia a la enfermedad: izquierda, árbol sus-ceptible; derecha, árbol resistente.

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de allí; esto incluye a M. cryptica y M.nubilosa en Nueva Zelanda (Dick, 1982; Dick& Gadgil, 1983), M. cryptica en Chile(Wingfield et al., 1995), M. marksii enIndonesia, Vietnam, Sudáfrica y Portugal y M.suttoniae (Phaeophleospora epicoccoides) enIndonesia y Brasil (Crous, 1998). Sin embar-go, muchas especies no han sido reportadasen Australia y sus poblaciones de origen po-drían encontrarse en mirtáceas nativas (Crous& Wingfield, 1996; Crous, 1998). Existen re-portes de la ocurrencia de Mycosphaerellaspp. en mirtáceas nativas en Brasil (Ferreira,1989; Corlett, 1991) y en Uruguay (Pérez etal., 2007).

Las enfermedades foliares causadas porMycosphaerella spp. son una de las mayo-res restricciones en la propagación deEucalyptus en muchas partes del mundo. M.cryptica y M. nubilosa han causado dañosconsiderables en plantaciones en Australia(Park & Keane, 1982a; 1982b; 1984;Carnegie et al., 1994), mientras que M.cryptica y M. juvenis han tenido efectos se-veros en Nueva Zelanda (Ganapathi &Corbin, 1979) y Sudáfr ica (Crous &Wingfield, 1996), respectivamente.

Síntomas

Los síntomas pueden variar según la olas especies presentes en la infección. Engeneral, las especies de Mycosphaerellaproducen manchas de color castaño claro amarrón y son de forma irregular, angular ocircular (Figura 3). Los bordes pueden sermás oscuros que las manchas y varían ensu coloración (Balmelli et al., 2004).

Una infección severa puede causar laabscisión prematura de las hojas y un mar-chitamiento y muerte del ápice (Crous, 1998;Carnegie et al., 1994) provocando a la vezuna pérdida de crecimiento y un aumentodel estrés, dejando más vulnerable a la plan-ta a la acción de otros patógenos y/o facto-res abióticos (Figura 4).

Ciclo de vida

Este género se caracteriza por la forma-ción de fructificaciones de color negro so-bre las lesiones en hojas (pseudotecios) encuyo interior se producen esporas de ori-gen sexual denominadas ascosporas. Ladispersión ocurre a partir de la liberaciónactiva de las ascosporas bajo determinadascondiciones ambientales. La propagación delas mismas ocurre principalmente a travésdel viento, mientras que la lluvia contribuyea la dispersión sobre un mismo árbol(Beresford, 1978).

Según estudios realizados en plantacio-nes de Eucalyptus en Nueva Zelanda porCheah (1977) y Beresford (1978), las ma-yores concentraciones de ascosporas en elaire se dan durante el otoño y hasta princi-pios del verano. A su vez, Park y Keane(1987) encontraron que en Australia la ma-yor cantidad de inóculo en el aire se regis-tra en verano y hasta mediados de otoño.En el caso de M. nubilosa, M. cryptica y M.parva, la formación de fructificaciones ocu-rre durante todo el año, pero la liberaciónde las ascosporas requiere condiciones dehumedad relativa cercanas a la saturación,no ocurriendo por debajo del 90% (Park y

Figura 3. Manchas causadas por Mycosphaerella spp.

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Keane, 1982a; 1987). Por otra parte, lastemperaturas óptimas para dicha liberaciónson de 25º C para M. nubilosa, 20º C paraM. cryptica y 7-25º C para M. parva. Estastemperaturas pueden diferir bajo condicio-nes de campo.

Impacto en Uruguay

Para Uruguay las especies reportadaspara Eucalyptus globulus son: M. marksii, M.walkeri, M. suberosa (Wingfield, 2000) y M.vespa (Balmelli et al., 2004). A su vez existenreportes de M. heimii, M. marksii y M. aurantiaen mirtáceas nativas (Pérez et al., 2007).

En ensayos de E. globulus de un año,llevados a cabo en Rocha y Maldonado, seconstató la presencia de manchas deMycosphaerella spp. en el 35 y 26 % de lashojas muestreadas, respect ivamente(Balmelli et al., 2004).

Control

Debido al daño causado por Mycosphaerellaspp. en plantaciones comerciales, se ha bus-cado resistencia a estos patógenos en espe-cies y orígenes de Eucalyptus tanto en Austra-lia (Carnegie & Keane, 1998; Carnegie et al.,1994; Dungey et al., 1997), como en Sudáfrica(Purnell & Lundquist, 1986) y Nueva Zelanda(Wilcox, 1982a; 1982b).

Existen evidencias de variación en la re-sistencia a Mycosphaerella spp. entre dis-tintas especies de Eucalyptus (Wilcox,1982a; 1982b; Carnegie et al., 1994), entrediferentes orígenes (Wilcox, 1982a; 1982b;Lunquist & Purnell 1987; Carnegie & Keane,1998; Carnegie et al.,1994; Dungey et al.,1997) y entre familias (Reinoso, 1992; Dungeyet al.,1997).Estudios de heredabilidad de laresistencia en E. globulus en Tasmania de-mostraron la viabilidad de la selección porresistencia a la enfermedad como forma dereducir los efectos de la misma (Dungey etal., 1997; Milgate et al., 2005). Balmelli etal. (2004) también observaron valores mo-derados a altos de heredabilidad paradefoliación en ensayos de E. globulus enUruguay, por lo que se podría esperar unaaceptable respuesta a la selección.

II.3. Cancros en el fuste asociadosa Botryosphaeriaceae

Los cancros son infecciones que resul-tan en la muerte del cambium, de forma ytamaño variable, que pueden ocurrir en tron-cos y ramas de un árbol (Figura 5). Cuandose produce la invasión fúngica, se disparanmecanismos de respuesta por parte del ár-bol para restringir dicha infección. EnEucalyptus, el daño del cambium se ve ge-

Figura 4. a) Defoliación causada por Mycosphaerella spp. en Eucalytus globulus. b) Dife-rencias en resistencia a la enfermedad: adelante, árbol susceptible; atrás, árboles resis-tentes.

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neralmente acompañado de la exudación dequino (Figura 5). La respuesta del árbol fren-te a la invasión fúngica puede verse modifi-cada debido a condiciones ambientales demanera que el estrés, ya sea biótico oabiótico, puede resultar en un aumento deltamaño del cancro (Old & Davison, 2000).

Diversos géneros de hongos se han re-portado asociados a este tipo de lesiones,varios de los cuales se ubican dentro de lafamilia Botryospaheriaceae. Este grupo esrico en especies y tiene una distribución cos-mopolita. Dichas especies ocurren en unamplio rango de huéspedes y su modo devida abarca el saprofitismo, el parasitismoy el endofitismo (Smith et al., 1996).

Los anamorfos han sido ubicados en losgéneros Botryodiplodia (Sacc.) Sacc, DiplodiaFr., Dothiorella Sacc., Fusicoccum Corda,Lasiodiplodia Ellis & Everh., Macrophoma(Sacc.) Berl. & Vogl., Macrophomopsis Petrak,Sphaeropsis Sacc., y Neofusicoccum(Denmann et al., 2000; Crous et al., 2006).

Debido a que las característ icasmorfológicas de estos géneros se encuen-tran pobremente definidas, los mismos noestán claramente delimitados (Alonso, 2004)y existe confusión en la ubicación de lasespecies dentro del género. La taxonomíade la familia Botryosphaeriaceae se encuen-tra actualmente en revisión, atendiendo ala de sus anamorfos, las formas más comu-

Figura 5. Presencia de cancros en Eucalyptus globulus. (Gentileza del Ing.Agr. Carlos Pérez, Fa-cultad de Agronomía, UDELAR).

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nes encontradas en la naturaleza (Denmannet al., 2000). Dada la controversia existen-te en cuanto a la taxonomía del género, alos efectos de esta publicación se utilizaráen forma genérica “Botryosphaeria”, de ma-nera de simplificar la mención de los aisla-mientos, salvo aquellos que posean unaidentificación correcta.

Síntomas

Numerosas especies del género Botryos-phaeria han sido reportadas como causan-tes de manchas de hojas, muerte apical enárboles jóvenes y de cancros en ramas yfuste (Barnard et al., 1987; Davison & Tay,1983; Shearer et al., 1987; Old & Davison,2000; Smith et al., 2001). Estos síntomashan sido observados mayoritariamente aso-ciados a estrés abiótico. A su vez diversas“Botryosphaeria” spp. han sido reportadascomo endófitos, colonizando asintomática-mente tejidos sanos de Eucalyptus spp.(Bettucci & Alonso, 1997; Bettucci et al.,1997; Fisher et al., 1993; Smith et al., 1996).También fueron aisladas de tejidos sanos ysintomáticos en otras especies de mirtáceasnativas en Sudáfrica (Pavlic et al., 2007),Australia (Burguess et al., 2006) y Uruguay(Bettucci et al., 2004; Carlos Pérez, com.pers.).

En función del genotipo, de las condicio-nes fisiológicas de la planta y de las condi-ciones ambientales, estos hongos puedenvariar su modo de vida desarrollando la en-fermedad. La ocurrencia de la misma se havisto asociada a factores de estrés talescomo viento, heladas, condiciones adversasde suelo y ocurrencia de sequía.

Impacto en Uruguay

Balmelli et al. (2006; 2007) no detecta-ron un efecto de la presencia de cancrossobre el crecimiento, pero sí un aumento enla mortalidad respecto a los árboles sanos.A su vez, Balmelli y Resquín (2005) encon-traron una clara relación entre nivel decancros y la mortalidad de las cepas. Se haobservado también que los árboles severa-mente afectados presentan una copa muypequeña, con ocasional muerte total o par-cial de la misma, así como la emisión de

brotes epicórmicos (Balmelli et al., 2004).La aparición de estos rebrotes dificulta eldescortezado de los árboles afectados almomento de la cosecha, debiéndose recu-rrir al descortezado manual cuando éstosson demasiado numerosos o de gran tama-ño. A su vez, la madera de árboles afecta-dos por cancros tiene un menor rendimien-to en pulpa y un mayor consumo dereactivos con el consiguiente aumento decostos (Resquin et al., 2005).

En Uruguay se ha reportado la presen-cia de B. dothidea, Neofusicoccum ribis-N.parva y N. eucalyptorum en distintas es-pecies de Eucalyptus a partir de tejidos sa-nos y con síntomas (Alonso, 2004; Balmelliet al., 2004; Bettucci et al., 1999; Wingfield,2000; Carlos Pérez, com. pers.).

Control

Al igual que con otras enfermedades,entre las distintas especies y orígenes deEucalyptus, existen diferencias en las res-puestas a la infección por “Botryosphaeria”spp. (Old & Davison, 2000), por lo que laselección de materiales resistentes es laestrategia más aceptada para el manejo deestas enfermedades en plantaciones comer-ciales (Gadgil et al., 2000). A su vez,Balmelli et al. (2004) reportaron que la va-riabilidad observada en el nivel de síntomasse encuentra sujeta a un buen controlgenético y que por lo tanto es factible redu-cir la susceptibilidad mediante selección.

III. DESARROLLO DE LAMETODOLOGÍA DEINOCULACIÓN

III.1. Puccinia psidii

A los efectos de realizar una capacita-ción en la metodología de trabajo con P.psidii, en setiembre de 2005 se realizó unapasantía de dos semanas en el Departamen-to de Patología Vegetal de la Universidadde Visoça, bajo la supervisión del Dr.Acelino Couto Alfenas, referente internacio-nal en el tema. Se estudiaron las técnicasde colecta, multiplicación y conservación deinóculo, así como también los procedimien-

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tos básicos de inoculación sobre plantas deEucalyptus grandis y evaluación de la reac-ción a P. psidii, propuestos por Alfenas etal. (2004) y Junghans et al. (2003). En oc-tubre de 2006, el Dr. Alfenas viajó a INIALas Brujas durante una semana para super-visar el ajuste de la metodología en E.globulus.

La colecta inicial de inóculo se realizóen plantaciones jóvenes de E. globulus quepresentaban infección natural de P. psidii.Se muestrearon hojas con pústulas, de lascuales se extrajo la esporada y se la enva-só en ampollas de vidrio al vacío o en tuboseppendorf. Se obtuvieron un total de sieteaislamientos.

Por tratarse de un parásito obligado (hon-go biotrófico), el crecimiento y multiplicaciónde P. psidii requiere de tejidos vivos de unhospedante, no siendo posible su cultivo invitro. Por tal razón, para la producción delinóculo se utilizan plantas de Syzygiumjambos, mirtácea originaria del sudeste deAsia, altamente susceptible a la enferme-dad. Una vez inoculadas con P. psidii seobtiene una gran esporulación sobre lashojas afectadas, facilitando de esta formala obtención de inóculo para posterioresensayos (Figuras 6a y 6b).

Para la inoculación de plantas de S.jambos, a partir de un stock de esporas ymediante un pincel de cerdas firmes, seespolvoreó la cara adaxial de las hojas másjóvenes. Las plantas se incubaron durante24 horas en oscuridad, a 25º C y en un am-biente de humedad saturada. Posteriormen-

te, se trasladaron a una cámara de creci-miento a 20º C, con un régimen de luz/os-curidad de 12 horas. Transcurridos 12 díasdespués de la inoculación (ddi), se colectó laesporada y se almacenó a –80º C.

A partir de las inoculaciones en plantasde S. jambos se pudo mult ipl icarexitosamente la mayoría de los aislamien-tos de P. psidii colectados. Atendiendo a laabundancia en el sitio de colecta y a la ca-pacidad de multiplicación en S. jambos, seseleccionó uno de los aislamientos (aisla-miento N° 10) para ser utilizado en las su-cesivas inoculaciones. Del mismo, se obtu-vo un aislamiento monopustular, a fin deasegurar la homogeneidad del inóculo. Esteprocedimiento permite el mantenimiento yla producción de inóculo en forma sistemá-tica y periódica, tal como reporta Alfenas etal. (2004).

Los experimentos de inoculación sobreE. globulus se realizaron en plantas prove-nientes de semilla (de origen comercial y deprogenies del programa de mejoramientogenético del INIA) y sobre material clonal.Para esta inoculación se preparó una sus-pensión en agua de 2 x 104 esporas/ml y seaplicó con un aspersor a ambas caras delos primeros pares de hojas (Figura 7a). Lascondiciones de incubación fueron las mis-mas que las utilizadas para la inoculaciónde S. jambos (Figuras 7b y 7c).

A los 12 ddi se realizó una evaluaciónpreliminar de síntomas y a los 20 ddi la eva-luación final. La caracterización de la reac-ción se realizó tomando como base la es-

Figura 6. a) Inoculación artificial de plantas de Syzygium jambos con Puccinia psidii. b) S. jamboscon abundante esporulación.

a b

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Figura 7. a) Inoculación de Eucalyptus conPuccinia psidii. b) Cámara de incubación. c) Cá-mara de crecimiento.

Figura 8. Escala visual de reacción de Eucalyptus grandis a la inoculación artificial conPuccinia psidii. (Gentileza del Dr. Acelino Couto Alfenas, Universidad Federal de Visoça,Brasil).

a

b c

Escala para la evaluación de resitencia a la roya del Eucalyptus con cuatro clases de severidad:SO= inmunidad o reacción de hipersensibilidad del tipo “fleck” o necrótico (SO HR); SI= pústulas<0,8 mm de diámetro; S2= pústulas de 0,8 1,6 mm de diámetro y S3= pústulas = 1,6 mm (Junghanset al., 2003; Fitopatología Brasileira, 28: 261-265).

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cala visual desarrollada por Junghans et al.(2003) para E. grandis (Figura 8). Esta es-cala considera el tamaño y cantidad de pús-tulas, delimitándose cuatro clases de seve-ridad: S0 = inmunidad o reacción de hiper-sensibilidad del tipo “fleck” o necrótico(S0H); S1 = pústulas puntiformes < 0,8 mmde diámetro; S2 = pústulas medianas de 0,8a 1,6 mm de diámetro; S3 = pústulas gran-des > 1,6 mm de diámetro. La lectura sedebe realizar en los primeros pares de ho-jas del tallo principal, evitando las hojas delas ramificaciones laterales.

Figura 9. Inoculación artificial de Eucalyptusglobulus con Puccinia psidii; a) planta resisten-te; b) y c) Plantas susceptibles.

Para E. globulus, tanto en lasinoculaciones de plantas provenientes desemilla como de material clonal, la meto-dología permitió registrar reacciones dife-rentes en cuanto a la presencia deesporulación (tamaño y cantidad de pústu-las). Las plantas fueron caracterizadascomo resistentes o susceptibles (Figura 9).

En las plantas provenientes de semillacomercial se observaron diferentes respues-tas que abarcaron desde S0 a S3. De lasplantas provenientes de progenies del Pro-grama de Mejoramiento Genético de INIA,dos de las familias inoculadas fueron total-mente susceptibles y la tercera familia pre-sentó ocho plantas de reacción S3 (suscep-tibles) y una planta de reacción S0 (inmu-ne). En la inoculación de cuatro clones deE. globulus se observaron respuestas S3 enlas once plantas evaluadas para cada clon.Teniendo en cuenta los resultados de estasinoculaciones, y para poder realizar unaevaluación más precisa, es necesario utili-zar un número mayor de plantas, sobretodopara la evaluación de familias. SegúnAcelino Alfenas (com. pers.), es recomen-dable inocular 10 plantas en el caso de eva-luación de clones y al menos 150 plantasen el caso de evaluación de familias.

A los efectos de implementar la metodolo-gía ajustada para seleccionar germoplasmapor resistencia a la roya del Eucalyptus, hoyse dispone de materiales caracterizados comosusceptibles para ser incluidos como testigosen futuras evaluaciones.

III.2. Mycosphaerella spp.

Para el aislamiento de Mycosphaerellaspp. se muestrearon hojas en plantacionesjóvenes de E. globulus, que presentabansíntomas típicos de la enfermedad (manchasfoliares y defoliación). Los aislamientos fue-ron obtenidos siguiendo el método descritopor Crous (1998). Se recortaron las lesio-nes de hojas recientemente colectadas y sedejaron en remojo por 2 horas. Se secaronlos segmentos recortados y se los pegó enla tapa de una caja de Petri con MA 2%.Las fructificaciones (pseudotecios) presen-tes en las lesiones quedaron ubicadas ha-cia abajo, de manera que las ascosporas

a

b

c

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fueran expulsadas sobre el medio de culti-vo. Transcurridas 24 horas a temperaturaambiente, se reemplazaron las tapas y seincubó durante dos días más en oscuridada 25º C. Las ascosporas germinadas setransfirieron a MA 2% fresco. Paralelamente,se ensayó un procedimiento abreviado, co-locando hojas sintomáticas en cámara hú-meda e incubándolas a temperatura ambien-te; luego de siete días, las fructificacionespresentes en las manchas fueron directa-mente transferidas a MA 2%. En total, seobtuvieron 24 aislamientos deMycosphaerella spp.

Para la producción de inóculo se evaluóel crecimiento de diversos aislamientos deMycosphaerella spp. en cuatro medios decultivo: CLA (Carnation Leaf Agar), agar agua2%, PDA (Potato Dextrose Agar), y en agaragua 2% con fragmentos estériles de hoja deEucalyptus. En todos los casos, se ensaya-ron regímenes de alternancia luz/oscuridadde 12 horas y oscuridad total a 25 º C.

Los aislamientos de Mycosphaerella spp.obtenidos presentaron variabilidad y proba-blemente representen diferentes especies(Figura 10). Su identificación taxonómicaestá siendo actualmente completada (Car-los Pérez, com. pers.).

Cinco aislamientos fueron seleccionadospara evaluar su capacidad de esporulación,característica esencial para lograr un volu-men de inóculo mínimo a los efectos de rea-lizar ensayos de inoculación sobre plantasde Eucalyptus. Ninguno de los medios decultivo ni regímenes de luz/oscuridad ensa-yados permitieron promover la esporulación

de los aislamientos seleccionados, no ha-biendo sido posible preparar una suspen-sión de esporas para la inoculación.

Como alternativa, y en base a bibliogra-fía consultada (Van den Ende, 1992; Silueet al., 1999), se seleccionaron tres aisla-mientos para realizar un ensayo de inocu-lación con suspensiones de fragmentosmiceliales. A partir de la fragmentación decolonias de Mycosphaerella spp. crecidassobre agar V8 a 25 ºC, se obtuvo una sus-pensión de aproximadamente 104 fragmen-tos/ml de cada aislamiento. Las suspensio-nes se aplicaron mediante un aspersor so-bre las hojas jóvenes de plantas de E.globulus. Durante los primeros cinco díaslas ramas inoculadas se mantuvieron cubier-tas con una bolsa plástica a fin de mante-ner la humedad. En las condiciones en quefue ensayada esta técnica, no se logró in-ducir la ocurrencia de síntomas sobre lashojas inoculadas.

III.3. Botryosphaeriaceae

El muestreo para la colecta de especiesde la familia Botryosphaeriaceae se realizóen plantaciones de E. globulus que presen-taban árboles con síntomas (manchasnecróticas y/o cancros en ramas y fuste) yárboles asintomáticos. Para el aislamientodesde lesiones se siguió el método descritopor Phillips et al. (2005). Las muestrassintomáticas se dispusieron en cámara hú-meda y fueron incubadas a temperaturaambiente; luego de cuatro días, lasfructificaciones presentes en las lesiones

Figura 10. Colonias de Mycosphaerella spp. en MA 2 %. a) M. aurantia. b) M. ambiphylla. (Gentile-za del Ing.Agr. Carlos Pérez, Facultad de Agronomía, UDELAR).

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fueron transferidas a MA 2%. Para el aisla-miento de endófitos se utilizó el métodopropuesto por Simeto et al. (2005). Se proce-dió a la esterilización superficial e incubaciónde segmentos de ramas asintomáticas y pos-terior aislamiento selectivo de colonias de“Botryosphaeria” spp. (Figuras 11 a y 11b).Se obtuvieron un total de 54 aislamientos, loscuales fueron conservados en tubos con MA2% a 4° C (Figura 11 c).

Los aislamientos de “Botryosphaeria”spp. obtenidos presentaron variabilidad en

sus características morfológicas, recono-ciéndose la ocurrencia de diferentes espe-cies. La identificación taxonómica de los ais-lamientos está siendo actualmente comple-tada (Carlos Pérez, com. pers.).

Se realizaron tres ensayos de inocula-ción sobre plantas de E. globulus provenien-tes de semilla (de origen comercial y de pro-genies del programa de mejoramientogenético del INIA) y dos ensayos sobrematerial clonal de E. globulus y E. grandis.Para la inoculación se ensayaron las técni-cas propuestas por Alonso (2004), Pavlic etal. (2007) y Smith et al. (1994).

Para realizar los tres primeros ensayos,se seleccionaron ocho aislamientos de«Botryosphaeria» spp. según sitio de origeny especie (Cuadro 1). Para cada uno de losaislamientos se inocularon cinco plantas contallos de 0,8 a 1,0 cm de diámetro, inclu-

Figura 11. a) Técnica de aislamiento de co-lonias de “Botryosphaeria” spp. b) Coloniasde Botryospaheria dothidea en MA 2%(Gentileza del Ing.Agr. Carlos Pérez, Facul-tad de Agronomía, UDELAR). c) Mantenimien-to de los aislamientos a 4° C.

a

c

b

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Aislamiento Especie Sitio de muestreo

ILB 61 Botryosphaeria dothidea Tacuarembó

ILB 70 “Botryosphaeria” sp. Lavalleja

ILB 60 Neofusicoccum ribis Tacuarembó

ILB 20 “Botryosphaeria” sp. Soriano

ILB 44 “Botryosphaeria” sp. Rivera

UY 54 Neofusicoccum eucalyptorum Tacuarembó

ILB 34 “Botryosphaeria” sp. Lavalleja

UY 185 Neofusicoccum eucalyptorum Tacuarembó

yéndose además dos plantas como contro-les. Para proceder a la inoculación, se des-infectó con alcohol 75º la zona del tallo ainocular, luego se realizó una herida con unsacabocados y se retiró la corteza. Sobreel cambium expuesto se aplicó un disco deagar con micelio proveniente de una colo-nia de “Botryosphaeria” spp. creciendo so-bre MA 2% y se recubrió con film plástico.Para evitar la desecación, por debajo delpunto de inoculación se colocó un algodónembebido en agua destilada y también serecubrió con film plástico (Figuras 12 a y 12

Cuadro 1. Aislamientos de “Botryosphaeria” spp. seleccionados para los ensayos deinoculación sobre plantas de Eucalyptus globulus provenientes de semilla.

Figura 12. a) Aplicación de disco de agar con micelio de “Botryosphaeria” spp. b) Algodónhúmedo por debajo del punto de inoculación y herida, cubiertos por film plástico.

b). En el caso de las plantas usadas comocontroles, se inoculó con un disco de agarestéril, y se procedió de la misma forma co-locando algodón y film plástico. Los tres en-sayos de inoculación se repitieron en losmeses de abril, junio y agosto de 2006, ob-servar posibles efectos de las condicionesambientales.

La evaluación se realizó transcurridos 45días, procediéndose a registrar el tipo dereacción. Los síntomas evaluados fueron:extensión longitudinal y en profundidad dela lesión, presencia de fructificaciones, de-

a b

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coloración de la corteza en la zona periféricaal punto de inoculación, crecimiento irregu-lar y/o deformación del tallo, rajaduras dedistinta magnitud y formación de tejido decicatrización. En base a estas determina-ciones, se definieron las variables para lacaracterización de la reacción.

Para comprobar la permanencia delinóculo, se obtuvieron fragmentos de tejidode la zona del punto de inoculación, de la zonadecolorada y de la zona sana adyacente. Es-tos fragmentos fueron incubados, previa es-terilización superficial, en MA 2% a 25 ºC. Losaislamientos de “Botryosphaeria” spp. fueroncomparados con los inoculados en cada casoen base a su macro y micromorfología.

Las reacciones observadas presentaronun rango amplio de variabilidad. Debido aque estos ensayos fueron realizados condiferentes aislamientos sobre plantas pro-venientes de semilla, es posible considerarque la variabilidad registrada fue función delgenotipo de la planta y del genotipo del ais-lamiento (Figura 13).

Por esta razón, y con el fin de eliminar elefecto del genotipo de las plantas sobre lasintomatología, en diciembre de 2006 se

realizó un cuarto ensayo de inoculación so-bre un clon de E. globulus, A su vez, paraevaluar el posible efecto del ambiente so-bre la expresión de síntomas se ensayarontres condiciones de incubación: a) Estréshídrico por exceso de agua, para lo cual secolocaron las macetas en un recipiente quese mantuvo con un cierto nivel de agua, demanera que éstas quedasen sumergidasparcialmente (Figura 14 a); b) Estrés térmi-co, para lo cual las plantas se mantuvieronen invernáculo con una temperatura deaproximadamente 35-40º C y fueron rega-das de forma regular (Figura 14 b); c) Sinestrés, para lo cual las plantas simplemen-te se colocaron al aire libre, manteniendoun buen riego (Figura 14 c).

Para realizar este ensayo, se seleccio-naron tres de los ocho aislamientos utiliza-dos anteriormente, tomando en cuenta lareacción inducida en los ensayos previos(presencia de fructificaciones, lesión y de-formación del tallo). Los aislamientos selec-cionados fueron ILB 20, ILB 61 y UY 54.Para cada uno de los aislamientos y condi-ciones de incubación se inocularon tres

Figura 13. a) Variabilidad en la respuesta obtenida en los ensayos de inoculación de plantas deEucalyptus globulus provenientes de semilla, para un mismo aislamiento de “Botryosphaeria” spp.b) Respuesta de las plantas control.

a b

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Figura 14. Ensayo de inoculación so-bre material clonal de Eucalyptusglobulus. a) Incubación bajo condi-ciones de estrés hídrico por excesode agua. b) Incubación bajo condi-ciones de estrés térmico (por tempe-ratura elevada). c) Incubación sincondiciones de estrés.

a b

c

plantas, incluyéndose además una plantacon un disco de agar estéril como control.

La variabilidad registrada en las reaccio-nes fue considerablemente menor que laexistente en las inoculaciones sobre plan-tas provenientes de semilla, donde cada unarepresentaba un genotipo diferente (Figura15). La realización de las inoculaciones so-bre un clon permitió eliminar el efecto delgenotipo de las plantas sobre el tipo de re-acción. Sin embargo, en las respuestas ob-servadas no se manifestaron diferencias enfunción de las condiciones de incubaciónensayadas. Más aún, las plantas utilizadascomo controles tampoco evidenciaron unefecto del estrés, lo que sugiere que no selogró inducir condiciones abióticas extremas.

Por último, en el marco de la tesis dedoctorado del Ing.Agr. (M.Sc.) Carlos Pérez

y en forma coordinada entre INIA y Facul-tad de Agronomía, se realizó en enero de2007 un quinto ensayo de inoculación so-bre plantas de un clon de E. grandis. En estecaso se utilizaron veinte aislamientos de“Botryosphaeria” spp. provenientes deEucalyptus spp. y otras especies demirtáceas nativas, obtenidos a partir de te-jido sintomático y asintomático. La metodo-logía utilizada para esta inoculación se mo-dificó ligeramente respecto a la de los en-sayos anteriores; la herida se efectuó sola-mente con bisturí retirando la corteza enforma longitudinal (aproximadamente 1 cmde largo) con cuidado de no dañar elcambium. Para cada uno de los aislamien-tos se inocularon tres plantas, incluyéndo-se además nueve plantas inoculadas condiscos de agar estéril como controles. Las

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Figura 15. Ensayo de inoculación sobre material clonal de Eucalyptus globulus. a) Respuesta deplantas de un clon de E. globulus a la inoculación con un mismo aislamiento de “Botryosphaeria”spp. b) Respuesta de las plantas control. c) Corte longitudinal de la zona afectada por la inocula-ción con detalle de exudación de quino.

aa

b c

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plantas se mantuvieron en invernáculo a unatemperatura de aproximadamente 25 ºC.

La reacción registrada en las plantas clo-nales de E. grandis varió en función del ais-lamiento utilizado para la inoculación. Conalgunos aislamientos no hubo reacción deltejido vegetal, observándose solamente eldaño de la herida mecánica. Con otros ais-lamientos se observó una reacción de ne-crosis en el cambium que indica claramen-te la patogenicidad de los mismos, distin-guiéndose a su vez dos grados de agresivi-dad: (1) daño en el cambium y formación detejido de cicatrización sobrecreciendo alre-dedor de la herida, y (2) ausencia de res-

puesta de defensa de la planta con unamayor extensión de la herida y eventual for-mación de fructificaciones. En base a losdistintos tipos de reacción, fue posible ela-borar una escala visual de tres clases: 0 =sin infección; 1 = con lesión en el cambiumy presencia de tejido de cicatrización; y 2 =daño severo del cambium y ausencia dereacción de defensa de la planta (Figura 16).Los resultados de este último ensayo de ino-culación demuestran la variabilidad presenteen el complejo de aislamientos que compo-nen la familia Botryosphaeriaceae, en cuan-to a su capacidad patogénica sobre Eucalyp-tus.

Figura 16. Respuesta de plantas deun clon de Eucalyptus grandis a lainoculación con distintos aislamien-tos de “Botryosphaeria” spp.; escalavisual de tres clases: 0 = sin infec-ción; 1 = con lesión en el cambium ypresencia de tejido de cicatrización;y 2 = daño severo del cambium y au-sencia de reacción de defensa de laplanta (Gentileza del Ing.Agr. CarlosPérez, Facultad de Agronomía,UdelaR).

Clase 0 Clase 1

Clase 2

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IV. IMPLICANCIAS PARA ELMEJORAMIENTOGENÉTICO

Existen diferentes estrategias para elmanejo de enfermedades forestales, unastendientes a impedir la entrada de un agen-te patógeno (exclusión), otras tendientes aeliminar el inóculo de patógenos ya esta-blecidos (erradicación) y otras orientadas ala protección (por ejemplo la aplicación defungicidas). Sin embargo, el control de unaenfermedad forestal es prácticamente impo-sible, siendo más factible la reducción de laincidencia y/o severidad de la misma. Eneste sentido, el mejoramiento genético esuna herramienta ampliamente utilizada parael manejo de enfermedades forestales a tra-vés de la selección de genotipos más resis-tentes (Eldridge et al., 1994; Simpson yPodger, 2000; Gadgil et al., 2000).

Sin embargo, el mejoramiento genéticopor resistencia a enfermedades es comple-jo, costoso y requiere bastante tiempo. Lascondiciones para obtener éxito en este tipode mejora son similares a las necesariaspara otras características: existencia devariación genética y al menos un moderadocontrol genético. Además, en la mejora porresistencia a enfermedades se agreganotros factores: presencia del patógeno, con-diciones ambientales adecuadas para quese produzca la enfermedad y, en algunospatógenos, variabilidad genética en su vi-rulencia y/o agresividad. A su vez, en el casode la resistencia a enfermedades lainteracción genotipo-ambiente es más com-pleja, por un lado porque se da una dobleinteracción (árbol-ambiente y patógeno-ambiente) y por otro porque puede existiruna interacción múltiple árbol-ambiente-pa-tógeno.

Para las tres enfermedades de E.globulus estudiadas en este proyecto,Balmelli et al. (2004) constataron la existen-cia de variabilidad en cuanto al nivel de ex-presión de síntomas y obtuvieron valores deheredabilidad moderados a altos, por lo quesería esperable una buena respuesta a laselección. Dicha variabilidad puede ser

aprovechada de diferentes formas: elecciónde la fuente de semil la, selección yclonación de individuos resistentes, y selec-ción recurrente (selección y cruzamiento degenotipos resistentes). Estas estrategiasdifieren en cuanto a simplicidad, recursosrequeridos y tiempo necesario para obtenermaterial mejorado, pero en todas ellas elnivel de mejora que puede obtenerse estádirectamente relacionado a la eficiencia conque se realice la selección y al grado conque se conozca y entienda la magnitud dela interacción genotipo-ambiente.

A su vez, la eficiencia en la selecciónestá determinada por la precisión con quese evalúan y detectan los genotipos resis-tentes. Por otro lado, comprender las com-plejas interacciones genotipo-ambiente de-pende de cuán bien se tengan identificadoslos genotipos (tanto del árbol como del pa-tógeno) y cuán controlado se tenga el am-biente. Es evidente que cuando la evalua-ción de susceptibilidad a diferentes enfer-medades se realiza en condiciones de cam-po no es posible ejercer ningún tipo de con-trol sobre los patógenos ni sobre las condi-ciones ambientales.

Por tal motivo, la inoculación artificial esuna excelente herramienta para la evalua-ción de la expresión de resistencia/suscep-tibilidad a cada enfermedad ya que:

• Se puede evaluar la reacción a cada pató-geno en forma aislada, puesto que se lo-gra identificar los síntomas inducidos porcada uno (evitando los «complejos» desíntomas).

• Se asegura que todos los individuos tie-nen contacto con el patógeno y por lo tan-to que la ausencia de síntomas se debea la expresión de resistencia.

• Se tiene seguridad que todos los indivi-duos tienen contacto con la misma cepapatógena y por lo tanto que las diferen-cias en el nivel de reacción se deben adiferencias de susceptibilidad.

• Se pueden elegir y controlar las condicio-nes ambientales, principalmente durantela incubación, lo que asegura la manifes-tación de la enfermedad.

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• Todos los individuos se caracterizan en elmismo ambiente y por lo tanto se evita laeventual interacción entre la susceptibili-dad y el estrés provocado por condicio-nes ambientales variables, lo que hacemás precisa la evaluación.

• Se puede evaluar un gran número degenotipos en un espacio reducido y encorto tiempo, lo que reduce los costos deevaluación.

• Se puede conocer la susceptibilidad adeterminada enfermedad de forma tem-prana, por lo que se obtienen resultadosen menor tiempo.

En definitiva, la inoculación artificial per-mite mejorar la eficiencia con que se selec-cionan los genotipos más resistentes y porlo tanto permite obtener mayores gananciasgenéticas o reducir el tiempo y el costo re-querido para alcanzar determinada ganan-cia.

Para Puccinia psidii se ajustó una meto-dología para su conservación y multiplica-ción in vivo, así como un protocolo de ino-culación y evaluación de la reacción en plan-tas de E. globulus. En las inoculaciones seevidenció la existencia de variabilidad encuanto a la resistencia a la enfermedad,siendo posible caracterizar el material comosusceptible o resistente, lo cual permite pa-sar a una etapa de evaluación de materia-les utilizados a nivel comercial, tanto declones como lotes de semilla.

En el caso de Botryosphaeriaceae secuenta con la metodología para la conser-vación y producción del inóculo y se ajustóun protocolo estándar de inoculación. Sedefinieron las variables a medir para carac-terizar el tipo de reacción y se elaboró unaescala de evaluación. Dado que se observóuna gran variabilidad en la respuesta segúnla especie y el aislamiento utilizado, se con-sidera necesario realizar una correcta iden-tificación y caracterización de la estructurapoblacional de Botryosphaereaceae. Estopermitirá avanzar en la evaluación sanita-ria en programas de mejoramiento genéticomediante la selección de las cepas más

agresivas para ser ut i l izadas en lasinoculaciones.

Si bien para Mycosphaerella spp. secuenta con una metodología de aislamientoy conservación del inóculo, la ausencia deresultados exitosos en la inducción deesporulación in vitro plantea la necesidadde continuar evaluando alternativas, a losefectos de levantar esta restricción esencialpara desarrollar un protocolo de inoculación.Por otro lado, la ocurrencia de variabilidaden el complejo de patógenos causantes demanchas foliares deberá ser tenida en cuen-ta para seleccionar las especies y aislamien-tos de Mycosphaerella a ser ensayados.

El desarrollo del proyecto FPTA N° 221/2006: “Caracterización de las poblacionesde Botryosphaeria y Mycosphaerella presen-tes en plantaciones de Eucalyptus en Uru-guay, tendiente a minimizar el impacto eco-nómico de dicho” ejecutado por la Facultadde Agronomía, bajo la responsabilidad delIng.Agr. (M.Sc.) Carlos Pérez, en un esfuer-zo conjunto con INIA y el Laboratorio deMicología de la Facultad de Ciencias-Inge-niería, contribuirá a despejar algunas de lasinterrogantes que quedan planteadas.

V. CONCLUSIONES YPERSPECTIVAS

Al presente, se dispone de una colecciónde aislamientos de hongos patógenos deEucalyptus para ser utilizados en la carac-terización sanitaria de germoplasma, con elfin de asistir a los programas de mejoramien-to genético. Parte de la variabi l idadpatogénica presente en las plantacionesforestales está representada en la coleccióny deberá ser correctamente estudiada.

En el caso de Mycosphaerella spp. sedebe continuar investigando con el fin delograr la inducción de esporulación in vitro,paso imprescindible para producir el inóculonecesario para desarrollar un protocolo deinoculación.

Para Puccinia psidii y Botryosphaeria-ceae, dos de los grupos de microorganis-mos causantes de enfermedades de riesgoreal o potencial para las plantaciones de E.

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globulus en el país, se dispone de protoco-los para la inoculación artificial.

Dichos protocolos permitirán establecerun Servicio de Evaluación Sanitaria quepodrá ser utilizado directamente por el Pro-grama Forestal del INIA y por empresas quetienen sus propios programas de mejora-miento genético. De esta forma, podrán eva-luar sus poblaciones de cría y seleccionarlos progenitores y/o clones en base a suresistencia a las principales enfermedades.

Otros beneficiarios de dicho servicio se-rán las empresas que importan semilla y/olos usuarios de las mismas, los cuales po-drán conocer la calidad sanitaria de ésta ydecidir su utilización en plantaciones comer-ciales, en base al conocimiento previo delcomportamiento sanitario.

VI. AGRADECIMIENTOS

A las siguientes personas y empresasque colaboraron e hicieron posible la culmi-nación de este proyecto de investigación:Acelino Couto Alfenas, Carlos Pérez,Alfredo Fernández, Eufores, Forestal Orien-tal S.A.

VII. BIBLIOGRAFÍA

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